Badanie oddziaływania białko-ligand metodą ITC na przykładzie białka CRP.

Transkrypt

1 Badaie oddziaływaia białko-ligad metodą ITC a przykładzie białka CRP. Wstęp. Pomiary kalorymetrycze są powszechie wykorzystywae do pozyskiwaia iformacji o termodyamiczych właściwościach makrocząsteczek. Techiki te opierają się a precyzyjym pomiarze ciepła towarzyszącego przemiaom, które są wywołae ajczęściej przez zmiay temperatury, bądź postęp reakcji. Jedą z główych techik jest izotermicze miareczkowaie kalorymetrycze (ag. Isothermal Titratio Calorimetry, ITC), będące doskoałym arzędziem służącym do badaia oddziaływań międzycząsteczkowych. Jako jedya techika, umożliwia uzyskaie pełego opisu termodyamiczego badaego procesu w pojedyczym eksperymecie. Poprawie zaprojektowae doświadczeie dostarcza iformacji o stechiometrii wiązaia (), stałej rówowagi (K) a więc i etalpii swobodej reakcji (G), a także daje możliwość wyzaczeie molowej etalpii (H) i etropii wiązaia (S). Dodatkowo wykoując pomiary w różych temperaturach uzyskać moża wartość zmiay pojemości cieplej towarzyszącej procesowi wiązaia ligada (Cp). ITC posiada kilka ważych zalet w porówaiu z iymi techikami. Przede wszystkim sygał cieply jest uiwersalą własością prawie wszystkich reakcji. Stąd możliwość zastosowaia tej techiki do badaia większości reakcji. Istota jest wspomiaa już możliwość pozaia wielu wielkości w jedym eksperymecie. Próbka ie ulega ziszczeiu w trakcie pomiaru, a substraty reakcji ie są w żade sposób modyfikowae. Zasadicze wady metody, które jeszcze kilka lat temu poważie ograiczały jej stosowaie w biochemii, czyli wysoka materiałochłoość i iska czułość, obecie ie odgrywają takiej roli. Najowsze aparaty pracują przy stężeiach białek rzędu ułamka mikromola, co umożliwia badaie układów o szerokim zakresie stałej wiązaia ( M -1 ). Dla siliejszych oddziaływań bezpośredio wyzaczyć moża jedyie stechiometrię wiązaia i stadardową etalpię reakcji, atomiast stała rówowagi wiązaia wyzaczaa jest w sposób pośredi. Jedak w tym przypadku koiecze jest, aby jeda z badaych cząsteczek dodatkowo tworzyła kompleks z iym substratem, dla którego możliwe jest wyzaczeie stałej rówowagi. Wykoując eksperymet miareczkowaia kalorymetryczego, gdzie jako titrat stosoway jest substrat o większym powiowactwie, a titratem jest kompleks o iższej stałej rówowagi dochodzi do wypieraia słabiej związaego substratu, przez siliej wiązay. Dzięki zajomości stałej rówowagi dla słabiej oddziałującego kompleksu oraz molowej etalpii wiązaia siliej oddziałującego ligada, eksperymet pozwala określić stałe wiązaia dochodzące do 10 1 M -1. Techika ITC często stosowaa jest przy pomiarach oddziaływań: białko ligad, białko białko, białko DNA, czy też białko lipid. Określeie wszystkich parametrów termodyamiczych charakteryzujących oddziaływaie pozwala a głęboki wgląd w baday proces, umożliwiając określeie rodzajów oddziaływań prowadzących do utworzeia kompleksu. Jeśli substraty oddziałują ze sobą w bardziej skomplikoway sposób, to zaczy, gdy stechiometria róża jest od jedości, określoy zostaje schemat oddziaływaia i wyzaczyć moża parametry termodyamicze opisując poszczególe klasy miejsc wiążących. Pozwala to a zobrazowaie iterakcji pomiędzy miejscami wiążącymi, zidetyfikowaie kooperatywości, oraz określeia jej charakteru. Zazaczyć ależy, że wyzaczoa wartość H obrazuje ie tylko ciepło tworzeia wiązań pomiędzy oddziałującymi cząsteczkami, ale także ie rówowagowe procesy takie jak zmiay koformacyje w obrębie cząsteczek, zmiay w ich oddziaływaiu z rozpuszczalikiem, czy też joizacje grup polarych składików reakcji, lub buforu. Zmiaa etalpii swobodej mierzoych procesów złożoa jest z dwóch człoów: etalpowego i etropowego. Techiką ITC bezpośredio obserwujemy pierwszy z ich. Tylko w przypadku reakcji o dużym udziale zmiay etropii i iewielkim etalpii, ie moża zaobserwować przebiegu procesu. Zajomość udziału obu człoów w zmiaach etalpii swobodej pozwala wioskować o molekularym mechaizmie wiązaia reagetów: ilości 1

