CHROMATOGRAFIA W UKŁADACH FAZ ODWRÓCONYCH RP-HPLC

Transkrypt

1 CHROMATOGRAFIA W UKŁADACH FAZ ODWRÓCONYCH RP-HPLC MK-EG-AS Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Gdańsk 2009

2 Chromatograficzne układy faz odwróconych (RP) Potocznie: Układy chromatograficzne, w których faza ruchoma jest bardziej polarna niż faza stacjonarna Jest to w istocie myląca definicja, ponieważ w chromatografii oddziaływań hydrofilowych (HILIC) taka sytuacja ma także miejsce Definicja bardziej poprawna Układy chromatograficzne, w których powierzchnia sorpcyjna fazy stacjonarnej wykazuje charakter hydrofobowy, a eluentem jest mieszanina wody (buforu) i organicznego dodatku rozpuszczalnego z wodzie

3 Materiały wyjściowe stosowane do otrzymywania związanych faz stacjonarnych typu RP: 1. żel krzemionkowy; 2. tlenek glinu; 3. di-tlenek tytanu; 4. di-tlenek cyrkonu; 5. polimery organiczne (kopolimer styrenu diwinylobenzenu (SDVB), albo poliamidy, lub polimetakrylany i inne).

4 Otrzymywanie niepolarnych faz związanych typu RP:

5 Zestawienie najczęściej stosowanych rodzajów faz stacjonarnych, produkowanych na bazie żelu krzemionkowego.

6 Fazy stacjonarne w RP-HPLC / RP-HPTLC CN, cyklodekstryny, -głównie substancje średnio polarne i polarne metabolity, organiczne składniki ścieków i inne

7 Schemat struktury powierzchni modyfikowanego żelu krzemionkowego Brak tzw. endcapping u Sorbent po wykonaniu tzw. endcappingu (metylowanie lub silanizacja wolnych grup OH)

8 Zalety i wady żelu krzemionkowego jako nośnika związanych faz stacjonarnych Duża odporność mechaniczna Przystępna cena Możliwość sterowania porowatością ziaren wypełnienia Możliwość otrzymywania kolumn o dobrej sprawności Ograniczony zakres ph (2-8) Inne nośniki : Al2O3, ZrO2, TiO2

9 Informacje producenta 1. Grupa funkcyjna decydująca o charakterze powierzchni sorpcyjnej. 2. Materiał wyjściowy. 3. Stopień pokrycia węglem. 4. Czy wypełnienie poddano procesowi usuwania resztkowych grup OH (endcapping) 5. Zakres ph.

10 Faza ruchoma - wymagania: 1. Ciecz obojętna chemicznie względem fazy stacjonarnej i składników rozdzielanych mieszanin. 2. Dobry rozpuszczalnik dla badanych substancji, aby nie dochodziło do ich wytrącania się w kolumnie. 3. Mała lepkość. 4. Stały skład przez dostatecznie długi okres czasu.

11 Szereg elucyjny organicznych dodatków do eluentu w warunkach RP woda <<< metanol < acetonitryl < etanol < tetrahydrofuran < propanol < chlorek metylenu

12 Maksimum lepkości fazy ruchomej: % zawartość metanolu w wodzie; % zawartość acetonitrylu w wodzie; % zawartość tetrahydrofuranu w wodzie.

13 Kolejność elucji chemicznych w warunkach RP - od najmniej hydrofobowych (najbardziej polarnych - hydrofilowych) do najbardziej hydrofobowych (niepolarnych), np., t r p-nitroaniliny < t r m-nitroaniliny < t r o-nitroaniliny (proszę zwrócić uwagę na względną polarność grupy NH2, względną hydrofobowość grupy NO2 oraz znaczny wymiar tej ostatniej (steryczne działanie osłaniające grupy NO2 względem NH2 w położeniu orto-); - w ramach szeregu homologicznego - od nisko- do wysokocząsteczkowych, np. t r estru metylowego kwasu 4-OH benzoesowego< t r estru etylowego kwasu 4-OH benzoeosowego< t r estru propylowego kwasu 4-OH benzoesowego

14 W przypadku tradycyjnych wysoce hydrofobowych faz stacjonarnych typu RP eluent o nadmiernej zawartości wody może być niekorzystny, należy zapewnić minimum 3%v/v AcCN / 5%v/v MeOH, aby uniknąć stłamszenia struktury f. stacjonarnej

15 Retencja substancji jest wypadkową wielu oddziaływań: działanie sił van der Vaalsa pomiędzy pomiędzy hydrofobową faza stacjonarną a cząsteczkami substancji działanie sił elektrostatycznych pomiędzy cząsteczkami substancji rozdzielanej, zawierającej polarne grupy funkcyjne i cząsteczkami fazy ruchomej działanie sił van der Vaalsa pomiędzy cząsteczkami substancji rozdzielanej i fazy ruchomej oddziaływanie elektrostyczne pomiędzy cząsteczkami substancji rozdzielanej i fazy ruchomej a powierzchniowymi grupami OH.

16 Retencja substancji rośnie ze wzrostem: stopnia pokrycia powierzchni sorpcyjnej związaną fazą organiczną długości łańcucha fazy organicznej związanej z powierzchnią sorpcyjną hydrofobowości grupy funkcyjnej decydującej o charakterze powierzchni sorpcyjnej hydrofobowości substancji rozdzielanych zawartości wody w fazie ruchomej temperatury Spada ze wzrostem : Dla substancji kwaśnych / zasadowych zależy od ph (spadek ph zwiększa retencję substancji kwaśnych, w wzrost ph substancji zasadowych dlaczego???)

17 Wpływ ph na rozdzielanie pochodnych kwasu benzoesowego: a) ph 2.5, b) ph 3.0, c) ph 3.5, d) ph 4.0 (prędkość przepływu eluentu stała)

18 Sposoby prowadzenia elucji Elucja w warunkach izokratycznych (izokratyczna) skład fazy ruchomej (eluentu) jest stały (niezmienny w funkcji czasu) Elucja gradientowa- następuje wzrost siły elucyjnej fazy ruchomej przez zmianę składu eluentu w funkcji czasu (wzrost zawartości organicznego modyfikatora eluentu w czasie trwania elucji) (poza szczególnymi przypadkami dotyczy rozdzielania peptydów i białek brak rozdzielenia składników mieszaniny w warunkach elucji izokratycznej z optymalnie dobranym eleuentem oznacza, że elucja gradientowa nic tu nie pomoże)

19 Elucja gradientowa - zastosowanie Optymalizacja warunków rozdzielania (minimalizacja czasu rozdzielania, maksymalizacja stężenia składników w eluacie, maksymalizacja czułości detekcji) mieszanin substancji istotnie różniących się właściwościami sorpcyjnymi; Elucja gradientowa jest także niezbędna w przypadku rozdzielania peptydów i białek w warunkach RP- HPLC / RP-HPTLC

20 Ilustracja stosowanych w praktyce zróżnicowań kształtu przebiegu programu elucji gradientowej gradientu elucji Ważne znaczenie ma też etap rekondycjonowania aktywności sorpcyjnej kolumny chromatograficznej po zakończeniu elucji gradientowej. Należy doprowadzić do uzyskania równowagi sorpcyjnej wobec eluentu o początkowym składzie. Uzyskuje się to w warunkach RP po przepłukaniu kolumny ok. 7 - do 10 ciu objętości martwych eluentem o początkowym składzie. Ten etap włącza się często do programu elucji jako ostatni etap, stosując podwyższoną prędkość przepływu eluentu.

21