UNIWERSYTET GDAŃSKI WYDZIAŁ CHEMII Pracowna studencka Katedry Analzy Środowska Instrukcja do ćwczeń laboratoryjnych Ćwczene nr 2 WYZNACZANIE WSPÓŁCZYNNIKA PDZIAŁU WYBRANYCH ZANIECZYSZCZEŃ RGANICZNYCH ŚRDWISKA METDĄ WYSKSPRAWNEJ CHRMATGRAFII CIECZWEJ RAZ METDĄ BLICZENIWĄ Chemczne zagrożena środowska Gdańsk, 2010
2. Chemczne zagrożena środowska wyznaczane współczynnka podzału metodą HPLC 2 1. CZĘŚĆ TERETYCZNA Hydrofobowość (lpoflność) substancj zaneczyszczających środowsko jak leków oraz nnych ksenobotyków jest cechą w dużym stopnu wpływającą na ch właścwośc farmakodynamczne, farmakoknetyczne, toksyczność czy współczynnk bokoncentracj. Szeroke zastosowane ma parametr hydrofobowośc logarytm współczynnka podzału zwązku mędzy n- oktanolem a wodą podczas szacowana zagrożeń wynkających z chemcznego zaneczyszczena środowska. Współczynnk podzału P określany jako stosunek równowagowych stężeń rozpuszczonej substancj w układze n-oktanol/woda jest podstawową marą lpoflowośc zwązku chemcznego. Znaczene tego parametru w prognozowanu losów środowskowych zaneczyszczeń chemcznych zostało dokładne opsane w nstrukcj nr 2 pt. Wyznaczane współczynnka podzału n-oktanol/woda dla kwasu octowego. Jednak warto przytoczyć pewne przykłady: 1. Prognozowane korelacj mędzy log P rozpuszczalnoścą w wodze oraz współczynnkam bokoncentracj (BCF) jak też ch korelacje dla organzmów wodnych lądowych (np. zależność mędzy tym parametrem a knetyką bokoncentracj u ryb). 1. Wzajemny zwązek mędzy log P a sorpcją glebową oraz poberanem pestycydów przez dżdżownce BCF dla alg. 2. znaczenu log P w chem środowska śwadczą równeż publkacje dotyczące pestycydów nnych zwązków. Pomędzy log P a parametram retencj z RP HPLC można zauważyć ścsłą zależność jeżel układ chromatografczny przypomna układ podzałowy n-oktanol/woda. Dlatego też współczynnk podzału można wyznaczać metodam pośrednm, z użycem wysokosprawnej chromatograf ceczowej (HPLC) lub metodam oblczenowym. 1.1. Metoda HPLC Hydrofobowość można zdefnować jako tendencję danego zwązku do preferowana środowska newodnego względem wodnego, pojęce to może być rozumane jako tendencja cząsteczek zwązku rozpuszczonego do agregacj w roztworach wodnych. Właścwośc hydrofobowe są sumą oddzaływań fzykochemcznych: orentacyjnych, ndukcyjnych, dyspersyjnych, wązana wodorowego przenesena ładunku. W przypadku oddzaływań hydrofobowych sły te zależą główne od właścwośc rozpuszczalnków, a ne od substancj rozpuszczonych. d czasu wprowadzena chromatografa ceczowa z fazam odwróconym jest szczególne odpowedna do oznaczana hydrofobowośc. W przypadku metody z wykorzystanem
2. Chemczne zagrożena środowska wyznaczane współczynnka podzału metodą HPLC 3 HPLC zakłada sę, ż retencja badanej substancj w odwróconym układze faz odpowada jej podzałow pomędzy dwe ne meszające sę fazy jako taka jest proporcjonalna do współczynnka podzału P. W takm układze, jedną z faz (faza stacjonarna) stanową zarna krzemonk chemczne zmodyfkowane warstwą hydrofobową złożoną z podstawnków n-alklowych o różnej długośc łańcucha (C8 C18), natomast drugą fazę (faza ruchoma) stanow