Ćwiczenie laboratoryjne nr 4 dla e-rolnictwa (20 i 22 - skrypt).

Transkrypt

1 Ćwiczenie laboratoryjne nr 4 dla e-rolnictwa (20 i 22 - skrypt). Oznaczanie aktywności proteolitycznej metodą Ansona na przykładzie trypsyny. Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest poznanie metody oznaczania aktywności enzymów proteolitycznych na przykładzie trypsyny. Wprowadzenie Peptydazy. Peptydazy zwierząt wyższych ze względu na ich lokalizację dzieli się na enzymy pozakomórkowe i wewnątrzkomórkowe. Pierwsze z nich, czyli enzymy trawienne, wydzielane są do przewodu pokarmowego, gdzie rozkładają spożywany pokarm białkowy. Należą do nich: pepsyna, podpuszczka, trypsyna, chymotrypsyna, aminopeptydazy, karboksypeptydazy i elastaza. Enzymy wewnątrzkomórkowe są to tzw. katepsyny, a ich rola polega na utrzymywaniu równowagi między poziomem białek i produktów ich hydrolizy wewnątrz komórki. Peptydazy należą do klasy hydrolaz. Charakteryzują się niską specyficznością w stosunku do rozkładanego substratu, natomiast wykazują wybiórczość w stosunku do położenia hydrolizowego wiązania. W związku z tym wyróżnia się endopeptydazy, rozszczepiające wiązanie wewnątrz łańcucha polipetydowego, oraz egzopeptydazy, działające na wiązanie peptydowe aminokwasów N-końcowych (aminopeptydazy) oraz aminokwasów C-końcowych (karboksypeptydazy). Ponadto niektóre z tych enzymów charakteryzują się specyficznością w stosunku do charakteru reszt aminokwasów tworzących rozkładane wiązanie peptydowe. Na przykład pepsyna rozszczepia te wiązania peptydowe, w których grup aminowych dostarczają aminokwasy aromatyczne i kwaśne, trypsyna te wiązania, w których grupy karbonylowe należą do argininy lub lizyny, chymotrypsyna zaś te wiązania, w których grupy karbonylowe pochodzą z fenyloalaniny, tryptofanu lub tyrozyny, w mniejszym stopniu z leucyny i metioniny. Proteinazy obejmują co najmniej 4 podklasy enzymów, które różnią się budową centrum aktywnego. Wyróżnia się np. enzymy serynowe (z seryną jako głównym aminokwasem kontaktowym), enzymy zawierające grupy SH w centrum aktywnym, czy metaloproteinazy. Trypsyna. Enzym ten, należący do hydrolaz, podpodklasy proteinaz serynowych, jest jednym z ważniejszych enzymów trawiennych. Jest wydzielany przez trzustkę w formie nieaktywnego zymogenu (proenzymu) trypsynogenu. Proenzym w jelicie cienkim przekształcany jest w formę enzymatycznie aktywną. Trypsynogen składa się z pojedynczego łańcucha polipetydowego zawierającego 249 reszt aminokwasowych o znanej sekwencji. Przekształca się on w formę aktywną z udziałem innej proteinazy enteropeptydazy wytworzonej przez śluzówkę jelita cienkiego lub pod działaniem aktywnych cząsteczek trypsyny (autokataliza). Aktywacja trypsynogenu polega na rozerwaniu wiązania peptydowego pomiędzy lizyną i izoleucyna oraz odłączeniu niewielkiego peptydu (6 12 reszt aminokwasowych, zależnie od pochodzenia), który blokuje centrum aktywne enzymu, nie dopuszczając do kontaktu z substratem (Rys. 1). 1

