Ćwiczenie 7 ENZYMY. KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNYCH Część doświadczalna obejmuje: - wyznaczenie optimum ph dla reakcji katalizowanej przez kwaśną fosfatazę - wyznaczenie szybkości początkowej reakcji katalizowanej przez kwaśną fosfatazę WPROWADZENIE Fosfataza kwaśna (EC 3.1.3.2) enzym znacznikowy lizosomów, głównego miejsca trawienia wewnątrzkomórkowego Fosfatazy to grupa enzymów naleŝących do klasy hydrolaz (klasa 3 obejmuje enzymy rozszczepiające wiązania z udziałem cząsteczki wody, Tabela 1), podklasy enzymów hydrolizujących wiązania estrowe (esterazy), podpodklasy hydrolaz monoestrów fosforanowych. Tabela 1. Klasy enzymów (wg Koolman i Röhm 2005) 1
Enzymy te katalizują odszczepienie reszty fosforanowej od cukrowców, białek, tłuszczowców, nukleotydów i wielu innych naturalnych estrów kwasu fosforowego według poniŝszej reakcji: R-O-PO 3 H + H 2 O fosfataza R-OH + H 2 PO 4 Poza naturalnymi substratami, hydrolazy monoestrów fosforanowych rozszczepiają takŝe estry fosforanowe fenoli, np. p-nitrofenylofosforan. Fosfatazy działają w ph alkalicznym, z optymalnym ph w zakresie 9,0 11,0, jak równieŝ w ph kwaśnym i obojętnym, w zakresie 4,5 7,0. Te ostatnie są typowe dla komórek roślinnych, chociaŝ nie brakuje ich takŝe w komórkach zwierzęcych, gdzie występują przede wszystkim w lizosomach, niewielkich błonowych pęcherzykach będących głównym miejscem trawienia wewnątrzkomórkowego. Lizosomy zawierają specyficzny zestaw hydrolaz, optymalnie aktywnych w środowisku kwaśnym, uczestniczących w rozkładzie organelli komórkowych i wszystkich rodzajów makrocząsteczek dostarczanych do komórki róŝnymi drogami. Wiodącym enzymem jest tu kwaśna fosfataza uznawana za tzw. enzym znacznikowy lizosomów. Kwaśne środowisko światła lizosomu (ph ~ 5) jest utrzymywane dzięki działaniu błonowej H + -ATPazy, pompującej H + z cytozolu do wnętrza lizosomu(ryc. 1). Ryc. 1. Schemat lizosomu (wg Alberts i wsp. 1999) W obojętnym ph cytoplazmy (ph 7 7,3), hydrolityczne enzymy lizosomalne wykazują niską aktywność. Jest to przypuszczalnie mechanizm obronny przed samoistnym strawieniem komórki, w 2
przypadku, gdyby enzymy dostały się do cytoplazmy. W komórkach roślin i grzybów rolę lizosomów pełni wakuola komórkowa. Kwaśny odczyn wnętrza wakuoli, istotny dla aktywności występujących tam enzymów hydrolitycznych, jest utrzymywany dzięki działaniu dwóch pomp protonowych (H + -ATPazy i H + -PPazy) zlokalizowanych w błonie otaczającej wakuolę, tzw. tonoplaście. Podstawy kinetyki enzymatycznej Kinetyka enzymatyczna stanowi dział enzymologii zajmujący się zagadnieniami związanymi z szybkością reakcji katalizowanych enzymatycznie. Szybkość reakcji enzymatycznej (V), która jest miarą aktywności, czyli katalitycznego działania enzymu, mierzy się podobnie jak szybkość reakcji chemicznych. Jest ona w pewnym zakresie proporcjonalna do stęŝenia substancji reagujących; wyznacza ją przyrost stęŝenia produktu reakcji w czasie. Miarą szybkości reakcji w danym momencie jest więc wzrost stęŝenia produktu, jaki następuje w jednostce czasu. Aktywność enzymatyczną wyraŝamy w dwóch standardowych jednostkach. Są to: jednostka enzymatyczna (U) oraz katal (kat). Jednostka enzymatyczna (U) jest to taka ilość enzymu, która katalizuje przekształcenie 1 µmola substratu w ciągu 1 minuty, w warunkach optymalnych dla danego enzymu. Katal (kat) jest jednostką aktywności enzymatycznej obowiązującą w układzie SI i jest definiowany jako aktywność katalityczna, która zwiększa szybkość reakcji o 1 mol na sekundę, w warunkach optymalnych. Przy stałym stęŝeniu enzymu i substratu szybkość powstawania produktu reakcji powinna być wprost proporcjonalna do czasu reakcji. W rzeczywistości tylko w początkowej fazie reakcja ta jest reakcją pierwszego rzędu (Ryc. 2), co znaczy, Ŝe szybkość działania enzymu jest liniową funkcją czasu jest to tzw. szybkość początkowa reakcji enzymatycznej (V 0 ). Ryc. 2. Wzrost ilości produktu reakcji enzymatycznej w czasie NaleŜy pamiętać, Ŝe w analizach in vitro stęŝenie substratu maleje w czasie reakcji i przy dłuŝszym czasie inkubacji zaleŝność pomiędzy przyrostem produktu, a czasem reakcji nie będzie funkcją 3
