Krew należy poddać hemolizie, która zachodzi pod wpływem izotonicznego odczynnika Drabkina.

Transkrypt

1 Imię i nazwisko Uzyskane punkty Nr albumu data /3 podpis asystenta ĆWICZENIE 13 BIOCHEMIA KRWI Doświadczenie 1 Cel: Oznaczenie stężenia Hb metodą cyjanmethemoglobinową. Hemoglobina (Hb) i niektóre jej pochodne są utleniane przez K3[Fe(CN)6] do methemoglobiny, a następnie ulega przekształceniu pod wpływem KCN w trwały związek cyjanomethemoglobinę (HiCN), której stężenie wyznacza się metodą kolorymetryczną dokonując pomiaru zmiany natężenia barwy próbki przy długości fali =540 nm, a następnie obliczając stężenie Hb stosując podany poniżej wzór lub na podstawie ekstynkcji oraz stężenia wzorcowego roztworu cyjanomethemoglobiny. Przygotowanie materiału do badań Krew należy poddać hemolizie, która zachodzi pod wpływem izotonicznego odczynnika Drabkina. wzorcowy roztwór cyjanomethemoglobiny o stężeniu mg/dl odczynnik Drabkina (0.03% K3[Fe(CN)6], 0.1% NaHCO3, 0.005% KCN) 1. Do czystej probówki należy dodać 2.5 cm 3 odczynnika Drabkina, a następnie 0.01 cm 3 krwi (próbka badana). 2. Zawartość probówki należy dokładnie wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut. 3. Po upływie czasu inkubacji należy odczytać absorbancję próbki badanej wobec odczynnika Drabkina (ślepa próba) przy długości fali =540 nm. 4. Do kolejnej kuwety pomiarowej należy dodać wzorzec cyjanomethemoglobiny (próbka wzorcowa) i odczytać absorbancję wobec odczynnika Drabkina. Obliczenie stężenia Hb na podstawie wzoru: gdzie: rozcieńczenie krwi = 2.51 : masa molowa Hb (g/mol) 44 - milimolowy współczynnik absorbancji przy λ = 540 nm (jest to absorbancja jaką wykazuje roztwór o stężeniu 1 mmol/dm 3 i grubości warstwy 1 cm) dzielnik 10 - wynika z przeliczenia z 1 dm 3 na 100 cm 3 dzielnik wynika z przeliczenia z milimoli na mole str. 1

2 Obliczenie stężenia Hb na podstawie absorbancji próbki badanej Abad oraz absorbancji próby wzorcowej Awz i stężenia próby wzorcowej. Przelicznik: mmol/l = 0,6205 x g/dl Zakres normy: Kobiety: [g/dl]; Mężczyźni: [g/dl] Cel: Oznaczenie stężenia mocznika w surowicy krwi. Doświadczenie 2 Ureaza (hydrolaza roślinna) katalizuje hydrolizę mocznika do dwutlenku węgla i amoniaku. Uwolniony amoniak utlenia się chloranem(i) sodu do chloraminy, która ulega kondensacji z fenolem dając niebieski barwnik indofenolowy. Katalizatorem reakcji jest nitroprusydek sodu. Intensywność barwy roztworu jest proporcjonalna do zawartości amoniaku a tym samym mocznika w badanej próbie. roztwór ureazy wzorcowy roztwór mocznika o stężeniu 60 mg/dl surowica do oznaczania stężenia mocznika roztwór fenolu (10g/l) z nitroprusydkiem sodu (50 mg/l) 7 mmol/l roztwór wodny podchlorynu sodu (NaClO) str. 2

3 Przygotuj 3 probówki podpisane odpowiednio: W (próbka zawierająca wzorcowy roztwór mocznika), B (próbka badana) i O (próbka ślepa). Do każdej z probówek dodaj kolejne zgodnie z tabelą. W B O Roztwór ureazy 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml Wzorcowy roztwór mocznika o stężeniu 60 mg/dl 0.01 ml - - Surowica do oznaczania mocznika ml - H2O ml Próbki należy inkubować w temperaturze 37 C przez 5 minut. Roztwór fenolu z nitroprusydkiem sodu 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml Roztwór wodny podchlorynu sodu (NaClO) 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. H2O 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml Zmierzyć ekstynkcję próbek W i B względem próbki O przy długości fali =630 nm. Oblicz stężenie mocznika w surowicy wyrażone w mg/dl. Przedstaw wynik także w mol/l. Obserwacje i obliczenia: Zakres normy: mg/dl str. 3

4 Doświadczenie 3 Cel: Oznaczenie stężenia kwasu moczowego w surowicy krwi. Kwas moczowy w obecności węglanu sodowego redukuje kwas fosforowolframowy (odczynnik Folina-Denisa) do błękitu wolframowego. Natężenie powstałego zabarwienia jest proporcjonalne do stężenia kwasu moczowego. Kwas fosforowolframowy służy jednocześnie do odbiałczania materiału biologicznego. wzorcowy roztwór kwasu moczowego o stężeniu 1.25 mg% surowica do oznaczania kwasu moczowego 10% roztwór wodny węglanu sodu odczynnik Folina-Denisa Przygotuj 3 probówki podpisane odpowiednio: W (próbka zawierająca wzorcowy roztwór kwasu moczowego), B (próbka badana) i O (próbka ślepa). Do każdej z probówek dodaj kolejne zgodnie z tabelą. W B O Wzorcowy roztwór kwasu moczowego o stężeniu 1.25 mg% 0.01 ml - - Surowica do oznaczania kwasu moczowego ml - H2O ml 10% roztwór wodny węglanu sodu 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml odczynnik Folina-Denisa 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie należy zmierzyć ekstynkcję próbek W i B względem próbki O przy długości fali =700 nm. Pomiar zakończyć w ciągu minut (po tym czasie pojawia się zmętnienie). Obserwacje i obliczenia: Zakres normy: Kobiety: mg/dl; Mężczyźni: mg/dl str. 4

