(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (1) T3 Int.Cl. C12P 21/02 (06.01) C07K 14/6 (06.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 11/34 EP B1 (4) Tytuł wynalazku: Sposób oczyszczania interferonu beta (30) Pierwszeństwo: KR (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 06/36 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 11/12 (73) Uprawniony z patentu: CJ CheilJedang Corporation, Seoul, KR (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 JI-SOOK PARK, Seoul, KR JONG-SANG CHUNG, Seoul, KR MIN-JI BAEK, Yongin, KR JEE-WON AHN, Seoul, KR KI-WAN KIM, Seoul, KR HYUNG-KI PARK, Seoul, KR DONG-EOK LEE, Seoul, KR MYUNG-SUK OH, Suwon, KR (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Marta Kawczyńska POLSERVICE KANCELARIA RZECZNIKÓW PATENTOWYCH SP. Z O.O. ul. Bluszczańska Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 2 17/P28238PL00 EP Dziedzina techniki [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu oczyszczania ludzkiego interferonu beta z hodowli zawierającej rekombinowany ludzki interferon beta przy zastosowaniu chromatografii powinowactwa i wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami. Tło wynalazku [0002] Interferony w szerokim znaczeniu to zewnątrzkomórkowe przekaźniki pośredniczące w reakcjach gospodarzy i konserwowane ewolucyjnie rodziny białek, które są uwalniane w stosunkowo niewielkich ilościach z komórek. Interferony są uwalniane z komórek wytwarzających interferon w odpowiedzi na stymulację przez wirusy, dwuniciowe RNA, rozmaite mikroorganizmy lub cytokiny, takie jak TNF lub IL1, a następnie wiążą się z powierzchniami sąsiednich komórek poprzez receptory interferonów. Następnie interferony indukują syntezę różnych białek, aby utrzymać reaktywność i homeostazę gospodarzy poprzez następujące po sobie przekazywanie sygnałów. Dlatego interferony działają jako białka przeciwwirusowe, antyproliferacyjne i 2 przekazujące sygnały immunologiczne w organizmach oraz wywierają bezpośrednie wpływy antyproliferacyjne wobec

3 3 komórek nowotworowych, a zatem poświęcono im wiele uwagi jako środkom terapeutycznym [Postka S., Langer J. A. and Zoon K. C. (1987) Interferons and their actions, Annu. Rev. Biochem. 6: ]. [0003] Interferony należą do klasy heliakalnych, fizjologicznie aktywnych substancji. Według właściwości fizykochemicznych i działania, istnieją dwie klasy interferonów: typ 1 i 2. Interferon-alfa, -beta, -tau, i -epsilon są przedstawicielami interferonu typu 1 [Weissman C. and Weber H. (1986) The Interferon genes, Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 33: ], a interferon gamma jest przedstawicielem interferonu typu 2. Wśród nich, interferony beta należące do interferonu typu 1 to białka, które wykazują specyficzność gatunkową. Interferony beta są również nazywane interferonami fibroblastowymi ze względu na ich źródła i jako interferony stabilne w ph 2 biorąc pod uwagę właściwości biologiczne. Interferony beta wiążą się z tymi samymi receptorami na powierzchni komórek, razem z interferonami alfa należącymi do interferonu typu 1, a następnie indukują transkrypcję czynników przeciwwirusowych w odpowiedzi na system przekazywania następujących po sobie sygnałów w komórce. [0004] Interferony beta są glikoproteinami (około % 2 to reszta cukrowa) o masie cząsteczkowej około kda i jednołańcuchowymi białkami składającymi się ze 166

