KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNYCH

Transkrypt

1 ĆWICZENIE 8 KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNYCH Wyznaczanie stałej Michaelisa i szybkości maksymalnej reakcji utleniania gwajakolu przez H 2 2, katalizowanej przez peroksydazę chrzanową. Badanie wpływu siarczanu hydroksyloaminy i azydku sodowego na szybkość reakcji enzymatycznej utleniania gwajakolu. kreślanie typu inhibicji peroksydazy chrzanowej przez badane związki. 1. ZałoŜenia teoretyczne Peroksydazy są enzymami naleŝącymi do klasy oksydoreduktaz. Ich grupą prostetyczną jest hem. Są to enzymy powszechne zarówno w świecie roślinnym jak i zwierzęcym. Tkanki zwierzęce bogate w te enzymy to: leukocyty, płytki krwi, wątroba i inne tkanki metabolizujące eikozanoidy. Peroksydazy redukują nadtlenek wodoru lub inne nadtlenki organiczne np. nadtlenki lipidów, wykorzystując do tego rozmaite donory elektronów: cytochrom c, askorbinian, hydrochinon, aminy aromatyczne, fenole, indol, kw. moczowy. Są to enzymy pełniące funkcje ochronne, zapobiegające nagromadzaniu się nadtlenków i tworzeniu z nich wolnych rodników. Reakcja katalizowana przez peroksydazy jest trójstopniowa: [Fe(III)] Px + H 2 2 [Fe(IV)=]* + H 2 kompleks I [Fe(IV)=]* + AH [Fe(IV)=] + A kompleks I kompleks II [Fe(IV)=] + AH [Fe(III)] Px + A + H 2 kompleks II Peroksydaza chrzanowa HRP (EC ) jest glikoproteiną o masie cząsteczkowej około 42 kda, zawierającą zawierającą w centrum aktywnym cztery reszty lizyny oraz pojedynczy, luźno związany z apoproteiną hem. Najbogatszym jej źródłem jest sok z chrzanu, kapusty, szczawiu, marchwi, ziemniaków. Enzym wykazuje optimum aktywności w ph 5,8-7,5. Substratem, czyli donorem wodoru, w prowadzonej przez enzym reakcji mogą być m.in. fenole oraz aminy, np gwajakol, e-toluidyna, pirogalol. 1

2 2. Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest wyznaczenie stałej Michaelisa i szybkości maksymalnej reakcji katalizowanej przez peroksydazę chrzanową w warunkach zmiennych stęŝeń gwajakolu, przy stałym stęŝeniu H 2 2 oraz określenie typu inhibicji enzymu zachodzącej w obecności: 1) siarczanu hydroksyloaminy; 2) azydku sodowego. Inhibitorem określa się kaŝdą substancję, która zmniejsza szybkość reakcji katalizowanej przez dany enzym. Inhibicja niekompetycyjna: W przypadku inhibicji niekompetycyjnej zarówno inhibitor, jak i substrat nie wywierają wzajemnego wpływu na wiązanie się z białkiem enzymatycznym. Ich wiązanie się z enzymem przebiega niezaleŝnie od siebie, losowo i zachodzi w odmiennych miejscach w strukturze białka enzymatycznego. Efektem związania się inhibitora z enzymem jest obniŝenie wartości szybkości maksymalnej (V max ). Przykładem tego typu inhibicji jest hamowanie dehydrogenazy α-ketoglutaranowej przez kwas acetylosalicylowy. Inhibicja kompetycyjna: Związek będący inhibitorem kompetycyjnym wiąŝe się z białkiem enzymatycznym w centrum aktywnym uniemoŝliwiając związanie się enzymu z właściwym substratem. Dochodzi zatem do konkurencji o miejsce wiązania pomiędzy inhibitorem, a substratem, przy czym enzym wykazuje zwykle wyŝsze powinowactwo do inhibitora, niŝ do substratu. Inhibitor kompetycyjny moŝe być nie tylko analogiem lub pochodną substratu, ale takŝe alternatywnym substratem danej reakcji lub jej produktem. Przykładem inhibicji kompetycyjnej jest hamowanie dehydrogenazy bursztynianowej przez malonian będący analogiem strukturalnym bursztynianu. Zdarzają się takŝe przypadki inhibicji kompetycyjnej powodowanej przez inhibitory nie będące związkami o podobnej do substratu strukturze chemicznej. W tym wypadku mówi się o tzw. inhibicji zwrotnej. Inhibitor wiąŝe się wówczas w miejscu odmiennym niŝ substrat, co powoduje pojawienie się zmiany konformacyjnej białka enzymatycznego powodującej zniekształcenie miejsca wiązania substratu, a zatem brak moŝliwości utworzenia kompleksu enzym-substrat. Inhibicja mieszana: Inhibicja mieszana jest jedną z odmian inhibicji niekompetycyjnej. W tym przypadku inhibitor moŝe wiązać się zarówno z wolnym enzymem, jak i kompleksem enzym-substrat. Przykładem tego typu inhibicji jest hamowanie syntazy tymidylanowej przez analogi metylenotetrahydrfolianu. Inhibicja akompetycyjna: W przypadku inhibicji akompetycyjnej inhibitor odwracalnie wiąŝe się z kompleksem enzym-substrat tworząc nieaktywny kompleks potrójny: enzym-substrat-inhibitor. Równocześnie inhibitor nie ma zdolności wiązania się z wolnym enzymem. Efektem tego typu inhibicji jest równoczesne obniŝenie o ten sam współczynnik zarówno wartości K m, jak i V max. Przykładem inhibicji akompetycyjnej jest hamowanie dehydrogenazy inozynomonofosforanu przez kwas mykofenolowy. 2

