(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2014/18 EP B1 (13) (1) T3 Int.Cl. C07K 16/46 ( ) C07K 16/22 ( ) C07K 16/28 ( ) C07K 19/00 ( ) A61K 39/39 ( ) (4) Tytuł wynalazku: Dwuwartościowe bispecyficzne przeciwciała (30) Pierwszeństwo: EP (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2010/36 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2014/09 (73) Uprawniony z patentu: F. Hoffmann-La Roche AG, Basel, CH (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 CHRISTIAN KLEIN, Bonstetten, CH WOLFGANG SCHÄFER, Mannheim, DE (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Zofia Sulima SULIMA GRABOWSKA SIERZPUTOWSKA BIURO PATENTÓW I ZNAKÓW TOWAROWYCH SP.J. Skr. poczt Warszawa 10 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 SGS-494/VAL EP B1 Opis [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy nowych dwuwartościowych, bispecyficznych przeciwciał, ich wytwarzania i zastosowania. Tło wynalazku [0002] Zaprojektowane białka, takie jak bi- lub wielospecyficzne przeciwciała zdolne do wiązania się z dwoma lub większą liczbą antygenów, są znane w dziedzinie. Takie wielospecyficzne białka wiążące mogą być wytwarzane drogą fuzji komórek, sprzęgania chemicznego lub technik rekombinacji DNA. [0003] W ostatnim czasie opracowano wiele różnych formatów rekombinowanych bispecyficznych przeciwciał, np. czterowartościowe, bispecyficzne przeciwciała, drogą fuzji, np. przeciwciała formatu IgG i domen jednołańcuchowych (patrz np. Coloma, M.J., i in., Nature Biotech 1 (1997) ; WO ; i Morrison, S.L., Nature Biotech 2 (2007) ). [0004] Ponadto opracowano kilka innych nowych formatów, w których nie jest już zachowana rdzeniowa struktura przeciwciała (IgA, IgD, IgE, IgG lub IgM), takie jak dia-, tria- i tetraciała, miniciała, kilka formatów jednołańcuchowych (scfv, bis-scfv), które są zdolne do wiązania dwóch lub większej liczby antygenów (Holliger, P., i in., Nature Biotech 23 (200) ; Fischer, N., Léger O., Pathobiology 74 (2007) 3-14; Shen, J., i in., Journal of Immunological Methods 318 (2007) 6-74; Wu, C., i in., Nature Biotech 2 (2007) ). [000] Wszystkie takie formaty wykorzystują łączniki albo do połączenia rdzenia przeciwciała (IgA, IgD, IgE, IgG lub IgM) z kolejnym białkiem wiążącym (np. scfv), albo do połączenia np. dwóch fragmentów Fab lub scfv. (Fischer N., Léger O., Pathobiology 74 (2007) 3-14). Podczas gdy oczywiste jest, że łączniki mają zalety przy projektowaniu bispecyficznych przeciwciał, mogą one również powodować problemy w warunkach terapeutycznych. W rzeczywistosci, te obce peptydy mogą wywoływać odpowiedź immunologiczną skierowaną przeciw samemu łącznikowi lub połączeniu pomiędzy białkiem a łącznikiem. Co więcej, elastyczny charakter tych peptydów czyni je bardziej podatnymi na rozszczepienie proteolityczne, co może prowadzić do słabej trwałości przeciwciała, agregacji i zwiększonej immunogenności. Ponadto pożądane może być zachowanie funkcji efektorowych, takich jak np. cytotoksyczność zależna od dopełniacza (CDC) lub cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał (ADCC), w których pośredniczy wiązanie z receptorem Fc, przez zachowanie wysokiego stopnia podobieństwa do tych naturalnie występujących. [0006] Zatem w idealnym przypadku, należy dążyć do opracowania bispecyficznych przeciwciał, które są bardzo podobne w ogólnej strukturze do naturalnie występujących przeciwciał (takich jak IgA, IgD, IgE, IgG lub IgM), z minimalnymi różnicami względem ludzkich sekwencji. [0007] W jednym podejściu bispecyficzne przeciwciała, które są bardzo podobne do naturalnych przeciwciał, zostały wytworzone z użyciem technologii kwadroma (patrz Milstein, C. i A.C. Cuello, Nature, 30 (1983) 37-40) opartej na somatycznej fuzji dwóch różnych linii komórkowych hybrydomy eksprymujących mysie przeciwciała monoklonalne o pożądanej specyficzności dla bispecyficznego przeciwciała. Ze względu na losowe parowanie różnych łańcuchów ciężkich i lekkich dwóch różnych przeciwciał w otrzymanej linii komórkowej hybryd-hybrydomy (czyli kwadromy), uzyskuje się do dziesięciu różnych rodzajów przeciwciał, z których tylko jeden jest pożądanym funkcjonalnym bispecyficznym przeciwciałem. Ze względu na obecność źle sparowanych produktów ubocznych i znacznie zmniejszoną wydajność produkcji, wymagane są skomplikowane procedury oczyszczania

3 (patrz np. Morrison, S.L., Nature Biotech 2 (2007) ). Na ogół taki sam problem źle sparowanych produktów ubocznych pozostaje, gdy stosowane są techniki rekombinacyjnej ekspresji. [0008] Podejście pozwalające ominąć problem źle sparowanych produktów ubocznych, które jest znane jako knobs-into-holes ( gałki w dołkach ), ma na celu wymuszenie parowania dwóch różnych łańcuchów ciężkich przeciwciała poprzez wprowadzenie mutacji do domen CH3, aby zmodyfikować miejsce zetknięcia. Na jednym łańcuchu duże aminokwasy zostały zastąpione aminokwasami z krótkimi łańcuchami bocznymi w celu stworzenia dołka. Z kolei aminokwasy o dużych łańcuchach bocznych wprowadzono do drugiej domeny CH3, aby stworzyć gałkę. Przy koekspresji tych dwóch łańcuchów ciężkich (i dwóch identycznych łańcuchów lekkich, które muszą być odpowiednie dla obu łańcuchów ciężkich) stwierdzono wysoką wydajność powstawania heterodimeru ( gałka-dołek ) względem powstawania homodimeru ( dołek-dołek lub gałka-gałka ) (Ridgway, J.B., Presta LG, Carter P; i WO ). Procentowy udział heterodimerów można dalej zwiększyć przez przebudowę powierzchni oddziaływania dwóch domen CH3 z zastosowaniem metody prezentacji fagowej oraz wprowadzenia mostku disulfidowego do stabilizacji heterodimerów (Merchant, A.M., i in., Nature Biotech 16 (1998) ; Atwell, S., Ridgway, J.B., Wells, J.A., Carter, P., J Mol Biol 270 (1997) 26-3). Nowe podejście do technologii knobs-into-holes opisano np. w EP A1. Pomimo, iż wydaje się, że ten format jest bardzo atrakcyjny, obecnie brak jest danych opisujących postęp w kierunku stosowania klinicznego. Jednym ważnym ograniczeniem tej strategii jest to, że łańcuchy lekkie dwóch przeciwciał macierzystych muszą być identyczne, aby zapobiec nieprawidłowemu parowaniu i tworzeniu nieaktywnych cząsteczek. Zatem ta technika nie jest odpowiednia do łatwego opracowywania rekombinowanych dwuwartościowych, bispecyficznych przeciwciał przeciw dwóm antygenom, wychodząc z dwóch przeciwciał przeciw pierwszemu i drugiemu antygenowi, ponieważ łańcuchy ciężkie tych przeciwciał i/lub identyczne łańcuchy lekkie muszą zostać zoptymalizowane. [0009] Simon T. i in., EMBO Journal, 9 (1990) dotyczy zmutowanych domen przeciwciał monospecyficznych. W WO93/06217 ujawniono sprzęganie dwóch fragmentów mono- lub bispecyficznych przeciwciał z zastosowaniem reszty cysteiny z wolną grupą tiolową. W WO99/37791 ujawniono zastosowanie oddziaływania CL-CH1 jako rusztowania do heterodimeryzacji dla konstruktów przeciwciał bispecyficznych lub wielospecyficznych. Streszczenie wynalazku [0010] Wynalazek dotyczy dwuwartościowego, bispecyficznego przeciwciała, zawierającego: a) łańcuch lekki i łańcuch ciężki przeciwciała specyficznie wiążącego się z pierwszym antygenem; oraz b) łańcuch lekki i łańcuch ciężki przeciwciała specyficznie wiążącego się z drugim antygenem, w którym domeny stałe CL i CH1 są wzajemnie zastąpione. [0011] Kolejną postacią wynalazku jest sposób wytwarzania dwuwartościowego, bispecyficznego przeciwciała według wynalazku obejmujący etapy a) transformowania komórki gospodarza z użyciem - wektorów zawierających cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące łańcuch lekki i łańcuch ciężki przeciwciała specyficznie wiążącego się z pierwszym antygenem - wektorów zawierających cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące łańcuch lekki i łańcuch ciężki przeciwciała specyficznie wiążącego się z drugim antygenem, w którym domeny stałe CL i CH1 są wzajemnie zastąpione;

4 b) hodowania komórki gospodarza w warunkach umożliwiających syntezę tej cząsteczki przeciwciała; i c) odzyskiwania tej cząsteczki przeciwciała z tej hodowli. [0012] Kolejną postacią wynalazku jest komórka gospodarz zawierająca - wektory zawierające cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące łańcuch lekki i łańcuch ciężki przeciwciała specyficznie wiążącego się z pierwszym antygenem - wektory zawierające cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące łańcuch lekki i łańcuch ciężki przeciwciała specyficznie wiążącego się z drugim antygenem, w którym domeny stałe CL i CH1 są wzajemnie zastąpione. [0013] Kolejną postacią wynalazku jest kompozycja, korzystnie kompozycja farmaceutyczna lub diagnostyczna, przeciwciała według wynalazku. [0014] Kolejną postacią wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca przeciwciało według wynalazku i co najmniej jedną farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę. [001] Kolejną postacią wynalazku jest sposób leczenia pacjenta potrzebującego terapii, charakteryzujący się podawaniem pacjentowi terapeutycznie skutecznej ilości przeciwciała według wynalazku. Szczegółowy Opis Wynalazku [0016] Wynalazek dotyczy dwuwartościowego, bispecyficznego przeciwciała, zawierającego: a) łańcuch lekki i łańcuch ciężki przeciwciała specyficznie wiążącego się z pierwszym antygenem; oraz b) łańcuch lekki i łańcuch ciężki przeciwciała specyficznie wiążącego się z drugim antygenem, w którym domeny stałe CL i CH1 są wzajemnie zastąpione. [0017] Zatem to dwuwartościowe, bispecyficzne przeciwciało zawiera: a) pierwszy łańcuch lekki i pierwszy łańcuch ciężki przeciwciała specyficznie wiążącego się z pierwszym antygenem; oraz b) drugi łańcuch lekki i drugi łańcuch ciężki przeciwciała specyficznie wiążącego się z drugim antygenem, przy czym domeny stałe CL i CH1 z drugiego łańcucha lekkiego są wzajemnie zastąpione. [0018] Zatem dla tego przeciwciała specyficznie wiążącego się z drugim antygenem obowiązuje co następuje: w łańcuchu lekkim domena stała łańcucha lekkiego CL jest zastąpiona domeną stałą łańcucha ciężkiego CH1 tego przeciwciała; a w łańcuchu ciężkim domena stała łańcucha ciężkiego CH1 jest zastąpiona domeną stałą łańcucha lekkiego CL tego przeciwciała. [0019] Stosowane tu określenie przeciwciało odnosi się do całych przeciwciał monoklonalnych. Takie całe przeciwciała składają się z dwóch par łańcucha lekkiego (LC) i łańcucha ciężkiego (HC) (takie pary łańcucha lekkiego (LC)/łańcucha ciężkiego są tu określane skrótowo jako LC/HC). Łańcuchy lekkie i łańcuchy ciężkie takich przeciwciał są polipeptydami składającymi się z kilku domen. W całym przeciwciele, każdy łańcuch ciężki zawiera region zmienny łańcucha ciężkiego (określany tu skrótem HCVR lub VH) oraz region stały łańcucha ciężkiego. Region stały łańcucha ciężkiego zawiera domeny stałe łańcucha ciężkiego CH1, CH2 i CH3 (klasy przeciwciał IgA, IgD i IgG) i ewentualnie domenę stałą łańcucha ciężkiego CH4 (klasy przeciwciał IgE i IgM). Każdy łańcuch lekki składa się z domeny zmiennej łańcucha lekkiego VL i domeny stałej łańcucha lekkiego CL. Struktura jednego z naturalnie występujących całych przeciwciał, przeciwciała IgG, jest