2 Rys 1. Proteolityczna aktywacja trypsynogenu. W centrum aktywnym występują reszty: seryny, histydyny oraz kwasu asparaginowego jako aminokwasy kontaktowe. Trypsyna katalizuje hydrolizę wiązań peptydowych, w których grupy karbonylowe należą do argininy lub lizyny (Rys. 2). Jej masa cząsteczkowa wynosi Da, a optimum ph zawiera się w granicach 7 9. Efektem działania trypsyny na białko są peptydy o różnej długości łańcucha. Rys. 2 Działanie trypsyny na białko. Zasada metody. Szybkość reakcji enzymatycznej katalizowanej przez trypsynę zależy od rodzaju zastosowanego substratu i metody jej oznaczania. Na ćwiczeniu aktywność trypsyny będzie oznaczona metodą Ansona, która polega na pomiarze ilości tyrozyny zawartej w peptydach uwolnionych w trakcie hydrolizy, które nie wytrącają się z 3% kwasem trichlorooctowym. Roztwór białka (kazeina) inkubuje się z enzymem w ph 8,6 i temp. 37 C. Oznaczenie zawartości tyrozyny wykonuje się fotometrycznie przy użyciu odczynnika Folina. Końcowa barwa, której natężenie jest wprost proporcjonalne do ilości tyrozyny w próbie, jest wynikiem redukcji odczynnika fosforomolibdenofosforowolframowego (odczynnik Folina) w środowisku zasadowym do błękitu fosforomolibdenowego głównie przez zawartą w peptydach tyrozynę. Miarą aktywności otrzymanego na ćwiczeniu preparatu trypsyny będzie liczba µmoli tyrozyny zawarta w uwolnionych peptydach. 2

3 Odczynniki 1. 0,1-molowy bufor dietanoloamina-kwas solny o ph 8,6: 0,2-molowy roztwór dietanoloaminy (19,2 ml) dopełnić wodą do 1 l i doprowadzić ph do 8,6 za pomocą 0,1- molowego kwasu solnego (na 50 ml roztworu dietanoloaminy zużywa się ok. 38 ml kwasu solnego i uzupełnia wodą do 100 ml) proc. roztwór kazeiny o ph 8,6: zmiksować w zlewce 1 g kazeiny w ok. 80 ml wody, doprowadzić ph do 8,6 za pomocą 1-molowego kwasu solnego i uzupełnić do 100 ml wodą. 3. Odczynnik Folina (Ciocalteu); przed użyciem odczynnik rozcieńczyć czterokrotnie wodą. 4. 0,5-molowy wodorotlenek sodowy. 5. 7,5-proc. roztwór kwasu trichlorooctowego (przechowywać w lodówce). Wykonanie 1. Hydroliza. Otrzymany w kolbie miarowej na 10 ml roztwór trypsyny, dopełniony do kreski 0,01-molowym buforem dietanoloaminowym (1) dobrze wymieszać. Do 3 enzymatycznie czystych probówek odmierzyć po 2,0 ml roztworu kazeiny (2) i umieścić je w łaźni wodnej w temp. 37 C. Po około 5 min do 2 probówek z kazeiną (próby pełne - P) dodać 1 ml enzymu z kolby miarowej na 10 ml, szybko wymieszać i inkubować w temp. 37 C dokładnie przez 15 min. Następnie do prób pełnych i materiałowej (M) dodać po 2 ml kwasu trichlorooctowego (5), a następnie do próby materiałowej 1 ml enzymu z kolby miarowej na 10 ml. Wszystkie próby wymieszać na wytrząsarce i pozostawić przez 30 min w celu całkowitego wytrącenia osadu białka. Następnie próby przesączyć do czystych probówek przez sączek z bibuły. 2. Fotometryczne oznaczanie tyrozyny. Aby oznaczyć zawartość tyrozyny w produktach proteolizy, trzeba do czystych probówek odmierzyć z prób pełnych i materiałowej po 1 ml klarownego przesączu. Następnie do każdej probówki dodać 2 ml 0,5-molowego wodorotlenku sodowego (4), po czym 0,6 ml odczynnika Folina (3) i zawartość probówek natychmiast dobrze wymieszać. Po 10 min odczytać absorbancję poszczególnych prób w fotometrze przy długości fali 670 nm ustawionym na zero wobec wody. Obliczenie i interpretacja wyników Od średniej wartości absorbancji