data ĆWICZENIE 6 IZOLACJA BIAŁEK I ANALIZA WPŁYWU WYBRANYCH CZYNNIKÓW NA BIAŁKA Doświadczenie 1

Transkrypt

1 Imię i nazwisko Uzyskane punkty Nr albumu data /3 podpis asystenta ĆWICZENIE 6 IZOLACJA BIAŁEK I ANALIZA WPŁYWU WYBRANYCH CZYNNIKÓW NA BIAŁKA Doświadczenie 1 Cel: Frakcjonowanie białek mleka metodą wysalania i oznaczenie stęŝenia albumin i globulin w mleku Frakcjonowanie białek mleka Izolacja pojedynczego białka z mieszaniny wielu białek jest moŝliwa dzięki zróŝnicowaniu ich właściwości fizykochemicznych, takich jak: rozpuszczalność, masa cząsteczkowa, ładunek elektryczny, powinowactwo jednych cząsteczek do drugich. Pierwszym zasadniczym elementem działań prowadzących do otrzymania czystego białka jest wybór materiału biologicznego. Powinien on przede wszystkim charakteryzować się wysoką zawartością danego białka. W przypadku wyboru procedur izolacyjnych waŝne jest takŝe rozmieszczenie danego białka w materiale biologicznym (białko pozakomórkowe, wewnątrzkomórkowe, białko błonowe), gdyŝ warunkuje ono dobór wstępnej techniki izolacyjnej umoŝliwiającej jego uwolnienie do roztworu (krojenie, mielenie, homogenizacja, sonikacja, liza osmotyczna, prasa frencza, zastosowanie detergentów itp.). Zastosowanie pojedynczej techniki izolacyjnej nie pozwala jednak na uzyskanie w pełni oczyszczonego białka. Postępowanie wymaga zastosowania wielu kolejno po sobie następujących procedur, aby na kaŝdym etapie izolacji danego białka uzyskać coraz to wyŝszy stopień jego oczyszczenia. Do kolbki stoŝkowej naleŝy dodać 25 cm 3 mleka (mleko UHT lub z mlekomatu) i lekko ogrzać kolbę w łaźni wodnej. Do ogrzanego mleka powoli dodawać, mieszając, 10 cm 3 1% kwasu octowego. Wytrącony osad kazeiny odsączyć na lejku z sączkiem karbowanym. Odmierzyć pipetą automatyczną 3 cm 3 przesączu do probówki wirówkowej i dodać równą objętość nasyconego roztworu siarczanu amonu. Mieszać przez około 5 minut nie dopuszczając do spienienia zawartości probówki. Wytrącony osad globulin odwirować przez 10 min. przy 5000 rpm. Usunąć delikatnie supernatant przenosząc go do następnej probówki wirówkowej, zaś osad globulin zachować do oznaczenia ilościowego. Do supernatantu dodawać małymi porcjami stały siarczan amonu (ok g; na dnie powinno zostać trochę nierozpuszczonych kryształków), jednocześnie mieszając zawartość probówki bez jej spienienia, do momentu wysycenia roztworu. Wytrącony osad albumin odwirować przez 10 min. przy 5000 rpm. Usunąć delikatnie supernatant, zaś osad zachować do oznaczenia ilościowego. 1% kwas octowy nasycony roztwór (NH 4 ) 2 SO 4 stały (NH 4 ) 2 SO 4 str. 1

2 1.2. Oznaczanie stęŝenia albumin i globulin mleka metodą biuretową Reakcja biuretowa jest reakcją barwną, której podlegają: większość peptydów, białka, dimocznik (biuret), diamidy. Wolne aminokwasy i dipeptydy nie dają dodatniej próby. Nazwa reakcji wywodzi się od nazwy biuretu, czyli dimocznika, który jest najprostszym ze związków podlegających tej reakcji. W środowisku zasadowym wiązanie peptydowe ulega tautomeryzacji do formy enolowej, zdolnej do dysocjacji. W tych warunkach jon Cu 2+ tworzy dwa wiązania z dwiema sąsiednimi grupami enolowymi i dwa wiązania koordynacyjne z atomami azotu. Powstaje kompleks o barwie czerwonofioletowej lub niebieskofioletowej, a intensywność barwy jest wprost proporcjonalna do ilości zaangaŝowanych w reakcji wiązań peptydowych. Wytrącone frakcje białek mleka albumin i globulin naleŝy rozpuścić w 1 ml 0,9% NaCl. Następnie naleŝy przygotować 3 probówki i postępować wg schematu zamieszczonego w tabeli: numer probówki woda destylowana 0.5 ml - - roztwór albumin ml - roztwór globulin ml biuretowy 2.0 ml 2.0 ml 2.0 ml Przygotowane roztwory zamieszać i inkubować 30 minut w temperaturze pokojowej. Odczytać absorbancję przy długości fali 540 nm i na podstawie krzywej wzorcowej wyznaczyć stęŝenie albumin i globulin w mleku. str. 2

