Biochemia Ćwiczenie 7 O R O P

Transkrypt

1 Imię i nazwisko Uzyskane punkty Nr albumu data /2 podpis asystenta ĆWICZENIE 6 FSFATAZY SCZA KRWI Wstęp merytoryczny Fosfatazy są enzymami należącymi do klasy hydrolaz, podklasy fosfomonoesteraz. Hydrolizują one wyłącznie wiązania estrowe tworzone przez kwas fosforowy(v) wg schematu: R P H + H 2 R H + H P H H H Ryc. 1. Schemat reakcji katalizowanej przez fosfatazy Doświadczenia z użyciem wody znakowanej izotopem 18 wykazały, że enzymy te powodują zerwanie wiązania pomiędzy fosforem a tlenem i przeniesienie reszty fosforanowej na cząsteczkę wody. W przypadku organizmów eukariotycznych wyróżnia się trzy rodziny fosfataz kodowanych przez trzy odrębne strukturalnie rodziny genów: dwie rodziny fosfataz serynowo/treoninowych białek PPP i PPM, jedną rodzinę fosfataz tyrozynowych białek PTP. Fosfatazy klasy PPP i PPM należą do grupy metaloproteinaz zawierających w centrum katalitycznym jon/jony metali (Fe 2+ /Fe 3+, Mn 2+, Zn 2+ ) uczestniczące m.in. w aktywacji cząsteczek wody. Fosfatazy klasy PTP wykorzystują tzw. triadę katalityczną (Asp, Cys, Glu). Ryc. 2. Mechanizm hydrolizy wiązania estrowego przy udziale fosfatazy klasy PTP. Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 1

2 Fosfatazy uczestniczą m.in. w regulacji metabolizmu glikogenu, skurczu mięśni, cyklu komórkowego, aktywności neuronów i splicingu RNA (PPP), oddychania komórkowego, biosyntezy kwasów tłuszczowych i cholesterolu, sygnalizacji wewnątrzkomórkowej (PPM) oraz sygnalizacji międzykomórkowej (PTP). W osoczu krwi stwierdza się aktywność dwóch podstawowych fosfataz: zasadowej (E.C ) i kwaśnej (E.C ). Enzymy te, zgodnie z brzmieniem przymiotnikowych członów ich nazw, wykazują zasadniczo różne optimum ph. Fosfataza zasadowa wykazuje bowiem mierzalną aktywność w przedziale ph 8,0-11,5 natomiast fosfataza kwaśna w ph 3,8-6,0. Fosfataza zasadowa jest enzymem o szerokim powinowactwie. Jej substratami mogą być: -glicerofosforan, fenylofosforan, glukozo-6-fosforan, p-nitrofenylofosforan, L-naftylofosforan. W organizmie człowieka, podobnie jak w organizmach ssaków, występuje kilka izoenzymów fosfatazy zasadowej o zróżnicowanej lokalizacji narządowej. Znaczne aktywności tego enzymu stwierdza się w cytoplazmie i mikrosomach neuronów istoty szarej centralnego układu nerwowego, enterocytów, osteoblastów, hepatocytów i komórek łożyska. W osoczu krwi oraz limfie stwierdza się obecność zespołu izoenzymów o różnym pochodzeniu tkankowym, z dominacją izoenzymu pochodzącego z wątroby. Fosfataza kwaśna wykazuje, podobnie jak zasadowa, szerokie powinowactwo substartowe, katalizując hydrolizę wiązań fosfoestrowych w fenylofosforanie, p-nitrofenylofosforanie, -glicerofosforanie oraz w glukozoi fruktozofosforanach. Podobnie jak to miało miejsce w przypadku fosfatazy zasadowej, w organizmie występują liczne izoenzymy fosfatazy kwaśnej o zróżnicowanej lokalizacji narządowej. Wysokie aktywności tego enzymu stwierdza się w komórkach gruczołu krokowego, śledziony, wątroby, miąższu nerek, a także w neuronach UN, erytrocytach i trombocytach. W osoczu stwierdza się zespół izoenzymów o zróżnicowanym pochodzeniu tkankowym, z dominacją wariantu wątrobowego, śledzionowego i trombocytarnego. prócz różnic w zakresie optimum ph fosfatazy: zasadową i kwaśną, różni podatność na aktywacyjny i inhibicyjny wpływ jonów metali dwuwartościowych. Doświadczenie 1 Cel: Porównanie aktywności fosfataz: zasadowej i kwaśnej w surowicy krwi oraz ocena wpływu jonów magnezowych na ich aktywność Zasada metody: Fosfatazy w odpowiednio dobranym do ich optimum ph (dla fosfatazy zasadowej ph=10.3; dla fosfatazy kwaśnej ph = 4.8), hydrolizują p-nitrofenylofosforan do p-nitrofenolu i anionu fosforanowego(v). powstający w trakcie reakcji produkt - p-nitrofenol po dodaniu 1mol/l roztworu NaH tworzy sól (p-nitrofenolan sodu) o zabarwieniu żółtym. Związek ten wykazuje maksimum absorpcji przy długości fali = 405 nm. Stopień absorpcji promieniowania o tej długości jest proporcjonalny do ilości uwolnionego p-nitrofenolu. 2 N P - Na + 2 N H + H P - Na + Ryc. 3. Schemat reakcji hydrolizy p-nitrofenylofosforanu do p-nitrofenolu i anionu fosforanowego(v) Materiałem do badań są surowice kontrolne w postaci suchej (liofilizaty) przygotowane na bazie surowicy krwi owczej, częściowo wzbogacane i standaryzowane na wartości prawidłowe surowicy ludzkiej SERSTANDARD N lub wartości patologiczne SERSTANDARD P. Liofilizaty zostają rozpuszczone i w gotowej formie wydane. Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 2

