Oznaczanie aktywności proteolitycznej trypsyny metodą Ansona

Transkrypt

1 Oznaczanie aktywności proteolitycznej trypsyny metodą Ansona Wymagane zagadnienia teoretyczne 1. Enzymy proteolityczne, klasyfikacja, rola biologiczna. 2. Enzymy proteolityczne krwi. 3. Wewnątrzkomórkowa degradacja białek poprzez o system ubikwityna-proteasom o proteazy lizosomalne (katepsyny) o kaspazy 4. Degradacja białek macierzy pozakomórkowej przy udziale metaloproteinaz. 5. Trawienie białek w przewodzie pokarmowym. 6. Sok żołądkowy. Synteza i rola kwasu solnego Cel ćwiczenia: Zapoznanie się z metodą oznaczania aktywności endopeptydaz na przykładzie trypsyny. Zasada metody Ansona Szybkość reakcji katalizowanej przez trypsynę zależy od rodzaju zastosowanego substratu i metody jej oznaczania. Na ćwiczeniach aktywność trypsyny będzie oznaczana metodą Ansona, która polega na pomiarze ilości tyrozyny zawartej w peptydach uwolnionych przez enzym z substratu (kazeina) w trakcie hydrolizy. Peptydy te są rozpuszczalne i nie wytrącają się w 3 procentowym kwasie trichlorooctowym. Wytrącone kwasem białka usuwa się z mieszaniny przez wirowanie lub sączenie. Enzymatyczną hydrolizę białka (kazeiny) prowadzi się w ph 8.6 i w temperaturze 37 C. Oznaczanie zawartości tyrozyny wykonuje się fotometrycznie przy użyciu odczynnika Folina. Końcowa barwa, której natężenie jest wprost proporcjonalne do ilości tyrozyny w próbie, jest wynikiem redukcji odczynnika fosforomolibdenofosforowolframowego (odczynnik Folina) w środowisku zasadowym do błękitu fosforomolibdenowego, głównie przez zawartą w peptydach tyrozynę. Stężenie barwnego produktu w próbie oznacza się mierząc absorbancję o długości fali 670 nm. Miarą aktywności otrzymanego na ćwiczeniach preparatu trypsyny będzie liczba µmoli tyrozyny zawarta w uwolnionych peptydach. Odczynniki: 0,1 molowy bufor Tris-HCl o ph 8,6 1% roztwór kazeiny o ph 8.6 odczynnik Folina (Ciocalteu) 0,5-molowy roztwór NaOH 7,5% roztwór TCA (kwas trichlorooctowy) - przechowywać w lodówce Wykonanie: 1. Otrzymany roztwór trypsyny dopełnić do 10 ml buforem Tris-HCl o ph 8,6 i dobrze wymieszać. 2. Przygotować 2 probówki (próba badana i kontrolna) 3. Do obu probówek (badanej i kontrolnej) odmierzyć po 2,0 ml 1% roztworu kazeiny i obie probówki umieścić w łaźni wodnej w temperaturze 37 C 4. Po 5 minutach do próby badanej dodać 1,0 ml roztworu trypsyny (z punktu 1), dokładnie wymieszać i inkubować obie próby przez 15 minut w temperaturze 37 C! 5. Po tym czasie do obu prób dodać po 2.0 ml 7,5% TCA, dokładnie wymieszać i wyjąć probówki z łaźni wodnej 6. Do próby kontrolnej dodać 1,0 ml roztworu trypsyny (z punktu 1), dokładnie wymieszać 7. Obie próby pozostawić przez 30 minut w temperaturze pokojowej w celu całkowitego wytrącenia roztworu białka, a następnie próby przesączyć do czystych probówek przez sączki bibułowe 8. W celu oznaczenia zawartości tyrozyny w produktach proteolizy, odmierzyć po 1.0 ml klarownego przesączu z próby badanej i kontrolnej do suchych probówek, do obu dodać po 2.0 ml 0,5-molowego NaOH i po 0,6 ml odczynnika Folina, szybko dokładnie wymieszać i po 10 minutach odczytać absorbancję próby badanej wobec próby kontrolnej przy długości fali 670 nm 9. Z krzywej wzorcowej odczytać ilość µmoli tyrozyny zawartej w peptydach uwolnionych z kazeiny przez 1 ml trypsyny (pobrany do inkubacji) w ciągu 15 minut inkubacji z kazeiną

