DHPLC. Denaturing high performance liquid chromatography. Wiktoria Stańczyk Zofia Kołeczko

Transkrypt

1 DHPLC Denaturing high performance liquid chromatography Wiktoria Stańczyk Zofia Kołeczko

2 Mini-słowniczek SNP (Single Nucleotide Polymorphism) - zmienność sekwencji DNA; HET - analiza heterodupleksów; HPLC - chromatografia cieczowa; PCR - reakcja łańcuchowa polimeryzacji; amplikon - fragment DNA powstały w wyniku amplifikacji.

3 Cel metody - Porównanie dwóch lub większej liczby chromosomów za pomocą mieszaniny zdenaturowanych amplikonów PCR, które pozwala na detekcję mutacji dzięki różnej retencji homo- lub heterodupleksów DNA w układzie odwróconej fazy. - Można znajdować substytucje pojedynczych nukleotydów, krótkie insercje i delecje oraz polimorfizmy pojedynczych nukleotydów (SNPs), - Temperatura wpływa tu na czułość detekcji i jej wartość optymalna może być wyznaczana metodami komputerowymi.

4 Faza stacjonarna Stanowią ją alkilowane nieporowate cząstki kopolimeru polistyrenu i poliwinylobenzenu, o średnicy 2-3 mikrometrów (DNASep) Umożliwia rozdzielenie cząsteczek kwasów nukleinowych przy pomocy chromatografii par jonowych, z zastosowaniem układu odwróconej fazy.

5 Separacja DNA Stosuje się hydroorganiczny eluent (związek wymywający), zawierający amfifilowe jony, np. trietyloamonowe, pochodzące z octanu trietyloaminowego (TEAA). Dodatnio naładowane jony trietyloamonowe są adsorbowane między niepolarną fazę stacjonarną, a hydroorganiczną fazę ruchomą, co prowadzi do pojawienia się dodatniego ładunku powierzchniowego. Wielkość tego ładunku zależy od wielu czynników, tj. temperatury, siły jonowej, stałej dielektrycznej fazy mobilnej, itd.

6 Separacja DNA Retencja cząsteczek dsdna będzie zależeć od siły oddziaływań elektrostatycznych między dodatnio naładowaną powierzchnią fazy stacjonarnej, której ładunek zawdzięcza związanym jonom trietyloamonowym, z ujemnie naładowanymi grupami fosforanowymi cząsteczek DNA. Wymywanie odbywa się na skutek zwiększania stężenia rozpuszczalnika organicznego, np. acetonitrylu w fazie mobilnej, co skutkuje desorpcją dodatnio naładowanych jonów, a w konsekwencji i dsdna.

7 Detekcja heterodupleksów Heterodupleksy charakteryzują się mniejszą stabilnością niż homodupleksy, przez co nawet częściowa ich denaturacja pozwala na uzyskanie znacznej różnicy w retencji. Ta niestabilność wynika z obecności naprzeciw siebie niekomplementarnych zasad. Heterodupleksy zawierające parę G-T będą pozostawały w układzie dłużej niż heterodupleksy z parą A-C, ponieważ otaczające ją inne pary zasad bardziej stabilizują cząsteczkę.

8 Przebieg metody DHPLC C.swf

9

10 Wpływ ilości TEAA i temperatury Zwiększenie stężenia TEAA w fazie ruchomej skutkowało koniecznością podniesienia temperatury w celu efektywnej denaturacji. Nie zwiększyło to rozdzielczości metody. Niektóre mutacje są wykrywane tylko przy zastosowaniu określonej wartości temperatury.

11 Multipleksowe wykrywanie mutacji

12 DHPLC w warunkach całkowicie denaturujących DHPLC w warunkach częściowo denaturujących niesie ze sobą problemy: - mieszanie badanego genomu z referencją przed analizą - dodatkowe metody są drogie Rozwiązanie: dzięki całkowitej denaturacji DHPLC rozwija się pojedyncze kwasy nukleinowe jako funkcję ich składu, a nie wielkości.

13 Kolejność wypłukiwania kwasów nukleinowych czas wypłukiwania Cytozyna hydrofilowa Guanina grupa karbonylowa i aminowa Adenina grupa aminowa Tymina grupa metylowa; hydrofobowa

14 Zastosowanie - mapowanie genów (Arabidopsis thaliana), - badanie wzajemnego wpływu wad genetycznych, - detekcja metylacji, - analiza ilościowa ekspresji genów, - szukanie w genach mutacji, które mogą wywołać chorobę nowotworową,

15 Podsumowanie - Metoda DHPLC umożliwia rozpoznanie mutacji dzięki rozróżnieniu homo- i heterodupleksów, - Wymaga tylko wcześniejszego przeprowadzenia reakcji PCR, poza tym jest metodą bardzo prostą, - Pozwala na mapowanie genów, - Temperatura, w jakiej jest przeprowadzany pomiar, ma wpływ na jego czułość.

16 Zapraszamy do zadawania pytań :) Dziękujemy za uwagę Prezentacja przygotowana na podstawie artykułu Denaturing High-Performance Liquid Chromatography: A Review, Wenzhong Xiao i Peter J. Oefner, Human Mutation, 2001