data ĆWICZENIE 8 KINETYKA RERAKCJI ENZYMATYCZNEJ Wstęp merytoryczny

Transkrypt

1 Imię i nazwisko Uzyskane punkty albumu data /3 podpis asystenta ĆWICZENIE 8 KINETYKA RERAKCJI ENZYMATYCZNEJ Wstęp merytoryczny Peroksydazy są enzymami naleŝącymi do klasy oksydoreduktaz. Ich grupą prostetyczną jest hem. Są to enzymy powszechne zarówno w świecie roślinnym jak i zwierzęcym. Tkanki zwierzęce bogate w te enzymy to: leukocyty, płytki krwi, wątroba i inne tkanki metabolizujące eikozanoidy. Peroksydazy redukują nadtlenek wodoru lub inne nadtlenki organiczne np. nadtlenki lipidów, wykorzystując do tego rozmaite donory elektronów: cytochrom c, askorbinian, hydrochinon, aminy aromatyczne, fenole, indol, kwas moczowy. Są to enzymy pełniące funkcje ochronne, zapobiegające nagromadzaniu się nadtlenków i tworzeniu z nich wolnych rodników. Reakcja katalizowana przez peroksydazy jest trzystopniowa: [Fe(III)] Px + H 2 O 2 [Fe(IV)=O]* + H 2 O kompleks I [Fe(IV)=O]* + AH [Fe(IV)=O] + A kompleks I kompleks II [Fe(IV)=O] + AH [Fe(III)] Px + A + H 2 O kompleks II Peroksydaza chrzanowa (EC ) jest glikoproteiną o masie cząsteczkowej około 42 kda, zawierającą zawierającą w centrum aktywnym cztery reszty lizyny oraz pojedynczy, luźno związany z apoproteiną hem. Najbogatszym jej źródłem jest sok z chrzanu, kapusty, szczawiu, marchwi, ziemniaków. Enzym wykazuje optimum aktywności w ph 5,8-7,5. Substratem, czyli donorem wodoru, w prowadzonej przez enzym reakcji mogą być m.in. fenole oraz aminy, np gwajakol, e-toluidyna, pirogalol. Miarą aktywności enzymu jest ilość substratu, którym w tym przypadku jest gwajakol, przekształconego w jednostce czasu. Aktywność enzymu wyraŝa się w jednostkach aktywności (taka ilość enzymu, która katalizuje przemianę 1 µ mola substratu w ciągu 1 min., w temperaturze 30 C i optymalnych warunk ach ph oraz stęŝenia substratu). str. 1