liniową (Ryc. 2). RównieŜ enzym w trakcie wykonywania oznaczeń moŝe ulegać denaturacji, co pogłębia powyŝszy efekt. Wartość V 0 uzyskuje się przez wykreślenie linii prostej stycznej do początkowego odcinka krzywej, poczynając od czasu zerowego (Ryc. 2). Nachylenie tej prostej ma wartość V 0. Dla badań kinetyki enzymów in vitro niezwykle waŝne jest więc określenie czasu reakcji, w którym przyrost produktu reakcji enzymatycznej jest wprost proporcjonalny do czasu. V 0 = produkt (µmole) czas (min) Szybkość reakcji enzymatycznej zaleŝy od wielu czynników fizycznych i chemicznych, takich jak: stęŝenie enzymu, stęŝenie substratu, temperatura, ph, stęŝenie aktywatorów i inhibitorów. Większość enzymów wykazuje maksymalną aktywność w środowisku o określonym stęŝeniu jonów wodorowych (w określonym ph). Wynika to stąd, Ŝe w katalizie enzymatycznej biorą udział, między innymi, zjonizowane grupy funkcyjne centrum aktywnego. Odsetek cząsteczek enzymu, w których grupy kwasowe lub zasadowe znajdują się w formie jonowej, zaleŝy od pk tych grup i stę- Ŝenia jonów wodorowych w roztworze. ZaleŜność aktywności enzymatycznej od ph przyjmuje najczęściej postać krzywej w kształcie dzwonu (Ryc. 3). Ryc. 3. ZaleŜność aktywności enzymu od ph (wg Koolman i Röhm 2005) Rozpiętość optimum ph, czyli takiej wartość ph, przy której aktywność jest maksymalna, jest bardzo duŝa. Dla wielu enzymów optimum ph znajduje się w pobliŝu ph komórki (ph 7,0), ale np. pepsyna (EC 3.4.23.1) występująca w kwaśnym środowisku Ŝołądka wykazuje najwyŝszą aktywność 4
w ph około 2,0, a arginaza (EC 3.5.3.1.) w ph powyŝej 10,0. Optymalną wartość ph, która jest jedną z wartości liczbowych charakteryzujących dany enzym, wyznacza się z wykresu zaleŝności aktywności od ph. WYKONANIE Zasada metody W ćwiczeniu, do wyznaczenia optimum ph, podobnie jak w wyznaczaniu szybkości początkowej reakcji, stosuje się metodę, w której naturalny substrat kwaśnej fosfatazy zostaje zastąpiony sztucznym substratem p-nitrofenylofosforanem (analogiem naturalnego substratu). Enzym hydrolizując p-nitrofenylofosforan, uwalnia p-nitrofenol, który w środowisku zasadowym tworzy Ŝółto zabarwiony anion p-nitrofenolanowy. O fosfataza O 2 N O P OH + H2O O N OH + H PO OH 2 3 4 p-nitrofenylofosforan (pnpp) p-nitrofenol (pnp) NatęŜenie barwy mierzone przy λ = 405 nm jest proporcjonalne do ilości zhydrolizowanego substratu. Ryc. 4 przedstawia widmo absorpcyjne p-nitrofenylofosforanu (pnpp) i p-nitrofenolu (pnp). Odczynniki: Ryc. 4. Widmo absorpcyjne p-nitrofenylofosforanu (pnpp) i p-nitrofenolu (pnp) w środowisku alkalicznym 1. 8mM p-nitrofenylofosforan w H 2 O 2. 0,1M NaOH 5
3. 0,9% NaCl 4. 0,5M bufory Tris-octan o ph 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5 Wyciąg z ziemniaka: obrany i umyty ziemniak zetrzeć na tarce, przesączyć przez warstwę nylonu. Odstawić do lodówki. Wyznaczanie optimum ph kwaśnej fosfatazy Do probówek napipetować po: 0,25 ml 8mM p-nitrofenylofosforanu i 0,25 ml odpowiedniego buforu, kolejno od ph 4,0 do 6,5. Próby wykonać w dwóch powtórzeniach dla kaŝdego ph. Starannie wymieszać zawartość probówek i wstawić je do łaźni wodnej o temp. 30 0 C. Wyciąg z ziemniaka zawierający kwaśną fosfatazę rozcieńczyć w cylinderku miarowym na 25 ml 250x uŝywając 0,9% roztworu NaCl. Do preinkubowanych prób, zawierających napipetowany substrat i bufor, ogrzanych w łaźni wodnej do temp. 30 0 C dodawać, w odstępach co 30 sekund, po 0,5 