EKSTRAHOWANIE KWASÓW NUKLEINOWYCH JAK ZMIERZYĆ ILOŚĆ KWASÓW NUKLEINOWYCH PO IZOLACJI? JAK ZMIERZYĆ ILOŚĆ KWASÓW NUKLEINOWYCH PO IZOLACJI?

Wielkość: px

Rozpocząć pokaz od strony:

Download "EKSTRAHOWANIE KWASÓW NUKLEINOWYCH JAK ZMIERZYĆ ILOŚĆ KWASÓW NUKLEINOWYCH PO IZOLACJI? JAK ZMIERZYĆ ILOŚĆ KWASÓW NUKLEINOWYCH PO IZOLACJI?"

Kamil Jankowski
6 lat temu
Przeglądów:

1 EKSTRAHOWANIE KWASÓW NUKLEINOWYCH Wytrącanie etanolem Rozpuszczenie kwasu nukleinowego w fazie wodnej (met. fenol/chloroform) Wiązanie ze złożem krzemionkowym za pomocą substancji chaotropowych: jodek sodu, nadchloran sodowy (met. kolumienkowa) Wiązanie dwudodatnich jonów metali (kofaktory enzymów np. DNaz) przez substancje chelatujace podczas gdy kwas nukleinowy uwalniany jest do roztworu (metoda z wykorzystaniem cheleksu) Wiązanie kwasów nukleinowych na dodatnie naładowanych magnesach (metoda z wykorzystaniem kulek magnetycznych) Podstawowe miary masy i objętości stosowane przy oznaczaniu ilości kwasów nukleinowych : 1g (1) 1l (1) 1mg (1g x 10-3 ) 1ml (1l x 10-3 ) 1μg (1g x 10-6 ) 1μl (1l x 10-6 ) 1ng (1g x 10-9 ) 1pg (1g x ) NUKLEINOWYCH PO IZOLACJI? Przybliżone szacowanie izolowanego DNA: 1 komórka ludzka zawiera ok. 6pg DNA; jeśli próbka zawiera przeciętnie 10 7 komórek, a wydajność izolacji szacujemy na poziomie 80%, to powinniśmy otrzymać ok 48mg DNA Metoda nieskuteczna! - różne rodzaje tkanek będą zawierały różną liczbę komórek; - stopień degradacji DNA w komórkach może być różny; - trudno jest określić faktyczną wydajność stosowanej metody bez odniesienia do kalibratora- żywej komórki 1

2 NUKLEINOWYCH PO IZOLACJI? Przybliżone szacowanie izolowanego DNA: krew obwodowa (20-60μg/ml) surowica ( μg/ml) tkanka kostna (2-25μg/mg) nabłonek jamy ustnej w ślinie (5-15μg/ml) W przypadku RNA, metoda ta jest w ogóle niemożliwa, ponieważ nie znamy ilości RNA (niskocząsteczkowego) w komórce oraz nie jesteśmy w stanie określić stopnia degradacji RNA od momentu pobrania tkanki do zakończenia izolacji. Spektrofotometryczny pomiar stężenia DNA lub RNA: Spektrofotometria absorpcyjna w ultrafiolecie to selektywna absorpcja/absorbancja promieniowania elektromagnetycznego przez substancjęw tym przypadku cząsteczki kwasu nukleinowego Cząsteczki DNA i RNA absorbują światło ultrafioletowe o długości 260nm Miernikiem absorpcji jest gęstość optyczna (OD)- optical density mierzona na fotodetektorze OD= log Intensywność światła emitowanego (padającego na detektor) Intensywność światła przechodzącego przez detektor 1 OD/A 260 = 50µg/ml dwuniciowej cząsteczki DNA 1 OD/A 260 = 40µg/ml jednoniciowej cząsteczki RNA 1 OD/A 260 = 37µg/ml jednoniciowej cząsteczki DNA W pomiarze spektrofotometrycznym cząsteczki DNA oraz RNA są nierozróżnialne!!! 2

Dodatkowy pomiar absorpcji fali daje możliwość wykrycia zanieczyszczeń w próbce: 230nm (absorbowana przez związki organiczne: fenole; alkohole; izocyjanki) 280nm (absorbowana przez

