Matematyczny model ścieżki regulatorowej NF-κB z dodatnim sprzężeniem zwrotnym

Uniwersytet Warszawski Wydział Matematyki, Informatyki i Mechaniki Jakub Pękalski Nr albumu: 249341 Matematyczny model ścieżki regulatorowej NF-κB z dodatnim sprzężeniem zwrotnym Praca magisterska na kierunku MATEMATYKA W RAMACH MIĘDZYWYDZIAŁOWYCH INDYWIDUALNYCH STUDIÓW MATEMATYCZNO-PRZYRODNICZYCH w zakresie MATEMATYKI STOSOWANEJ Praca wykonana pod kierunkiem dra hab. Jacka Miękisza Instytut Matematyki Stosowanej i Mechaniki, Uniwersytet Warszawski oraz dra hab. Tomasza Lipniackiego Instytut Podstawowych Problemów Techniki Polskiej Akademii Nauk Warszawa, lipiec 2011

Oświadczenie kierującego pracą Potwierdzam, że niniejsza praca została przygotowana pod moim kierunkiem i kwalifikuje się do przedstawienia jej w postępowaniu o nadanie tytułu zawodowego. Data Podpis kierującego pracą Oświadczenie autora (autorów) pracy Świadom odpowiedzialności prawnej oświadczam, że niniejsza praca dyplomowa została napisana przeze mnie samodzielnie i nie zawiera treści uzyskanych w sposób niezgodny z obowiązującymi przepisami. Oświadczam również, że przedstawiona praca nie była wcześniej przedmiotem procedur związanych z uzyskaniem tytułu zawodowego w wyższej uczelni. Oświadczam ponadto, że niniejsza wersja pracy jest identyczna z załączoną wersją elektroniczną. Data Podpis autora (autorów) pracy

Moim promotorom dr hab. Tomaszowi Lipniackiemu oraz dr hab. Jackowi Miękiszowi za pomoc, cierpliwość i inspirację oraz koledze Pawłowi Żukowi za niezawodny symulator MC Dziękuję Niniejsza praca została sfinansowana w ramach Programu Team: TEAM/2009-3/6 Fundacji na rzecz Nauki Polskiej. 3

Streszczenie W pracy analizuję matematyczny model ścieżki regulatorowej czynnika transkrypcyjnego NF κb. Do zaproponowanego przez Tomasza Lipniackiego i współpracowników (Nature 2010) modelu dołączam pętlę dodatniego sprzężenia zwrotnego związanego z wewnątrzkomórkową produkcją ligandu TNF α. Po szczegółowym omówieniu rozważanych reakcji oraz uzasadnieniu wprowadzonych modyfikacji przeprowadzam analizę bifurkacyjną modelu deterministycznego. Ze względu na wysoką złożoność problemu (układ 24 nieliniowych równań różniczkowych zwyczajnych) ograniczam rozważania do symulacji numerycznych. W dalszej części pracy badam model stochastyczny oparty na teorii procesów Markowa z czasem ciągłym i dyskretną przestrzenią stanów. Analizę tego modelu opieram o symulacje numeryczne przeprowadzone zgodnie z algorytmem Gillespiego (J. Phys. Chem. 1977) omówionym w rozdziale 5. Uzyskane wyniki prowadzą mnie do badania stochastycznych efektów związanych z bistabilnością układu (skoki stochastycznych trajektorii pomiędzy deterministycznymi atraktorami) oraz występującymi w nim oscylacjami (rezonans stochastyczny). W końcowym rozdziale pracy przedstawiam wyniki dopasowania parametrów modelu do danych eksperymentalnych opublikowanych przez grupę M.R. White a (J. Cell. Sci. 2010). Wyniki te potwierdzają zasadność wprowadzonych w modelu zmian. Są one również podstawą do postawienia hipotezy na temat występowania autoaktywacji wśród innych komórek o wysokiej wewnętrznej produkcji TNF α (monocyty, makrofagi). Słowa kluczowe układy dynamiczne, bistabilność, proces Markowa, sieci regulatorowe, NF-κB 11.1 Matematyka Dziedzina pracy (kody wg programu Socrates-Erasmus) Klasyfikacja tematyczna 60J28 Application of continuous-time Markov processes on discrete state spaces 92C40 Biochemistry, molecular biology 93A30 Mathematical modeling (models od systems, model-matching, etc.) Tytuł pracy w języku angielskim Mathematical model of NF-κB regulatory pathway with positive feedback loop

Spis treści 1. Wprowadzenie..................................... 5 1.1. Motywacje biologiczne............................... 5 1.2. Motywacje matematyczne............................. 6 2. Ścieżka sygnałowa NF-κB.............................. 9 2.1. Opis modelu.................................... 9 2.2. Moduły szlaku sygnałowego NF-κB........................ 10 3. Analiza bifurkacyjna modelu............................ 17 3.1. Bifurkacje kowymiaru 1 prowadzące do oscylacji................. 17 3.2. Analiza bifurkacyjna ścieżki regulatorowej NF κb................ 20 4. Model stochastyczny................................. 25 4.1. Proces Markowa.................................. 25 4.2. Stochastyczny model ekspresji genu........................ 28 5. Symulacje numeryczne................................ 31 5.1. Algorytm Gillespiego................................ 31 5.2. Stochastyczne efekty................................ 33 6. Weryfikacja modelu.................................. 39 7. Podsumowanie..................................... 43 Bibliografia......................................... 45 3

Rozdział 1 Wprowadzenie 1.1. Motywacje biologiczne Czynnik transkrypcyjny NF κb Obiektem badań niniejszej pracy jest szlak sygnałowy czynnika transkrypcyjnego NF κb (Nuclear Factor kappa-b). Ten kompleks białek odkryty w 1986 roku przez Davida Baltimora występuje we wszystkich typach komórek od muszki owocowej do człowieka. Jest on uznawany za najważniejszy czynnik regulujący ekspresję genów związanych z wczesną odpowiedzią immunologiczną. Gdy NF κb przyczepia się do obszaru promotora danego genu, wówczas następuje jego aktywacja i rozpoczyna się proces produkcji białka. Stan, w którym NF κb znajduje się w jądrze komórkowym nie jest stanem stałym. Produkcja białek jest hamowana przez grupę inhibitorów NF κb (m.in. IκBα i A20), które wpływają na odłączenie NF κb od genu i jego powrót do cytoplazmy. Będziemy mówić, że komórka jest aktywna, gdy poziom NF κb w jądrze zmienia się w sposób oscylujący natomiast nieaktywna, gdy większość molekuł NF κb znajduje się poza jądrem komórkowym. NF κb jest czynnikiem transkrypcyjnym dla kilkuset genów. Aktywacja czynnika NF κb prowadzi do aktywacji genów odpowiadających za zapalenie, proliferację, odpowiedź antywirusową oraz antyapoptotyczną. NF κb może być aktywowany na dwa sposoby: przez sygnał pochodzący z innych komórek wydzielających cytokiny takie jak TNF α czy Interleukina 1 (IL-1), przyłączające się do receptorów typu TNFR1, IL-R; poprzez bezpośrednie oddziaływanie z patogenami (bakteriami, wirusami) bądź ich produktami (np. fragmentami błony komórkowej, dwuniciowym RNA). Ze względu właśnie na aktywację NF κb fizjologicznymi dawkami TNF α pochodzącymi od pobliskich komórek, w dalszej części pracy będziemy badać odpowiedź na zewnętrzny sygnał TNF α rzędu kilkudziesięciu pg/ml (10 9 gram/litr). Rola NF κb w komórkach nowotworowych Ligand TNF α jest najlepiej dotąd poznanym czynnikiem prowadzącym do apoptozy komórek. Apoptoza indukowana przez TNF α jest kontrolowana przez funkcjonowanie modułu regulatorowego NF κb. Komórki rakowe mają podwyższony poziom NF κb co, ze względu na antyapoptotyczną rolę NF κb, utrudnia chemio- i radioterapię. Zablokowanie ścieżki przekazu sygnału pomiędzy receptorem TNF α (T N F R1) a czynnikiem transkrypcyjnym NF κb wraz z jednoczesną stymulacją komórek TNF α pozwoliłoby wprowadzić komórkę rakową na 5

