HODOWLA PERIODYCZNA DROBNOUSTROJÓW

Transkrypt

1 Cel ćwiczenia: Celem ćwiczenia jest porównanie zdolności rozkładu fenolu lub wybranej jego pochodnej przez szczepy Stenotrophomonas maltophilia KB2 i Pseudomonas sp. CF600 w trakcie prowadzenia hodowli periodycznych. Zadanie 1 Zakładanie hodowli okresowej badanych szczepów bakterii Po uzupełnieniu Tabeli 1 w przeliczeniu na 100 podłoża należy zgodnie z nią założyć hodowle badanych mikroorganizmów.. Skład pożywki mineralnej (g/l): Na 2 HPO 4 *12H 2 O, 4; KH 2 PO 4, 0,5; NH 4 Cl, 0,5; MgSO 4 *7H 2 O, 0,1; ekstrakt drożdżowy 0,1, TMS (ang. Trace Mineral Solution) o składzie: FeSO 4 x 7H 2 O 3,82 g; CoSO 4 x 7H 2 O 295 mg; MnSO 4 x H 2 O 82 mg; ZnSO 4 x 7H 2 O 141 mg; H 3 BO 3 6 mg; Na 2 MoO 4 x 2H 2 O 40 mg; NiSO 4 x 7H 2 O 82 mg; CuSO 4 x 5H 2 O 2,9 mg; Al 2 (SO 4 ) 3 x 18H 2 O 148 mg; Na 2 WO 4 x 2H 2 O 6 mg. Tabela I Stężenie badanego substratu, 80 r-ru wzorcowego.., TMS, pożywki mineralnej, hodowli bakterii, pożywki mineralnej użyta do uzupełnienia objętości hodowli do 100, 1 0,1 80 Kolby inkubować w temperaturze pokojowej lub w 30 C w warunkach wytrząsania (130 rpm). Zadanie 2 Prowadzenie hodowli periodycznej 1) Zaraz po założeniu hodowli określić gęstość hodowli w kolbie poprzez pomiar absorbancji przy = 600 nm oraz wyjściowe stężenie fenolu poprzez pomiar metodą kolorymetryczną z p-nitroaniliną. Wyniki umieścić w Tabeli III. 2) W odstępach 20-minutowych określać gęstość hodowli przez pomiar absorbancji przy = 600 nm oraz sprawdzać ubytek fenolu lub jego metylowej pochodnej poprzez oznaczanie stężenia fenolu metodą z p-nitroaniliną. Wyniki umieszczać w Tabeli III. 3) Wyznaczyć krzywą kalibracyjną do oznaczania stężenia fenolu 4) Na podstawie otrzymanych wyników narysować wykresy ubytku fenolu oraz przyrostu liczby komórek w funkcji czasu w hodowlach szczepów S. maltophilia KB2 i Pseudomonas sp. CF600. 1