polarny rozpuszczalnk, na ogół meszanna wody metanolu. Podstawowa zaleta oznaczana hydrofobowośc tą metodą to możlwość użyca modyfkatorów organcznych jako składnków bnarnych (dwuskładnkowych) eluentów. Jednak obecność modyfkatora organcznego powoduje podnesene stopna skomplkowana natury oddzaływań wpływających na rozdzał chromatografczny. Przy zastosowanu ustalonego składu eluentu badany zwązek może okazywać sę bardzej hydrofobowy nż nny zwązek, podczas gdy sytuacja taka może przedstawać sę odwrotne przy nnym składze eluentu. Dlatego też stosuje sę metodę polegającą na wykreślenu log k względem procentowej objętoścowej zawartośc modyfkatora. W trakce przemeszczana sę przez kolumnę chromatografczną badana substancja ulega podzałow pomędzy hydrofobową warstwą w faze stacjonarnej a polarnym rozpuszczalnkem w faze ruchomej. Podobne jak to ma mejsce w metodze wyznaczana równowagowego współczynnka podzału pomędzy oktanolem a wodą, m bardzej substancja będze lpoflową tym wększe będze jej pownowactwo do stacjonarnej fazy hydrofobowej. W praktyce oznacza to, ż w układze chromatografcznym substancja taka będze dłużej zatrzymywana, a węc wzrastać będze jej czas retencj. Dla dużej grupy zwązków chemcznych wykazano lnową zależność pomędzy czasem retencj a współczynnkem podzału wg następującego równana: log P = a log t R + b (1) Przy czym a b są charakterystyczne dla danej grupy zwązków (homologów, kongenerów, zomerów tp.). Rysunek 1 przedstawa tę korelację dla wybranych zwązków aromatycznych, których współczynnk podzału meśc sę w szerokm zakrese 4 rzędów welkośc. Najprostszym, praktycznym zastosowanem tej metody jest wyznaczene klkunastu współczynnków retencj dla grupy zwązków referencyjnych, o znanych współczynnkach podzału a następne, w oparcu o uzyskaną korelację szacowane tych współczynnków dla zwązków neznanych na podstawe ch czasów retencj w tych samych warunkach chromatografcznych.
2. Chemczne zagrożena środowska wyznaczane współczynnka podzału metodą HPLC 4 Rysunek 1. Lnowa zależność pomędzy współczynnkem retencj log P a czasem retencj log t R. Należy jednak zauważyć, ż pomędzy współczynnkem podzału n-oktanol/woda a współczynnkem wyznaczonym metodą chromatografczną występuje różnca w składze faz. le można przyjąć, ż stacjonarna faza hydrofobowa oraz wolne ugrupowana slanolowe na powerzchn krzemonk przypomnają do pewnego stopna strukturę n-oktanolu (rysunek 2), o tyle faza polarna zawera ne tylko wodę lecz równeż modyfkator organczny jakm jest metanol. Powoduje to, że układ chromatografczny zawera dodatkowy czynnk wpływający na rozpuszczalność, a tym samym na podzał badanej substancj, co zwłaszcza przy wysokej zawartośc metanolu może poważne zakłócć omawaną korelację. faza stacjonarna n-oktanol S S H S H Rysunek 2. Porównane chromatografcznej fazy odwróconej n-oktanolu. Logcznym wydałoby sę węc użyce czystej wody jako fazy ruchomej. Jest to jednak nemożlwe w odwróconym układze faz, w którym slne uwodnone układy wywołują efekt kładzena sę podstawnków alklowych, co znaczne ograncza sprawność kolumny chromatografcznej (rysunek 3).
