ĆWICZENIE NR 3 BADANIE MIKROBIOLOGICZNEGO UTLENIENIA AMONIAKU DO AZOTYNÓW ZA POMOCĄ BAKTERII NITROSOMONAS sp.

Transkrypt

1 ĆWICZENIE NR 3 BADANIE MIKROBIOLOGICZNEGO UTLENIENIA AMONIAKU DO AZOTYNÓW ZA POMOCĄ BAKTERII NITROSOMONAS sp. Uwaga: Ze względu na laboratoryjny charakter zajęć oraz kontakt z materiałem biologicznym, studenci zobowiązani są uŝywać fartuchów i rękawiczek jednorazowych. Azot jest nieodzownym dla Ŝycia pierwiastkiem. Występując w atmosferze ziemskiej w postaci dwuatomowej cząsteczki, nie moŝe być wykorzystywany przez organizmy jako źródło azotu do produkcji białek i kwasów nukleinowych. Źródłem mogą być jedynie mineralne sole azotu rozpuszczone w wodzie (w postaci jonów NO 2, NO 3 i NH + 4 ). Do zbiorników wodnych związki azotu dostają się ze źródeł naturalnych (rozkład materii organicznej, wydaliny) i antropogenicznych (dopływ ze ściekami komunalnymi i przemysłowymi, spływ z pól nawoŝonych związkami azotu, z depozycji zanieczyszczeń atmosferycznych). Atomy tego pierwiastka zostają wbudowane w związki chemiczne wskutek procesów biochemicznych. Dzięki mikroorganizmom następuje rozkład azotowych związków organicznych (mocznika, białka, kwasu moczowego) do amoniaku i jonów amonowych (NH + 4 ) w wyniku procesu zwanego amonifikacją. Amonifikacja mocznika: (NH2)2CO + H2O 2NH3 + CO2 W procesie zwanym nitryfikacją toksyczne jony amoniowe pod wpływem ściśle chemolitotroficznych Gram ujemnych bakterii Nitrosomonas sp. ulegają utlenieniu do znacznie mniej toksycznych azotynów według reakcji: 2NH O 2 2NO 2 + 4H + + 2H 2 O Następnie dzięki bakterii Nitrobacter sp. do azotanów według reakcji: 2NO 2 + O 2 2NO 3 Azotany mogą być bezpośrednio wykorzystywane jako źródło azotu przez rośliny, mogą gromadzić się w glebie (np. złoŝa saletry chilijskiej) lub ulegać rozkładowi przez bakterie 1

2 denitryfikacyjne (bakterie wykorzystujące jako ostateczny akceptor wodoru azotany, azotyny lub podtlenek azotu z wytworzeniem tlenków azotu i azotu cząsteczkowego, uchodzącego do atmosfery, jako produktów końcowych reakcji). Proces ten nazywa się denitryfikacją lub oddychaniem azotanowym, który zachodzi w warunkach beztlenowych. Ogólne równanie denitryfikacji wygląda następująco: 5(CH 2 O) + 4NO 3 +4H + 5CO 2 + 2N 2 + 7H 2 O Denitryfikatory są to powszechnie występujących w środowisku glebowym bakterie chemoheterotroficznych z rodzaju Bacillus, Micrococcus, Pseudomonas, Aeromonas i Vibrio. Oceniając stopień zanieczyszczenia wód związkami azotu naleŝy rozpatrywać ich jakościowe i ilościowe występowanie. Obecność w wodzie powierzchniowej amoniaku, przy braku azotynów wskazuje na świeŝe zanieczyszczenia wody ściekami gospodarczymi lub innymi związkami organicznymi. Jednoczesne występowanie amoniaku i azotynów wskazuje na to, Ŝe zanieczyszczenie wody nastąpiło jakiś czas temu. Natomiast brak amoniaku i azotynów przy obecności azotanów wskazuje o dawnym zanieczyszczeniu wody i zapoczątkowaniu procesów jej samooczyszczania. 2

