data ĆWICZENIE 12 BIOCHEMIA MOCZU Doświadczenie 1

Transkrypt

1 Imię i nazwisko Uzyskane punkty Nr albumu data /3 podpis asystenta ĆWICZENIE 12 BIOCHEMIA MOCZU Doświadczenie 1 Cel: Wyznaczanie klirensu endogennej kreatyniny. Miarą zdolności nerek do usuwania i wydalania danego związku z moczem jest współczynnik oczyszczania, czyli klirens. Im większa jest wartość klirensu, tym skuteczniej wydalany jest ten związek. Klirens określonej substancji to objętość osocza, która jest całkowicie oczyszczona przez nerki z danej substancji w ciągu 1 min. Klirens endogennej kreatyniny służy do oceny wielkości przesączania kłębkowego (wartości normatywne dla kreatyniny mieszczą się w zakresie ml/min.) Przy wyznaczaniu klirensu endogennej kreatyniny dokonuje się oznaczenia stężenia kreatyniny w świeżym moczu, a następnie wyznacza klirens tego związku jako stosunek iloczynu stężenia kreatyniny w moczu (mg/dl) i objętości moczu wydalonego w czasie 1 minuty (ml/min) do stężenia kreatyniny w osoczu (mg/dl). Stężenie kreatyniny w surowicy jest wartością ulegającą tylko nieznacznym wahaniom, zależy głównie od masy mięśniowej oraz płci (u mężczyzn jest wyższe niż u kobiet). Na wzrost stężenia kreatyniny wpływ ma również zwiększona ilość mięsa w diecie. Kreatynina daje charakterystyczną reakcję z kwasem pikrynowym. Roztwór zawierający kreatyninę i kwas pikrynowy po ogrzaniu do temp. 100 C i dodaniu NaOH zmienia zabarwienie z żółtego na pomarańczowe. Intensywność barwy jest proporcjonalna do stężenia kreatyniny. Przygotowanie materiału do badań W ćwiczeniu stosuje się świeży mocz rozcieńczony 50 x. wzorcowy roztwór wodny kreatyniny o stężeniu 5 mg% nasycony roztwór wodny kwasu pikrynowego 1% roztwór wodny NaOH str. 1

2 Przygotuj 3 probówki podpisane odpowiednio: W (próbka zawierająca wzorcowy roztwór kreatyniny), B (próbka badana) i O (próbka ślepa). Do każdej z probówek dodaj kolejne odczynniki zgodnie z tabelą. odczynniki oznaczenie probówki W B O wzorcowy roztwór wodny kreatyniny o stężeniu 5 mg% 0.5 ml - - świeży mocz rozcieńczony 50 x ml - woda destylowana ml nasycony roztwór wodny kwasu pikrynowego 1.5 ml 1.5 ml 1.5 ml Próbki należy ogrzewać w temperaturze 100 C przez sekund, a następnie ochłodzić. 1% roztwór wodny NaOH 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Następnie należy zmierzyć ekstynkcję próbek W i B względem próbki O przy długości fali =530 nm. Oblicz stężenie kreatyniny (mg/dl) w moczu nie rozcieńczonym. Następnie oblicz klirens endogennej kreatyniny korzystając ze wzoru: gdzie: C o współczynnik oczyszczania klirens (ml/min.) U m stężenie substancji w moczu (mg/dl) V m objętość moczu wydalonego w ciągu 1 min. (ml/min.) P o stężenie substancji w osoczu (mg/dl) Obserwacje i obliczenia: str. 2

3 Cel: Wykrywanie patologicznych składników moczu Wykrywanie krwi w moczu. Doświadczenie 2 Hemoglobina, ze względu na swą budowę (obecność hemu), może zachowywać się w reakcjach chemicznych podobnie jak peroksydaza, tzn. może katalizować reakcję utleniania różnych związków organicznych wykorzystując jako utleniacz nadtlenek wodoru. Benzydyna w obecności hemoglobiny ulega utlenieniu za pomocą H 2 O 2 do błękitu benzydynowego. odczynnik benzydynowy 3% roztwór wodny H 2 O 2 Do probówki zawierającej 0.5 ml odczynnika benzydynowego należy dodać 0.5 ml 3% roztworu wodnego H 2 O 2 i 1.0 ml moczu do wykrywania obecności hemoglobiny Wykrywanie białka w moczu. Kwas sulfosalicylowy powoduje denaturację i wytrącenie białka. 10% roztwór wodny kwasu sulfosalicylowego Do 2.0 ml moczu do oznaczania białka należy dodać 5 kropli 10% roztworu wodnego kwasu sulfosalicylowego. str. 3

4 2.3. Wykrywanie cukrów w moczu metodą Benedicta. Glukoza i inne cukry redukujące powodują redukcję jonów Cu 2+ do jonów Cu +. W ćwiczeniu stosuje się niebiesko zabarwiony odczynnik Benedicta (zasadowy roztwór, zawierający związek kompleksowy miedzi z anionami kwasu cytrynowego). W wyniku redukcji jonów Cu 2+ wytrąca się ceglastoczerwony osad tlenku miedzi(ii) (Cu 2 O). odczynnik Benedicta Do 1.0 ml odczynnika Benedicta należy dodać 1 kroplę moczu do oznaczania cukrów. Próbkę należy inkubować w temp. 100 C przez 5 minut Wykrywanie ciał ketonowych w moczu. Aceton i kwas acetooctowy dają fioletowe zabarwienie z proszkiem Rothera (mieszanina nitroprusydku sodu, siarczanu(vi) amonu i węglanu sodu). proszek Rothera Do 0.5 ml moczu do oznaczania ciał ketonowych dodać szczyptę proszku Rothera. str. 4