2. Chemczne zagrożena środowska wyznaczane współczynnka podzału metodą HPLC 5 Rysunek 3. Porównane struktury hydrofobowej fazy stacjonarnej w przypadku użyca czystej wody (A) oraz wody z metanolem (B) jako faz ruchomych. Dlatego do chromatografcznego wyznaczana współczynnka podzału przyjęto używać sę metodę ekstrapolacyjną. W skróce, polega ona na wyznaczenu czasów (współczynnków) retencj badanego zwązku dla klku faz ruchomych o różnej zawartośc metanolu wykreślenu powstałej zależnośc według następującego, lnowego równana: log k = log k w Sφ (2) nazywanego równanem Snydera-Soczewńskego, które jest jedną z podstawowych zależnośc w chromatograf w odwróconym układze faz. W równanu, k to współczynnk retencj (lub współczynnk objętoścowy) wyznaczony z zależnośc: k = (t R t 0 )/t 0, gdze t 0 to czas martwy układu; k w to wartość współczynnka retencj odpowadająca faze zawerającej wyłączne wodę (0% metanolu). Z podanych powyżej ogranczeń wartość tę wyznacza sę ekstrapolując wynk uzyskane dla faz zawerających metanol do punktu przecęca z osą y. Stąd, log k w uznaje sę za chromatografczny współczynnk podzału (odpowadający podzałow pomędzy wodę a fazę hydrofobową). S to nachylene wykreślonej prostej, charakterystyczne dla badanego zwązku a φ to udzał metanolu w faze ruchomej (%). Rysunek 4 przedstawa opsaną zależność. Rysunek 4. Zależność Snydera Soczewńskego, z której wyznacza sę chromatografczny współczynnk podzału log k w.
2. Chemczne zagrożena środowska wyznaczane współczynnka podzału metodą HPLC 6 W metodze HPLC substancje o bardzo nskej rozpuszczalnośc w n-oktanolu wykazują tendencję do dawana zanżonych wartośc log P. Pk takch zwązków czasem towarzyszą czołu rozpuszczalnka. Dzeje sę tak dlatego, ż w takej sytuacj proces podzału jest zbyt powolny do uzyskana równowag w czase branym pod uwagę przy zwykłym rozdzelanu metodą HPLC. Zmnejszene szybkośc przepływu /lub obnżene stosunku metanol/woda może być w tym przypadku pożądane, aby uzyskać rzeczywstą wartość. Wartość ph eluentu jest krytyczna dla zwązków ulegających jonzacj. Pownno być ono w obrębe zakresu roboczego ph kolumny, które zwykle wynos mędzy 2 8. Zalecane jest buforowane. Należy zachować ostrożność, aby ne dopuścć do wytrącana sę sol znszczena kolumny, co zachodz dla nektórych meszann faza organczna/bufor. Pomary HPLC faz stacjonarnych opartych na krzemonce powyżej ph 8 ne są polecane, gdyż użyce zasadowej fazy ruchomej powoduje gwałtowne pogorszene sę wydajnośc kolumny. Warto dodać, ż prowadzono badana nad użycem wypełneń nnych, nż oparte na chemczne zwązanej krzemonce. Przebadano mędzy nnym następujące wypełnena: kopolmery pol(styrenodwnylobenzenowe), kopolmer oktadecylopolwnylowy, tlenek glnowy, tlenek cyrkonowy, oraz nedawno wprowadzony materał do pakowana kolumn tzw. mmoblzowana sztuczna membrana (IAM). W przypadku DS proponuje sę modyfkację fazy stacjonarnej bądź też ruchomej polegającej na np.: zastosowanu ph od 2,5 do 3,5 wyższych stężeń buforu, zastąpene sol sodowych potasowym dodatek modyfkatorów amnowych (dmetylooktyloamna, trmetyloamna), dodane oktanolu decylamny do fazy ruchomej składającej sę mędzy nnym z MeH. Jednak ne stneje sposób który umożlwałby uczynene układu RP HPLC dentycznym z układem n- oktanol/woda. 1.2. Metody oblczenowe Wszystke metody oblczenowe są oparte o formalną fragmentację cząsteczk na odpowedne podstruktury dla których pewne przyrosty wartośc log P są znane z eksperymentu. Wartość log P całej cząsteczk jest następne oblczana jako suma wartośc odpowadająca jej fragmentom plus suma składnków korekcj dla oddzaływań wewnątrzcząsteczkowych. Warygodność metod oblczenowych obnża sę ze wzrostem złożonośc badanych zwązków. W przypadku prostych cząsteczek o nskej mase cząsteczkowej jednej lub dwu grupach funkcyjnych, można oczekwać odchylena od 0,1 do 0,3 jednostek log P mędzy wynkam różnych metod fragmentaryzacj wartoścam zmerzonym.