5 przedstawiona np. na Fig. 1. Domeny zmienne VH i VL można dalej podzielić na regiony hiperzmienności, określane jako regiony determinujące komplementarność (CDR), przedzielone bardziej konserwatywnymi regionami, nazywanymi regionami zrębowymi (FR). Każda VH i VL składa się z trzech CDR i czterech FR, ułożonych od końca aminowego do końca karboksylowego w następującej kolejności: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 ((Janeway, C.A., Jr, i in., (2001). Immunobiology.,. wydanie, Garland Publishing; i Woof, J., Burton, D., Nat Rev Immunol 4 (2004) 89-99). Dwie pary łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego (HC/LC) są zdolne do specyficznego wiązania się z tym samym antygenem. Zatem to całe przeciwciało jest dwuwartościowym, monospecyficznym przeciwciałem. Takie przeciwciała obejmują np. przeciwciała mysie, przeciwciała ludzkie, przeciwciała chimeryczne, przeciwciała humanizowane i przeciwciała zmodyfikowane genetycznie (warianty lub zmutowane przeciwciała), o ile ich charakterystyczne właściwości są zachowane. Szczególnie korzystne są przeciwciała ludzkie lub humanizowane, zwłaszcza rekombinowane przeciwciała ludzkie lub humanizowane. [0020] Istnieje pięć typów łańcuchów ciężkich ssaczych przeciwciał, oznaczonych greckimi literami: α, δ, ε, γ i µ (Janeway, CA, Jr, i in., (2001). Immunobiology.,. wydanie, Garland Publishing). Typ obecnego łańcucha ciężkiego określa klasę przeciwciała; Łańcuchy te znajdują się odpowiednio w przeciwciałach IgA, IgD, IgE, IgG, i IgM (Rhoades RA, Pflanzer RG (2002). Human Physiology, 4. wydanie, Thomson Learning). Różne łańcuchy ciężkie różnią się wielkością i składem; α i γ zawierają około 40 aminokwasów, a µ i ε mają około 0 aminokwasów. [0021] Każdy łańcuch ciężki zawiera dwa regiony, region stały i region zmienny. Region stały jest identyczny we wszystkich przeciwciałach o tym samym izotypie, ale różni się w przeciwciałach o innym izotypie. Łańcuchy ciężkie γ, α i δ mają region stały złożony z trzech stałych domen CH1, CH2 i CH3 (w linii) i region zawiasowy dla zwiększenia elastyczności (Hau, J., Burton, D., Nat Rev Immunol 4 (2004) 89-99); łańcuchy ciężkie µ i ε mają region stały złożony z czterech stałych domen CH1, CH2, CH3 i CH4 (Janeway, C.A., Jr. i in. (2001). Immunobiology.,. wydanie, Garland Publishing). Region zmienny łańcucha ciężkiego różni się w przeciwciałach wytwarzanych przez różne komórki B, ale jest taki sam dla wszystkich przeciwciał wytwarzanych przez jedną komórkę B lub klon komórki B. Region zmienny każdego łańcucha ciężkiego ma długość około 110 aminokwasów i składa się z pojedynczej domeny przeciwciała. [0022] U ssaków występują tylko dwa typy łańcuchów lekkich, które są nazywane lambda (λ) i kappa (κ). Łańcuch lekki zawiera dwie kolejne domeny: jedną domenę stałą CL i jedną domenę zmienną VL. Przybliżona długość łańcucha lekkiego wynosi 211 do 217 aminokwasów. Korzystnie łańcuch lekki jest łańcuchem lekkim typu kappa (κ), a domena stała CL jest korzystnie C kappa (κ). [0023] Stosowane tu określenia przeciwciało monoklonalne lub kompozycja przeciwciała monoklonalnego odnoszą się do preparatu cząsteczek przeciwciała o pojedynczym składzie aminokwasowym. [0024] Przeciwciała według wynalazku mogą być jakiejkolwiek klasy (np. IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a korzystnie IgG lub IgE) lub podklasy (np. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2, korzystnie IgG1), przy czym oba przeciwciała, z których uzyskane jest dwuwartościowe, bispecyficzne przeciwciało według wynalazku, zawierają część Fc z tej samej podklasy (np. IgG1, IgG4 i tym podobne, korzystnie IgG1), korzystnie tego samego allotypu (np. rasy kaukaskiej). [002] Część Fc przeciwciała jest określeniem dobrze znanym specjaliście w dziedzinie i zdefiniowanym na podstawie rozszczepiania przeciwciał papainą. Przeciwciała według wynalazku zawierają jako część Fc, korzystnie część Fc pochodzenia ludzkiego i korzystnie wszystkie inne części ludzkich regionów stałych. Część Fc przeciwciała jest bezpośrednio zaangażowana w aktywację dopełniacza, wiązanie C1q, aktywację C3 i wiązanie receptora Fc. Podczas gdy wpływ przeciwciała na układ dopełniacza jest zależny od okre-

6 ślonych warunków, wiązanie z C1q jest wywołane przez określone miejsca wiążące w części Fc. Takie miejsca wiążące są znane w dziedzinie i opisane np. przez Lukas, T.J., i in., J. Immunol. 127 (1981) 2-260; Brunhouse, R., i Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) ; Burton, D.R., i in., Nature 288 (1980) ; Thommesen, J.E., i in., Mol. Immunol. 37 (2000) ; Idusogie, E.E., i in., J. Immunol. 164 (2000) ; Hezareh, M., i in., J. Virol. 7 (2001) ; Morgan, A., i in., Immunology 86 (199) ; i EP Takimi miejscami wiążącymi są np. L234, L23, D270, N297, E318, K320, K322, P331 i P329 (numeracja zgodna z indeksem EU według Kabata, patrz niżej). Przeciwciała podklasy IgG1, IgG2 i IgG3 zwykle wykazują aktywację dopełniacza, wiązanie C1q i aktywację C3, podczas gdy IgG4 nie aktywują układu dopełniacza, nie wiążą C1q i nie aktywują C3. Część Fc jest korzystnie ludzką częścią Fc. [0026] Określenie przeciwciało chimeryczne odnosi się do przeciwciała zawierającego region zmienny, tj. region wiążący, z jednego źródła lub gatunku i co najmniej część regionu stałego pochodzącego z innego źródła lub gatunku, zazwyczaj wytwarzanego technikami rekombinacji DNA. Korzystne są przeciwciała chimeryczne zawierające mysi region zmienny i ludzki region stały. Innymi korzystnymi postaciami chimerycznych przeciwciał objętymi niniejszym wynalazkiem są te, w których region stały został zmodyfikowany lub zmieniony w stosunku do pierwotnego przeciwciała w celu uzyskania właściwości zgodnych z wynalazkiem, zwłaszcza w odniesieniu do wiązania C1q i/lub wiązania receptora Fc (FcR). Takie chimeryczne przeciwciała są również określane jako przeciwciała z przełączoną klasą. Chimeryczne przeciwciała są produktem ekspresji genów immunoglobulin zawierających segmenty DNA kodujące regiony zmienne immunoglobulin i segmenty DNA kodujące regiony stałe immunoglobulin. Do sposobów wytwarzania przeciwciał chimerycznych należą standardowe techniki rekombinacji DNA i transfekcji genów, które są dobrze znane w dziedzinie. Patrz np. Morrison, S.L., i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) ; US i US [0027] Określenie humanizowane przeciwciało odnosi się do przeciwciał, w których zrąb lub regiony determinujące komplementarność (CDR) zostały zmodyfikowane tak, że zawierają CDR immunoglobuliny o innej specyficzności w porównaniu z immunoglobuliną macierzystą. W korzystnej postaci, mysi CDR jest przeszczepiony do regionu zrębowego ludzkiego przeciwciała z wytworzeniem humanizowanego przeciwciała. Patrz, na przykład, Riechmann, L., i in., Nature 332 (1988) ; i Neuberger, M.S., i in., Nature 314 (198) Szczególnie korzystne CDR odpowiadają tym, które stanowią sekwencje rozpoznające antygeny wspomniane powyżej dla przeciwciał chimerycznych. Innymi postaciami humanizowanych przeciwciał objętymi niniejszym wynalazkiem są te, w których stały region został dodatkowo zmodyfikowany lub zmieniony względem pierwotnego przeciwciała w celu uzyskania właściwości zgodnych z wynalakiem, zwłaszcza w odniesieniu do wiązania C1q i/lub wiązania z receptorem Fc (FcR). [0028] Stosowane tu określenie ludzkie przeciwciało z zamierzenia obejmuje przeciwciała zawierające regiony zmienne i stałe pochodzące z ludzkich sekwencji immunoglobulin linii zarodkowych. Ludzkie przeciwciała są dobrze znane w dziedzinie (van Dijk, M.A., i van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. (2001) ). Ludzkie przeciwciała można również wytwarzać w zwierzętach transgenicznych (np. myszach), które są zdolne, po immunizacji, do wytwarzania pełnego repertuaru lub wybranych ludzkich przeciwciał przy braku wytwarzania endogennych immunoglobulin. Przeniesienie zestawu ludzkich genów immunoglobulin z linii zarodkowej do takich myszy o zmutowanej linii zarodkowej będzie powodować wytwarzanie ludzkich przeciwciał po ekspozycji na antygen (patrz np. Jakobovits, A., i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 21-2; Jakobovits, A., i in., Nature 362 (1993) 2-28; Bruggemann, M., i in., Year Immunol. 7 (1993) 33-40). Ludzkie przeciwciała można również wytwarzać w bibliotekach fagowych (Hoogenboom, H.R., i Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) ; Marks, J.D., i in., J. Mol. Biol. 222 (1991) 81-97). Dostępne są też techniki Cole i in. oraz Boerner i in. do wytwarzania ludzkich

7 przeciwciał monoklonalnych (Cole i in. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, str. 77 (198); oraz Boerner, P., i in. J. Immunol.147 (1991) 86-9). Jak już wspomniano dla przeciwciał chimerycznych i humanizowanych według wynalazku stosowane tu określenie przeciwciało ludzkie obejmuje również takie przeciwciała, które zostały zmodyfikowane w regionie stałym w celu uzyskania właściwości według wynalazku/zgodnych z wynalazkiem, zwłaszcza w odniesieniu do wiązania C1q i/lub wiązania FcR, np. drogą przełączenia klasy, czyli zmiany lub mutacji części Fc (np. z IgG1 na IgG4 i/lub mutacji IgG1/IgG4). [0029] Stosowane tu określenie rekombinowane ludzkie przeciwciało z zamierzenia obejmuje wszystkie ludzkie przeciwciała, które są wytwarzane, eksprymowane, tworzone lub izolowane metodami rekombinacyjnymi, takie jak przeciwciała izolowane z komórki gospodarza, takiej jak komórka NS0 lub CHO lub ze zwierzęcia (np. myszy), które jest transgeniczne pod względem ludzkich genów immunoglobulin lub przeciwciała eksprymowane z użyciem rekombinowanych wektorów ekspresyjnych, którymi transfekowano komórki gospodarzy. Takie rekombinowane ludzkie przeciwciała mają regiony zmienne i stałe w postaci rearanżowanej. Rekombinowane ludzkie przeciwciała według wynalazku poddano hipermutacji somatycznej in vivo. Zatem sekwencje aminokwasowe regionów VH i VL rekombinowanych przeciwciał są sekwencjami, które mimo iż pochodzą i są spokrewnione z sekwencjami VH i VL z ludzkiej linii zarodkowej, mogą nie występować naturalnie w repertuarze ludzkich przeciwciał linii zarodkowej in vivo. [0030] Stosowane tu określenie domena zmienna (domena zmienna łańcucha lekkiego (VL), region zmienny łańcucha ciężkiego (VH)) oznacza każdy z pary łańcuchów ciężkiego i lekkiego, który uczestniczy bezpośrednio w wiązaniu przeciwciała z antygenem. Domeny ludzkiego zmiennego łańcucha lekkiego i ciężkiego mają taką samą ogólną strukturę, a każda domena zawiera cztery regiony zrębowe (FR), których sekwencje są silnie konserwatywne, połączone przez trzy regiony hiperzmienne (lub regiony determinujące komplementarność, CDR). Regiony zrębowe przyjmują konformację β-kartki, a CDR mogą tworzyć pętle łączące strukturę β-kartki. CDR w każdym łańcuchu są utrzymywane w swojej strukturze trójwymiarowej przez regiony zrębowe i razem z CDR innego łańcucha tworzą miejsce wiążące antygen. Regiony CDR3 łańcucha ciężkiego i lekkiego przeciwciała odgrywają szczególnie ważną rolę w specyficzności/ powinowactwie wiązania przeciwciał według wynalazku, a zatem stanowią kolejny przedmiot wynalazku. [0031] Stosowane tu określenia region hiperzmienny lub część przeciwciała wiążąca antygen odnoszą się do reszt aminokwasowych przeciwciała, które są odpowiedzialne za wiązanie antygenu. Region hiperzmienny zawiera reszty aminokwasowe z regionów determinujących komplementarność lub CDR. Regiony zrębowe lub FR są regionami domeny zmiennej innymi niż reszty regionu hiperzmiennego, jak tu określono. W związku z tym, łańcuchy lekkie i ciężkie przeciwciała zawierają od N- do C-końca domeny FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. CDR w każdym łańcuchu są oddzielone takimi aminokwasami zrębowymi. W szczególności CDR3 łańcucha ciężkiego jest regionem, który najbardziej przyczynia się do wiązania antygenu. Regiony CDR i FR określa się według standardowej definicji z Kabat i in., Sequences of Proteins of Immunological Interest,. wydanie, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). [0032] Domeny stałe łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego nie są bezpośrednio zaangażowane w wiązanie przeciwciała z antygenem, ale wykazują różne funkcje efektorowe. W zależności od sekwencji aminokwasowej regionu stałego ich łańcuchów ciężkich, przeciwciała lub immunoglobuliny zostały podzielone na klasy: [0033] Stosowane tu określenie dwuwartościowe, bispecyficzne przeciwciało odnosi się do przeciwciała, jak opisano powyżej, w którym każda z dwóch par łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego (HC/LC) specyficznie wiąże się z innym antygenem, tj. pierwszy łańcuch ciężki i pierwszy łańcuch lekki (pochodzące z przeciwciała przeciwko pierwszemu antygenowi) specyficznie wiążą się razem z pierwszym antygenem, a drugi łańcuch ciężki

8 i drugi łańcuch lekki (pochodzące z przeciwciała przeciwko drugiemu antygenowi) specyficznie wiążą się razem z drugim antygenem (jak przedstawiono na fig. 2); takie dwuwartościowe, bispecyficzne przeciwciała są zdolne do specyficznego wiązania się z dwoma różnymi antygenami w tym samym czasie, i nie więcej niż z dwoma antygenami, w przeciwieństwie, z jednej strony do monospecyficznego przeciwciała zdolnego do wiązania się tylko z jednym antygenem, a z drugiej strony np. do czterowartościowego, tetraspecyficznego przeciwciała, które może wiązać się z czterema cząsteczkami antygenów w tym samym czasie. [0034] Zgodnie z wynalazkiem, stosunek pożądanego dwuwartościowego, bispecyficznego przeciwciała do niepożądanych produktów ubocznych można polepszyć przez zastąpienie pewnych domen tylko w jednej parze łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego (HC/LC). Podczas gdy pierwsza z dwóch par HC/LC pochodzi z przeciwciała specyficznie wiążącego się z pierwszym antygenem i pozostaje zasadniczo niezmieniona, druga z dwóch par HC/LC pochodzi z przeciwciała specyficznie wiążącego się z drugim antygenem i jest zmieniona przez następujące zastąpienie: - łańcuch lekki: zastąpienie stałej domeny łańcucha lekkiego CL domeną stałą łańcucha ciężkiego CH1 z tego przeciwciała specyficznie wiążącego się z drugim antygenem, i - łańcuch ciężki: zastąpienie stałej domeny łańcucha ciężkiego CH1 domeną stałą łańcucha lekkiego CL z tego przeciwciała specyficznie wiążącego się z drugim antygenem. [003] W ten sposób otrzymane dwuwartościowe, bispecyficzne przeciwciała są sztucznymi przeciwciałami, które zawierają a) łańcuch lekki i łańcuch ciężki przeciwciała specyficznie wiążącego się z pierwszym antygenem; oraz b) łańcuch lekki i łańcuch ciężki przeciwciała specyficznie wiążącego się z drugim antygenem; przy czym ten łańcuch lekki (z przeciwciała specyficznie wiążącego się z drugim antygenem) zawiera stałą domenę CH1 zamiast CL przy czym ten łańcuch ciężki (z przeciwciała specyficznie wiążącego się z drugim antygenem) zawiera stałą domenę CL zamiast CH1. [0036] W dodatkowym aspekcie wynalazku, taki polepszony stosunek pożądanego dwuwartościowego, bispecyficznego przeciwciała do niepożądanych produktów ubocznych może być dodatkowo poprawiony przez jedną z dwóch następujących możliwości: A) Pierwsza możliwość (patrz Fig. 3): [0037] Domeny CH3 tego dwuwartościowego, bispecyficznego przeciwciała według wynalazku mogą być zmieniane z użyciem technologii knob-into-holes, którą opisano szczegółowo w kilku przykładach np. w WO 96/027011, Ridgeway, JB i in., Protein Eng 9 (1996) ; oraz Merchant, AM, i in., Nat Biotechnol 16 (1998) W tym sposobie, powierzchnie oddziaływania dwóch domen CH3 są zmienione w celu zwiększenia heterodimeryzacji obu łańcuchów ciężkich zawierających te dwie domeny CH3. Każda z tych dwóch domen CH3 (z dwóch łańcuchów ciężkich) może być gałką, podczas gdy druga jest dołkiem. Wprowadzenie mostka disulfidowego stabilizuje heterodimery (Merchant, A..M., i in., Nature Biotech 16 (1998) ; Atwell, S., Ridgway, J.B., Wells, J.A., Carter, P., J Mol Biol 270 (1997) 26-3) i zwiększa wydajność. [0038] Zatem w korzystnej postaci domeny CH3 dwuwartościowego, bispecyficznego przeciwciała, w którym pierwsza domena CH3 i druga domena CH3 spotykają się w miejscy zetknięcia, które stanowi pierwotne miejsce zetknięcia między domenami CH3 przeciwciała, są zmienione z zastosowaniem technologii knob-into-holes, włączając dodat-