2 10. Aktywność enzymu wyrazić w µmolach tyrozyny zawartej w peptydach uwolnionych w warunkach metody w ciągu 1 minuty przez 1 ml trypsyny a. uwzględniając rozcieńczenie trypsyny w preparacie enzymatycznym (roztwór trypsyny), który wyjściowo otrzymano od prowadzącego ćwiczenia (np. 0,25 ml czy 0,75 ml) a następnie uzupełniono buforem Tris- HCl do 10 ml (punkt 1- wykonanie) b. pamiętając, że 1ml roztworu trypsyny do badania aktywności pobrano z 10 ml roztworu wyjściowego (punkt 4- wykonanie ) c. pamiętając, że do reakcji barwnej pobrano 1 ml przesączu z 5 ml przesączu d. uwzględniając czas trwania enzymatycznej hydrolizy substratu Ilość µmoli tyrozyny odczytana z krzywej wzorcowej znajduje się w 1,0 ml przesączu pobranego do reakcji barwnej (np. 0,15 µmola). Ponieważ 1.0 ml przesączu pobrano z 5.0 ml przesączu, stąd w całej objętości przesączu znajduje się 0,75 µmoli tyrozyny. Jest to ilość tyrozyny zawarta w peptydach uwolnionych z kazeiny przez 1 ml rozcieńczonego preparatu enzymatycznego pobranego do reakcji. Ponieważ 1 ml preparatu enzymatycznego (trypsyny) pobrano z 10 ml, stąd aktywność preparatu w 10 ml roztworu równa jest 7,5 µmolom tyrozyny. Znając ilość otrzymanego od prowadzącego ćwiczenia wyjściowego roztworu trypsyny przed uzupełnieniem do objętości 10 ml i uwzględniając czas reakcji wyliczyć wynik końcowy. Aktywność enzymu można również wyrazić w µmolach tyrozyny zawartej w peptydach uwolnionych w warunkach metody w ciągu 1 minuty przez 1 mg trypsyny, wiedząc dodatkowo, że znana ilość otrzymanego od prowadzącego zajęcia wyjściowego roztworu trypsyny przed uzupełnieniem do objętości 10 ml pobrana została z podstawowego roztworu przygotowanego przez rozpuszczenie 7 mg enzymu w 40 ml buforu Tris-HCl.

3 BIOCHEMIA Imię i Nazwisko GS... Data... Zasada metody: Oznaczanie aktywności proteolitycznej trypsyny metodą Ansona Obliczenie i interpretacja wyniku: Wniosek końcowy: Umiejętności: Kompetencje: zaliczono nie zaliczono ocena pozytywna ocena negatywna Data i podpis prowadzącego

4 Badanie soku żołądkowego Kwasota całkowita soku żołądkowego jest sumą zawartości wolnego i związanego kwasu solnego oraz innych kwaśnych związków, w tym białek, fosforanów i organicznych kwasów. Normalny sok żołądkowy na czczo nie zawiera wolnego kwasu solnego, a kwasota całkowita może dochodzić do 20 ml 0,1 N NaOH w 100 ml soku żołądkowego. Po podaniu histaminy lub innych bodźców stymulujących żołądek do wydzielania (śniadanie próbne) zawartość wolnego kwasu solnego po godzinie w normalnym soku żołądkowym wzrasta do ml 0,1N NaOH na 100 ml soku, a kwasota całkowita ml. Jeżeli te wartości są wyższe, wskazuje to na nadkwaśność, jeżeli niższe to na niedokwaśność soku żołądkowego. Nadkwaśność występuje przy braku czynników regulujących kwasowość, wrzodzie dwunastnicy, zwężeniu odźwiernika i nieżycie kwaśnym żołądka. Bywa także przyczyną wrzodów żołądka. Niedokwaśność występuje w nieżycie niedokwaśnym żołądka. Przy braku kwasu solnego w soku żołądkowym i zaleganiu pokarmów zachodzą procesy fermentacyjne powodowane obecnością bakterii, co prowadzi do wytwarzania kwasów organicznych takich jak np. mlekowy czy masłowy. Cel ćwiczenia: 1. Oznaczanie ph prawidłowego i patologicznego soku żołądkowego. 2. Ilościowe oznaczanie zawartości wolnego kwasu solnego oraz całkowitej kwasoty w prawidłowym i nadkwaśnym soku żołądkowym. 3. Oznaczanie deficytu kwasu solnego w soku żołądkowym Wykonanie 1) Oznaczanie ph soku żołądkowego Do 3 szklanych probówek chemicznych odpipetować po 1 ml różnych soków żołądkowych: a. pierwsza probówka prawidłowy sok żołądkowy b. druga probówka nadkwaśny sok żołądkowy c. trzecia probówka bezkwaśny (deficytowy) sok żołądkowy Następnie zanurzyć w nich paseczki papierka uniwersalnego. Po 30 sekundach określić przybliżone ph porównując ze skalą. Wyjaśnienie Prawidłowy sok żołądkowy wykazuje na czczo ph między 1,5-2,5. Nadkwaśny sok żołądkowy ma ph poniżej wartości fizjologicznego soku żołądkowego. Niedokwaśny sok żołądkowy ma odczyn ph powyżej prawidłowego. 2) Ilościowe oznaczanie wolnego kwasu solnego oraz kwasoty całkowitej prawidłowego i nadkwaśnego soku żołądkowego Do 2 szklanych kolbek lub zlewek (o objętości 25 ml) odmierzyć po 10 ml różnych soków żołądkowych: a. do pierwszej kolbki odmierzyć prawidłowy sok żołądkowy b. do drugiej kolbki odmierzyć nadkwaśny sok żołądkowy Następnie do każdej kolbki dodać po 2 krople roztworu oranżu metylowego i po 4 krople roztworu fenoloftaleiny, dokładnie wymieszać. Zawartość każdej kolbki miareczkować 0,1N roztworem NaOH do barwy łososiowej, ciągle mieszając. Zapisać ilość ml 0,1N roztworu NaOH zużytego na miareczkowanie badanego soku żołądkowego. Ilość mililitrów 0,1 N roztworu NaOH zużyta na miareczkowanie do barwy łososiowej służy do obliczania zawartości wolnego kwasu solnego w soku żołądkowym. Ilość mililitrów 0,1N roztworu NaOH zużyta do osiągnięcia barwy łososiowej pomnożona przez 10 odpowiada miliekwiwalentom wolnego kwasu solnego w 1 litrze soku żołądkowego (me/l). Następnie miareczkować dalej zawartość każdej kolbki 0,1 N roztworem NaOH do zmiany barwy z łososiowej na różowoczerwoną, ciągle mieszając. Zapisać ilość ml 0,1N roztworu NaOH zużytego na miareczkowanie prób z barwy łososiowej do różowo-czerwonej.

