1. Oznaczanie aktywności lipazy trzustkowej i jej zależności od stężenia enzymu oraz żółci jako modulatora reakcji enzymatycznej.

Transkrypt

1 ĆWICZENIE OZNACZANIE AKTYWNOŚCI LIPAZY TRZUSTKOWEJ I JEJ ZALEŻNOŚCI OD STĘŻENIA ENZYMU ORAZ ŻÓŁCI JAKO MODULATORA REAKCJI ENZYMATYCZNEJ. INHIBICJA KOMPETYCYJNA DEHYDROGENAZY BURSZTYNIANOWEJ. 1. Oznaczanie aktywności lipazy trzustkowej i jej zależności od stężenia enzymu oraz żółci jako modulatora reakcji enzymatycznej. Zasada metody: Aktywność lipazy określa się na podstawie ilości uwolnionych kwasów tłuszczowych z tłuszczów roślinnych, w czasie działania enzymu w optymalnych warunkach. Ilość uwolnionych kwasów tłuszczowych oznacza się poprzez miareczkowanie mianowanym roztworem NaOH wobec fenoloftaleiny jako wskaźnika. Część analityczna Przygotowanie substratu Odmierzyć 25 ml oleju do kolbki stożkowej. Dodać 1 ml 0,01M NaOH i sporządzić emulsję przez wytrząsanie. Wolne kwasy tłuszczowe zawarte w oleju tworzą w obecności NaOH mydła, które obniżają napięcie powierzchniowe, a nieznaczny nadmiar NaOH zapewnia słabo alkaliczny odczyn, optymalny dla aktywności lipazy. Oznaczenie aktywności enzymu Przygotować dwa szeregi próbówek i oznaczyć je odpowiednio cyframi: trzy pierwsze próbówki w rzędzie jako 0 (próby kontrolne) a kolejne cyframi od 1 do 5. Następnie do próbówek odmierzyć roztwory odczynników w ilościach podanych w tabelach poniżej. Szereg I. Inkubacja bez aktywatorów Próbówka nr Substrat 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 NaCl 2,0 2,0 2,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 Szereg II. Inkubacja z aktywatorami Próbówka nr Substrat 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 NaCl 1,5 1,5 1,5 2,0 1,5 1,0 0,5 - Żółć 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 W doświadczeniu wykorzystujemy lipazę trzustkową ekstrahowaną ze zliofilizowanego proszku tkankowego trzustki. Lipazę zinaktywowaną otrzymujemy poprzez denaturację cieplną enzymu

2 aktywnego. Do obydwu szeregów próbówek dodawać lipazę w 30 sekundowych odstępach w ilościach przedstawionych w tabeli poniżej. Szereg I Szereg II Próbówka nr Enzym aktywny Enzym zinaktywowany Enzym aktywny Enzym zinaktywowany ,5 1,0 1,5 2,0 2,5 1,0 1,0 1, ,5 1,0 1,5 2,0 2,5 1,0 1,0 1, Wymieszać zawartość próbówek i wstawić do łaźni wodnej o temp. 37 C. Zanotować czas rozpoczęcia inkubacji, Próby należy inkubować przez 30 min. w łaźni wodnej, po czym do każdej z nich należy dodać w odstępach 30 sekund po 2 ml 96% etanolu w celu zatrzymania reakcji enzymatycznej. Kolejność dodawania etanolu do próbówek musi być identyczna jak w przypadku dodawania enzymów. Etanol denaturuje białko oraz ułatwia przejście hydrofobowych produktów reakcji enzymatycznej do fazy wodnej, a tym samym umożliwia ich odmiareczkowanie za pomocą wodnego roztworu NaOH. Przenieść próbówki z łaźni wodnej na stół laboratoryjny i dodać do każdej z nich po 4 krople fenoloftaleiny. Przenieść zawartość próbówek do kolbek stożkowych, a następnie miareczkować 0,01M NaOH do wystąpienia i utrzymania się przez 30 sek. purpurowego zabarwienia. Zanotować objętość wodorotlenku zużytą do zobojętniania poszczególnych próbówek. Uwaga: W czasie miareczkowania wstrząsać intensywnie zawartość kolby, gdyż miareczkowany jest układ dwufazowy!!! Obliczenia i wnioski Od każdej objętości NaOH zużytej do odmiareczkowania próby z aktywnym enzymem odejmij objętość NaOH zużytą do odmiareczkowania odpowiednich prób kontrolnych (średnią z trzech prób), jest ona wykładnikiem kwasowości mieszaniny reakcyjnej niezależnej od aktywności enzymu. Sporządzić wykres zależności aktywności lipazy wyrażonej w ml NaOH zużytego na zobojętnienie wolnych kwasów tłuszczowych powstałych w wyniku hydrolizy od jej stężenia wyrażonego w ml dodanego roztworu enzymu. Opisać wnioski wyciągnięte z doświadczenia. 2. Oznaczanie aktywności dehydrogenazy bursztynianowej za pomocą K 3 [Fe(CN) 6 ] oraz hamowanie jej aktywności w obecności inhibitorów. Zasada metody: Dehydrogenaza bursztynianowa jest flawoproteiną ściśle związaną z wewnętrzną błoną mitochondrialną. Uczestniczy w transporcie protonów i elektronów w łańcuchu oddechowym. W warunkach fizjologicznych utlenia bursztynian do fumaranu, a akceptorem protonów jest ubichinon. W oznaczeniach aktywności enzymatycznej dehydrogenazy bursztynianowej in vitro stosowane są sztuczne akceptory elektronów takie jak heksacyjanożelazian (III) potasu K 3 [Fe(CN) 6 ]. Reakcję redukcji heksacyjanożelazianu (III) potasu przedstawia reakcja: K 3 [Fe(CN) 6 ] + e K 4 [Fe(CN) 6 ] żółty bezbarwny Obserwując zmianę barwy w trakcie przebiegu reakcji, można wnioskować o kierunku przebiegu reakcji oksydacyjno-redukcyjnej w badanym roztworze.