4 4 aminokwasów. Wiadomo, że jedno miejsce N-glikozylacji odgrywa rolę raczej w zwiększaniu stabilności lub rozpuszczalności materiału jako funkcjach fizykochemicznych niż w aktywności biologicznej lub antygenowości [Karpusas M., Whytty A., Runkel L., and Hochman P. The structure of human interferon- (3: implications for activity CMLS, 4: ]. [000] Postęp w technologii rekombinowania genetycznego umożliwił ustalenie sekwencji aminokwasowej ludzkiego interferonu beta oraz klonowanie i ekspresję ludzkiego interferonu beta w E. coli [Taniguchi, Gene : 11-, 1980]. Ponadto, opisano również ekspresję interferonu beta w komórkach jajnika chomika chińskiego (CHO) [USP4,966,843, USP,376,67 i USP,79,779]. [0006] Obecnie, interferony beta są wytwarzane poprzez technologię rekombinowania genów i są dostępne handlowo pod znakiem towarowym Betaserone, Avonex i Rebif. Wiadomo, że rekombinowane interferony beta są skuteczne w opóźnianiu postępu stwardnienia rozsianego u pacjentów z objawami choroby i łagodzeniu bólów w tej chorobie. Ponadto, rekombinowane interferony beta są szeroko stosowane jako środki terapeutyczne w stwardnieniu rozsianym i jednocześnie są skuteczne w nieswoistej regulacji ludzkiej odpowiedzi 2 immunologicznej, odpowiedzi immunologicznej wobec

5 zakażenia wirusowego i antyproliferacji komórek nowotworowych. [0007] Dostępne obecnie technologie oczyszczania rekombinowanych interferonów beta wyrażonych w komórkach CHO obejmują 3- procedur oczyszczania, w tym najpierw oczyszczanie poprzez chromatografię powinowactwa (USP4,278,661, USP4,289,689, USP4,41,92, USP4,808,23, itd.), chromatografię w oparciu o chelat metalu (USP4,27,938, USP4,39,389, USP4,41,92, USP,244,6, itd.), chromatografię z użyciem CPG (szkło o kontrolowanych porach) (USP4, 39,389, USP,066,786, USP,244,6, itd.) lub chromatografię z użyciem konkanawaliny A (USP4,289,689, USP4,68,017, itd.), a następnie chromatografię jonowymienną i chromatografię z odwróconymi fazami. [0008] W opisanych powyżej powszechnie stosowanych technologiach oczyszczania chromatografia w oparciu o chelat metalu może powodować zanieczyszczenie środowiska na skutek zastosowania metalu ciężkiego. Chromatografia z użyciem CPG lub konkanawaliny A ma słabą specyficzność oczyszczania. Mianowicie, chromatografia z użyciem konkanawaliny A oparta na wybiórczym wiązaniu z wieloma białkami zawierającymi łańcuch cukrowy zawartymi w hodowli komórek wykazuje 2 niską specyficzność. Kolumna CPG umożliwia rozdział w oparciu o wielkość cząsteczek po związaniu z białkiem.

6 6 Jednakże, wydajność rozdziału i czystość interferonów beta jest niższa niż tych uzyskanych z zastosowaniem chromatografii powinowactwa (np. kolumny chromatograficznej z Blue Sepharose). [0009] Ponadto powszechnie stosowane technologie oczyszczania poprzez chromatografię powinowactwa obejmują płukanie i wymywanie glikolem etylenowym przy zastosowaniu przeciwciała monoklonalnego i/lub złoża z barwnikiem. Jednakże, chromatografia powinowactwa przy zastosowaniu przeciwciała monoklonalnego wymaga odrębnego usunięcia nieglikozylowanych postaci interferonu beta, co sprawia, że produkcja na skalę masową jest trudna. Szczególnie, glikol etylenowy stosowany w etapach płukania i wymywania jest bardzo toksyczny dla organizmu, co ogranicza jego rzeczywiste zastosowanie do oczyszczania. [00] W międzyczasie, w patencie USA nr 4,483,849 ujawniono sposób oczyszczania i stabilizacji interferonu beta przy zastosowaniu glikolu propylenowego, zamiast toksycznego glikolu etylenowego, poprzez chromatografię powinowactwa. Sposób ujawniony w tym dokumencie patentowym obejmuje nakładanie hodowli zawierającej interferon na kolumnę powinowactwa z barwnikiem, taką jak zrównoważona kolumna Affi-Gel 2 Blue, płukanie kolumny przy użyciu 1,0 M roztworu buforowego NaCl/PO 4 i 1,0 M roztworu buforowego

