Wykazanie obecności oksydoreduktaz w materiale biologicznym

Transkrypt

1 KATEDRA BIOCHEMII Wydział Biologii i Ochrony Środowiska Wykazanie obecności oksydoreduktaz w materiale biologicznym ĆWICZENIE 9 ZADANIE 1 OTRZYMYWANIE PREPARATU ENZYMATYCZNEGO 1. Umyty ziemniak utrzeć na tarce. 2. Miazgę włożyć do woreczka z gazy i zanurzyć w zlewce zawierającej około 200 wody, a następnie lekko wycisnąć zawartość.. Roztwór łagodnie wymieszać. Po opadnięciu skrobi na dno zlewki, płyn ostrożnie zlać znad osadu. 4. Uzyskujemy w ten sposób wodny ekstrakt enzymów. Roztwór zachować do dalszych badań! A) INAKTYWACJA TERMICZNA ENZYMU 1. Około 50 preparatu enzymatycznego przenieś do zlewki, doprowadzić do wrzenia i gotować przez 2- minuty. 2. Ostudzić. Roztwór zachować do dalszych badań! ZADANIE 2 WYKAZANIE OBECNOŚCI OKSYDAZY CYTOCHROMOWEJ Oksydaza cytochromowa występuje w wewnętrznej błonie mitochondrialnej, stanowiąc końcowy element łańcucha oddechowego w komórce. Jest hemoproteiną zawierającą w cząsteczce 2 cytochromy: a i a mające po jednym atomie miedzi oscylującym między dwoma stopniami utlenienia Cu 2+ i Cu + oraz po jednym atomie żelaza oscylującym między Fe + i Fe 2+ w reakcji katalizowanej przez ten enzym zachodzi przeniesienie 4 elektronów z 4 cząsteczek cytochromu c na tlen cząsteczkowy z wytworzeniem 2 cząsteczek wody. Obecność oksydazy w tkankach można wykazać za pomocą reakcji z odczynnikiem NADI. W wyniku nieenzymatycznej reakcji cytochromu przez p-fenylenodiaminę powstaje p- fenylenodiimina, tworząca w obecności -naftolu niebieski kompleks. 1

2 WYKONANIE: Tabela 1 Numer probówki 1. Do pięciu ponumerowanych probówek wprowadzić podane w Tabeli 1 ilości poszczególnych roztworów. UWAGA! Do probówki nr 4 wprowadzić ekstrakt z ziemniaka. 2. Zawartość probówek starannie wymieszać i pozostawić w temperaturze pokojowej na 0 minut.. Obserwować powstałe zabarwienie i wyciągnąć odpowiednie wnioski. Roztwór enzymu, Woda destylowana, Bufor ph7,4, KCN, krople NADI, , ,1 1 0, ekstrakt, , ,1 ZADANIE WYKAZANIE OBECNOŚCI OKSYDAZY FENOLOWEJ Oksydaza fenolowa jest metaloproteiną, zawierającą miedź która przenosi wodór bezpośrednio na tlen cząsteczkowy. Substratami w tej reakcji są mono- i polifenole, które utleniają się do chinonów. Produktem reakcji obok chinonów jest woda. Chinony kondensując dają barwne pochodne (żółte lub brązowe). Typową reakcją katalizowaną przez ten enzym jest utlenianie pirokatechiny. Działaniu enzymu ulega również fenol jednowodorotlenowy, przy czym najpierw tworzy się pirokatechina. Obecność oksydaz polifenolowych w komórkach roślin można łatwo stwierdzić obserwując uszkodzone tkanki. W wyniku kontaktu z tlenem pojawiają się barwniki chinonowe odpowiedzialne za ciemnienie np. obranych ziemniaków, jabłek itp. Reakcja katalizowana przez oksydazę. WYKONANIE: 1. Do trzech ponumerowanych probówek wprowadzić podane w Tabeli 2 ilości poszczególnych roztworów. UWAGA! Do probówki nr wprowadzić ekstrakt z ziemniaka. 2