2 tworzoych i rozrywaych wiązań, zmiaach stopi swobody łańcuchów polipeptydowych i grup boczych, zmiaach uwodieia i joizacji czy ekspozycji powierzchi makrocząsteczek dostępej dla wody Budowa i zasada działaia kalorymetru. ITC opiera się a pomiarze wymieioego w toku reakcji ciepła, dla różych wartości stężeń reagetów. W warukach izotermiczo-izobaryczych, w których to przeprowadzay jest eksperymet, ciepło reakcji (Q) utożsamiae jest z etalpią reakcji (H). Pomiar realizoway jest poprzez dodawaie rówych objętości jedego z reagetów (titrata) do komory pomiarowej, w której zajduje się drugi z reagetów (aalit). Ich stężeia dobrae są w te sposób, aby umożliwić uzyskaie wysokiego stopia wysyceia miejsc wiążących. Podczas pierwszych dodatków, gdy występuje zaczy admiar aalitu, praktyczie wszystkie Rys. 1 Zależość kształtu krzywej miareczkowaia od wartości parametru c. cząsteczki titrata utworzą kompleks z cząsteczkami aalitu. Jedakże występująca rówowaga termodyamicza powodować będzie, że podczas kolejych dodatków liczba owo powstających kompleksów będzie sukcesywie spadać. Wartości wymieiaego ciepła pozwalają a pomiar molowej etalpii reakcji. Zmiaa wielkości wymieiaego ciepła dla kolejych dodatków titrata pozwala a wyzaczeie stałej rówowagi reakcji, atomiast stosuki molowe reagetów, dla których widoczy jest proces wysycaia miejsc wiążących iformują as o stechiometrii reakcji. Precyzyje wyzaczeie stałej rówowagi wymaga dobrego zobrazowaia procesu stopiowego wysycaia miejsc wiążących. Uważa się, że sukcesywy spadek wartości mierzoego ciepła, obrazujący te proces, powiie obejmować, co ajmiej kilka kolejych dodatków titrata. Sytuacja taka ma miejsce, jeśli wartość iloczyu stężeia miejsc wiążących i stałej rówowagi, zwaa parametrem c mieści się w graicach od 1 do 1000, jedak estymowaa wartość stałej rówowago obarczoa jest ajmiejszym błędem, jeśli c będzie w przedziale od 10 do 100 (patrz rysuek 1). Zasadiczą częścią kalorymetru są dwie komory: pomiarowa i referecyja (o pojemości ok. 1,4 ml). Obie umieszczoe są w metalowych płaszczach zapewiających termostabilość z dokładością do kilku dziesięciotysięczych części kelwia. Pomiędzy komorami a płaszczem umieszczoe są termostosy, mierzące różicę temperatur, która jest astępie przeliczaa a moc, z jaką jest grzaa lub chłodzoa próbka. Roztwór ligada jest podaway przez strzykawkę, której tłokiem kieruje precyzyjy silik krokowy. Igła jest jedocześie mieszadłem. Komorę referecyją wypełia się cieczą o zbliżoej pojemości cieplej do badaej próbki. W przypadku eksperymetów w buforach wodych stosuje się wodę. Wszystkie roztwory ależy przed doświadczeiem staraie odgazować, aby uikąć błędów wywołaych pojawieiem się pęcherzyków gazu. Pomiar jest realizoway poprzez koleje, mikrolitrowe dodatki roztworu ligada (L) do próbki z makromolekułą (M) z kilkumiutowymi odstępami. Sygałem kalorymetru jest moc w fukcji czasu. (rys. ).

3 Rys.. Przykładowy rezultat eksperymetu ITC, zależość mocy od czasu. Dla uzyskaia wysokiej precyzji w pomiarach ciepła, podczas wykoywaia eksperymetu komora referecyja jest ciągle podgrzewaa strumieiem ciepła rzędu mikrowatów. Powstająca w wyiku tej operacji różica temperatur geeruje liię bazową a wykresie. Wydzielae w wyiku reakcji ciepło wpływa a tę różicę, a jej zależość od czasu jest parametrem rejestrowaym podczas eksperymetu. Całkując krzywą względem czasu dla poszczególych dodatków otrzymuje się wykres zależości efektów cieplych (Q) od stosuku molowego stężeń reagetów ([T]/[A]). Rys. 3. Przykładowy rezultat eksperymetu ITC, zależość ciepła od stosuku molowego reagetów - etalpogram. Budowa aparatu (rys. 4) powoduje, że rejestrowae ciepło ie jest explicite ciepłem reakcji. Wyika to m.i. ze zmiay całkowitej objętości mieszaiy reakcyjej podczas miareczkowaia i powoduje, że koiecze jest wprowadzeie szeregu poprawek. Komora pomiarowa, skostruowaa jest w te sposób, że rejestrowae przez aparat wymieiae ciepło (ΔQ(i)), pochodzi wyłączie z określoej, stałej objętości (V), która przez cały czas trwaia eksperymetu wypełioa jest całkowicie cieczą. 3 Rys. 4 Budowa kalorymetru