5 Doświadczenie 3 Cel: Oznaczanie stężenia białka w moczu metodą Extona. Oznaczanie stężenia białka w moczu opiera się na pomiarze zmętnienia moczu na skutek wytrącenia białka przez odczynnik sulfosalicylowy (mieszanina kwasu sulfosalicylowego i siarczanu(vi) sodu). odczynnik sulfosalicylowy 0.9% roztwór wodny NaCl Przygotuj 2 probówki i podpisz je jako: B (próbka badana) i O (próbka ślepa). Do probówek wprowadź odpowiednio: odczynniki oznaczenie probówki mocz do próby Extona 0.5 ml 0.5 ml odczynnik sulfosalicylowy 3.5 ml - 0.9% roztwór wodny NaCl ml Próbki należy inkubować w temp. pokojowej przez 5 minut, a następnie zmierzyć absorbancję próbki B względem próbki O przy długości fali =445 nm. Mierzona ekstynkcja jest w tym przypadku miarą zmętnienia roztworu, a nie miarą absorpcji promieniowania. Z krzywej wzorcowej należy odczytać stężenie białka w moczu (mg/dl) B O str. 5

6 Doświadczenie 4 Cel: Oznaczanie stężenia mukopolisacharydów w moczu. Mukopolisacharydozy to choroby spowodowane przez genetycznie uwarunkowane zaburzenia syntezy enzymów lizosomalnych odpowiedzialnych za degradację glikozoaminoglikanów (mukopolisacharydów) np. siarczanu chondroityny. Skutkiem tego jest odkładanie się w tkankach tych związków lub produktów ich częściowego katabolizmu. Ostatecznie dochodzi do zwiększonego wydalania mukopolisacharydów w moczu Próba z błękitem toluidyny Mukopolisacharydy tworzą z błękitem toluidyny niebiesko zabarwiony kompleks. Jest to próba nieswoista, pozwalająca jedynie na wstępną, orientacyjną ocenę zawartości mukopolisacharydów w moczu. wzorcowe roztwory siarczanu chondroityny o stężeniach 5, 10, 15, 30 mg/dl błękit toluidyny Na pasek bibuły (Whatman nr 1) należy nałożyć w odstępach co 2 cm po 10 μl wzorcowych roztworów siarczanu chondroityny o stężeniach 5, 10, 15, 30 mg/dl. Poniżej, pod uprzednio nałożonymi roztworami wzorcowymi, należy nałożyć 4 razy po 10 μl badanego moczu. Po wysuszeniu bibułę należy zanurzyć w roztworze błękitu toluidyny na 1 minutę, następnie zlać barwnik, a bibułę płukać pod bieżącą wodą aż do momentu, kiedy spływająca woda stanie się bezbarwna. Po wysuszeniu należy porównać zabarwienie każdej plamy badanego moczu z położoną wyżej plamą odpowiadającą danemu stężeniu wzorca Oznaczanie mukopolisacharydów w moczu metodą zmętnieniową. Mukopolisacharydy tworzą z chlorkiem cetylopirydyny trudno rozpuszczalny związek kompleksowy, wywołujący zmętnienie roztworu. Między stężeniem mukopolisacharydów i wielkością tego zmętnienia istnieje liniowa zależność. str. 6

7 roztwór standardowy siarczanu chondroityny o stężeniu 10 mg/dl 0,1 M bufor cytrynianowy ph 4,8 0,1% roztwór wodny chlorku cetylopirydyny w buforze cytrynianowym Do czterech probówek oznaczonych symbolami: B (próba badana), Ob (próba ślepa dla próby badanej), W (wzorzec), Ow (próba ślepa dla wzorca) należy dodać kolejno: odczynnik oznaczenie probówki B Ob W Ow odwirowany mocz 1.0 ml 1.0 ml - - roztwór standardowy siarczanu chondroityny o stężeniu 10 mg/dl ml - woda destylowana ml 0,1 M bufor cytrynianowy ph 4,8-1.0 ml ml 0,1% roztwór wodny chlorku cetylopirydyny w buforze cytrynianowym 1.0 ml ml - Próbki starannie wymieszaj i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie zmierz ekstynkcję próby badanej i wzorcowej wobec odpowiednich prób ślepych przy długości fali =680 nm. Obliczyć stężenie mukopolisacharydów w moczu według wzoru: gdzie: Ep ekstynkcja próbki badanej (B) Ew ekstynkcja próbki wzorcowej (W) 1 jednostka = 1 mg mukopolisacharydów Wydalanie dobowe kreatyniny jest wartością stałą i dlatego przyjęto je jako wskaźnik rozcieńczania próbki moczu. Oznaczanie stężenia kreatyniny w moczu pozwala uniknąć dobowej zbiórki. Obserwacje i obliczenia: str. 7