3 Tabela 2 Numer probówki 2. W celu lepszego dostępu tlenu, próby co minutę mocno wstrząsnąć!. Próby pozostawić na 20 minut w temperaturze pokojowej.. Obserwować powstałe zabarwienie i wyciągnąć odpowiednie wnioski. Roztwór enzymu, Bufor ph 7,4;, Pirokatechina, Fenol, Woda destylowana, , , ,1 ekstrakt, ,1 ZADANIE ENZYMY ROZKŁADAJĄCE NADTLENEK WODORU Nadtlenek wodoru (H 2 O 2 ) jest silnym inhibitorem układów enzymatycznych, a jego nagromadzenie może sprzyjać tworzeniu się wolnych rodników, które z kolei mogą uszkadzać błony komórkowe i materiał genetyczny komórek. W związku z tym organizmy żywe posiadają aktywne mechanizmy zdolne do rozkładu nadtlenku wodoru. Do enzymów biorących udział w usuwaniu H 2 O 2 z komórki należą peroksydazy i katalazy. Są to metaloproteiny z atomem żelaza w grupie prostetycznej. Katalaza występuje powszechnie w organizmach tlenowych, głównie u zwierząt: w wątrobie, nerkach, krwi, szpiku, błonach śluzowych. Peroksydazy są to enzymy głównie roślinne, rzadziej zwierzęce. A) WYKRYWANIE PEROKSYDAZY Peroksydazy katalizują reakcję utleniania nadtlenkiem wodoru wielu różnych substratów organicznych i nieorganicznych. Mechanizm działania peroksydaz można przedstawić równaniem: AH 2 +H 2 O 2 A+2H 2 O gdzie: AH 2 -substrat w stanie zredukowanym; A - utleniony produkt reakcji. Peroksydazy są obecne we wszystkich organizmach żywych. Ich bogatym źródłem są rośliny, np. ziemniak i chrzan. Enzymy te stanowią pierwszą linię obronną roślin. Ich aktywność szybko wzrasta, kiedy roślina reaguje na patogen (np. drobnoustroje, owady) czy stres (np. zanieczyszczenie powietrza). Dlatego też wraz z katalazą mogą być dobrym markerem stresów fizjologicznych w roślinie. W stosowanej metodzie oznaczania aktywności peroksydazy jako donor wodoru wykorzystywana jest benzydyna. Związek ten w obecności peroksydazy i H 2 O 2 ulega utlenieniu do difenochinonodiiminy, która kondensując z cząsteczką nie zredukowanej benzydyny tworzy błękit benzydynowy:

4 WYKONANIE: Tabela Numer probówki 1. Do 5 probówek odmierzyć podane w Tabeli objętości ekstraktu z ziemniaka, benzydyny, H 2 O 2, KCN i H 2 O. UWAGA! Do probówki nr wprowadzić ekstrakt z ziemniaka. 2. Zawartość probówek wymieszać i postawić na 20 min. w temperaturze pokojowej.. Obserwować powstałe zabarwienie i wyciągnąć odpowiednie wnioski. Roztwór enzymu, Woda destylowana, Benzydyna, KCN, krople H 2 O 2, 1 2,5 1 0,1 0 0,1 2 2,5 0, ,1 0 0,1 0 0,1 ekstrakt 2,5 4 2,5 0,1 0,

5 A) WYKRYWANIE KATALAZY Katalazy są metaloproteinami zawierającymi w swoich cząsteczkach atomy żelaza. Enzymy te charakteryzują się bardzo dużą aktywnością. Katalizują rozpad nadtlenku wodoru do wody i tlenu cząsteczkowego: H 2 O 2 jest jednocześnie donorem i akceptorem wodoru. Powstający w tej reakcji tlen gwałtownie wydziela się z roztworu, co powoduje jego silne pienienie. WYKONANIE: 1. Do probówek odmierzyć podane w Tabeli 4 objętości ekstraktu z ziemniaka, H 2 O 2, KCN i H 2 O. UWAGA! Do probówki nr wprowadzić ekstrakt z ziemniaka. 2. Zawartość probówek wymieszać i postawić na 20 min. w temperaturze pokojowej.. Obserwować powstałe zabarwienie i wyciągnąć odpowiednie wnioski. Tabela 4 Numer Roztwór H 2 O 2 KCN probówki enzymu, krople krople , kilka ekstrakt, ZAKRES MATERIAŁU Powtórzenie wiadomości o koenzymach. Powtórzenie wiadomości o budowie i funkcji błon biologicznych. Transport przez błony (bierny, aktywny, przykłady). Łańcuch oddechowy (potencjały oksydoredukcyjne, sekwencja przenośników elektronów i ich transport, pompy protonowe). Budowa i funkcja ATPazy (podjednostka F 0 i F1) Typy fosforylacji w komórce (fosforylacja substratowa i oksydacyjna). Teoria chemiosmotyczna Mitchella (siła protonomotoryczna, potencjał błonowy). Bilans energetyczny łańcucha oddechowego. Literatura 1. Biochemia, J. M. Berg i wsp., PWN, Warszawa

6 2. Biochemia Harpera, R. K. Murray i wsp., PZWL, Warszawa Cytobiochemia, L. Kłyszejko-Stefanowicz, PWN, Warszawa Biochemia kręgowców, W. Minakowski, S. Weidner, PWN, Warszawa Zarys biochemii, P. Karlson, PWN, Warszawa Ćwiczenia z biochemii, L. Kłyszejko-Stefanowicz, PWN, Warszawa Ćwiczenia z biochemii, Strzeżek J., ART, Ćwiczenia z biochemii, Łogoń A. i in., ART, Biochemia ćwiczenia laboratoryjne, J. Walory i in., Oficyna Wydawnicza Politechniki Warszawskiej, Warszawa 200 6