(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2012/26 EP B1 (13) (51) T3 Int.Cl. C07K 16/28 ( ) C12N 5/20 ( ) A61K 39/395 ( ) (54) Tytuł wynalazku: Przeciwciała anty-il-13r alfa1 i ich zastosowania (30) Pierwszeństwo: US P (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2009/25 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2012/11 (73) Uprawniony z patentu: CSL Limited, Parkville, AU (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 ANDREW DONALD NASH, Kew, AU MANUEL BACA, Gaithersburg, US LOUIS JERRY FABRI, Diamond Creek, AU DENNIS ZALLER, Scotch Plains, US WILLIAM R. STROHL, Bridgewater, US ZHIQIANG AN, Ambler, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Aleksandra Twardowska KANCELARIA PATENTOWA KULIKOWSKA & KULIKOWSKI SP.J. SKR. POCZT Warszawa 12 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 22374/EP/12 EP B1 Wstęp Tło wynalazku [0001] Interleukina-13 (IL-13) bierze udział w indukowaniu produkcji przeciwciał IgE i IgG4, jak i różnicowaniu limfocytów Th (pomocniczych) (Th) w fenotyp wydzielniczy (Th2). Wymienione etapy stymulujące procesy immunologiczne mają podstawowe znaczenie w rozwoju chorób atopowych, które są poważnym zagrożeniem dla zdrowia ludzi, na przykład w przypadku szoku anafilaktycznego (Howard i wsp., Am. J. Hum. Genet. 70(1): , 2002; Noguchi i wsp., Hum. Immunol. 62(11): , 2001), jak również prowadząc do łagodniejszych stanów, takich jak katar sienny, alergiczny nieżyt nosa i przewlekłe zapalenie zatok, które choć nie zagrażają życiu, są odpowiedzialne za znaczną śmiertelność na świecie. [0002] IL-13 jest pośrednikiem w patologii stadium ostrego i przewlekłego astmy. Podczas ataku astmy zwiększa się poziom ekspresji tego białka a działanie obejmuje zmniejszenie pojemności komórek nabłonkowych płuc w celu utrzymania ścisłej bariery przeciwko pobieranym przy wdechu cząstkom i patogenom (Ahdieh i wsp., Am. J. Physiol. Cell Physiol. 281 (6):C , 2000) i wzmocnienie wywołanej alergenem nadreaktywności dróg oddechowych (Morse i wsp., Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 282 (1):L44-49, 2002). W dłuższej perspektywie IL-13 wzmacnia niezapalne zmiany strukturalne w astmatycznych drogach oddechowych, takie jak zwiększona ekspresja genów mucyny, uszkodzenia dróg oddechowych i zatorowość małych dróg oddechowych (Howard i

3 2 wsp., 2002, supra;. Danahay i wsp., Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 282(2): L , 2002). [0003] W działaniu biologicznym IL-13 pośredniczy dimeryczny kompleks receptora obejmujący podjednostki IL-13Rα1 i IL-4Rα. Postuluje się, że IL-13 po związaniu z IL-13Rα1 wyzwala dimeryzację z IL-4Rα i aktywację wewnątrzkomórkowych mediatorów, które obejmują kinazy Janusa JAK1 i JAK2, jak również STAT6, ERK i p38 (David i wsp., Oncogene 20(46): , 2001, Perez i wsp., J. Immunol. 168(3): , 2002). [0004] IL-13 wykazuje wiele działań biologicznych nakładających się z działaniami biologicznymi właściwymi dla IL-4. IL-13 i IL-4 są powiązane przez sekwencje i obie są zaangażowane w wiele powiązanych procesów, takich jak formowanie się komórek szpikowych zwłaszcza serii białokrwinkowej (mielopoeza) i regulacja funkcji prozapalnych monocytów/makrofagów. Na przykład wykazano, że zarówno IL-13 jak i IL-4 wpływają na limfocyty B w podobny sposób, zwiększając poziom ekspresji cząsteczek powierzchniowych, takich jak cząsteczki MHC klasy II i CD23, i zwiększają wydzielanie IgG4 i IgE. [0005] Nakładające się aktywności IL-13 i IL-4 mogą być wyjaśnione częściowo przez to, że mają one wspólny dimeryczny kompleks receptorowy. Kompleks receptorowy IL-13 składa się z IL-13Rα1 i IL-4Rα; ten sam kompleks receptorowy jest również kompleksem receptorowym IL-4 typu II (Callard i wsp., Immunology Today 17 (3): 108, 1996). Właśnie dlatego, poszukując sposobu osiągnięcia terapeutycznej kontroli kompleksu receptorowego IL-13 przez blokowanie przekazywania sygnałów, w którym uczestniczą cytokiny, może być przydatne

4 3 posiadanie nie tylko cząsteczki, która hamuje sygnalizację za pośrednictwem IL-13, ale też cząsteczki, która hamuje sygnalizację za pośrednictwem zarówno IL-13 jak i IL-4. [0006] Gauchat i wsp. (Eur. J. Immunol. 28: , 1998) opisali mysie przeciwciała przeciwko ludzkiemu IL-13Rα1, które blokowały oddziaływanie znakowanego IL-13 z unieruchomioną rozpuszczalną znakowaną IL-13Rα1. Przeciwciała te również hamowały wiązanie IL-13 z IL-13Rα1 w transfekowanych komórkach HEK-293. Jednak żadne z tych przeciwciał nie wykazywało znoszenia aktywności biologicznej indukowanej przez IL-13, co sugeruje, że nie były one antagonistami kompletnego kompleksu receptorowego IL- 13Rα1/IL-4Rα. W późniejszej pracy, Gauchat i wsp. (Eur. J. Immunol. 30: , 2000) opisali przeciwciała od szczurów, oznaczone jako C41, przeciwko mysiej IL-13Rα1, które wiążą się z komórkami HEK-293 transfekowanymi mysią IL- 13Rα1. Jednak C41 nie znosiło wywołanej przez IL-13 aktywności biologicznej. Ponadto, C41 nie reagowało z postacią rozpuszczalną ludzkiej IL-13Rα1. Akaiwa i wsp. (cytokin 13:75-84, 2001) opisali przeciwciała, które rozpoznawały rozpuszczalną IL-13Rα1 w teście immunoenzymatycznym i pełnej długości znakowaną IL-13Rα1, której genem transfekowano komórki COS7. Przeciwciało to zostało użyte w badaniach immunohistochemicznych, ale nie ma żadnego odniesienia, że było przeciwciałem znoszącym aktywność. [0007] W WO 03/56009 przedstawiono mysie przeciwciała przeciwko ludzkiej IL-13Rα1, które hamowały odpowiedzi komórek TF-1 na IL-13, ale nie IL-4, a Krause i wsp. (Mol. Immunol. 43 (11): , 2006) opisali mysie przeciwciała

