POLITECHNIKA ŁÓDZKA INSTRUKCJA Z LABORATORIUM W ZAKŁADZIE BIOFIZYKI. Ćwiczenie 3 ANALIZA TRANSPORTU SUBSTANCJI NISKOCZĄSTECZKOWYCH PRZEZ

Wielkość: px

Rozpocząć pokaz od strony:

Download "POLITECHNIKA ŁÓDZKA INSTRUKCJA Z LABORATORIUM W ZAKŁADZIE BIOFIZYKI. Ćwiczenie 3 ANALIZA TRANSPORTU SUBSTANCJI NISKOCZĄSTECZKOWYCH PRZEZ"

Dagmara Staniszewska
6 lat temu
Przeglądów:

1 POLITECHNIKA ŁÓDZKA INSTRUKCJA Z LABORATORIUM W ZAKŁADZIE BIOFIZYKI Ćwiczenie 3 ANALIZA TRANSPORTU SUBSTANCJI NISKOCZĄSTECZKOWYCH PRZEZ BŁONĘ KOMÓRKOWĄ

I. WSTĘP TEORETYCZNY Każda komórka, zarówno roślinna, jak i zwierzęca jest otoczona błoną komórkową, która stanowi selektywną, półprzepuszczalną barierę dla substancji znajdujących się we wnętrzu

2 I. WSTĘP TEORETYCZNY Każda komórka, zarówno roślinna, jak i zwierzęca jest otoczona błoną komórkową, która stanowi selektywną, półprzepuszczalną barierę dla substancji znajdujących się we wnętrzu komórki i w jej otoczeniu. Wszystkie błony biologiczne zbudowane są przede wszystkim z lipidów oraz białek. Cząsteczki białek zanurzone są w dwuwarstwowej błonie fosfolipidowej, której strukturę określa się mianem płynnej mozaiki błony. Cząsteczki fosfolipidów błonowych składają się z hydrofilowych główek i hydrofobowych ogonków. W wodzie ogonki dążą do siebie, a główki na zewnątrz w ten sposób powstaje błona komórkowa (rys.1.). Rys.1. Model struktury błony cytoplazmatycznej B 1 białko integralne (wewnętrzne), B 2 B 5 - białka powierzchniowe (peryferyjne) Błony biologiczne są strukturami dynamicznymi, zmieniającymi się w czasie. Przez płynność błony należy rozumieć możliwość przemieszczania się elementów tworzących błonę, szczególnie białek. Stopień płynności danego obszaru błony zależy od czynników środowiskowych (temperatura, charakter chemiczny roztworów stykających się z błoną) oraz strukturalnych: większą sztywność wykazują błony o dużej zawartości płaskich cząsteczek cholesterolu i nienasyconych kwasów tłuszczowych w fosfolipidach. 1

3 Cząsteczki białek błonowych mogą przenikać w poprzek całą błonę (białka integralne lub transmembranowe) bądź tylko przyczepione do niej po obu jej stronach. Funkcje błon biologicznych są różnorodne. Lipidy błonowe nie przepuszczają substancji rozpuszczonych w wodzie, powodując oddzielnie roztworów znajdujących się po obu stronach błony. Transport substancji chemicznych przez błony odbywa się głównie za pośrednictwem białek. Są wśród nich cząsteczki tworzące kanały, które w miarę potrzeb mogą być otwierane i zamykane. Są białka, które po pobraniu cząsteczek czy jonów po jednej stronie błony wędrują na drugą stronę, by tam je uwolnić. Istnieją białka, które obracają się w błonie o 180 o, przenosząc tym samym cząsteczki z jednej strony błony na drugą, niekiedy jednocześnie dwa rodzaje cząsteczek w przeciwnych kierunkach. Jeśli transport odbywa się zgodnie z gradientem stężeń danej substancji, tj. z obszaru o większym stężeniu do obszaru o mniejszym stężeniu, nie sprawia to problemów. Transport wbrew gradientowi stężeń wymaga natomiast nakładu energii jest to transport aktywny. Pobieranie substancji chemicznych przez komórkę może odbywać się także poprzez wpuklanie fragmentów błony i tworzenie pęcherzyków zawierających obiekt, który przylegał do błony po stronie zewnętrznej. Odpowiednio wydzielanie substancji poza komórkę może polegać na łączeniu się błony otaczającej pęcherzyk zawierający tę substancję z błoną komórkową. Oprócz pełnienia licznych funkcji ochronnych i transportowych błony biologiczne, biorą udział w odbieraniu i przewodzeniu sygnałów. Sygnały docierają do komórek najczęściej w postaci pewnych cząsteczek, np. hormonów. Aby komórka mogła odebrać dany sygnał, musi mieć na powierzchni błony swoisty receptor białko, glikoproteinę, wiążące się z cząsteczką sygnałową. Związanie tej cząsteczki powoduje zmiany w strukturze białka receptora, wpływające na białka enzymatyczne we wnętrzu komórki. 2