3 Reakcje redukcji heksacyjanożelazianu (III) potasu hamuje malonian, będący odwracalnym inhibitorem kompetycyjnym dehydrogenazy bursztynianowej oraz HgCl 2. Część analityczna Przygotowanie homogenatu Odważyć 10 g wątroby i rozdrobnić. Wprowadzić do cylindra homogenizatora pokrojoną tkankę oraz 50 ml buforu fosforanowego ph=6. Homogenizować przez 5 minut, a następnie przesączyć przez podwójną warstwę gazy. Przygotowanie próbówek z mieszaninami inkubacyjnymi, inkubacja wstępna Przygotować mieszaniny inkubacyjne na podstawie zamieszczonej tabeli. Próbę kontrolną bez substratu będzie stanowiła mieszanina inkubacyjna w próbówce nr 1. Natomiast w próbówce nr 2 będzie się znajdować próba kontrolna bez aktywnego enzymu, w tym celu należy dodać do niej 2 ml 10% kwasu trichlorooctowego, który poprzez denaturację białka spowoduje zanik aktywności enzymu. Wszystkie mieszaniny inkubacyjne należy ogrzewać na łaźni wodnej w temperaturze 37 C przez 5 minut w celu preinkubacji. Numer próbówki ,1 M bufor fosforanowy ph=6, ,05 M bursztynian sodowy 0 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 2,0 2,0 2,0 2,0 0,1 0,1 2,0 2,0 0,05 M malonian sodowy ,1 0,1 0,1 0, ,01 M HgCl 2 0,5%K 3 [Fe(CN) 6 ] Woda destylowana Inkubacja właściwa ,1 0,1 0,1 0,1 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 3,0 2,9 2,9 2,9 2,8 2,8 0,9 0,9 1,0 1,0 2,8 2,8 0,9 0,9 Do każdej próbówki dodać 0,5 ml homogenatu wątroby, wymieszać i inkubować przez 30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 C. Reakcję przerwać poprzez dodanie do każdej próbówki (za wyjątkiem próbówki nr 2) 2 ml 10% kwasu trichlorooctowego, a następnie odwirowywać przez 10 minut. W otrzymanym nadsączu oznaczyć absorbancję przy długości fali 420 nm względem wody. Obliczenia i wnioski Obliczyć i wpisać do tabeli stężenia substratu (bursztynianu) i inhibitorów (malonianu, HgCl 2 ) w poszczególnych próbówkach. Opisać w których próbówkach obserwowano zmiany zabarwienia i wyjaśnić przyczynę zjawisk obserwowanych w każdej z próbówek. Literatura 1. Biochemia Harpera - Robert Murray 2. Ćwiczenia z biochemii - Leokadia Kłyszejko-Stefanowicz 3. Biochemia. Ćwiczenia praktyczne dla studentów wydziału farmaceutycznego - Lidia Włodek Proszę przynieść na ćwiczenia papier milimetrowy SPRAWOZDANIE

4 1. Oznaczanie aktywności lipazy trzustkowej i jej zależności od stężenia enzymu oraz żółci jako modulatora reakcji enzymatycznej. A. OBSERWACJE DOTYCZĄCE WYZNACZENIA PUNKTU KOŃCOWEGO MIARECZKOWANIA. TYP METODY. B. OBJĘTOŚCI NaOH WYZNACZONE PODCZAS MIARECZKOWANIA Szereg I Szereg II Nr próbki V NaOH Nr próbki V NaOH C. OBLICZENIE V NaOH RÓWNOWAŻNEJ ILOŚCI UWOLNIONYCH WOLNYCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH Szereg I Szereg II Nr próbki V NaOH Nr próbki V NaOH

5 D. WYKONANIE WYKRESU Sporządzenie na papierze milimetrowym wykresu zależności aktywności lipazy wyrażonej w ml NaOH zużytego na zobojętnienie wolnych kwasów tłuszczowych powstałych w wyniku hydrolizy (y) od jej stężenia wyrażonego w ml dodanego roztworu enzymu (x). szereg I X szereg II E. WNIOSKI 2. Oznaczanie aktywności dehydrogenazy bursztynianowej za pomocą K 3 [Fe(CN) 6 ] oraz hamowanie jej aktywności w obecności inhibitorów. A. OBLICZENIE STĘŻEŃ MOLOWYCH BURSZTYNIANU, MALONIANU I HgCl 2 W POSZCZEGÓLNYCH PRÓBACH BADANYCH B. WYNIKI POMIARU ABSORBANCJI I OBSERWACJE Numer próbówki C bursztynianu [mol/dm 3 ] C inhibitora [mol/dm 3 ] A Zajście reakcji [-, +, ++, +++]

6 C. WNIOSKI