5 4 przeciwko ludzkiej IL-13Rα1 hamujące zależną od IL-13 proliferację komórek TF-1. Przeciwciała przeciwko hil-13rα1 są również znane z WO 97/15663, WO 03/080675, WO 06/ i Vermot-Desroches i wsp., 2000 Tissue Antigens 5 (Supp. 1) :52-53 (streszczenie ze Spotkania). [0008] Pomimo tych doniesień, nadal istnieje zapotrzebowanie na opracowanie przeciwciał przeciwko ludzkiej IL-13Rα1, które są odpowiednie do podawania ludziom i które blokują aktywność IL-13. Istota wynalazku [0009] Wynalazek ogólnie dotyczy wyizolowanych przeciwciał, w szczególności ludzkich, humanizowanych, deimmunizowanych, chimerycznych lub prymatyzowanych przeciwciał monoklonalnych, które wiążą się z hil-13rα1 przez jedną lub więcej reszt aminokwasowych w obrębie hil-13rα1. [0010] W jednym wykonaniu, wynalazek dostarcza izolowane monoklonalne przeciwciało, które wiąże się z hil-13rα1 przez jedną lub więcej reszt aminokwasowych w obrębie hil- 13Rα1, hamuje przekazywanie sygnałów przez IL-13 i nie reaguje krzyżowo z IL-13Rα1 pochodzącą z makaka jawajskiego. W innym wykonaniu wynalazku, monoklonalne przeciwciało hamuje w komórkach NHDF indukowane przez IL-13 uwalnianie eotaksyny. [0011] Mutacja peptydu zawierającego domenę 3 z hil-13rα1 polegająca na substytucji w obrębie reszt aminokwasowych Val- Phe-Tyr-Val-Gln (SEQ ID NO: 44), które odpowiadają pozycjom w SEQ ID NO:1 przez reszty aminokwasowe Ile-Leu-Glu- Val-Glu (SEQ ID NO: 45) prowadzi do utraty wiązania pomiędzy przeciwciałem a otrzymanym zmutowanym peptydem hil-13rα1 w

6 5 porównaniu do wiązania między przeciwciałem a peptydem hil- 13Rα1 bez mutacji polegającej na substytucji. [0012] Mutacja w obrębie peptydu obejmującego domenę 3 z hil- 13Rα1 polegająca na substytucji dowolnej reszty spośród: reszty fenyloalaniny, która odpowiada pozycji 249 w SEQ ID NO: 1 na resztę alaniny; reszty tyrozyny, która odpowiada pozycji 250 w SEQ ID NO: 1 na resztę alaniny; reszty glutaminy, która odpowiada pozycji 252 w SEQ ID NO: 1 na resztę alaniny, prowadzi do utraty wiązania pomiędzy przeciwciałem a otrzymanym zmutowanym peptydem hil-13rα1 w porównaniu do wiązania pomiędzy tym przeciwciałem a peptydem hil-13rα1 bez substytucji. [0013] Jedną grupą przeciwciał według wynalazku stanowią ludzkie przeciwciała monoklonalne 4B5, 8B11 i 15F4. W szczególności, przeciwciała takie zawierają region zmienny łańcucha ciężkiego o sekwencji aminokwasów przedstawionej jako SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8 i SEQ ID NO: 12. [0014] Sekwencje aminokwasowe regionów CDR1, CDR2 i CDR3 w regionie zmiennym łańcucha ciężkiego określono jako: (i) odpowiednio SEQ ID NO: 5, 6 i 7, (ii) odpowiednio SEQ ID NO: 9, 10 i 11, lub (iii) SEQ ID NOS: odpowiednio 13, 14 i 15. Sekwencje CDR1, CDR2 i CDR3 w regionie zmiennym łańcucha lekkiego zostały określone w sekwencjach, odpowiednio: SEQ ID NO: 17, 18 i 19. Inne przeciwciała według wynalazku obejmują zestawy sekwencji CDR z ciężkich i/lub lekkich łańcuchów z przeciwciał 4B5, 8B11 i 15F4 lub konserwatywne modyfikacje tych sekwencji lub ich homologi. Inne przeciwciała według wynalazku obejmują sekwencje regionów zmiennych ciężkich i/lub lekkich łańcuchów z przeciwciał 4B5, 8B11 i 15F4 lub konserwatywne modyfikacje tych sekwencji lub ich homologi.

7 6 Zwłaszcza przedmiotem wynalazku są przeciwciała, które obejmują te wytworzone przez linie komórkowe hybrydomy np. o numerze depozytu w ATCC: PTA6931, o numerze depozytu w ATCC: PTA6936 i o numerze depozytu w ATCC: PTA6935. [0015] W innym aspekcie, przedmiotem wynalazku są przeciwciała, które współzawodniczą o wiązanie hil-13rα1 z dowolnym z przeciwciał 4B5, 8B11 lub 15F4. [0016] Przeciwciała według wynalazku obejmują, na przykład, przeciwciała pełnej długości, takie jak o izotypie IgG1 lub IgG4. Alternatywnie, przeciwciała stanowią fragmenty przeciwciał, takie jak fragmenty Fab lub Fab'2 lub przeciwciała jednołańcuchowe. [0017] W szczególnych wykonaniach, przeciwciała według wynalazku są przeciwciałami ludzkimi. Alternatywnie, przeciwciała są przeciwciałami humanizowanymi, prymatyzowanymi, deimmunizowanymi lub chimerycznymi. [0018] Wynalazek dostarcza także immunokoniugat obejmujący przeciwciało według wynalazku związane z czynnikiem terapeutycznym, np. cytotoksyną lub izotopem promieniotwórczym. Wynalazek dostarcza również bispecyficzną cząsteczkę obejmującą przeciwciało według wynalazku, połączone z drugim ugrupowaniem funkcjonalnym mającym inną swoistość wiązania niż to przeciwciało. [0019] Dostarczone są również kompozycje obejmujące przeciwciało lub immunokoniugat lub cząsteczkę bispecyficzną według wynalazku i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. [0020] Opisem objęte są również cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące przeciwciała według wynalazku, jak również wektory ekspresyjne zawierające takie kwasy nukleinowe i komórki gospodarza zawierające takie wektory ekspresyjne.

8 7 [0021] W innym aspekcie wynalazek dostarcza metody identyfikacji przeciwciała zdolnego do wiązania z hil-13rα1 poprzez domenę 3 zewnątrzkomórkowego regionu receptora. [0022] Inny aspekt wynalazku dostarcza sposób hamowania szlaku sygnałowego, w którym pośredniczy receptor IL-13 przez kontaktowanie komórki, w której zachodzi ekspresja IL-13Rα1, z przeciwciałem według wynalazku w warunkach, które pozwalają na wiązanie przeciwciała z IL-13Rα1. [0023] W jeszcze innym aspekcie, wynalazek dostarcza przeciwciała według wynalazku do zastosowania w leczeniu astmy, POChP, atopowego zapalenia skóry, alergicznego nieżytu nosa, eozynofilii przełyku, chłoniaka Hodgkina, choroby zapalnej jelit, łuszczycy, łuszczycowego zapalenia stawów i zwłóknienia. [0024] Inne cechy i zalety wynalazku będą widoczne na podstawie poniższego szczegółowego opisu i przykładów, które nie powinny być rozumiane jako ograniczające zakres wynalazku. Krótki opis rysunków [0025] Fig. 1 obrazuje zewnątrzkomórkowy region mysiej IL-13Rα1, w którym reszty aminokwasów różniące się od ludzkich sekwencji pokazano małymi literami. Panel eksponowanych na fagu białek ludzkiej/mysiej chimerycznej IL-13Rα1 przygotowano przez systematyczne zastępowanie pojedynczych zidentyfikowanych segmentów zewnątrzkomórkowego regionu ludzkiej IL-13Rα1 przez odpowiadający mu podkreślony segment z sekwencji pochodzącej z myszy (tj. HM1 do HM11). Fig. 2 przedstawia sekwencję nukleotydową i pochodzącą od niej sekwencję aminokwasową regionu zmiennego łańcucha

