RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 209954 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 354769 (51) Int.Cl. C07K 1/18 (2006.01) C07K 14/555 (2006.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 27.06.2002 (54) Sposób oczyszczania białek interferonu i jego zastosowanie (30) Pierwszeństwo: 06.07.2001, IT, BO2001A000426 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 13.01.2003 BUP 01/03 (73) Uprawniony z patentu: ALFA WASSERMANN S.P.A., Alanno Scalo, IT (72) Twórca(y) wynalazku: LUCIA SCAPOL, Sasso Marconi, IT GIUSEPPE CLAUDIO VISCOMI, Sasso Marconi, IT (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 30.11.2011 WUP 11/11 (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Elżbieta Pietruszyńska-Dajewska PL 209954 B1
2 PL 209 954 B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest sposób oczyszczania białek interferonu oraz zastosowanie przedmiotowego sposobu do wytwarzania aktywnych substancji zawartych w preparatach leczniczych opartych na farmakologicznie aktywnych białkach. Znaczna część biochemicznych nauk opiera się na zastosowaniu farmakologicznie aktywnych białek, zarówno pochodzenia naturalnego, uzyskanych za pomocą technik ekstrakcyjnych, jak i pochodzenia syntetycznego, uzyskanych za pomocą metod opartych na rekombinacji DNA. W obydwu przypadkach ważny jest poziom czystości uzyskanych produktów, ponieważ zrozumienie ich aktywności związane jest z możliwością ścisłego powiązania biologicznego działania z obecnością określonej ilości białka. W tym kontekście, sposoby oczyszczania farmakologicznie aktywnych białek zyskały ważne znaczenie, gdyż czystość wytwarzanego białka wykazuje znaczny wpływ na wyniki, zwłaszcza gdy występuje w medycznym preparacie jako składnik lub dodatek. Możliwość wywołania toksycznych efektów i/lub spowodowania działań ubocznych w czasie prowadzenia leczenia jest powodem zmuszającym osoby odpowiedzialne za rejestrację i dopuszczenie do obrotu, leków opartych na białkach, do wprowadzania jeszcze bardziej ostrych przepisów w celu określenia ilości i uzyskiwanego składu aktywnych składników pochodzenia białkowego w wytwarzanych lekach. Ze względu na powyższe zagadnienia wzrasta rola sposobów oczyszczania białek, przy czym. główną trudność sprawia fakt, że farmakologicznie aktywne białka zawsze występują w mieszaninie z wieloma innymi białkami. Problem ten występuje zarówno w przypadku wykorzystania naturalnych źródeł przeznaczonych do ekstrahowania farmakologicznie aktywnych białek, takich jak, na przykład, krew, ekstrakty z narządów zwierzęcych i części roślin, jak i w przypadku stosowania metod rekombinowania DNA, ponieważ białka wykazują podobne właściwości fizykochemiczne, niezależnie od ich pochodzenia. Ponadto, w przypadku oczyszczania farmakologicznie aktywnych białek, białka te są zmieszane z innymi białkami o podobnych właściwościach i często występującymi w przeważającej ilości w porównaniu z pożądanymi białkiem, które należy wyizolować, jako produkt o wysokiej czystości. Zadanie to wymaga znacznego wysiłku i zwykle przeprowadzenia szeregu etapów oczyszczania w celu osiągnięcia pożądanego poziomu czystości. Tym sposobem, proces oczyszczania staje się bardzo skomplikowany i sukces przemysłowego wytwarzania białka jest zasadniczo związany ze skutecznością procesu oczyszczania, ponieważ ten ostatni determinuje koszty wytwarzania. W celu oczyszczania białka zastosowano wiele metod, na przykład, selektywnego wytrącania w wodnych i organicznych rozpuszczalnikach lub przy użyciu środków kaotropowych; rozdzielania za pomocą sączenia i/lub dializy; procesów imnunowytrącania przy użyciu odpowiednich przeciwciał; procesów chromatograficznych. Te ostatnie metody ogromnie zyskały na znaczeniu w czasie ostatnich lat głównie ze względu na to, że pozwalają na uzyskiwanie produktu o wysokiej czystości, jak opisał F.E. Régnier w J. Chromatogr. 413, 115-143, (1937). Wiele technik opisano w literaturze naukowej i można je sklasyfikować na podstawie mechanizmu działania zastosowanego w odniesieniu do białek, na przykład, metody te obejmują rozdzielanie na podstawie ciężaru cząsteczkowego, absorbowania na polarnych nośnikach, zwanych również fazami stacjonarnymi, absorpcji na niepolarnych nośnikach, zwanych fazami stacjonarnymi odwróconymi, absorpcji przez wykorzystanie selektywnego powinowactwa z ligandami osadzonymi na obojętnych nośnikach, takich jak, miedź, cynk, żelazo i platyna, chemiczne barwniki, takie jak, błękit brylantowy, białka typu białko A i białko G, węglowodany typu wielocukry i glukozaminoglikany, absorpcji z wykorzystaniem, immuno-powinowactwa ze specyficznymi przeciwciałami osadzonymi na obojętnych nośnikach, absorpcji opartej na jonowym oddziaływaniu z elektrostatycznie naładowanymi ligandami osadzonymi na obojętnych nośnikach. Selektywność, to znaczy zdolność do selektywnego rozpoznania pożądanego białka, koszt i możliwość zastosowania na skalę przemysłową są parametrami pozwalającymi na określenie przydatności różnych technik chromatograficznych. Na podstawie takich parametrów uznano, że chromatografia oparta na zasadzie swoistej sorpcji, to znaczy, na immunologicznym powinowactwie gwarantuje wysoką selektywność, lecz wykazuje jednocześnie wysokie reszty stosowania, ryzyko denaturowania przeciwciał i ryzyko związane z bezpieczeństwem stosowania oczyszczonego produktu, gdyż przeciwciało jest pochodzenia zwierzęcego.
