WYCHOWANIE FIZYCZNE - STUDIA ZAOCZNE 2010/2011

Transkrypt

1 WYCHOWANIE FIZYCZNE - STUDIA ZAOCZNE 2010/2011 INSTRUKCJE DO ĆWICZEŃ LABORATORYJNYCH Z BIOCHEMII Zasady postępowania w laboratorium: 1. Do wykonania ćwiczenia moŝna przystąpić dopiero po dokładnym zapoznaniu się z opisem całego doświadczenia. 2. Do pobierania odczynników z butelek naleŝy zawsze stosować czyste pipety lub cylindry, umyte i wypłukane wodą destylowaną. 3. Nadmiaru pobranego odczynnika nigdy nie wlewać z powrotem do butelki z odczynnikiem. 4. W czasie ogrzewania zawartości probówek nigdy nie kierować jej wylotu w stronę innych osób. 5. W przypadku kontaktu odczynnika ze skórą natychmiast przemyć ją obficie wodą wodociągową i powiadomić o tym prowadzącego zajęcia. 6. KaŜdy wypadek naleŝy natychmiast zgłosić prowadzącemu zajęcia. 7. Po zakończeniu eksperymentu dokładnie zamknąć wszystkie butelki z odczynnikami. 8. Przed wyjściem z pracowni umyć ręce. Ćwiczenie 1 Oznaczanie stęŝenia hemoglobiny metodą Drabkina Do 3 probówek odmierzyć po 5 ml odczynnika Drabkina. Następnie do kaŝdej probówki dodać 0,02 ml krwi pełnej - dobrze wymieszać. Odstawić na 30 minut w temp. pokojowej. Odczytać ekstynkcję próbek (λ=540 nm) wobec odcz. Drabkina jako próby ślepej. Odczytać ekstynkcję wzorca hemoglobiny. Obliczyć stęŝenie hemoglobiny (Hb) wg wzoru: Hb[g%] = (E próby / E wzorca ) x f Ćwiczenie 2 Strącanie białek kationami metali cięŝkich Do 4 probówek odmierzyć po 2 ml rozcieńczonego (10-krotnie) białka jaja kurzego. Wkropić do nich poniŝsze sole; zapisać obserwacje (ocenić stopień zmętnienia). SÓL STOPIEŃ ZMĘTNIENIA CuSO 4 HgCl 2 (CH 3 COO) 2 Pb Na 2 WO 4

2 Ćwiczenie 3 Denaturacja termiczna sacharazy Do dwóch probówek (A, B) odmierzyć po 3 ml zawiesiny droŝdŝy piekarniczych. Probówkę A wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 10 minut. Po wyjęciu z łaźni schłodzić pod bieŝącą wodą. Następnie do probówek A i B dodać po 3 ml roztworu sacharozy, zawartość probówek wstrząsnąć i pozostawić na 10 minut. Przeprowadzić próbę Fehlinga dla roztworów z probówek A i B. Dla porównania wykonać próbę Fehlinga na czystym roztworze sacharozy. Próba Fehlinga: Przygotować dwie probówki. W jednej probówce zmieszać 1 ml odczynnika Fehling I z 1 ml odczynnika Fehling II. Do drugiej probówki wlać 2ml roztworu badanej substancji. Zawartość obu probówek ogrzewać nad płomieniem lub we wrzącej łaźni wodnej. Następnie zlać zawartość obu probówek razem i obserwować zmianę zabarwienia. Wyjaśnienie: w obecności cukru, mającego właściwości redukujące, miedź zawarta w odczynniku (niebieski kolor) redukuje się ze stopnia utlenienia +2 do stopnia utlenienia +1 (kolor Ŝółty, pomarańczowy lub czerwony). Ćwiczenie 4 Oznaczanie aktywności amylazy Zasada oznaczenia: Roztwór skrobi z roztworem J 2 w KJ tworzą granatowy kompleks. Pośrednimi produktami rozkładu skrobi są amylozy dające róŝne zabarwienie z roztworem J 2 w KJ: amylodekstryny zabarwienie fiołkowe erytrodekstryny - zabarwienie czerwone achro-i-malto-dekstryny nie dają zmiany zabarwienia jodu Zjawisko to moŝna wykorzystać do badania aktywności amylazy, dla której skrobia jest naturalnym substratem. Oznaczanie aktywności amylazy w zaleŝności od a) Dla buforu o = 5,5 i buforu o = 6,5 postępujemy następująco: Przygotowujemy statywy z ok. 10 probówkami, do których wlewamy po 0,5 ml J 2 w KJ W nowej probówce przygotowujemy mieszaninę inkubacyjną zawierającą 2 ml buforu (o odpowiednim ) i 2 ml kleiku skrobiowego Do mieszaniny inkubacyjnej dodajemy 0,2 ml amylazy, wstrząsamy i natychmiast zaczynamy liczyć czas (stoper) Co 1 minutę pobieramy z mieszaniny inkubacyjnej po 0,2 ml roztworu do kolejnych probówek z J 2 w KJ Obserwujemy zmiany zabarwienia aŝ do Ŝółtej (barwa jodu) jest to moment osiągnięcia hydrolizy skrobi do stadium achrodekstryn. b) Dla buforu o = 7,5 postępujemy w punktach 1 3 identycznie jak wyŝej, następnie: Co 5 minut pobieramy z mieszaniny inkubacyjnej po 0,2 ml roztworu do kolejnych probówek z J 2 w KJ