9 kową stabilizację przez wprowadzenie mostka disulfidowego w domenach CH3 (opisane w WO 96/027011, Ridgway, J.B., i in., Protein Eng 9 (1996) ; Merchant. A.M, i in., Nature Biotech 16 (1998) ; oraz Atwell, S., Ridgway, J.B., Wells, J.A., Carter P., J Mol Biol 270 (1997) 26-3), co sprzyja tworzeniu się dwuwartościowego, bispecyficznego przeciwciała. [0039] Tak więc w jednym aspekcie wynalazku, to dwuwartościowe, bispecyficzne przeciwciało charakteryzuje się tym, że domena CH3 z jednego łańcucha ciężkiego i domena CH3 z drugiego łańcucha ciężkiego spotykają się w miejscu zetknięcia, które stanowi pierwotne miejsce zetknięcia między domenami CH3 przeciwciała; przy czym to miejsce zetknięcia jest zmienione, tak że sprzyja tworzeniu się dwuwartościowego, bispecyficznego przeciwciała, przy czym ta zmiana charakteryzuje sieę tym, że: a) domena CH3 z jednego łańcucha ciężkiego jest zmieniona, tak że w pierwotnym miejscu zetknięcia domeny CH3 z jednego łańcucha ciężkiego, które spotyka się z pierwotnym miejscem zetknięcia domeny CH3 z drugiego łańcucha ciężkiego w dwuwartościowym, bispecyficznym przeciwciele, reszta aminokwasowa jest zastąpiona resztą aminokwasową z łańcuchem bocznym o większej objętości, tworząc tym samym wypukłość w miejscu zetknięcia domeny CH3 z jednego łańcucha ciężkiego, która mieści się we wnęce w miejscu zetknięcia domeny CH3 z drugiego łańcucha ciężkiego oraz b) domena CH3 z drugiego łańcucha ciężkiego jest zmieniona, tak że w pierwotnym miejscu zetknięcia drugiej domeny CH3, które spotyka się z pierwotnym miejscem zetknięcia pierwszej domeny CH3 w dwuwartościowym, bispecyficznym przeciwciele, reszta aminokwasowa jest zastąpiona resztą aminokwasową z łańcuchem bocznym o mniejszej objętości, tworząc tym samym wnękę w miejscu zetknięcia drugiej domeny CH3, w której mieści się wypukłość z miejsca zetknięcia pierwszej domeny CH3. [0040] Korzystnie, ta reszta aminokwasowa z łańcuchem bocznym o większej objętości jest wybrana z grupy obejmującej argininę (R), fenyloalaninę (F), tyrozynę (Y), tryptofan (W). [0041] Korzystnie, ta reszta aminokwasowa z łańcuchem bocznym o mniejszej objętości jest wybrana z grupy obejmującej alaninę (A), serynę (S), treoninę (T), walinę (V). [0042] W jednym aspekcie wynalazku obie domeny CH3 są dodatkowo zmienione przez wprowadzenie cysteiny (C) jako aminokwasu w odpowiednich pozycjach każdej domeny CH3, tak że może powstać mostek disulfidowy między obiema domenami CH3. [0043] W innej korzystnej postaci wynalazku obie domeny CH3 są zmieniane przez zastosowanie reszt R409D; K370E (K409D) jako reszt gałek i reszt D399K; E37K jako reszt dołków, jak opisano np. w EP A1. lub B) Druga możliwość (patrz Figura 4): [0044] Zastąpienie jednej z domen stałych łańcucha ciężkiego CH3 domeną stałą łańcucha ciężkiego CH1; i zastąpienie drugiej domeny stałej łańcucha ciężkiego CH3 domeną stałą łańcucha lekkiego CL. Domena stała łańcucha ciężkiego CH1, którą zastępuje się domenę łańcucha ciężkiego CH3 może być dowolnej klasy Ig (np. IgA, IgD, IgE, IgG i IgM) lub podklasy (np. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2). Domena stała łańcucha lekkiego CL, którą zastępuje się domenę łańcucha ciężkiego CH3 może być typu lambda (λ) lub kappa (κ), korzystnie typu kappa (κ). [004] Zatem jedną korzystną postacią wynalazku jest dwuwartościowe, bispecyficzne przeciwciało, zawierające: a) łańcuch lekki i łańcuch ciężki przeciwciała specyficznie wiążącego się z pierwszym antygenem; oraz

10 b) łańcuch lekki i łańcuch ciężki przeciwciała specyficznie wiążącego się z drugim antygenem; w którym domeny stałe CL i CH1 zostały wzajemnie zastąpione, i przy czym ewentualnie c) domena CH3 z jednego łańcucha ciężkiego i domena CH3 z drugiego łańcucha ciężkiego spotykają się w miejscu zetknięcia, które stanowi pierwotne miejsce zetknięcia między domenami CH3 przeciwciała; przy czym to miejsce zetknięcia jest zmienione, tak że sprzyja tworzeniu się dwuwartościowego, bispecyficznego przeciwciała, przy czym ta zmiana charakteryzuje się tym, że: ca) domena CH3 z jednego łańcucha ciężkiego jest zmieniona, tak że w pierwotnym miejscu zetknięcia domeny CH3 z jednego łańcucha ciężkiego, które spotyka się z pierwotnym miejscem zetknięcia domeny CH3 z drugiego łańcucha ciężkiego w dwuwartościowym, bispecyficznym przeciwciele, reszta aminokwasowa jest zastąpiona resztą aminokwasową z łańcuchem bocznym o większej objętości, tworząc tym samym wypukłość w miejscu zetknięcia domeny CH3 z jednego łańcucha ciężkiego, która mieści się we wnęce w miejscu zetknięcia domeny CH3 z drugiego łańcucha ciężkiego oraz cb) domena CH3 z drugiego łańcucha ciężkiego jest zmieniona, tak że w pierwotnym miejscu zetknięcia drugiej domeny CH3, które spotyka się z pierwotnym miejscem zetknięcia pierwszej domeny CH3 w dwuwartościowym, bispecyficznym przeciwciele, reszta aminokwasowa jest zastąpiona resztą aminokwasową z łańcuchem bocznym o mniejszej objętości, tworząc tym samym wnękę w miejscu zetknięcia drugiej domeny CH3, w której mieści się wypukłość z miejsca zetknięcia pierwszej domeny CH3; lub d) jedna domena stała łańcucha ciężkiego CH3 jest zastąpiona domeną stałą łańcucha ciężkiego CH1; a druga domena stała łańcucha ciężkiego CH3 jest zastąpiona domeną stałą łańcucha lekkiego CL [0046] Stosowane tu określenia antygen lub cząsteczka antygenu są stosowane zamiennie i odnoszą się do wszelkich cząsteczek, które mogą być specyficznie wiązane przez przeciwciało. Dwuwartościowe, bispecyficzne przeciwciało specyficznie wiąże się z pierwszym antygenem i drugim odrębnym antygenem. Stosowane tu określenie antygeny obejmuje np. białka, różne epitopy na białkach (jako różne antygeny w rozumieniu niniejszego wynalazku) i polisacharydy. Dotyczy to głównie części (płaszczy, otoczek, ścian komórkowych, rzęsek, fimbrii i toksyn) z bakterii, wirusów oraz innych mikroorganizmów. Lipidy i kwasy nukleinowe są antygenowe jedynie w połączeniu z białkami i polisacharydami. Egzogenne wobec mikroorganizmów (nie-własne) antygeny mogą obejmować pyłek, białko jaja i białka z przeszczepionych tkanek i narządów lub z powierzchni krwinek poddawanych transfuzji. Korzystnie antygen jest wybrany z grupy obejmującej cytokiny, białka powierzchniowe komórek, enzymy i receptory. [0047] Antygeny nowotworowe są tymi antygenami, które są prezentowane przez cząsteczki MHC I i MHC II na powierzchni komórek nowotworowych. Antygeny te mogą czasami być prezentowane przez komórki nowotworowe, a nigdy przez zdrowe komórki. W tym przypadku, są one nazywane antygenami specyficznymi dla nowotworu (TSA) i są zazwyczaj wynikiem specyficznej mutacji nowotworowej. Bardziej powszechne są antygeny, które są prezentowane przez komórki nowotworowe i zdrowe komórki i są nazywane antygenami związanymi z nowotworem (TAA). Cytotoksyczne limfocyty T, które rozpoznały te antygeny mogą być w stanie zniszczyć komórki nowotworowe przed ich namnożeniem lub wytworzeniem przerzutów. Antygeny nowotworowe mogą się również znajdować na powierzchni guza w postaci na przykład zmutowanego receptora, w którym to przypadku będą rozpoznawane przez komórki B.

11 [0048] W jednej korzystnej postaci co najmniej jeden z dwóch różnych antygenów (pierwszego i drugiego antygenu), z którymi specyficznie wiąże się dwuwartościowe, bispecyficzne przeciwciało, jest antygenem nowotworowym. [0049] W innej korzystnej postaci oba z dwóch różnych antygenów (pierwszego i drugiego antygenu), z którymi specyficznie wiąże się dwuwartościowe, bispecyficzne przeciwciało, są antygenami nowotworowymi; w tym przypadku pierwszy i drugi antygen mogą być również dwoma różnymi epitopami na tym samym białku specyficznym dla nowotworu. [000] W innej korzystnej postaci jeden z dwóch różnych antygenów (pierwszego i drugiego antygenu), z którymi specyficznie wiąże się dwuwartościowe, bispecyficzne przeciwciało, jest antygenem nowotworowym, a drugi jest antygenem komórki efektorowej, jak np. receptorem komórek T, CD3, CD16 i tym podobnym. [001] W innej korzystnej postaci jeden z dwóch różnych antygenów (pierwszego i drugiego antygenu), z którymi specyficznie wiąże się dwuwartościowe, bispecyficzne przeciwciało, jest antygenem nowotworowym, a drugi jest substancją przeciwnowotworową, taką jak toksyna lub inhibitor kinazy. [002] Stosowane tu określenie specyficznie wiążące lub specyficznie wiąże się z odnosi się do przeciwciała specyficznie wiążącego antygen. Korzystnie, powinowactwo wiązania przeciwciała specyficznie wiążącego ten antygen ma wartość KD równą 10-9 mola/l lub niższą (np mola/l), korzystnie wartość KD równą mola/l lub niższą (np moal/l). Powinowactwo wiązania określa się w standardowym teście wiązania, takim jak technika powierzchniowego rezonansu plazmonowego (Biacore ). [003] Określenie epitop obejmuje jakąkolwiek determinantę polipeptydową zdolną do specyficznego wiązania się z przeciwciałem. W niektórych postaciach, determinanta epitopu obejmuje aktywne chemicznie ugrupowania powierzchniowe cząsteczek, takich jak aminokwasy, cukrowe łańcuchy boczne, grupy fosforylowe albo sulfonylowe, a w niektórych postaciach, może mieć specyficzne cechy struktury trójwymiarowej i/lub specyficzne właściwości ładunku. Epitop jest regionem antygenu, który jest wiązany przez przeciwciało. W niektórych postaciach mówi się, że przeciwciało wiąże się specyficznie z antygenem, gdy preferencyjnie rozpoznaje swój docelowy antygen w złożonej mieszaninie białek i/lub makrocząsteczek. [004] Kolejną postacią wynalazku jest sposób wytwarzania dwuwartościowego, bispecyficznego przeciwciała według wynalazku obejmujący a) transformowanie komórki gospodarza z użyciem - wektorów zawierających cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące łańcuch lekki i łańcuch ciężki przeciwciała specyficznie wiążącego się z pierwszym antygenem - wektorów zawierających cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące łańcuch lekki i łańcuch ciężki przeciwciała specyficznie wiążącego się z drugim antygenem, w którym domeny stałe CL i CH1 są wzajemnie zastąpione; b) hodowanie komórki gospodarza w warunkach umożliwiających syntezę tej cząsteczki przeciwciała; i c) odzyskiwanie tej cząsteczki przeciwciała z tej hodowli. [00] Zazwyczaj istnieją dwa wektory kodujące łańcuch lekki i łańcuch ciężki tego przeciwciała specyficznie wiążącego się z pierwszym antygenem oraz kolejne dwa wektory kodujące łańcuch lekki i łańcuch ciężki tego przeciwciała specyficznie wiążącego się z drugim antygenem. Jeden z tych dwóch wektorów koduje odpowiedni łańcuch lekki, a drugi z tych dwóch wektorów koduje odpowiedni łańcuch ciężki. Jednak w alternatywnym sposobie wytwarzania dwuwartościowego, bispecyficznego przeciwciała według wynalazku do transformacji komórki gospodarza można zastosować tylko jeden pierwszy wektor kodujący łańcuch lekki i łańcuch ciężki przeciwciała specyficznie wiążącego się z pierw-