PL 209 954 B1 3 Chromatografia, która wykorzystuje oddziaływania jonowe, zwana także chromatografią jonowymienną, związana jest z mniejszym, ryzykiem, dla utrzymania farmakologicznej aktywności białek i jest łatwiejsza do zastosowania w warunkach przemysłowych, przy mniejszych kosztach, lecz jednocześnie charakteryzuje ją mniejsza selektywność. Tym samym bardzo pożądanym jest znalezienie warunków dla chromatografii jonowymiennej, które pozwolą na zwiększenie selektywności tak, aby ta metoda stała się konkurencyjna w stosunku do innych metod z punktu widzenia czystości uzyskiwanego produktu. Chromatografię jonowymienną zwykle przeprowadza się przy użyciu kolumn o różnej wielkości, wypełnionych stałymi nośnikami posiadającymi grupy chemiczne, które ciągle lub w określonych warunkach są obdarzone ładunkiem elektrostatycznym. Związek naniesiony na kolumnę jonowymienną oddziałuje na zasadzie przyciągania/odpychania ładunku elektrycznego z wypełnieniem, osadzonym, na nośniku. Różne związki zawarte w mieszaninie będą zdolne do wiązania się z fazą stacjonarną w zależności od wielkości posiadanego ładunku, w wyniku, czego będą utrzymywane na niej dłużej lub krócej, co umożliwia ich rozdzielanie przy wyjściu z kolumny. Chromatografię nazywa się kationowymienną, jeśli ładunki osadzone na nośniku są ujemne, ponieważ zatrzymywane są kationy, oraz anionowymienną gdy ładunki na nośniku są dodatnie. Białka są związkami o wysokim, ciężarze cząsteczkowym wyższym niż 10 000 daltonów, utworzonymi przez heterogeniczne polimery aminokwasowe; pewne aminokwasy posiadają w swoi łańcuchu bocznym grupy funkcjonalne, które mogą być przekształcane w jony w zależności od wysokości ph roztworu, czyli w jony ujemne w przypadku kwasowych aminokwasów, lub jony dodatnie w przypadku zasadowych aminokwasów, tym samym, wszystkie ciałka posiadają dużą ilość ładunków dodatnich i ujemnych. Punkt izoelektryczny białka, pi, oznacza taką wartość ph, przy której białko jest obojętne, ponieważ ładunki ujemne są równoważone ładunkami dodatnimi; białko w punkcie izoelektrycznym umieszczone w polu elektrycznym, nie ulega jakiejkolwiek polaryzacji pod wpływem tego pola. Ilość ujemnych ładunków wzrasta przy wartościach ph wyższych, niż pl i białko uzyskuje sieć ładunków ujemnych, oraz przeciwnie przy wartościach ph niższych niż pl białko uzyskuje sieć ładunków dodatnich. Każde białko posiada swoją charakterystyczną wartość pl, która jest inna niż wartości dla innych białek oraz pewne białka stają się nierozpuszczalne w punkcie izoelektrycznym. Jeśli białko znajduje się w roztworze przy wartości ph niższej niż pi to posiada sieć ładunków dodatnich i tym samym może oddziaływać z ujemnie naładowanym, nośnikiem, i może być poddawane chromatografii kationowowymiennej, oraz białko może być poddawane chromatografii anionowymiennej przy wartościach ph wyższych niż jego pl, jak opisał F. E. Régnier, Science, 233, 319-323 (1987) i S. Yamamoto i jego współpracownicy w Chromatographic Science Series, 4 3, 1 58 3:, Marcel Dekker, Inc. Publisher, New York. W przeciwieństwie do tego, niespodziewanie stwierdzone i na tym stwierdzeniu opiera się niniejszy wynalazek, że możliwe jest znalezienie zakresu wartości ph wyższych niż odpowiadające pl dla danego białka, przy których białka będą wciąż absorbowane na nośnikach do chromatografii kationowymiennej tak, że będzie możliwe przeprowadzenie chromatografii kationowymiennej. Taka sytuacja szczególnie ważna, ponieważ w tych warunkach można uzyskać wysoką selektywność pomiędzy białkami, gdyż nawet bardzo małe różnice pi różnych białek można wykorzystać dla osiągnięcia znacznego rozdzielenia, co pozwala na uzyskanie wysokiej skuteczności oczyszczania. Ten ostatni aspekt jest szczególnie ważny w procesach oczyszczania białek otrzymanych w wyniku rekombinacji, gdzie zanieczyszczenia, to znaczy, wykazujące bardzo małe zmiany strukturalne w porównaniu z produktami, takie jak, na przykład, produkty na różnych stopniach utlenienia, acetylacji, o utraconej funkcji amidowej i tym podobne. Ten rodzaj zanieczyszczeń jest bardzo trudny do usunięcia nawet sposobem chromatografii z wykorzystaniem swoistej sorpcji typu immmunologicznego, ponieważ w większości przypadków przeciwciała nie są zdolne do ich rozróżniania. Mechanizm, który może tłumaczyć ten fenomen opiera się na fakcie, że rozkład ładunków na zewnętrznej powierzchni białka nie jest jednorodny, czyli w przypadku gdy wartość ph jest nieznacznie większa niż wartość pl i białko posiada całkowity, ujemny ładunek sieci, to pozostają jeszcze dodatnie ładunki ulokowane w cząsteczce, które mogą oddziaływać na ujemną fazę stacjonarną. W celu skutecznego wykorzystania tego mechanizmu ważnym jest, aby nadmiar ładunków ujemnych nie był zbyt silny, bo inaczej pola elektryczne wytworzone przez ładunki ujemne mogą być tak silne, że będą uniemożliwiały oddziaływanie całego białka z ujemnie naładowanym nośnikiem chromatograficznym.