3 Postępowanie: 1.1. znaczenie aktywności fosfatazy zasadowej w surowicy krwi Przygotuj 5 jednorazowych kuwet akrylowych o wymiarach 10x10x45mm i dodaj do każdej z nich odpowiednie odczynniki zgodnie ze schematem zamieszczonym w poniższej tabeli: składnik 0.05 M bufor glicynowy ph 10,3 z substratem (23 mm r-r p-nitrofenylofosforanu) Numer kuwety cm cm cm cm cm 3 H cm cm cm M roztwór wodny MgCl cm cm 3 surowica prawidłowa cm cm 3 - surowica patologiczna cm cm 3 Zmierz absorbancję próbek nr 2, 3, 4 I 5 względem próbki nr 1 (odnośnik) przy długości fali =405 nm w czasie 0 (A 0 ) Inkubuj kuwety w temperaturze 37 C przez 30 min. Po tym czasie do kuwet natychmiast dodaj: 1 mol/l NaH 0.1 cm cm cm cm cm 3 Zmierz absorbancję próbek nr 2, 3, 4 I 5 względem próbki nr 1 (odnośnik) przy długości fali =405 nm po inkubacji (A 1 ) blicz aktywność fosfatazy zasadowej w jednym mililitrze surowicy prawidłowej i patologicznej w warunkach kontrolnych (bez dodatku MgCl 2 ) oraz w obecności 0.1 M roztworu wodnego MgCl 2 zgodnie z podanym wzorem: K = (A 1 -A 0 ). V k t.. l. V S mol min x ml gdzie: A 0 - absorbancja początkowa próbki; A 1 - absorbancja końcowa próbki; l - grubość warstwy roztworu w kuwecie wyrażona w cm = 1 cm; V k - końcowa objętość próbki w kuwecie = 2 ml; t - czas prowadzenia reakcji enzymatycznej = 30 min.; - współczynnik absorbancji molowej p-nitrofenolu = 18,5x10 6 [M -1 cm -1 ]; V s - objętość surowicy w próbce = 0.1 ml. bliczenia: Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 3

