WŁASNOŚCI SPEKTRALNE NUKLEOTYDÓW PIRYDYNOWYCH (NAD +, NADP + ) OZNACZANIE AKTYWNOŚCI TRANSAMINAZY ALANINOWEJ

Transkrypt

1 WŁASNOŚCI SPEKTRALNE NUKLEOTYDÓW PIRYDYNOWYCH (NAD +, NADP + ) OZNACZANIE AKTYWNOŚCI TRANSAMINAZY ALANINOWEJ WSTĘP Nukleotydy pirydynowe (NAD +, NADP + ) pełnią funkcję koenzymów dehydrogenaz przenosząc jony wodorkowe (2e - i 1H + ) (równowaŝniki redukcyjne) między utlenianym substratem, a redukowanym akceptorem. Częścią aktywną koenzymów jest pierścień nikotynoamidowy (Ryc. 1) Ryc. 1. Amid kwasu nikotynowego i dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy, forma zredukowana Przedstawiona na ryc. 2 forma przechodzących w siebie utlenionych struktur koenzymu NAD + (NADP + ) ma w połoŝeniu para do atomu azotu ubogi w elektrony, dodatnio naładowany atom węgla. W to miejsce zostaje wprowadzony jon wodorkowy, tworząc zredukowane formy NADH (NADPH). PoniewaŜ jednocześnie uwalniany jest proton, zredukowane koenzymy nukleotydu pirydynowego poprawnie powinny być zapisywane jako NADH + H + (NADPH+ H + ). Ryc. 2. Formy utlenione amidu kwasu nikotynowego i przyłączenie jonu wodorkowego 1

2 Własności spektralne utlenionych i zredukowanych form nukleotydów pirydynowych (róŝnice w widmie absorpcyjnym) są często wykorzystywane w analityce biochemicznej, np.: 1, stosując odpowiedni substrat moŝna oznaczyć aktywność specyficznej względem niego dehydrogenazy na podstawie ilości zredukowanego koenzymu powstałego zgodnie z reakcją: AH 2 + NAD + A + NADH +H + (NADP + ) (NADPH + H + ) 2, stosując określoną oczyszczoną dehydrogenazę lub odpowiedni układ enzymatyczny moŝna oznaczać małe ilości metabolitów selektywnie utlenianych lub redukowanych przez te enzymy z równoczesnym wytworzeniem stechiometrycznych ilości zredukowanego (utlenionego) koenzymu. Przykładem takich sprzęŝonych reakcji jest układ uŝywany do oznaczania ATP lub glukozy: ATP + glukoza ADP + glukozo-6-fosforan glukozo-6-fosforan + NADP + 6-fosfoglukonolakton + NADPH +H + MoŜliwości szerokiego wykorzystania nukleotydów pirydynowych w analityce wynikają z ich specyficznych właściwości: - zredukowane formy koenzymów wykazują absorbancję w 340 nm; nie wykazują jej formy utlenione koenzymów - zredukowane formy są trwałe w środowisku alkalicznym i wykazują wówczas intensywną fluorescencję własną. Formy utlenione ulegają w takich warunkach natychmiastowej destrukcji. Zredukowane koenzymy są nietrwałe w środowisku kwaśnym, natomiast utlenione wykazują trwałość w niskim ph. Właściwości te dają moŝliwość zniszczenia, po zakończeniu reakcji, nadmiaru koenzymu pozostawiając do pomiaru niezmienioną ilość trwałej w danych warunkach formy nukleotydu zredukowanej w środowisku alkalicznym bądź utlenionej w środowisku kwaśnym - zarówno zredukowana jak i utleniona postać koezymu powstałego w reakcji moŝe być przekształcona w silnie fluoryzującą pochodną dzięki czemu moŝna go oznaczać w stęŝeniach rzędu M, co jest szczególnie uŝyteczne przy oznaczeniu stęŝeń metabolitów w małych próbkach tkanek lub w pojedynczych komórkach. 2