9 8 ciężkiego przeciwciała 4B5. Regiony CDR i sekwencje kwasu nukleinowego kodujące CDR zostały podkreślone. Fig. 3 przedstawia sekwencję nukleotydową i pochodzącą od niej sekwencję aminokwasową regionu zmiennego łańcucha ciężkiego przeciwciała 8B11. Regiony CDR i sekwencje kwasu nukleinowego kodujące CDR zostały podkreślone. Fig. 4 przedstawia sekwencję nukleotydową i pochodzącą od niej sekwencję aminokwasową regionu zmiennego łańcucha ciężkiego przeciwciała 15F4. Regiony CDR i sekwencje kwasu nukleinowego kodujące CDR zostały podkreślone. Fig. 5 przedstawia sekwencję nukleotydową i pochodzącą od niej sekwencję aminokwasową regionu zmiennego łańcucha lekkiego przeciwciała 15F4. Regiony CDR i sekwencje kwasu nukleinowego kodujące CDR zostały podkreślone. Fig. 6 przedstawia porównanie sekwencji domen Fc izotypów IgG1 (SEQ ID NO: 38), IgG2 (SEQ ID NO: 39), IgG4 (SEQ ID NO: 40) i IgG2m4 (SEQ ID NO: 41). Szczegółowy opis wynalazku [0026] Wynalazek dotyczy wyizolowanych przeciwciał, szczególnie ludzkich przeciwciał monoklonalnych, które wiążą się z ludzką IL-13Rα1 poprzez domenę 3 zewnątrzkomórkowego regionu receptora, i które hamują pewne właściwości funkcjonalne IL-13Rα1. Odniesienie do obecnych przeciwciał monoklonalnych obejmuje humanizowane, deimmunizowane i chimeryczne formy tych przeciwciał, a także formy prymatyzowane. W pewnych wykonaniach, przeciwciała według wynalazku obejmują szczególne właściwości strukturalne, takie jak regiony CDR mające szczególne sekwencje aminokwasowe. Wynalazek dostarcza wyizolowane przeciwciała, sposoby

10 9 wytwarzania takich przeciwciał, immunokoniugaty i cząsteczki bispecyficzne, obejmujące takie przeciwciała i kompozycje farmaceutyczne zawierające te przeciwciała, immunokonjugaty lub cząsteczki bispecyficzne według wynalazku. Wynalazek dotyczy także sposobów zastosowania przeciwciał do hamowania odpowiedzi IL-13, na przykład w leczeniu różnych zaburzeń i chorób związanych z IL-13 w tym astmy, POChP, atopowego zapalenia skóry, alergicznego nieżytu nosa, eozynofilii przełyku, chłoniaka Hodgkina, zapalnej choroby jelit, łuszczycy, łuszczycowego zapalenia stawów i zwłóknienia. [0027] Przewiduje się, że zewnątrzkomórkowy region hil-13rα składa się z 3 kulistych domen fibronektyny typu III, każda o długości około 100 aminokwasów (Arima i wsp., J. Biol. Chem. 280 (26): , 2005). Po końcu aminowym domeny fibronektyny typu III (określonej tu jako domena 1 lub D1) występują dwie inne domeny fibronektyny typu III (określone tu, odpowiednio, jako domeny 2 i domeny 3 lub D2 i D3), które mają moduł homologii receptora cytokin (Wells i de Vos, Ann. Rev. Biochem. 65:609-34, 1996). Aby przewidzieć granice sekwencji każdej z tych domen fibronektyny typu III, przyrównano dojrzałe sekwencje zewnątrzkomórkowych regionów hil-13rα1 i hil-4rα. Zewnątrzkomórkowy region hil-4rα o około 200 resztach składa się z modułu homologii receptora cytokiny, odpowiadającego domenom D2 i D3 z IL-13Rα1, lecz nie zawiera żadnych domen położonych w górę, odpowiadających domenie D1. Zgodnie z powyższym, pierwsza reszta dojrzałej hil-4rα została przyjęta do określenia granicy między D1 a D2 w obrębie przyrównywanej sekwencji hil-13rα1. Granicę pomiędzy tymi dwoma domenami fibronektyny typu III w IL-4Rα, jaką wywnioskowano ze struktury krystalicznej

11 10 [0028] (Hage i wsp., Cell, 97 (2) :271-81, 1999) została następnie wykorzystana do określenia granicy między D2 i D3 w przyrównanej sekwencji IL-13Rα1. Zgodnie z powyższym, domena 1 zewnątrzkomórkowego regionu hil-13rα1 odpowiada resztom aminokwasowym od 1 do 100 w SEQ ID NO: 1, domena 2 odpowiada resztom aminokwasowym od 101 do 200 w SEQ ID NO: 1 i domena 3 odpowiada resztom aminokwasowym od 201 do 317 w SEQ ID nr: 1. Domena 3 została również określona tutaj jako SEQ ID NO: 37. [0029] Zgodnie z wynalazkiem wytwarza się przeciwciała, które wiążą się z hil-13rα1 poprzez domenę 3 zewnątrzkomórkowego regionu łańcucha receptora i które hamują przekazywanie sygnału przez interleukinę IL-13 przez kompleks IL-13Rα1/IL- 4Rα. Takie przeciwciała hamują zależną od IL-13 aktywność biologiczną. W określonej realizacji wynalazku, niektóre przeciwciała według wynalazku hamują przekazywanie sygnału przez interleukinę zarówno IL-13, jak i IL-4 przez kompleks IL-13Rα1/IL-4Rα. [0030] Zgodnie z celem wynalazku, terminy podjednostka alfa 1 receptora interleukiny 13 i IL-13Rα1 są używane zamiennie i mogą obejmować warianty, izoformy i homologi cząsteczkowe ludzkiej IL-13Rα1. Zgodnie z powyższym ludzkie przeciwciała według wynalazku mogą w niektórych przypadkach oddziaływać krzyżowo z IL-13Rα1 z innych gatunków oprócz człowieka. W innych przypadkach, przeciwciała mogą być swoiste przeciwko ludzkiej IL-13Rα1 i mogą nie wykazywać swoistości gatunkowej lub innych rodzajów oddziaływania krzyżowego. Sekwencja aminokwasowa ludzkiej IL-13Rα1 (zwanej również hil-13rα1) ma numer dostępu w GenBank NP_ i dojrzałą formę białka, tzn. bez sekwencji sygnałowej, przedstawioną tu jako SEQ ID NO: 1. Sekwencja aminokwasowa

12 11 IL-13Rα1 z makaka jawajskiego ma numer dostępu AAP78901 w GenBanku i dojrzałą formę białka przedstawioną tu jako SEQ ID NO: 2. Sekwencja aminokwasowa mysiej IL-13Rα1 (zwanej także ML-13Rα1) ma numer dostępu w GenBank i dojrzałą formę białka przedstawioną tu jako SEQ ID Nr 3. [0031] Inne sekwencje objęte niniejszym ujawnieneim przedstawiono Tabeli 1. TABELA 1 SEQ ID NO: Opis 1 dojrzała ludzka IL-13Rα1 2 dojrzała IL-13Rα1 z makaka jawajskiego 3 dojrzała mysia IL-13Rα1 4 VH z 4B5 5 CDR1 w VH z 4B5 6 CDR2 w VH z 4B5 7 CDR3 w VH z 4B5 8 VH z 8B11 9 CDR1 w VH z 8B11 10 CDR2 w VH z 8B11 11 CDR3 w VH z 8B11 12 VH z 15F4 13 CDR1 w VH z 15F4 14 CDR2 w VH z 15F4 15 CDR3 w VH z 15F4 16 VL z 15F4 17 CDR1 w VL z 15F4 18 CDR2 w VL z 15F4 19 CDR3 w VL z 15F4 20 N-końcowy znakowany FLAG hil-13rα1.ecr