2 Oznaczanie fenolu/krezolu metodą kolorymetryczną z p-nitroaniliną 1. Pobrać 1 hodowli i umieścić w probówce typu Eppendorf. Zawartość probówki wirować przez 5 min przy rpm w temperaturze 4 C. 2. Do szklanej probówki miarowej wprowadzić 0,5 odwirowanej hodowli (supernatant) albo jej odpowiednie rozcieńczenie, tj. na przykład rozcieńczenie 10-krotne uzyskuje się poprzez pobranie 50 l supernatantu i 450 l wody destylowanej. 3. Dodać 2 wody destylowanej. 4. Wprowadzić 0,5 zdwuazowanej p-nitroaniliny (otrzymanej poprzez odbarwienie żółtego roztworu p-nitroaniliny z użyciem 2% NaNO 2 ) 5. Dodać 0,25 10% Na 2 CO Wprowadzić 0,5 10% NaOH w celu utrwalenia barwy. 7. Uzupełnić probówkę do objętości 5 poprzez wprowadzenie 1,25 wody destylowanej. 8. Równocześnie przygotować próbę ślepą w identyczny sposób, zastępując supernatant wodą destylowaną. 9. Po wymieszaniu zmierzyć absorbancję przy = 550 nm względem próby ślepej. 10. Uzyskane wyniki absorbancji umieścić w Tabeli II i III. 11. Do przeliczeń stężeń fenolu stosować równanie krzywej kalibracyjnej A = b * c fenolu, gdzie A to absorbancja przy = 550 nm, c fenolu to stężenie fenolu/krezolu wyrażone w, b = współczynnik krzywej kalibracyjnej obliczony metodą najmniejszych kwadratów (patrz: Aneks Tabela IV). Wyniki umieścić w Tabeli II. Wyznaczanie wzrostu bakterii poprzez pomiar absorbancji przy = 600 nm W tym celu należy pobrać po 1 z każdego układu hodowlanego i zmierzyć absorbancję przy długości fali = 600 nm z użyciem spektrofotometru wobec próby ślepej, którą stanowi woda destylowana. Pomiaru dokonywać w odstępach 20-minutowych, a uzyskane wyniki zebrać w Tabeli III. Wyznaczenie krzywej kalibracyjnej do oznaczania stężenia fenolu Krzywą kalibracyjną do oznaczania stężenia fenolu/krezoli wykonać zgodnie z instrukcją do oznaczania fenolu metodą kolorymetryczną z p-nitroaniliną oraz tabelą II. Następnie dane uzyskane w Tabeli II wprowadzić do arkusza Excel, narysować wykres zależności absorbancji od stężenia, wyznaczyć linię trendu opisaną równaniem y=ax 0 +bx 1 oraz określić stopień dopasowania poprzez wyznaczenie współczynnika R 2. 2

3 L.p. Stężenie Fenolu/ Krezolu, Fenol/ Krezol 5, Woda, p-nitroanilina zdwuazowana, Na 2 CO 3 10%, NaOH 10%, Woda, 1 0,0 0,00 2,5 0,5 0,25 0,5 1,25 2 0,1 0,01 2,49 0,5 0,25 0,5 1,25 3 0,2 0,02 2,48 0,5 0,25 0,5 1,25 4 0,3 0,03 2,47 0,5 0,25 0,5 1,25 5 0,4 0,04 2,46 0,5 0,25 0,5 1,25 6 0,5 0,05 2,45 0,5 0,25 0,5 1,25 7 0,6 0,06 2,44 0,5 0,25 0,5 1,25 8 0,7 0,07 2,43 0,5 0,25 0,5 1,25 9 0,8 0,08 2,42 0,5 0,25 0,5 1, ,9 0,09 2,41 0,5 0,25 0,5 1, ,0 0,10 2,4 0,5 0,25 0,5 1,25 Ekstynkcja, = 550 nm Tabela II UWAGA!!! Krzywa zależności ekstynkcji od stężenia jest liniowa tylko w określonym zakresie. Nie można więc stosować uzyskanego równania do wyznaczania stężenia z ekstynkcji większej niż wyznaczona w krzywej kalibracyjnej!!! Wniosek: Badaną krzywą kalibracyjną opisuje równanie:... 3

4 I CIĄGŁA S. maltophilia KB2 Tabela III Pomiar Czas, min. A 600 A 550 Rozc. C fen, 0 : 1 : 2 : 3 : 4 : 5 : 6 : 7 : 8 : Pseudomonas sp. CF600 Pomiar Czas, min. A 600 A 550 Rozc. C fen, 0 : 1 : 2 : 3 : 4 : 5 : 6 : 7 : 8 : 4

5 I CIĄGŁA Sprawozdanie Wyniki należy przedstawić w postaci tabel oraz wykresów opatrzonych komentarzem oraz wnioskami. Wykresy powinny mieć opisane osie, legendę oraz odpowiednią skalę. Dodatkowo proszę wyjaśnić: 1. W jakim celu do podłoża płynnego dodawany był: a) ekstrakt drożdżowy, b) TMS c) Na 2 HPO 4 i KH 2 PO 4 2. W jakim celu w trakcie oznaczania fenolu metodą kolorymetryczną dodawany jest węglan sodu i wodorotlenek sodu oraz na czym polega dwuazowanie p-nitroaniliny. 5