Kinetyka reakcji hydrolizy sacharozy katalizowanej przez inwertazę

Transkrypt

1 Kinetyka reakcji hydrolizy sacharozy katalizowanej przez inwertazę Prowadzący: dr hab. inż. Ilona WANDZIK mgr inż. Sebastian BUDNIOK mgr inż. Marta GREC mgr inż. Jadwiga PASZKOWSKA Miejsce ćwiczenia: sala 7

2 CEL ĆWICZENIA Celem ćwiczenia jest wyznaczenie stałej Michaelisa (K m ) oraz szybkości maksymalnej (V max ) dla reakcji hydrolizy sacharozy katalizowanej przez inwertazę oraz określenie wpływu stężenia enzymu na szybkość hydrolizy sacharozy. WSTĘP TEORETYCZNY Kinetyka reakcji enzymatycznych (na podstawie Ćwiczenia z biochemii, praca zbiorowa pod redakcją Leokadii Kłyszejko- Stefanowicz, PWN, Warszawa-Poznań 1982) Kinetyka reakcji chemicznych zajmuje się badaniem szybkości przebiegu reakcji w zależności od różnych czynników (stężenia reagentów, temperatury, obecności katalizatorów). Zadaniem kinetyki jest ustalenie charakteru reakcji i matematyczne ujęcie zależności pomiędzy szybkością reakcji a czasem jej trwania, co pozwala na podanie szybkości reakcji w dowolnym czasie i przy dowolnym stężeniu substratu. Podstawą katalitycznej reakcji enzymatycznej jest odwracalne wzajemne oddziaływanie substratu (S) z enzymem (E), przy którym powstaje nietrwały kompleks (ES), który następnie rozpada się na enzym i produkt reakcji (P). Schemat reakcji enzymatycznej można przedstawić równaniem: E + S k 1 k 3 k 2 ES E + P Gdzie: E S ES P k 1, k 2, k 3 wolny enzym substrat kompleks enzym-substrat produkt stałe szybkości reakcji W równaniu tym zakłada się nieodwracalny mechanizm reakcji. Przy małym stężeniu enzymu, lecz przy zmieniającym się w szerokich granicach początkowym stężeniu substratu, zmiany początkowej szybkości reakcji, wyrażone jako ilość substratu przetworzonego w jednostce czasu, można przedstawić w postaci krzywej: szybkość V=-d[S]/dt -d[s]/dt=k[e] -d[s]/dt=k[e][s] stężenie substratu [S] Wpływ zwiększania stężenia substratu na szybkość reakcji enzymatycznej 2

3 Krzywa w pewnym punkcie zgina się i osiąga wartość maksymalną. Przy małym stężeniu substratu reakcja jest I rzędu i szybkość reakcji jest uzależniona od stężenia substratu [S]. Przy zwiększeniu stężenia substratu osiąga się maksymalną szybkość reakcji, która jest niezależna od stężenia substratu. Tłumaczy się to faktem, że przy zbyt małym stężeniu substratu niektóre cząsteczki enzymu nie są połączone z substratem w danym momencie i niecałkowite wysycenie enzymu jest przyczyną tego, że nie wykazuje on maksymalnej aktywności katalitycznej. W miarę zwiększania stężenia substratu dochodzi do momentu, gdy wszystkie cząsteczki enzymu są z nim połączone i wówczas enzym pracuje z maksymalną szybkością. Dalsze zwiększanie stężenia substratu nie wpływa już na zwiększenie szybkości reakcji- reakcja przebiega ze stałą szybkością. Dla reakcji (1) szybkość poszczególnych przemian jest następująca: v 1 =k 1 [E][S]=k 1 [E c -ES][S] (2) v 2 =k 2 [ES] (3) v 3 =k 3 [ES] (4) gdzie: [E] stężenie enzymu wolnego [S] stężenie substratu [ES] stężenie kompleksu enzym-substrat [E c ] stężenie całkowite enzymu biorącego udział w reakcji Kompleks ES tworzy się z szybkością v 1, a rozkłada z szybkością v 2 +v 3 Po przekształceniu otrzymujemy: [Ec-ES][S] [ES] = k 1 [E c -ES][S]=k 2 [ES]+k 3 [ES] (5) k2+k3 k1 Uwzględniając, że [E c -ES]=[E], otrzymujemy: = Km (6) [E][S] = [ES] Km (7) Wielkość K m zwana stałą Michaelisa jest wyrazem powinowactwa enzymu do substratu. Enzymy o niskiej wartości K m działają znacznie sprawniej niż enzymy o wysokiej K m. Szybkość tworzenia produktu v 3 zależy od [ES], a więc im wartość [ES] jest większa, a tym samym stała Michaelisa mniejsza, tym szybsze powstawanie produktu. Szybkość reakcji enzymatycznej można zapisać równaniem v 3 = v 1 -v 2 (8) Reakcja v 2 przebiega bardzo wolno, więc można przyjąć, że szybkość procesu enzymatycznego v przebiega z szybkością v 3 : v = v 3 = k 3 [ES] (9) Gdy substrat występuje w dużym nadmiarze, cały enzym jest nasycony substratem, [ES]=[E c ], szybkość reakcji osiąga swą wartość maksymalną: V max = k 3 [E c ] (10) Korzystając z odpowiednich przekształceń równań otrzymujemy zależność: Vmax[S] Km+[S] = V (11) 3

