SPECJALNE TECHNIKI ROZDZIELANIA W BIOTECHNOLOGII. Laboratorium nr1 CHROMATOGRAFIA ODDZIAŁYWAŃ HYDROFOBOWYCH

Transkrypt

1 SPECJALNE TECHNIKI ROZDZIELANIA W BIOTECHNOLOGII Laboratorium nr1 CHROMATOGRAFIA ODDZIAŁYWAŃ HYDROFOBOWYCH Opracowała: dr inż. Renata Muca I. WPROWADZENIE TEORETYCZNE Chromatografia oddziaływań hydrofobowych (HIC) jest szeroko wykorzystywana do separacji i oczyszczania makrocząsteczek białkowych w biotechnologii i przemyśle farmaceutycznym. Białka posiadają skomplikowaną strukturę wewnętrzną, w której można wyróżnić zarówno obszary hydrofilowe eksponowane na zewnątrz cząsteczki w polarnym otoczeniu wody, jak i obszary hydrofobowe ukryte w jej wnętrzu i eksponowane na zewnątrz przy zmianie środowiska na niepolarne. Ilość takich obszarów hydrofobowych, jak też różne umiejscowienie w strukturze cząsteczki stanowią indywidualną cechę makrocząsteczek. Odmienne właściwości hydrofobowe białek umożliwiają ich rozdział metodą HIC. Mechanizm chromatografii HIC polega na adsorpcji białek na złożu dzięki występowaniu oddziaływań pomiędzy hydrofobowymi fragmentami białka a silnie hydrofobowymi grupami ligandów, trwale umocowanych na powierzchni matrycy pozbawionej ładunku elektrycznego. W środowisku wodnym zarówno ligandy (P ) jak i hydrofobowe fragmenty rozdzielanych białek (P) otoczone są uporządkowanymi cząsteczkami wody tworząc układ o bardzo niekorzystnej entropii S (rys.1). Niewielki dodatek soli powoduje oddanie roztworowi uwolnionych cząsteczek wody, a więc prowadzi do wzrostu entropii S > 0. Wynikiem tego jest asocjacja hydrofobowych fragmentów matrycy i białka. 1

2 Rys.1 Mechanizm chromatografii oddziaływań hydrofobowych. Na rozdzielczość i selektywność metody, a także na zdolność wiązania cząsteczek przez złoże ma wpływ wiele czynników. Do najważniejszych z nich należą: typ liganda oraz jego gęstość na powierzchni nośnika, rodzaj nośnika (matrycy), rodzaj i stężenie soli, ph roztworu, temperatura, skład solwentów. Typ liganda Typ liganda unieruchomionego na nośniku determinuje sposób adsorpcji i rozdział makrocząsteczek. Ligandy będące liniowymi łańcuchami alkilowymi (węglowodorowymi) wykazują zdolność do czysto hydrofobowego oddziaływania. Natomiast ligandy arylowe mają mieszane własności, ponieważ oddziałują zarówno przez liniowe fragmenty łańcucha, jak i wykorzystują wiązania z aromatycznych pierścieni grup arylowych (π π). Wśród najczęściej używanych ligandów wyróżniamy (rys.3): alkilowe: butylowe, oktylowe, arylowe: fenylowe, polimery: PEG, PPG glikol polietylenowy, glikol polipropylenowy. 2

3 Gęstość powierzchniowa liganda Pojemność chłonna złoża rośnie wraz ze wzrostem gęstości powierzchniowej unieruchomionego liganda ze względu na większe prawdopodobieństwo tworzenia połączeń między białkiem a ligandem. Rodzaj i stężenie soli Rodzaj i stężenie soli bardzo silnie wpływają na oddziaływanie białko ligand w chromatografii hydrofobowej. Sole kosmotropowe wzmagają siłę oddziaływań hydrofobowych, podczas gdy sole chaotropowe osłabiają oddziaływania i ułatwiają desorpcję. Ilość wiązanego białka przez unieruchomione ligandy zależy od stężenia soli kosmotropowych i wzrasta ze wzrostem jej stężenia. Początkowo wzrost ten jest liniowy, ale powyżej pewnego stężenia ilość białka wiązanego przez ligandy wzrasta wykładniczo. Wykładniczy wzrost ilości wiązanego białka obserwuje się przy stężeniu soli, w którym zachodzi jego wysalanie. Proteina zostaje wówczas zatrzymana w kolumnie chromatograficznej. Poza stężeniem soli również jej rodzaj ma duży wpływ na efektywność i selektywność rozdziału makromolekuł. Wpływ różnych soli na siłę oddziaływań hydrofobowych wynika z liotropowego szeregu Hofmeistera. Najbardziej skuteczne w promowaniu oddziaływań białko ligand są sole: siarczan amonu, siarczan sodu i siarczan potasu wywołujące silny efekt wysalania białka. Wpływ wartości ph ph fazy stacjonarnej jest ważnym czynnikiem wpływającym na zachowanie się białka w HIC. Zazwyczaj wzrost ph (do wartości 9 10) zmniejsza oddziaływania hydrofobowe między białkiem a hydrofobowymi ligandami z uwagi na zwiększoną hydrofilowość promowaną przez zmianę ładunku białka. Z drugiej strony, spadek ph powoduje wyraźny wzrost oddziaływań hydrofobowych. Jednakże literatura podaje, że budowa oraz właściwości białka zmieniają się przy wartości ph powyżej 8,5 i poniżej 5. W zakresie ph 5 8,5 można mówić o wyższej stabilności formy natywnej białka. Ponieważ każde białko inaczej zachowuje się w różnych wartościach ph, parametr ten powinien być stosowany w optymalizacji rozdziału białek metodą HIC. 3