2 Na aktywność enzymów wpływają liczne czynniki, w tym: stęŝenie enzymu, stęŝenie substratu, temperatura, stęŝenie jonów wodorowych w środowisku reakcji (ph środowiska), obecność aktywatorów oraz inhibitorów. Inhibitorem określa się kaŝdą substancję, która zmniejsza szybkość reakcji katalizowanej przez dany enzym. Inhibicja kompetycyjna: Związek będący inhibitorem kompetycyjnym wiąŝe się z białkiem enzymatycznym w centrum aktywnym uniemoŝliwiając związanie się enzymu z właściwym substratem. Dochodzi zatem do konkurencji o miejsce wiązania pomiędzy inhibitorem, a substratem, przy czym enzym wykazuje zwykle wyŝsze powinowactwo do inhibitora, niŝ do substratu. Inhibitor kompetycyjny moŝe być nie tylko analogiem lub pochodną substratu, ale takŝe alternatywnym substratem danej reakcji lub jej produktem. Przykładem inhibicji kompetycyjnej jest hamowanie dehydrogenazy bursztynianowej przez malonian będący analogiem strukturalnym bursztynianu. Obecność pojedynczej grupy metylenowej w strukturze malonianu uniemoŝliwia utlenienie tego związku, jak to ma miejsce w przypadku bursztynianu. Malonian moŝe zatem utworzyć z enzymem kompleks EI, który moŝe dysocjować zgodnie z równaniem: E + I EI. Przykładami tego typu inhibicji jest takŝe hamowanie biosyntezy kwasu foliowego z kwasu p-aminobenzoesowego przez amid kwasu sulfanilowego, a takŝe hamowanie de4hydrogenazy α-ketoglutaranowej przez kwas salicylowy. Zdarzają się takŝe przypadki inhibicji kompetycyjnej powodowanej przez inhibitory nie będące związkami o podobnej do substratu strukturze chemicznej. W tym wypadku mówi się o tzw. inhibicji zwrotnej. Inhibitor wiąŝe się wówczas w miejscu odmiennym niŝ substrat, co powoduje pojawienie się zmiany konformacyjnej białka enzymatycznego powodującej zniekształcenie miejsca wiązania substratu, a zatem brak moŝliwości utworzenia kompleksu enzym-substrat. Inhibicja kompetycyjna moŝe być takŝe wynikiem łączenia się centrum aktywnego enzymu z substratem alternatywnym. Przykładem tego typu inhibicji jest hamowanie fosforylacji glukozy katalizowanej przez heksokinazę przy udziale fruktozy lub mannozy. Inhibicja niekompetycyjna: W przypadku inhibicji niekompetycyjnej zarówno inhibitor, jak i substrat nie wywierają wzajemnego wpływu na wiązanie się z białkiem enzymatycznym. Ich wiązanie się z enzymem przebiega niezaleŝnie od siebie, losowo i zachodzi w odmiennych miejscach w strukturze białka enzymatycznego. Efektem związania się inhibitora z enzymem jest obniŝenie wartości szybkości maksymalnej (V max ). Przykładem tego typu inhibicji jest hamowanie dehydrogenazy α-ketoglutaranowej przez kwas acetylosalicylowy. Inhibicja mieszana: Inhibicja mieszana jest jedną z odmian inhibicji niekompetycyjnej. W tym przypadku inhibitor moŝe wiązać się zarówno z wolnym enzymem, jak i kompleksem enzym-substrat. Powstały kompleks EIS zachowuje nieznaczną aktywność katalityczną. Przykładem tego typu inhibicji jest hamowanie syntazy tymidylanowej przez analogi metylenotetrahydrfolianu, a takŝe wpływ jonów litu na arginazę. Inhibicja akompetycyjna: W przypadku inhibicji akompetycyjnej inhibitor odwracalnie wiąŝe się z kompleksem enzym-substrat tworząc nieaktywny kompleks potrójny: enzym-substrat-inhibitor. Równocześnie inhibitor nie ma zdolności wiązania się z wolnym enzymem. Efektem tego typu inhibicji jest równoczesne obniŝenie o ten sam współczynnik zarówno wartości K m, jak i V max. Przykładem inhibicji akompetycyjnej jest hamowanie dehydrogenazy inozynomonofosforanu przez kwas mykofenolowy (lek cytostatyczny i immunosupresyjny). Podobny efekt wywiera lit w odniesieniu do monofosfatazy inozytolowej katalizującej reakcję rozkładu monofosforanu inozytolu. str. 2