3 1 ml 0,9% NaCl biuretowy Doświadczenie 2 Cel: Analiza wpływu wybranych czynników na właściwości białek 2.1. Badanie wpływu ph na rozpuszczalność kazeiny i wyznaczanie punktu izoelektrycznego kazeiny W środowisku o wartości ph równej pi białka, w tym analizowana kazeina, wykazują najniŝszą rozpuszczalność. Do zestawu roztworów buforowych o róŝnych wartościach ph wprowadza się jednakową ilość kazeiny i obserwuje powstający osad. Wartość ph roztworu buforowego, w którym pojawi się najobfitszy osad, odpowiada wartości pi kazeiny. Do 5 probówek typu falkon odmierzyć podane w tabelce ilości roztworów kwasu octowego i wody. Następnie do kaŝdej probówki dodać kroplami po 1 ml 1% roztworu kazeiny w 0,1 M octanie sodu. Po kaŝdej dodanej kropli kazeiny wymieszać zawartość probówki ,01 M CH 3 COOH 0.5 ml 1.0 ml ,1 M CH 3 COOH ml 4.0 ml - 1M CH 3 COOH ml H 2 O destylowana 8.5 ml 8.0 ml 8.0 ml 5.0 ml 7.4 ml kazeina w 0,1 M CH 3 COONa 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml Inkubować w temperaturze pokojowej 30 min. Zanotować wynik obserwacji: brak zmętnienia (-) lub róŝne stopnie zmętnienia (+, ++, +++). Obliczyć ph w punkcie izoelektrycznym posługując się równaniem Hendersona-Hasselbalcha: pk kwasu octowego = 4,75 str. 3

4 0,01 M CH 3 COOH 0,1 M CH 3 COOH 1M CH 3 COOH H 2 O destylowana kazeina w 0,1 M CH 3 COONa 2.2. Badanie wpływu czynników denaturujących Denaturacja to pojawienie się zmian w strukturze cząsteczki białka, w wyniku których traci ono swoje właściwości biologiczne. Denaturacja następuje wówczas, gdy pod wpływem czynników fizycznych lub chemicznych ulega zdeformowaniu lub zniszczeniu struktura IV, III lub II rzędu. Zjawisko to jest wynikiem działania na białko m.in. wysokiej temperatury, mocnych kwasów lub zasad nieorganicznych, niektórych kwasów organicznych, rozpuszczalników organicznych, takich jak: alkohol lub aceton w temperaturze pokojowej i wyŝszej oraz kationów metali cięŝkich. W zaleŝności od intensywności działania wymienionych czynników (w tym czasu oddziaływania), wielkość zmian denaturacyjnych moŝe się róŝnić od minimalnych do całkowitego zniszczenia oddziaływań stabilizujących konformację białka. Z drugiej strony, jedne białka są bardziej wraŝliwe na czynniki denaturujące (np. lipoproteiny), inne są stosunkowo stabilne (np. albuminy) Wpływ temperatury na białka NaleŜy przygotować 3 probówki (czyste i suche) i postępować zgodnie ze schematem podanym w tabeli: % roztwór białka kurzego 2.0 ml - - mleko ml 1.0 ml 1% CH 3 COOH 1 kropla 1 kropla - Probówki naleŝy ogrzać do momentu wrzenia. Porównaj próbki nr 2 i 3 stały NaCl kilkanaście kryształków - - str. 4

5 1% roztwór białka kurzego mleko 1% CH 3 COOH stały NaCl Wpływ kationów metali cięŝkich na białka Białka w środowisku o wartości ph wyŝszej od pi obdarzone są ładunkiem ujemnym i mogą reagować z kationami. Kationy metali cięŝkich (np. Hg 2+, Pb 2+ ) tworzą z białkami nierozpuszczalne kompleksy, które wytrącają się z roztworu. Działanie denaturujące metali cięŝkich moŝe być takŝe konsekwencją ich reakcji z grupami SH i zrywania wiązań disiarczkowych. Dzięki temu, Ŝe białka z kationami metali cięŝkich mogą tworzyć trudno rozpuszczalne sole, które wytrącają się z roztworu, niekiedy białka są stosowane jako odtrutki przy zatruciu metalami cięŝkimi. NaleŜy przygotować 2 probówki (czyste i suche) i postępować zgodnie ze schematem podanym w tabeli: 1% roztwór albuminy 2% roztwór (CH 3 COO) 2 Pb 2% roztwór HgCl % roztwór albuminy 2.0 ml 2.0 ml 2% roztwór (CH 3 COO) 2 Pb 5-6 kropli - 2% roztwór HgCl kropli str. 5

6 Wpływ anionów na białka Zasada metody W środowisku o wartości ph niŝszej od pi białka, dysocjacja grup karboksylowych jest cofnięta, dlatego eliminowane są oddziaływania jonowe, w których uczestniczyła zjonizowana grupa karboksylowa. Białka obdarzone są w tych warunkach ładunkiem dodatnim i z niektórymi kwasami organicznymi tworzą nierozpuszczalne połączenia. NaleŜy przygotować 3 probówki (czyste i suche) i postępować zgodnie ze schematem podanym w tabeli: % roztwór albuminy 2.0 ml 2.0 ml 2.0 ml 10% roztwór kwasu trójchlorooctowego 2.0 ml % roztwór kwasu sulfosalicylowego ml - 30% roztwór kwasu fosforowolframowego ml 1% roztwór albuminy 10% roztwór kwasu trójchlorooctowego 20% roztwór kwasu sulfosalicylowego 30% roztwór kwasu fosforowolframowego str. 6