7 7 NaCl/PO 4 zawierającego 40% glikolu propylenowego i wymywanie interferonu 0% glikolem propylenowym. Chociaż sposób według tego dokumentu patentowego obejmuje płukanie i wymywanie kolumny, pik pożądanego produktu końcowego i pik zanieczyszczenia współwystępują, obniżając przez to czystość. Ujawnienie wynalazku [0011] Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu oczyszczania interferonu beta, który obejmuje odzyskiwanie produktu pierwotnego oczyszczania interferonu beta o wysokiej czystości poprzez ulepszoną chromatografię powinowactwa z zastosowaniem nietoksycznego glikolu propylenowego, a następnie wysokosprawną chromatografię cieczową z odwróconymi fazami (RP-HPLC). [0012] A zatem, niniejszy wynalazek dostarcza sposobu oczyszczania ludzkiego interferonu beta z hodowli zawierającej rekombinowany ludzki interferon beta, obejmującego przeprowadzanie chromatografii powinowactwa i RP-HPLC, który obejmuje płukanie i wymywanie specyficznym roztworem buforowym. [0013] Według aspektu niniejszego wynalazku, dostarczony jest sposób oczyszczania ludzkiego interferonu beta z hodowli zawierającej rekombinowany 2 ludzki interferon beta poprzez chromatografię powinowactwa i RP-HPLC, w którym chromatografia

8 8 powinowactwa obejmuje: adsorbowanie hodowli zawierającej interferon beta na zrównoważonej kolumnie do chromatografii powinowactwa, a następnie płukanie roztworem buforowym do równoważenia; płukanie kolumny roztworem buforowym do płukania A o ph 6,-7, zawierającym 30-60% wag. glikolu propylenowego i roztworem buforowym do płukania B o ph 6,-7, zawierającym -30% wag. glikolu propylenowego i 1-2 M NaCl; oraz wymywanie frakcji zawierającej interferon beta roztworem buforowym o ph 6,-7, zawierającym 40-60% wag. glikolu propylenowego i 1-2 M NaCl. [0014] W sposobie oczyszczania według niniejszego wynalazku nieograniczające przykłady hodowli zawierającej rekombinowany ludzki interferon beta stosowanych jako próbka obejmują komórki i szczepy wytwarzające interferon beta. Na przykład, hodowlą zawierającą rekombinowany ludzki interferon beta może być hodowla otrzymana przy zastosowaniu znanej metody ujawnionej w Carter and Horoszewicz, Pharm. Ther. 8,39-377, 1980; Strander and Cantell, Ann. Med. Exp. Fenn. 44,26-273, 1966; Wheelock, Science, 149,3-311, 196, i tym podobnych. Korzystne jest, jeżeli hodowlą zawierającą rekombinowany ludzki interferon beta jest wolna od surowicy hodowla pochodząca z komórek jajnika 2 chomika chińskiego (CHO) wytwarzających rekombinowany ludzki interferon beta.