ml rozcieńczonego roztworu enzymu. Próby inkubować 15 minut w temperaturze 30 0 C, po czym reakcję przerwać dodając do kaŝdej z nich, znowu w odstępach co 30 sekund i w kolejności takiej jak dodawano enzym, po 5 ml 0,1M roztworu NaOH,. Próbę kontrolną (zerową) wykonać równolegle z próbami badanymi postępując następująco: do probówki napipetować 0,25 ml buforu o ph 5,0 oraz 0,25 ml roztworu p-nitrofenylofosforanu. Mieszaninę inkubować 15 minut w łaźni wodnej razem z próbami badanymi, po czym dodać 5 ml 0,1M roztworu NaOH, a dopiero na końcu dodać 0,5 ml enzymu (enzym w takich warunkach juŝ nie będzie działał, poniewaŝ roztwór zawiera wysokie stęŝenie NaOH). NatęŜenie barwy zmierzyć wobec próby zerowej przy λ = 405 nm. Wykreślić krzywą zaleŝności szybkości hydrolizy p-nitrofenylofosforanu (wyraŝoną jako absorbancja przy 405nm) od ph. Wyznaczanie szybkości początkowej reakcji Wyznaczanie szybkości początkowej reakcji hydrolizy pnpp wykonujemy uŝywając 4 lub 5 róŝnych rozcieńczeń wyciągu z ziemniaka (róŝne stęŝenie enzymu). KaŜda para ćwiczeniowa przygotowuje jedno z wybranych rozcieńczeń wyciągu, np. 10x, 50x, 100x lub 250x (wyciąg naleŝy rozcieńczyć 0,9% roztworem NaCl w cylindrze miarowym na 25 ml) i wykonuje oznaczenie szybkości początkowej dodając do mieszaniny reakcyjnej wyciąg o określonym rozcieńczeniu (kaŝda para inne rozcieńczenie!). Do suchych probówek napipetować po 0,25 ml buforu octanowego o ph optymalnym dla aktywności kwaśnej fosfatazy (zwykle jest to ph 5,5) i 0,25 ml roztworu substratu (próby wykonać w 6
dwóch powtórzeniach). KaŜda próba zawiera zatem po 0,5 ml mieszaniny inkubacyjnej o ph optymalnym dla fosfatazy kwaśnej. Próby wstawić do łaźni wodnej o temperaturze 30 0 C. Reakcję enzymatyczną rozpocząć dodając do kaŝdej próby, w odstępach co 30 sekund, po 0,5 ml ekstraktu ziemniaczanego o odpowiednim rozcieńczeniu (10x, 50x, 100x lub 250x). Próby inkubować: 2, 4, 6, 8, 10 i 12 minut. Reakcję przerwać dodając, znowu w 30 sekundowych odstępach, po 5 ml 0,1M roztworu NaOH w kolejności takiej jak dodawano enzym. Próby zerowe naleŝy przygotować następująco: do probówki napipetować 0,25 ml buforu o ph 5,5 oraz 0,25 ml p-nitrofenylofosforanu. Mieszaninę inkubować 12 minut w łaźni wodnej razem z próbami badanymi, po czym dodać 5 ml 0,1M roztworu NaOH i na koniec 0,5 ml enzymu o danym rozcieńczeniu. Dokonać pomiaru absorbancji przy λ = 405 nm wobec próby zerowej. Na podstawie otrzymanych wyników naleŝy wykreślić zaleŝność szybkości hydrolizy p-nitrofenylofosforanu (wyraŝonej jako wartości absorbancji przy 405 nm) od czasu inkubacji, dla odpowiedniego rozcieńczenia enzymu. Wszystkie pary ćwiczeniowe wymienią się wynikami, a następnie kaŝda osoba wykona jeden wykres, który będzie przedstawiał wyniki uzyskane przez całą grupę ćwiczeniową. Proszę przeanalizować przebieg krzywych zaleŝności dla poszczególnych rozcieńczeń enzymu! Zagadnienia do przygotowania: - podstawy katalizy enzymatycznej (zbliŝenie i orientacja substratu, eliminacja wody, stabilizacja stanu przejściowego, przenoszenie grup funkcyjnych) - kinetyka reakcji enzymatycznych (aktywność enzymatyczna, jednostki aktywności, teoria wysyceniowa Michaelisa-Menten, szybkość początkowa, szybkość maksymalna ) - enzymy izosteryczne i allosteryczne - klasyfikacja i nomenklatura enzymów Piśmiennictwo: 1, Alberts B, Bray D, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P Podstawy biologii komórki. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1999. 2, Berg JM, Tymoczko, JL, Stryer L Biochemia. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2005. 3, Koolman J, Röhm K-H Biochemia. Ilustrowany przewodnik. Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2005. 4, Witwicki J, Ardelt W Elementy enzymologii. Państwowe Wydawnictwo Naukowe, Warszawa 1984. 7