3 A, WYZNACZENIE WIDMA ABSORPCYJNEGO DLA NAD + I NADH+H + Odczynniki: 0,05 M bufor fosforanowy ph 9,0 i ph 6,5 roztwór podstawowy (0,2 mm) NAD + w buforze fosforanowym o ph 6,5 roztwór podstawowy (0,2 mm) NADH + H + w buforze fosforanowym o ph 9,0 Wykonanie: Dokonać pomiarów absorbancji 0,1 mm roztworu NAD + w zakresie widma nm. Pomiary wykonać w kuwetach kwarcowych względem buforu fosforanowego o ph 6,5. Podobnych pomiarów dokonać dla 0,1 mm roztworu NADH + H + względem buforu o ph 9,0. Na podstawie wykreślonego widma: obliczyć teoretyczną wartość absorbancji 0,1 mm roztworu NADH + H + przy 340 nm wiedząc, Ŝe molowy współczynnik absorpcji wynosi 6220 określić na tej podstawie stopień czystości (%) preparatu NADH + H + uŝytego w doświadczeniu B, WYKONANIE KRZYWEJ KALIBRACYJNEJ DLA NADH +H + METODĄ SPEKTROFOTOMETRYCZNĄ Odczynniki: 0,05 M bufor fosforanowy ph 9,0 roztwór podstawowy (0,2 mm) NADH + H + Wykonanie: Z roztworu podstawowego (0,2 mm) NADH + H +, zawierającego 200 nmoli zredukowanego koenzymu w 1 ml, przygotować 6 rozcieńczeń do końcowej objętości 2 ml. Rozcieńczone roztwory powinny zawierać 20, 40, 60, 80, 100 i 150 nmoli NADH + H + w 1 ml roztworu. Do rozcieńczania uŝywać buforu fosforanowego o ph 9,0. Dokonać pomiarów absorbancji roztworów o rosnącym stęŝeniu NADH + H + w 340 nm względem buforu uŝywanego do rozcieńczeń. Wykreślić krzywą wzorcową oraz obliczyć współczynnik kierunkowy. 3

4 C, OZNACZANIE AKTYWNOŚCI AMINOTRANSFERAZY ALANINOWEJ Grupa α-aminowa wielu aminokwasów jest przenoszona na α-ketoglutaran w reakcji, której mechanizm określany jest jako mechanizm podwójnego przeniesienia (reakcje ping-pong). Cechą wyróŝniającą ten mechanizm katalizy jest istnienie enzymu z podstawioną grupą, a więc pośredniej formy enzymu, który uległ czasowej modyfikacji. Tak więc, aminotransferaza alaninowa katalizuje przeniesienie grupy aminowej z alaniny na α-ketoglutaran, a produktami reakcji są pirogronian i glutaminian. Po związaniu alaniny do enzymu zostaje z niej usunięta grupa aminową, która jest przeniesiona na fosforan pirydoksalu (PLP)(koenzym aminotransferaz i liaz), a z aminotransferazy uwalnia się pirogronian. Drugi substrat, α-ketoglutaran, wiąŝe się do zmodyfikowanego enzymu i przyjmuje od niego grupę aminową, a następnie zostaje uwolniony jako produkt reakcji - glutaminian. Na ryc. 3 pokazany jest schemat reakcji podwójnego przeniesienia, a na ryc. 4 mechanizm transaminacji. Ryc. 3. Schemat reakcji podwójnego przeniesienia katalizowanej przez aminotransferazy 4

5 Ryc. 4. Mechanizm transaminacji Powstający w reakcji pirogronian moŝna oznaczać ilościowo zgodnie z poniŝszą reakcją, uŝywając oczyszczonej dehydrogenazy mleczanowej 5

6 Odczynniki: 100 mm roztwór buforu Tris-HCl, ph 8,0 zawierający 20 mm α-ketoglutaran 350 mm roztwór alaniny w 100 mm buforze Tris-HCl, ph 8,0 2,5 mm roztwór NADH + H + w 100 mm buforze Tris-HCl, ph 8,0 roztwór dehydrogenazy mleczanowej o aktywności około 1,2 jednostki w 100 µl (roztwór przygotowany w 100 mm buforze Tris-HCl, ph 8,0 Materiał: OdwaŜyć 1 g niedojrzałych nasion grochu (zielony groszek), przenieść do małego moździerza i rozetrzeć, najpierw na sucho, a potem dodając 1 ml 100 mm buforu Tris-HCl, ph 8,0. Dobrze roztarty materiał przenieś do probówek Eppendorfa i odwirować 5 min przy obr./min. Do oznaczeń uŝywać klarownego nadsączu (supernatantu) rozcieńczonego 5x buforem uŝywanym do homogenizacji. Wykonanie: Do kuwety kwarcowej napipetować 500 µl 100 mm buforu Tris-HCl, ph 8,0 zawierającego 20 mm α-ketoglutaran, następnie dodać 100 µl roztworu NADH + H +, 100 µl dehydrogenazy mleczanowej i 100 µl ekstraktu tkankowego (rozcieńczonego nadsączu). Kuwetę umieścić w spektrofotometrze i sprawdzić stabilność układu, a następnie reakcję transaminacji zapoczątkować dodając 200 µl 350 mm roztworu alaniny. Mierzyć spadki absorbancji przy 340 nm przez około 10 min, a następnie policzyć średnią wartość A/min. Obliczyć aktywność aminotransferazy alaninowej wyraŝoną jako ilość nmoli pirogronianu powstałego w reakcji enzymatycznej w ciągu 1 min. 6