4 Dlatego też zmiaa objętości mieszaiy reakcyjej wywołaa dodatkiem titrata (dv) spowoduje wydostaie się jej admiaru z części komory pomiarowej, dla której rejestrowae jest ciepło. Poieważ ciepło to rejestrowae jest także w czasie przeprowadzaia iiekcji, gdy dokouje się zmiaa stężeia reagetów, dodatkowo zarejestrowaa jest także część ciepła reakcji pochodząca od wypływającej cieczy. Zgodie z ogólie przyjętą metodą postępowaia założoe zostało, że kietyka reakcji oraz mieszaie reagetów są a tyle szybkie, że zarejestrowae jest dodatkowo 50 % efektu cieplego pochodzącego od wypływającej objętości mieszaiy reakcyjej. Dlatego też użyto stadardowej poprawki związaej z tym efektem: dvi Q( i) Q( i 1) Q( i) Q( i) ( 1) Q i V gdzie: ΔQ(i) to ciepło zarejestrowae podczas i-tego dodatku, V to objętość czyej części komory pomiarowej, dvi to dodaa objętość titrata, a Q(i-1) i Q(i) to skumulowae ciepła wymieioe podczas kolejych dodatków ligada począwszy od pierwszego odpowiedio do i-1-go i i-tego. Miareczkowaie w sposób oczywisty wpływa także a stężeie aalitu, powodując jego rozcieńczeie. Dodawaie ie zaiedbywalie małych objętości, powoduje, że stężeie to zmieia się także w trakcie iiekcji i jest oo rówe stężeiu aktualie wypływającemu z objętości czyej komory pomiarowej. W przypadku szybkiego mieszaia, średie stężeie aalitu, jest średią ze stężeń występujących a 0 C T początku ( ) i końcu iiekcji (CT). Dlatego też, korzystając z prawa zachowaia mas otrzymujemy poprawkę a końcowe stężeie aalitu (CT) po dodatku o objętości dv: dv V 0 C T CT dv V Idetyczy efekt zmusza do zastosowaia poprawki a stężeie titrata, która to wyprowadzoa została dzięki aalogiczemu rozumowaiu. 0 dv Ct Ct 1 V gdzie: Ct to stężeie titrata po dokoaiu iiekcji, V i dv to odpowiedio objętość czyej części komory pomiarowej i objętość dodatku. Ct 0 jest atomiast hipotetyczym stężeiem titrata, w przypadku gdyby doday titrat w całości pozostał w objętości V. Podczas miareczkowaia istoty wkład do rejestrowaego ciepła woszą także procesy rozcieńczaia składików reakcji (qdil), w szczególości ciepło rozcieńczaia titrata, a także efekty ciele ewetualych, dodatkowych procesów towarzyszących prowadzoemu eksperymetowi, p. ciepło protoacji/deprotoacji buforu. Wówczas zmierzoa etalpia Hobs będzie rówa:, gdzie ozacza wypadkową liczbę moli wymieioych protoów, Hbuf etalpię joizacji zastosowaego buforu, a H0 etalpię procesu mierzoą w obecości buforu o zerowej etalpii joizacji. Dlatego też aalizę wyików powio przeprowadzać się po uwzględieiu tych efektów. Rozważając ajprostszy przypadek, gdy aalit (A) tworzy z titratem (B) bimolekulary kompleks (AB) oddziaływaie opisać moża schematem: A B AB W staie rówowagi termodyamiczej, wartości stężeń poszczególych składików reakcji spełiają rówaie: [ A K [ A] [ (1 ) [ 4