2. Chemczne zagrożena środowska wyznaczane współczynnka podzału metodą HPLC 7 Jedną z perwszych stosowanych półemprycznych metod oblczenowych była metoda stałej podstawena hydrofobowego π, defnowaną jako: π x ( PhX) log P ( PhH) = log P (3) gdze P (PhX) jest współczynnkem podzału pochodnej aromatycznej, a P (PhH) zwązku macerzystego. Na przykład, chcąc wyznaczyć cząstkową hydrofobowość podstawnka chloru odejmuje sę od sebe wcześnej wyznaczone współczynnk podzałów chlorobenzenu benzenu: ( π = log P ( C H Cl) log P( C H ) ) n.p. Cl 6 5 6 6 = 2,84 2,13 = 0,71 Metoda stosowana jest główne dla podstawena aromatycznego. Wartośc dla wększej lczby podstawnków zostało stabelaryzowane w lcznych pozycjach lteraturowych. Są one stosowane dla oblczeń log P cząsteczek aromatycznych lub podstruktur. Stosuje sę równeż metodę Rekkera w której wartość log P jest oblczana z następującej zależnośc: log P = a f + gdze f reprezentuje różne stałe fragmentów cząsteczk, natomast a, częstotlwość ch występowana w badanej cząsteczce. Składnk korekcj są wyrażone jako całkowta welokrotność pojedynczej stałej C j. Stałe fragmentu f, C j zostały ustalone z wykazu z ponad tysąca dośwadczalnych wartośc współczynnka podzału P. Dla prostych cząsteczek, równane przyjmuje uproszczoną postać, gdze suma składnków korekcj wynos 0,229: log P = a f + 0,229 (6) Najbardzej zaawansowanym sposobem wyznaczana współczynnka podzału jest metoda Hansch- Leo zgodne z którą wartość log P jest oblczana z: j C j log P = a f + b F (7) gdze f przedstawa różne stałe fragmentu cząsteczkowego, Fj składnk korekcj oraz a, b odpowadające częstotlwośc występowana. Wyprowadzony z dośwadczalnych wartośc współczynnków podzału wykaz atomowych cząsteczkowych grup wartośc, oraz wykaz składnków korekcj Fj zostały ustalone metodą prób błędów. Składnk korekcj zostały uporządkowane w klka różnych klas. Wzęce pod uwagę wszystkch zasad składnków korekcj jest względne skomplkowane zużywające czas. Dlatego współcześne stneje szereg programów komputerowych oblczających lpoflowość zwązku na podstawe zadanej struktury. j j j (4) (5)
2. Chemczne zagrożena środowska wyznaczane współczynnka podzału metodą HPLC 8 2. WYKNANIE ĆWICZENIA 1. Należy zaznajomć sę z podstawowym elementam zestawu HPLC oraz ch funkcjonowanem, sposobam zmany natężena przepływu w pompe, zmaną długośc fal w detektorze, obsługą ntegratora oraz podstawowym czynnoścam nastrzyku, zmany fazy ruchomej, zmany kolumny td. 2. Rozdzały będą wykonywane w układze faz odwróconych z wykorzystanem kolumny oktadecyloslanowej DS (RP-18) oraz z układem elucyjnym metanol (MeH) woda, przy przepływe 0,8 cm 3 /mn. Każda z przygotowanych faz ruchomych pownna zostać odgazowana w łaźn ultradźwękowej. 3. Należy przygotować po 200 ml faz zawerających: 35, 40, 50 60 % (v/v) MeH. 4. Analzowane próbk to roztwory fenolu, o-ntrofenolu oraz anlny, stężene każdej z substancj wynos 1 mm dm -3. Dla każdej z faz ruchomych należy wykonać nastrzyk po 20 µl każdego z roztworów badanych substancj określć czasy retencj badanych zwązków, a z nch wyznaczyć współczynnk retencj k. Czas martwy pownen być zmerzony poprzez wstrzyknęce wody dla każdego z eluentów. 5. W trakce wykonywana analz należy oblczyć współczynnk podzału dla zwązków z ponższej tabel. W tym celu proszę skorzystać z programu EpSute, udostępnonego przez US EPA. Po otwarcu programu wyberamy po lewej strone okna moduł "KWWIN", w kolejnym okne "NameLookup", w kolejnym wpsujemy nazwę zwązku potwerdzamy "K". W otwartym okne wyboru potwerdzamy nasz wybór lub wyszukujemy na lśce żądany zwązek. W uzupełnonym o dane zwązku okne programu KWWIN wyberamy "Calculate". Wynk: przewdywany współczynnk podzału (w czerwonej ramce) oraz wartość lteraturową (Exp Log P) wpsujemy do tabel. Jeśl brakuje wartośc eksperymentalnej, pozostawamy wolne mejsce. Program KWWIN wykorzystuje do oblczeń algorytm dentyczny z opsanym w ćwczenu.