4 PL 209 954 B1 Ponadto niezbędnym jest odpowiednie kontrolowanie mocy jonowej roztworów stosowanych, jako eluenty, ponieważ wysoka moc jonowa wykazuje działanie osłaniające wobec białka, zapobiegając ich oddziaływaniu z fazą stacjonarną. G.P. Lampson i jego współpracownicy w Anal. Biochem., 11, 347-377 (1965); opisali przypadek, w którym białka typu ludzkiej gamma-globuliny, rybonukleazy, hemoglobiny, delta-chymotrypsyny, globiny i lizozymu, przy niewielkich zmianach ph ale przy utrzymywaniu len w roztworze o wysokiej mocy jonowej, zapewnianej przez 0,1 molowy roztwór fosforanu poddawały się eluowaniu metodą chromatografii kationowymiennej przy wartościach ph o prawie 0,4 jednostki niższych niż pl. Powyżej opisana zasada, na której opiera się niniejszy wynalazek, zgodnie z wiedzą wynalazców nigdy nie była zastosowana w celu przeprowadzenia skutecznego procesu oczyszczania białek. Możliwość wykorzystania różnic wartości punktu izoelektrycznego białek w celu optymalizacji procesu oczyszczania opisanego przez A. K. Kontturi i jego współpracowników w Acta Chem. Scand., 50(2), 102-106,(1996), w istocie dotyczy konwencjonalnego zastosowania chromatografii jonowymiennej, w którym chromatografię kationowymienną przeprowadza się zawsze przy wartości ph niż punkt izoelektryczny. W przeciwieństwie do tego, zgodnie ze sposobem przedstawionym w niniejszym zgłoszeniu patentowym chromatografię kationowymienną przeprowadza się przy wartości ph wyższej niż punkt izoelektryczny białka. Sposób przedstawiony w niniejszym zgłoszeniu patentowym można ogólnie rozważać zgodnie z załączonymi przykładami, w których wykazano jego użyteczność zarówno dla białka pochodzenia naturalnego jak i dla białka uzyskanego w wyniku rekombinacji DNA. Różnice pomiędzy białkami polegają na rozległości zakresu ph, wyższego niż Pi, użytecznego dla oczyszczania danego białka. Rzeczywiście, na przykład, jak przedstawia się w poniższych przykładach, taki zakres ph wynosi około 0,2 jednostki ph w przypadku białka interferonu, oraz około jednej jednostki ph w przypadku albuminy. Zastosowanie niniejszego wynalazku rekombinowanego interferonu alfa (RFNα) którego punkt izoelektryczny wynosi 5,9 jak podali D. Thatcher i N. Panayotatos w Methods Enzymol., 119, 166-177 (1986), będzie przedstawione w przykładach, gdzie zostanie pokazane możliwe i korzystne oczyszczanie tego białka metodą kationowymienną przy wartości ph 6,1. Ponadto w przykładzie przedstawia się oczyszczania, albuminy z surowicy krwi ludzkiej o wartości Pi wynoszącej 4,9, co przedstawili D. B. Rylatt i jego współpracownicy w J. Chromatogr., 865, 145-153 (1999) i będzie pokazane, że oczyszczanie jest możliwe i korzystne metodą kationowymienną przy wartości ph 6,0. Korzyści stosowania sposobu według niniejszego wynalazku są znaczące, jeśli uzyskane wyniki porównuje się z wynikami uzyskanymi sposobami opisanymi w naukowych publikacjach i/lub patentach poświęconych oczyszczaniu α interferonu i albuminy z surowicy krwi ludzkiej, które to procesy zwykle wymagają stosowania trzech i więcej kolejnych etapów, co powoduje wysokie koszty przemysłowe i spadek wydajności. D. Thatcher i N. Panayotatos opisali oczyszczanie rekombinowanego, ludzkiego interferonu rifn-α2, Metod Enzymom., 119, 166-177 (1986) za pomocą pięciu kolejnych etapów: a) chromatografii kationowymiennej; b) chromatografii anionowymiennej; c) chromatografii wykorzystującej powinowactwo do metali ciężkich; d) działanie nasyconym roztworem siarczanu amonowego; d) chromatografii cząsteczkowego wykluczania. W europejskim opisie patentowym 0108585 przedstawiono sposób oczyszczania interferonu za pomocą kolejnego zastosowania trzech typów chromatografii: a) z wykorzystaniem swoistej sorpcji immunologicznej; b) kationowymiennej; c) cząsteczkowego wykluczania. W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki 4 765 903 przedstawiono sposób oczyszczania interferonu za pomocą kolejnego zastosowania czterech typów chromatografii: a) z sorpcją immunologiczną z monoklinalnym przeciwciałem; b) na odwróconej fazie; c) kationowymiennej; d) cząsteczkowego wykluczania. W europejskim, opisie patentowymi 0679718 przedstawiono sposób wytwarzania alfa interferonu, w którym, zaangażowano cztery typy chromatografii: a) z metalem, chelatującym; b) kationowymienną; c) anionowymienną; d) sączenia na żelu. Inne publikacje i patenty przedstawiają trzy lub więcej działań koniecznych dla oczyszczania białka interferonu, na przykład, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki 4 732 683, międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO 8604067 i publikacja F. R. Khana i V. R. Rai, Bioprocess Technol., 7, 161-169, (1990).
