Zastosowanie metody wygaszania fluorescencji wewnętrznej do badań strukturalnych białek

Wielkość: px

Rozpocząć pokaz od strony:

Download "Zastosowanie metody wygaszania fluorescencji wewnętrznej do badań strukturalnych białek"

Przybysław Adam Marszałek
7 lat temu
Przeglądów:

1 Zastosowane metody wygaszana luorescencj wewnętrznej do badań struturalnych bałe Jedną z metod stosownych w badanach dynam strutury bałe oraz ch ragmentów jest spetrosopa luorescencyjna. Jej przydatność wyna mędzy nnym z atu ntegralnej obecnośc w łańcuchach polpeptydowych luoroorów, tzn. reszt amnowasów aromatycznych posadających sprzężony uład wązań podwójnych: tryptoanu, tyrozyny enyloalanny. W zarese długośc al śwatła wzbudzającego od ooło 295 nm do 35 nm, za absorpcje otonów odpowedzalne są wyłączne reszty tryptoanow, co umożlwa ch seletywne wzbudzane w obecnośc nnych reszt aromatycznych, Wydajność wantowa luorescencj, denowana jao stosune lośc wantów wyemtowanych do lośc wantów zaabsorbowanych, równa jest jednośc tylo wówczas, gdy deescytacja stanu wzbudzonego zachodz wyłączne poprzez emsje otonów. Zwyle jedna występują równeż procesy bezpromenste. W warunach równowag, szybość pochłanana wantów śwatła, tj. przechodzene ze stanu podstawowego do stanu wzbudzonego cząstecz, równa jest szybośc powrotu ze stanu podstawowego do stanu podstawowego, na tóry to powrót sładają sę procesy zachodzące z emsja otonów oraz procesy bezemsyjne. Oznaczając wydajność wantowa przez Φ: Γ Φ (1) Γ + K gdze: jest lczbą wantów śwatła luorescencyjnego, lczba wantów śwatła luorescencyjnego w przypadu, gdyby deescytacja ażdego stanu wzbudzonego zachodzła wyłączne przez zjawso emsj, Γ - szyboścą deescytacj zachodzącej poprzez emsję otonów, K szyboścą deescytacj zachodzącej poprzez procesy bezpromenste. Wyrażene 1/Γ+K ma wymar czasu jest czasem życa luorescencj: 1 (2) Γ + K Wyrażene 1/Γ oznacza czas życa pozomu wzbudzonego, gdy jedynym sposobem detecj jest emsja otonów. Rozważając procesy zachodzące podczas naśwetlana śwatłem monochromatycznym rozceńczonego, homogencznego roztworu substancj można zapsać: a wzbudzene: + hν * (3) deescytacja przez luorescencję: * + hν` (4) m deescytacja bezpromensta: * (5) oraz: * + Q [*.Q] + Q + c (6)

2 Równane (6) opsuje zjawso wygaszana luorescencj przez substancję wygaszającą Q obecną w roztworze. Cząstecza wygaszacza w wynu zderzena z ze wzbudzoną cząsteczą powoduje deescytację tej ostatnej. Poneważ do utworzena omplesu [*.Q] dochodz w jaś czas po wzbudzenu luoroora, zjawso bmoleularnego wygaszana prowadz do srócena czasu życa luorescencj. Szybośc zachodzena wymenonych są równe: d[ *] *] *] *]/ a m [ *] [ *] [ *][ Q] Wartość jest stałą szybośc gaszena bmoleularnego. Jeśl natężene śwatła wzbudzającego jest stałe, to w uładze ustala sę równowaga, w tórej szybość wzbudzana cząstecze jest równa sume szybośc wszystch procesów sładających sę na deescytację: + [ Q] * (7) ( )[ ] a m + Zgodne z dencją wydajnośc wantowej można zapsać: Φ [ *] ( + + [ Q] )[ *] m (8) Analogczne, wydajność wantowa przy brau wygaszacza wynos: przy czym 1 ( + ) m Φ` [ *] ( + )[ *] m jest czasem życa luorescencj przy zerowym stężenu wygaszacza. Dzeląc stornam równane (8) przez (9) otrzymamy tzw. zależność Sterna-Volmera w postac: 1 (1) 1+ [ Q] Wartość K SV nos nazwę stałej Sterna-Volmera. Równane (1) jest najczęścej przedstawane jao: (9) 1+ K SV [ Q] (11) gdyż w uładze współrzędnych / w uncj [Q] przewduje zależność lnową o nachylenu równym K SV. Należy zwrócć uwagę, że proces bmoleularnego gaszena może być merzony jao zmnejszane ntensywnośc luorescencj lub tez jao srócene czasu życa luorescencj.

