WPŁYW ILOŚCI MODYFIKATORA NA WSPÓŁCZYNNIK RETENCJI W TECHNICE WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ

Transkrypt

1 WPŁYW ILOŚCI MODYFIKATORA NA WSPÓŁCZYNNIK RETENCJI W TECHNICE WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ Wprowadzenie Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) jest uniwersalną technika analityczną, stosowaną głównie do separacji wieloskładnikowych próbek, zwłaszcza zawierających nielotne, także wielkocząsteczkowe związki chemiczne, takie jak białka czy kwasy nukleinowe. W chromatografii cieczowej fazą stacjonarną, nieruchomą jest zwykle porowate wypełnienie a fazą ruchomą, eluentem, ciecz. HPLC różni się od klasycznej chromatografii cieczowej wysokim ciśnieniem fazy koniecznym do uzyskania przepływu tej fazy przez kolumnę chromatograficzną. Polarność eluentu pełni zasadniczą rolę w separacji w technice HPLC. W przypadku chromatografii w odwróconym układzie faz polarnym składnikiem fazy jest woda, zaś metanol, izopropanol oraz acetonitryl pełnią rolę modyfikatorów fazy. Zadaniem ich jest zmniejszenie polarności fazy. Organiczne składniki fazy mające bardziej hydrofobowy charakter, łatwiej wymywają składniki mieszaniny chromatografowanej zatrzymywane na fazie stacjonarnej. Zmniejszają tym samym czas poszczególnego składnika mieszaniny. Celem ćwiczenia jest określenie wpływu polarności fazy na retencję polarnych i niepolarnych związków separowanych techniką wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Sprzęt i odczynniki. Chromatograf cieczowy: WATERS 600E, składający się z następujących modułów: a. Kontroler układu chromatograficznego (Waters 600 Controller) umożliwia ustawienie żądanego składu fazy i prędkości przepływu, a także zaprogramowanie tabel odpowiedzialnych za przebieg analizy (np. gradientu). Ponadto w sposób automatyczny kontroluje odgazowanie poszczególnych składników fazy helem. b. Pompa chromatograficzna (Waters 600 Pump) odpowiada za automatyczne mieszanie składników fazy w określonych proporcjach i bezpulsacyjne tłoczenie mieszaniny elucyjnej do dalszych modułów układu HPLC. Odpowiedzialna jest za monitorowanie ciśnienia w układzie. Maksymalne ciśnienie pracy pompy wynosi 4000 psi/80 bar. c. Detektor dwuwiązkowy UVVis (Waters 487 Dual λ Absorbance Detector) pozwala na pracę przy dwóch wybranych długościach fali w zakresie nm. Wyposażony jest w lampę deuterową i celkę pomiarową o objętości 0 μl i długości drogi optycznej równej 0 mm. Maksymalne ciśnienie pracy detektora wynosi 000 psi/70 bar.

2 d. Automatyczny podajnik próbek (Waters 77 plus) służy do automatycznego nastrzykiwania próbek na kolumnę chromatograficzną. Wyposażony jest w dwie karuzele: pierwszą mogącą pomieścić 48 wialek z próbkami o objętości 4 ml i drugą mogącą pomieścić 96 wialek z próbkami o objętości ml. Maksymalna objętość nastrzyku wynosi 00 μl. Urządzenie wyposażone jest w termostat dający możliwość ustawienia temperatury w zakresie od 4 do 40 C. e. Komputer z zainstalowaną kartą komunikacyjną i oprogramowaniem Empower Software (Build 54) służył do sterowania układu chromatograficznego i do przetwarzania zebranych danych.. Warunki chromatograficzne: składnik B: acetonitryl HPLC grade, składnik C: woda wysokiej czystości, przepływ fazy ml/min, detekcja z zakresu światła UV. 3. Pipety automatyczne 000 μl, 0000 μl, μl 4. Naczyńka do automatycznego podajnika próbek o pojemności 4 ml 5. Toluen (metylobenzen) 0.5 mg/ml 6. Fenol (hydroksybenzen) 0.5 mg/ml 7. Acetonitryl HPLC grade 8. Azotan sodu roztwór 0.5 mg/ml Sposób wykonania ćwiczenia. Wyznaczanie analitycznej długości fali do detekcji i oraz azotanu (V) sodu. Wykorzystując spektrofotometr JASCO wykonać analizę spektrofotometryczną roztworów azotanu (V) sodu, i, pomiar wykonać w kuwetach 0. ml. Odczytać długości fali odpowiadające maksimom absorpcji dla poszczególnych próbek i wykorzystując do tego celu roztwory obu związków. Stwierdzić czy wśród wartości uzyskanych dla obu związków są długości fali wspólne dla obu związków identyczne czy też różnią się znacznie. W drugim przypadku istnieje konieczność zmiany długości fali detektora UVVIS w trakcie prowadzenia analizy. Przygotowanie roztworów wzorcowych azotanu (V) sodu, i. W wialkach chromatograficznych o pojemności 4 ml wykonać rozcieńczenia roztworów wyjściowych azotanu(v) sodu, i tak, aby osiągnąć stężenie 0 mg/l. W tym celu automatyczną pipetą pobrać porcje acetonitrylu po 3000 μl i wprowadzić do wialek o pojemności 4 ml oznaczonych jako dla azotanu (V) sodu, dla, 3 dla. Automatyczną pipetą o pojemności 000 μl usunąć z każdej wialki po 60 μl acetonitrylu. Następnie z naczyńka z roztworem podstawowym azotanu(v) sodu pobrać 60 μl porcję roztworu i przenieść ją do