3 3. Zadania a) Metodą kinetyczną oznacz aktywność peroksydazy chrzanowej (HRP) przy róŝnych stęŝeniach gwajakolu (w zakresie 1,25-10,0 mm) i stałym stęŝeniu H 2 2. b) znacz aktywność HRP przy tych samych stęŝeniach gwajakolu w obecności siarczanu hydroksyloaminy i azydku sodowego. c) Wykreśl krzywą zaleŝności szybkości reakcji (V) od stęŝenia gwajakolu [s] w układzie Michaelisa- Menten bez inhibitorów oraz w ich obecności. d) Wykreśl krzywą zaleŝności 1/V od 1/[s] (układ Lineweavera-Burka) dla kaŝdego z w/w układów. e) Metodą graficzną wyznacz wartość K M i V max w kaŝdym z tych układów i zapisz uzyskane wartości z uwzględnieniem odpowiednich jednostek. f) Przeprowadź analizę zmian wartości K M i V max w układach z siarczanem hydroksyloaminy i azydku sodowego oraz określ typ inhibicji, którą te związki powodują. 4. Tok ćwiczenia znaczanie aktywności peroksydazy chrzanowej (HRP) Zasada metody oznaczania HRP Peroksydaza katalizuje reakcje utleniania niektórych zw. organicznych (aminy aromatyczne, fenole, indol, kw. moczowy) z równoczesną redukcją H 2 2, wg ogólnego równania: AH 2 + H 2 2 A + 2 H 2 W przeprowadzanym doświadczeniu wykorzystywanym substratem będzie gwajakol (2-metoksyfenol), który w obecności H 2 2 pod wpływem HRP ulega utlenieniu, a następnie sprzęgnięciu do tetragwajakolu. Powstający tetragwajakol (związek o barwie rubinowej) oznaczany jest spektrofotometrycznie w sposób ciągły (kinetycznie) poprzez pomiar absorbancji przy dł. fali 470 nm. Wzrost jego stęŝenia jest miarą aktywności HRP. Schemat przebiegu reakcji katalizowanej przez HRP: H H H 2 Gwajakol Tetragwajakol 3