PL 209 954 B1 5 Cytowane przykłady przedstawiają większość doniesień na temat oczyszczania interferonu, a zwłaszcza interferonu alfa. Wykazują one, że oczyszczanie tego ostatniego jest szczególnie trudne i wymaga stosowania wielu etapów. Ponadto podkreślić należy jak wysokie poziomy oczyszczenia uzyskuje się szczególnie przy zastosowaniu chromatografii z sorpcją immunologiczną wykorzystującej przeciwciała pochodzące od myszy lub szczurów. Jednak obecność takich technik w procesie wytwarzania przemysłowego stosowanego przy wytwarzaniu aktywnych substancji dla celów farmacji ludzkiej grozi ryzykiem możliwego zakażenia wirusami pochodzącym od myszy lub szczurów, ze względu na możliwość występowania immunogenicznych fragmentów pochodzących od immunoglobulin myszy lub szczurów w produkcie końcowym, oraz ze względu na trudności z walidowaniem nośników chromatograficznych z przemysłowego punktu widzenia. Ponadto, z krótko zilustrowanych przykładów wynika, że chromatografia kationowymienna jest szeroko stosowana, lecz nigdy jako oddzielna technika, ponieważ jej możliwości są ograniczone jeśli chodzi o zwiększanie poziomów czystości. W publikacjach K. R. Babu i jego współpracowników w Appl. Microbiol. Biotech., 53(6), 655- -660, (2000), i R. Bouyona i jego współpracowników w Biotecnología Aplicada, 14, 189-192 (1997) przedstawiono sposoby oczyszczania alfa interferonu w jednym etapie za pomocą chromatografii jonowymiennej w roztworze o gradiencie stężenia soli. Jednak w obydwu przypadkach w celu uzyskania produktu o dostatecznej czystości autorzy poddawali izolacji tylko niektóre frakcje chromatograficzne zawierające alfa interferon, co powodowało znaczne obniżenie wydajności aż do minimalnej 7,5%. Ponadto, opisane sposoby oczyszczania za pomocą chromatografii prowadzonej w gradiencie stężenia soli nie można stosować na skalę przemysłową. Wiele sposobów oczyszczania opartych na chromatografii opisano także w odniesieniu do albuminy ludzkiej. Wychodzą one z procedur obejmujących otrzymywanie albuminy za pomocą frakcjonowania surowicy ludzkiej lub metodami rekombinowania DNA, są to techniki kompleksowe i zaledwie dają się przenieść na poziom przemysłowy, co potwierdza wielkość wciąż istniejącego problemu skutecznego oczyszczania albuminy ludzkiej, zarówno pochodzenia naturalnego jak i uzyskiwanego przy użyciu rekombinacji. W opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki numery 6150504 i 5521287 przedstawiono oczyszczanie albuminy za pomocą chromatografii jonowymiennej i oddziaływania hydrofobowego. Schemat oczyszczania przedstawiony w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 6034221 ujawnia sposób oczyszczania albuminy za pomocą dwóch etapów chromatograficznych, jednego etapu ultrafiltracji i dwóch następnych etapów oczyszczania za pomocą chromatografii. Mniej konwencjonalne metody oczyszczania albuminy, w których zastosowano chromatografię anionowymienną w złożu fluidalnym lub chromatografię na zasadzie swoistej sorpcji współdziałającą z dostępnymi w handlu nośnikami typu Streamline lub nośnikami odpowiednio spreparowanymi, na przykład z cząstkami zmodyfikowanymi cyrkonem lub emulsjami perfluorowęglowodorów przedstawiono w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5962649 i w publikacjach A. Sumi i jego współpracowników w Bioseparation, 8(1-5), 195-200, (1999), A. Mullick i M. C. Flickinger w Biotechnol. Bioeng., 65(3), 282-290 (1999) i G. E. Creath i jego współpracownicy w J. Chromatogr., 597(1-2), 189-196 (1992). Ostatnio metodę oczyszczania albuminy z wykorzystaniem ciężkich metali opisali również L. Yang i jego współpracownicy w Sheng Wu Kung Cheng Hsueh Pao, 16(1), 74-77 (2000) oraz technikę z wykorzystaniem powinowactwa chemicznego na nośnikach, do których cząsteczek przyłączono barwniki typu Cibacron Blue F3G opisali A. Compagnini i jego współpracownicy w J. Chromatogr. A, 736(1-2), 115, (1996). Wszystkie te metody w różnym stopniu charakteryzują problemy z kompleksowym stosowaniem i wysokimi kosztami, tym samym nie został rozwiązany problem indywidualnego, nowego sposobu oczyszczania farmakologicznie aktywnych białek, który byłby zarówno prosty i skuteczny na skalę przemysłową jak i korzystny ekonomicznie. Wynalazek opisany poniżej daje odpowiedź na te ważne wymagania dostarczając proces oczyszczania farmakologicznie aktywnych białek, prosty do stosowania przemysłowego, o niskich kosztach i znacznych ekonomicznych zaletach. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem sposób oczyszczania białek interferonu oparty jest na zastosowaniu kationowymiennej chromatografii prowadzonej na stałym nośniku w szczególnych warunkach, które obejmują, po naniesieniu próbki, kondycjonowanie kolumny eluentami o odpowiedniej wartości ph i odpowiedniej mocy jonowej, takie że kolumna będzie jednorodna i znajdzie się w bardziej zasadowym