12 szym antygenem i tylko jeden drugi wektor kodujący łańcuch lekki i łańcuch ciężki przeciwciała specyficznie wiążącego się z drugim antygenem. [006] Wynalazek obejmuje sposób wytwarzania przeciwciał, obejmujący hodowanie odpowiednich komórek gospodarzy w warunkach, które umożliwiają syntezę cząsteczek tego przeciwciała i odzyskiwanie tych przeciwciał z tej hodowli, na przykład przez ekspresję - pierwszej sekwencji kwasu nukleinowego kodującej łańcuch lekki przeciwciała specyficznie wiążącego się z pierwszym antygenem; - drugiej sekwencji kwasu nukleinowego kodującej łańcuch ciężki tego przeciwciała specyficznie wiążącego się z pierwszym antygenem; - trzeciej sekwencji kwasu nukleinowego kodującej łańcuch lekki przeciwciała specyficznie wiążącego się z drugim antygenem, w którym domena stała łańcucha lekkiego CL jest zastąpiona domeną stałą łańcucha ciężkiego CH1; i - czwartej sekwencji kwasu nukleinowego kodującej łańcuch ciężki tego przeciwciała specyficznie wiążącego się z drugim antygenem, w którym domena stała łańcucha ciężkiego CH1 jest zastąpiona domeną stałą łańcucha lekkiego CL. [007] Kolejną postacią wynalazku jest komórka gospodarz zawierająca - wektory zawierające cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące łańcuch lekki i łańcuch ciężki przeciwciała specyficznie wiążącego się z pierwszym antygenem - wektory zawierające cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące łańcuch lekki i łańcuch ciężki przeciwciała specyficznie wiążącego się z drugim antygenem, w którym domeny stałe CL i CH1 są wzajemnie zastąpione. [008] Kolejną postacią wynalazku jest komórka gospodarz zawierająca a) wektor zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą łańcuch lekki i wektor zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą łańcuch ciężki przeciwciała specyficznie wiążącego się z pierwszym antygenem b) wektor zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą łańcuch lekki i wektor zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą łańcuch ciężki przeciwciała specyficznie wiążącego się z drugim antygenem, w którym domeny stałe CL i CH1 są wzajemnie zastąpione. [009] Kolejną postacią wynalazku jest kompozycja, korzystnie kompozycja farmaceutyczna lub diagnostyczna dwuwartościowego, bispecyficznego przeciwciała według wynalazku. [0060] Kolejną postacią wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca dwuwartościowe, bispecyficzne przeciwciało według wynalazku i co najmniej jedną farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę. [0061] Kolejną postacią wynalazku jest sposób leczenia pacjenta potrzebującego terapii, charakteryzujący się podawaniem pacjentowi terapeutycznie skutecznej ilości dwuwartościowego, bispecyficznego przeciwciała według wynalazku. [0062] Stosowane tu określenia kwas nukleinowy lub cząsteczka kwasu nukleinowego z zamierzenia obejmują cząsteczki DNA i cząsteczki RNA. Cząsteczka kwasu nukleinowego może być jednoniciowa albo dwuniciowa, ale korzystnie jest dwuniciowym DNA. [0063] Stosowane tu wyrażenia komórka, linia komórkowa i hodowla komórkowa stosuje się wymiennie i wszystkie takie określenia obejmują potomstwo. Zatem słowa transformanty i komórki transformowane obejmują określoną pierwotną komórkę i pochodzące z niej hodowle bez względu na liczbę transferów. Jest również zrozumiałe, że całe potomstwo może nie być dokładnie identyczne pod względem zawartości DNA z powodu umyślnych lub przypadkowych mutacji. Objęte są warianty potomstwa, które mają taką samą funkcję lub aktywność biologiczną, jak poszukiwana w pierwotnie transformowanej komórce. W przypadku, gdy zamierzone będzie inne znaczenie, będzie to jasno wynikało z kontekstu.

13 [0064] Stosowane tu określenie transformacja odnosi się do procesu przeniesienia wektorów/kwasu nukleinowego do komórki gospodarza. Jeśli jako komórki gospodarze stosowane są komórki bez znacznych barier w postaci ściany komórkowej, transfekcję prowadzi się np. metodą strącania fosforanem wapnia, jak opisali Graham i Van der Eh, Virology 2 (1978), 46 i nast. Jednakże można również stosować inne sposoby wprowadzania DNA do komórek, takie jak wstrzyknięcie do jądra lub fuzja protoplastów. Jeśli stosowane są komórki prokariotyczne lub komórki, które zawierają znaczące konstrukcje ścian komórkowych, np. jedną z metod transfekcji jest traktowanie wapniem z użyciem chlorku wapnia, jak opisano w Cohen, F. N, i in., PNAS. 69 (1972) 7110 i nast. [006] Rekombinacyjne wytwarzanie przeciwciał z zastosowaniem transformacji jest dobrze znane w dziedzinie i opisane na przykład w artykułach przeglądowych Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) ; Geisse, S., i in., Protein Expr. Purif. 8 (1996) ; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) ; Werner, R.G., i in., Arzneimittelforschung 48 (1998) , jak również w US i US [0066] Stosowane tu określenie ekspresja odnosi się do procesu, w którym kwas nukleinowy ulega transkrypcji do mrna i/lub do procesu, w którym mrna po transkrypcji (także określane jako transkrypt), ulega następnie translacji do peptydów, polipeptydów lub białek. Transkrypty i kodowane polipeptydy są wspólnie określane jako produkt genu. Jeśli polinukleotyd pochodzi z genomowego DNA, ekspresja w komórce eukariotycznej może obejmować splicing mrna. [0067] Wektor jest cząsteczką kwasu nukleinowego, w szczególności samonamnażającą się, która przenosi wstawioną cząsteczkę kwasu nukleinowego do i/lub pomiędzy komórkami gospodarzami. To określenie obejmuje wektory, które służą głównie do wprowadzania DNA lub RNA do komórki (np. integracji chromosomowej), wektory do replikacji, które służą głównie do replikacji DNA lub RNA i wektory ekspresyjne, które służą do transkrypcji i/lub translacji DNA lub RNA. Objęte są również wektory, które pełnią więcej niż jedną z tych funkcji, jak opisano. [0068] Wektor ekspresyjny jest polinukleotydem, który po wprowadzeniu do odpowiedniej komórki gospodarza, może ulegać transkrypcji i translacji do polipeptydu. Układ ekspresyjny zazwyczaj odnosi się do odpowiedniej komórki gospodarza, zawierającej wektor ekspresyjny, który może służyć do uzyskania pożądanego produktu ekspresji. [0069] Dwuwartościowe, bispecyficzne przeciwciała według wynalazku są korzystnie wytwarzane metodami rekombinacyjnymi. Takie metody są dobrze znane w dziedzinie i obejmują ekspresję białek w komórkach prokariotycznych i eukariotycznych, a następnie izolację polipeptydu przeciwciała i zazwyczaj oczyszczanie do osiągnięcia dopuszczalnej farmaceutycznie czystości. W celu ekspresji białka, kwasy nukleinowe kodujące łańcuchy lekkie i ciężkie lub ich fragmenty wstawia się do wektorów ekspresyjnych z użyciem standardowych metod. Ekspresję prowadzi się w odpowiednich prokariotycznych lub eukariotycznych komórkach gospodarzach, takich jak komórki CHO, komórki NS0, komórki SP2/0, komórki HEK293, komórki COS, drożdże lub komórki E.coli, i odzyskuje się przeciwciało z tych komórek (z supernatantu lub komórek po lizie). Dwuwartościowe, bispecyficzne przeciwciała mogą być obecne w całych komórkach, w lizacie komórkowym lub w częściowo oczyszczonej lub zasadniczo czystej postaci. Oczyszczanie prowadzi się w celu wyeliminowania innych składników komórkowych lub innych zanieczyszczeń, np. innych komórkowych kwasów nukleinowych lub białek, standardowymi technikami obejmującymi traktowanie zasadą/sds, chromatografię kolumnową i inne dobrze znane w dziedzinie. Patrz Ausubel, F., i in., red., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, Nowy Jork (1987). [0070] Ekspresja w komórkach NS0 jest opisana na przykład w Barnes, L.M., i in., Cytotechnology 32 (2000) ; oraz Barnes, L.M., i in., Biotech. Bioeng. 73 (2001) Przejściowa ekspresja jest opisana np. w Durocher, Y., i in., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9. Klonowanie zmiennych domen jest opisane w Orlandi, R., i in., Proc. Natl.

14 Acad. Sci. USA 86 (1989) ; Carter, P., i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) ; i Norderhaug, L., i in., J. Immunol. Methods 204 (1997) Korzystny układ do przejściowej ekspresji (HEK 293) jest opisany przez Schlaeger, E.-J., i Christensen, K., w Cytotechnology 30 (1999) oraz przez Schlaeger, E.-J., w J. Immunol. Methods 194 (1996) [0071] Sekwencje kontrolne, które są odpowiednie dla prokariotów, obejmują na przykład promotor, ewentualnie sekwencję operatora, oraz miejsce wiązania rybosomu. Wiadomo, że komórki eukariotyczne wykorzystują promotory, wzmacniacze i sygnały poliadenylacji. [0072] Kwas nukleinowy jest funkcjonalnie połączony gdy jest umieszczony w funkcjonalnej zależności z inną sekwencją kwasu nukleinowego. Przykładowo DNA presekwencji lub lidera sekrecyjnego jest funkcjonalnie połączony z DNA polipeptydu jeżeli jest on eksprymowany jako pre-białko, które uczestniczy w wydzielaniu polipeptydu; promotor lub wzmacniacz jest funkcjonalnie połączony z sekwencją kodującą, jeżeli wpływa on na transkrypcję sekwencji; lub miejsce wiązania rybosomu jest funkcjonalnie połączone z sekwencją kodującą, jeżeli jest umiejscowione w sposób ułatwiający translację. Ogólnie funkcjonalnie połączony oznacza, że połączone sekwencje DNA sąsiadują ze sobą oraz, w przypadku lidera sekrecyjnego, sąsiadują i są w ramce odczytu. Jednakże wzmacniacze nie muszą sąsiadować. Łączenie uzyskuje się drogą ligacji w dogodnych miejscach restrykcyjnych. Jeżeli takie miejsca nie istnieją stosuje się syntetyczne oligonukleotydowe adaptery lub łączniki, zgodnie ze standardową praktyką. [0073] Dwuwartościowe, bispecyficzne przeciwciała są odpowiednio oddzielane od pożywki hodowlanej z użyciem standardowych procedur oczyszczania immunoglobulin, takich jak na przykład, białko A-Sepharose, chromatografia na hydroksyapatycie, elektroforeza żelowa, dializa lub chromatografia powinowactwa. DNA i RNA kodujące przeciwciała monoklonalne łatwo izoluje się i sekwencjonuje z użyciem standardowych procedur. Komórki hybrydoma mogą służyć jako źródło takich DNA i RNA. Po wyizolowaniu, DNA można wstawiać do wektorów ekspresyjnych, którymi następnie transfekuje się komórki gospodarzy, takie jak komórki HEK 293, komórki CHO lub komórki szpiczaka, które inaczej nie wytwarzają białka immunoglobuliny, w celu uzyskania syntezy rekombinowanych przeciwciał monoklonalnych w komórkach gospodarzach. [0074] Warianty (lub mutanty) sekwencji aminokwasowych dwuwartościowych, bispecyficznych przeciwciał wytwarza się przez wprowadzenie odpowiednich zmian nukleotydów do DNA przeciwciała lub drogą syntezy nukleotydów. Takie modyfikacje można jednak przeprowadzić tylko w bardzo ograniczonym zakresie, np. jak to opisano powyżej. Przykładowo, te modyfikacje nie zmieniają wspominanych powyżej właściwości przeciwciała, takich jak izotyp IgG i wiązanie się z antygenem, ale mogą polepszać wydajność rekombinacyjnej produkcji, trwałość białka lub ułatwiać oczyszczanie. [007] Następujące przykłady, wykaz sekwencji i figury /przedstawione, aby pomóc w zrozumieniu niniejszego wynalazku, którego prawdziwy zakres jest przedstawiony w załączonych zastrzeżeniach. 4 0 Wykaz sekwencji [0076] SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4 sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego przeciwciała <IGF-1R> typu dzikiego sekwencja aminokwasowa łańcucha lekkiego przeciwciała <IGF-1R> typu dzikiego sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego** (HC**) przeciwciała <IGF-1R> z zamianą CL-CH1, w którym domena łańcucha ciężkiego CH1 jest zastąpiona domeną łańcucha lekkiego CL sekwencja aminokwasowa łańcucha lekkiego** (LC**) przeciwciała