prób pełnych odjąć absorbancję próby materiałowej. Posługując się różnicą otrzymanej wartości absorbancji, z krzywej wzorcowej odczytać ilość µmoli tyrozyny zawartej w peptydach uwolnionych przez 1 ml trypsyny w ciągu 15 min inkubacji z kazeiną. Aktywność enzymu wyrazić w µmolach tyrozyny zawartej w peptydach uwolnionych w warunkach metody w ciągu 1 min przez 1 ml preparatu trypsyny. Pytania 1. Jak dzielone są peptydazy ze względu na sposób działania na łańcuch polipeptydowy? 2. Wymienić kolejno enzymy proteolityczne działające w przewodzie pokarmowym zwierząt wyższych i krótko je scharakteryzować. 3. Jakiego typu specyficznością charakteryzuje się trypsyna i jakie reszty aminokwasów wchodzą w skład jej centrum aktywnego? 4. Na czym polega aktywacja trypsynogenu i z udziałem jakich enzymów się odbywa? 5. Jaką metodą oznaczana jest aktywność trypsyny na ćwiczeniu? Omówić jej zasadę. W jakim celu przygotowywane są próby kontrolne materiałowe, w jaki sposób przerywana jest reakcja enzymatyczna? 3

4 6. Wyjaśnić i uzasadnić wynik działania trypsyny na kazeinę przy zastosowaniu metody Ansona. 7. W jakich jednostkach wyraża się aktywność trypsyny w metodzie stosowanej na ćwiczeniu? 8. Narysować fragment łańcucha polipeptydowego, z zaznaczonymi wiązaniami peptydowymi i wskazać miejsce działania trypsyny. 9. Omów zasadę oznaczania trypsyny metodą Ansona. W jakim celu w opisanej metodzie dodajemy TCA (kwas trichlorooctowy)? Na podanym przykładzie sekwencji zaznacz miejsca działania trypsyny N- Ala-Tyr-Lys-Cys-Arg-Val -C Badanie szybkości hydrolizy lipidów mleka i oznaczanie aktywności lipazy trzustkowej. Cel ćwiczenia Poznanie alkacymetrycznej metody oznaczania aktywności lipazy z użyciem śmietanki jako naturalnej emulsji lipidu oraz badanie szybkości katalizowanej reakcji zależnie od czasu jej trwania. Wprowadzenie Lipazy. Hydrolazy estrów glicerolu, potocznie nazywane lipazami, należą do klasy hydrolaz, podklasy esteraz. Występują one powszechnie u zwierząt (trzustka, wątroba, ściana żołądka, jelita), jak również w nasionach i organach wegetatywnych roślin. Enzymy te zapoczątkowują proces katabolizmu lipidów (tłuszczowców), które są ich naturalnymi substratami. Rozszczepiają one wiązania estrowe, np. triacyloglicerolu, z przyłączeniem wody i uwolnieniem kwasu tłuszczowego, zgodnie z reakcją pokazaną dla lipazy trzustkowej (Rys. 3). triacyloglicerol 2-acyloglicerol + 2 kwas tłuszczowy Rys. 3. Hydroliza triacyloglicerolu z udziałem lipazy trzustkowej: R 1, R 2, R 3 reszty kwasów tłuszczowych. Lipazy odznaczają się niską specyficznością substratową, gdyż katalizują rozkład estrów utworzonych przez kwasy tłuszczowe o różnej długości łańcucha, nasycone i nienasycone, oraz alkohole długo- i krótkołańcuchowe, jedno- lub wielohydroksylowe. Zależnie od pochodzenia enzymy te różnią się optimum ph działania, np. dla lipazy trzustkowej wynosi ono około 7, lipazy wątrobowej około 8, a lipaz roślinnych 4,5 5,0. Lipaza trzustkowa jest najważniejszym enzymem lipolitycznym przewodu pokarmowego. Działając na triacyloglicerole odszczepia ona kwasy tłuszczowe z pozycji 1 i 3, w wyniku czego powstają monoacyloglicerole (na 2-acyloglicerole działa lipaza ścianki jelita). Enzym ten łatwiej hydrolizuje acyloglicerole nienasyconych kwasów tłuszczowych niż nasyconych analogów. Ponieważ triacyloglicerole są nierozpuszczalne w wodzie, więc enzym działa na granicy faz ester woda i hydrolizie podlegają tylko zewnętrzne wiązania estrowe. Powstający produkt diacyloglicerol jest już bardziej polarny i skutkiem tego szybkość 4