4 Wnioski: 1.2. znaczenie aktywności fosfatazy kwaśnej w surowicy krwi Przygotuj 5 jednorazowych kuwet akrylowych o wymiarach 10x10x45mm i dodaj do każdej z nich odpowiednie odczynniki zgodnie ze schematem zamieszczonym w poniższej tabeli: składnik 0.05 M bufor cytrynianowy ph 4,8 z substratem (23 mm r-r p-nitrofenylofosforanu) Numer kuwety cm cm cm cm cm 3 H cm cm cm M roztwór wodny MgCl cm cm 3 surowica prawidłowa cm cm 3 - surowica patologiczna cm cm 3 Zmierz absorbancję próbek nr 2, 3, 4 I 5 względem próbki nr 1 (odnośnik) przy długości fali =405 nm w czasie 0 (A 0 ) Inkubuj kuwety w temperaturze 37 C przez 30 min. Po tym czasie do kuwet natychmiast dodaj: 1 mol/l NaH 0.1 cm cm cm cm cm 3 Zmierz absorbancję próbek nr 2, 3, 4 I 5 względem próbki nr 1 (odnośnik) przy długości fali =405 nm po inkubacji (A 1 ) blicz aktywność fosfatazy kwaśnej w jednym mililitrze surowicy prawidłowej i patologicznej w warunkach kontrolnych (bez dodatku MgCl 2 ) oraz w obecności 0.1 M roztworu wodnego MgCl 2 zgodnie z podanym wzorem: K = (A 1 -A 0 ). V k t.. l. V S mol min x ml gdzie: A 0 - absorbancja początkowa próbki; A 1 - absorbancja końcowa próbki; l - grubość warstwy roztworu w kuwecie wyrażona w cm = 1 cm; V k - końcowa objętość próbki w kuwecie = 2 ml; t - czas prowadzenia reakcji enzymatycznej = 30 min.; - współczynnik absorbancji molowej p-nitrofenolu = 18,5x10 6 [M -1 cm -1 ]; V s - objętość surowicy w próbce = 0.1 ml. Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 4

5 bliczenia: Wnioski: 1.3. Porównanie aktywności fosfataz: zasadowej i kwaśnej w surowicy prawidłowej i patologicznej Na podstawie uzyskanych wyników przeprowadzonych oznaczeń aktywności fosfataz zasadowej i kwaśniej porównaj aktywność tych enzymów w surowicy prawidłowej i patologicznej. Wnioski: Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 5

6 Doświadczenie 2 Cel: kreślenie stałej Michealisa (K m ) i szybkości maksymalnej reakcji (V max ) katalizowanej przez fosfatazę zasadową. Zasada metody: Fosfataza zasadowa w ph=10.3; katalizuje reakcję hydrolizy p-nitrofenylofosforanu do p-nitrofenolu i anionu kwasu fosforowego(v). Powstający w trakcie reakcji p-nitrofenol po dodaniu 1 mol/l roztworu NaH tworzy sól (p-nitrofenolan sodu) o zabarwieniu żółtym. Związek ten wykazuje maksimum absorpcji przy długości fali = 405 nm. Stopień absorpcji promieniowania o tej długości fali jest proporcjonalny do ilości uwolnionego p-nitrofenolu. Stałą Michealisa (K m ) i szybkość maksymalną reakcji (V max ) katalizowanej przez fosfatazę zasadową można wyznaczyć: matematycznie: na podstawie równania Michaelisa-Menten lub równania Lineweavera-Burka 1/V = K M /Vmax x 1/[S] + 1/Vmax; graficznie: na podstawie krzywej Michaelisa-Menten (wykres zależności szybkości reakcji od stężenia substratu) i/lub wykresu Lineweavera-Burka (wykres zależności odwrotności szybkości reakcji od odwrotności stężenia substratu). Ryc. 4. Wykres Michaelisa-Menten Ryc. 5. Wykres Lineweavera-Burka Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 6