15 <IGF-1R> z zamianą CL-CH1, w którym domena łańcucha lekkiego CL jest zastąpiona domeną łańcucha ciężkiego CH1 SEQ ID NO: sekwencja aminokwasowa ektodomeny IGF-1R ze znacznikiem Hispeptyd wiążący streptawidynę (ECD IGF-1R-His-SBP) SEQ ID NO: 6 sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego przeciwciała przeciw ANGPT2 <ANGPT2> typu dzikiego SEQ ID NO: 7 sekwencja aminokwasowa łańcucha lekkiego przeciwciała przeciw ANGPT2 <ANGPT2> typu dzikiego SEQ ID NO: 8 sekwencja aminokwasowa domeny CH3 ( gałka ) z zamianą T366W do stosowania w technologii knobs-into-holes SEQ ID NO: 9 sekwencja aminokwasowa domeny CH3 ( dołek ) z zamianą T366S, L368A, Y407V do stosowania w technologii knobs-into-holes SEQ ID NO: 10 sekwencja aminokwasowa ektodomeny IGF-1R ze znacznikiem Hispeptyd wiążący streptawidynę (ECD IGF-1R-His-SBP) Opis Figur [0077] Figura 1 Figura 2 Figura 3 Figura 4 Figura Figura 6 Figura 7 Figura 8 Figura 9 Figura 10 Schematyczny rysunek IgG, naturalnie występującego całego przeciwciała specyficznego dla jednego antygenu z dwoma parami łańcucha ciężkiego i lekkiego, które zawierają domeny zmienne i stałe w typowej kolejności. Schematyczny rysunek dwuwartościowego, bispecyficznego przeciwciała, zawierającego: a) łańcuch lekki i łańcuch ciężki przeciwciała specyficznie wiążącego się z pierwszym antygenem; oraz b) łańcuch lekki i łańcuch ciężki przeciwciała specyficznie wiążącego się z drugim antygenem, w którym domeny stałe CL i CH1 zostały wzajemnie zastąpione. Schematyczny rysunek dwuwartościowego, bispecyficznego przeciwciała zawierającego: a) łańcuch lekki i łańcuch ciężki przeciwciała specyficznie wiążącego się z pierwszym antygenem; oraz b) łańcuch lekki i łańcuch ciężki przeciwciała specyficznie wiążącego się z drugim antygenem, w którym domeny stałe CL i CH1 zostały wzajemnie zastąpione, przy czym domeny CH3 z obu łańcuchów ciężkich są zmienione z użyciem technologii knobs-intoholes. Schematyczny rysunek dwuwartościowego, bispecyficznego przeciwciała zawierającego: a) łańcuch lekki i łańcuch ciężki przeciwciała specyficznie wiążącego się z pierwszym antygenem; oraz b) łańcuch lekki i łańcuch ciężki przeciwciała specyficznie wiążącego się z drugim antygenem, w którym domeny stałe CL i CH1 zostały wzajemnie zastąpione, przy czym jedna z domen stałych łańcucha ciężkiego CH3 z obu łańcuchów ciężkich jest zastąpiona domeną stałą łańcucha ciężkiego CH1, a druga domena stała łańcucha ciężkiego CH3 jest zastąpiona domeną stałą łańcucha lekkiego CL. Schemat sekwencji białka łańcucha ciężkiego** <IGF-1R> HC** przeciwciała <IGF-1R> z zamianą CL-CH1 (z domeną stałą łańcucha lekkiego CL typu kappa) Schemat sekwencji białka łańcucha lekkiego** <IGF-1R> LC** przeciwciała <IGF-1R> z zamianą CL-CH1 Mapa plazmidu wektora ekspresyjnego puc-hc**-igf-1r dla łańcucha ciężkiego** <IGF-1R> HC** Mapa plazmidu wektora ekspresyjnego puc-lc**-igf-1r dla łańcucha lekkiego** <IGF-1R> LC** Mapa plazmidu wektora ekspresyjnego 4700-Hyg-OriP Zasada działania komórkowego testu FACS tworzenia mostków IGF-1R- ANGPT2 na komórkach I24 eksprymujących IGF-1R w celu wykrycia obec-

16 Figura 11 Figura 12 Figura 13 Figura 14 Figura 1 Przykłady ności funkcjonalnego bispecyficznego przeciwciała <ANGPT2-IGF-1R> z zamianą CL-CH1 Schemat metody Biacore dla ECD IGF-1R SDS-PAGE i chromatografia wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek oczyszczonego monospecyficznego, dwuwartościowego przeciwciała <IGF- 1R> z zamianą CL-CH1 (IgG1**) z HC** i LC**, wyizolowanego z supernatantów hodowli komórkowej po przejściowej transfekcji komórek HEK293-F. Wiązanie monospecyficznego przeciwciała <IGF-1R> z zamianą CL-CH1 i przeciwciała <IGF-1R> typu dzikiego z ECD IGF-1R w teście wiązania opartym na ELISA. SDS-PAGE i chromatografia wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek mieszaniny przeciwciał <ANGPT2-IGF-1R> z zamianą CL-CH1 oczyszczonych z supernatantów hodowli komórkowej po przejściowej transfekcji komórek HEK293-F. Wyniki dla próbek A do F komórkowego testu FACS tworzenia mostków IGF-1R-ANGPT2 na komórkach I24 eksprymujących IGF-1R w celu wykrycia obecności funkcjonalnego bispecyficznego przeciwciała <ANGPT2-IGF- 1R> z zamianą CL-CH1 w oczyszczonej mieszaninie przeciwciał: oczyszczone próbki białek A do F: A = nietraktowane I24 B = I µg/ml hangpt2 + izotyp higg C = I µg/ml hangpt2 + mieszanina z koekspresji przeciwciała <IGF- 1R> z zamianą CL-CH1 i przeciwciała <ANGPT2> typu dzikiego zawierająca bispecyficzne przeciwciało <ANGPT2-IGF-1R> z zamianą CL-CH1 D: nieobecne E = I µg/ml hangpt2 + przeciwciało <ANGPT2> typu dzikiego F = I µg/ml hangpt2 + przeciwciało <IGF-1R> ypu dzikiego Materiały i ogólne metody [0078] Ogólne informacje dotyczące sekwencji nukleotydowych łańcuchów lekkich i ciężkich ludzkich immunoglobulin można znaleźć w: Kabat, E.A., i in., Sequences of Proteins of Immunological Interest,. wydanie, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Aminokwasy łańcuchów przeciwciał są ponumerowane i określone zgodnie z numeracją EU (Edelman, G.M., i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-8; Kabat, E.A., i in., Sequences of Proteins of Immunological Interest,. wydanie, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)). Techniki rekombinacji DNA [0079] Do manipulacji DNA wykorzystano standardowe metody, jak opisane w Sambrook, J. i in., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nowy Jork, Odczynniki do biologii molekularnej stosowano zgodnie z instrukcjami producentów. Synteza genów [0080] Pożądane odcinki genów wytworzono z oligonukleotydów sporządzonych drogą syntezy chemicznej. Segmenty genów o długości pz, które są flankowane przez pojedyncze miejsca rozszczepienia dla endonukleaz restrykcyjnych, zostały połączone przez przyłączanie i ligację oligonukleotydów metodą amplifikacji PCR, a następnie klonowane za pomocą wskazanych miejsc restrykcyjnych np. KpnI/SacI lub AscI/PacI do wektora do klonowania pga4 opartego na ppcrscript (Stratagene). Sekwencje DNA subklonowanych fragmentów genów potwierdzono metodą sekwencjonowania DNA. Frag-

17 menty do syntezy genów zostały uporządkowane według specyfikacji podanych w Geneart (Regensburg, Niemcy). Określenie sekwencji DNA [0081] Sekwencje DNA określono metodą sekwencjonowania podwójnej nici przeprowadzoną w MediGenomix GmbH (Martinsried, Niemcy) lub Sequiserve GmbH (Vaterstetten, Niemcy). [0082] Analiza sekwencji DNA i białek i zarządzanie danymi o sekwencjach [0083] Pakiet oprogramowania GCG (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) w wersji 10.2 i pakiet Infomax's Vector NT1 Advance w wersji 8.0 były używane do tworzenia, mapowania, analizy, opisywania i przedstawiania sekwencji. Wektory ekspresyjne [0084] Do ekspresji opisanych wariantów przeciwciał zastosowano plazmidy ekspresyjne do przejściowej ekspresji komórek (np. w HEK293 EBNA lub HEK293-F) oparte albo na organizacji cdna z promotorem CMV-Intron A, albo na organizacji genomowej z promotorem CMV. [008] Oprócz kasety ekspresyjnej przeciwciała wektory zawierały: miejsce inicjacji replikacji, które umożliwia replikację plazmidu w E. coli, i gen β-laktamazy, który nadaje oporność na ampicylinę u E. coli. [0086] Jednostka transkrypcyjna genu przeciwciała składa się z następujących elementów: unikalne miejsce(-a) restrykcyjne na '-końcu natychmiastowy wczesny wzmacniacz i promotor z ludzkiego wirusa cytomegalii następnie sekwencja intronu A w przypadku organizacji cdna '-nieulegający translacji region z genu ludzkiego przeciwciała sekwencja sygnałowa łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, łańcuch ludzkiego przeciwciała (typu dzikiego lub z zamianą domen) w organizacji cdna lub genomowej z organizacją immunoglobuliny typu egzon-intron 3'-nieulegający translacji region z sekwencją sygnału poliadenylacji, oraz unikalne miejsce(-a) restrykcyjnego na 3'-końcu. [0087] Geny fuzyjne obejmujące opisane łańcuchy przeciwciał, jak opisano poniżej, wytworzono metodą PCR i/lub syntezy genów i połączono z użyciem znanych metod i technik rekombinacji przez połączenie odpowiednich segmentów kwasu nukleinowego, np. wykorzystując unikalne miejsca restrykcyjne w odpowiednich wektorach. Subklonowane sekwencje kwasu nukleinowego sprawdzono drogą sekwencjonowania DNA. Do przejściowych transfekcji przygotowano większe ilości plazmidów przez uzyskanie plazmidów z transformowanych hodowli E. coli (Nucleobond AX, Macherey-Nagel). Techniki hodowli komórek [0088] Stosowano standardowe techniki hodowli komórek, jak opisane w Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott- Schwartz, J. i Yamada, K.M. (red.), John Wiley & Sons, Inc. [0089] Bispecyficzne przeciwciała eksprymowano przez przejściową kotransfekcję odpowiednimi plazmidami ekspresyjnymi adherentnie rosnących komórek HEK293-EBNA lub komórek HEK29-F rosnących w zawiesinie, jak opisano poniżej. Przejściowe transfekcje w układzie HEK 293-EBNA [0090] Bispecyficzne przeciwciała eksprymowano drogą przejściowej kotransfekcji odpowiednimi plazmidami ekspresyjnymi (np. kodującymi ciężki i zmodyfikowany łańcuch ciężki, jak również odpowiadający im łańcuch lekki i zmodyfikowany łańcuch lekki) adherentnie rosnących komórek HEK293-EBNA (linia 293 ludzkich komórek zarodkowych nerki eksprymujących antygen jądrowy wirusa Epsteina-Barr; numer depozytu w American type cul-

18 ture collection ATCC nr CRL-1082, Seria ) hodowanych w DMEM (pożywka Eagle'a zmodyfikowana przez Dulbecco, Gibco) uzupełnionej 10% FCS z ultra niską zawartością IgG (płodowa surowica cielęca, Gibco), 2 mm L-glutaminy (Gibco) i 20 µg/ml Genetycyny (Gibco). Do transfekcji zastosowano odczynnik FuGENE 6 Transfection Reagent (Roche Molecular Biochemicals) przy stosunku odczynnika FuGENE (µl) do DNA (µg) równym 4:1 (w zakresie od 3:1 do 6:1). Białka poddano ekspresji z odpowiednich plazmidów stosując molowy stosunek plazmidów kodujących (zmodyfikowany i typu dzikiego) łańcuch lekki i łańcuch ciężki równy 1:1 (równomolowy) w zakresie odpowiednio od 1:2 do 2:1. Komórkom podano w dniu 3 L-glutaminę i 4 mm Glukozę [Sigma] i NAA [Gibco]. Supernatanty z hodowli komórkowych zawierające bispecyficzne przeciwciało zbierano od dnia do dnia 11 po transfekcji przez odwirowanie i przechowywano w temperaturze -20 C. Ogólne informacje dotyczące rekombinowanej ekspresji ludzkich immunoglobulin np. w komórkach HEK293 podano w Meissner, P. i in., Biotechnol. Bioeng. 7 (2001) Przejściowe transfekcje w układzie HEK 293-F [0091] Bispecyficzne przeciwciała wytworzono drogą przejściowej transfekcji odpowiednimi plazmidami (np. kodującymi łańcuch ciężki i zmodyfikowany łańcuch ciężki, jak również odpowiadający im łańcuch lekki i zmodyfikowany łańcuch lekki) z użyciem układu HEK293-F (lnvitrogen) zgodnie z instrukcją producenta. W skrócie, komórki HEK 293- F (lnvitrogen) rosnące w zawiesinie w kolbach do wytrząsania albo w fermentorze z mieszadłem w pożywce ekspresyjnej wolnej od surowicy FreeStyle 293 (lnvitrogen) transfekowano mieszaniną czterech plazmidów ekspresyjnych i odczynnika 293fectin lub fectin (lnvitrogen). W 2 litrowej kolbie do wytrząsania (Corning) wysiano komórki HEK293-F przy gęstości 1,0E*6 komórek/ml w 600 ml i inkubowano przy 120 obr./min, 8% CO2. Dzień po transfekcji komórek przy gęstości komórek około 1,E*6 komórek/ml z użyciem około 42 ml mieszaniny A) 20 ml Opti-MEM (Invitrogen) z 600 µg całkowitego plazmidowego DNA (1 µg/ml) kodującego odpowiednio łańcuch ciężki lub zmodyfikowany łańcuch ciężki i odpowiadający mu łańcuch lekki w stosunku równomolowym i B) 20 ml Opti -MEM + 1,2 ml odczynnika 293 fectin lub fectin (2 µl/ml). Podczas fermentacji dodawano roztwór glukozy w zależności od ze zużycia glukozy. Supernatant zawierający wydzielane przeciwciało zbierano po -10 dniach i przeciwciała albo oczyszczano bezpośrednio z supernatantu, albo supernatant zamrożono i przechowywano. Oznaczanie białek [0092] Stężenie białek oczyszczonych przeciwciał i pochodnych oznaczono przez ustalenie wartości gęstości optycznej (OD) przy 280 nm, z użyciem molowego współczynnika ekstynkcji obliczonego na podstawie sekwencji aminokwasowej według Pace i in., Protein Science, 199, 4, Oznaczanie stężenia przeciwciał w supernatantach [0093] Stężenie przeciwciał i pochodnych w supernatantach z hodowli komórek oszacowano metodą immunoprecypitacji z kulkami agarozowymi z białkiem A (Roche). 60 µl kulek agarozowych z białkiem A przemyto trzy razy TBS-NP40 (0 mm Tris, ph 7,, 10 mm NaCl, 1% Nonidet-P40). Następnie, 1-1 ml supernatantu z hodowli komórkowej naniesiono na kulki agarozowe z białkiem A wstępnie zrównoważone w TBS-NP40. Po inkubacji przez 1 h w temperaturze pokojowej kulki przemyto na kolumnie filtracyjnej Ultrafree-MC [Amicon] jednokrotnie 0, ml TBS-NP40, dwukrotnie 0, ml 2x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (2xPBS, Roche) i krótko czterokrotnie 0, ml 100 mm cytrynianu sodu o ph,0. Związane przeciwciało wymywano przez dodanie 3 µl buforu Nu- PAGE LDS Sample Buffer (lnvitrogen). Połowę próbek odpowiednio połączono z odczynnikiem redukującym do próbek NuPAGE lub pozostawiono niezredukowane i ogrzewano przez 10 min w temperaturze 70 C. Następnie, -30 µl naniesiono na 4-12%