6 PL 209 954 B1 ph, na przykład wyższym, niż odpowiedni dla białek interferonu punkt izoelektryczny pl, przy zapewnieniu jednak aby wymienione białka mogły być jeszcze absorbowane na stałym nośniku stosowanym w chromatografii kationowymiennej. Po przeprowadzeniu takiego kondycjonowania farmakologicznie aktywne białka eluuje się z kolumny za pomocą zwiększania mocy jonowej i/lub wartości ph eluentów. Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób oczyszczania białek interferonu, polegający na tym, że obejmuje przeprowadzanie kationowymiennej chromatografii na stałym nośniku przy wartości ph bardziej zasadowej niż ph odpowiadające punktowi izoelektrycznemu pl oczyszczanych białek, wartości ph przy której wymienione białka pozostają wciąż zaabsorbowane i eluowanie wymienionych białek poprzez zwiększanie mocy jonowej i/lub wartości ph wodnych roztworów buforowych. Korzystnie wodne roztwory buforowe zawierają od 5 do 100 mm mieszanin buforujących wybranych spośród mieszanin monozasadowego fosforanu potasu i dizasadowego fosforanu sodu, monozasadowego ftalanu potasu i wodorotlenku sodu, dizasadowego cytrynianu sodu i wodorotlenku sodu, kwasu cytrynowego i dizasadowego fosforanu sodu, imidazolu i kwasu chlorowodorowego. Korzystniej roztwory buforowe mogą zawierać sole organiczne lub nieorganiczne w stężeniu od 1 do 100 mm, zdolne do modyfikowania mocy jonowej roztworów. Korzystnie białkami interferonu są interferony alfa, beta, gamma, delta, omega, tau, naturalne alfa z leukocytów, rekombinowane alfa-2b i zgodne. Korzystnie oczyszcza się rekombinowany interferon alfa-2b, rifnα-2b, przy czym sposób obejmuje nanoszenie mieszaniny białkowej pochodzącej z fermentacji rifnα-2b, umieszczonej w 1 M roztworze octanu sodu o wartości ph doprowadzonej kwasem octowym do 5,5, na kolumnę wypełnioną silną kationowymienną żywicą, kondycjonowaną przy wartości ph 5,5 za pomocą roztworu octanu sodu o stężeniu 20 mm. tak, aby nanieść pomiędzy 6 a 8 mg białka na każdy ml stacjonarnej fazy, poddawanie kolumny dwóm cyklom przemywania, pierwszemu za pomocą roztworu buforowego o wartości ph wynoszącej 6,1 przy stężeniu pomiędzy 5 a 15 mm, następnie przemywaniu tym samym roztworem buforowym z dodanym chlorkiem potasu w stężeniu 2 mm oraz na koniec eluowanie czystego rifna-2b z kolumny za pomocą roztworu buforowego o wartości ph 6,1 zawierającego chlorek potasu w stężeniu pomiędzy 15 a 25 mm. Korzystniej, jako żywicę stosuje się mocny nośnik kationowymienny składający się z hydrofilowego polimeru z grupami kwasu sulfonowego usieciowanymi na membranie polieterowosulfonowej i mieszaniny buforowe wybiera się z następujących mieszanin: monozasadowy fosforan potasu i dizasadowy fosforan sodu, monozasadowy ftalan potasu i wodorotlenek sodu, dizasadowy cytrynian sodu i wodorotlenek sodu, kwas cytrynowy i dizasadowy fosforan sodu, imidazol i kwas chlorowodorowy. Przedmiot wynalazku stanowi także zastosowanie sposobu jak określono powyżej do wytwarzania aktywnych substancji zawartych w preparatach leczniczych opartych na farmakologicznie aktywnych białkach. Korzystnie białko interferonu jest rekombinowanym interferonem alfa-2b. Skuteczne przeprowadzenie oczyszczania sposobem według wynalazku wymaga indywidualnego i prawidłowego zastosowania kombinacji obejmującej stosowany nośnik chromatograficzny, wartość ph wyższą niż wartość pl i wielkość mocy jonowej zastosowanej w chromatograficznych eluentach, ponieważ dla wybranego nośnika chromatograficznego skuteczne oczyszczanie osiąga się przy ograniczonych zmianach wartości ph i/lub mocy jonowej, często wynoszących dziesiąte części jednostki ph i/lub kilku setnych części µs będącej jednostką mocy jonowej. Można stosować wszystkie stałe nośniki zwykle wykorzystywane, jako fazy stacjonarne dla kationowymiennej chromatografii, zwłaszcza korzystnie stosuje się fazy stacjonarne zwane silnymi fazami kationowymiennymi gdy pl oczyszczanego białka jest niższe niż 6, podczas gdy kationowymienne fazy stacjonarne zarówno zwane silnymi jak i słabymi można stosować bez różnicy dla białek wykazujących pl wyższe niż 6. Wymienione fazy stacjonarne mogą zawierać nośniki silikonowe lub polimerowe, funkcjonalizowane za pomocą grup sulfonowych lub karboksylowych w postaci protonowanej lub w postaci soli alkalicznej. Skutecznie można stosować handlowe fazy stacjonarne obejmujące, na przykład, Source S (Pharmacia Biotech), Sepharose SP-Fast Flow, Sepharose SP-High Performance, SP Sepharose XL (Pharmacia Biotech), Fractogel S (Merck, Darmstadt), Mustang (Pall Corporate), CM Sepharose FF (Pharmacia Biotech), Dowex, Bio-Rad AG (Bio-Rad), Poros S (PerSeptive Biosystems), Shodex - S, Toyopearl SP (Tosohass). Zakres wartości ph, przy których skutecznie można przeprowadzać oczyszczanie sposobem według wynalazku jest bardzo szeroki, zależy od wartości punktów izoelektrycznych oczyszczanych białek interferonu i zawiera się pomiędzy 2 a 11, korzystnie pomiędzy 4 a 8,5.
PL 209 954 B1 7 Rozpiętość zakresu wartości ph, wyższych niż wartość pl, zgodnie ze sposobem według niniejszego wynalazku, może zmieniać się odpowiednio do wartości pl białek interferonu o jednostkę ph powyżej wymienionej wartości pl, dając znaczące różnice pomiędzy różnymi białkami. Na przykład, stwierdzono, że w przypadku rekombinowanego interferonu alfa 2b (rifnα-2b) możliwe jest uzyskanie absorpcji białka na nośniku kationowymiennym do 0,2 jednostki ph powyżej wartości pl wynoszącej 5,9 w wyniku czego możliwe jest oczyszczanie za pomocą chromatografii kationowymiennej, podczas gdy w przypadku albuminy z surowicy krwi ludzkiej stwierdzono, że białko pozostaje zaabsorbowane do jednej jednostki ph powyżej jego wartości pl. Zakres stężenia soli w roztworach wodnych stosowany dla skutecznego zastosowania eluentów, zależy od rodzaju oczyszczanego białka interferonu i stwierdzono, że mieści w zakresie pomiędzy stężeniem 1 milimolowym a 100 milimolowym, korzystnie pomiędzy stężeniem 1 milimolowym a 30 milimolowym. Na przykład, w przypadku oczyszczania rekombinowanego interferonu alfa 2b (rifnα-2b), zakres stężenia soli w wodnym roztworze mieści się pomiędzy 1 milimolowym a 30 milimolowym, korzystnie pomiędzy 5 a 15 milimolowym. W celu zapewnienia wysokiej użyteczności