4 Przygotowanie odczynników do oznaczenia Peroksydaza (HRP): o stęŝeniu 1 mg/ml rozcieńczona 250x wydano gotowy odczynnik 0,006 mol/l bufor fosforanowy o ph 6,8 wydano gotowy odczynnik 0,2 mol/l H 2 2 wydano gotowy odczynnik 0,1 mol/l gwajakol wydano gotowy odczynnik 0,5 mol/l roztwór azydku sodowego wydano gotowy odczynnik 0,005 mol/l roztwór siarczanu hydroksyloaminy wydano gotowy odczynnik Ustalenie ilości enzymu niezbędnego do przeprowadzenia pomiarów kinetycznych Przygotuj mieszaninę inkubacyjną zawierającą 250 x rozcieńczony roztwór enzymu HRP (gotowy odczynnik), bufor i gwajakol w ilościach takich jak w próbce nr 1 (patrz Tabela 1). Wyzeruj spektrofotometr przy długości fali 470 nm wobec próbki odnośnikowej (2 ml buforu fosforanowego). Mieszaninę inkubacyjną umieść w aparacie, wprowadź do niej 0,5 ml roztworu H 2 2, zmieszaj i rejestruj zmiany absorbancji przez 2 min. Postaraj się uzyskać w ciągu 1 minuty przyrost absorbancji około 0.2 jednostki przy załoŝeniu, Ŝe wykres tej reakcji będzie przez cały ten czas prostoliniowy. JeŜeli prostoliniowość przebiegu tej reakcji zanika przed upływem 1 minuty, enzym naleŝy rozcieńczyć. JeŜeli wzrost absorbancji jest mniejszy niŝ 0.1 jednostki absorbancji, naleŝy zwiększyć ilość enzymu dodawaną do kuwety Przygotowanie mieszaniny inkubacyjnej W 5 kuwetach przygotować buforowane mieszaniny odpowiednio rozcieńczonego enzymu i róŝnych stęŝeń gwajakolu wg. Tabeli 1: (bjętość próbki musi pozostać stała [2ml] - jeŝeli konieczne było zwiększenie ilości enzymu, proszę o tę wartość zmniejszyć ilość buforu) Nr próbki Bufor fosforanowy ph 6,8 HRP 0,1 mol/l gwajakol Końcowe stęŝenie gwajakolu [mm] 1 1,25 0,05 0,20 10,0 2 1,30 0,05 0,15 7,5 3 1,35 0,05 0,10 5,0 4 1,40 0,05 0,05 2,5 5 1,425 0,05 0,025 1, znaczanie aktywności peroksydazy w układzie kontrolnym Po dobraniu optymalnego stęŝenia enzymu, w identyczny sposób (jak dla próbki nr 1) oznacz i zarejestruj aktywność w pozostałych mieszaninach inkubacyjnych (róŝniących się stęŝeniem gwajakolu), a zmiany absorbancji wpisz do tabeli wyników (pkt. 5). 4

5 znaczanie aktywności peroksydazy w obecności inhibitorów Przygotowanie mieszanin inkubacyjnych, wg Tabeli 2: Nr próbki Bufor fosforanowy ph 6,8 HRP 0,1 mol/l gwajakol Końcowe stęŝenie gwajakolu [mm] Azydek sodowy lub siarczan hydroksyloaminy 1 1,15 0,05 0,20 10,0 0,1 2 1,20 0,05 0,15 7,5 0,1 3 1,25 0,05 0,10 5,0 0,1 4 1,30 0,05 0,05 2,5 0,1 5 1,375 0,05 0,025 1,25 0,1 Do kolejnych próbek dodaj 0,5 ml H 2 2 i rejestruj zmiany absorbancji przez okres 2 minut. JeŜeli stopień inhibicji wynosi 100% naleŝy odpowiednio rozcieńczyć inhibitor. Zmiany absorbancji wpisz do tabeli wyników bliczanie aktywności HRP a) Aktywność właściwa peroksydazy (K): gdzie: K = Α/min. v. R ε. l. V S mol min x ml A/min - wzrost absorbancji w ciągu 1 minuty v - objętość próbki [2 ml] l - grubość warstwy roztworu w kuwecie [1cm] ε - współczynnik ekstynkcji molarnej dla tetragwajakolu posiada wartość 26,6 mm 1 cm -1 Vs - objętość roztworu enzymu w próbce [0,05 ml] R - rozcieńczenie enzymu 5

6 5. Zestawienie wyników Końcowe stęŝenie gwajakolu [mm] 10,0 7,5 5,0 2,5 1,25 Układ kontrolny A/min Aktywność właściwa Układ z siarczanem hydroksyloaminy A/min Aktywność właściwa Układ z azydkiem sodowym A/min Aktywność właściwa pracuj wyniki w układzie Michaelisa-Menten i Lineweavera-Burka. Porównaj je ze sobą. W miejsce szybkości reakcji (V) wstaw wartości aktywności właściwej enzymu (K). blicz wartości: K M i V max i umieść je w poniŝszej tabeli z uwzględnieniem jednostek, w których się je wyraŝa: Układ kontrolny Układ z siarczanem hydroksyloaminy Układ z azydkiem sodowym K m. V max Typ inhibicji 6. Podsumowanie i wnioski Napisz jak zmienia się szybkość reakcji w miarę wzrostu stęŝenia substratu i jaki kształt przyjmuje krzywa zaleŝności szybkość reakcji od stęŝenia substratu? Która forma graficznego przedstawienia wyników pozwala na precyzyjne wyznaczenie wartości K M i V max? Jak zmienia się aktywność właściwa peroksydazy chrzanowej po dodaniu do układu inhibitorów? Jaki typ inhibicji powodują siarczan hydroksyloaminy i azydek sodowy, na jakiej podstawie moŝna to stwierdzić? 6