ścieżkę apoptozy. Dokładne poznanie szlaku sygnałowego NF κb jest więc istotne nie tylko ze względu na jego kluczową rolę procesie obrony immunologicznej, ale również ze względu na jego antyapoptotyczne działanie w komórkach nowotworów. Badania opublikowane w 2010 roku przez grupę M.R. White a [16] nad komórkami rakowymi typu SK-N-AS 1 pokazały, iż aktywacja komórki zależy od poziomu zewnętrznego sygnału TNF α. Przy czym blisko 100% populacji badanych komórek aktywuje się już przy dawce 100 pg/ml podczas ciągłej stymulacji. Co ciekawe, okazało się również, że blisko 20% ich populacji doznaje samoaktywacji (bez zewnętrznej stymulacji). W dalszej części pracy pokażę, iż takie zachowanie może być efektem istniejącego w tego typu komórkach dodatniego sprzężenia zwrotnego NF κb związanego z wewnętrzną produkcją TNF α. Stawiam również hipotezę, iż podobne zachowanie może być obserwowane w przypadku innych komórek o podwyższonej wewnętrznej produkcji TNF α (monocyty, makrofagi). 1.2. Motywacje matematyczne Podstawowym narzędziem służącym modelowaniu szlaków sygnałowych jest układ równań różniczkowych zwyczajnych. Opisując stężenia kolejnych białek biorących udział w przekazywaniu sygnału w głąb komórki poprzez nowe zmienne korzysta się z założenia o ich ciągłości. Jednak gdy przychodzi nam opisać np. stan genu, który może być tylko aktywny bądź nieaktywny lub procesy w których uczestniczy niewielka liczba molekuł, wydaje się to być założeniem nieuzasadnionym. Wówczas do opisu zachodzących reakcji stosuje się teorię procesów Markowa z dyskretną przestrzenią stanów. Do ogólnej analizy zachowań naszego modelu w przypadku deterministycznym korzysta się z bogatej teorii jakościowej równań różniczkowych. Jednak nawet podstawowe pojęcia tam występujące takie jak punkt stacjonarny czy cykl graniczny w teorii procesów stochastycznych nie mają swoich ścisłych analogów. Pojawia się więc pytanie, jakie są podobieństwa, a jakie są różnice w zachowaniach trajektorii deterministycznych i stochastycznych. Intuicja sugerująca, iż model ciągły jest dobrym przybliżeniem średniej ze stochastycznych trajektorii jest dla bistabilnych modeli całkowicie błędna. W przypadku, gdy w układzie mamy do czynienia z dwoma atraktorami, trajektorie potrafią pod wpływem występującej w modelu stochastyczności przeskakiwać pomiędzy obszarami, które w modelu ciągłym były basenami przyciągania atraktorów. Uśrednienie takiego zachowania w czasie mogłoby doprowadzić do mylnego wrażenia, że w modelu deterministycznym mamy do czynienia tylko z jednym stanem stabilnym. W pracy, korzystając z teorii bifurkacji kowymiaru 1, przedstawię opartą o numeryczne symulacje analizę bifurkacyjną deterministycznego modelu szlaku sygnałowego NF κb. Korzystając z teorii procesów Markowa z czasem ciągłym i dyskretną przestrzenią stanów przejdę przy pomocy algorytmu Gillespiego do symulacji modelu stochastycznego. Występująca w tym modelu bistabilność, spowodowana współistnieniem stabilnego punktu stacjonarnego oraz cyklu granicznego, doprowadzi mnie do analizy dwojakiego rodzaju efektów stochastycznych. Pierwszy z nich związany jest ze skokami stochastycznych trajektorii pomiędzy obszarami odpowiadającymi basenom przyciągania atraktorów modelu ciągłego. Drugi natomiast, zwany rezonansem stochastycznym, skutkuje pojawieniem się stochastycznych oscylacji dla takiego zakresu parametru bifurkacyjnego, dla którego w modelu deterministycznym cyklu granicznego nie ma. To właśnie dzięki tym czysto stochastycznym zachowaniom, niemożliwym do osiągnięcia 1 Komórki SK-N-AS to komórki nowotworowe neuroblastomy (nerwiaka płodowego). Komórki nowotworowe są często używane w eksperymentach przede wszystkim z powodu ich wysokiej przeżywalności 6

w modelach ciągłych, w ostatnim rozdziale pracy udało mi się dopasować nasz model ścieżki sygnałowej do danych eksperymentalnych. 7

Rozdział 2 Ścieżka sygnałowa NF-κB Procesy zachodzące w komórce są kontrolowane przez szlaki sygnałowe (moduły regulatorowe), czyli ciągi aktywacji i dezaktywacji kolejnych białek mające na celu wytworzenie odpowiedzi na zewnętrzną stymulację. Głównym obiektem badań mojej pracy jest szlak sygnałowy czynnika transkrypcyjnego NF-κB (Nuclear Factor κ-light-chain-enhancer of activated B cells), którego model stworzony przez Tomasza Lipniackiego i współpracowników, [15] szczegółowo omówię w tym rozdziale. 2.1. Opis modelu Poniższe równania (2.1-2.24) 1 stanowią autonomiczny układ równań różniczkowych zwyczajnych opisujący odpowiedź rakowej komórki eukariotycznej na zewnętrzną stymulację. Jest to model opublikowany w 2010 roku w Nature [15], zmodyfikowany o dodanie dodatniego sprzężenia zwrotnego związanego z T N F α. Schemat opisywanych reakcji został przedstawiony na rysunku 2.1. Uwzględnione w modelu sprzężenia zwrotne przedstawia schematycznie rysunek 2.2. 1 Przy zapisie równań została zastosowana następująca konwencja: ẋ oznacza pochodną zmiennej x względem czasu. Współczynniki równań zostały zapisane małymi arabskimi literami, za wyjątkiem λ opisującej szybkość transkrypcji T NF α. 9

T NF α ext = T deg T NF α ext (2.1) R act (M R act ) = T NF α int csec +k b T NF α ext (M R act ) k f R act (2.2) (M R act ) + c b IKKK a = k a R act (IKKK n ) IKKK n = k a R act (IKKK n ) k A20 k A20 + k AB A20 k i IKKK a (2.3) k A20 k A20 + k AB A20 + k i IKKK a (2.4) IKK n = k 1 IKKK 2 a IKK n + k 4 IKK ii (2.5) IKK a = k 1 IKKK 2 a IKK n k 3 k 2 IKK a A20 k 3 IKK a (2.6) IKK i = k 3 IKK a A20 + k 3 IKK a k 4 IKK i k 2 (2.7) IKK ii = k 4 IKK i k 4 IKK ii (2.8) IκBα ph = a 2 IKK a IκBα cyt t p IκBα ph (2.9) (IκBα ph NF κb) cyt = a 3 IKK a (IκBα NF κb) cyt t p (IκBα ph NF κb) cyt (2.10) NF κb cyt = c 6a (IκBα NF κb) cyt a 1 NF κb cyt IκBα cyt + t p (IκBα ph NF κb) cyt i 1 NF κb cyt (2.11) NF κb nuc = i 1 NF κb cyt a 1 k v IκBα nuc NF κb nuc (2.12) A20 = c 4 A20 t c 5 A20 (2.13) A20 t = c 1 G A20 c 3 A20 t (2.14) IκBα cyt = a 2 IKK a IκBα cyt a 1 IκBα cyt NF κb cyt + c 4 IκBα t c 5a IκBα cyt i 1a IκBα cyt + e 1a IκBα nuc (2.15) IκBα nuc = a 1 k v IκBα nuc NF κb cyt + i 1a IκBα cyt e 1a IκBα nuc (2.16) IκBα t = c 1a G IκBα c 3 IκBα t (2.17) (IκBα NF κb) cyt = a 1 IκBα cyt NF κb cyt c 6a (IκBα NF κb) cyt a 3 IKK a (IκBα NF κb) cyt + e 2a (IκBα NF κb) nuc (2.18) (IκBα NF κb) nuc = a 1 kv IκBα nuc NF κb nuc e 2a (IκBα NF κb) nuc (2.19) T NF α t = λ G T NF α c 3 T NF α t (2.20) T NF α int = c 4t T NF α t c 5t T NF α int c sec T NF α int (2.21) G A20 = q 1 NF κb nuc (AN G A20 ) q 2 IκBα nuc G A20 (2.22) G IκBα = q 1 NF κb nuc (ANa G IκBα ) q 2 IκBα nuc G IκBα (2.23) G T NF α = q 1t NF κb nuc (ANT G T NF α ) (q 2tt +q 2 IκBα nuc ) G T NF α (2.24) 2.2. Moduły szlaku sygnałowego NF-κB Aktywacja i dezaktywacja receptorów Zewnętrznym sygnałem stymulującym komórkę w naszym modelu jest ligand Tumor Necrosis Factor alpha (T NF α ext ). Parametry modelu są tak dopasowane, by trajektorie w sposób ilościowy opisywały reakcje pojedynczej komórki na stymulacje stężeniem T NF α ext rzędu 10