7 Postępowanie: 2.1. znaczenie aktywności fosfatazy zasadowej w surowicy krwi w próbkach zawierających różne stężenia substratu (p-nitrofenylofosforanu). Przygotuj 10 jednorazowych kuwet akrylowych o wymiarach 10x10x45mm i dodaj do każdej z nich odpowiednie odczynniki zgodnie ze schematem zamieszczonym w poniższej tabeli: odczynnik c = 0,36 mmol/lw 0,05 mol/l buforze c = 0,72 mmol/lw 0,05 mol/l buforze c = 1,44 mmol/l w 0,05 mol/l buforze c = 2,88 mmol/l w 0,05 mol/l buforze c = 5,75 mmol/l w 0,05 mol/l buforze c = 11,50 mmol/l w 0,05 mol/l buforze c = 23,00 mmol/l w 0,05 mol/l buforze c = 34,50 mmol/l w 0,05 mol/l buforze c = 46,00 mmol/l w 0,05 mol/l buforze Numer kuwety cm cm 3 cm 3 cm 3 cm 3 cm 3 cm 3 cm 3 cm 3 cm 3 Wyzeruj spektrofotometr na kuwetę nr 10 (odnośnik) przy długości fali =405nm; Dodawaj surowicę do kolejnych kuwet stosując za każdym razem 1 min opóźnienie w stosunku do poprzedniej próbki Surowica krwi owczej cm 3 cm 3 cm 3 cm 3 cm 3 cm 3 cm 3 cm 3 cm 3 Bezpośrednio po dodaniu surowicy i wymieszaniu zawartości każdej kolejnej kuwety dokonaj pomiaru absorbancji A o (ekstynkcji) przy długości fali =405nm Inkubuj próbki przez 30 min w temperaturze 37 C. Po upływie czasu inkubacji dodaj do poszczególnych kuwet z zachowaniem 1 minutowego opóźnienia w stosunku do poprzedniej próbki: mol/l roztwór NaH cm 3 cm 3 cm 3 cm 3 cm 3 cm 3 cm 3 cm 3 cm 3 cm 3 Wyzeruj spektrofotometr na kuwetę nr 10 (odnośnik) przy długości fali = 405 nm. Dokonaj pomiaru absorbancji A 1 (ekstynkcji) przy długości fali = 405 nm Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 7

8 blicz aktywność fosfatazy zasadowej w jednym mililitrze surowicy zgodnie z podanym wzorem: K = (A 1 -A 0 ). V k t.. l. V S mol min x ml gdzie: A 0 - absorbancja początkowa próbki; A 1 - absorbancja końcowa próbki; l - grubość warstwy roztworu w kuwecie wyrażona w cm = 1 cm; V k - końcowa objętość próbki w kuwecie = 2 ml; t - czas prowadzenia reakcji enzymatycznej = 30 min.; - współczynnik absorbancji molowej p-nitrofenolu = 18,5x10 6 [M -1 cm -1 ]; V s - objętość surowicy w próbce = 0.1 ml. Na podstawie uzyskanych wyników oblicz wartości 1/V max dla wszystkich stężeń substratu oraz wartości 1/[s] dla poszczególnych próbek. bliczenia: Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 8

9 Uzyskane wyniki zestaw w poniższej tabeli. Stężenie roztworu wzorcowego p-nitrofenylofosforanu (w 0.05 mol/l buforze glicynowym o ph=10.3) użytego do przygotowania próbki [mmol/l] Stężenie p-nitrofenylofosforanu w próbce (w kuwecie) [s] [mmol/l] 0,36 0,34 0,72 0,68 1,44 1,37 2,88 2,74 5,75 5,46 11,50 10,92 23,00 21,85 34,50 32,77 46,00 43,70 1/[S] [l/mmol] A 0 A 1 v [mol/min] 1/v [min/mol] 2.2. Wyznaczanie stałej Michaelisa (K m ) i szybkości maksymalnej (V max ) reakcji katalizowanej przez fosfatazę zasadową. Na podstawie uzyskanych wartości szybkości reakcji przy różnych stężeniach substratu wykreśl krzywą Michaelisa-Menten i wykres Lineweavera-Burka. Na podstawie uzyskanych wykresów wyznacz wartości V max i K m. Wnioski: Miejsce na wklejenie wykresów. Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 9