9 9 [00] W sposobie oczyszczania według niniejszego wynalazku kolumną do chromatografii powinowactwa stosowaną w chromatografii powinowactwa może być powszechnie stosowana kolumna powinowactwa z barwnikiem, na przykład kolumna (np. kolumna XK-0, Amersham biosciences, Szwecja) zapakowana Blue- Sepharose 6 (Amersham biosciences, Szwecja) lub kolumna Affi-Gel Blue (Bio-Rad, USA). Roztworem buforowym do równoważenia dla kolumny do chromatografii powinowactwa może być roztwór buforowy: fosforan sodowy-edta (ph około 7,2). Kolumna do chromatografii powinowactwa może być zrównoważona 3 objętościami kolumny (CV) roztworu buforowego do równoważenia, na przykład przy liniowej szybkości około -30 cm/h. [0016] W sposobie oczyszczania według niniejszego wynalazku chromatografia powinowactwa obejmuje adsorbowanie hodowli zawierającej interferon beta na zrównoważonej kolumnie do chromatografii powinowactwa i usuwanie białka związanego niespecyficznie poprzez płukanie roztworem buforowym do równoważenia. [0017] Chromatografia powinowactwa obejmuje również płukanie wielostopniowe, tj. płukanie kolumny roztworem buforowym do płukania A o ph 6,-7, zawierającym 30-60% wag. glikolu propylenowego i płukanie kolumny 2 roztworem buforowym do płukania B o ph 6,-7, zawierającym -30% wag. glikolu propylenowego i 1-2 M

10 NaCl. Korzystne jest, jeżeli chromatografia powinowactwa obejmuje ponadto płukanie roztworem buforowym do płukania C o ph 6,-7, zawierającym 1-2 M NaCl. Korzystne jest, jeżeli każde płukanie przeprowadza się przy użyciu 2-4 CV każdego roztworu buforowego. [0018] W sposobie oczyszczania według niniejszego wynalazku nie ma ograniczenia co do zastosowanej kolejności roztworów buforowych do płukania. Oznacza to, płukanie można przeprowadzić stosując roztwór buforowy do płukania A, a następnie roztwór buforowy do płukania B albo stosując roztwór buforowy do płukania B, a następnie roztwór buforowy do płukania A. Ponadto, płukanie można przeprowadzić stosując roztwór buforowy do płukania A, roztwór buforowy do płukania C, a następnie roztwór buforowy do płukania B albo stosując roztwór buforowy do płukania B, roztwór buforowy do płukania C, a następnie roztwór buforowy do płukania A. Płukanie roztworem buforowym do płukania A skutecznie usuwa zanieczyszczenia o wysokiej hydrofobowości, płukanie roztworem buforowym do płukania C usuwa zanieczyszczenia hydrofilowe, a płukanie roztworem buforowym do płukania B usuwa zanieczyszczające białka. [0019] Odzyskiwanie interferonu beta można 2 przeprowadzić poprzez wymywanie frakcji zawierającej ludzki interferon beta roztworem buforowym o ph 6,-7,

11 11 zawierającym 40-60% wag. glikolu propylenowego i 1-2 M NaCl, korzystnie, 0% wag. glikolu propylenowego i 1-2 M NaCl. [00] Korzystnie, każdym roztworem buforowym stosowanym do płukania i wymywania może być roztwór buforowy fosforanu sodu albo roztwór buforowy fosforanu potasu. [0021] W sposobie oczyszczania według niniejszego wynalazku płukanie roztworem buforowym zawierającym około 0% glikolu propylenowego umożliwia wydajne usunięcie pików zanieczyszczeń, co stanowi kontrast w stosunku do sposobu ujawnionego w patencie USA 4,483,849, w którym płukanie i wymywanie przeprowadza się stopniowym gradientem stężenia glikolu propylenowego. [0022] W sposobie oczyszczania według niniejszego wynalazku po opisanej powyżej chromatografii powinowactwa następuje RP-HPLC. Korzystne jest, jeżeli przed przeprowadzeniem RP-HPLC, wymyty roztwór z chromatografii powinowactwa podlega diafiltracji przy użyciu błony ultrafiltracyjnej z wartością odcięcia masy cząsteczkowej wynoszącą 000. Poprzez diafiltrację, interferon beta o stosunkowo wysokim stężeniu soli można doprowadzić do odpowiedniego 2 stężenia soli.