4 szybkość reakcji V Vmax 1/2 V Km [S] Graficzne przedstawienie równania Michaelisa-Menten Jeżeli do równania (11) wstawimy v=v max /2, to otrzymamy po przekształceniu: K m = [S] (12) Czyli stała Michaelisa odpowiada takiemu stężeniu substratu, przy którym szybkość reakcji wynosi połowę szybkości maksymalnej. Praktyczną metodą określania stałej Michaelisa i szybkości reakcji jest metoda graficzna. Doprowadzając równanie (11) do postaci: 1 Km 1 = + 1 V Vmax [S] Vmax (13) Otrzymujemy rónanie o postaci ogólnej y = ax + b, gdzie: b = 1/V max Równanie (13) nosi nazwę równania Lineweavera-Burka. Przekształcenie to ma na celu uzyskanie równania o ogólnej postaci linii prostej. W układzie współrzędnych wartości 1/v odkłada się na osi rzędnych, a wartości 1/[S] na osi odciętych. Równanie daje wówczas linię prostą, której nachylenie określa stosunek K m /V max. Przecina ona oś rzędnych w punkcie 1/V max, a oś odciętych w punkcie 1/K m. W ten sposób można określić maksymalną szybkość V max oraz stałą Michaelisa K m. Graficzne przedstawienie równania Michaelisa-Menten według Lineweavera-Burka 4

5 Aktywność optyczna Związki optycznie czynne posiadają zdolność skręcania płaszczyzny polaryzacji światła. Gdy światło spolaryzowane, wykazujące drgania w określonej płaszczyźnie przejdzie przez substancję optycznie czynną, wówczas jego drgania pojawiają się w innej płaszczyźnie. Kierunek i stopień skręcenia można mierzyć za pomocą polarymetru. Skręcenie w lewo oznaczamy znakiem (-), a skręcenie w prawo znakiem (+). Na przykład (+)-sacharoza jest prawoskrętna. Wielkość kąta skręcenia zależy od liczby cząsteczek znajdujących się na drodze wiązki światła podczas jej przechodzenia przez rurkę polarymetryczną, a zatem zależy od stężenia próbki i od długości rurki pomiarowej. Skręcalność właściwą [α] D danego związku definiujemy jako zaobserwowaną wartość skręcenia, gdy długość rurki pomiarowej wynosi 1 decymetr, stężenie próbki wynosi 1g/ml, a długość fali światła wynosi 589 nm. [α] D = α - obserwowane skręcenie (w stopniach), l długość rurki polarymetrycznej (w dm), c stężenie roztworu (g/ml). Skręcalność właściwa [α] D jest wielkością fizyczną charakterystyczną dla danego związku optycznie czynnego, podobnie jak temperatura topnienia, temperatura wrzenia, gęstość lub współczynnik załamania światła. α l c Hydroliza sacharozy Sacharoza jest dwucukrem zbudowanym z cząsteczki D-glukopiranozy i D- fruktofuranozy. Wiązanie łączące glukozę z fruktozą ulega hydrolizie i to zarówno pod wpływem kwasów mineralnych, jak i enzymu zwanego inwertazą. Z tą reakcją związane jest zjawisko zwane inwersją sacharozy, polegające na zmianie znaku skręcalności roztworu sacharozy (+), gdyż w powstałej równomolowej mieszaninie cukrów fruktoza silniej skręca płaszczyznę polaryzacji w kierunku (-) niż glukoza (+) i cały roztwór przyjmuje skręcalność ujemną, czyli po reakcji znak skręcalności roztworu zmienia się na przeciwny (inwersja). Otrzymywany produkt, który jest mieszaniną D-glukozy i D- fruktozy nazywany jest cukrem inwertowanym. C 12 H 22 O 11 + H 2 O C 6 H 12 O 6 + C 6 H 12 O 6 sacharoza D-glukoza D-fruktoza [α] D = +66.4o [α] D = +52.1o [α] D = -93.1o cukier inwertowany [α] D = -20.5o 5