4 Wpływ temperatury Temperatura odgrywa istotną rolę we właściwym przeprowadzeniu rozdziału metodą HIC. Oddziaływania hydrofobowe białek z hydrofobowym ligandem mają charakter sił van der Waalsa, które są zależne od temperatury. Zwykle im wyższa temperatura, tym oddziaływania hydrofobowe są silniejsze, co wiąże się ze wzrostem współczynnika retencji proteiny w kolumnie chromatograficznej. Skład fazy ruchomej Skład fazy ruchomej może decydować zarówno o sile oddziaływań hydrofobowych makromolekuł z hydrofobowym ligandem, jak i o selektywności tych oddziaływań. Niewielki dodatek polarnych alkoholi, detergentów oraz chaotropów zdecydowanie obniża siłę wiązania białka z ligandami, poprzez konkurencję o miejsca wiążące na ligandzie. II. CEL ĆWICZENIA Celem ćwiczenia jest przedstawienie zastosowania chromatografii oddziaływań hydrofobowych w rozdzielaniu i oczyszczaniu mieszanin białek. III. CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA III.1. SPRZĘT LABORATORYJNY I ODCZYNNIKI 1. Sprzęt laboratoryjny Chromatograf Äkta prime plus z detektorami: konduktometrycznym i spektrofotometrycznym UV (GE Healthcare Life Sciences, Szwecja). Kolumna analityczna upakowana złożem Butyl Sepharose 4FF (GE Healthcare Life Sciences, Szwecja) o długości L=4cm i średnicy d=4mm 2. Odczynniki Mioglobina ( z mięśnia szkieletowego konia) Lizozym (z białka jaja kurzego) Bufor fosforanowy o ph=7 1.7 M roztwór siarczanu amonu o ph=7 III.2. OPIS ĆWICZENIA Omówienie układu chromatograficznego (typ kolumny chromatograficznej, zastosowana faza ruchoma, mieszaniny białek). 4

5 Przygotowanie potrzebnych roztworów, uruchomienie sprzętu, kondycjonowanie kolumny chromatograficznej. Wykonanie pomiarów: a) wykonanie chromatogramu mieszaniny dwóch białek: lizozymu i mioglobiny w trybie elucji izokratycznej. Warunki przebiegu elucji chromatograficznej: faza ruchoma 70% [v/v] roztwór siarczanu amonu, objętość nastrzyku mieszaniny białek 100µl, przepływ fazy ruchomej 1ml/min, temperatura pokojowa. b) wykonanie chromatogramu w/w mieszaniny białek w trybie elucji gradientowej (gradient skokowy) składu fazy ruchomej. Warunki przebiegu elucji chromatograficznej: faza ruchoma 80% roztwór siarczanu amonu zmieniony na 0%[v/v], objętość nastrzyku mieszaniny białek 100µl, przepływ fazy ruchomej 1ml/min, temperatura pokojowa. Omówienie uzyskanych wyników oraz porównanie dwóch technik prowadzenia procesu chromatografii oddziaływań hydrofobowych. LITERATURA 1. D. Antos, K. Kaczmarski, W. Piątkowski, Chromatografia preparatywna jako proces rozdzielania mieszanin, Wydawnictwo WNT, Warszawa (2011) 2. G. Carta, A. Jungbauer, Protein Chromatography. Process Development and Scale Up, Wiley VCH, Weinheim (2010) 3. Hydrophobic Interaction Chromatography Principles and Methods, Amersham Pharmacia Biotech, Edition AB (2000) 4. J.J. Kirkland, Współczesna chromatografia cieczowa Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa (1976) 5. B. Walkowiak, Techniki chromatografii cieczowej. Przykłady zastosowań, Amersham Pharmacia Biotech. MORPOL, Lublin (2000) 5