3 CZĘŚĆ I WYZNACZANIE PARAMETRÓW KINETYCZNYCH REAKCJI KATALIZOWANEJ PRZEZ PEROKSYDAZĘ CHRZANOWĄ Doświadczenie 1 Cel: wyznaczenie stałej Michaelisa i szybkości maksymalnej reakcji katalizowanej przez peroksydazę chrzanową w warunkach zmiennych stęŝeń gwajakolu, przy stałym stęŝeniu H 2 O 2 (układ kontrolny) Zasada metody: Peroksydaza katalizuje reakcje utleniania niektórych związków organicznych (aminy aromatyczne, fenole, indol, kwas moczowy) z równoczesną redukcją H 2 O 2, według ogólnego równania: AH 2 + H 2 O 2 A + 2 H 2 O W przeprowadzanym doświadczeniu wykorzystywanym substratem będzie gwajakol (2-metoksyfenol), który w obecności H 2 O 2 pod wpływem ulega utlenieniu, a następnie sprzęgnięciu do tetragwajakolu. Zmiana stęŝenie powstającego tetragwajakolu (związek o barwie rubinowej) oznaczana jest spektrofotometrycznie w sposób ciągły (kinetycznie) poprzez pomiar absorbancji przy długości fali λ=470 nm. Wzrost stęŝenia tetragwajakolu w próbce jest miarą aktywności. Schemat przebiegu reakcji katalizowanej przez : 1.1. Ustalenie ilości enzymu niezbędnego do przeprowadzenia pomiarów kinetycznych W trzech kuwetach pomiarowych naleŝy przygotować mieszaninę inkubacyjną zawierającą roztwór 250-krotnie rozcieńczonego enzymu (gotowy odczynnik), bufor i gwajakol zgodnie z poniŝszą tabelą: 0,1 mol/l gwajakol Końcowe stęŝenie gwajakolu [mm] 1 1,250 0,050 0,200 10,0 2 1,290 0,010 0,200 10,0 3 1,295 0,005 0,200 10,0 Spektrofotometr naleŝy wyzerować przy długości fali λ=470 nm wobec odnośnikowej (2 ml buforu fosforanowego). Mieszaninę inkubacyjną naleŝy umieść w aparacie, a następnie wprowadzić do niej 0,5 ml roztworu H 2 O 2, zmieszać końcówką i rejestrować zmiany absorbancji przez 2 min. Przyrost absorbancji w ciągu 1 minuty powinien wynosić około 0.2 jednostki przy załoŝeniu, Ŝe wykres tej reakcji będzie przez cały ten czas prostoliniowy. JeŜeli prostoliniowość przebiegu tej reakcji zanika przed upływem 1 minuty, enzym naleŝy rozcieńczyć. JeŜeli wzrost absorbancji jest mniejszy niŝ 0.1 jednostki absorbancji, naleŝy zwiększyć ilość enzymu dodawaną do kuwety. str. 3

4 peroksydaza (): o stęŝeniu 1 mg/ml rozcieńczona 250x 0,006 mol/l bufor fosforanowy o 1.2. Oznaczanie aktywności peroksydazy w układzie kontrolnym Przygotuj odpowiednie (wyznaczone w poprzedniej części doświadczenia) rozcieńczenie peroksydazy chrzanowej. W 5 kuwetach pomiarowych naleŝy przygotować buforowane mieszaniny odpowiednio rozcieńczonego enzymu i róŝnych stęŝeń gwajakolu zgodnie z poniŝszą tabelą: 0,1 mol/l gwajakol Końcowe stęŝenie gwajakolu [mm] 1 1,250 0,050 0,200 10,0 2 1,300 0,050 0,150 7,5 3 1,350 0,050 0,100 5,0 4 1,400 0,050 0,050 2,5 5 1,425 0,050 0,025 1,25 Spektrofotometr naleŝy wyzerować przy długości fali λ=470 nm wobec odnośnikowej (2 ml buforu fosforanowego). Mieszaninę inkubacyjną naleŝy umieść w aparacie, a następnie wprowadzić do niej 0,5 ml roztworu H 2 O 2, zmieszać końcówką i rejestrować zmiany absorbancji przez 2 min. peroksydaza (): o stęŝeniu 1 mg/ml rozcieńczona 250x 0,006 mol/l bufor fosforanowy o 1.3. Obliczenie aktywności peroksydazy w układzie kontrolnym Oblicz aktywność właściwą (K) peroksydazy chrzanowej: Α/min. v. R mol K = ε. l. min x ml V S gdzie: A/min - wzrost absorbancji w ciągu 1 minuty v - objętość [2 ml] l - grubość warstwy roztworu w kuwecie [1cm] ε - współczynnik ekstynkcji molarnej dla tetragwajakolu posiada wartość 26,6 mm 1 cm -1 Vs - objętość roztworu enzymu w próbce [0,05 ml] R - rozcieńczenie enzymu str. 4