BŁONA KOMÓRKOWA CYTOPLAZMA AKTYWACJA REAKCJI HAMOWANIE REAKCJI REAKCJA JĄDRO KOMÓRKOWE Rysunek 2.1: Schemat modelu szlaku sygnałowego czynnika transkrypcyjnego NF κb. Receptory IKKK PRZEKAZ SYGNAŁU TNF NF-κB cyt A20 HAMOWANIE SYGNAŁU NF-κB nuc IκBα AKTYWACJA TRANSKRYPCJI DNA Rysunek 2.2: Schemat uwzględnionych w modelu sprzężeń zwrotnych. 11

kilkuset pg/ml. Jego obecność w pobliżu komórki jest wyłapywana poprzez znajdujące się na błonie komórkowej receptory. Całkowita liczba receptorów, (M) nawet dla komórek tego samego typu nowotworu może być różna, dlatego w modelu dla każdej komórki przed symulacją ten parametr jest losowany. Zakładamy wówczas, tak jak w [15] log-normalny rozkład liczby receptorów. Parametry tego rozkładu zostały dopasowane do wyników eksperymentów opublikowanych w [16]. Proces aktywacji receptorów w wyniku przyłączenia T NF α ext do nieaktywnych receptorów opisany jest w równaniu 2.2. W równaniu tym współczynnik szybkości aktywacji receptorów przez pochodzący z zewnętrznej stymulacji T NF α ext został oznaczony przez k b. Reakcja ta jest biliniowa, gdyż zakładamy, że przy zewnętrznej stymulacji wszystkie molekuły T NF α ext są przez nieaktywne receptory wyłapywane lub równoważnie, że w trakcie zewnętrznej stymulacji (trwającej tylko kilka minut) ilość podawanego T NF α ext jest bardzo duża. Przy długookresowych symulacjach postać tego członu równania 2.2 nie ma znaczenia, gdyż dla odpowiednio dużych czasów symulacji T NF α ext = 0. Dezaktywacja receptorów następuje samoistnie ze stałą szybkością reakcji k f. Człon równania 2.2 odpowiadający aktywacji receptorów przez pochodzący z wnętrza komórki T NF α int omówiony jest w części poświęconej dodatniemu sprzężeniu zwrotnemu. Kaskada sygnałowa Aktywacja receptorów powoduje przekazanie sygnału do wnętrza komórki poprzez trójstopniową kaskadę sygnałową składająca się z kinaz IKKK oraz IKK. Zakładamy, że białko IKKK może przyjmować dwie formy: aktywną IKKK a oraz neutralną IKKK n. Przyjmuje się, że IKKK n jest aktywowane, gdy znajduje się w pobliżu aktywnego receptora R act i reakcja ta zachodzi z szybkością k a (2.3, 2.4), natomiast współczynnik dezaktywacji jest stale równy k i. Dalszym etapem przekazywania sygnału jest aktywacja molekuł białka IKK, które może przyjmować już nie dwie, ale 4 formy: IKK a, IKK n, IKK i, IKK ii. Zakładamy za [1], że forma aktywna IKK a powstaje z neutralnej IKK n poprzez fosforylację dwóch cząsteczek IKKK a - stąd w równaniach (2.6) oraz (2.5) kwadratowa zależność od stężenia IKKK a. Forma nieaktywna IKK i powstaje z IKK a poprzez nadmierną fosforylację (2.7), natomiast IKK ii pełni rolę formy przejściowej pomiędzy IKK i a IKK n (2.5) powodując swoją obecnością opóźnienie w procesie aktywacji białka IKK. W modelu zakładamy, że łączna liczba molekuł wszystkich form IKK, podobnie jak IKKK, jest stała w czasie - w rzeczywistości oczywiście białka te degradują, jednak zakładamy, że ich produkcja jest równie szybka, co pozwala te procesy w równaniach zaniedbać. Kaskada sygnałowa prowadząca od aktywnych receptorów kończy się degradacją białka IκBα cyt wskutek oddziaływania z aktywną kinazą IKK a (2.15). Aktywacja i dezaktywacja genów Proces tworzenia nowych białek w komórce eukariotycznej rozpoczyna się w jądrze, gdzie znajduje się DNA. NF κb jako czynnik transkrypcyjny rozpoczyna ten proces dla wielu białek, między innymi dla rozpatrywanych przez nas: A20, IκBα oraz TNF α. W modelu zakładamy, że gen może przyjmować jeden z dwóch stanów: aktywny bądź nieaktywny. Gen staje się aktywny, gdy czynnik transkrypcyjny zwiąże się z DNA na obszarze promotora. Dezaktywacja natomiast następuje wskutek pojawienia się w jądrze komórkowym IκBα nuc, które wiążąc się z NF κb nuc odłącza je od obszaru promotora i tym samym zatrzymuje produkcję transkryptu. 12

Moduł opisujący proces aktywacji i dezaktywacji genów ze względu na biologicznie uzasadnione założenie, iż gen może przyjmować tylko dwa stany (0 - gdy jest nieaktywny, 1 - gdy jest aktywny) najlepiej jest opisywać jako stochastyczny proces Markowa z ciągłym czasem, ale dyskretną przestrzenią stanów. Takie podejście szczegółowo omawiam w rozdziale czwartym. W modelu deterministycznym zmuszeni jesteśmy do ciągłego przybliżenia tego procesu. Rozpatrujemy wówczas przyjmującą wartości z przedziału [0,1] zmienną opisująca częstość przebywania genu w stanach 0 i 1. Proces aktywacji i dezaktywacji genów w modelu ciągłym opisują równania (2.22), (2.23) i (2.24). Występujące w tych równaniach stałe AN, ANa oraz ANT oznaczają liczbę kopii genu znajdującego się w jądrze komórkowym odpowiednio dla A20, IκBα, TNF α. W modelu założono, że każdy z genów posiada dwie niezależnie aktywowane kopie. Jeśli jedna kopia G i (i = 1, 2) przyjmuje wartości z przedziału [0, 1], to zmienna opisująca stan zależnych od NF κb genów G = G 1 + G 2 może przyjmować wartości z przedziału [0, 2]. Pomimo braku eksperymentalnych przesłanek, by ograniczyć liczbę parametrów modelu założono, iż współczynniki aktywacji i dezaktywacji genów dla A20, IκBα są takie same. W przypadku TNF α wprowadziliśmy w równaniu (2.24) dodatkowo (za [11]) możliwość spontanicznego odczepienia NF κb od genu ze stałą szybkością q 2tt. Należy zwrócić uwagę, iż czynnik transkrypcyjny nie ma wpływu na szybkość transkrypcji, a jedynie na rozpoczęcie tego procesu lub jego zakończenie w momencie odczepienia od promotora genu. Pętle ujemnego sprzężenia W modelu ścieżki sygnałowej NF κb zostały uwzględnione dwie pętle ujemnego sprzężenia zwrotnego. (1) Pierwsza związana jest z produkcją białka A20. W modelu przyjęliśmy, że A20 jako inhibitor NF κb hamuje przekazywanie aktywującego sygnału w głąb komórki na dwóch różnych etapach: tłumi sygnał od aktywnych receptorów, wpływa na dezaktywacje kinazy IKK. W równaniu (2.3) za [17] uwzględniony został wpływ A20 na aktywację kinazy IKKK. Dokładny mechanizm tej reakcji nie jest jeszcze znany, wiemy jedynie, że A20 tłumi sygnał przekazywany od aktywnych receptorów, natomiast nie ma wpływu na ich aktywację. Reakcje opisujące wpływ A20 na proces dezaktywacji kinazy IKK zostały uwzględnione w równaniach (2.6) i (2.7). (2) Druga pętla ujemnego sprzężenia, która została przez nas uwzględniona jest związana z IκBα. Schemat składających się na nią reakcji przedstawia rysunek 2.3. IκBα oddziałuje z NF κb łącząc się z nim w kompleks na dwóch etapach ścieżki sygnałowej. w cytoplazmie hamując przez to translokację NF κb cyt do jądra komórkowego, w jądrze komórkowym powodując odłączenie NF κb nuc od promotora. NF κb cyt może przejść z cytoplazmy do jądra tylko, gdy nie jest związane z IκBα cyt. W obszarze cytoplazmy IκBα cyt łączy się z NF κb cyt tworząc kompleks (IκBα NF κb) cyt. Kompleks ten może się rozpaść samoistnie w tej postaci lub dopiero po sfosforylowaniu IκBα cyt. Uwolnione NF κb cyt przedostaje się do jądra komórkowego. W jądrze NF κb nuc aktywuje transkrypcję genu IκBα, która zostaje przerwana, gdy do NF κb nuc przyłączy się IκBα nuc. 13

