ĆWICZENIE 5 MECHANIZMY PROMUJĄCE WZROST ROŚLIN

Transkrypt

1 ĆWICZENIE 5 MECHANIZMY PROMUJĄCE WZROST ROŚLIN CZĘŚĆ TEORETYCZNA Mechanizmy promujące wzrost rośli (PGP) Metody badań PGP

2 CZĘŚĆ PRAKTYCZNA 1. Mechanizmy promujące wzrost roślin. Odczyt. a) Wytwarzanie sideroforów- podłoże CAS. Sprawdzić, które szczepy wytwarzają siderofory, określić zmianę barwy podłoża oraz typ produkowanych sideroforów. Wyciągnąć wnioski. b) Produkcja enzymów rozkładających ścianę komórkową fitopatogenów. Po okresie inkubacji płytki Petriego na których zaobserwowano wzrost zalać płynem Lugola i odczekać 15 minut. Po tym czasie zlać płyn i określić zmianę zabarwienia podłoża. Wyciągnąć wnioski. c) Uwalnianie fosforu z jego nierozpuszczalnych związków- podłoże Pikowskaya agar. Po okresie hodowli zmierzyć średnicę powstałej wokół kolonii strefy przejaśnienia oraz średnicę samej kolonii. Porównać otrzymane wyniki na podstawie stosunku średnicy strefy przejaśnienia do kolonii. Wyciągnąć wnioski. d) Produkcja kwasu indolilo-3-octowego (IAA, auksyna)- podłoże LB z dodatkiem tryptofanu (500 µg/ml). Po inkubacji zawiesinę bakterii odwirować ( rpm, 10 minut, 4ºC). Zmieszać 2 ml supernatantu ze 100 μl 10 mm kwasu ortofosforowego oraz 4 ml odczynnika Salkowskiego. Po 25 minutach inkubacji w ciemni i temperaturze pokojowej, zmierzyć absorbancję mieszaniny (530 nm). Różowe zabarwienie świadczy o obecności kwasu indolilo-3-octowego. Obliczyć stężenie powstałego kwasu indolilo-3-octowego z krzywej wzorcowej IAA sporządzonej w zakresie 1-10 μg/ml tego związku. Wyciągnąć wnioski.

3 e) Produkcja amoniaku- podłoże woda peptonowa. Po okresie inkubacji sprawdzić ph hodowli. Następnie dodać 0,4 ml odczynnika Nesslera. Amoniak w środowisku alkalicznym tworzy z odczynnikiem Nesslera związek o żółtopomarańczowym zabarwieniu (jodek zasady Millona), którego intensywność jest proporcjonalna do stężenia azotu amonowego w badanej próbie. Wyciągnąć wnioski. f) Produkcja cyjanowodoru- podłoże z glicyną (4,4 g/l)- posiew na podłoże płynne. Po okresie inkubacji wysiać po 0,1 ml hodowli na podłoże stałe agar odżywczy z glicyną. Następnie na środek każdej płytki położyć kwadraty sterylnej bibuły, zanurzone uprzednio w 2% roztworze Na 2 CO 3 i 0,5% roztworze kwasu pikrynowego. Koniecznie posiane płytki uszczelnić parafilmem, gdyż HCN jest związkiem lotnym. Zostawić płytki do inkubacji w temperaturze pokojowej na kilka dni. Po tym czasie określić powstałe zmiany i wyciągnąć wnioski. Zmiana barwy bibuły z żółtej na pomarańczowo-brązową świadczy o produkcji HCN. Intensywność zabarwienia wskazuje na ilość powstałego związku. 2. Określenie zdolności badanych szczepów do wzrostu na podłożu z ACC jako jedynym źródłem azotu oraz oznaczanie aktywności enzymu deaminazy ACC. Oznaczanie aktywności enzymu deaminazy ACC Po inkubacji odwirować hodowle bakterii 6000 rpm przez 10 minut. Otrzymany osad zawiesić w 1 ml 0,1 M buforu Tris-HCl o ph 7,6 i ponownie wirować rpm przez 10 minut. Otrzymany osad zawiesić w 600 µl 0,1 M buforu Tris-HCl o ph 8,5. Do zawiesiny komórek bakterii dodać 30 µl toluenu i intensywnie wortekswać. Etap ten ma na celu spowodować lizę komórek bakteryjnych. Następnie postępować zgodnie z zamieszczonym schematem.

4 Do 200 µl ekstraktu komórek, dodać 20 µl 0,5 M ACC inkubować w 30 C przez 30 min Dodać 1 ml 0,56 N HCl zwirować ( rpm, 5 min) Do 1 ml supernatantu dodać 800 µl 0,56 N HCl, worteksować, dodać 300 µl 0,2% 2,4- dinitrofenylohydrazyny inkubować w 30 C przez 30 min Dodać 2 ml 2 N NaOH worteksować Zmierzyć absorbancję (540 nm) Ilość powstałego α-ketomaślanu określić się za pomocą krzywej standardowej w zakresie 0,1-1 µmol tego związku. Aktywność enzymu wyrazić w nmol α-ketomaślanu mg -1 białka h 1.

5 Określenie zawartości białka w ekstraktach komórkowych Stężenie białka w ekstraktach komórkowych z komórek traktowanych toluenem określić stosując metodę opracowaną przez Bradford (1976). 100 µl 5 M NaOH wprowadzić do 900 µl ekstraktu komórkowego, wytrząsać przez 10 minut w temperaturze pokojowej, po czym do 200 µl otrzymanej mieszaniny wprowadzić 1 ml odczynnika Bradford. Mieszaninę reakcyjną następnie inkubować 15 minut i po tym czasie zmierzyć absorbancję (595 nm). Krzywą kalibracyjną wykonać w zakresie stężeń µg/ml dla białka wzorcowegoalbuminy wołowej (BSA).