2. Chemczne zagrożena środowska wyznaczane współczynnka podzału metodą HPLC 9 Tabela 1. Wartośc eksperymentalne przewdywane dla szeregu homologcznego kwasów karboksylowych Lczba atomów węgla Nazwa log P oblczony log P eksperymentalny 2 acetc acd 4 butanoc acd 6 hexanoc acd 8 octanoc acd 10 decanoc acd 12 dodecanoc acd 14 tetradecanoc acd 16 hexadecanoc acd 18 octadecanoc acd 20 ecosanoc acd 22 docosanoc acd 24 tetracosanoc acd 26 hexacosanoc acd 28 octacosanoc acd 30 tracontanoc acd 3. PRACWANIE WYNIKÓW Należy wykreślć zależność log k od procentowego udzału MeH w faze ruchomej zgodne z równanem Snydera-Soczewńskego (2) odczytać wartość log k w. Dla wszystkch analzowanych zwązków należy oblczyć współczynnk podzału korzystając z równana (6) oraz stałych fragmentów cząsteczkowych zawartych w ponżej tabel: Fragment Alfatyczny -CH 3 0.5473 Alfatyczny -CH 2-0.4911 Aromatyczny C lub CH 0.2940 Cl- (połączony z aromatem) 0.6445 H- (połączony z aromatem) -0.4802 Aromatyczny -NH 2-0,9170 Br- (połączony z aromatem) 0.8900 Aromatyczny -N 2-0,1823 f
2. Chemczne zagrożena środowska wyznaczane współczynnka podzału metodą HPLC 10 Następne otrzymane wartośc log k w należy porównać (skorelować) z oblczonym współczynnkam lpoflowośc log P, a dla uzyskanej zależnośc oblczyć współczynnk korelacj lnowej R 2. Na podstawe uzupełnonej Tabel 1 wykonaj na jednym rysunku wykresy zależnośc log P eksperymentalnego oraz log P przewdywanego (y) od lczby atomów węgla w cząsteczce (x). Czy przebeg obu zależnośc jest lnowy? Dokonaj ekstrapolacj uzyskanej zależnośc przewdywanej dla kwasów o 35 40 atomach węgla w cząsteczce. Do czego może być przydatny tak model oblczenowy jak ocenasz jego zgodność z rzeczywstoścą? 4. SZKŁ I DCZYNNIKI Metanol, woda destylowana Roztwory fenolu, o-ntrofenolu oraz anlny o stężenu 1 mm dm -3 Strzykawka do HPLC Kolby stożkowe 250 ml 4 szt. Cylnder marowy 250 ml 2 szt. 5. ZAKRES WYMAGANYCH WIADMŚCI Podstawowe pojęca z wysokosprawnej chromatograf ceczowej (zawarte w nstrukcj do przedmotu ANALIZA ŚLADWYCH ZANIECZYSZCZEŃ W ŚRDWISKU, TERIA: "HPLC Wysokosprawna chromatografa ceczowa", lnk: http://www.chem.unv.gda.pl/analza/dydaktyka/slady_hplc.pdf) przede wszystkm parametry retencj! Współczynnk podzału, wyznaczane tego współczynnka metodą HPLC metodam oblczenowym, równane Snydera-Soczewńskego 6. LITERATURA Pgoń K., Chema fzyczna, Tom I, Wydawnctwo Naukowe PWN, Warszawa 2005. Rosset R., Kołodzejczyk H., Współczesna chromatografa ceczowa. Ćwczena zadana, Wydawnctwo Naukowe PWN, Warszawa 2001. Wtkewcz Z., Podstawy chromatograf, Wydawnctwa Naukowo-Technczne, Warszawa 2005.