Oznaczanie aktywności - i β- amylazy słodu metodą kolorymetryczną

Transkrypt

1 KATEDRA BIOCHEMII Wydział Biologii i Ochrony Środowiska Oznaczanie aktywności - i β- amylazy słodu metodą kolorymetryczną ĆWICZENIE 5 OZNACZANIE AKTYWNOŚCI -AMYLAZY SŁODU METODĄ KOLORYMETRYCZNĄ Enzymy stosowane do hydrolizy skrobi są zaliczane do podklasy hydrolaz (EC 3.2.). Typowymi enzymami trawiennymi, występującymi w ślinie i wydzielinie trzustki kręgowców są amylazy, które katalizują rozkład skrobi i glikogenu. Są one również obecne w roślinach, zwłaszcza w zarodkach ziarna zbóż, gdzie w procesie kiełkowania następuje ich gwałtowna synteza, mająca na celu szybkie uruchomienie energetycznego materiału zapasowego. Z punktu widzenia możliwości hydrolizy różnych wiązań glikozydowych można je podzielić na: -amylazy i β-amylazy (atakujące wiązania -1,4-glikozydowe), izoamylazy i pullulanazy (atakujące wiązania -1,6-glikozydowe) oraz glukoamylazy i niektóre pullulanazy (hydrolizujące wiązania -1,4-glikozydowe i -1,6-glikozydowe). ZADANIE 1 PRZYGOTOWANIE WYCIĄDU ENZYMATYCZNEGO 3 g słodu jęczmiennego utrzeć w moździerzu na proszek. Zalać 20 ml H 2 O destylowanej i mieszać przez 1 godzinę na mieszadle magnetycznym. Całość odwirować w wirówce K70 przy szybkości 2500 obr/min w temperaturze 4 C, przez 5 minut. Ostrożnie zlać supernatant zawierający i β amylazę. Roztwór rozcieńczyć 20-krotnie i zachować do badań. ZADANIE 2 PRZYGOTOWANIE ROZCIEŃCZEŃ ROZTWORU -AMYLAZY Do 4 opisanych probówek (I-IV) wprowadzić wodę destylowaną i roztwór wyjściowy - amylazy według poniższego schematu: 1

2 Tabela 1 Nr I II III IV Woda destylowana Roztwór - amylazy 4,5 ml 6 ml 7 ml 9,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml Rozcieńczenie roztworu - amylazy (z) Obliczyć i wpisać do tabeli rozcieńczenie otrzymanych roztworów. Zachować rozcieńczone roztwory -amylazy do zadania 3!! ZADANIE 3 HYDROLIZA SKROBI PRZEZ -AMYLAZĘ Roztwór skrobi z roztworem jodu w jodku potasu tworzy barwny kompleks. Zjawisko to można wykorzystać do oznaczenia katalitycznej aktywności -amylazy, dla której skrobia jest naturalnym substratem. Aktywność -amylazy oznacza się na podstawie zaniku charakterystycznego zabarwienia z jodem. 1. Do 5 opisanych probówek (1-5) wprowadzić po 4 ml 2 % roztworu skrobi w buforze octanowym o ph 5,3 2. Do nr 1 dodać 1 ml 0,5M HCl (kontrola, K). 3. Wszystkie (1-5) wstawić do łaźni wodnej o temperaturze 30 C i inkubować przez 5 minut. 4. Po tym czasie wyjąć z łaźni wodnej i szybko! dodać rozcieńczone roztwory - amylazy według schematu: 2

3 Tabela 2 Nr 1 (K) 2 (S1) 3(S2) 4(S3) 5(S4) Woda destylowana 1ml Rozcieńczone roztwory α- amylazy - 1 ml z I 1 ml z II 1 ml z III 1 ml z IV 5. Zawartość probówek intensywnie wymieszać. 6. Wszystkie wstawić do łaźni wodnej o temperaturze 30 C i inkubować przez 15 minut. 7. Po zakończonej inkubacji do probówek nr 2-5 dodać po 1 ml 0,5 M HCl, w celu zatrzymania reakcji enzymatycznej. 8. Do wszystkich probówek (1-5) wprowadzić po 1 ml roztworu I 2 w KI i wymieszać zawartość probówek. Uwaga! Barwa roztworów powinna być niebieska i powinna różnić się w niewielkim stopniu intensywnością. Jeśli przy najwyższych użytych stężeniach enzymu barwa roztworu jest czerwonawa lub żółtawa, należy te próbki odrzucić i nie brać ich pod uwagę przy obliczeniach aktywności enzymatycznej -amylazy. 9. Zmierzyć absorbancję próbek (1-5) względem wody przy długości fali λ=670 nm Tabela3 (wartości wpisać do Tabeli 3). Nr 1 (K) 2 (S1) 3(S2) 4(S3) 5(S4) Absorbancja λ=670 nm ZADANIE 4 OBLICZENIE AKTYWNOŚCI -AMYLAZY Aktywność -amylazy podajemy jako ilość μmoli zhydrolizowanych wiązań glikozydowych w czasie 1 minuty w warunkach optymalnych (ph, temperatura, wysycenie substratem, obecność jonów chlorkowych). W doświadczeniu A670 próby kontrolnej odpowiada ilości = 0, M (124 μmola) wiązań glikozydowych. 3