3 Oznaczanie aktywności amylazy w zaleŝności od temperatury W 4 probówkach (A, B, C, D) przygotowujemy jednakowe mieszaniny inkubacyjne składające się z 2 ml buforu o =6,5 i 2 ml kleiku skrobiowego. Mieszaniny inkubujemy przez 5 minut w temperaturach: probówka A: wody wodociągowej z lodem probówka B: pokojowej probówka C: łaźni wodnej o temp C probówka D: wrzącej łaźni wodnej Przygotowujemy statywy z ok. 10 probówkami (dla kaŝdej temperatury), do których wlewamy po 0,5 ml J 2 w KJ Następnie dodajemy do kaŝdej mieszaniny po 0,2 ml amylazy, wstrzasamy i natychmiast zaczynamy liczyć czas Analogicznie jak w poprzednim ćwiczeniu, co 1 minutę pobieramy po 0,2 ml mieszaniny do kolejnych probówek zawierających J 2 w KJ i zapisujemy czas, po którym następują zmiany barwy. Ćwiczenie 5 Badanie właściwości redukcyjnych cukrów a) Próba Tollensa (dla glukozy): Do suchej probówki dodać 2 ml roztworu azotanu srebra. Następnie, kroplami (powinny wystarczyć max. 2 krople) dodawać roztwór amoniaku jednocześnie wstrząsając tak długo, aŝ wytrącający się osad tlenku srebra całkowicie się rozpuści. NaleŜy unikać nadmiaru amoniaku. Do tak przygotowanego roztworu dodać 2 ml glukozy. Probówkę powoli i ostroŝnie ogrzewać nad płomieniem palnika spirytusowego lub we wrzącej łaźni wodnej do uzyskania lustra srebrnego. UWAGA! NIE KIEROWAĆ WYLOTU PROBÓWKI W STRONĘ INNYCH OSÓB b) Próba Fehlinga (dla glukozy, laktozy, sacharozy) Próbę przeprowadzić jak w ćwiczeniu 3. Ćwiczenie 6 Reakcja zmydlania trójglicerydów Do probówki odmierzyć 0,5 ml oliwy i dodać 5 ml 10% alkoholowego roztworu KOH. Zmieszać i wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 15 minut. Następnie dodać 5 ml wody destylowanej i ogrzewać w łaźni do odparowania alkoholu. Powstaje opalizujący roztwór, który wstrząsany pieni się. Przy pomocy papierka wskaźnikowego zbadać otrzymanego roztworu. Napisać reakcję zmydlania trójoleinianu glicerolu. Napisać reakcję utwardzania trójoleinianu glicerolu. Napisać reakcję lipolizy TG otrzymanego w wyniku utwardzenia trójoleinianu glicerolu.

4 Ćwiczenie 7 Pomiar wartości roztworów wybranych związków chemicznych oraz produktów spoŝywczych Nalewamy badany roztwór do zlewki i badamy jego za pomocą papierka uniwersalnego, a następnie przy pomocy -metru. Porównujemy uzyskane wyniki. Lp. RODZAJ SUBSTANCJI PAPIEREK - metr 1 HCl 0,1 M 2 NaOH 0,1 M 3 KH 2 PO 4 0,1 M 4 Na 2 HPO 4 0,1 M 5 NaCl 2 0,1 M 6 Mleko 7 Sok jabłkowy 8 Sok pomarańczowy 9 Pepsi/Coca Cola 10 Woda wodociągowa 11 Woda destylowana Ćwiczenie 8 Porównanie buforujących właściwości wody destylowanej, wody wodociągowej i białek osocza Do 3 kolbek odmierzyć kolejno: kolba A: kolba B: kolba C: 5 ml wody destylowanej 5 ml wody wodociągowej 5 ml roztworu surowicy Do wszystkich kolbek (A, B, C) dodać po 5-6 kropli czerwieni metylowej (wskaźnik alkacymetryczny - indykator). Następnie do kaŝdej z nich dodawać kroplami (licząc!) 0,2 M HCl, aŝ do porównywalnej zmiany zabarwienia kaŝdego z roztworów. Za kaŝdym razem po dodaniu kropli HCl zamieszać zawartość kolby! Uzyskane wyniki zapisać w tabeli. SUBSTANCJA woda destylowana woda wodociągowa surowica ILOŚĆ KROPLI HCl

5 Ćwiczenie 9 Badnie odczynu biuretowego białek. Do 2 ml roztworu białka jaja kurzego dodać 2 ml roztworu odczynnika biuretowego. Zapisać jaką barwę uzyskał roztwór:... Ćwiczenie 10 Badanie własności roztworów buforowych Sporządzić bufor fosforanowy: 1) do kolbki wlać 40 ml 1/15 M ortofosforanu jednopotasowego (KH 2 PO 4 ) i 20ml 1/15 M ortofosforanu dwusodowego (Na 2 HPO 4 ) dokładnie wymieszać 2) do zlewek oznaczonych A i B wlać po około 20 ml buforu zmierzyć początkowe, wpisać do tabeli 3) do zlewki A dodać 1 ml 0,1 M roztworu kwasu solnego (HCl), wymieszać 4) do zlewki B dodać 1 ml 0,1 M roztworu zasady sodowej (NaOH), wymieszać Przeprowadzić kontrolę z wodą destylowaną: 1) do zlewek oznaczonych A i B wlać po około 20 ml wody destylowanej zmierzyć początkowe, wpisać do tabeli 2) do zlewki A dodać 1 ml 0,1 M roztworu kwasu solnego (HCl), wymieszać 3) do zlewki B dodać 1 ml 0,1 M roztworu zasady sodowej (NaOH), wymieszać Roztwór badany początkowe zlewka A (z HCl ) zlewka B (z NaOH ) Bufor fosforanowy Woda destylowana