Rysunek 2.3: Schemat modelu pętli ujemnego sprzężenia związanego z IκBα. Pętla dodatniego sprzężenia Uwzględnienie w strukturze ścieżki sygnałowej NF κb pętli dodatniego sprzężenia związanej z TNF α jest modyfikacją, która odróżnia nasz model od do tej pory istniejących. Motywacją do tej zmiany były pojawiające się wyniki eksperymentów na komórkach SK-N-AS (neuroblastomy) [16], których spontaniczna samoaktywacja wskazywała na istnienie właśnie takiego sprzężenia. Reakcje opisujące dodatnie sprzężenie zwrotne zostały uwzględnione w równaniach (2.2), (2.20), (2.21) oraz (2.24). Na rysunku 2.1 zostały one oznaczone czerwonym kolorem jako nowo dodane w stosunku do modelu z [15]. Rozpoczynając od aktywacji genu TNF α, kolejne czerwone strzałki na rys. 2.1 przedstawiają uwzględnione przez nas procesy: transkrypcji T NF α t, transportu z jądra komórkowego do cytoplazmy oraz translacji TNF α, aktywacji własnych receptorów na membranie przez TNF α wydzielany na zewnątrz komórki (prawa strzałka) aktywacji receptorów pobliskich komórek przez TNF α wydzielany na zewnątrz (lewa strzałka) W modelu wpływ T NF α int na aktywacje receptorów opisuje równanie (2.2), w którym T NF α int c sec oznacza ilość TNF α wydzielanego przez komórkę w trakcie sekundy. Natomiast act) (M R (M R act)+c b to ta część wydzielonego z komórki TNF α, która jest wyłapywana przez nieaktywne receptory komórki. Zauważmy, że (M R act ) (M R act ) + c b < 1, (2.25) 14

czyli nieaktywne receptory nie wyłapują wszystkich molekuły TNF α - część z nich może aktywować komórki znajdujące się w pobliżu 2. Taka postać równania (2.2) odpowiadającego za autoaktywację komórki, w odróżnieniu od biliniowej postaci stymulacji zewnętrznej, została przyjęta ze względu na małe (fizjologiczne, rzędu kilkudziesięciu pg/ml) dawki T NF α int występujące w przypadku długookresowych symulacji życia komórki. W dalszej części pracy, traktując współczynnik szybkości transkrypcji λ jako parametr bifurkacyjny, będę badał jaki wpływ na jakościowe zachowanie modelu ma uwzględnienie powyższego sprzężenia. 2 Proces wzajemnej aktywacji sąsiadujących ze sobą komórek nie został w naszym modelu uwzględniony, jest on jednak ważnym czynnikiem, który warto zanalizować w kolejnych jego modyfikacjach. 15

Rozdział 3 Analiza bifurkacyjna modelu W tym rozdziale przedstawię wyniki analizy bifurkacyjnej deterministycznego modelu ścieżki sygnałowej NF κb. Ze względów interpretacyjnych najbardziej interesujące są dla nas występujące w układzie atraktory. Dokładając do istniejących już w układzie ujemnych sprzężeń zwrotnych sprzężenie dodatnie mieliśmy nadzieję, że w układzie pojawi się stabilny cykl graniczny. Jego współistnienie ze stabilnym punktem stałym wskazywałoby na możliwość stałej aktywacji komórki w przypadku modelu deterministycznego, natomiast nietrwałej samoaktywacji w przypadku modelu stochastycznego. By zweryfikować nasze przypuszczenia przeprowadzona została przy pomocy numerycznych symulacji analiza bifurkacyjna układu. W poniższym paragrafie na podstawie [6], [18] oraz [19] przybliżam teorię bifurkacji kowymiaru 1, która pozwoliła mi stwierdzić, w wyniku jakiej bifurkacji narodził się w naszym układzie cykl graniczny. 3.1. Bifurkacje kowymiaru 1 prowadzące do oscylacji Gdy portret fazowy układu równań różniczkowych jest stabilny względem zaburzeń parametrów w nim występujących mówimy, że układ jest strukturalnie stabilny, w przeciwnym wypadku w układzie zachodzą bifurkacje. Spośród bifurkacji kowymiaru 1, to znaczy bifurkacji powstałych w wyniku zaburzenia tylko jednego z parametrów, można wyróżnić bifurkacje prowadzące w układzie do oscylacji. Na rysunku 3.1 (za [18]) przedstawione zostało zestawienie czterech głównych typów bifurkacji dla układu równań różniczkowych. Nadkrytyczna bifurkacja Hopfa Nadkrytyczna bifurkacja Hopfa (nazywana również bifurkacją Andronova-Hopfa lub bifurkacją narodzin cyklu granicznego) jest przykładem bifurkacji lokalnej, tzn. zachodzącej w otoczeniu punktu osobliwego. Analitycznie warunkiem jej wystąpienia jest, by dla bifurkacyjnej wartości parametru zlinearyzowany układ posiadał jedną parę sprzężonych, niezerowych, czysto urojonych wartości własnych: λ 1 = λ 2 = iω ir i Reλ j 0 dla j > 2 oraz µ Reλ 1,2(µ) µ=0 < 0. Jakościowo natomiast bifurkacja ta wyróżnia się narodzinami stabilnego cyklu granicznego z zerową amplitudą i skończonym niezerowym okresem w punkcie bifurkacji. Równocześnie stabilny punkt, który dał początek temu cyklowi traci swoją stabilność. 17

< < λ0 λ λ < λ 0 λ λ= λ 0 λ λ λ 0 λ < (a) Bifurkacja siodło węzeł dla orbity okresowej. λ 0 λ λ < λ 0 λ λ λ 0 λ (b) Bifurkacja nadkrytyczna Hopfa. λ 0 λ λ < λ 0 λ λ λ 0 λ (c) Bifurkacja podkrytyczna Hopfa. λ < λ 0 λ λ λ 0 λ λ λ 0 (d) Bifurkacja siodło węzeł na cyklu niezmienniczym. < λ λ < λ 0 λ λ λ 0 λ λ λ 0 (e) Bifurkacja homokliniczna. < λ Rysunek 3.1: Bifurkacje kowymiaru 18 1 prowadzące do oscylacji.