19 NuPAGE Bis-Tris SDS-PAGE (lnvitrogen) (z buforem MOPS do SDS-PAGE w warunkach redukujących i buforem MES z dodatkiem przeciwutleniacza do buforu roboczego NuPAGE (Invitrogen) do SDS-PAGE w warunkach redukujących) i barwiono błękitem Coomasie. [0094] Stężenie przeciwciał i pochodnych w supernatantach z hodowli komórek mierzono ilościowo metodą chromatografii powinowactwa HPLC. W skrócie, supernatanty z hodowli komórek zawierające przeciwciała i ich pochodne, które wiążą się z białkiem A naniesiono na kolumnę Applied Biosystems Poros A/20 w 200 mm KH2PO4 100 mm cytrynianu sodu, ph 7,4 i wymywano z matrycy z użyciem 200 mm NaCl, 100 mm kwasu cytrynowego, ph 2, w układzie Agilent 1100 HPLC. Wymyte białko oznaczono ilościowo przez pomiar absorbancji UV i scałkowanie powierzchni pików. Oczyszczone standardowe przeciwciało IgG1 służyło za wzorzec. [009] Alternatywnie, stężenie przeciwciał i pochodnych w supernatantach z hodowli komórek mierzono metodą Sandwich-IgG-ELISA. W skrócie, 96-studzienkowe mikropłytki StreptaWell High Bind Strepatavidin A (Roche) powleczono 100 µl/studzienkę biotynylowanych cząsteczek wychwytujących przeciw ludzkiej IgG F(ab')2<h-Fcγ> BI (Dianova) w stężeniu 0,1 µg/ml przez 1 h w temperaturze pokojowej, lub alternatywnie, przez noc w temperaturze 4 C, a następnie przemywano trzykrotnie 200 µl/studzienkę PBS, 0,0% Tween (PBST, Sigma). Do studzienek dodano 100 µl/studzienkę serii rozcieńczeń w PBS (Sigma) supernatantów z hodowli komórek zawierających odpowiednie przeciwciała i inkubowano przez 1-2 h na wytrząsarce do mikropłytek w temperaturze pokojowej. Studzienki przemyto trzy razy 200 µl/studzienkę PBST i związane przeciwciało wykrywano za pomocą 100 µl F(ab')2<hFcγ>POD (Dianova) w stężeniu 0,1 µg/ml jako przeciwciała wykrywającego przez 1-2 h na wytrząsarce do mikropłytek w temperaturze pokojowej. Niezwiązane przeciwciało wykrywające wymywano trzy razy z użyciem 200 µl/studzienkę PBST, a związane przeciwciało wykrywające wykryto przez dodanie 100 µl/studzienkę ABTS. Oznaczanie absorbancji przeprowadzono przy użyciu spektrometru Tecan Fluor przy pomiarowej długości fali 40 nm (referencyjna długość fali 492 nm). Oczyszczanie białek [0096] Białka oczyszczano z przefiltrowanych supernatantów z hodowli komórkowych zgodnie ze standardowymi protokołami. W skrócie, przeciwciała nałożono na kolumnę z białkiem A-Sepharose (GE Healthcare) i przemyto PBS. Wymycie przeciwciał uzyskano przy ph 2,8, a następnie natychmiast zobojętniono próbkę. Zagregowane białko oddzielono od monomerycznych przeciwciał metodą chromatografii wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek (Superdex 200, GE Healthcare) w PBS lub w 20 mm histydynie, 10 mm NaCl, ph 6,0. Frakcje przeciwciał monomerycznych połączono, zatężono w razie potrzeby, np. z użyciem koncentratora wirówkowego MILLIPORE Amicon Ultra (30 MWCO), zamrożono i przechowywano w temperaturze -20 C lub -80 C. Część próbek poddano kolejnym analizom białek i charakterystyce analitycznej, np. metodą SDS-PAGE, chromatografii wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek lub spektrometrii masowej. SDS-PAGE [0097] System prefabrykowanych żeli NuPAGE (Invitrogen) zastosowano zgodnie z instrukcją producenta. W szczególności, stosowano 10% lub 4-12% prefabrykowane żele NuPAGE Novex Bis-TRIS (ph 6,4) i bufor roboczy NuPAGE MES (zredukowane żele, z dodatkiem przeciwutleniacza do buforu roboczego NuPAGE ) lub MOPS (niezredukowane żele). Analityczna chromatografia wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek [0098] Chromatografię wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek do określania agregacji i stanu oligomeryzacji przeciwciał przeprowadzono metodą chromatografii

20 HPLC. W skrócie, przeciwciała oczyszczone na białku A naniesiono na kolumnę do Tosoh TSKgel G3000SW w 300 mm NaCl, 0 mm KH2PO4/K2HPO4, ph 7, w układzie Agilent HPLC 1100 lub na kolumnę Superdex 200 (GE Healthcare) w 2 x PBS w układzie Dionex HPLC. Wymyte białko oznaczono ilościowo przez pomiar absorbancji UV i scałkowanie powierzchni pików. Jako wzorzec służył BioRad Gel Filtration Standard Spektrometria mas [0099] Całkowitą deglikozylowaną masę skrzyżowanych przeciwciał określano i potwierdzono drogą spektrometrii masowej z jonizacją przez elektrorozpylanie (ESI-MS). W skrócie, 100 µg oczyszczonych przeciwciał deglikozylowano z użyciem 0 mu N-glikozydazy F (PNGaseF, ProZyme) w 100 mm KH2PO4/K2HPO4, ph 7 w temperaturze 37 C przez godziny przy stężeniu białka do 2 mg/ml, a następnie odsolono metodą HPLC na kolumnie Sephadex G2 (GE Healthcare). Masę odpowiednich łańcuchów ciężkich i lekkich oznaczano metodą ESI-MS po deglikozylacji i redukcji. W skrócie, 0 µg przeciwciała w 11 µl inkubowano z 60 µl 1M TCEP i 0 µl 8 M chlorowodorku guanidyny, a następnie odsolono. Całkowitą masę i masę zredukowanych łańcuchów ciężkich i lekkich określono metodą ESI-MS w układzie Q-Star Elite MS wyposażonym w źródło NanoMate. Test ELISA wiązania ECD IGF-1R [0100] Właściwości wiązania wytworzonych przeciwciał oceniano w teście ELISA z zewnątrzkomórkową domeną (ECD) IGF-1R. W tym celu zewnątrzkomórkową domenę IGF- 1R (reszty 1-462), zawierającą naturalną sekwencję liderową i domeny bogate w LIcysteinę 12 z ektodomeny ludzkiego IGF-IR z łańcucha alfa (zgodnie z McKern i in., 1997;. Ward i in., 2001) połączoną z N-końcowym znacznikiem His-peptyd wiążący streptawidynę (His-SBP) wklonowano do pochodnej wektora pcdna3 i przejściowo eksprymowano w komórkach HEK293F. Sekwencję białkową ECD IGF-1R-His-SBP przedstawiono w SEQ ID NO: studzienkowe mikropłytki StreptaWell High Bind Strepatavidin A (Roche) powleczono 100 µl/studzienkę supernatantu z hodowli komórek zawierającego rozpuszczalne białko fuzyjne ECD IGF-1R-SBP przez noc w temperaturze 4 C i przemyto trzykrotnie za pomocą 200 µl/studzienkę PBS, 0,0% Tween (PBST, Sigma). Następnie do studzienek dodano 100 µl/studzienkę serii rozcieńczeń odpowiedniego przeciwciała, i jako odniesienia przeciwciała <IGF-1R> typu dzikiego w PBS (Sigma), wraz z 1% BSA (frakcja V, Roche) i inkubowano przez 1-2 h na wytrząsarce do mikropłytek w temperaturze pokojowej. Do serii rozcieńczeń zastosowano taką samą ilość oczyszczonego przeciwciała do studzienek. Studzienki przemyto trzy razy 200 µl/studzienkę PBST i związane przeciwciało wykrywano z użyciem 100 µl/studzienkę F(ab')2<hFcγ>POD (Dianova) w stężeniu 0,1 µg/ml (1:8000) jako przeciwciała wykrywającego przez 1-2 h na wytrząsarce do mikropłytek w temperaturze pokojowej. Niezwiązane przeciwciało wykrywające wymywano trzy razy z użyciem 200 µl/studzienkę PBST, a związane przeciwciało wykrywające wykryto przez dodanie 100 µl/studzienkę ABTS. Oznaczanie absorbancji przeprowadzono na spektrometrze Tecan Fluor przy długości fali 40 nm (referencyjna długość fali 492 nm). Biacore dla ECD IGF-1R [0101] Wiązanie się wytworzonych przeciwciał z ECD ludzkiego IGF-1R badano również metodą powierzchniowego rezonansu plazmonowego z użyciem urządzenia BIACORE T100 (GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Szwecja). W skrócie, do pomiarów powinowactwa kozie przeciwciała przeciw ludzkiej IgG JIR unieruchomiono na chipie CM drogą sprzęgania amin do prezentacji przeciwciał przeciwko ECD ludzkiego IGF-1R ze znacznikiem Fc. Wiązanie mierzono w buforze HBS (HBS-P (10 mm HEPES, 10 mm NaCl, 0,00% Tween 20, ph 7,4) w temperaturze 2 C. ECD IGF-1R (R&D Systems lub oczyszczona na miejscu) dodawano w różnych stężeniach w roztworze. Asocjację

21 mierzono przez wstrzykiwanie ECD IGF-1R przez 80 sekund do 3 minut; dysocjację mierzono przez przemywanie powierzchni chipa buforem HBS przez 3-10 minut, a wartość KD oszacowano stosując model wiązania 1:1 Langmuira. Ze względu na niską gęstość załadunku i poziom wychwytywania przeciwciał <IGF-1R> uzyskano jednowartościowe wiązanie ECD IGF-1R. Dane z kontroli negatywnych (np. krzywe dla buforu) odjęto od krzywych dla próbek w celu korekty wewnętrznego dryfu linii podstawowej w systemie i redukcji szumu. Oprogramowanie Biacore T100 Evaluation Software w wersji użyto do analizy sensorgramów i obliczenia danych dotyczących powinowactwa. Figura 11 przedstawia schemat testu Biacore. Przykłady 1 Wytwarzanie, ekspresja, oczyszczanie i charakterystyka monospecyficznego, dwuwartościowego przeciwciała <IGF-1R>, w którym domeny zmienne CL i CH1 są wzajemnie zastąpione (oznaczanego tu skrótowo przeciwciałem <IGF-1R> z zamianą CL-CH1) Przykład 1A Wytwarzanie plazmidów ekspresyjnych dla monospecyficznego, dwuwartościowego przeciwciała <IGF-1R> z zamianą CL-CH1 [0102] Sekwencje dla zmiennych domen łańcucha ciężkiego i lekkiego monospecyficznego, dwuwartościowego przeciwciała <IGF-1R> z zamianą CL-CH1 wraz z odpowiednimi sekwencjami liderowymi opisane w tym przykładzie pochodzą z łańcucha ciężkiego (SEQ ID NO: 1, plazmid 4843-pUC-HC-IGF-1R) i łańcucha lekkiego (SEQ ID NO: 2, plazmid 4842-pUC-LC-IGF-1R) ludzkiego przeciwciała <IGF-1R>, opisanych w WO 200/0063I, a domeny stałe łańcucha ciężkiego i lekkiego pochodzą z ludzkiego przeciwciała (C-kappa i IgG1). [0103] Segmenty genów kodujące sekwencję liderową przeciwciała <IGF-1R>, domenę zmienną łańcucha ciężkiego (VH) i ludzką domenę łańcucha lekkiego typu kappa (CL) zostały połączone i połączone z '-końcem domen Fc z ludzkich domen stałych łańcucha ciężkiego typu γ1 (zawias-ch2-ch3). DNA kodujące odpowiednie białko fuzyjne otrzymane drogą zamiany domeny CH1 przez domenę CL (zamiana CH1-CL) wytworzono poprzez syntezę genu i oznaczono <IGF-1R> HC** (SEQ ID NO: 3) poniżej. [0104] Segmenty genów kodujące sekwencję liderową przeciwciała <IGF-1R>, domenę zmienną łańcucha lekkiego (VL) i ludzką domenę stałą łańcucha ciężkiego typu γ1 (CH1) zostały połączone jako niezależny łańcuch. DNA kodujące odpowiednie białko fuzyjne otrzymane drogą zamiany domeny CL przez domenę CH1 (zamiana CL-CH1) wytworzono poprzez syntezę genu i oznaczono <IGF-1R> LC** (SEQ ID NO: 4) poniżej. [010] Figura i Figura 6 przedstawiają schematyczny obraz sekwencji białkowej zmodyfikowanego łańcucha ciężkiego <IGF-1R> HC** i zmodyfikowanego łańcucha lekkiego <IGF-1R> LC**. [0106] Poniżej opisano w skrócie odpowiednie wektory ekspresyjne: Wektor puc-hc**-igf-1r Wektor puc-hc**-igf-1r jest plazmidem ekspresyjnym np. do przejściowej ekspresji łańcucha ciężkiego HC** <IGF-1R> z zamianą CL-CH1 (kaseta ekspresyjna o organizacji cdna, z CMV-Intron A) w komórkach HEK293 (EBNA) lub do stabilnej ekspresji w komórkach CHO. [0107] Oprócz kasety ekspresyjnej <IGF-1R> HC** ten wektor zawiera: - miejsce inicjacji replikacji z wektora puc18, które umożliwia replikację tego plazmidu w E. coli, i - gen β-laktamazy, który nadaje oporność na ampicylinę u E. coli. [0108] Jednostka transkrypcyjna genu <IGF-1R> HC** składa się z następujących elementów:

