RP WPROWADZENIE. M. Kamioski PG WCh Gdaosk 2013

Transkrypt

1 RP WPRWADZENIE M. Kamioski PG WCh Gdaosk 2013

2 Fazy stacjonarne w RP-HPLC / RP-HPTLC CN, cyklodekstryny, - głównie substancje średnio polarne i polarne metabolity, organiczne składniki ścieków i inne

3 Zestawienie najczęściej stosowanych rodzajów faz stacjonarnych, produkowanych na bazie żelu krzemionkowego. nitryl

4 Czystośd krzemionki LiChrospher, Superspher Tworzenie wiązao z C18 na powierzchni krzemionki H H H H H X H CH 3 CH 3 H H CH 3 CH 3 H CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH C 2 6 H 13 CH 3 Endcapping CH 3 H H CH 3 CH 3 CH 3 CH H 3 CH 3 H CH CH 3 3 CH3 CH 3 Pomimo endcapping u wolne grupy silanolowe są wciąż dostępne nieporządane oddziaływania z polarnymi fragmentami rozdzielanych substancji (asymetria pików)

5 Czystośd krzemionki Purospher STAR RP-18e S i S i C 6 H 13 S i H S i S i CH 3 H S i C H C 2 6 H 13 Purospher STAR RP-18 charakteryzuje się prawie całkowitym pokryciem powierzchni. Zapobiega to polarnym oddziaływaniom z próbką. S i S i C 6 H 13

6 Schemat struktury powierzchni modyfikowanego żelu krzemionkowego

7

8 Układy faz odwróconych RP-HPLC / RP-TLC gdy: Nisko polarna (hydrofobowa) faza stacjonarna, względnie polarny eluent, składający się z wody i dodatku organicznego; Ze wzrostem zawartości dodatku organicznego w eluencie rośnie siła elucyjna f. ruchomej!!! - Zmiana jednego składnika organicznego eluentu na inny wpływa na retencję i może wpływad na selektywnośd rozdzielania; - Dla przewidywania retencji i selektywności rozdzielania ma znaczenie przede wszystkim hydrofobowośd substancji rozdzielanych, ale także w znacznie mniejszym stopniu - elektrodonorowośd i elektroakceptorowośd, polarnośd i polaryzowalnośd oraz wiązania wodorowe między cząsteczkami substancji chromatografowanych i cząsteczkami eluentu, a także częścią polarną powierzchni sorpcyjnej; Fazy stacjonarne dla RP-HPLC: typu C18, C8, PHENYL, CN (wypełnienie typu CN może byd też używane w układach faz normalnych, zarówno w warunkach adsorpcyjnych, jak i HILIC)

9 Retencja w RP jest wypadkową wielu oddziaływań: - sił van der Vaalsa pomiędzy hydrofobową fazą stacjonarną, a cząsteczkami substancji rozdzielanych / organicznych składników eluentu - sił elektrostatycznych pomiędzy cząsteczkami / fragmentami cząsteczek substancji rozdzielanych, zawierających polarne grupy funkcyjne i cząsteczkami / fragmentami cząsteczek, jonami fazy ruchomej - sił van der Vaalsa pomiędzy cząsteczkami / fragmentami cząsteczek substancji rozdzielanej i cząsteczkami / fragmentami cząsteczek fazy ruchomej - oddziaływań elektrostatycznych pomiędzy cząsteczkami substancji rozdzielanej i fazy ruchomej, a powierzchniowymi resztkowymi grupami -H lub - tam, gdzie to możliwe ma miejsce tworzenie kompleksów z metalami, występującymi w stężeniach śladowych na powierzchni fazy stacjonarnej niskiej jakości.

10 RP powtórzenie mechanizmy rozdzielania

11 Kolejność elucji Związki chemiczne są eluowane z kolumny od polarnych (hydrofilowych) do niepolarnych (hydrofobowych) oraz w szeregach homologicznych - od nisko- do wysokocząsteczkowych

12 Retencja substancji rośnie ze wzrostem: stopnia pokrycia powierzchni związaną fazą organiczną długości łańcucha fazy związanej hydrofobowości grupy funkcyjnej decydującej o charakterze powierzchni sorpcyjnej hydrofobowości substancji rozdzielanych zawartości wody w fazie ruchomej Spada ze wzrostem : temperatury Dla substancji kwaśnych / zasadowych zależy od ph (spadek ph zwiększa retencję substancji kwaśnych, w wzrost ph substancji zasadowych dlaczego???)