5 Gdzie: K to stała rówowagi reakcji, [A], [ i [A to odpowiedio stężeia titrata, aalitu i powstałego kompleksu, atomiast jest frakcją miejsc wiążących aalitu obsadzoych przez titrat. W tym przypadku ciepło wydzieloe podczas tworzeia kompleksu, gdy układ dochodzi do stau rówowagi, zależeć będzie od molowej etalpii wiązaia (H) i od ilości moli utworzoego kompleksu, a to z kolei zależeć będzie od stężeia substratu zajdującego się w komorze pomiarowej ([A]), stopia wysyceia jego miejsc wiążących (), oraz objętości komory pomiarowej (V) zgodie z zależością: Q [ Atot ]V H W przypadku białek często mamy do czyieia z większą ilością miejsc wiążących ligad dla jedej makromolekuły. Do aalizy tych sytuacji służą dwa koleje modele. Pierwszy z ich wyróżia dwie klasy miejsc wiążących, iezależych od siebie. Używając symboliki aalogiczej dla poprzediego modelu, możemy go przedstawić w formie dwóch rówań: 1 K1 i K. ( 1 1) [ ( 1 ) [ Wówczas ilość wydzieloego ciepła w każdym dodatku będzie opisaa rówością: Q [ Atot ] V ( 11H 1 H ). Model sekwecyjego wiązaia ligadów zakłada astępcze reakcje wiązaia ligadów: K1 K K3 K A B AB AB AB W tym modelu brak rozróżieia, które miejsca są wysycae, iformacja dotyczy tylko całkowitej liczby miejsc wysycoych. W efekcie rozróżia się makroskopowe (K) i mikroskopowe stałe wiązaia (k). Obserwowae stałe wiązaia zdefiiowae podaymi powyżej wzorami to makroskopowe stałe. Stałe mikroskopowe opisują rówowagę, która byłby mierzoa dla pojedyczego miejsca wiązaia. Relację pomiędzy imi określa rówość: i 1 K i k i, i gdzie całkowita liczba miejsc wiążących, i koleje obsadzoe miejsce. Opisae rozróżieie stałych rówowagi jest rezultatem czyików statystyczych. Wiązae jako pierwsze cząsteczki ligada mogą obsadzać większą liczbę miejsc wiążących iż koleje. W przypadku białek często związaie pierwszej cząsteczki ligada wpływa a powiowactwo wiązaia kolejej, co określamy kooperatywością. Kooperatywość dodatia występuje, gdy kolejy ligad wiąże się z wyższą stałą wiązaia, atomiast w przeciwym wypadku mówimy o kooperatywości ujemej. Ilościowo kooperatywość określamy parametrem α, będącym stosukiem dwóch kolejych stałych mikroskopowych. Ilość ciepła wydzieloego podczas pojedyczego dodatku w tym modelu określa rówaie: Q A ] V( F H F [ H H ] F [ H H ]), gdzie F [ tot K K K K [ K1[ K1K [ K1K K [ Podczas miareczkowaia istoty wkład do rejestrowaego ciepła woszą także procesy rozcieńczaia składików reakcji, w szczególości ciepło rozcieńczaia titrata. Dlatego też aalizę wyików przeprowadza się po uwzględieiu tego efektu. Wykorzystaie rówań () i (3) do opisu eksperymetalej zależości wymieioego ciepła od stężeń reagetów, pozwala a obliczeie stałej rówowagi reakcji i molowej etalpii reakcji. Natomiast molowa etropia reakcji wyliczoa zostaje z podstawowej zależości termodyamiczej opisującą etalpię swobodą reakcji: G H T S RT l K Aby atomiast uzyskać wartość zmiay pojemości cieplej wykoujemy kilka doświadczeń w różych temperaturach korzystając z zależości: 5

6 C p ( H ). T Cel ćwiczeia. Celem ćwiczeia jest aaliza oddziaływaia camp z białkiem bakteryjym CRP. Wykoaie. 1. Zaplaować parametry eksperymetu (stężeia białka i ligada).. Sporządzić próbki o stężeiach określoych podczas plaowaia eksperymetu w ilości: ml dla białka i 0,5 ml dla ligadu. 3. Wykoać eksperymet miareczkowaia CRP przez camp z zużyciem mikrokalorymetru VP-ITC. 4. Dokoać aalizy otrzymaego rezultatu z wykorzystaiem oprogramowaia firmy Microcal. Sprawozdaie. 1. Opisać szczegółowo wykoaie ćwiczeia.. Na podstawie uzyskaych parametrów aalizy poszczególych modeli wybrać właściwy, uzasadiając wybór. 3. W oparciu o uzyskae wyiki przedyskutować parametry termodyamicze badaego układu. Zagadieia do przygotowaia: Podstawy termodyamiki. Fukcje termodyamicze. Rówowaga reakcji. Etalpia swoboda i jej związek z rówowagą reakcji. Etalpia va`t Hoffa. Rodzaje wiązań iekowalecyjych. Eergetyka wiązań kowalecyjych i iekowalecyjych. Termodyamika oddziaływaia białko-ligad (udział etalpii, etropii). 6