22 miejsce restrykcyjne AscI na -końcu, natychmiastowy wczesny wzmacniacz i promotor z ludzkiego wirusa cytomegalii, następnie sekwencja intronu A, '-nieulegający translacji region z genu ludzkiego przeciwciała, sekwencja sygnałowa łańcucha lekkiego immunoglobuliny, dojrzały łańcuch HC** ludzkiego <IGF-1R> kodujący białko fuzyjne domeny zmiennej łańcucha ciężkiego (VH) i domeny stałej ludzkiego łańcucha lekkiego typu kappa (CL) połączone z '-końcem domen Fc z domen stałych ludzkiego łańcucha ciężkiego typu γ1 (zawias-ch2-ch3). 3'-nieulegający translacji region z sekwencją sygnału poliadenylacji, oraz miejsce restrykcyjne SgrAI na 3 -końcu. [0109] Mapa plazmidu wektora ekspresyjnego puc-hc**-igf-1r dla łańcucha ciężkiego** HC** <IGF-1R> z zamianą CL-CH1 jest pokazana na Figurze 7. Sekwencja aminokwasowa <IGF-1R> HC** (wraz z sekwencją sygnałową) jest podana w SEQ ID NO: 3. Wektor puc-lc**-igf-1r Wektor puc-lc**-igf-1r jest plazmidem ekspresyjnym np. do przejściowej ekspresji łańcucha lekkiego LC** <IGF-1R> z zamianą CL-CH1 (kaseta ekspresyjna o organizacji cdna, z CMV-Intron A) w komórkach HEK293 (EBNA) lub do stabilnej ekspresji w komórkach CHO. [0110] Oprócz kasety ekspresyjnej <IGF-1R> LC** ten wektor zawiera: - miejsce inicjacji replikacji z wektora puc18, które umożliwia replikację tego plazmidu w E. coli, i - gen β-laktamazy, który nadaje oporność na ampicylinę u E. coli. [0111] Jednostka transkrypcyjna genu <IGF-1R> LC** składa się z następujących elementów: miejsce restrykcyjne Sse8387I na -końcu, natychmiastowy wczesny wzmacniacz i promotor z ludzkiego wirusa cytomegalii, następnie sekwencja intronu A, '-nieulegający translacji region z genu ludzkiego przeciwciała, sekwencja sygnałowa łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, dojrzały łańcuch LC** ludzkiego przeciwciała <IGF-1R> kodujący białko fuzyjne domeny zmiennej łańcucha lekkiego (VL) i domen stałych ludzkiego łańcucha ciężkiego typu γ1 (CH1). 3'-nieulegający translacji region z sekwencją sygnału poliadenylacji, oraz miejsca restrykcyjne SalI i FseI na 3 -końcu. [0112] Mapa plazmidu wektora ekspresyjnego puc-lc**-igf-1r dla łańcucha lekkiego** LC** <IGF-1R> z zamianą CL-CH1 jest pokazana na Figurze 8. Sekwencja aminokwasowa <IGF-1R> LC** (wraz z sekwencją sygnałową) jest podana w SEQ ID NO: 4. [0113] Plazmidy puc-hc**-igf-1r i puc-lc**-igf-1r mogą być stosowane do przejściowej lub stabilnej kotransfekcji np. w komórkach HEK293, HEK293 EBNA lub CHO (układ 2-wektorowy). Ze względów porównawczych przeciwciało <IGF-1R> typu dzikiego poddano przejściowej ekspresji z plazmidów 4842-pUC-LC-IGF-1R (SEQ ID NO: 2) i 4843-pUC-HC-IGF-1R (SEQ ID NO: 1), analogiczne do opisanych w tym przykładzie. [0114] W celu uzyskania wyższych poziomów ekspresji w przejściowych ekspresjach w komórkach HEK293 EBNA, kasetę ekspresyjną <IGF-1R> HC** można subklonować w miejscach AscI, SgrAI, a kasetę ekspresyjną <IGF-1R> LC** można subklonować w miejscach Sse8387I i FseI do wektora ekspresyjnego 4700 puc-hyg_orip zawierającego

23 element OriP, oraz - gen oporności na higromycynę jako marker selekcyjny. [011] Jednostki transkrypcyjne łańcucha ciężkiego i lekkiego mogą być albo subklonowane do dwóch niezależnych wektorów 4700-pUC-Hyg-OriP do kotransfekcji (układ 2- wektorowy), albo mogą być klonowane do jednego wspólnego wektora 4700-pUC-Hyg- OriP (układ 1-wektorowy) do kolejnych przejściowych lub stabilnych transfekcji z użyciem otrzymanych wektorów. Figura 9 przedstawia mapę plazmidu podstawowego wektora 4700-pUC-OriP. Przykład 1 B Wytwarzanie plazmidów ekspresyjnych dla monospecyficznego dwuwartościowego przeciwciała <IGF-1R> z zamianą CL-CH1 [0116] Geny fuzyjne <IGF-1R> (geny fuzyjne HC** i LC**) zawierające zamienione sekwencje Fab przeciwciała <IGF-1R> typu dzikiego złożono z użyciem znanych metod i technik rekombinacji przez połączenie odpowiednich segmentów kwasu nukleinowego. [0117] Każdą z sekwencji kwasu nukleinowego kodującą IGF-1R HC** i LC** syntetyzowano drogą syntezy chemicznej, a następnie wklonowano do wektora do klonowania pga4 oparty na ppcrscript (Stratagene) w Geneart (Regensburg, Niemcy). Kasetę ekspresyjną kodującą IGF-1R HC** wligowano do odpowiedniego plazmidu E. coli z użyciem miejsc restrykcyjnych PvuII i BmgBI z utworzeniem końcowego wektora puc- HC**-IGF-1R; kasetę ekspresyjną kodującą odpowiedni IGF-1R LC** wligowano do odpowiedniego plazmidu E. coli z użyciem miejsc restrykcyjnych PvuII i Sali z wytworzeniem końcowego wektora puc-lc**-igf-1r. Subklonowane sekwencje kwasu nukleinowego zweryfikowano metodą sekwencjonowania DNA. Do przejściowych i stabilnych transfekcji wytworzono większe ilości plazmidów przez uzyskanie plazmidów z transformowanych hodowli E. coli (Nucleobond AX, Macherey-Nagel). Przykład 1C Przejściowa ekspresja monospecyficznego, dwuwartościowego przeciwciała <IGF-1R> z zamianą CL-CH1, oczyszczanie i potwierdzenie tożsamości metodą spektrometrii masowej [0118] Rekombinowane przeciwciało <IGF-1R> z zamianą CL-CH1 eksprymowano drogą przejściowej kotransfekcji plazmidami puc-hc**-igf-1r i puc-lc**-igf-1r w komórkach HEK293-F w zawiesinie, jak opisano powyżej. [0119] Eksprymowane i wydzielane monospecyficzne dwuwartościowe przeciwciało <IGF-1R> z zamianą CL-CH1 oczyszczono z przefiltrowanych supernatantów z hodowli komórkowych metodą chromatografii powinowactwa na białku A, jak opisano powyżej. W skrócie supernatanty z hodowli komórkowych zawierające przeciwciało <IGF-1R> z zamianą CL-CH1 z przejściowych transfekcji sklarowano przez odwirowanie i przesączenie i wprowadzono na kolumnę Protein A HiTrap MabSelect Xtra (GE Healthcare) zrównoważoną buforem PBS (10 mm Na2HPO4, 1 mm KH2PO4, 137 mm NaCl i 2,7 mm KCl, ph 7,4). Niezwiązane białka wymywano buforem równoważącym PBS, a następnie 0,1 M buforem na bazie cytrynianu sodu o ph, i przemyto PBS. Wymycie przeciwciała osiągnięto z użyciem 100 mm cytrynian sodu o ph 2,8, a następnie natychmiast zobojętniono próbkę z użyciem 300 µl 2 M Tris o ph 9,0 na 2 ml frakcję. Zagregowane białko oddzielono od monomerycznych przeciwciał metodą chromatografii wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek na kolumnie HiLoad 26/60 Superdex 200 prep grade (GE Healthcare) w 20 mm histydynie, 10 mm NaCl o ph 6,0 i frakcje monomerycznych przeciwciał następnie zatężono z użyciem wirówkowego koncentratora MILLIPORE Amicon Ultra-1. Przeciwciało <IGF-1R> z zamianą CL-CH1 zamrożono i przechowywano w temperaturze -20 C lub -80 C. Integralność przeciwciała <IGF-1R> z zamianą CL-CH1 analizowano metodą SDS-PAGE w obecności i nieobecności środka redukującego, a następnie barwie-

24 nia błękitem Coomasie, jak opisano powyżej. Monomeryczny stan przeciwciała <IGF-1R> z zamianą CL-CH1 potwierdzono metodą analitycznej chromatografii wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek. (Figura 12) Scharakteryzowane próbki poddano kolejnym analizom białek i charakterystyce funkcjonalnej. Spektrometria mas ESI potwierdziła teoretyczną masą cząsteczkową całkowicie deglikozylowanego przeciwciała <IGF-1R> z zamianą CL-CH1. Przykład 1D Analiza właściwości wiązania IGF-1R monospecyficznego, dwuwartościowego przeciwciała <IGF-1R> z zamianą CL-CH1w teście ELISA wiązania ECD IGF-1R i metodą Biacore [0120] Właściwości wiązania monospecyficznego, dwuwartościowego przeciwciała <IGF- 1R> z zamianą CL-CH1 oceniano w teście ELISA z zewnątrzkomórkową domeną (ECD) IGF-1R, jak opisano powyżej. W tym celu domenę zewnątrzkomórkową IGF-1R (reszty 1-462), zawierającą naturalną sekwencję liderową i domeny bogate w LI-cysteinę 12 z ektodomeny ludzkiego IGF-IR z łańcucha alfa (zgodnie z McKern i in., 1997; Ward i in., 2001) połączoną z N-końcowym znacznikiem His-peptyd wiążący streptawidynę (His-SBP) wklonowano do pochodnej wektora pcdna3 i przejściowo eksprymowano w komórkach HEK293F. Sekwencja białkowa ECD IGF-1R-His-SBP została podana powyżej. Uzyskana krzywa miareczkowania wykazała, że przeciwciało <IGF-1R> z zamianą CL-CH1 było funkcjonalne i wykazywało porównywalne właściwości i kinetykę wiązania, co przeciwciało <IGF-1R> typu dzikiego w granicach błędu metody, a tym samym okazało się w pełni funkcjonalne (Figura 13). [0121] Ustalenia te zostały potwierdzone przez dane z Biacore z odpowiednimi oczyszczonymi przeciwciałami, które wykazały, że monospecyficzne, dwuwartościowe przeciwciało <IGF-1R> z zamianą CL-CH1 przy wartości KD równej 3,7 pm miało porównywalne powinowactwo i kinetykę wiązania z ECD IGF-1R jak pierwotne przeciwciało <IGF- 1R> typu dzikiego przy wartości KD równej 3,2 nm: Przykład 1G Analiza właściwości wiązania IGF-1R monospecyficznego, dwuwartościowego przeciwciała <IGF-1R> z zamianą CL-CH1 metodą FACS z użyciem komórek I24 wykazujących nadekspresję IGF-1R [0122] W celu potwierdzenia aktywności wiązania przeciwciała <IGF-1R> z zamianą CL- CH1 z komórkami I24 wykazującymi nadekspresję IGF-1R na powierzchni (komórki NIH3T3 eksprymujące rekombinowane ludzkie IGF-1R, Roche), zbadano metodą FACS. W skrócie, x10e komórek I24 na probówkę do FACS inkubowano z rozcieńczeniem oczyszczonego przeciwciała <IGF-1R> z zamianą CL-CH1 i przeciwciała <IGF-1R> typu dzikiego jako odniesieniem i inkubowano na lodzie przez 1 h. Niezwiązane przeciwciało odpłukano z użyciem 4 ml lodowatej PBS (Gibco) + 2% FCS (Gibco). Następnie komórki odwirowano ( min przy 400 g) i związane przeciwciało wykrywano z użyciem koniugatu F(ab')2<hFcγ>PE (Dianova) na lodzie przez 1 h zabezpieczając przed światłem. Niezwiązane przeciwciało wykrywające odpłukano z użyciem 4 ml lodowatej PBS + 2% FCS. Następnie komórki odwirowano ( min, 400 g), ponownie przeprowadzono w zawiesinę w µl PBS i związane przeciwciało wykrywające oznaczono ilościowo na FACSCalibur lub FACS Canto (BD (kanał FL2, komórek na pomiar). Podczas eksperymentu włączono odpowiednie kontrole izotypowe w celu wykluczenia wszelkich niespecyficznych zdarzeń wiązania. Wiązanie przeciwciała <IGF-1R> z zamianą CL-CH1 i przeciwciała referencyjnego <IGF-1R> typu dzikiego z IGF-1R na komórkach I24 wywołuje porównywalne, zależne od stężenia przesunięcie średniej intensywności fluorescencji. Przykłady 2:

25 Opis monospecyficznego dwuwartościowego przeciwciała <ANGPT2> typu dzikiego Przykład 2A Wytwarzanie plazmidów ekspresyjnych dla monospecyficznego, dwuwartościowego przeciwciała <ANGPT2> typu dzikiego [0123] Sekwencje dla domen zmiennych łańcucha ciężkiego i lekkiego monospecyficznego, dwuwartościowego przeciwciała ANGPT2 <ANGPT2> typu dzikiego wraz z odpowiednimi sekwencjami liderowymi opisane w tym przykładzie pochodzą z łańcucha ciężkiego (SEQ ID NO: 6) i łańcucha lekkiego (SEQ ID NO: 7) ludzkiego przeciwciała <ANGPT2>, opisanych w WO 2006/04049, a domeny stałe łańcucha ciężkiego i lekkiego pochodzą z ludzkiego przeciwciała (C-kappa i IgG1). [0124] Przeciwciało <ANGPT2> typu dzikiego wklonowano do plazmidów SB04-pUC- HC-ANGPT2 (SEQ ID NO: 6) i SB06-pUC-LC-ANGPT2 (SEQ ID NO: 7), które są analogiczne do wektorów opisanych w poprzednim przykładzie 1A. [012] Ze względów porównawczych i do eksperymentów z koekspresją (patrz przykład 3) przeciwciało <ANGPT2> typu dzikiego poddano przejściowej (ko-)ekspresji z plazmidów SB04-pUC-HC-ANGPT2 i SB06-pUC-LC-ANGPT2. Przykład 2B Wytwarzanie plazmidów ekspresyjnych dla monospecyficznego, dwuwartościowego przeciwciała <ANGPT2> typu dzikiego [0126] Każdą z sekwencji kwasu nukleinowego kodującą HC i LC <ANGPT2> syntetyzowano drogą syntezy chemicznej, a następnie wklonowano do wektora do klonowania pga4 opartego na ppcrscript (Stratagene) w Geneart (Regensburg, Niemcy). Kasetę ekspresyjną kodującą <ANGPT2> HC wklonowano do odpowiedniego plazmidu E. coli z utworzeniem końcowego wektora SB04-pUC-HC-ANGPT2; kasetę ekspresyjną kodującą odpowiedni <ANGPT2> LC wklonowano do odpowiedniego plazmidu E. coli z wytworzeniem końcowego wektora SB06-pUC-LC-ANGPT2. Subklonowane sekwencje kwasu nukleinowego zweryfikowano metodą sekwencjonowania DNA. Do przejściowych i stabilnych transfekcji wytworzono większe ilości plazmidów przez uzyskanie plazmidów z transformowanych hodowli E. coli (Nucleobond AX, Macherey-Nagel). Przykład 3 Ekspresja bispecyficznego, dwuwartościowego przeciwciała <ANGPT2-IGF-1R>, w którym w łańcuchach ciężkim i lekkim specyficznie wiążących IGF-1R, domeny stałe CL i CH1 są wzajemnie zastąpione (określanego tu w skrócie jako przeciwciało <ANGPT2- IGF-1R> z zamianą CL-CH1) Przykład 3A Przejściowa koekspresja i oczyszczanie przeciwciała <IGF-1R> z zamianą CL-CH1 i przeciwciała <ANGPT2> typu dzikiego w komórkach HEK293 EBNA w celu otrzymami bispecyficznego przeciwciała <ANGPT2-IGF-1R> z zamianą CL-CH1 [0127] W celu wytworzenia funkcjonalnego bispecyficznego przeciwciała rozpoznającego IGF-1R przez Fab przeciwciała <IGF-1R> z zamianą CL-CH1 z jednej strony i <ANGPT2> przez region Fab <ANGPT2> typu dzikiego z drugiej strony, dwa plazmidy ekspresyjne kodujące przeciwciało <IGF-1R> z zamianą CL-CH1 (przykład 1A) poddano koekspresji z dwoma plazmidami ekspresyjnymi kodującymi przeciwciało <ANGPT2> typu dzikiego (przykład 2A). Zakładając statystyczne wiązanie się łańcuchów ciężkich HC typu dzikiego i łańcuchów ciężkich HC** z zamianą CL-CH1, prowadzi to do wytwarzania bispecyficznego i dwuwartościowego przeciwciała <IGF-1R-ANGPT2> z zamianą CL- CH1. Przy założeniu, że oba przeciwciała są równie dobrze eksprymowane i bez uwzględ-