3 1. Przygotowanie biomasy bakterii Nitrosomonas sp. i Nitrobacter sp. Bakterie Nitrosomonas sp. i Nitrobacter sp. to płynna zawiesina preparatu BIOLEN IN 100 firmy BioArcus. a) Przygotować poŝywkę hodowlaną zawierającą w 1000ml o ph 7.6: 0,306g NH 4 Cl, 0,1g Na 2 HPO 4 12H 2 O; 0,05g MgSO 4 7H 2 O; 0,015g CaCl 2 2H 2 O; 1,13g NaHCO 3 ; 99µg MnCl 2 4H 2 O; 6,3µg ZnSO 4 7H 2 O; 26,3µg NiSO 4 7H 2 O; 2,81µg CoSO 4 7H 2 O; 4,99µg CuSO 4 5H 2 O PoŜywkę zautoklawować w autoklawie automatycznym (temp. 121 o C, czas ok. 45min) b) Do kolby Erlenmayera o pojemności 250 ml wprowadzić 150ml poŝywki oraz roztwór NH 3 aq tak aby jego stęŝenie w poŝywce wyniosło 15mM (wprowadzić 88 µl stęŝonego roztworu NH 3 aq do 150ml poŝywki) c) Do kolb z poŝywką i amoniakiem dodać 20 ml preparatu BIOLEN IN 100. Do jednej kolby z poŝywką i NH 3 aq nie dodawać preparatu BIOLEN (próba kontrolna). d) Przed inkubacją pobrać 15ml mieszaniny, próbkę odwirować, supernatant zachować do pomiaru spektrofotometrycznego (jako próba ślepa, punkt IVa) e) Kolby owinąć folią aluminiową i inkubować w 35 o C w łaźni wodnej z wytrząsaniem. f) Po 24, 48 i 96 godzinach inkubacji pobrać po 15ml zawiesiny hodowlanej, próbki odwirować (10min, 5500rpm), a supernatant pozostawić do analizy 3

4 2. Przygotowanie krzywej wzorcowej a) Przygotować wzorcowy roztwór azotynu sodu o stęŝeniu 100 µg/ml b) Do probówek typu falkon o pojemności 15ml sporządzić szereg rozcieńczeń wzorcowego roztworu NaNO 2 (w dwóch powtórzeniach) wg poniŝszej tabeli: Nr próby NaNO 2 (µl) H 2 O (ml) 12 11,99 11,97 11,95 11,85 11,75 11,5 Ilość NO 2 µg/ml 0 0,5 2,5 5, c) Do otrzymanych roztworów dodać 350 µl odczynnika A, i 350µl odczynnika B, (odczynniki Griessa) dokładnie wymieszać i po 10 minutach oznaczyć wartość absorbancji przy długości fali przy λ = 545nm w odniesieniu do próbki nie zawierającej amoniaku. Wykreślić krzywą wzorcową odkładając na osi X stęŝenie jonów azotynowych w µg/ml, a na osi Y odpowiednie wartości absorbancji. Z krzywej wzorcowej odczytać stęŝenie jonów NO - 2 w badanych próbach. 3. Oznaczanie azotynów a) Do probówek typu falkon dodać po 12ml otrzymanych supernatantów, następnie do kaŝdej dodać 350µl odczynnika Griessa A, i 350µl odczynnika Griessa B, wymieszać i pozostawić na 10min. Te same czynności wykonać dla próbki otrzymanej w punkcie Id, która będzie tzw. próbą ślepą. b) Po upływie 10 min odczytać wartość absorbancji prób badanych przy λ = 545nm 4. Opracowanie wyników a) Wykreślić krzywą wzorcową oznaczając na osi odciętych stęŝenie jonów azotynowych w µg/ml, na osi rzędnych odpowiadające im wartości absorbancji. b) Na krzywą wzorcową nanieść uzyskane wyniki, odczytać stęŝenie jonów NO 2 i uzasadnić wyniki. 4

5 Odczynniki Preparat BIOLEN IN100 (zawiesina bakterii Nitrosomonas sp. i Nitrobacter sp.) PoŜywka hodowlana zawiera w 1000ml: 0,306g NH 4 Cl, 0,1g Na 2 HPO 4 12H 2 O; 0,05g MgSO 4 7H 2 O; 0,015g CaCl 2 2H 2 O; 1,13g NaHCO 3 ; 99µg MnCl 2 4H 2 O; 6,3µg ZnSO 4 7H 2 O; 26,3µg NiSO 4 7H 2 O; 2,81µg CoSO 4 7H 2 O; 4,99µg CuSO 4 5H 2 O StęŜony roztwór NH 3 aq NaNO 2 Odczynnik Griessa: o Roztwór A: 0,1% sulfanilamid w H 2 O o Roztwór B: 0,1% dichlorowodorek N-1-naftyloetylenodiaminy w 5% H 3 PO 4 5