Ćwiczenie 14. Maria Bełtowska-Brzezinska KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNYCH

Transkrypt

1 Ćwiczenie 14 aria Bełtowska-Brzezinska KINETYKA REAKCJI ENZYATYCZNYCH Zagadnienia: Podstawowe pojęcia kinetyki chemicznej (szybkość reakcji, reakcje elementarne, rząd reakcji). Równania kinetyczne prostych reakcji zerowego, pierwszego i drugiego rzędu oraz niektórych reakcji złoŝonych (odwracalnych, równoległych, następczych). Energia aktywacji, teoria stanu przejściowego. echanizm i kinetyka homogenicznych reakcji katalitycznych. Katalizatorami w układach biologicznych są enzymy, wśród których prawie wszystkie są białkami. Działanie enzymów, tak jak i wszystkich innych katalizatorów, polega na obniŝeniu energii aktywacji w reakcji chemicznej czego konsekwencją jest zwiększenie szybkości przejścia od substratów do produktów. Reakcje katalizowane przez enzymy (reakcje enzymatyczne) przebiegają co najmniej 1 5 razy szybciej niŝ przy braku katalizatora. Nie zmienia się przy tym stan równowagi w reakcjach odwracalnych, gdyŝ enzym przyspiesza w jednakowym stopniu reakcje biegnące w obu kierunkach. Warunkiem katalizy enzymatycznej jest związanie substratu (S) w tak zwanym miejscu aktywnym enzymu (E) poprzez lokalne oddziaływania będące kombinacją wiązań wodorowych, sił elektrostatycznych oraz sił van der Waalsa. Istotne jest przy tym wzajemne dopasowanie struktury przestrzennej (kształtu) miejsca aktywnego i cząsteczek substratu. StęŜenie enzymu pełniącego rolę katalizatora pozostaje niezmiennie stałe podczas reakcji. W przypadku szeregu enzymów nie zmieniają się teŝ właściwości ich miejsc aktywnych po związaniu cząsteczek substratu. Obserwowana jest wówczas paraboliczna zaleŝność miedzy szybkością reakcji enzymatycznej a stęŝeniem substratu, co pokazuje rys. 1. Takiej charakterystyce kinetycznej odpowiada model mechanizmu zaproponowany przez ichaelisa-enten. Według tych autorów, w pierwszym etapie reakcji enzym (E) przyłącza substrat (S) w miejscu aktywnym, tworząc kompleks pośredni enzym-substrat (ES). Kompleks (ES) dysocjuje następnie częściowo do (S) i (E), a częściowo przekształca się w produkt (P). Uwolnione przy tym

2 miejsce aktywne enzymu moŝe wiązać i aktywować następne cząsteczki substratu. Sekwencję wymienionych reakcji odzwierciedla schemat: E + S k 1 k k 1 ES E + P (1) gdzie k 1, k 1, k stałe szybkości odpowiednich reakcji. Według powyŝszego schematu szybkość przyrostu stęŝenia produktu reakcji ([P]), stanowiąca miarę szybkości reakcji (v), jest równa iloczynowi stałej szybkości k i stęŝenia kompleksu substratu z enzymem ([E): v = d[ P]/dt = k E () Związek miedzy stęŝeniem kompleksu enzym substrat [E a stęŝeniem enzymu i substratu moŝna określić przy zastosowaniu tzw. metody stanu stacjonarnego, to jest przyjmując załoŝenie o jednakowej szybkości tworzenia i rozpadu takiego kompleksu: = k 1 E E (3) gdzie [ i [ oznaczają odpowiednio stęŝenie wolnego enzymu i substratu. Oznacza to d[e/dt =, a więc stałe (stacjonarne) stęŝenie kompleksu enzym-substrat w czasie reakcji. W typowych reakcjach enzymatycznych całkowite stęŝenie enzymu [ jest znacznie mniejsze od całkowitego stęŝenia substratu [ ([ << [ ) i zatem stęŝenie substratu związanego z enzymem jest znacznie mniejsze od steŝenia wolnego substratu [E << [. StęŜenie wolnego substratu praktycznie nie róŝni się wtedy od całkowitego stęŝenia substratu: [ [S ] =[ + [E. Natomiast większość miejsc aktywnych enzymu zostaje związana w kompleks z substratem i zatem stęŝenie wolnego enzymu [ wyraŝa wzór: [ [ E (4) Podstawienie prawej strony wyraŝenia (4) i [ [S ] do równania (3) daje: ([ [ E ) = k E ] 1 ES (5) skąd po przekształceniu wynika wyraŝenie opisujące stęŝenie kompleksu aktywnego: [ E k 1 1 (6)