13 12 SEQ ID NO: Opis 21 kwas nukleinowy kodujący VH z 4B5 22 kwas nukleinowy kodujący CDR1 w VH z 4B5 23 kwas nukleinowy kodujący CDR2 w VH z 4B5 24 kwas nukleinowy kodujący CDR3 w VH z 4B5 25 kwas nukleinowy kodujący VH z 8B11 26 kwas nukleinowy kodujący CDR1 w VH z 8B11 27 kwas nukleinowy kodujący CDR2 w VH z 8B11 28 kwas nukleinowy kodujący CDR3 w VH z 8B11 29 kwas nukleinowy kodujący VH z 15F4 30 kwas nukleinowy kodujący CDR1 w VH z 15F4 31 kwas nukleinowy kodujący CDR2 w VH z 15F4 32 kwas nukleinowy kodujący CDR3 w VH z 15F4 33 kwas nukleinowy kodujący VL z 15F4 34 kwas nukleinowy kodujący CDR1 w VL z 15F4 35 kwas nukleinowy kodujący CDR2 w VL z 15F4 36 kwas nukleinowy kodujący CDR3 w VL z 15F4 37 D3 z zewnątrzkomórkowego regionu hil-13rα1 38 zawiera domenę Fc z IgG1 39 zawiera domenę Fc z IgG2 40 zawiera domenę Fc z IgG4 41 zawiera domenę Fc z IgG2m4 42 domena Fc z IgG2m4 43 kwas nukleinowy kodujący domenę Fc z IgG2m4 44 domena 3 peptydu hil-13rα1 typu dzikiego 45 zmutowana domena 3 peptydu hil-13rα1 typu dzikiego 46 zewnątrzkomórkowy region z mil-13rα1

14 13 [0032] Termin przeciwciało zgodnie z opisem obejmuje całe przeciwciała (znane również jako przeciwciała pełnej długości) oraz wszelkie wiążące fragmenty antygenu (np. część wiążąca antygen ). Całe przeciwciało odnosi się do białka składającego się z dwóch ciężkich (H) i dwóch lekkich (L) łańcuchów połączonych ze sobą mostkami dwusiarczkowymi. Każdy ciężki łańcuch składa się z regionu zmiennego (w skrócie tutaj określanego jako V H ) łańcucha ciężkiego i regionu stałego łańcucha ciężkiego. Region stały łańcucha ciężkiego składa się z trzech domen: C H1, C H2 i C H3. Każdy łańcuch lekki składa się z regionu zmiennego (w skrócie tutaj określanego jako V L ) łańcucha lekkiego i regionu stałego łańcucha lekkiego. Region stały łańcucha lekkiego składa się z jednej domeny - C L. Regiony V H i V L mogą być podzielone dalej na regiony o hiperzmienności, zwane regionami określającymi (determinującymi) komplementarność (CDR), przedzielone regionami, które są bardziej konserwowane, zwanymi regionami zrębowymi (FR). Każdy V H i V L składa się z trzech regionów CDR i czterech regionów FR, ustawionych od końca aminowego do końca karboksylowego w następującej kolejności: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Regiony zmienne łańcuchów ciężkich i lekkich zawierają domenę wiążącą, która oddziałuje z antygenem. Stałe regiony przeciwciał mogą pośredniczyć w wiązaniu immunoglobuliny z tkankami lub czynnikami gospodarza, w tym różnymi komórkami układu immunologicznego (np. komórkami efektorowymi) i pierwszym składnikiem (Clq) klasycznego układu dopełniacza. [0033] Określenie część przeciwciała wiążąca antygen, zgodnie z opisem, odnosi się do jednego lub kilku fragmentów przeciwciał, które zachowują zdolność do wiązania się z

15 14 hil-13rα1. Wykazano, że funkcja wiązania antygenu przez przeciwciało może być uzyskiwana przez fragmenty z przeciwciał pełnej długości. Przykłady fragmentów wiążących objętych terminem część przeciwciała wiążąca antygen obejmują (i) fragment Fab, monowalentny fragment składający się z domen V L, V H, C L i C H1 ; (ii) fragment F(ab') 2, biwalentny fragment składający się z dwóch fragmentów Fab połączonych mostkiem dwusiarczkowym w regionie zawiasowym, (iii) fragment Fd składający się z domen V H i C H1, (iv) fragment Fv składający się z domen V L i V H jednego ramienia przeciwciała, (v) fragment dab (Ward i wsp., Nature 341: , 1989), który składa się albo z domeny V H albo z domeny V L (Holt i wsp., Trends in Biotechnology, 21: , 2003) oraz (vi) wyizolowany region determinujący komplementarność (CDR), w szczególności CDR3 z V H. Jak będzie to zrozumiałe dla specjalisty z dziedziny fragmenty przeciwciała, które zachowują zdolność do wiązania się z hil-13rα1 mogą być wprowadzane do różnych układach, patrz np. Patent US Nr i odniesienia w nim zawarte, omawiające różne układy, które mogą być stosowane do eksponowania pętli przeciwciał wcześniej wybranych na podstawie wiązania antygenu. Ponadto, mimo że obie domeny fragmentu FV, V L i V H, są kodowane przez odrębne geny, mogą być one połączone ze sobą technikami rekombinacji poprzez syntetyczny łącznik umożliwiający ich wytwarzanie jako jednego łańcucha białkowego, w którym regiony V L i V H łączą się w parę tworząc monowalentne cząsteczki (znane jako jednołańcuchowy Fv (scfv), patrz np., Bird i wsp., Science 242: , 1988, i Huston i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: , 1988). Takie jednołańcuchowe przeciwciała również będą objęte terminem

16 15 część przeciwciała wiążąca antygen. Te fragmenty przeciwciał można uzyskać stosując konwencjonalne techniki znane specjaliście w dziedzinie, i mogą być produkowane bez uprzedniego wytworzenia przeciwciała pełnej długości. Fragmenty mogą być przeszukiwane pod kątem odpowiednich właściwości w taki sam sposób, jak przeciwciała pełnej długości. [0034] Wyizolowane przeciwciało", zgodnie z opisem, odnosi się przeciwciała, które jest zasadniczo wolne od innych przeciwciał mających różną swoistość antygenową (np. wyizolowane przeciwciało, które wiąże się z hil-13rα1 jest zasadniczo wolne od przeciwciał, które wiążą się z antygenami innymi niż IL-13Rα1). Wyizolowane przeciwciało, które wiąże się z hil-13rα1 może jednak wykazywać reaktywność krzyżową z innymi antygenami, takimi jak cząsteczki IL-13Rα1 z innych gatunków. Ponadto wyizolowane przeciwciało może być zasadniczo wolne od innego materiału komórkowego i/lub związków chemicznych. [0035] Termin przeciwciało monoklonalne lub mab zgodnie z opisem odnosi się do przeciwciała uzyskanego z populacji zasadniczo jednorodnych przeciwciał, tj. poszczególne przeciwciała tworzące populację są identyczne z wyjątkiem możliwych naturalnie występujących mutacji, które mogą być obecne w niewielkich ilościach. Przeciwciała monoklonalne są wysoce swoiste, ponieważ są skierowane przeciwko jednemu miejscu w obrębie antygenu. Ponadto, w przeciwieństwie do konwencjonalnych (poliklonalnych) preparatów przeciwciał, które zazwyczaj obejmują różne przeciwciała skierowane przeciwko różnym determinantom (epitopom), każde przeciwciało monoklonalne skierowane jest przeciwko jednej determinancie

17 16 na antygenie. Określenie monoklonalne wskazuje na cechę przeciwciała, jako otrzymanego z zasadniczo jednorodnej populacji przeciwciał, i nie może być interpretowane jako ograniczenie do produkcji przeciwciał jednym określonym sposobem. Przeciwciało monoklonalne, które jest wyizolowanym przeciwciałem, może być określane jako wyizolowane przeciwciało monoklonalne. [0036] Określenie ludzkie przeciwciało", zgodnie z opisem, będzie obejmowało przeciwciała mające regiony zmienne pochodzące z ludzkich sekwencji immunoglobulin komórek germinalnych. Ponadto, jeśli przeciwciało zawiera region stały, to rejon stały również wywodzi się z sekwencji ludzkich immunoglobulin komórek germinalnych. Ludzkie przeciwciała według wynalazku mogą zawierać inne, niepochodzące od człowieka reszty aminokwasowe kodowane przez sekwencje immunoglobulin komórek germinalnych (np. mutacje wprowadzone przez mutagenezę losową lub mutacje punktowe in vitro lub mutacje somatyczne in vivo) na przykład w CDR, a w szczególności w CDR3, a zatem sekwencje aminokwasowe regionów V L i/lub V H przeciwciał są sekwencjami, które choć pochodzą z i są spokrewnione z sekwencjami V L i V H ludzkich komórek terminalnych, nie mogą naturalnie występować w zestawie in vivo ludzkich przeciwciał komórek germinalnych. Jednakże termin ludzkie przeciwciało", zgodnie z opisem, nie będzie obejmować przeciwciał, w których sekwencje CDR pochodzą z innych gatunków ssaków, takich jak mysz, które wszczepiono do układów sekwencji ludzkich, czyli nie obejmuje przeciwciał humanizowanych. [0037] Zgodnie z opisem, domena 3 z zewnątrzkomórkowego regionu hil-13rα1 odpowiada aminokwasom 201 do 317 w SEQ ID