6 WYKONANIE ĆWICZENIA Sprzęt: polarymetr, rurka polarymetryczna, kolba miarowa o poj. 100 ml, 6 szt, pipeta miarowa o poj. 25 ml, kolby stożkowe o poj. 50 ml, 6 szt., mikropipeta,, waga analityczna. Materiał i odczynniki: sacharoza, bufor octanowy o ph 4,7 roztwór inwertazy Zadanie 1. Wyznaczanie stałej Michaelisa dla reakcji hydrolizy sacharozy katalizowanej przez inwertazę. Wykonanie ćwiczenia: Przygotować 100 ml roztworu sacharozy o stężeniu 4 w buforze octanowym. Do 25 ml roztworu dodać ml (100µl) roztworu inwertazy, wymieszać, szybko napełnić rurkę polarymetryczną i zmierzyć kąt skręcania. Pomiary wykonać w 2, 4, 6, 8 i 10 minucie od wprowadzenia inwertazy do roztworu. Analogicznie przeprowadzić hydrolizę sacharozy wobec takiej samej ilości enzymu dla roztworów o stężeniu 0,5, 1, 1,5, 2 i 3 g/100 ml. Opracowanie wyników: 1. Uzyskane wyniki zebrać w tabeli (dla każdego stężenia substratu): Czas, min Skręcalność, stopnie substratu, c s produktu, c o -c s, Szybkość początkowa, v o, g/min 1/c O 1/v O 1,16 c S = * α + 0,23* c O l l- długość rurki polarymetrycznej, dm α- kąt skręcania, stopnie c O - stężenie wagowe sacharozy na początku pomiarów,. 6

7 2. Dla każdego stężenia sacharozy wykreślić zależność ilości wytworzonego produktu (c O c S ) od czasu. 3. Na każdym wykresie przeprowadzić styczną do krzywej w punkcie t = 0 i wyznaczyć szybkość początkową reakcji równą tgα. 4. Sporządzić wykres Michaelisa-Menten na podstawie wyznaczonych szybkości początkowych v O oraz wyznaczyć na tej podstawie stałą Michaelisa K m. 5. Sporządzić wykres zależności 1/v O od 1/c O dla równania Lineweavera-Burka i wyznaczyć stałą Michaelisa K m oraz maksymalną szybkość reakcji V max. Zadanie 2. Wpływ stężenia enzymu na szybkość hydrolizy sacharozy. Wykonanie ćwiczenia: Przygotować 100 ml roztworu sacharozy o stężeniu 10 w buforze octanowym i do 25 ml tego roztworu wprowadzić 0.25 ml roztworu inwertazy. Wymieszać, szybko napełnić roztworem rurkę polarymetryczną i zmierzyć kąt skręcenia. Pomiary powtórzyć w 5, 10, 15 i 20 minucie doświadczenia. Analogicznie przeprowadzić badania stosując: ml, ml, ml roztworu inwertazy. Opracowanie wyników: 1. Uzyskane wyniki zebrać w tabeli dla każdego stężenia inwertazy: Czas, min Skręcalność, stopnie substratu, c s produktu, c o -c s, Szybkość początkowa, v o, g/min 2. Dla każdego stężenia enzymu sporządzić wykresy zależności ilości produktu od czasu. 3. Wyznaczyć szybkości początkowe reakcji. 4. Przedstawić graficznie zależność szybkości v O od stężenia enzymu. 5. Zinterpretować uzyskane wyniki. Warunki zaliczenia ćwiczenia: Pozytywny wynik kartkówki dopuszczającej do wykonania ćwiczenia Wykonanie sprawozdania, Uwaga: na zajęcia należy przynieść papier milimetrowy 7