Podkrytyczna bifurkacja Hopfa Podkrytyczna bifurkacja Hopfa jest lokalną bifurkacją narodzin niestabilnego cyklu granicznego. Analityczne warunki jej wystąpienia są analogiczne do bifurkacji nadkrytycznej, tzn. λ 1 = λ 2 = iω ir i Reλ j 0 dla j > 2, z tą różnicą, że µ Reλ 1,2(µ) µ=0 > 0. Jakościowo bifurkacja ta polega na utracie stabilności przez stabilny punkt stacjonarny w wyniku scalenia z zanikającym niestabilnym cyklem granicznym. Bifurkacja siodło-węzeł Bifurkacja siodło-węzeł nie prowadzi do powstania w układzie zamkniętej orbity, stanowi ona jednak podstawę do zrozumienia sytuacji analogicznych zachodzących dla cykli granicznych. Bifurkacja siodło-węzeł jest przykładem bifurkacji lokalnej. Analitycznym warunkiem jej wystąpienia jest by zlinearyzowany w punkcie bifurkacyjnym układ posiadał jedną zerową wartość własną, natomiast pozostałe wartości własne powinny mieć niezerowe części rzeczywiste: λ 1 = 0 i Reλ j 0 dla j > 1. Jakościowo bifurkacja ta polega na wzajemnym zniesieniu się punktu siodłowego i węzłowego, które w punkcie bifurkacyjnym tworzą tzw. siodło-węzeł, a następnie anihilują. Bifurkacja siodło-węzeł dla orbity okresowej (Cyclic Fold) Bardzo często w pobliżu podkrytycznej bifurkacji Hopfa występuje bifurkacja, w wyniku której nowopowstały niestabilny cykl graniczny zanika. Bifurkacja siodło węzeł dla orbity okresowej jest przykładem bifurkacji nielokalnej, dlatego też analityczny warunek na jej wystąpienie opiera się na przekształceniu powrotu Poincarego. Mianowicie do jej wystąpienia potrzeba, by jedna z wartości własnych liniowej części przekształcenia powrotu dla wartości bifurkacyjnej parametru była równa 1: λ 1 = 1 i λ j 1 dla j > 1. Jakościowo bifurkacja ta polega na wzajemnym zniesieniu się dwóch cykli granicznych: stabilnego i niestabilnego, które dla wartości bifurkacyjnej parametru w przekroju Poincarego tworzą siodło-węzeł. Bifurkacja siodło węzeł na cyklu niezmienniczym Jeśli dwa punkty stacjonarne siodło i stabilny węzeł są połączone dwiema heteroklinicznym orbitami, wówczas punkty te mogą znieść się wzajemnie poprzez bifurkację siodło-węzeł na cyklu niezminniczym. Rezultatem tej bifurkacji jest cykl stabilny, który w punkcie bifurkacyjnym posiada na swojej orbicie punkt siodłowy (pojawia się orbita homokliniczna). Cechą charakterystyczną dla tego typu bifurkacji są więc narodziny stabilnego cyklu o skończonej niezerowej amplitudzie i nieskończonym okresie. Bifurkacja homokliniczna W bifurkacji homoklinicznej punkt siodłowy łączy się z niestabilnym punktem stacjonarnym tworząc w punkcie bifurkacyjnym homokliniczną orbitę, a następnie stabilny cykl graniczny. Podobnie więc jak w bifurkacji siodło węzeł na cyklu niezmienniczym mamy doczynienia ze stabilnym cyklem o nieskończonym okresie i skończonej amplitudzie, jednak w tym wypadku w układzie przed pojawieniem się cyklu nie ma atraktorów. 19

3.2. Analiza bifurkacyjna ścieżki regulatorowej NF κb Głównym celem mojej pracy jest ustalenie, jaki wpływ na jakościowe zachowanie modelu ścieżki sygnałowej NF κb ma dołączenie do niego dodatniego sprzężenia zwrotnego związanego z produkcją w jądrze komórki ligandu TNF α. Jako parametr regulujący siłę tego sprzężenia wybraliśmy λ, współczynnik szybkości transkrypcji TNF α. Badając więc numerycznie, jaki wpływ na zmianę portretu fazowego układu ma zmiana parametru λ, uzyskałem portret bifurkacyjny modelu. Wyniki analizy Rysunek 3.2 przedstawia wyniki analizy bifurkacyjnej naszego modelu ścieżki regulatorowej czynnika transkrypcyjnego NF κb. Do przedstawienia wyników wybrane zostały cztery najważniejsze w modelu zmienne: frakcja jądrowa NF κb nuc oraz odpowiedzialne ze sprzężenia zwrotne: IκBα cyt, A20 i TNF α. Powyższe portrety są wynikiem numerycznych symulacjach modelu. Weryfikacja hipotez co do występujących w modelu bifurkacji przebiegała następująco: 1) Poprzez losowe wybieranie warunków początkowych zostały znalezione występujące w układzie atraktory. Okazało się, że wraz ze wzrostem wartości parametru bifurkacyjnego w układzie możemy zaobserwować kolejno: monostabilność związana z istnieniem stabilnego punktu stacjonarnego ( λ [0, λ 1 )); bistabilność w wyniku koegzystencji stabilnego punktu stacjonarnego oraz stabilnego cyklu granicznego ( λ [λ 1, λ 2 ]); monostabilność związaną ze stabilnym cyklem granicznym ( λ (λ 2, λ 3 ]); monostabilność związaną z punktem stabilnym ( λ > λ 3 ). Prowadzi nas to do wniosku, że w układzie występują trzy różne bifurkacje. 2) Zbiór wartości przyjmowanych zarówno przez punkt stacjonarny, jak i cykl stabilny dla różnych wartości λ, udało się uzyskać poprzez sprytne zastosowanie numerycznych symulacji układu. Mianowicie uzmienniony został parametr bifurkacyjny. Taki zabieg sprawił, iż trajektoria, której wartości początkowe pokrywały się z którymś z atraktorów, w miarę powolnej zmiany parametru bifurkacyjnego, w trakcie symulacji pozostawała na atraktorze. Przeprowadzenie takich symulacji pozwoliło odtworzyć amplitudę oscylacji cyklu stabilnego, oraz położenie punktu stacjonarnego w zależności od wartości parametru bifurkacyjnego λ. Co ciekawe, udało się również tym sposobem odtworzyć położenie niestabilnego punktu stacjonarnego. 3) W wyniku tych symulacji udało się ustalić, iż występujący w układzie cykl stabilny rodzi się w punkcie λ 3 (por. rysunek 3.2) ze stabilnego punktu stacjonarnego z zerową amplitudą. Taka sytuacja jednoznacznie wskazuje, że punkt λ 3 jest punktem bifurkacji nadkrytycznej Hopfa. 4) By ustalić, w wyniku jakiej bifurkacji pojawił się z niezerową amplitudą cykl stabilny w punkcie λ 1 został zmierzony okres oscylacji w pobliżu punktu narodzin cyklu. Wyniki tego pomiaru przedstawia rysunek 3.3. Skończony okres w punkcie bifurkacyjnym wyklucza bifurkację siodło węzeł na cyklu niezmienniczym oraz bifurkację homokliniczną. Pozostaje tylko bifurkacja siodło-węzeł dla orbity okresowej. 20

1 0 0.041 0.094 0.2 (a) (b) (c) (d) TNFα int Nuclear NF κb fraction nuc cyt IκBα NF-κB A20 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0.041 0.094 0.2 0.34 5 4 λ1 λ2 λ 3 λ λ 1 2 λ 3 TNFα 0 0 0.041 0.094 0.2 λ1 λ2 λ 3 0.041 0.094 0.2 λ1 λ2 λ 3 Rysunek 3.2: Portrety bifurkacyjne dla wybranych zmiennych modelu: (a) IκBα cyt, (b) NF κb nuc, (c) A20, (d) T NF α int. Oznaczenia: ciągła linia - stacjonarny punkt stabilny, przerywana linia - stacjonarny punkt niestabilny, pełne koło - amplituda cyklu stabilnego, puste koło - amplituda cyklu niestabilnego. Występujące w układzie bifurkacje: λ 1 - bifurkacja siodło węzeł dla orbity okresowej; λ 2 - bifurkacja podkrytyczna Hopfa; λ 3 - bifurkacja nadkrytyczna Hopfa. 21

