Laboratorium 5. Wpływ temperatury na aktywność enzymów. Inaktywacja termiczna

Transkrypt

1 Laboratorium 5 Wpływ temperatury na aktywność enzymów. Inaktywacja termiczna Prowadzący: dr inż. Karolina Labus 1. CZĘŚĆ TEORETYCZNA Szybkość reakcji enzymatycznej zależy przede wszystkim od stężenia substratu oraz enzymu zastosowanego jako biokatalizatora. Niemniej jednak znaczący wpływ na przebieg takiej reakcji mają również fizyko-chemiczne parametry środowiska tj. temperatura, ph, siła jonowa, potencjał redukcyjno-oksydacyjny oraz obecność rozmaitych związków (aktywatorów, inhibitorów). WPŁYW TEMPERATURY NA AKTYWNOŚĆ ENZYMÓW Wpływ temperatury na aktywność enzymów nie jest prostą zależnością, ponieważ z jednej strony jej wzrost o każde 10 C, zgodnie z regułą van t Hoffa, powoduje przyspieszenie katalizowanej reakcji od 2 do 4 razy, a z drugiej, po przekroczeniu pewnej granicy, powoduje stopniową inaktywację i zanik zdolności katalitycznych, co w rezultacie prowadzi do nieodwracalnej denaturacji termicznej tych białek. Dlatego znajomość wartości optymalnej temperatury działania i zakresu temperatur w którym stabilność konformacyjna danego białka jest największa, jest obligatoryjnie wymagana przed procesowym wykorzystaniem dowolnego enzymu. Nadmierny wzrost temperatury zwiększa prawdopodobieństwo zrywania licznych słabych wiązań stabilizujących strukturę przestrzenną białka, w tym strukturę centrum katalitycznego, kluczowego do prawidłowego działania enzymów. Szybkość inaktywacji zależy w pewnym stopniu od stężenia enzymu, ph środowiska reakcji oraz siły jonowej roztworu. Krzywa zależności aktywności enzymatycznej od temperatury posiada charakterystyczne maksimum, przy którym szybkość katalizowanej reakcji jest największa (Rys. 1). Rysunek 1. Krzywa zależności aktywności katalitycznej enzymu od temperatury. 1

2 W maksimum tym równocześnie zachodzą dwa zjawiska: (1) aktywność badanego enzymu jest najwyższa (lewa strona maksimum); (2) początek inaktywacji termicznej enzymu (prawa strona maksimum). Dlatego też zalecane jest stosowanie temperatury nieco niższej od wartości wyznaczonej w maksimum. Dla większości enzymów zmiany denaturacyjne zachodzą bardzo intensywnie powyżej C, jednakże są i takie, które wykazują znaczną odporność na inaktywujące działanie podwyższonej temperatury, czyli cechuje je tzw. wysoka termostabilność. Większość enzymów nieodwracalnie traci swoje właściwości katalityczne po przekroczeniu temperatury 65 C i jedynie nieliczne wytrzymują krótką inkubację w 100 C (np. pepsyna w ph 1.0). INAKTYWACJA TERMICZNA ENZYMÓW Kinetykę inaktywacji termicznej enzymów w najprostszy sposób można opisać jednostopniowym nieodwracalnym modelem pierwszorzędowym w którym aktywna forma enzymu (N) ulega przekształceniu do formy zdenaturowanej (I): N k I A kinetyczne równanie opisujące ten mechanizm ma postać: r dc dt gdzie: r szybkość reakcji [g. L -1. h -1 ] CN stężenie enzymu w formie aktywnej [g. L -1 ] Warunki początkowe: CN = CN0 dla t=0. N kc N Celem wyznaczenia kinetyki inaktywacji termicznej enzymu należy zbadać jak zmienia się aktywność takiego biokatalizatora w zależności od czasu jego inkubacji w danej temperaturze. Zazwyczaj taki eksperyment przeprowadza się dla kilku różnych temperatur a zmianę aktywności enzymatycznej w trakcie inaktywacji wyraża się jako stosunek aktywności po danym czasie (At) do początkowej aktywności enzymu wyznaczonej dla czasu t = 0 (A0). Przykładowy przebieg procesu inaktywacji termicznej enzymu dla danej temperatury przedstawia Rysunek 2. 2

3 Rysunek 2. Przykładowy przebieg inaktywacji termicznej enzymu wyrażony jako zależność aktywności enzymu (At/A0) od czasu inkubacji w danej temperaturze. Następnie wyznacza się tą zależność w skali półlogarytmicznej (Rys.3), dzięki czemu w przypadku inaktywacji przebiegającej zgodnie z jednostopniowym nieodwracalnym mechanizmem pierwszorzędowym możliwe jest wyznaczenie stałej szybkości inaktywacji (k) w danej temperaturze. Rysunek 3. Przykładowy przebieg inaktywacji termicznej enzymu w skali półlogarytmicznej. Z kolei, znając stałe szybkości procesu inaktywacji danego enzymu dla kilku temperatur można wyznaczyć energię aktywacji dla tego procesu wykorzystując równanie Arrheniusa, opisujące zależność szybkości danej reakcji od temperatury: ln k ln A Ea RT 3