18 17 NO: 1 i jest przedstawiona w opisie jako SEQ ID NO: 37. W związku z powyższym przeciwciało, które wiąże się z hil-13rα1 poprzez domenę 3 zewnątrzkomórkowego regionu receptora jest właśnie tym, które wykazuje wiązanie z peptydem składającym się głównie z domeny 3 zawierającej reszty aminokwasowe określone powyżej, na przykład z konstruktem domeny 3 eksponowanej na fagach zgodnie z przykładem 3, w którym wiązanie oznaczano metodą ELISA. Specjaliści w dziedzinie wiedzą, że istnieją inne metody określania wiązania z domeną 3 z zewnątrzkomórkowego regionu hil-13rα1, na przykład z użyciem testu Biacore (Pharmacia AB Corporation). Przeciwciało, które wiąże się z hil-13rα1 przez domenę 3 zewnątrzkomórkowego regionu receptora wiąże się również z receptorem pełnej długości i innymi peptydami pochodzącymi od takiego receptora, obejmującymi SEQ ID NO: 37; na przykład peptydem hil-13rα1.ecr z przykładu 1, który obejmuje domeny 1, 2 i 3 z zewnątrzkomórkowego regionu receptora. [0038] Zgodnie z opisem, przeciwciało, które wiąże się z ludzką IL-13Rα1 odnosi się do przeciwciała, które wiąże się z ludzką IL-13Rα1 z K D o wartości 5 x M 10-9 lub niższą, korzystniej 2 x 10-9 m lub niższą, a jeszcze korzystniej 1 x 10-9 m lub niższą. Podobne określenia, takie jak przeciwciała wiążące się z ludzką IL-13Rα1 mają takie samo znaczenie. Przeciwciało, które oddziałuje krzyżowo z IL- 13Rα1 z makaka jawajskiego odnosi się do przeciwciała, które wiąże się z IL-13Rα1 z makaka jawajskiego z K D wynoszącą 5 x 10-9 m lub niższą, a jeszcze korzystniej 2 x 10-9 m lub niższą. Przeciwciało, które nie oddziałuje krzyżowo z mysią IL-13Rα1 odnosi się do przeciwciała, które wiąże się z mysią IL-13Rα1 z K D wynoszącą 1 x 10-7 m lub wyższą. W niektórych

19 18 wykonaniach, przeciwciała, które nie reagują krzyżowo z mysią IL-13Rα1 wykazują zasadniczo niewykrywalne wiązanie z tym białkiem w standardowych testach wiązania. [0039] Oznaczenie K a ", zgodnie z opisem, odnosi się do szybkości wiązania danego antygenu z przeciwciałem, natomiast oznaczenie K d ", zgodnie z opisem, odnosi się do szybkości dysocjacji wiązania danego antygenu z przeciwciałem. Oznaczenie K D ", zgodnie z opisem, odnosi się do stałej dysocjacji, którą otrzymuje się ze stosunku K d do K a (tj. K d /K a ) i jest wyrażona jako stężenie molowe (M). Wartości K D dla przeciwciał można określić za pomocą metod dobrze znanych w dziedzinie. Preferowaną metodą określania K D dla przeciwciał jest wykorzystanie powierzchniowego rezonansu plazmonowego, najkorzystniej stosując układ biosensorowy taki jak układ Biacore. [0040] Różne aspekty wynalazku zostały opisane bardziej szczegółowo w kolejnych podrozdziałach. [0041] Przeciwciała anty-hil-13rα1. [0042] Przeciwciała według wynalazku charakteryzują się szczególnymi cechami funkcjonalnymi lub właściwościami przeciwciał. Na przykład, przeciwciała wiążą się z ludzką IL- 13Rα1 przez domenę 3 zewnątrzkomórkowego regionu receptora. [0043] Dodatkowo, przeciwciała według wynalazku mogą ewentualnie oddziaływać krzyżowo z IL-13Rα1 pochodzącą z jednego lub więcej innych naczelnych, np. z makaka jawajskiego. Zatem, w jednym rozwiązaniu, przeciwciała według wynalazku oddziałują krzyżowo z IL-13Rα1 z makaka jawajskiego. [0044] W innym wykonaniu, przeciwciała według wynalazku nie oddziałują krzyżowo z mysią IL-13Rα1.

20 19 [0045] W szczególnych rozwiązaniach, przeciwciało według wynalazku wiąże się z IL-13Rα1 z wysokim powinowactwem, na przykład z K D wynoszącą 5 x 10-9 m lub niższą, korzystniej wynoszącą 2 x 10-9 m lub niższą, a jeszcze korzystniej wynoszącą 1 x 10-9 m lub niższą. [0046] Ponadto, przeciwciała według wynalazku są zdolne do hamowania jednej lub więcej aktywności funkcjonalnych hil- 13Rα1. Na przykład, w jednej realizacji wynalazku, przeciwciała mogą hamować indukowane przez IL-13 uwalnianie eotaksyny w komórkach NHDF. W jeszcze innej realizacji wynalazku, przeciwciała mogą hamować indukowaną przez IL-13 fosforylację STAT6 w komórkach NHDF. W jeszcze innej realizacji wynalazku, przeciwciała mogą hamować indukowane przez IL-4 uwalnianie eotaksyny w komórkach NHDF. W jeszcze innej realizacji wynalazku, przeciwciała mogą hamować indukowaną przez IL-4 fosforylację STAT6 w komórkach NHDF. W szczególnych realizacjach wynalazku, przeciwciała hamują wszystkie powyższe aktywności funkcjonalne hil-13rα1. [0047] Przeciwciała według wynalazku mogą hamować wiązanie IL-13 z wyizolowaną IL-13Rα1 (tj. IL-13Rα1, która nie jest częścią dimerycznego receptora IL-4Rα). Niektóre przeciwciała według wynalazku nie mogą hamować wiązania IL-13 z wyizolowaną IL-13Rα1 jednak mogą hamować indukowane przez IL- 13 odpowiedzi w komórkach NHDF, w których pośredniczy kompleks receptorowy IL-13 typu I. [0048] Jedna grupa przeciwciał według wynalazku obejmuje te, które hamują wiązanie hil-13 z wyizolowaną hil-13rα1. [0049] Inną grupą przeciwciał według wynalazku są przeciwciała pełnej długości.