12 12 [0023] RP-HPLC przeprowadza się jak następuje: próbkę otrzymaną poprzez diafiltrację nakłada się na kolumnę, a następnie frakcję zawierającą ludzki interferon beta wymywa się przy ph 2- gradientem stężenia etanolu zawierającego HCl. Dokładnie, kolumnę równoważy się 0,1% HCl zawierającym 0,1-%, korzystnie % lub mniej glikolu propylenowego, a następnie próbkę otrzymaną poprzez diafiltrację, zawierającą 0,1-%, korzystnie % lub mniej glikolu propylenowego nakłada się na kolumnę. Następnie kolumnę płucze się 0,1% HCl i frakcje zawierające interferon beta wymywa się liniowym gradientem stężenia od 30-0%, korzystnie 4% etanolu zawierającego 0,1% HCl do 6-90%, korzystnie 70% etanolu zawierającego 0,1% HCl. [0024] Kolumną do RP-HPLC może być kolumna z białkiem C4 (Protein C4) (wielkość ziaren złoża m, wielkość porów 30 Å, Vydac) i może być ona zrównoważona około CV 0,1% roztworu HCl zawierającego glikol propylenowy. W RP-HPLC umożliwia się przepływ próbki otrzymanej poprzez diafiltrację przez zrównoważoną kolumnę przy odpowiedniej szybkości przepływu, płucze się 3 CV lub więcej 0,1% roztworu buforowego HCl i wymywa się liniowym gradientem stężenia około - CV etanolu zawierającego 0,1% HCl aby rozdzielić w ten sposób 2 białka zanieczyszczające i białka docelowe.

13 13 [002] Frakcję zawierającą interferon beta otrzymaną poprzez RP-HPLC można ponadto poddać wymianie na świeży roztwór buforowy. Wymianę na świeży roztwór buforowy można przeprowadzić poprzez sączenie molekularne albo zatężanie i diafiltrację. [0026] Na przykład, w przypadku przeprowadzania sączenia molekularnego frakcje zawierające interferon beta otrzymane poprzez RP-HPLC zatęża się na przykład do g/ml, dializuje przy użyciu -0 mm roztworu buforowego octanu sodu (ph 3,-,) i nakłada na kolumnę do chromatografii poprzez sączenie molekularne (np. Sephacryl S-0, Amersham biosciences) zrównoważoną -0 mm, korzystnie mm roztworem buforowym octanu sodu (ph 3,-,). Następnie umożliwia się przepływ przez kolumnę -0 mm roztworu buforowego octanu sodu (ph 3,-,) przy odpowiedniej szybkości przepływu, czego wynikiem jest zastąpienie roztworu dla docelowych białek oraz rozdział i usunięcie polimerów. [0027] Schemat blokowy ilustrujący sposób oczyszczania według niniejszego wynalazku jest pokazany na Fig. 1. Krótki opis figur [0028] FIG. 1 to wykres ilustrujący sposób oczyszczania według 2 niniejszego wynalazku.

14 14 FIG. 2 to chromatogram z analizy RP-HPLC C4 interferonu beta wymytego w chromatografii powinowactwa zgodnie ze sposobem oczyszczania według niniejszego wynalazku. FIG. 3 to chromatogram z analizy RP-HPLC C4 interferonu beta wymytego bez płukania 0% glikolem propylenowym. FIG. 4A i 4B to, odpowiednio, chromatogram z analizy RP-HPLC C4 roztworu buforowego z sączenia molekularnego i chromatogram z analizy RP-HPLC C4 wymytego roztworu po sączeniu molekularnym. Najlepszy sposób wykonywania wynalazku [0029] Niniejszy wynalazek będzie tu dalej opisany bardziej szczegółowo poprzez Przykłady. Jednakże następujące dalej Przykłady są dostarczone jedynie dla ilustracji, a zatem niniejszy wynalazek nie jest do nich ani przez nie ograniczony. Przykład 1: chromatografia powinowactwa [0030] 30 ml Blue-Sepharose 6 (Amersham biosciences, Szwecja) upakowano na kolumnie XK-0 (Amersham biosciences, Szwecja) aby przygotować kolumnę do chromatografii powinowactwa. Umożliwiono przepływ mm roztworu buforowego fosforanu sodu zawierającego 1 mm EDTA, dostateczny aby zrównoważyć kolumnę. Następnie 2 umożliwiono przepływ przez kolumnę 2 l wolnej od surowicy hodowli komórek jajnika chomika chińskiego