4 1. Obliczyć różnicę pomiędzy absorbancją próbki kontrolnej (K) a absorbancjami poszczególnych próbek badanych. Wartości wpisać do tabeli 4. Różnice te są wprost proporcjonalne do ilości rozłożonych wiązań glikozydowych. Tabela 4 Różnica absorbancji AK - AS1 AK AS2 AK AS3 AK AS4 Ilość rozłożonych wiązań glikozydowych obliczyć z proporcji: AK μmola wiązań glikozydowych AK - AS X μmoli wiązań rozłożonych w próbce X = (AK AS1) 124 AK X- to ilość mikromoli wiązań glikozydowych rozłożonych w próbce w ciągu 15 minut pod wpływem α-amylazy zawartej w 1 ml preparatu rozcieńczonego z razy Aktywność -amylazy Y obliczyć ze wzoru: Y = X z t Gdzie: X- ilość mikromoli wiązań glikozydowych rozłożonych w próbce z- rozcieńczenie roztworu t czas -15 minut Wyliczyć średnią wartość aktywności -amylazy słodu. Wartości wpisać do Tabeli 5. 4

5 Tabela 5 Nr próbki Rozcieńczenie roztworu - amylazy (z) Ilość wiązań glikozydowych, mol (X) Średnia wartość aktywności α-amylazy mol/min Aktywność -amylazy, mol/min (Y) Aktywność --amylazy M/ min/g słodu ZADANIE 5 OZNACZANIE AKTYWNOŚCI β-amylazy SŁODU METODĄ WINDISCHA I KOLBACHA β-amylaza jest egzoamylazą, działa na substrat od strony nieredukującego końca łańcucha. Hydrolizuje co drugie wiązanie α-1,4-glikozydowe, odrywając jednostki β-maltozy. Enzym nie działa na wiązanie α-1,6-glikozydowe i nie jest w stanie go ominąć jak α-amylaza. Stąd jej działanie zatrzymuje się po dojściu do tego wiązania w cząsteczce substratu. Produktami jej działania są maltoza i wysokocząsteczkowa dekstryna graniczna. β-amylazy pochodzenia roślinnego wykazują najwyższą aktywność w zakresie ph 4,0-5,5. Metoda polega na jodometrycznym oznaczeniu zawartości sacharydów redukujących (głównie β-maltozy) uwalnianych w czasie działania hydrolizy skrobi przez β-amylazę w środowisku lekko kwaśnym. Sacharyd redukujący pod wpływem jodu ulega utlenieniu zgodnie z reakcją: sacharyd redukujący + I 2 kwas onowy + 2I - Nadmiar jodu który nie wszedł w reakcję z sacharydem miareczkuje się mianowanym roztworem Na 2 S 2 O 3 zgodnie z równaniem: I 2 + S 2 O 3 2-2I - +S 4 O Do 4 kolb stożkowych o pojemności 100 ml ze szlifem, opisanych (K1, K2 kontrola; B1, B2- próba badana) odmierzyć po 10 ml roztworu 2 % skrobi o ph 4,8. 2. Kolbki wstawić do łaźni wodnej o temperaturze 30 C na 5 minut. 3. Do prób kontrolnych (K1 i K2) dodać po 1 ml 1 M NaOH. 4. Do wszystkich kolb dodać po 1 ml roztworu enzymów (z zadania 1). Wymieszać. 5. Kolbki wstawić do łaźni wodnej o temperaturze 30 C na 30 minut. 6. Po inkubacji do kolb badanych (B1 i B2) dodać po 1 ml 1 M NaOH. Wymieszać. 7. Do wszystkich kolb dodać po 10 ml 0,06 M roztworu jodu. 8. Kolby zamknąć korkiem i pozostawić w ciemności na 20 minut. 5

6 9. Do wszystkich kolb dodać po 2,5 ml 1 M H 2 SO 4. Wymieszać. 10. Miareczkować 0,04 M mianowanym roztworem tiosiarczanu sodowego do momentu odbarwienia. 11. Wartości wpisać do Tabeli 6. ZADANIE 6 OBLICZENIE AKTYWNOŚCI β-amylazy Wynik miareczkowania próby kontrolnej odpowiada całej ilości jodu wziętej do utleniania. Wynik miareczkowania próby badanej oznacza nadmiar jodu, który nie wszedł w reakcję z sacharydem redukującym. 1. Obliczyć różnicę ilości ml Na 2 S 2 O 3 potrzebnych do miareczkowania próby kontrolnej (K śr ) i próbki badanej (B śr ). 2. Różnice te są wprost proporcjonalne do ilości uwolnionej maltozy. 1 ml 0,04 M Na 2 S 2 O 3 odpowiada 6,84 mg maltozy. Obliczyć ilość uwolnionej maltozy w wyniku działania β-amylazy. 3. Obliczyć aktywność β-amylazy słodu w M maltozy uwolnionej w ciągu minuty przez enzym wyekstrahowany z 1 g słodu. 4. Wartości wpisać do Tabeli 6. Tabela 6 Próbka Na 2 S 2 O 3, ml K śr -B śr Maltoza, mg K1 K2 K średnia B1 B2 B średnia Aktywność β- amylazy M/ min/g słodu ZAKRES MATERIAŁU Cykl pentozofosforanowy- schemat przemian, enzymy, lokalizacja, rola. Glukoneogeneza- schemat przemian, enzymy, lokalizacja, rola. 6

7 Glikogenogeneza (synteza glikogenu). Fosforoliza glikogenu. Rozkład dwucukrów (sacharozy, laktozy). Enzymatyczny rozkład skrobi i celulozy. Literatura 1. Biochemia, J. M. Berg i wsp., PWN, Warszawa Biochemia Harpera, R. K. Murray i wsp., PZWL, Warszawa Cytobiochemia, L. Kłyszejko-Stefanowicz, PWN, Warszawa Biochemia kręgowców, W. Minakowski, S. Weidner, PWN, Warszawa Zarys biochemii (tom I i II), P. Karlson, PWN, Warszawa Ćwiczenia z biochemii, L. Kłyszejko-Stefanowicz, PWN, Warszawa Ćwiczenia z biochemii, Strzeżek J., ART, Ćwiczenia z biochemii, Łogin A. i in., ART,