5 działania lipazy trzustkowej, mierzona ilością uwolnionych kwasów tłuszczowych w jednostce czasu, na początku reakcji jest niska i rośnie w miarę zwiększania się stężenia diacylogliceroli. Na aktywność lipazy mogą wpływać niektóre związki chemiczne. Na przykład aktywatorami lipazy trzustkowej są: Ca 2+, cyjanek, związki zawierające grupę SH, a inhibitorami ketony, aldehydy oraz związki reagujące z grupami SH. W przewodzie pokarmowym aktywność lipazy wzmagają kwasy żółciowe, które obniżając napięcie powierzchniowe, ułatwiają zemulgowanie lipidów (zwiększenie powierzchni granicznej między fazą wodną i kuleczkami lipidu). Badanie aktywności lipaz ma znaczenie diagnostyczne, np. aktywność ich obniża się w osoczu przy schorzeniach wątroby, awitaminozie A, niektórych nowotworach złośliwych i cukrzycy. Natomiast wzrasta przy ostrym zapaleniu trzustki i raku trzustki. Metody oznaczania aktywności lipaz. Większość metod oznaczania aktywności lipaz oparta jest na alkacymetrycznym oznaczeniu uwolnionych kwasów tłuszczowych w wyniku działania na estry rozpuszczalne w wodzie, np. tween, lub nierozpuszczalne, np. substraty naturalne (lipidy). Ilość uwolnionych kwasów tłuszczowych można też oznaczyć np. poprzez wytworzenie mydeł miedziowych. Związany z mydłem jon miedziowy oznacza się na podstawie reakcji z dietyloditiokarbaminianem. Substraty nierozpuszczalne w wodzie powinny znajdować się w postaci zemulgowanej, tj. silnie rozproszonej. Otrzymanie jednorodnej emulsji i zachowanie jej przez cały czas działania enzymu na podstawowe znaczenie przy oznaczaniu aktywności lipaz. Optymalna temperatura działania lipazy trzustkowej wynosi 37 C, a ph ok. 7. Obydwie te wartości mogą ulegać zmianie zależnie od rodzaju substratu i buforu. Zasada stosowanej metody. Metoda zastosowana w ćwiczeniu opiera się na pomiarze ilości uwolnionych kwasów tłuszczowych z lipidów mleka pod działaniem lipazy w temp. 37 C i początkowym ph 7,7, którego wartość z upływem czasu ulega niewielkiemu obniżeniu w wyniku uwalniania kwasów tłuszczowych. Ilość uwolnionych kwasów tłuszczowych oznacza się przez zmiareczkowanie mieszaniny inkubacyjnej mianowanym roztworem wodorotlenku potasowego wobec fenoloftaleiny. W opisanej metodzie uzyskuje się proporcjonalność między ilością wyciągu trzustkowego, a szybkością reakcji dopiero po 60 minutach inkubacji. Odczynniki proc. słodka śmietanka homogenizowana zobojętniona 1-molowym wodorotlenkiem potasowym z dodatkiem 1 ml toluenu na 100 ml śmietanki (śmietankę o wyższej zawartości tłuszczu rozcieńczyć wodą). 2. 0,7-molowy bufor fosforanowy o ph 7, proc. etanol (może być skażony, np. metanolem, acetonem) lub metanol. Uwaga! Środek trujący! 4. 0,5-proc. fenoloftaleina w 70-proc. etanolu. 5. 0,05-molowy mianowany roztwór wodorotlenku potasowego. 