Rysunek 3.3: Okres oscylacji stabilnego cyklu granicznego. 5) Do rozpoznania pozostała już tylko bifurkacja w punkcie λ 2. Wiemy, że wiąże się ona z nabyciem stabilności przez niestabilny punkt stacjonarny oraz że w jej wyniku nie powstaje żaden dodatkowy atraktor. Wskazuje to bezpośrednio na bifurkacje podkrytyczną Hopfa. Jak wiemy wiąże się ona również z narodzinami niestabilnego cyklu granicznego. Te jednak zazwyczaj przy pomocy numerycznych symulacji trudno jest zidentyfikować. W naszym modelu trajektorie znajdujące się w pobliżu niestabilnego cyklu, zanim zostały pochłonięte przez atraktor, w którego basenie przyciąganie akurat się znajdowały, spędzały w otoczeniu niestabilnego cyklu znaczącą ilość czasu. Przykłady takiej trajektorii przedstawione zostały na rysunku 3.4. Rysunek 3.4a przedstawia trajektorie, która po spędzeniu w pobliżu niestabilnej orbity około 120 godzin życia komórki spadła na stabilny punkt, natomiast rysunek 3.4b przedstawia trajektorie, która dopiero po niemal 200 godzinach, z otoczenia niestabilnego cyklu przeskoczyła na orbitę stabilną. Takie zachowanie tłumaczone jest w [12] jako quasistabilność orbity niestabilnej. A dla nas dodatkowo potwierdziło wynik przeprowadzonego wyżej rozumowania oraz umożliwiło dokładne określenie położenia orbity niestabilnej. 22

8x10 4 IκBα 18x10 4 0 0 Czas [ godziny ] 160 (a) A20 0 0 Czas [ godziny ] 350 (b) Rysunek 3.4: Trajektoria oscyluje w otoczeniu niestabilnego cyklu granicznego, a następnie przeskakuje (a) do punktu stabilnego lub (c) do cyklu stabilnego. 23

Rozdział 4 Model stochastyczny W przyrodzie żadna komórka nie jest identyczna. Nawet gdy ograniczymy sie do jednego typu komórek raka mózgu, to wciąż nie ma reguły, która by mówiła jakie stężenie konkretnego białka powinna każda komórka w danym momencie swojego życia zawierać. Co więcej reakcja takich komórek na dokładnie taki sam zewnętrzny bodziec również nie musi być identyczna - może nią być proliferacja jak i apoptoza. Dlatego też modelowanie cyklu komórki jako procesu czysto deterministycznego, a zatem poprzez układ równań różniczkowych zwyczajnych, nie jest w stanie w pełni oddać różnorodności jej zachowań. Aby móc uwzględnić losowość zachodzących w komórce reakcji oraz uniezależnić trajektorie modelu od zadanych warunków początkowych, należy odwołać się do teorii procesów stochastycznych Markowa. Treścią niniejszego rozdziału jest krótkie wprowadzenie do tej teorii (w oparciu o [2]) wraz z jej zastosowaniem do modelu ścieżki regulatorowej NF κb. 4.1. Proces Markowa Definicje i oznaczenia Niech (Ω, F, P) będzie przestrzenią probabilistyczną, (S, E) przestrzenią mierzalną, a T dowolnym zbiorem. Wówczas: Definicja 4.1.1 Procesem stochastycznym o wartościach w S, określonym na zbiorze T nazywamy rodzinę zmiennych losowych (X t ) t T przyjmujących wartości w zbiorze S. W interesującym nas przypadku parametr t traktujemy jako ciągłą zmienną czasową i wtedy T jest podzbiorem zbioru nieujemnych liczb rzeczywistych R 0. Przestrzeń (S, E) natomiast nazywamy przestrzenią stanów. Definicja 4.1.2 Proces (X t ) t 0 jest Markowa (ma własność Markowa) jeśli dla E S, ξ S oraz t, τ T takich, że t > τ zachodzi P(X t E X τ = ξ) = P(X t E X η, 0 < η τ) (4.1) Wówczas dobrze zdefiniowana jest funkcja prawdopodobieństwa: P(X t E) := P(X t E X τ = ω)d Ω P(Ω, τ) (4.2) S Z której dzieląc przedział [τ, t] punktem s [τ, t] dostajemy równość P(X t E X τ = ξ) = P(X t E X s = ω)d Ω P(X s Ω, X τ = ξ) (4.3) S 25

zwaną równaniem Chapmana - Kołmogorowa. Rozpatrzmy teraz zmiany wartości procesu X, w małym przedziale czasowym. Załóżmy, że prawdopodobieństwo nastąpienia więcej niż jednej zmiany wartości procesu jest wielkością zmierzającą do zera szybciej niż t. Wówczas wprowadzając funkcję intensywności zmian wartości procesu q(x t = ξ) możemy zapisać q(x t = ξ) t + o( t) - prawdopodobieństwo, że proces X zmieni swoją wartość w przedziale czasowym (t, t) pod warunkiem, że w chwili t przyjął wartość ξ. Ponadto, niech Q(E X t = ξ) oznacza prawdopodobieństwo, ze jeśli w chwili t proces X przyjął wartość ξ oraz w przedziale czasowym (t, t) zmienił swoją wartość, to X t+ t E. Tak przyjęte oznaczenia pozwalają nam zapisać równanie: P(X t+ t E X t = ξ) = (1 q(x t = ξ) t)χ E (ξ) + Q(E X t = ξ)q(x t = ξ) t + o( t), (4.4) gdzie χ E (ξ) oznacza funkcje charakterystyczną zbioru E, tzn. { 1, dla ξ E χ E (ξ) = 0, w.p.p. w literaturze równanie (4.4) znane jest jako równanie Master. Proces Poissona Proces Poissona jest najbardziej znanym przykładem procesu Markowa o co najwyżej przeliczalnej przestrzeni stanów. Można go uzyskać poprzez postawienie dodatkowego warunku o niezależności prawdopodobieństw przejść od aktualnego stanu układu oraz zdefiniowanie funkcji intensywności. Dla procesu Poissona: q(x t = ξ) = λ (λ = const > 0). (4.5) Wówczas przyjmując tradycyjne oznaczenie P n (t) prawdopodobieństwa, że proces w chwili t jest w stanie n N, równanie Master dla n 1 ma następującą postać: P n (t + t) = (1 λ t)p n (t) + λp n 1 (t) t + o( t). (4.6) Zaś dla n = 0 (gdy przejście do stanu n-1 jest nie możliwe), dostajemy P 0 (t + t) = (1 λ t)p 0 (t) + o( t). (4.7) Równania te po odpowiednim uporządkowaniu i przejściu z t do granicy w zerze sprowadza się do postaci d dt P n(t) = λp n (t) + λp n 1 (t) (4.8) oraz d dt P 0(t) = λp 0 (t), (4.9) dla n 1 i n = 0 odpowiednio. Rozwiązaniem tego nieskończonego układu równań, gdy za warunek początkowy weźmiemy P 0 (0) = 1, jest rozkład Poissona P n (t) = (λt)n e λt. (4.10) n! Proces Poissona jest tzw. procesem zliczającym. Pozwala on modelować reakcje trwające nieskończenie krótko i zachodzące w losowym czasie. Interesuje nas jednak tylko ich łączna liczba i zakładamy, że są tego samego rodzaju. 26