15 (CHO) zawierającej interferon beta, przy szybkości przepływu - ml/min, a następnie kolumnę płukano około 3 objętościami kolumny (CV) roztworu buforowego do równoważenia. [0031] Aby usunąć zanieczyszczające białka umożliwiono przepływ przez kolumnę około 3 CV mm roztworu buforowego fosforanu sodu (ph 7,2) zawierającego 0% glikolu propylenowego, z szybkością przepływu ml/min, a następnie płukano około 3 CV roztworu buforowego do równoważenia. Następnie, aby usunąć zanieczyszczające białka umożliwiono przepływ przez kolumnę około 3 CV mm roztworu buforowego fosforanu sodu (ph 7,2) zawierającego 2 M NaCl, z szybkością przepływu ml/min. Na koniec, aby usunąć zanieczyszczające białka umożliwiono przepływ przez kolumnę około 3 CV mm roztworu buforowego fosforanu sodu (ph 7,2) zawierającego 2 M NaCl i % glikolu propylenowego, z szybkością przepływu ml/min. [0032] Umożliwiono przepływ przez kolumnę około 3 CV roztworu buforowego do wymywania ( mm roztworu buforowego fosforanu sodu zawierającego 2 M NaCl i 0% glikolu propylenowego, ph 7,2), z szybkością przepływu ml/min, aby odzyskać w ten sposób roztwór zawierający interferon beta. Czystość odzyskanego w ten sposób 2 wymytego roztworu mierzono przy zastosowaniu analizy chromatograficznej HPLC C4 a wyniki pokazano na FIG. 2.

16 16 Jak widać na FIG. 2, czystość interferonu beta wynosiła około 8% lub więcej. [0033] Jako kontrolę przeprowadzono chromatografię powinowactwa zgodnie z opisanym powyżej sposobem z tą różnicą, że pominięto płukanie mm roztworem buforowym fosforanu sodu (ph 7,2) zawierającym 0% glikolu propylenowego. Czystość otrzymanego w ten sposób wymytego roztworu mierzono przy zastosowaniu analizy chromatograficznej C4 HPLC a wyniki pokazano na FIG. 3. Jak widać na FIG. 3, brak płukania mm roztworem buforowym fosforanu sodu (ph 7,2) zawierającym 0% glikolu propylenowego wyraźnie zmniejsza czystość interferonu beta. Przykład 2: wysokosprawna chromatografia cieczowa z odwróconymi fazami (RP-HPLC) [0034] Roztwór zawierający interferon otrzymany zgodnie z niniejszym wynalazkiem w Przykładzie 1 został poddany diafiltracji przy zastosowaniu systemu ultrafiltracji (z wartością odcięcia masy cząsteczkowej wynoszącą 000), a następnie nałożony na kolumnę RP-HPLC (Protein C4, wielkość ziaren m, wielkość porów 30 Å, Vydac) przy szybkości przepływu 2 ml/min. Kolumnę płukano następnie około 3 CV 0,1% roztworu buforowego HCl (ph 2 2,1). Wymywanie interferonu beta przeprowadzono przy użyciu roztworu (A) - 0,1% HCl i roztworu (B) - 0,1%