3 Częstość zderzeń cząstecze wygaszacza z luoroorem, Z [ Q] D, zależy od stałej szybośc D, tóra jest zwązana z procesem dyuzj równanem Smoluchowsego: D 4πN A RD (12) 1 gdze R jest promenem oddzaływana olzyjnego równym w przyblżenu sume promen cząsteczowych luoroora wygaszacza, D jest sumą współczynnów dyuzj zderzających sę cząstecze, N A jest lczbą Avogadro. Współczynn D można wylczyć z równana Stoesa-Enstena: T D (13) 6πηR w tórym η oznacza lepość środowsa, stalą Boltzmana, a T temperaturę. Stałe: D oraz szybośc gaszena bmoleularnego, zwązane są zależnoścą: D γ (14) gdze γ jest wydajnoścą procesu gaszena dynamcznego. W przypadu zastosowana wydajnych wygaszaczy γ1, D wartość w roztworach wodnych jest rzędu M -1 s -1 (gaszene ontrolowane dyuzyjne, tzn. przez procesy dyuzj). Zależność / w uncj stężena wygaszacza jest lną prostą tylo wtedy, gdy w jednorodnym uładze luoroorów obnżene wydajnośc wantowej luorescencj spowodowane jest wyłączne gaszenem dynamcznym. Needy zależność Sterna-Volmera oazuje sę być rzywą wypułą. Za dodatne odchylene od lnowośc odpowedzalna jest współobecność mechanzmu tzw. gaszena statycznego. W przecweństwe do gaszena dynamcznego (olzyjnego), tóre zachodz w mlseundowej sal czasu luorescencj, wygaszane statyczne polega na natychmastowym (ooło 1-15 s) odebranu energ wzbudzena luoroora przez wygaszasz, albo też na utworzenu neluoryzującego omplesu jeszcze przed momentem wzbudzena. Aby doszło do natychmastowej deescytacj, cząstecz wygaszacza muszą znajdować dostateczne blso luorooru w momence absorpcj wantu śwatła. Jeśl obecne są one w momence wzbudzena wewnątrz pewnej atywnej objętośc, v, w poblżu luoroora, to prawdopodobeństwo natychmastowego wygaszena luorescencj jest równe 1. Równane Sterna-Volmera dla uładu jednorodnego, uwzględnając proces gaszena statycznego przybera postać: 1 (15) ( 1+ [ Q] ) exp V [ Q] ( ) gdze V jest stałą gaszena statycznego, V vn A / 1. Wartośc stałej V są najczęścej rzędu lu M -1, co odpowada elementow objętośc v o promenu ooło 1 Å. Promeń ten jest porównywalny z odległoścam Van der Waalsowsch oddzaływań pomędzy cząsteczam. Poneważ gaszene statyczne zachodz przed procesem emsj, ne wpływa ono na obserwowany czas życa luorescencj luoroora przy danym stężenu wygaszacza.