21 20 [0050] W szczególnych realizacjach wynalazku, przeciwciała według wynalazku są przeciwciałami ludzkimi. W innej realizacji przeciwciała są przeciwciałami humanizowanymi, deimmunizowanymi, prymatyzowanymi lub chimerycznymi. [0051] Przeciwciała według wynalazku mogą być przeciwciałami każdego spośród izotypów, np. IgG, IgA, IgE i IgM i każdej spośród podklas izotypów, zwłaszcza IgG1 i IgG4. Zazwyczaj korzystny jest IgG4, ponieważ nie wiąże się z układem dopełniacza i nie tworzy funkcji efektorowych. Wszelkie warianty syntetyczne lub inny wariant stałego regionu, które mają wymienione lub inne pożądane właściwości również są korzystnie stosowane w realizacjach według wynalazku. [0052] Standardowe testy do oceny zdolności wiązania przeciwciał z IL-13Rα1 pochodzące z różnych gatunków są znane ze stanu techniki, obejmujące techniki np. ELISA, Western blot i RIA. Przykłady odpowiednich testów są także opisane w przykładach. Kinetyka wiązania (np. powinowactwo wiązania) przeciwciał również może być oceniana za pomocą standardowych testów znanych w dziedzinie, np. test Biacore. Przykłady testów do oceny wpływu przeciwciał na właściwości funkcjonalne IL-13Rα1 (np. wiązanie ligandu, hamowanie aktywności komórek indukowanej przez IL-13) zostały opisane w przykładach. [0053] W związku z powyższym, przeciwciało, które hamuje jedną lub więcej z aktywności funkcjonalnych IL-13Rα1, jak wyznaczono metodami znanymi ze stanu techniki i opisanymi tutaj, będzie zrozumiałe, że odnosi się do obniżenia danej aktywności w stosunku do obserwowanej aktywności w przypadku braku przeciwciał (np., lub gdy obecne jest stanowiące kontrolę przeciwciało o nieistotnej swoistości). Korzystnie

22 21 przeciwciało, które hamuje aktywności IL-13 i/lub IL-4 prowadzi do takiego spadku o co najmniej 10% dla mierzonego parametru, korzystniej co najmniej o 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% lub 95%. [0054] W jednej realizacji wynalazku, dostarcza się wyizolowane monoklonalne przeciwciało, które wiąże się z IL- 13Rα1 przez domenę 3 zewnątrzkomórkowego regionu receptora i hamuje przekazywanie sygnału przez interleukinę IL-13. W określonych rozwiązaniach, wynalazek również wykazuje co najmniej jedną z następujących właściwości funkcjonalnych: (i) hamuje uwalnianie eotaksyny indukowane IL-13 w komórkach NHDF, (ii) hamuje uwalnianie eotaksyny indukowane IL-4 w komórkach NHDF, (iii) hamuje fosforylację STAT6 indukowaną przez IL-13 w komórkach NHDF lub (iv) hamuje fosforylację STAT6 indukowaną przez IL-4 w komórkach NHDF. [0055] W szczególnej realizacji wynalazku, mutacja w peptydzie obejmującym domenę 3 z hil-13rα1 polegająca na substytucji reszt Val-Phe-Tyr-Val-Gln (SEQ ID NO: 44), które odpowiadają pozycjom z SEQ ID NO: 1, na reszty Ile- Leu-Glu-Val-Glu (SEQ ID NO: 45) prowadzi do utraty wiązania pomiędzy przeciwciałem wynalazku a otrzymanym zmutowanym peptydem hil-13rα1 w porównaniu do wiązaniem między tym przeciwciałem a peptydem hil-13rα1 bez tych substytucji. [0056] W innym wykonaniu, mutacja w peptydzie obejmującym domenę 3 z hil-13rα1 polegająca na substytucji reszty fenyloalaniny, która odpowiada pozycji 249 w SEQ ID NO: 1 przez resztę alaniny; resztę tyrozyny, która odpowiada pozycji 250 w SEQ ID NO: 1 przez resztę alaniny; lub resztę glutaminy, które odpowiada pozycja 252 w SEQ ID NO: 1 przez resztę alaniny; prowadzi do utraty wiązania pomiędzy

23 22 przeciwciałem według wynalazku a otrzymanym mutantem peptydu hil-13rα1 w porównaniu do wiązania pomiędzy tym przeciwciałem a peptydem hil-13rα1 bez substytucji. Przeciwciała monoklonalne 4B5, 8B11 i 15F4. [0057] Grupa przeciwciał anty-hil-13rα1 według wynalazku obejmuje ludzkie przeciwciała monoklonalne 4B5, 8B11 i 15F4, wyizolowane i strukturalnie scharakteryzowane jak opisano w przykładach. Sekwencje aminokwasowe regionu zmiennego ciężkiego łańcucha 4B5, 8B11 i 15F4 oraz odpowiadające im sekwencje CDR1, CDR2 i CDR3 zostały przedstawione w tabeli 2 poniżej. Podobnie sekwencja aminokwasowa zmiennego regionu łańcucha lekkiego z 15F4, oraz odpowiadające im sekwencje CDR1, CDR2 i CDR3 sekwencje zostały przedstawione w tabeli poniżej. Regiony CDR zostały określone z wykorzystaniem systemu Kabat (Kabat i wsp., Sekwencje białek odpowiednich do zastosowań immunologicznych, wydanie piąte, US Department of Health and Human Services, Publikacja NIH Nr 91:3242, 1991), z wyjątkiem CDR1 w V H, który został poszerzony zarówno o sekwencje i definicje strukturalne (Chothia i Lesk, J. Mol. Biol. 196: , 1987), a mianowicie reszty V H TABELA 2 Sekwencja SEQ ID NO: VH z 4B5 4 CDR1 w VH z 4B5 5 CDR2 w VH z 4B5 6 CDR3 w VH z 4B5 7 VH z 8B11 8 CDR1 w VH z 8B11 9 CDR2 w VH z 8B11 10

24 23 Sekwencja SEQ ID NO: CDR3 w VH z 8B11 11 VH z 15F4 12 CDR1 w VH z 15F4 13 CDR2 w VH z 15F4 14 CDR3 w VH z 15F4 15 VL z 15F4 16 CDR1 w VL z 15F4 17 CDR2 w VL z 15F4 18 CDR3 w VL z 15F4 19 [0058] Wiadomo, że regiony CDR przeciwciał stanowią o rozpoznawaniu antygenów przez przeciwciała, a szczególne znaczenie ma region CDR3. Zatem w innym aspekcie, wynalazek dostarcza wyizolowane przeciwciało monoklonalne obejmujące sekwencję CDR3 wybraną z grupy obejmującej SEQ ID NO: 7, 11, 15 oraz konserwatywne modyfikacje tych sekwencji, które: a) wiąże się z hil-13rα1 poprzez domenę 3 zewnątrzkomórkowego regionu receptora oraz b) wykazuje co najmniej jedną z następujących właściwości funkcjonalnych: (i) hamuje uwalnianie eotaksyny indukowane przez IL-13 w komórkach NHDF, (ii) hamuje uwalnianie eotaksyny indukowane przez IL-4 w komórkach NHDF, (iii) hamuje indukowaną przez IL-13 fosforylację STAT6 w komórkach NHDF, lub (iv) hamują indukowaną przez IL-4 fosforylację STAT6 w komórkach NHDF. [0059] W szczególnej realizacji wynalazku, takie przeciwciała obejmują region zmienny łańcucha ciężkiego, w którym sekwencje CDR1, CDR2 i CDR3 są następujące (a) odpowiednio, SEQ ID nr: 5, 6 i 7, (b) odpowiednio, SEQ ID: 9, 10 i 11, (c) odpowiednio, SEQ ID NO: 13, 14 i 15, lub (d) zestaw takich