5 Doświadczenie 4 Cel: Oznaczenie stężenia ceruloplazminy oraz aktywności właściwej ceruloplazminy w surowicy metodą Ravina. W metodzie wykorzystuje się enzymatyczną aktywność ceruloplazminy jako oksydazy. Ceruloplazmina utlenia substrat, którym jest p-fenylenodiamina (PPD). Dzięki wytworzeniu kompleksu Cp-PPD elektrony z substratu zostają przeniesione na Cu enzymu. Cu ulega redukcji z +2 na +1 stopień utlenienia, a z substratu powstaje wolny rodnik. Jon miedzi (Cu + ) zawarty w cząsteczce enzymu ulega utlenieniu przez tlen i dzięki temu może utleniać kolejną cząsteczkę substratu. 3 cząsteczki substratu tworzą barwny produkt zwany zasadą Bandrowskiego. Azydek sodu hamuje reakcję enzymatyczną. 0.4 M bufor octanowy ph= % roztwór wodny azydku sodu (NaN3) 0.5% roztwór chlorowodorku p-fenylenodiaminy (PPD) (tuż przed oznaczeniem należy przygotować roztwór PPD rozpuszczając przygotowaną naważkę w 25 ml wody!) Przygotuj 2 probówki i podpisz je jako: B (próbka badana) i O (próbka ślepa). Do probówek wprowadź odpowiednio: 0.4 M bufor octanowy ph= ml 2.0 ml Surowica do oznaczania ceruloplazminy ml ml 0.5% roztwór wodny azydku sodu (NaN3) ml 0.5% roztwór chlorowodorku p-fenylenodiaminy (PPD) 0.25 ml 0.25 ml Próbki należy inkubować w temperaturze 37 C pokojowej przez 1 godzinę. 0.5% roztwór wodny azydku sodu (NaN3) 0.25 ml - Zmierzyć absorbancję próbki B względem próbki O przy długości fali =530 nm (A530). B O Obliczenie stężenia ceruloplazminy w mg/dl według wzoru: c = A530 x 50 mg/dl (współczynnik wyznaczony eksperymentalnie przy użyciu surowic wzorcowych). Zakres normy: g/l Obliczenie aktywności ceruloplazminy w jednostkach międzynarodowych (IU). Molowy współczynnik absorpcji dla produktu powstającego z 3 cząsteczek substratu wynosi 1.91, więc: 1,91 1 mikromol/ml A530 x mikromol/ml (stężenie produktu w badanym roztworze, którego objętość wynosi ml). str. 5

6 y = ilość mikromoli produktu reakcji w objętości ml, czyli y = x pomnożone przez ml. Ilość mikromoli substratu (PPD) jest 3 razy większa, bo 1 cząsteczka produktu powstaje z 3 cząsteczek substratu. Wyznaczona liczba moli PPD została utleniona w czasie 60 min, więc należy tę wartość podzielić przez 60, aby otrzymać wynik na minutę to wynika z definicji U. Obliczenie aktywność właściwej ceruloplazminy w jednostkach międzynarodowych/ mg białka (IU/mg białka). Aby podać aktywność właściwą w IU/mg białka należy wyliczone na pierwszym etapie obliczeń stężenie ceruloplazminy odnieść do ml roztworu zastosowanego w oznaczeniu, czyli wyznaczoną wartość U podzielić przez tę wartość (U/mg). Cel: Wykrywanie obecności żelaza w surowicy krwi. Doświadczenie 5 Odłączone od białka podczas odbiałczania surowicy żelazo występuje w postaci jonu trójwartościowego, który w obecności substancji redukujących (hydroksyloamina) przechodzi w jon dwuwartościowy. Jon żelaza(ii) (żelazawy) tworzy różowo zabarwiony kompleks z fenantroliną. odczynnik zawierający hydroksylaminę i fenantrolinę (0.25% roztwór fenantroliny w HCl, 10% r-r chlorowodorku hydroksyloaminy) Przygotuj 2 probówki i podpisz je jako: B (próbka badana) i O (próbka odniesieniowa). Do probówek wprowadź odpowiednio: odbiałczona surowica 1.0 ml - H2O ml odczynnik zawierający hydroksylaminę i fenantrolinę 1.0 ml 1.0 ml Zakres normy: µg/dl Próbki należy wymieszać i inkubować w temperaturze 100 C przez 5 minut. B O str. 6

7 Obserwacje: Cel: Wykrywanie obecności magnezu w surowicy krwi. Doświadczenie 6 W roztworze o odczynie alkalicznym, zawierającym calmagit (kwas 1-/1-hydroksy-4-metylo-2-fenylozo/-2-naftolo-4- sulfonowy) jony magnezu tworzą różowo-fioletowy kompleks. Reakcja ta jest specyficzna w obecności EGTA (kwas /etylenoglycol-bis/2-aminoetylo-eter/-n,n-czterooctowy). Intensywność zabarwienia jest proporcjonalna do stężenia jonów Mg 2+. odczynnik zawierający calmagit (0.3 mmol/l) i EGTA (0.21 mmol/l) Przygotuj 2 polistyrenowe probówki i podpisz je jako: B (próbka badana) i O (próbka odniesieniowa). Do probówek wprowadź odpowiednio: odbiałczona surowica 0.02 ml - H2O ml odczynnik zawierający calmagit i EGTA 1.0 ml 1.0 ml Próbki należy wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. B O Zakres normy: 0.7-1,05 mmol/l Obserwacje: str. 7