17 17 HCl w 90% etanolu jako liniowego gradientu stężenia od 4% roztworu (B) do 80% roztworu (B) (około CV), aby oddzielić w ten sposób białka zanieczyszczające od białek docelowych. Przykład 3: Chromatografia poprzez sączenie molekularne [003] Roztwór zawierający interferon beta otrzymany w Przykładzie 2 zatężono do 0 g/ml i zastąpiono 00 razy lub więcej mm roztworem buforowym octanu sodu (ph 4,0). Otrzymany w rezultacie roztwór nałożono na kolumnę Sephacryl S-0 (1700 ml, XK-0/0, Amersham biosciences, Szwecja) zrównoważoną mm roztworem buforowym octanu sodu (ph 4,0), aby otrzymać roztwór zawierający interferon beta. Przykład 4: Analiza RP-HPLC [0036] Każdy roztwór otrzymany w Przykładach 1, 2 i 3 nałożono na kolumnę RP-HPLC C4 (Vydac 214TP4, 4,6 mm średnicy wewnętrznej x 2 cm długości, wielkość cząstek - m, wielkość porów 300 Å) przy szybkości przepływu 1 ml/min. Następnie umożliwiono przepływ przez kolumnę CV acetonitrylu zawierającego 0,1% kwasu trifluorooctowego poprzez liniowy gradient stężenia od 30% acetonitrylu zawierającego 0,1% kwasu 2 trifluorooctowego do 80% acetonitrylu zawierającego

18 18 0,1% kwasu trifluorooctowego, w celu analizy wzorów chromatogramu. [0037] FIG. 4A i 4B pokazują, odpowiednio, analizę chromatogramu RP-HPLC C4 dla roztworu buforowego z chromatografii poprzez sączenie molekularne i analizę chromatogramu RP-HPLC C4 dla wymytego roztworu po chromatografii poprzez sączenie molekularne. Na FIG. 4A i 4B, można zobaczyć, że niniejszy wynalazek może dawać interferon beta o wysokiej czystości. Stosowalność przemysłowa [0038] Zgodnie ze sposobem oczyszczania według niniejszego wynalazku, interferon beta może być oczyszczany do wysokiej czystości 99% lub większej przy zastosowaniu nietoksycznego glikolu propylenowego i ulepszonej chromatografii powinowactwa.

19 19 Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób oczyszczania ludzkiego interferonu beta z hodowli zawierającej rekombinowany ludzki interferon beta, obejmujący przeprowadzanie chromatografii powinowactwa i wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (RP-HPLC), w którym chromatografia powinowactwa obejmuje: adsorbowanie hodowli zawierającej interferon beta na zrównoważonej kolumnie do chromatografii powinowactwa, a następnie płukanie roztworem buforowym do równoważenia; następnie płukanie kolumny pierwszym roztworem buforowym do płukania A o ph 6,-7, zawierającym 30-60% wag. glikolu propylenowego; następnie płukanie kolumny drugim roztworem buforowym do płukania C o ph 6,-7, zawierającym 1-2 M NaCl; następnie płukanie kolumny trzecim roztworem buforowym do płukania B o ph 6,-7, zawierającym - 30% wag. glikolu propylenowego i 1-2 M NaCl; a następnie wymywanie frakcji zawierającej interferon beta roztworem buforowym o ph 6,-7, zawierającym 40-60% wag. glikolu propylenowego i 1-2 M 2 NaCl.

20 2. Sposób według zastrz. 1, w którym każdym roztworem buforowym stosowanym do płukania i wymywania jest roztwór buforowy fosforanu sodu albo roztwór buforowy fosforanu potasu. 3. Sposób według zastrz. 1, w którym roztwór otrzymany poprzez chromatografię powinowactwa poddaje się diafiltracji przy użyciu błony ultrafiltracyjnej z wartością odcięcia masy cząsteczkowej wynoszącą 000 daltonów przed RP-HPLC. 4. Sposób według zastrz. 3, w którym w RP-HPLC próbkę otrzymaną poprzez diafiltrację nakłada się na kolumnę, a następnie frakcję zawierającą ludzki interferon beta wymywa się przy ph 2- gradientem stężenia etanolu zawierającego HCl. CJ CheilJedang Corporation Pełnomocnik: 2

21 21

22

23 23 2

24

25 2