Zakład Biologii Sanitarnej i Ekotechniki ĆWICZENIE 2 BUDOWA I FUNKCJE ENZYMÓW. ZASTOSOWANIE BADAŃ ENZYMATYCZNYCH W INŻYNIERII ŚRODOWISKA.

Transkrypt

1 ĆWICZENIE 2 BUDOWA I FUNKCJE ENZYMÓW. ZASTOSOWANIE BADAŃ ENZYMATYCZNYCH W INŻYNIERII ŚRODOWISKA. /Opiekun merytoryczny: dr hab. Teodora M. Traczewska, prof. nadzw. PWr modyfikacja: dr inż. Agnieszka Trusz-Zdybek i mgr inż. Maciej Bełcik/ 1. Zagadnienia szczegółowe: budowa i mechanizm działania enzymów; kinetyka reakcji enzymatycznych; stała Michaelisa; regulacja aktywności enzymatycznej; inhibitory enzymów; enzymy allosteryczne mechanizm działania; wpływ czynników zewnętrznych na aktywność enzymatyczną (ph, temp.); jednostka aktywności enzymatycznej; podstawowe typy enzymów i rodzaje katalizowanych przez nie reakcji; dehydrogenazy; test TTC zasada i sposób wykonania testu; metody wykrywania oraz mechanizmy działania aktywności katalazowej, oksydazowej, ureazowej i proteolitycznej. 2. Literatura zalecana Pawlaczyk-Szpilowa M.: Biologia i ekologia, Oficyna Wyd. Polit. Wroc., s

2 CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA Zad. 1: Oznaczanie aktywności dehydrogenazowej osadu czynnego testem TTC. Badanie wpływu czynników fizycznych i chemicznych na aktywność enzymatyczną (temperatura, ph, związki toksyczne). a) Badanie aktywności dehydrogenazowej w zależności od temperatury - probówki - Bufor Tris o ph 8,4 Do sześciu probówek wlać pipetą Pasterowską po 1 cm 3 buforu Tris o ph 8,4 i po 1 cm 3 osadu czynnego (próbkę wcześniej uśrednić). Opisać następująco probówki: 10 C, 22 C, 37 C, 45 C, 60 C i 100 C. Probówkę opisaną jako 100 C wstawić na 5 min. do łaźni wodnej o temp. 100 C, po czym schłodzić w strumieniu wody z kranu do temp. pokojowej. Następnie do wszystkich 6 probówek wprowadzić pipetą 0,5 cm 3 roztworu TTC. Probówki umieścić w odpowiednich temperaturach: probówkę 10 C w lodówce, probówki 37 C i 100 C w termostacie o temp. 37 C, probówkę 45 C w łaźni wodnej o temp. 45 C, a probówkę 60 C w łaźni wodnej o temp. 60 C. Probówkę 22 C pozostawić w temperaturze pokojowej. Próby pozostawić na min. 30 min inkubacji. b) Badanie aktywności dehydrogenazowej w zależności od odczynu. - Bufory o różnych ph Opisać 6 probówek: ph 2, ph 4, ph 5, ph 8,4, ph 10 i ph 12. Do probówek wlać pipetą po 1 cm 3 buforu o odpowiednim ph. Następnie do wszystkich

3 6 probówek wlać po 1 cm 3 osadu czynnego (próbka uśredniona) i po 0,5 cm 3 roztworu TTC. Próby umieścić na min. 30 min. w termostacie o temp. 37 C. c) Badanie aktywności dehydrogenazowej w obecności substancji toksycznej (octan ołowiu). - Bufor Tris o ph 8,4 - Octan ołowiu Opisać 2 probówki następująco: Pb i K (kontrola). Do obu probówek wprowadzić pipetą po 1 cm 3 osadu czynnego (próbka uśredniona) i po 1 cm 3 buforu Tris o ph 8,4. Następnie do probówki Pb wprowadzić 1 cm 3 15% roztworu octanu ołowiu (UWAGA: trucizna!), a do probówki K w celu uzyskania tych samych proporcji 1 cm 3 buforu Tris o ph 8,4. Do obu probówek dodać po 0,5 cm 3 r-u TTC. Próby inkubować w temp. 37 C przez min. 30 min. Po 30 min. inkubacji prób wg a, b i c, należy ocenić wizualnie zmianę zabarwienia próbki. Aktywność dehydrogenazowa w obecności TTC objawia się wystąpieniem czerwonego zabarwiania wywołanego powstaniem produktu reakcji enzymatycznej - TF. Intensywność zabarwiania zależy od aktywności enzymatycznej. Określić wpływ badanych czynników na aktywność dehydrogenazową osadu czynnego, wykonać wykresy aktywności enzymu w zależności od temperatury oraz odczynu na podstawie otrzymanych danych. Zad. 2: Wykrywanie aktywności oksydazowej osadu czynnego. - 1% roztwór pirokatechiny Do 2 probówek wlać po 2 cm 3 osadu czynnego (próbka uśredniona), probówki opisać jako kontrola i próba badana. Próbę badaną wstawić do łaźni wodnej o temp. 100 C na 5 min., a następnie schłodzić do temp. pokojowej. Do obu probówek wlać po 10 kropli 1% roztworu pirokatechiny. Próby inkubować w temp. 40 C przez min. 30 min.

4 Zaobserwować zabarwienie w próbach i na podstawie zasady działania enzymów oksydaz wyjaśnić jego pojawienie się. Zad. 3: Wykrywanie aktywności katalazowej osadu czynnego. a) Osad czynny - Nadtlenek wodoru - H 2 O 2 Do 2 probówek wprowadzić po 1 cm 3 osadu czynnego (próbka uśredniona), probówki opisać jako kontrolę i próbę badaną. Próbę badaną włożyć na 5 min. do łaźni wodnej o temp. 100 C, po czym schłodzić w strumieniu wody z kranu do temp. pokojowej. Następnie do obu probówek wprowadzić po 0,5 cm 3 roztworu H 2 O 2 i natychmiast obserwować pojawiające się zmiany. *) Hodowle wybranych szczepów bakteryjnych na skosach agarowych - Skosy agarowe z kulturami bakterii - Nadtlenek wodoru Na powierzchnię skosu agarowego z kulturą bakterii wlać sterylnie 0,5 cm 3 roztworu H 2 O 2 i natychmiast obserwować pojawiające się zmiany. Wyjaśnić zjawisko obserwowane w punkcie a /* bazując na zasadzie działania enzymów katalazowych. Zad. 4: Wykrywanie aktywności ureazowej osadu czynnego na podłożu mocznikowym. - Podłoże zawierające mocznik - Palnik - Eza Zaszczepić podłoże przy użyciu sterylnej ezy uśrednioną próbką osadu czynnego. Inkubować w temp. 22 C przez min. 48h.

5 Określić i zapisać barwę podłoża przed zaszczepem i po zaszczepieniu Po czasie inkubacji opisać i wyjaśnić zaobserwowane zmiany. Zad. 5: Wykrywanie aktywności proteolitycznej - Słupek żelatynowy - Palnik - Igła preparacyjna Dokonać posiewu metodą kłutą na słupek żelatynowy. Inkubować w temp. 20 C przez min. 48h. Opisać konsystencję żelatyny przed i po wykonaniu doświadczenia. Po czasie inkubacji opisać i wyjaśnić zaobserwowane zmiany.