4 Powyższe równana dotyczą najprostszego przypadu wygaszana luorescencj w jednorodnym uładze luoroorów. Często zdarza sę, że obserwowana emsja jest superpozycją luorescencj luoroorów emtujących nezależne w badanym uładze, ja np. w meszanne luoroorów lub w bałach zawerających la reszt tryptoanowych. Równane Sterna-Volmera (dla uproszczena przedstawone bez udzału gaszena statycznego) przybera wówczas postać: ( 1 + K [ Q] ) exp( V [ Q] ) SV (16) gdze jest wagą -tego sładna (luoroora), tzn. ułamem w całowtej luorescencj uładu, a K SV stałą Sterna-Volmera charateryzującą proces dynamcznego gaszena -tego sładna. Jeżel różnce pomędzy poszczególnym stałym K SV są dostateczne duże, zależność / ([Q]) jest rzywą wyazującą odchylene ujemne (w dół). Parametry oraz K SV można oblczyć stosując omputerowe dopasowane parametrów równana (16) do danych esperymentalnych wygaszana luorescencj. Metoda wygaszana luorescencj reszt tryptoanowych znalazła szeroe zastosowane w badanach dynam moleularnej strutury bałe. Mechanzm wygaszana luorescencj zależy od strutury chemcznej stosowanego wygaszacza w welu przypadach ne został do ońca wyjaśnony. Najczęścej stosowanym wygaszaczam są: tlen cząsteczowy, arylam oraz jon jodowy. Tlen cząsteczowy, podobne ja nne substancje paramagnetyczne, gas luorescencje główne przez procesy wymany spnu eletronowego, prowadzące do szybch przejść nterombnacyjnych eletronu z sngletowego stanu wzbudzonego do stanu trypletowego. Arylamd, nne amdy oraz amny wygaszają luorescencję dzałając jao aceptory w reacj przenesena eletronu ze stanu sngletowego luoroora. Wygaszane przez halogen (np. jon jodowy) oraz atomy perwastów cężch może być spowodowane sprzężenem spn-orbta pomędzy cząsteczam luorooru w stane wzbudzonym a wygaszaczem. Inne wygaszacze mogą gasć luorescencję poprzez rezonansowy transer energ wzbudzena, przenesene eletronu z wygaszaczem jao donorem, przenesene protonu, tworzene neluoryzujących escplesów oraz nne procesy. Jon J -, stosunowo dużych rozmarów, naładowany ujemne zhydratowany, ne może penetrować do wnętrza bała. Stosuje sę go do wygaszana luorescencj reszt tryptoanowych, znajdujących sę na powerzchn (esponowanych do środowsa wodnego), przy czym sam proces wygaszana zależy od rozładu ładunu woół luoroora. Tlen cząsteczowy jest bardzo małym, obojętnym eletryczne wygaszaczem, tóry może wnać do wnętrza cząstecz bała gasć luorescencję głęboo urytych reszt tryptoanowych. Dyuzja wygaszacza wewnątrz bała zachodz nawet przy gęstym upaowanu reszt amnowasowych wąże sę z lutuacją strutury cząstecz, tzn. z szybm rucham ragmentów łańcucha polpeptydowego w czase trwana zjawsa luorescencj. Arylamd (CH 2 CHCONH 2 ), równeż ma możlwość penetracj wewnątrz cząstecz bała oraz wygaszana luorescencj reszt urytych przed środowsem wodnym. Chocaż cząstecza arylamdu ma podobny rozmar do jonu I - to ne jest obdarzona ładunem eletrycznym. Stopeń espozycj ragmentów bała zawerającego reszty tryptoanowe można oszacować na podstawe stałej. Jeśl luoroor jest osłonęty przez nne częśc łańcucha polpeptydowego, to zwązana z nm stała będze mała w porównanu do luoroora neeranowanego.

5 Wyonane ćwczena Przygotować ooło 1,5 ml bała w buorze. luorescencję wzbudzać przy 297 nm. Przy taej długośc al eetywnemu wzbudzenu ulegają tylo wyłączne reszty tryptoanowe. Stężene bała mus być ta dobrane, aby absorbancja prób przy długośc al wzbudzena ne przeroczyła,1. Wyonać wygaszane luorescencj bała przy ooło 34 nm za pomocą roztworu jodu potasu (4 M). Merzyć ntensywność luorescencj po dodanu do prób olejnych, mroltrowych porcj wygaszacza (5-1 µl). Wyn zanalzować przy pomocy programu omputerowego umożlwającego dopasowane zależnośc Sterna- Volmera. Obowązujący materał 1. luorescencja dagram Jabłońsego, wzbudzene, wydajność wantowa emsj, czas życa 2. Sposoby detecj stanu wzbudzonego 3. Wygaszane emsj luorescencj, wygaszane dynamczne statyczne, równane Sterna-Volmera wyprowadzene, analza graczna, zastosowane w jedno- nejednorodnych uładach luoroorów 4. Równane Smoluchowsego, równane Stoesa-Enstena 5. Wyorzystane metody wygaszana luorescencj w badanach bałe, wygaszacze, mechanzmy gaszena Lteratura 1. otochema. Podstawy. J. A. Baltrop, J. D. Cole 2. otolumnescencja roztworów. A. Kaws 3. Zastosowane metody wygaszana luorescencj wewnętrznej do badana zman w struturze bałe. M. Dzedzca, Zeszyty Nauowe UJ Prace z Bolog Moleularnej, Z 15 (1987) str ] 4. Prncples o luorescence spectroscopy. J. R. Laowcz

Podobne dokumenty

ELEKTROCHEMIA. ( i = i ) Wykład II b. Nadnapięcie Równanie Buttlera-Volmera Równania Tafela. Wykład II. Równowaga dynamiczna i prąd wymiany

ELEKTROCHEMIA. ( i = i ) Wykład II b. Nadnapięcie Równanie Buttlera-Volmera Równania Tafela. Wykład II. Równowaga dynamiczna i prąd wymiany Wykład II ELEKTROCHEMIA Wykład II b Nadnapęce Równane Buttlera-Volmera Równana Tafela Równowaga dynamczna prąd wymany Jeśl układ jest rozwarty przez elektrolzer ne płyne prąd, to ne oznacza wcale, że na