3 Po podzieleniu licznika oraz mianownika przez k 1 i po wprowadzeniu nowej stałej nazywanej stałą ichaelisa: K = ( k 1 )/ wzór (6) ulega przekształceniu do postaci: [ E (6a) Na tej podstawie naleŝy oczekiwać, Ŝe wszystkie miejsca aktywne enzymu będą zajęte przez substrat wtedy, kiedy [ jest duŝo większe od K. Podstawiając kolejno wzory (6) i (6a) do równania () otrzymujemy: v = k k 1 1 = k (7) Z wzoru (7) wynika, Ŝe szybkość reakcji osiąga wartość maksymalną ( v max ) w warunkach wysycenia wszystkich miejsc aktywnych enzymu przez substrat. PoniewaŜ dla dostatecznie duŝego stęŝenia substratu S ] /( ) 1, to: v max k [ = (8) Łatwo moŝna zauwaŝyć, Ŝe o maksymalnej wartości szybkości reakcji enzymatycznej decyduje zarówno całkowite stęŝenie enzymu jak i stała szybkości rozpadu kompleksu enzym-substrat do produktów. Z podstawienia wzoru (8) do równania (7) otrzymujemy tak zwane równanie ichaelisa-enten: v = vmax (9) Z równania (9) wynika sens fizyczny stałej ichaelisa, K. ZauwaŜamy, Ŝe jeŝeli [ S ] = K to wtedy v = v max /. Fakt ten stanowi podstawę dla stwierdzenia, Ŝe stała K jest równa takiemu stęŝeniu substratu, przy którym szybkość reakcji enzymatycznej osiąga połowę wartości maksymalnej dla danej wartości stęŝenia [. Inaczej mówiąc, stała K odpowiada takiemu stęŝeniu substratu, przy którym obsadza on połowę miejsc aktywnych enzymu. NaleŜy pamiętać, Ŝe stała K jest określona przez wartości k 1, k 1 oraz k i dla większości enzymów jej wartość waha się w granicach mol/dm 3. Przebieg zaleŝności szybkości reakcji enzymatycznej od stęŝenia substratu według wyraŝenia (9), to jest w warunkach [ << [S ], jest zilustrowany na rys. 1. Przy małym całkowitym stęŝeniu substratu, takim iŝ [ << K, szybkość tworzenia produktu rośnie wprost proporcjonalnie do [S ] i dla 3

4 danego [ = const zaleŝy od wartości ilorazu ( k /K v = vmax / K = ( k / K )[ [. Dalej, przy dostatecznie duŝym stęŝeniu substratu ([ S >> K ), tworzenie się produktu nastepuje z maksymalną szybkoscią ( v = ewentualnego dalszego wzrostu steŝenia substratu. ] vmax ), niezaleŝnie od Rys. 1. ZaleŜność szybkości reakcji (v) od stęŝenia substratu ([) według równania ichaelisa-enten JeŜeli znane jest stęŝenie enzymu [ to szybkość maksymalna v max ujawnia liczbę obrotów enzymu. Tym pojęciem przyjęto określać liczbę cząsteczek substratu przekształconych w produkt reakcji w jednostce czasu przez 1 mol enzymu w warunkach pełnego wysycenia enzymu przez substrat. Liczba obrotów enzymu jest więc równa wartości stałej kinetycznej k. Dla większości enzymów w środowisku fizjologicznym jest ona zawarta w granicach 1 do 1 4 s 1. Jest oczywistym, Ŝe kaŝdy cykl katalizy następuje w czasie równym 1/ k [s]. Po przedstawieniu obu stron równania ichaelisa-enten w formie odwrotności otrzymujemy liniową zaleŝność (y = ax+ b ): 1 1 K 1 = (1) v v + max vmax Jak widać z rys., punkt przecięcia prostej z osią rzędnych ( y = 1/ v ) wyznacza wartość wyraŝenia b = 1/ vmax [dm 3 s mol 1 ] przy [E ] = const. 4

5 Z kolei ze współczynnika kierunkowego prostej względem osi odciętych: a = K /v max [s] moŝna obliczyć wartość K [mol dm 3 ]. PowyŜszy sposób postępowania przy wyznaczaniu wartości stałej ichaelisa i szybkości maksymalnej na podstawie danych doświadczalnych znany jest jako metoda Lineweavera-Burka. Rys.. Graficzne przedstawienie równania ichaelisa-enten według Lineweavera-Burka 5