13 Kolejnośd elucji w RP-HPLC Jony/woda, polarne substancje organiczne - o niskiej, średniej, wysokiej hydrofobowości grup funkcyjnych; Różne grupy funkcyjne o różnej hydrofobowości powodują zróżnicowanie retencji, dlatego rozdzielanie grupowe nie jest możliwe. - sole i kwasy nieorganiczne, alkanoloaminy (brak sorpcji), cukry, aminy, aminokwasy, kwasy karboksylowe, aldehydy, alkohole, etery cykliczne, estry, etery di-alkilowe, tioetery, węglowodory aromatyczne, węglowodory alicykliczne, węglowodory alifatyczne, fluoroalkany

14 trzymywanie niepolarnych faz związanych typu RP najprostsza metodyjka

15 trzymywanie faz stacjonarnych związanych chemicznie z żelem krzemionkowym różne metodyki

16 Faza ruchoma - wymagania: 1. Ciecz obojętna chemicznie względem fazy stacjonarnej i składników rozdzielanych mieszanin. 2. Dobry rozpuszczalnik dla rozdzielanych substancji, aby nie dochodziło do ich wytrącania się w kolumnie. 3. Mała lepkość 4. Stały skład przez dostatecznie długi okres czasu

17 Retencja substancji rośnie ze wzrostem: stopnia pokrycia powierzchni związaną fazą organiczną długości łańcucha fazy związanej hydrofobowości grupy funkcyjnej decydującej o charakterze powierzchni sorpcyjnej hydrofobowości substancji rozdzielanych zawartości wody w fazie ruchomej Spada ze wzrostem : temperatury Dla substancji kwaśnych / zasadowych zależy od ph (spadek ph zwiększa retencję substancji kwaśnych, w wzrost ph substancji zasadowych dlaczego???)

18

19

20 Faza ruchoma - wymagania: 1. Ciecz obojętna chemicznie względem fazy stacjonarnej i składników rozdzielanych mieszanin. 2. Dobry rozpuszczalnik dla rozdzielanych substancji, aby nie dochodziło do ich wytrącania się w kolumnie. 3. Mała lepkość 4. Stały skład przez dostatecznie długi okres czasu

21

22 Szereg elucyjny w RP-LC woda < < < < metanol < acetonitryl < etanol < propanol < tetrahydrofuran < chlorek metylenu

23 RP - warunki izo-elucyjne

24 Chromatogram 16-tu WWA waruynkielucji gradientowej Wykres zależności stężenia substancji w eluacie wypływającym z kolumny w funkcji objętości elucji - dla stałego natężenia przepływu eluentu (w, u = const) w funkcji czasu pis każdego chromatogramu powinien zawierać: - cel badania, dane o dozowanej / rozdzielanej mieszaninie, kolumnie, warunkach elucji (składniki i skład eluentu, albo składniki eluentu i program elucji), informacje o detektorze / detektorach, warunki detekcji, nazwy substancji odpowiadających pikom chromatograficznym, ew. inne dane

25 WWA Kolumna Lichrospher RP mmx4mm 5μm, CH3CN-H v/v, 1.5 ml/min, UV-DAD nm; piki: 1-(?), 2-benzen, 3- naftalen, 4-acenaften, 5-fenantren, 6-piren, 7-benzo (α) piren.

26 Chromatografia sorpcyjna adsorpcyjna / podziałowa / mieszana -- wprowadzenie -- Układy RP / HIC Układy NP / NP-w / HILIC Mechanizmy sorpcji i oddziaływania między-cząsteczkowe

27 o- m- p- H N + H N + H N + H N H NH 2 NH 2

28 H H H 3 C H 3 C etylowy propylowy

29 i H IzoH C H 3 CH3 i H IzoH H H IzoH IzoH i H NP i H H IzoH faza stacjonarna: 2 faza ruchoma: Heksan+IzoH

30 i NP H H C H 3 CH3 i H H i H faza stacjonarna: 2 i H faza ruchoma: C 6 H 14 : C 4 H 8 2 heksan: dioksan 8:2 v/v H

31 C H 3 H H 2 H 2 H CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 H 2 CH 3 C H 3 H RP CH 3 faza stacjonarna: 2 /C n H 2n+1 CH 3 faza ruchoma: MeH/ H 2, 1:1

32 Schemat struktury powierzchni modyfikowanego żelu krzemionkowego

33

34

35 Przewidywanie teoretyczne retencji analitów w warunkach RP-HPLC

36 Model liniowej siły elucyjnej (linear solvent strength model - LSS) lg k = lg kw sφ, gdzie: k- współczynnik retencji Lg kw- wartość ekstrapolowana do 0% rozpuszczalnika organicznego w fazie ruchomej s- stała φ- objętość rozpuszczalnika organicznego w fazie ruchomej

37 QUANTITATIVE STRUCTURE RETENTIN RELATINSHIPS (QSRRs)

38 MULTIPLE LINEAR REGRESSIN METHDS (METDY WIELKRTNEJ REGRESJI LINIWEJ) 1. Teoria Martin a i Synge a tr = b0 + b1c log P, gdzie: tr czas retencji analitów w warunkach izokratycznych b0, b1 współczynniki regresji clog P współczynnik podziału n-oktanol : woda 2. Teoria Kaliszana tr = b0 + b1μ + b2δmin + b3awas., gdzie b0, b1, b2, b3 współczynniki regresji μ całkowity moment dipolowy (oddziaływania typu dipol dipol) δmin nadwyżka ładunku elektrycznego atomu najbardziej elektroujemnego (oddziaływania polarne) Awas water accessible surface area (oddziaływania dyspersyjne)