25 24 sekwencji CDR, jak określono w pkt a), b) lub (c) z modyfikacjami konserwatywnymi sekwencji w jednej lub więcej wspomnianych sekwencjach CDR. [0060] W dalszej realizacji wynalazku, sekwencje CDR1, CDR2 i CDR3 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego są takie jak przedstawiono odpowiednio jako SEQ ID NO: 5, 6 i 7. [0061] W innym wykonaniu, sekwencje CDR1, CDR2 i CDR3 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego są takie jak przedstawiono odpowiednio jako SEQ ID NO: 9, 10 i 11. [0062] W innym wykonaniu, sekwencje CDR1, CDR2 i CDR3 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego są takie jak przedstawiono odpowiednio jako SEQ ID NO: 13, 14 i 15. [0063] W innym aspekcie, wynalazek dostarcza wyizolowane przeciwciało monoklonalne zawierające region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję CDR3 wybraną z grupy obejmującej SEQ ID NO: 19 i konserwatywne modyfikacje sekwencji, które: (a) wiąże się z hil-13rα1 poprzez domenę 3 zewnątrzkomórkowego regionu receptora, oraz (b) wykazuje co najmniej jedną z właściwości funkcjonalnych od (i) do (iv) opisanych powyżej. [0064] W szczególnych rozwiązaniach, takie przeciwciała obejmują region zmienny łańcucha lekkiego, w którym sekwencje CDR1, CDR2 i CDR3 zostały przedstawione jako odpowiednio SEQ ID: 17, 18 i 19, lub zestaw takich sekwencji CDR z konserwatywnymi zmianami sekwencji w jednej lub więcej sekwencji CDR. [0065] W kolejnej realizacji wynalazku, sekwencje CDR1, CDR2 i CDR3 regionu zmiennego łańcucha lekkiego przedstawiono jako odpowiednio SEQ ID NO: 17, 18 i 19.

26 25 [0066] W innym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest wyizolowane przeciwciało monoklonalne obejmujące sekwencję CDR3 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego i sekwencję CDR3 regionu zmiennego łańcucha lekkiego przedstawiono jako odpowiednio, SEQ ID NO: 15 i 19, lub konserwatywne modyfikacje sekwencji jednego lub więcej z wymienionych sekwencji CDR3, które to przeciwciało: (a) wiąże się z hil- 13Rα1 poprzez domenę 3 zewnątrzkomórkowego regionu receptora, oraz (b) wykazuje co najmniej jedną z funkcjonalnych właściwości od (i) do (iv) określonych powyżej. [0067] W szczególnej realizacji wynalazku, takie przeciwciała obejmują sekwencje CDR1, CDR2 i CDR3 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego i sekwencje CDR1, CDR2 i CDR3 regionu zmiennego łańcucha lekkiego, które przedstawiono odpowiednio jako SEQ ID: 13, 14, 15, 17, 18 i 19 lub zestaw takich sekwencji CDR z konserwatywnymi zmianami sekwencji jednej lub więcej wspomnianych sekwencji CDR. [0068] W dalszej realizacji wynalazku, sekwencje CDR1, CDR2 i CDR3 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego i sekwencje CDR1, CDR2 i CDR3 regionu zmiennego łańcucha lekkiego są takie jak przedstawiono odpowiednio jako SEQ ID NO: 13, 14, 15, 17, 18 i 19. [0069] W innym aspekcie, wynalazek dostarcza wyizolowane przeciwciało monoklonalne obejmujące region zmienny łańcucha ciężkiego, zawierający sekwencję wybraną z grupy składającej się z SEQ ID NO: 4, 8 i 12, które to przeciwciało: (a) wiąże się z hil-13rα1 poprzez domenę 3 zewnątrzkomórkowego regionu receptora, oraz (b) wykazuje co najmniej jedną z właściwości funkcjonalnej od (i) do (iv) opisanej powyżej.

27 26 [0070] W innym aspekcie, wynalazek dostarcza wyizolowane przeciwciało monoklonalne obejmujące region zmienny łańcucha lekkiego zawierający sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z SEQ ID NO: 16, które: (a) wiąże się z hil- 13Rα1 poprzez domenę 3 zewnątrzkomórkowego regionu receptora, oraz (b) wykazuje co najmniej jedną z funkcjonalnych właściwości od (i) do (iv) wskazanych powyżej. [0071] W innym aspekcie, takie wyizolowane przeciwciała monoklonalne obejmujące region zmienny łańcucha ciężkiego i region zmienny łańcucha lekkiego zawierające, odpowiednio SEQ ID NO: 12 i 16. Przeciwciała homologiczne. [0072] W jeszcze innym wykonaniu, przeciwciało według wynalazku zawiera zmienne regiony ciężkiego i/lub lekkiego łańcucha o sekwencjach aminokwasowych, które są homologiczne do sekwencji aminokwasowych opisanych przeciwciał swoistych, i które to przeciwciała zachowują pożądane właściwości funkcjonalne przeciwciał anty-il-13rα1 według wynalazku. [0073] Na przykład, obecny wynalazek dostarcza wyizolowane przeciwciało monoklonalne obejmujące sekwencję zmiennego regionu łańcucha ciężkiego, który wykazuje co najmniej 90% homologii regionów zmiennych do sekwencji wybranej z grupy składającej się z SEQ ID NO: 4, 8 i 12, które to przeciwciało: (a) wiąże się z hil-13rα1 poprzez domenę 3 zewnątrzkomórkowego regionu receptora, oraz (b) wykazuje co najmniej jedną z funkcjonalnych właściwości od (i) do (iv) opisanych powyżej. [0074] Odniesienie do co najmniej 90% homologii obejmuje sekwencje o homologii co najmniej 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 i 100%.

28 27 [0075] W innym wykonaniu, wynalazek dostarcza wyizolowane przeciwciało monoklonalne obejmujące sekwencję regionu zmiennego łańcucha lekkiego, który jest co najmniej 90% homologiczny do SEQ ID NO: 16, które to przeciwciało: (a) wiąże się z hil-13rα1 przez domenę 3 zewnątrzkomórkowego regionu receptora, oraz (b) wykazuje co najmniej jedną z funkcjonalnych właściwości od (i) do (iv) opisanych powyżej. [0076] W szczególnej realizacji wynalazku, takie wyizolowane przeciwciała monoklonalne obejmują regiony zmienne ciężkiego i lekkiego łańcucha, które wykazują co najmniej 90% homologii odpowiednio z SEQ ID NO: 12 i 16. [0077] W innych realizacjach wynalazku, sekwencje aminokwasowe V H i/lub V L mogą być w 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% homologiczne do sekwencji przedstawionych powyżej. Przeciwciała mające sekwencje V H i/lub V L o dużej (tj. 90% lub większej) homologii do sekwencji, odpowiednio, dla V H sekwencji SEQ ID NO: 4, 8 i 12 i/lub dla V L sekwencji SEQ ID NO: 16 mogą być uzyskane w wyniku mutagenezy (np. ukierunkowanej lub losowej mutagenezy) cząsteczek kwasu nukleinowego kodujących SEQ ID NO: 4, 8 i 12 oraz/lub SEQ ID NO: 16, a następnie zbadania kodowanego zmienionego przeciwciała pod kątem utrzymanych funkcji (tj. funkcji określonych powyżej w punktach od (i) do (iv)) za pomocą testów funkcjonalnych przedstawionych w opisie. [0078] W jeszcze innym wykonaniu, przeciwciało według wynalazku zawiera regiony zmienne ciężkiego i/lub lekkiego łańcucha z zestawami sekwencji CDR1, CDR2 i CDR3, które są homologiczne do sekwencji zestawów CDR1, CDR2 i CDR3 swoistych przeciwciał przedstawionych w opisie, i gdzie