Proces urodzin Pierwszym krokiem uogólniającym założenia procesu Poissona jest dozwolenie aby funkcja intensywności zmian procesu q, mogła zależeć również od stanu w jakim w danej chwili się układ znajduje. Wówczas można interpretować P n (t) jako prawdopodobieństwo, że w chwili t populacja danego gatunku składa się z dokładnie n osobników, zaś q t jest prawdopodobieństwem narodzin nowego osobnika. Takie podejście prowadzi jednak do rozpatrywania nieskończenie dużych populacji, dlatego zajmiemy się przypadkiem bardziej realistycznym, który uwzględnia również możliwość śmierci osobnika, a zarazem daje możliwość modelowania reakcji biochemicznych. Proces urodzin i śmierci Niech funkcja intensywności przejść będzie następującej postaci: λ i dla j = i + 1 q(x t+ t = j X t = i) = µ i dla j = i 1 0 w.p.p. Wówczas prawdopodobieństwo urodzin w przedziale (t, t + t), czyli przejścia ze stanu n do stanu n + 1 wynosi λ n t + o( t), natomiast prawdopodobieństwo śmierci, czyli przejścia ze stanu n do stanu n 1 jest równe µ n t + o( t). Aby obliczyć P n (t + t) należy zauważyć, że układ może znajdować się w stanie n wtedy i tylko wtedy, gdy zaszło któreś z poniższych zdarzeń: w chwili t układ był w stanie n i żadna zmiana w przedziale czasowym (t, t + t) nie zaszła; w chwili t układ był w stanie n-1 i przeszedł do stanu n (urodziny) w chwili t układ był w stanie n+1 i przeszedł do stanu n (śmierć) w czasie (t, t + t) zaszła więcej niż jedna zmiana, ale w ich efekcie układ znalazł się w stanie n. Z uwagi na to, że pierwsze trzy możliwości są zdarzeniami rozłącznymi, natomiast prawdopodobieństwo ostatniego dąży do zera szybciej niż t, możemy wypisać równanie M dla procesu urodzin i śmierci: P n (t + t) = P n (t)(1 λ n t µ n t) + λ n 1 tp n 1 (t) + µ n+1 tp n+1 (t) + o(t). (4.11) Po odpowiednim uporządkowaniu i przejściu granicznym z t to zera, dostajemy równanie różniczkowe d dt P n(t) = (λ n + µ n )P n (t) + λ n 1 P n 1 (t) + µ n+1 P n+1 (t) (4.12) dla n 1, zaś dla n = 0: d dt P 0(t) = λ 0 P 0 (t) + µ 1 P 1 (t). (4.13) 27

4.2. Stochastyczny model ekspresji genu Rozpatrując komórkę jako złożony reaktor biochemiczny można oddziaływania pomiędzy znajdującymi się w jej wnętrzu białkami rozpatrywać jako oddzielne reakcje. Mówienie o stężeniu białka, gdy jego cząsteczek jest w komórce kilkadziesiąt tysięcy jest uzasadnione i w takich przypadkach deterministyczne modelowanie uwzględniających je reakcji daje zadowalające rezultaty. Jednak w przypadku gdy cząsteczek biorących udział w rozpatrywanych reakcjach jest mniej, lub gdy rozpatrujemy proces aktywacji genu, o którym zakładamy, że może przyjąć tylko jeden z dwóch stanów: aktywny bądź nieaktywny, modelowanie w sposób ciągły jest całkowicie nieuzasadnione. By przejść do opisu zachowania pojedynczych molekuł w układzie należy przejść do stochastycznego opisu zachodzących reakcji, opartego na teorii procesów Markowa z dyskretną przestrzenią stanów. Na podstawie klasycznego modelu reakcji związanych z aktywacją genu [6], będących głównym źródłem stochastyczności w komórce, przedstawię w tym paragrafie zasady na jakich opiera się budowa całego stochastycznego modelu sieci regulatorowej NF κb. Proces aktywacji genu Kontrola aktywności genu w komórce odbywa się poprzez przyłączanie lub dysocjację czynnika transkrypcyjnego. Analogicznie do procesu urodzin i śmierci rozpatrujemy procesy aktywacji i dezaktywacji genu, transkrypcji i degradacji mrna oraz translacji i degradacji białka. W tym modelu współczynniki aktywacji i dezaktywacji uzależniamy od liczby cząsteczek syntetyzowanego białka (uwzględniamy autoregulacje). Model opisywany jest przez trzy zmienne: m(t) N - liczba cząsteczek mrna rozpatrywanego białka; p(t) N - liczba cząsteczek białka; G(t) {0, 1} - binarna zmienna losowa opisująca stan genu. Między którymi zachodzą reakcje przedstawione na rysunku 4.1 o następujących współczynnikach: a(p) - współczynnik aktywacji genu zależny od ilości białka; b(p) - współczynnik dezaktywacji genu zależny od ilości białka; t 1 - tempo transkrypcji mrna; t 2 - tempo translacji białka; r 1 - tempo degradacji mrna; r 2 - tempo degradacji białka. Celem jest wypisanie równań Master opisujących ewolucje w czasie prawdopodobieństwa, że nasz układ znajdzie się stanie zadanym przez zmienne (m, p, G). Oznaczmy przez x mp (t) łączne prawdopodobieństwo, że w układzie w chwili t znajduje się m cząsteczek mrna, p cząsteczek białka, a gen jest aktywny (układ jest w stanie (m, p, 1)), zaś przez y mp (t) 28

a(p) 0 1 b(p) t1 t 2 m r p r 1 2 Rysunek 4.1: Schemat modelu aktywacji genu z autoregulacją. prawdopodobieństwo, że układ jest w stanie (m, p, 0). Równanie M: d dt x mp(t) = ay mp bx mp + t 1 x (m 1)p t 1 x mp + r 1 (m + 1)x (m+1)p r 1 mx mp (4.14) +r 2 (p + 1)x m(p+1) r 2 px mp + t 2 mx m(p 1) t 2 mx mp d dt y mp(t) = ay mp + bx mp + r 1 (m + 1)y (m+1)p r 1 my mp (4.15) +r 2 (p + 1)y m(p+1) r 2 py mp + t 2 my m(p 1) t 2 my mp Proces aktywacji genu diploidalnego W modelu ścieżki regulatorowej NF κb założyliśmy, że w jądrze komórkowym znajdują się po dwie kopie genów A20, IκBα oraz TNF α. Oznacza to, że zmienna G opisująca stan danego genu, może przyjmować wartości ze zbioru 0, 1, 2. Wartość 0 jest przyjmowana, gdy obie kopie genu są nie aktywne, 1 gdy jedna z nich jest aktywna, natomiast 2 gdy obie kopie są włączone. Reakcje zachodzące w tym modelu przedstawia schemat na rysunku 4.2. Pełen opis tego przypadku, jak również jego uogólnienie na N kopii genu, można znaleźć w [6]. 2a(p) a(p) 0 1 2 b(p) t 1 2b(p) 2t 1 m r t 2 p r 1 2 Rysunek 4.2: Schemat modelu aktywacji diploidalnego genu z autoregulacją. 29

Rozdział 5 Symulacje numeryczne Rozpatrywanie prawdopodobieństw, że układ w danej chwili czasowej znajduje się w określonym stanie, prowadzi do stworzenia nieskończonego układu równań M. Rozwiązanie analityczne takiego układu ze względu na jego niedomknięcie lub zbyt duża złożoność jest najczęściej niemożliwe. W takich przypadkach z pomocą przychodzą algorytmy numeryczne. Powszechnie stosowaną metodą symulacji stochastycznych reakcji zachodzących w komórkach jest algorytm Gillespiego [5]. W poniższym rozdziale przedstawię założenia oraz kolejne kroki tego algorytmu, jak również wyniki opartych na nim symulacji numerycznych. 5.1. Algorytm Gillespiego Pierwotnie Dan Gillespie opublikował swój algorytm w 1977 roku [5] jako sposób na modelowanie reakcji chemicznych. Jego pomysł polegał na tym, by nie analizować prawdopodobieństw przyjęcia danego stanu przez wszystkie zmienne osobno, lecz rozpatrywać jednie jedną trajektorie układu, zaś koncentracje cząsteczek biorących udział w reakcjach estymować. Niech więc S(t) będzie wektorem stanu, a S(0) stanem początkowym układu. Wówczas w danej chwili t, a więc każdym kroku symulacji, układ znajduje się w dokładnie jednym określonym stanie. Zanim w wyniku zajścia jednej z reakcji nastąpi zmiana tego stanu, muszą zostać podjęte dwie decyzje: 1) po jakim czasie ma zajść następna reakcja, 2) która z reakcji ma zajść. By móc to zrobić oznaczmy przez q(i, τ)dτ prawdopodobieństwo, że i-ta reakcja zaszła w infinitezymalnym przedziale czasowym dτ po czasie τ, tzn. w chwili T (t + τ, t + τ + dτ). Możemy wówczas q(i, τ)dτ zapisać jako iloczyn prawdopodobieństw P 0 (τ) - że w czasie τ żadna reakcja nie zaszła oraz P i (dτ) - że i-ta reakcja zaszła w przedziale dτ: q(i, τ)dτ = P 0 (τ)p i (dτ). (5.1) Prawdopodobieństwo zajścia reakcji w przedziale czasowym dτ wygodnie jest zapisać za pomocą tzw. skłonności zajścia reakcji a i, zdefiniowanej równaniem P i (dτ) = a i dτ. Wówczas prawdopodobieństwo P (dτ) zajścia, którejkolwiek z rozpatrywanych N reakcji w przedziale dτ, zapisuje się jako sumę prawdopodobieństw N N P (dτ) = P i (dτ) = a i dτ adτ. (5.2) i=1 i=1 31