4 gdzie: k stała szybkości inaktywacji w danej temperaturze [h -1 ] A współczynnik przed wykładniczy [h -1 ] Ea energia aktywacji procesu inaktywacji [J. mol -1 ] R uniwersalna stała gazowa [J. mol -1. K -1 ] T temperatura [K] Zależność ta może być przedstawiona graficznie (Rysunek 4). Rysunek 4. Zależność szybkości reakcji od temperatury. (Równanie Arrheniusa). Do kartkówki obowiązuje materiał umieszczony w instrukcji (zarówno część teoretyczna i praktyczna). 2. CEL ĆWICZENIA Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z eksperymentalną procedurą wyznaczania kinetyki inaktywacji termicznej enzymu w danym zakresie temperatur oraz podstawowymi obliczeniami niezbędnymi do wyznaczenia stałych szybkości oraz energii aktywacji tego procesu. 3. CZĘŚĆ PRAKTYCZNA Przygotować 0,1M bufor fosforanowy ph 7.0 (dla całej grupy 1L) 200 ml laktozy o stężeniu 50 g/l przygotować w 0,1Mbuforze fosforanowym o ph 7.0 Każda podgrupa potrzebuje tzw. łaźnię lodową (zlewka z pokruszonym lodem) Odczynnik I (różowy) do pomiaru aktywności enzymu 4

5 3.1. Przebieg inaktywacji termicznej enzymu (β-galaktozydazy) Do termostatowanego reaktora wprowadzić 20 ml 0,1M buforu fosforanowego o ph 7.0 i inkubować przez 10 min. Po upływie tego czasu do reaktora dodać 0,5 ml roztworu enzymu (przygotowanego przez prowadzącego) i włączyć stoper od tej chwili rozpoczyna się proces inaktywacji enzymu. Do probówek schłodzonych w łaźni lodowej pobrać z reaktora po 1 ml roztworu enzymu po upływie: 0, 1, 5, 10, 20, 30, 60 min od rozpoczęcia procesu inaktywacji termicznej. Próbki enzymu pobrane z reaktora umieścić w łaźni lodowej na 5 min, a następnie we wszystkich zmierzyć aktywność zgodnie z procedurą opisaną w punkcie 3.2. Każda podgrupa wykonuje doświadczenie dla dwóch różnych temperatur Pomiar aktywności katalitycznej enzymu (przypomnienie analityki z Lab 4) W pomiarach aktywności enzymu (β-galaktozydazy) wykorzystywany jest test analityczny na glukozę jednego z produktów reakcji katalizowanej przez ten enzym. Sposób wykonania testu analitycznego na zawartość glukozy: Z odpowiednio rozcieńczonej próbki pobrać 10 µl do 1 ml Odczynnika I (Glukoza OXY DST, Alpha Diagnostics), inkubować przez 5 min w 37 C, a następnie mierzyć absorbancję przy długości fali 500 nm. Przed rozpoczęciem pomiarów spektrofotometr należy wyzerować na 1 ml Odczynnika I. Pomiar aktywności katalitycznej enzymu (β-galaktozydazy) W 0,1M buforze fosforanowym o ph 7.0 przygotować roztwór substratu (laktozy) o stężeniu 50 g/l Następnie do termostatu (37 C) włożyć probówkę zawierającą 5 ml roztworu substratu i inkubować przez około 10 min. W międzyczasie przygotować statyw z 6 probówkami i dodać do nich po 1 ml Odczynnika I (różowego). Po upływie tego czasu do probówki zawierającej preinkubowany substrat dodać 0,5 ml roztworu enzymu (pobranego po danym czasie inaktywacji) i włączyć stoper. Przez 10 min co 2 minuty pobierać próbki z probówki (10 µl), które od razu należy umieścić w 1 ml odczynnika różowego i wstawić dokładnie na 5 min do łaźni wodnej (37 C), a następnie na spektrofotometrze dla wszystkich próbek zmierzyć absorbancję przy 5

6 500 nm. Aparat wyzerować na 1 ml Odczynnika I. Próbki po wyciągnięciu z łaźni (5min, 37 C) mogą czekać na pomiary absorbancji w temperaturze pokojowej do ok. 25 min. Pomiar aktywności wykonać dla wszystkich próbek enzymu pobranych w trakcie przebiegu inaktywacji Opracowanie wyników Każda podgrupa do sporządzenia sprawozdania potrzebuje wyniki całej grupy. W sprawozdaniu procedurę wykonania doświadczenia przedstawić graficznie na schemacie (nie przepisywać instrukcji). Przebieg inaktywacji dla danej temperatury przedstawić na wykresie półlogarytmicznym (ln(at/a0) = -kt) i wyznaczyć stałą szybkości inaktywacji (k). Analogicznie wyznaczyć stałe inaktywacji dla pozostałych temperatur. Następnie wykorzystując równanie Arrheniusa wyznaczyć energię aktywacji dla procesu inaktywacji. Skomentować i podsumować uzyskane wyniki. 6