29 28 przeciwciała zachowują pożądane właściwości funkcjonalne przeciwciał anty-hil-13rα1 według wynalazku. [0079] Na przykład, przedmiot wynalazku stanowi wyizolowane przeciwciało monoklonalne obejmujące region zmienny łańcucha ciężkiego z sekwencją zestawu CDR1, CDR2 i CDR3, która wykazuje co najmniej w 90% homologii do sekwencji zestawu CDR1, CDR2 i CDR3 wybranej z grupa składającej się z: (a) odpowiednio, SEQ ID nr: 5, 6 i 7, (b) odpowiednio, SEQ ID NO: 9, 10 i 11, lub (c) odpowiednio, SEQ ID: 13, 14 i 15; gdzie przeciwciało wiąże się hil-13rα1 poprzez domenę 3 zewnątrzkomórkowego regionu receptora i wykazuje co najmniej jedną z właściwości funkcjonalnych od (i) do (iv) opisanych powyżej. [0080] W innym wykonaniu, wynalazek dostarcza wyizolowane przeciwciało monoklonalne obejmujące region zmienny łańcucha lekkiego z zestawem sekwencji CDR1, CDR2 i CDR3, które wykazują co najmniej 90% homologii do zestawu sekwencji CDR1, CDR2 i CDR3 wybranych z grupy składającej się odpowiednio, z SEQ ID NO: 17, 18 i 19, gdzie przeciwciało wiąże się z hil- 13Rα1 poprzez domenę 3 zewnątrzkomórkowego regionu receptora i wykazuje co najmniej jedną z właściwości funkcjonalnych od (i) do (iv) opisanych powyżej. [0081] W innym wykonaniu, wynalazek dostarcza wyizolowane przeciwciało monoklonalne obejmujące region zmienny łańcucha ciężkiego z zestawem sekwencji CDR1, CDR2 i CDR3, i region zmienny łańcucha lekkiego z zestawem sekwencji CDR1, CDR2 i CDR3, które wykazują co najmniej 90% homologii do zestawu sekwencji CDR1, CDR2 i CDR3 regionów zmiennych ciężkich i lekkich łańcuchów, które to sekwencje są wybrane z grupy składającej się odpowiednio, z SEQ ID NO: 13, 14, 15, 17, 18

30 29 i 19, gdzie przeciwciało wiąże się z hil -13Rα1 poprzez domenę 3 zewnątrzkomórkowego regionu receptora i wykazuje co najmniej jedną z właściwości funkcjonalnych od (i) do (iv) opisanych powyżej. [0082] Zgodnie z opisem, procent homologii między dwiema sekwencjami aminokwasowymi, lub pomiędzy dwoma zestawami sekwencji CDR, lub między dwoma sekwencjami nukleotydów, jest równoważny procentowi identyczności pomiędzy dwiema sekwencjami lub dwoma zestawami sekwencji CDR. Procent identyczności między dwiema sekwencjami lub dwoma zestawami sekwencji CDR jest funkcją liczby identycznych pozycji wspólnych dla obu sekwencji (tj. %homologii = #identycznych pozycji/całkowita liczba pozycji x 100), biorąc pod uwagę liczbę przerw, i długość każdej przerwy, które muszą być wprowadzone w celu przeprowadzenia optymalnego dopasowania dwóch sekwencji lub dwóch zestawów odpowiadających sobie sekwencji CDR (tzn. porównując względem siebie odpowiednich sekwencji CDR ciężkich i/lub lekkich łańcuchów). Porównanie sekwencji i określenie procenta identyczności między sekwencjami można przeprowadzić stosując algorytm matematyczny, jak opisano w nieograniczających przykładach poniżej. [0083] Procent identyczności pomiędzy sekwencjami aminokwasowymi i/lub sekwencjami nukleotydymi można określić stosując metody powszechnie znane w stanie techniki, na przykład algorytm Meyersa i Millera, Comput. Appl. Biosci, 4: , 1988, który został wykorzystany w oprogramowaniu ALIGN (wersja 2,0). Ponadto procent identyczności pomiędzy sekwencjami aminokwasów lub sekwencji nukleotydów można określić za pomocą programu GAP w pakiecie oprogramowania GCG

31 30 z wykorzystaniem parametrów domyślnych tego oprogramowania. Przeciwciała z modyfikacjami konserwatywnymi. [0084] Stosowane tu terminy konserwatywne modyfikacje sekwencji i modyfikacje konserwatywne używane są zamiennie i odnoszą się do modyfikacji reszt aminokwasowych, które nie zmniejszają lub zmieniają znacząco charakterystyki wiązania przeciwciała zawierającego tę sekwencję aminokwasów, ale może poprawić takie właściwości. Takie konserwatywne modyfikacje obejmują substytucje, addycje i delecje reszt aminokwasowych, a korzystnie konserwatywne substytucje reszt aminokwasowych. Zmiany można wprowadzić do przeciwciała według wynalazku standardowymi technikami znanymi w dziedzinie, takimi jak mutagenezy ukierunkowanej i mutagenezy z zastosowaniem PCR. Konserwatywne substytucje aminokwasów obejmują te, w których reszta aminokwasowa jest zastępowana przez resztę aminokwasową o podobnym łańcuchu bocznym. Rodziny reszt aminokwasowych mających podobne łańcuchy boczne zostały zdefiniowane w dziedzinie. Rodziny te obejmują aminokwasy z zasadowymi łańcuchami bocznymi (np. lizyna, arginina, histydyna), kwaśnymi łańcuchami bocznymi (np. kwas asparaginowy, kwas glutaminowy), nienaładowanymi polarnymi łańcuchami bocznymi (np. glicyna, asparagina, glutamina, seryna, treonina, tyrozyna, cysteina, tryptofan), niepolarnymi łańcuchami bocznymi (np. alanina, walina, leucyna, izoleucyna, prolina, fenyloalanina, metionina), łańcuchami bocznymi rozgałęzionymi w pozycji beta (np. treonina, walina, izoleucyna) i aromatycznymi łańcuchami bocznymi (np. tyrozyna, fenyloalanina, tryptofan, histydyna). Zatem, jedna lub więcej reszt aminokwasowych w obrębie regionów CDR przeciwciała według wynalazku mogą być

32 31 zastąpione innymi resztami aminokwasowymi z tej samej rodziny łańcucha bocznego i zmodyfikowane przeciwciało może być badane pod kątem utrzymania funkcji przy pomocy testów funkcjonalnych przedstawionych w opisie. Przeciwciała, które współzawodniczą z 4B5 i 8B11 lub 15F4. [0085] W innym wykonaniu, wynalazek dostarcza przeciwciał anty-hil-13rα1, które współzawodniczą o wiązanie hil-13rα1 z opisanymi przeciwciałami 4B5, 8B11 lub 15F4. Takie przeciwciała współzawodniczące mogą być identyfikowane na podstawie ich zdolności do konkurowania krzyżowego (np. do współzawodniczącego hamowania wiązania w sposób istotny statystycznie) z przeciwciałami 4B5, 8B11 lub 15F4 w standardowych testach wiązania IL-13Rα1. Zdolność badanego przeciwciała do hamowania wiązania 4B5, 8B11 lub 15F4 ludzkiej IL-13Rα1 pokazuje, że badane przeciwciało może konkurować z tym przeciwciałem w wiązaniu ludzkiej IL-13Rα1; takie przeciwciała mogą, zgodnie z nieograniczającą teorią, wiązać się z takim samym lub pokrewnym (np. strukturalnie podobnym lub przestrzennie zbliżonym) epitopem na ludzkiej IL-13Rα1 jak przeciwciała, z którymi współzawodniczy. Przeciwciała, które współzawodniczą o wiązanie się z co najmniej jednym z przeciwciał 4B5 i 8B11 lub 15F4 mogą być oceniane pod kątem (a) wiązania hil-13rα1 poprzez domenę 3 zewnątrzkomórkowego regionu receptora, oraz (b) posiadania co najmniej jednej z właściwości funkcjonalnych od (i) do (iv) opisanych powyżej. [0086] Swoiste przeciwciała współzawodniczące stanowią te, w których mutacja w peptydzie zawierającym domenę 3 hil-13rα1 polegająca na substytucji reszt Val-Phe-Tyr-Val-Gln (SEQ ID NO: 44), które odpowiadają pozycjom z SEQ ID nr: 1,