3 wialki oznaczonej numerem. Następnie z roztworu podstawowego pobrać 60 μl porcję roztworu i przenieść ją do wialki oznaczonej numerem, zaś pobraną z roztworu podstawowego 60 μl porcję roztworu przenieść do wialki oznaczonej numerem 3. Wialki szczelnie zamknąć nakrętką i wstrząsając nimi wymieszać dokładnie zawartość. 3. Przygotowanie mieszaniny i. Do wialki o pojemności 4mL automatyczną pipetą pobrać 3000 μl porcję acetonitrylu i oznaczyć numerem 4. Automatyczną pipetą o pojemności 000 μl usunąć razy po 60 μl acetonitrylu. Następnie z roztworu podstawowego pobrać 60 μl porcję roztworu i przenieść ją do wialki oznaczonej numerem 4, czynność tę powtórzyć dla roztworu podstawowego. Wialkę szczelnie zamknąć nakrętką i wstrząsając nią wymieszać dokładnie zawartość. 4. Ustawienie warunków chromatograficznych. a. Skład fazy : W oprogramowaniu ustawić skład fazy na: składnik A =0%, składnik B (acetonitryl)=0%, składnik C (woda)=90%, składnik D=0% oraz przepływ na ml/min. b. Warunki detekcji: Wybrać opcję detekcji przy dwóch analitycznych długościach fal wyznaczonych w punkcie. c. Ustawić tablicę nastrzyku próbek na kolumnę. 5. Wyznaczanie czasu martwego układu chromatograficznego: Wykonać analizę chromatograficzną roztworu azotanu(v) sodu w warunkach analizy opisanych w p.4., nastawiając długość fali na wartość odpowiadającą maksimum absorpcji azotanu sodu. związku jest martwym czasem układu. 6. Wykonanie pomiarów właściwych. Powtarzać analizę opisaną w p.4. zmieniając skład fazy zgodnie ze schematem umieszczonym w tabeli. Każdorazowo po analizie zebrać wszystkie podstawowe parametry charakteryzujące piki uzyskane dla badanych substancji czasy i, wysokości pików, pola powierzchni pod pikami umieszczając zebrane wartości w tabeli. Wyznaczanie współczynników Współczynnik definiowany jest wzorem: a martwy czas : ( t k t 0 t0) t r 0 Vm F 3

4 gdzie: k współczynnik, tr czas w min, t0 martwy czas w min, Vm martwa objętość kolumny (objętość fazy w kolumnie) w ml, F przepływ przez kolumnę w ml/min Martwą objętość kolumny można wyznaczyć z przybliżonego wzoru: gdzie: L długość kolumny w cm, dc wewnętrzna średnica kolumny w cm. V m 0,5 L dc Martwy czas można również stosunkowo łatwo wyznaczyć doświadczalnie chromatografując roztwór azotanu(v) sodu. Porównać uzyskaną wartość z wyliczoną teoretycznie. Do opracowania danych wykorzystać wyznaczoną doświadczalnie wartość martwego czasu. Tabela pomiarów: L.p. acetonitrylu w fazie wody w fazie MIX 4 MIX MIX MIX MIX MIX 90 0 Pole tol. Wys. tol. Pole fen. Wys. fen. Opracowanie wyników W sprawozdaniu z przebiegu ćwiczenia umieścić wyliczony i wyznaczony martwy czas. Korzystając z materiałów z wykładów wyliczyć wartości N liczby półek teoretycznych, współczynnik rozdzielenia substancji, Rs rozdzielczość substancji umieszczając obliczone wartości w tabeli wyników (poniżej). Na podstawie otrzymanych danych podać optymalne warunki przeprowadzenia separacji i oraz ocenę: 4

5 Wpływu polarności fazy na wysokość, pole oraz współczynnik obu związków. Korelacji pomiędzy polarnością fazy a wysokością, polem oraz współczynnikiem związku w zależności od jego polarności (wykonać odpowiednie wykresy i podać ich interpretację. Korzystając z materiału z wykładów wyliczyć wartości N liczby półek teoretycznych, współczynnik rozdzielenia substancji, Rs rozdzielczość substancji umieszczając obliczone wartości w tabeli wyników. Na podstawie otrzymanych danych podać optymalne warunki przeprowadzenia rozdziału i. Tabela wyników: L.p. acetonitrylu w fazie wody w fazie 3 MIX MIX MIX MIX MIX MIX 90 0 toulenu Współczynnik k N Współczynnik k N R s(,) Opracował: A. Łuczak, P. Seliger, R. Zakrzewski 5