5 Obliczenia: Doświadczenie 2 Cel: Badanie wpływu siarczanu hydroksyloaminy i azydku sodu na aktywność peroksydazy chrzanowej 2.1. Oznaczanie aktywności peroksydazy chrzanowej w obecności siarczanu hydroksyloaminy Przygotuj odpowiednie (wyznaczone w poprzedniej części doświadczenia) rozcieńczenie peroksydazy chrzanowej. W 5 kuwetach pomiarowych naleŝy przygotować mieszaninę inkubacyjną zawierającą odpowiednio rozcieńczony roztwór enzymu (gotowy odczynnik), bufor, gwajakol oraz siarczan hydroksyloaminy zgodnie z poniŝszą tabelą: 0,1 mol/l gwajakol Siarczan hydroksyloaminy 1 1,150 0,050 0,200 0, ,200 0,050 0,150 0, ,250 0,050 0,100 0, ,300 0,050 0,050 0, ,375 0,050 0,025 0,100 Spektrofotometr naleŝy wyzerować przy długości fali λ=470 nm wobec odnośnikowej (2 ml buforu fosforanowego). Daną próbkę zawierającą mieszaninę inkubacyjną naleŝy umieść w aparacie, a następnie wprowadzić do niej 0,5 ml roztworu H 2 O 2, zmieszać końcówką i rejestrować zmiany absorbancji przez 2 min. peroksydaza (): o stęŝeniu 1 mg/ml odpowiednio rozcieńczona 0,006 mol/l bufor fosforanowy o 0,005 mol/l roztwór siarczanu hydroksyloaminy 2.2. Oznaczanie aktywności peroksydazy chrzanowej w obecności azydku sodu Przygotuj odpowiednie (wyznaczone w poprzedniej części doświadczenia) rozcieńczenie peroksydazy chrzanowej. W 5 kuwetach pomiarowych naleŝy przygotować mieszaninę inkubacyjną zawierającą odpowiednio rozcieńczony roztwór enzymu (gotowy odczynnik), bufor, gwajakol oraz siarczan hydroksyloaminy zgodnie z poniŝszą tabelą: str. 5

6 0,1 mol/l gwajakol Azydek sodu 1 1,150 0,050 0,200 0, ,200 0,050 0,150 0, ,250 0,050 0,100 0, ,300 0,050 0,050 0, ,375 0,050 0,025 0,100 Spektrofotometr naleŝy wyzerować przy długości fali λ=470 nm wobec odnośnikowej (2 ml buforu fosforanowego). Daną próbkę zawierającą mieszaninę inkubacyjną naleŝy umieść w aparacie, a następnie wprowadzić do niej 0,5 ml roztworu H 2 O 2, zmieszać końcówką i rejestrować zmiany absorbancji przez 2 min. peroksydaza (): o stęŝeniu 1 mg/ml rozcieńczona 250x 0,006 mol/l bufor fosforanowy o 0,5 mol/l roztwór azydku sodowego 2.3. Obliczenie aktywności peroksydazy w układzie zawierającym siarczan hydroksyloaminy lub azydek sodu Oblicz aktywność właściwą (K) peroksydazy chrzanowej: Α/min. v. R mol K = ε. l. min x ml V S gdzie: A/min - wzrost absorbancji w ciągu 1 minuty v - objętość [2 ml] l - grubość warstwy roztworu w kuwecie [1cm] ε - współczynnik ekstynkcji molarnej dla tetragwajakolu posiada wartość 26,6 mm 1 cm -1 Vs - objętość roztworu enzymu w próbce [0,05 ml] R - rozcieńczenie enzymu str. 6

7 1. Zestawienie wyników CZĘŚĆ II ANALIZA WPŁYWU SIARCZANU HYDROKSYLOAMINY I AZYDKU SODU NA AKTYWNOŚĆ PEROKSYDAZY CHRZANOWEJ Końcowe stęŝenie 1 gwajakolu [s] [mm] [s] A/min Układ kontrolny Aktywność właściwa (K) 1 K A/min Układ z siarczanem hydroksyloaminy Aktywność właściwa 1 K A/min Układ z azydkiem sodu Aktywność właściwa 1 K 10,00 7,50 5,00 2,50 1,25 2. Opracowanie wyników Opracuj wyniki w układzie Michaelisa-Menten i Lineweavera-Burka. Porównaj je ze sobą. W miejsce szybkości reakcji (V) wstaw wartości aktywności właściwej enzymu (K). Oblicz wartości: K M i V max i umieść je w poniŝszej tabeli z uwzględnieniem jednostek, w których się je wyraŝa: Układ kontrolny Układ z siarczanem hydroksyloaminy Układ z azydkiem sodowym K m. V max Typ inhibicji Wnioski: str. 7