chromatograficznego sposobu według wynalazku, konieczne jest zapewnienie stałych i trwałych wartości ph eluentów, nawet jeśli nie są one absolutnie konieczne, to stosuje się wodne roztwory odpowiednio buforowane, zawierające od 5 do 100 milimoli, korzystnie 10 do 20 milimoli mieszanin buforowych. Korzystnie zastosować można każdą chemiczną substancję lub mieszaninę chemicznych substancji zdolnych do utrzymania wartości ph w zakresie od 2 do 11, ponieważ można stosować eluenty o wartościach ph od 2 do 11. Wiele wodnych roztworów buforowych można korzystnie stosować zgodnie z niniejszym wynalazkiem, między innymi takie jak zawierające: glicynę i chlorek sodu, kwas maleinowy i wodorotlenek sodu, kwas malonowy i wodorotlenek sodu, kwas mlekowy i wodorotlenek sodu, kwas mrówkowy i wodorotlenek sodu lub litu, kwas bursztynowy i wodorotlenek sodu, N-metylopiperazynę i kwas chlorowodorowy, piperazynę i kwas chlorowodorowy lub kwas octowy, L-histydynę i kwas chlorowodorowy, kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy i wodorotlenek sodu lub litu, N-metylodietanoloaminę i kwas siarkowy, N-metylodietanoloaminę i kwas chlorowodorowy lub kwas octowy, pirydynę i kwas mrówkowy, dizasadowy cytrynian sodu i wodorotlenek sodu, monozasadowy ftalan potasu i kwas chlorowodorowy, monozasadowy ftalan potasu i wodorotlenek sodu, monozasadowy fosforan potasu i dwuzasadowy fosforan sodu, bicynę i wodorotlenek sodu, dietylobarbituran sodu i kwas chlorowodorowy, boran sodu i kwas chlorowodorowy, boran sodu i wodorotlenek sodu, 1,3-diaminopropan i kwas chlorowodorowy, kwas cytrynowy i dizasadowy fosforan sodu, octan sodu i kwas octowy, imidazol i kwas chlorowodorowy, trietanoloaminę i kwas chlorowodorowy lub kwas octowy, tris(hydroksymetyloaminometan) i kwas chlorowodorowy, węglan sodu i wodorowęglan sodu, etanoloaminę i kwas chlorowodorowy, piperydynę i kwas chlorowodorowy, trimetyloaminę i kwas mrówkowy, pirydynę i kwas octowy, trimetyloaminę i kwas octowy, trimetyloaminę i kwas chlorowodorowy, wodorotlenek amonu i kwas mrówkowy, wodorotlenek amonu i kwas octowy, trimetyloaminę i węglan sodu, węglan amonu i wodorotlenek amonu. Zwłaszcza w przypadku oczyszczania rekombinowanego interferonu alfa 2b (rifnα-2b) można stosować wszystkie buforowe roztwory o wartości ph pomiędzy 5,9 a 6,1, korzystnie buforowe roztwory o wartości ph pomiędzy 5,9 a 6,1 zawierające monozasadowy fosforan potasu i dizasadowy fosforan sodu, monozasadowy ftalan potasu i wodorotlenek sodu, dizasadowy cytrynian sodu i wodorotlenek sodu, kwas cytrynowy i dizasadowy fosforan sodu, imidazol i kwas chlorowodorowy, podczas gdy w przypadku oczyszczania albuminy w surowicy krwi ludzkiej można stosować buforowe roztwory zawierające takie same mieszaniny związków chemicznych o wartości ph pomiędzy 4,9 a 6,0. Wodne roztwory stosowane, jako eluenty poza substancjami chemicznymi stosowanymi w celu buforowania wartości ph mogą zawierać również substancje chemiczne modyfikujące jonową moc roztworu. W tym celu korzystnie można stosować zarówno sole organiczne, takie jak, na przykład, karboksylany, alkilosulfoniany i ftalany, jak i sole nieorganiczne, takie jak, na przykład, siarczany, chlorki, fosforany, z kationami takimi jak, sodu, potasu, amoniowy, utworzony z aminy pierwszo-, drugo- i trzeciorzędowej lub aminy aromatycznej. Takie związki korzystnie stosuje się w stężeniu od 1 milimolowego do 100 milimolowego, korzystnie pomiędzy 1 milimolowym a 30 milimolowym.
8 PL 209 954 B1 Na przykład, w przypadku oczyszczania rekombinowanego interferonu alfa 2b (rifnα-2b) stężenie tych związków może zmieniać się w zakresie od 1 milimolowego do 30 milimolowego, korzystnie od 2 do 20 milimolowego. Skuteczność oczyszczania można zwiększyć, jeśli przed eluowaniem białek interferonu kolumnę raz lub więcej razy przemyje się eluentami o odpowiednim ph i odpowiedniej mocy jonowej tak, aby znalazła się w warunkach ph wyższego niż pl. W przypadku oczyszczania rekombinowanego interferonu alfa 2b (rifnα-2b), dla którego wartość pl wynosi 5,9, przemywanie prowadzi się buforowymi roztworami o wartości ph pomiędzy 6,0 a 6,1. Ilość eluentu przepuszczanego przez kolumnę w czasie takich przemywań może być różna, zwykle stosuje się od 5 do 100 objętości kolumny (CV). Na przykład, w przypadku oczyszczania albuminy z surowicy krwi ludzkiej przemywanie przeprowadza się przy użyciu od 20 do 40 CV, podczas gdy w przypadku oczyszczania rekombinowanego interferonu alfa 2b (rifnα-2b) przemywanie przeprowadza się przy użyciu od 10 do 80 CV. Ilość oczyszczanego produktu, którą można nanieść na kolumnę zależy od stosowanego nośnika chromatograficznego i może sięgać maksymalnej ilości 100 miligramów łącznej ilości białek na każdy mililitr fazy stacjonarnej, jednak zwykle stosuje się mniejsze ilości pomiędzy 5 a 20 mg/ml. Eluenty można przepuszczać przez kolumnę z szybkością liniową w odniesieniu do fazy stacjonarnej, wynoszącą maksymalnie 10 cm/minutę. Opisany sposób oczyszczania można stosować do wszystkich białek interferonu; korzystnie sposób według niniejszego wynalazku stosuje się do oczyszczania białek interferonu, zwłaszcza do oczyszczania interferonu alfa, beta, gamma, delta, omega, tau, do oczyszczania naturalnego interferonu z leukocytów, do oczyszczania rekombinowanego interferonu alfa 2b i interferonów zgodnych pochodzenia naturalnego jak i pochodzących z procesu rekombinacji. Przedmiotem opisanego powyżej sposobu oczyszczania jest zapewnienie przemysłowego i ekonomicznego sposobu otrzymywania farmakologicznie aktywnych białek o stopniu