3 Dodatkowy pomiar absorpcji fali daje możliwość wykrycia zanieczyszczeń w próbce: 230nm (absorbowana przez związki organiczne: fenole; alkohole; izocyjanki) 280nm (absorbowana przez białka) 340nm (zanieczyszczenie próbki substancjami inne niż wymienione) Prawidłowy wykres absorpcji uzyskany w spektrofotometrycznym pomiarze próbki zawierającej kwas nukleinowy 3

4 Iloraz OD/A 260 i OD/A 280 lub OD/A 260 i OD/A 230 (ratio) pozwala oszacować czystość kwasów nukleinowych Prawidłowa wartość Ratio A 260 /A 280 oraz A 260 /A 230 dla DNA zawiera się między Ratio A 260 /A 280 = 2.0 informuje, że maksymalna absorpcja fali przez kwasy nukleinowe (A 260 ) jest 2x większa niż absorpcja fali przez zanieczyszczenia w próbce (czyli, kwasu nukleinowego jest w próbce 200% więcej niż zanieczyszczeń) Prawidłowa wartość Ratio A 260 /A 280 oraz A 260 /A 230 dla RNA zawiera się między Poszczególne oligonukleotydy (w czystej postaci) będą wykazywały różne wartości Ratio A 260 /A 280 : GTP TTP CTP UTP ATP Ratio: A 260 /A 280 =1.8 A 260 /A 230 =2.0 Ratio: A 260 /A 280 =2.0 A 260 /A 230 =0.5 etanol Ratio A 260 /A 280 =1.5 A 260 /A 230 =1.0 fenol/trizol Ratio A 260 /A 280 =0.5 A 260 /A 230 =3.5 EDTA 4

5 Fluorymetryczny pomiar stężenia DNA lub RNA (spektroskopia fluorescencyjna): oddziaływane fotonów z molekułami powoduje wzbudzenie elektronów walencyjnych. Wzbudzone elektrony spontanicznie powracają do stanu podstawowego, emitując nadmiar energii w postaci światła Związki fluorescencyjne (znaczniki fluorescencyjne) wiążą się specyficznie z DNA i/lub RNA emitując światło o określonej długości Miernikiem emisji jest wydajność kwantowa (Q)- mierzona na fotodiodzie Q= Liczba wyemitowanych fotonów Liczba zabsorbowanych fotonów Bromek etydyny (pochodna akrydyny); DNA (RNA) λabs=493nm; λem=620nm λ- widmo= długość fali, dla której fluorescencja jest największa Hoechst (pochodna bisimidazolu); DNA mniejszy rowek helisy λabs=350nm; λem=461nm Reaktywna pochodna cząsteczki fluorescencyjnejfluorofor selektywnie wiąże się ze specyficznym regionem lub grupą funkcyjną w cząsteczce docelowej, może być przyłączony chemicznie lub biologicznie - W pomiarze fluorymetrycznym cząsteczki DNA oraz RNA są rozróżnialne!!! - Pomiar jest ponad 1000 x czulszy niż spektroskopia - Pomiar nie pozwala wykryć zanieczyszczeń 5

Podobne dokumenty

SKUTECZNOŚĆ IZOLACJI JAK ZMIERZYĆ ILOŚĆ KWASÓW NUKLEINOWYCH PO IZOLACJI? JAK ZMIERZYĆ ILOŚĆ KWASÓW NUKLEINOWYCH PO IZOLACJI?

SKUTECZNOŚĆ IZOLACJI JAK ZMIERZYĆ ILOŚĆ KWASÓW NUKLEINOWYCH PO IZOLACJI? JAK ZMIERZYĆ ILOŚĆ KWASÓW NUKLEINOWYCH PO IZOLACJI? SKUTECZNOŚĆ IZOLACJI Wydajność izolacji- ilość otrzymanego kwasu nukleinowego Efektywność izolacji- jakość otrzymanego kwasu nukleinowego w stosunku do ilości Powtarzalność izolacji- zoptymalizowanie procedury