5 Sumaryczna ilość mililitrów roztworu 0,1 N NaOH zużyta na miareczkowanie od początku do końcowej różowoczerwonej barwy służy do obliczania całkowitej kwasoty soku żołądkowego. Całkowita ilość 0,1N roztworu NaOH zużyta od początku miareczkowania. aż do osiągnięcia barwy różowoczerwonej pomnożona przez 10 odpowiada miliekwiwalentom wszystkich kwasów i substancji kwaśnych w 1 litrze soku żołądkowego (me/l), co odpowiada całkowitej kwasocie soku żołądkowego. Wyjaśnienie Podczas miareczkowania soku żołądkowego 0,1N roztworem NaOH w obecności wskaźnika, który zmienia barwę przy ph 2 (oranż metylowy) ilość ml zużytego roztworu 0,1N NaOH odpowiada ilości wolnego kwasu solnego. Miareczkowanie 0,1N roztworem NaOH w obecności wskaźnika zmieniającego barwę w ph 8,5 (fenoloftaleina) powoduje zobojętnienie wolnego i buforowanego kwasu solnego oraz kwasów organicznych i innych kwaśnych związków, co odpowiada całkowitej kwasocie soku żołądkowego. 3) Ilościowe oznaczanie deficytu kwasu solnego w soku żołądkowym Do szklanej kolbki (o objętości 25 ml) odpipetować 10 ml bezkwaśnego (deficytowego) soku żołądkowego, dodać 2 krople roztworu oranżu metylowego i wymieszać. Miareczkować 0,1N roztworem HCl do barwy łososiowej, ciągle mieszając. Zapisać ilość ml 0,1N roztworu HCl zużytego do miareczkowania, co służy do obliczania deficytu kwasu solnego w soku żołądkowym. Ilość 0,1N roztworu HCl zużyta do osiągnięcia barwy łososiowej pomnożona przez 10 odpowiada miliekwiwalentom deficytu kwasu solnego w litrze soku żołądkowego (me/l). Wyjaśnienie Deficyt kwasu solnego w soku żołądkowym można oznaczyć miareczkując sok 0,1N roztworem HCl do wystąpienia reakcji na wolny kwas solny.

6 BIOCHEMIA Imię i Nazwisko GS... Data... Badanie soków żołądkowych Cel ćwiczenia: 1. Oznaczanie ph soku żołądkowego Wykonanie : Interpretacja wyniku: 2. Ilościowe oznaczanie... Wykonanie : Interpretacja wyniku: Wniosek końcowy:... Umiejętności: Kompetencje: zaliczono nie zaliczono ocena pozytywna ocena negatywna... Data i podpis prowadzącego