czystości takim, że pozwala na ich bezpośrednie zastosowanie do wytwarzania zawierających je leczniczych preparatów. W szczególności, leczniczymi preparatami korzystnymi zgodnie z niniejszym wynalazkiem są takie, które zawierają interferon, jeszcze korzystniej rekombinowany interferon alfa 2b (rifnα-2b) pochodzenia naturalnego oraz uzyskany z wykorzystaniem rekombinacji. Poniżej przedstawia się pewne ilustrujące przykłady sposobu według niniejszego wynalazku, wyłącznie w celu wyjaśnienia wynalazku, lecz nie można ich rozważać, jako jakiegokolwiek jego ograniczenia. P r z y k ł a d I Wytwarzanie rekombinowanego interferonu alfa 2b (rlfnα-2b) Część komórek szczepu Escherichia coli BL21 DE3 poddaje się transformacji przy użyciu 5 nanogramów plazmidu pet9α-ifnα-2b, otrzymuje przez klonowanie syntetyczny gen wytwarzający sekwencję ludzkiego genu IFNa-2b, odpowiednio zmodyfikowany w celu włączenia tej sekwencji do kodonów częściej występujących w Escherichia coli w plazmidzie pet9a (Novagen). Białkowa sekwencja ulegająca ekspresji z komórek Escherichia coli odpowiada opisanej w Methods in Enzymology, Interferons, część C, wydawca S. Pestka, 119, 3-14 (1986), wydanie Academic Press Inc.. Szczep Escherichia coli BL21 DE3 przekształcony za pomocą plazmidu pet9α-ifnα-2b umieszcza się w hodowli w kolbie, w odpowiednim podłożu hodowlanym, na przykład, w roztworze zawierającym 12 g/l fitopeptonu (Phyto peptoton, BBL), 24 g/l ekstraktu z drożdży (Yeast extract, Difco), 4 g/l gliceryny (BDH) i neomycynę, w temperaturze 37 C, w czasie dostatecznym do osiągnięcia wartości gęstości optycznej przy długości fali 600 nm wynoszącej 0,6-0,8, co zachodzi zwykle w czasie 7-9 godzin. Uzyskaną tym sposobem hodowlę przy rozcieńczeniu od 1 do 100, stosuje się następnie do zaszczepienia 5 litrowego fermentora zawierającego podłoże identyczne jak powyżej opisane podłoże w kolbie. Hodowlę prowadzi się w czasie 14 godzin w temperaturze 37 C, przy napowietrzaniu prowadzonym z szybkością jednej objętości powietrza w czasie minuty w odniesieniu do objętości podłoża. Bakteryjne komórki po zakończeniu hodowli oddziela się za pomocą wirowania z szybkością 6000 obrotów na minutę (rpm), następnie zawiesza w odpowiednim wodnym roztworze zawierającym ditiotreitol (DTT) w stężeniu 1 milimolowym, w ilości nie większej niż 6 ml na każdy gram wilgotnej pozostałości bakteryjnej po wirowaniu. Bakteryjną zawiesinę poddaje się lizie komórek za pomocą
PL 209 954 B1 9 znanych i opisanych metod, typu rozbijania za pomocą ultradźwięków lub za pomocą hydraulicznego ciśnienia. Uzyskaną zawiesinę oddziela się za pomocą wirowania, stałą część zawiesza w 50 ml roztworu soli zawierającego DTT w stężeniu 1 milimolowym i ponownie wiruje. Stały składnik, zawierający zainkludowane związki, oddziela się i przy silnym mieszaniu w temperaturze pokojowej zawiesza w 450 ml roztworu zawierającego chlorek guanidyniowy w stężeniu 6 molowym, 50 mm Tris.HCl, przy wartości ph wynoszącej 8, oraz EDTA w stężeniu 0,1 milimolowym. Zawiesinę poddaje się wirowaniu i supernatant rozcieńcza w stosunku od 1 do 100, do 1 do 200 odpowiednio roztworem soli zawierającym 50 mm -Tris.HCl, przy wartości ph 8 i EDTA w stężeniu 0,1 milimolowym przy wartości ph 8, w celu renaturacji białka. Roztwór do renaturacji może zawierać aminokwasy typu glicyny lub argininy; mieszaniny związków zawierających siarczki w postaci utlenionej lub tworzących disiarczki w postaci zredukowanej, typu na przykład, glutationu, etanploaminy, cysteiny. Proces renaturacji prowadzi się przy silnym mieszaniu roztworu w temperaturze 4 C w czasie prawie 72 godzin, po czym roztwór sączy się i zatęża przy użyciu diafiltracji stosując bufor Tris.HCl o stężeniu 40 milimolowym o wartości ph 8 i prowadząc do czasu, gdy końcowy współczynnik stężenia spadnie od 5 do 10 razy. Końcowe stężenie roztworu zwykle wynosi od 0,4 do 1,0 mg/ml. P r z y k ł a d II Oczyszczanie rekombinowanego interferonu alfa 2b (rlfnα-2b) 1 molowy roztwór octanu sodu dodaje się do białkowej mieszaniny zawierającej rifnα-2b, uzyskanej sposobem opisanym w przykładzie I, aż do uzyskania końcowego stężenia 20 milimoli, następnie wartość ph doprowadza się do 5,5 za pomocą dodania kwasu octowego. Tak uzyskany roztwór nanosi się na silną kationowymienną kolumnę zawierającą dostępny w handlu chromatograficzny nośnik Mustang S (Pall Corporate). Przed naniesieniem roztworu białka, kationowymienną kolumnę poddaje się kondycjonowaniu za pomocą roztworu octanu sodu o stężeniu 20 milimolowym i wartości ph 5,5, podawanym w ilości 20 objętości kolumny (CV). Roztwór białka nanosi się w takiej ilości, że nie przekracza się ilości 10 mg naniesionego białka na każdy mililitr stacjonarnej fazy, korzystnie nanosi się ilości od 6 do 8 mg/ml. Po naniesieniu, produkty związane ze stacjonarną fazą poddaje się pierwszemu cyklowi przemywania za pomocą roztworu soli o wartości ph wynoszącej 6,1 przygotowanemu za pomocą zmieszania monozasadowego fosforanu potasu i dwuzasadowego fosforanu sodu przy całkowitym stężeniu wynoszącym od 5 do 15 milimoli. Optymalne stężenie roztworu określa się poprzez warunek, aby przewodnictwo roztworu nie przekraczało około 1800 µs. Całkowita ilość roztworu wynosi od 5 do 60 CV, korzystnie od 25 do 35 CV. Drugi cykl przemywania przeprowadza się przy użyciu tego samego roztworu, jaki stosuje się w pierwszym cyklu, do którego dodaje się chlorek potasu w ilości takiej, że końcowe stężenie nie przekracza 3 milimolowego, korzystnie 2 milimolowego; łączna ilość roztworu wynosi od 10 do 100 CV, korzystnie