Można więc zapisać wyrażenie na prawdopodobieństwo, iż żadna reakcja nie zajdzie w przedziale (t, t + τ + dτ) w następujący sposób P 0 (τ + dτ) = P 0 (τ)(1 adτ). (5.3) Równanie to po uporządkowaniu i przejściu z dτ do granicy w zerze daje się zapisać jako następujące równanie różniczkowe: d dτ P 0(τ) = ap 0 (τ), (5.4) którego rozwiązaniem, przy naturalnym warunku początkowym P 0 (0) = 1, jest P 0 (τ) = e aτ. Stąd, sumując równanie (5.1) po wszystkich reakcjach dostajemy M M q(τ)dτ q(i, τ)dτ = P 0 (τ) P i (dτ) = e aτ adτ, (5.5) i=1 i=1 czyli rozkład gęstości czasu oczekiwania na kolejne zajście kolejnych reakcji jest ekspotencjalny q(τ) = ae aτ. (5.6) Rozkład reakcji dostajemy poprzez prawdopodobieństwo warunkowe zajścia i-tej reakcji w chwili τ: q(i, τ)dτ q(i τ)dτ = = a ie aτ q(τ)dτ ae aτ = a i a. (5.7) Mamy więc odpowiedzi na oba pytania w formie rozkładów. Na potrzeby algorytmu wyliczamy dla rozkładu czasów kwantyl rzędu r 1 : t = 1 ( ) 1 a ln, (5.8) 1 r 1 gdzie r 1 pochodzi z rozkładu jednorodnego U[0, 1], możemy więc równoważnie zapisać wyrażenie na czas τ następnej reakcji jako τ = 1 a ln r 1. (5.9) Typ reakcji natomiast wyznaczamy losując liczbę r 2 z U[0, 1] i znajdując taką reakcje i, że i 1 j=1 a j a r 2 < i j=1 a j a. (5.10) Przyjmując przedstawione wyżej oznaczenia algorytm Gillespiego przebiega następująco: 1. Ustawiamy t = 0 i ustalamy S(0). 2. Dla ustalonego t oraz S(t) wylicz a i i 1,...,M oraz a. 3. Losujemy r 1, r 2 z U[0, 1], wyliczamy τ z (5.9) oraz znajdujemy i zgodnie z (5.10) 4. Zmieniamy t na t + τ i zgodnie z i-tą reakcją wyliczamy S(t + τ). 5. Kończymy symulację jeśli wszystkie a i = 0 lub czas symulacji dobiegł końca, w przeciwnym wypadku wracamy do punktu 2. 32

5.2. Stochastyczne efekty Stosując opisany wcześniej algorytm stochastycznych symulacji Gillespiego przeprowadziłem szereg różnego rodzaju symulacji naszego modelu ścieżki sygnałowej NF κb. Zgodnie z przewidywaniami okazało się, że zachowanie modelu w przypadku symulacji stochastycznych znacząco różni się od analizowanego wcześniej przypadku modelu deterministycznego. Poniżej omówię napotkane różnice oraz ich konsekwencje przy ustalaniu parametrów modelu. Skoki między atraktorami Pierwszym spostrzeżeniem jakie należy poczynić porównując oba podejścia jest ogólne stwierdzenie iż w przypadku monostabilnych układów trajektoria deterministyczna jest dobrym przybliżeniem uśrednionych trajektorii stochastycznych. W naszym modelu efekt ten jest widoczny dla małych wartości parametru bifurkacyjnego λ i krótkich czasów symulacji - patrz Rysunek 5.1. Rysunek 5.1: Porównanie deterministycznych (gruba czarna linia) i stochastycznych (cienkie kolorowe) trajektorii dla λ = 0.025 Dla wartości parametru bifurkacyjnego λ, dla których układ deterministyczny jest bistabilny tzn. występują dwa atraktory, uśrednianie stochastycznych trajektorii traci sens. Powodem są występujące w układzie skoki trajektorii pomiędzy obszarami, które w modelu deterministycznym odpowiadały atraktorom. Takie zachowanie modelu jest już w przypadku występowania dwóch stabilnych punktów dobrze znane i opisane w szeregu publikacjach (m.in. Ge [4], Song [14]). W naszym modelu takimi atraktorami są punkt stabilny i stabilny cykl graniczny. Układy w których jednym z atraktorów jest stabilny cykl jest wciąż obiektem badań ( [9], [7]). W mojej pracy przedstawię analizę zachowań modelu w takiej sytuacji opartą o numeryczne symulacje. 33

Rysunki 5.2 i 5.3 przedstawiają przykładowe trajektorie dla parametru bifurkacyjnego λ = 0.05 tzn. takiego, w którym układ jest bistabilny. Na rysunku 5.2 pogrubioną czarną linią został przedstawiony stabilny cykl graniczny, zaś czarna kropka oznacza stabilny punkt stacjonarny układu deterministycznego. Warto zauważyć, że cienka czerwona linia przedstawiająca trajektorie stochastyczną znajduje się dokładnie w otoczeniu stabilnych atraktorów układu deterministycznego. Rysunek 5.3 pokazuje bardzo długą symulacje (3000 godzin) trajektorii NF κb nuc. Widać na nim wyraźnie, że po spędzeniu pewnego czasu w okolicach punktu stabilnego (małe wartości NF κb nuc ) trajektoria przeskakuje do obszaru oscylacji (wyższe wartości NF κb nuc ), a potem znów wraca w okolice punktu. W dalszej części pracy przedstawiona zostanie ilościowa analiza tego zachowania. Rysunek 5.2: Porównanie deterministycznej (gruba czarna linia) i stochastycznej (cienka czerwona linia) trajektorii dla λ = 0.05 (bistabilność w modelu deterministycznym) Rezonans stochastyczny Skoki stochastycznych trajektorii pomiędzy obszarami odpowiadającymi deterministycznym atraktorom to zachowanie, którego się w naszym modelu spodziewaliśmy. Kolejnym, mniej spodziewanym, efektem stochastycznym, który został zaobserwowany jest rezonans stochastyczny [3]. Zjawisko to polega występowaniu oscylacji w modelu stochastycznym dla większego zakresu wartości parametru bifurkacyjnego niż w modelu deterministycznym. W takim przypadku mówi się o rozmyciu deterministycznych przewidywań modelu. Przykładowe porównanie trajektorii w przypadku gdy deterministyczny układ jest monostabilny (λ = 0.025) przedstawia rysunek 5.4. Widzimy, ze pogrubiona czarna linia po wykonaniu kilku gasnących oscylacji spada do punktu stabilnego, natomiast cienka czerwona trajektoria stochastyczna mimo to podlega oscylacjom. Na rysunku 5.5 widzimy analogicznie do rysunku 5.3, jak stochastyczna trajektoria NF κb nuc zachowuje się w czasie. Tym razem jednak, gdy 34