6. Wyciąg z trzustki wieprzowej; 30 g odtłuszczonej trzustki homogenizować przez ok. 5 min (z przerwami, aby uniknąć nagrzania się roztworu) ze 100 ml wody i uzupełnić wodą do 1l; homogenat przesączyć przez podwójną warstwę gazy, wirować przy 4000 obr./min przez 10 min i przesączyć przez sączek z waty. Wykonanie Próbę otrzymaną do zbadania w kolbce miarowej uzupełnić wodą do kreski i wymieszać. Do 6 probówek odmierzyć po 2,5 ml śmietanki (1) i po 1 ml buforu (2), wymieszać i umieścić w łaźni wodnej o temp 37 C w celu preinkubacji. Po 5 min do 5

6 wszystkich probówek dodać kolejno po 0,5 ml wyciągu lipazy (6), zanotować czas i wymieszać. Po 20 min od dodania enzymu do 2 probówek w łaźni dodać po 5 ml etanolu (3) przerwanie reakcji enzymatycznej, wyjąć probówki z łaźni, następnie przelać do kolb stożkowych na 100ml, dodać kilka kropli fenoloftaleiny (4) i uwolnione kwasy tłuszczowe odmiareczkować wodorotlenkiem potasowym (5) do trwałego różowego zabarwienia (wszystkie próby miareczkować do barwy o takiej samej intensywności). Następnie dwie próby zmiareczkować (postępując jak wyżej) po 40 min, a ostatnie dwie po 60 min od dodania enzymu. Aby określić kwasowość składników mieszaniny inkubacyjnej wykonać próbę kontrolną. W tym celu odmierzyć kolejno do dwóch kolb stożkowych po 2,5 ml śmietanki (1), 1 ml buforu (2), 5 ml etanolu (3), kilka kropli fenoloftaleiny (4), 0,5 ml próby do zbadania (6) i zmiareczkować (jak wyżej) wodorotlenkiem potasowym (5). Opracowanie wyników Od średniej wartości uzyskanej w wyniku miareczkowania prób pełnych po 60 min inkubacji odjąć wartość próby kontrolnej i różnicę w ml wodorotlenku potasowego podać prowadzącemu ćwiczenia. Aktywność lipazy wyrazić w µmolach kwasów tłuszczowych uwolnionych w ciągu 1 min przez enzym z 1 g trzustki (1 ml 0,05-molowego wodorotlenku potasowego = 50 µmoli kwasu tłuszczowego). Obliczyć liczbę mmoli uwolnionych kwasów tłuszczowych w 20-minutowych przedziałach czasu, tj. 0 20, i min. Sporządzić wykres przedstawiający zależność szybkości reakcji hydrolizy tłuszczu od czasu, odkładając na osi rzędnych mmole kwasów tłuszczowych, a na osi odciętych czas w minutach. Na podstawie otrzymanych wyników wnioskować o szybkości hydrolizy lipoidów w badanych przedziałach czasu. Pytania 1. Scharakteryzować hydrolazy estrów glicerolu pod względem funkcji, sposobu działania i specyficzności. Jakie wymagania muszą spełniać substraty wykorzystywane do oznaczania aktywności lipaz? 2. Przedstawić sposób działania lipazy na 1-palmitoilo-2-stearoilo-3- palmitoleiloglicerol. Dlaczego szybkość uwalniania kwasów tłuszczowych z tłuszczu mleka jest niższa na początku reakcji? 3. Podać zasadę stosowanej na ćwiczeniach metody oznaczania lipazy. Dlaczego do mieszaniny inkubacyjnej dodaje się bufor o wysokim stężeniu? g trzustki wieprzowej po homogenizacji rozcieńczono do 1000 ml, pobrano 5 ml i rozcieńczono do 25 ml. Do oznaczenia aktywności lipazy pobrano 1 ml wyciągu i inkubowano z substratem 60 min. Średnia wartość odmiareczkowania próby pełnej wynosiła 21,5 ml, a próby materiałowej 4,5 ml 0,05-molowego wodorotlenku potasowego. Obliczyć aktywność lipazy w mmolach kwasu tłuszczowego na 1 g trzustki i 1 min. 6