od 30 do 60 CV. Po przeprowadzeniu cyklów przemywania, prowadzi się fazę eluowania przy użyciu roztworu podobnego do roztworu stosowanego w pierwszym cyklu przemywania, z taką końcową ilością chlorku potasu, że jego stężenie nie jest niższe niż 10 milimolowe, korzystnie stężenie to jest od 15 do 25 milimolowe. Całkowita ilość roztworu stosowanego do eluowania waha się od 15 do 40 CV, korzystnie od 20 do 30 CV. Wszystkie roztwory i nanoszoną próbkę przeprowadza się przez kolumnę z szybkością liniową wynoszącą od 0,1 do 1,0 cm/minutę, korzystnie od 0,4 do 0,7 cm/minutę. W tych warunkach z kolumny eluuje się rifnα-2b z czystością wyższą niż 98%, gdy w wyjściowym roztworze czystość ta wynosiła około 40%, z wydajnością odzyskiwania pożądanego produktu wyższą niż 80%. Chromatograficzne wykresy produktu przed i po chromatograficznym oczyszczaniu przedstawiono na rysunkach fig. 1a i fig. 1b. Na rysunku fig. 1a przedstawia chromatograficzny wykres roztworu interferonu przed oczyszczaniem, zaś fig. 1b przedstawia chromatograficzny wykres po oczyszczaniu. Chromatograficzne wykresy wykonano za pomocą HPLC przy użyciu cieczowego chromatografu HP 1090, na kolumnie Vydac C18 z detektorem UV przy długości fali 214 nm. Eluowanie prowadzono przy szybkości przepływu 1 ml/minutę, stosując mieszaninę dwóch eluentów, eluentu A przygotowanego z 700 ml wody, 298 ml acetonitrylu i 2 ml kwasu trifluorooctowego, oraz eluentu B przygotowanego
10 PL 209 954 B1 z 198 ml wody, 800 ml acetonitrylu i 2 ml kwas trifluorooctowego. Te dwa eluenty mieszano w czasie eluowania zgodnie z ilościami podanymi w poniższej tabeli: Czas (minuty) % A % B 0 72 28 1 72 28 5 67 33 20 63 37 30 57 43 40 40 60 42 40 60 50 28 72 60 72 28 P r z y k ł a d III Proces prowadzi się sposobem opisanym w przykładzie II, przy użyciu buforowego roztworu przygotowanego z monozasadowego ftalanu potasu i wodorotlenku sodu. P r z y k ł a d IV Proces prowadzi się sposobem opisanym w przykładzie II, przy użyciu buforowego roztworu przygotowanego z dizasadowego cytrynianu sodu i wodorotlenku sodu. P r z y k ł a d V Proces prowadzi się sposobem opisanym w przykładzie II, przy użyciu buforowego roztworu przygotowanego z kwasu cytrynowego i dizasadowego fosforanu sodu. P r z y k ł a d VI Proces prowadzi się sposobem opisanym w przykładzie II, przy użyciu buforowego roztworu przygotowanego z imidazolu i kwasu chlorowodorowego. Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób oczyszczania białek interferonu, znamienny tym, że obejmuje przeprowadzanie kationowymiennej chromatografii na stałym nośniku przy wartości ph bardziej zasadowej niż ph odpowiadające punktowi izoelektrycznemu pl oczyszczanych białek, wartości ph przy której wymienione białka pozostają wciąż zaabsorbowane i eluowanie wymienionych białek poprzez zwiększanie mocy jonowej i/lub wartości ph wodnych roztworów buforowych. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wodne roztwory buforowe zawierają od 5 do 10 0 mm mieszanin buforujących wybranych spośród mieszanin; monozasadowego fosforanu potasu i dizasadowego fosforanu sodu, monozasadowego ftalanu potasu i wodorotlenku sodu, dizasadowego cytrynianu sodu i wodorotlenku sodu, kwasu cytrynowego i dizasadowego fosforanu sodu, imidazolu i kwasu chlorowodorowego. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że roztwory buforowe mogą zawierać sole organiczne lub nieorganiczne w stężeniu od 1 do 100 mm, zdolne do modyfikowania mocy jonowej roztworów. 4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że białkami interferonu są interferony alfa, beta, gamma, delta, omega, tau, naturalne alfa z leukocytów, rekombinowane alfa-2b i zgodne. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że oczyszcza się rekombinowany interferon alfa-2b, rifnα-2b, przy czym sposób obejmuje nanoszenie mieszaniny białkowej pochodzącej z fermentacji rifnα-2b, umieszczonej w 1 M roztworze octanu sodu o wartości ph doprowadzonej kwasem octowym do 5,5, na kolumnę wypełnioną silną kationowymienną żywicą, kondycjonowaną przy wartości ph 5,5 za pomocą roztworu octanu sodu o stężeniu 20 mm tak, aby nanieść pomiędzy 6 a 8 rag białka na każdy ml stacjonarnej fazy, poddawanie kolumny dwóm cyklom przemywania, pierwszemu za pomocą roztworu buforowego o wartości ph wynoszącej 6,1 przy stężeniu pomiędzy 5 a 15 mm, następnie przemywaniu tym samym roztworem buforowym z dodanym chlorkiem potasu w stężeniu 2 mm
PL 209 954 B1 11 oraz na koniec eluowanie czystego rifnα-2b z kolumny za pomocą roztworu buforowego o wartości ph 6,1 zawierającego chlorek potasu w stężeniu pomiędzy 15 a 25 mm. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że jako żywicę stosuje się mocny nośnik kationowymienny składający się z hydrofilowego polimeru z grupami kwasu sulfonowego usieciowanymi na membranie polieterowosulfonowej i mieszaniny buforowe wybiera się z następujących mieszanin: monozasadowy fosforan potasu i dizasadowy fosforan sodu, monozasadowy ftalan potasu i wodorotlenek sodu, dizasadowy cytrynian sodu i wodorotlenek sodu, kwas cytrynowy i dizasadowy fosforan sodu, imidazol i kwas chlorowodorowy. 7. Zastosowanie sposobu jak określono w zastrz. 1 do 6 do wytwarzania aktywnych substancji zawartych w preparatach leczniczych opartych na farmakologicznie aktywnych białkach. 8. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że białko interferonu jest rekombinowanym interferonem alfa-2b. Rysunki
12 PL 209 954 B1
PL 209 954 B1 13
14 PL 209 954 B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 4,92 zł (w tym 23% VAT)