4 III. PRZEBIEG ĆWICZENIA Niezbędne materiały do przeprowadzenia ćwiczenia zawiesina komórek drożdży Saccharomyces cerevisiae, pipety, wirówka, kapilary szklane Odczynniki wykorzystywane podczas analizy transportu: FURA - 2 AM - indykator do oznaczania wolnych jonów wapnia EDTA (wersenian dwusodowy) substancja wiążąca jony dwuwartościowe bufor fosforanowy ph 7,6 III. PRZEBIEG ĆWICZENIA A) Przygotowanie materiału do badań - określenie cytokrytu hodowli 1. Przygotować 4 próbówki jednorazowe typu Eppendorf. 2. Dokładnie wymieszać hodowlę drożdży i pobrać po 1000μl zawiesiny komórek do każdej z probówek. Następnie odwirować przez 1 min (wirówka Micro centrifuge type 320) w temperaturze pokojowej. 3. Supernatant dokładnie wylać, dodać 1000μl buforu fosforanowego, wymieszać. Następnie odwirować. 4. Czynność z punktu 3 powtórzyć jeszcze dwukrotnie. 5. Bardzo dokładnie usunąć supernatant i zawiesić osad drożdży w 100 μl buforu. 6. W obecności prowadzącego ćwiczenia napełnić kapilary zawiesiną do ¾ objętości (jedna kapilara z probówki). 7. Kapilary zamknąć przez opalenie końca nad palnikiem i umieścić w wirówce. Odwirować. 8. Dla każdej kapilary wyliczyć cytokryt - zmierzyć długość obszaru zajmowanego przez całą zawiesinę i przyjąć za 100%. Następnie zmierzyć długość obszaru zajmowanego przez osad drożdży i obliczyć jaki jest to % długości. Policzyć średnią dla wszystkich czterech kapilar. 3

5 B) Przygotowanie materiału Badania należy przeprowadzić przy cytokrycie 5% μl hodowli daje cytokryt obliczony w poprzedniej części. Używając proporcji obliczyć ile należy wziąć μl hodowli, aby po uzupełnieniu do 1000μl otrzymać cytokryt 5%. 2. Przygotować 10 probówek typu eppendorf (po dwie próby dla punktów czasowych czasów 0min, 5min, 10 min, 20 min, 30 min). 3. Dodać obliczoną ilość dokładnie wymieszanej hodowli. 4. Odwirować przez 1 min (wirówka typu 320) w temperaturze pokojowej. 5. Supernatant dokładnie wylać, dodać 1000ml buforu fosforanowego, wymieszać, a następnie odwirować. 6. Czynność z punktu 5 powtórzyć jeszcze dwukrotnie w celu dokładnego odmycia resztek pożywki 7. Bardzo dokładnie usunąć supernatant i zawiesić osad drożdży w 1000 μl buforu. C) Badanie transportu 1.Włączyć fluorymetr. 2. Do przygotowanych probówek w części B dodać 10µl odczynnika fluorescencyjnego FURA2-AM ( wyłączając czas 0 min). Podczas drugiej część ćwiczenia (badanie inhibicji transportu) dodać dodatkowo inhibitor. 3. Natychmiast dokładnie wymieszać i włączyć stoper. 4. Po upływie odpowiedniego czasu od rozpoczęcia reakcji (czyli po 5min, 10 min, 20min, 30min) należy odwirować probówki, wylać supernatant i dodać 1000 μl buforu i dokładnie wymieszać. 5. Fluorymetr TKO 100 wyzerować na powietrze, wlać zawartość probówki i uzupełnić dodatkowymi 1000 μl buforu. Wymieszać 6. Odczytać wynik pomiaru fluorescencji i zapisać w odpowiedniej tabeli. 4

6 Tab.1. Badanie transportu FURA - 2 AM CZAS (min) Średnia Tab.2. Badanie transportu FURA-2AM w obecności EDTA CZAS (min) Średnia IV. SPRAWOZDANIE POWINNO ZAWIERAĆ 1. Krótki wstęp teoretyczny. 2. Cel przeprowadzonego ćwiczenia. 3. Objaśnienie symboli stosowanych w sprawozdaniu. 4. Tabele z wartościami wielkości mierzonych. 5. Wykres szybkości transportu FURA 2 AM i wykres szybkości transportu FURA 2AM + EDTA 6. Dyskusję i wnioski. 5

7 V. PYTANIA KONTROLNE 1. Budowa błony komórkowej. 2. Rodzaje transportu przez błonę omówić transport aktywny 3. Zjawisko fluorescencji. LITERATURA 1. J. St. Szopa: Biologia i inżynieria komórki - laboratorium; PŁ, Łódź 1994r. 2. F. Jaroszka: Biofizyka; Wydawnictwo Lekarskie PZWL; Warszawa 2001r. 3. K. Ostrowski: J.Kawiaka: Cytofizjologia; Państwowy Zakład Wydawnictw Lekarskich; Warszawa 1990r. 4. A. Pilawski: Podstawy biofizyki; Państwowy Zakład Wydawnictw Lekarskich; Warszawa 1985r. 6

Podobne dokumenty

Eukariota - błony wewnątrzkomórkowe. Błony wewnętrzne stanowiące granice poszczególnych. przedziałów komórki i otaczające organelle komórkowe

Eukariota - błony wewnątrzkomórkowe. Błony wewnętrzne stanowiące granice poszczególnych. przedziałów komórki i otaczające organelle komórkowe Błona komórkowa (błona plazmatyczna, plazmolema) Występuje u wszystkich organizmów żywych (zarówno eukariota, jak i prokariota) Stanowią naturalną barierę między wnętrzem komórki a środowiskiem zewnętrznym