26 niania produktów ubocznych powinno to prowadzić do powstania trzech głównych produktów w stosunku 1:2:1 A) przeciwciała <IGF-1R> z zamianą CL-CH1, B) bispecyficznego przeciwciała <IGF-1R-ANGPT2> z zamianą CL-CH1 i C) przeciwciała <ANGPT2> typu dzikiego. Można przewidzieć kilka produktów ubocznych. Jednakże, ze względu na zamianę tylko domen CL-CH częstość występowania produktów ubocznych powinna być zmniejszona w porównaniu z całkowitym skrzyżowaniem Fab. Należy zwrócić uwagę, że ponieważ przeciwciało <ANGPT2> typu dzikiego wykazało wyższą wydajność przejściowej ekspresji niż przeciwciała <IGF-1R> typu dzikiego i <IGF-1R> z zamianą CL-CH1, stosunek plazmidów dla przeciwciała <ANGPT2> typu dzikiego i plazmidów dla przeciwciała <IGF-1R> z zamianą CL-CH1 został przesunięty na korzyść ekspresji przeciwciała <ANGPT2> typu dzikiego. [0128] W celu wytworzenia mieszaniny głównych produktów A) przeciwciała <IGF-1R> z zamianą CL-CH1, B) bispecyficznego przeciwciała <ANGPT2-IGF-1R> z zamianą CL- CH1 i C) przeciwciała <ANGPT2> typu dzikiego, cztery plazmidy puc-hc**-igf-1r i puc-lc**-igf-1r i plazmidy SB04-pUC-HC-ANGPT2 i SB06-pUC-LC-ANGPT2 poddano przejściowej kotransfekcji do komórek HEK293-F w zawiesinie jak opisano powyżej. Zebrany supernatant zawierał mieszaninę głównych produktów A) przeciwciała <IGF- 1R> z zamianą CL-CH1, B) bispecyficznego przeciwciała <ANGPT2-IGF-1R> z zamianą CL-CH1 i C) przeciwciała <ANGPT2> typu dzikiego i określaną jako mieszanina bispecyficzna z zamianą CL-CH1. Supernatanty z hodowli komórek zawierające mieszaninę bispecyficzną z zamianą CL-CH1 zebrano przez odwirowanie, a następnie oczyszczono w sposób opisany powyżej. Figura 14 [0129] Integralność przeciwciał z mieszaniny analizowano metodą SDS-PAGE w obecności i nieobecności czynnika redukującego, a następnie barwienia błękitem Coomasie, jak opisano. SDS-PAGE wykazała, że w preparacie obecne były 2 różne łańcuchy ciężkie i lekkie, jak oczekiwano (żel zredukowany). Monomeryczny stan przeciwciał w mieszaninie potwierdzono metodą analitycznej chromatografii wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek, która wykazała, że oczyszczone rodzaje przeciwciał były w stanie monomerycznym. Scharakteryzowane próbki poddano kolejnym analizom białek i charakterystyce funkcjonalnej. Przykład 3B Wykrywanie funkcjonalnego bispecyficznego przeciwciała <ANGPT2-IGF-1R> z zamianą CL-CH1 w komórkowym teście tworzenia mostków FACS na komórkach I24 eksprymujących IGF-1R [0130] W celu potwierdzenia obecności funkcjonalnego bispecyficznego przeciwciała <ANGPT2-IGF-1R> z zamianą CL-CH1 w oczyszczonej bispecyficznej mieszaninie głównych produktów z zamianą CL-CH1 A) przeciwciała <IGF-1R> z zamianą CL-CH1, B) bispecyficznego przeciwciała <ANGPT2-IGF-1R> z zamianą CL-CH1 i C) przeciwciała <ANGPT2> typu dzikiego z przejściowej koekspresji opisanej w przykładzie 3A, przeprowadzono komórkowy test FACS tworzenia mostków IGF-1R-ANGPT2 na komórkach I24 (komórki NIH3T3 eksprymujące rekombinowany ludzki IGF-1R, Roche). Zasadę testu przedstawiono na Figurze 10. Bispecyficzne przeciwciało <ANGPT2-IGF-1R> z zamianą CL-CH1, które jest obecne w oczyszczonej mieszaninie przeciwciał jest zdolne do wiązania się z IGF-1R w komórkach I24 i jednocześnie z ANGPT2; a zatem będzie tworzyć mostek miedzy swoimi dwoma antygenami docelowymi za pomocą dwóch przeciwległych regionów Fab. [0131] W skrócie, x10e komórek I24 na probówkę do FACS inkubowano z całą oczyszczoną mieszaniną przeciwciał i inkubowano na lodzie przez 1 h (miareczkowanie 160 µg/ml mieszaniny). Odpowiednie oczyszczone przeciwciała <IGF-1R> i <ANGPT2> typu dzikiego zastosowano do komórek I24 jako kontrole. Niezwiązane przeciwciało odpłukano z użyciem 4 ml lodowatej PBS (Gibco) + 2% FCS (Gibco), komórki odwirowano ( min

27 przy 400 g) i związane bispecyficzne przeciwciało wykrywano z użyciem 0 µl 2 µg/ml ludzkiej ANGPT2 (R&D Systems) przez 1 h na lodzie. Następnie, niezwiązaną ANGPT2 odpłukano raz lub dwa razy z użyciem 4 ml lodowatej PBS + 2% FCS (Gibco), komórki odwirowano ( min przy 400 g) i związaną ANGPT2 wykrywano z użyciem 0 µl µg/ml przeciwciała <ANGPT2>mIgG1-Biotyna (BAM0981, R&D Systems) przez 4 min na lodzie; alternatywnie, komórki inkubowano z 0 µl µg/ml kontroli izotypowej migg1- Biotyna (R&D Systems). Niezwiązane przeciwciało wykrywające odpłukano z użyciem 4 ml lodowatej PBS (Gibco) + 2% FCS (Gibco), komórki odwirowano ( min przy 400 g) i związane przeciwciało wykrywające wykrywano z użyciem 0 µl 1:400 koniugatu Streptawidyna-PE (Invitrogen/Zymed) przez 4 min na lodzie zabezpieczając przed światłem. Niezwiązany koniugat Streptawidyna-PE odpłukano z użyciem 4 ml lodowatej PBS + 2% FCS. Następnie komórki odwirowano ( min 400 g), ponownie przeprowadzono w zawiesinę w µl PBS i związany koniugat Streptawidyna-PE oznaczono ilościowo na FACSCalibur (BD (kanał FL2, komórek na pomiar). Podczas eksperymentu włączono odpowiednie kontrole izotypowe w celu wykluczenia wszelkich niespecyficznych zdarzeń wiązania. Ponadto, jako kontrole włączono oczyszczone monospecyficzne, dwuwartościowe przeciwciała IgG1 <IGF-1R> i <ANGPT2>. [0132] Wyniki na Figurze 1 pokazują, że inkubacja z oczyszczoną mieszaniną skrzyżowanych przeciwciał (przeciwciało <ANGPT2-IGF-1R> z zamianą CL-CH1) z koekspresji skrzyżowanego przeciwciała (przeciwciało <IGF-1R> z zamianą CL-CH1) z przeciwciałem typu dzikiego (przeciwciało <ANGPT2> typu dzikiego) prowadziła do istotnego przesunięcia fluorescencji wskazując na obecność funkcjonalnego bispecyficznego przeciwciała <ANGPT2-IGF-1R> z zamianą CL-CH1, które było zdolne do wiązania IGF-1R w komórkach I24 i jednocześnie ANGPT2; a zatem tworzy mostki między swoimi dwoma antygenami docelowymi za pomocą dwóch przeciwległych regionów Fab. W przeciwieństwie do tego odpowiednie przeciwciała kontrolne <IGF-1R> i <Ang-2> nie prowadziły do przesunięcia fluorescencji w teście tworzenia mostków FACS [0133] Podsumowując, dane te wskazują, że przez koekspresję odpowiednich plazmidów typu dzikiego i skrzyżowanych można wytworzyć funkcjonalne bispecyficzne przeciwciała. Wydajność produkcji prawidłowego bispecyficznego przeciwciała można zwiększyć przez wymuszenie prawidłowej heterodimeryzacji łańcuchów ciężkich typu dzikiego i zmodyfikowanych przez skrzyżowanie, np. z użyciem technologii knobs-into-holes, jak również stabilizacji dwusiarczkami (Patrz przykłady 4). Przykład 4 Ekspresja dwuwartościowego, bispecyficznego przeciwciała <ANGPT2-IGF-1R> z zamianą CL-CH1 ze zmodyfikowanymi domenami CH3 ( knobs-into-holes ) [0134] W celu dalszej poprawy wydajności bispecyficznego przeciwciała <ANGPT2-IGF- 1R> z zamianą CL-CH1 stosuje się technologię knobs-into-holes do koekspresji przeciwciał <IGF-1R> z zamianą CL-CH1 i <ANGPT2> typu dzikiego w celu uzyskania jednorodnego i funkcjonalnego preparatu przeciwciała bispecyficznego. W tym celu, domena CH3 łańcucha ciężkim* HC* przeciwciała <IGF-1R> z zamianą CL-CH1 jest zastąpiona domeną CH3 ( gałka ) o SEQ ID NO: 8 ze zamianą T366W, a domena CH3 w ciężkim łańcuchu przeciwciała <ANGPT2> typu dzikiego jest zastąpiona domeną CH3 ( dołek ) o SEQ ID NO: 9 z zamianą T366S, L368A, Y407V lub na odwrót. Ponadto, można wprowadzić mostek disulfidowy celu zwiększenia trwałości i wydajności, a także dodatkowe reszty tworzące mostki jonowe i zwiększające wydajność heterodimeryzacji (EP A1). [013] Przejściową koekspresję i oczyszczanie otrzymanego dwuwartościowego, bispecyficznego przeciwciała <ANGPT2-IGF-1R> z zamianą CL-CH1 ze zmodyfikowanymi domenami CH3 ( knobs-into-holes ) prowadzi się w sposób opisany w przykładzie 3. [0136] Należy zauważyć, że optymalizację heterodimeryzacji można osiągnąć np. z użyciem różnych technologii knobs-into-holes, takich jak wprowadzenie dodatkowego

28 mostka disulfidowego w domenie CH3 np. Y349C w łańcuchu gałki i D36C w łańcuchu dołka i/lub w połączeniu z zastosowaniem reszt R409D; K370E (K409D) jako reszt gałek i D399K; E37K jako reszt dołków, opisane w EP A1. [0137] Analogicznie do przykładu 4 można wytworzyć kolejne dwuwartościowe bispecyficzne przeciwciała z zamianą CH1-CL ze zmodyfikowanymi domenami CH3 ( knobsinto-holes ) skierowane przeciwko ANGPT2 i innemu docelowemu antygenowi (z użyciem opisanego wyżej łańcucha ciężkiego i lekkiego ANGPT2 oraz łańcucha ciężkiego i lekkiego** HC** i LC** z zamianą CH1-CL przeciwciała skierowanego przeciwko temu drugiemu celowi, przy czym oba łańcuchy ciężkie są zmodyfikowane metodą knobs-inholes ) lub skierowane przeciwko IGF-1R i innemu celowi (z użyciem łańcucha ciężkiego i lekkiego przeciwciała skierowanego przeciwko temu innemu celowi, i wyżej opisanego łańcucha ciężkiego i lekkiego** HC** i LC** z zamianą CH1-CL IGF-1R, przy czym oba łańcuchy ciężkie są zmodyfikowane są zmodyfikowane metodą knobs-into-holes ). WYKAZ SEKWENCJI [0138] <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Dwuwartościowe bispecyficzne przeciwciała <130> EP <10> EP <11> <160> 10 <170> PatentIn wersja 3.2 <210> 1 <211> 467 <212> PRT <213> Sztuczna <220> <223> sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego przeciwciała <IGF-1R> typu dzikiego <400> 1

29 28

30 29

31 30 <210> 2 <211> 23 <212> PRT <213> Sztuczna <220> <223> sekwencja aminokwasowa łańcucha lekkiego przeciwciała <IGF-1R> typu dzikiego <400> 2

32 31 <210> 3 <211> 471 <212> PRT <213> Sztuczna <220> <223> sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego** (HC**) przeciwciała <IGF- 1R> z zamianą CL-CH1, w którym domena łańcucha ciężkiego CH1 jest zastąpiona domeną łańcucha lekkiego CL <400> 3

33 32

34 33

35 34 <210> 4 <211> 233 <212> PRT <213> Sztuczna <220> <223> sekwencja aminokwasowa łańcucha lekkiego** (LC**) przeciwciała <IGF- 1R> z zamianą CL-CH1, w którym domena łańcucha lekkiego CL jest zastąpiona domeną łańcucha ciężkiego CH1 <400> 4

36 3 <210> <211> 7 <212> PRT <213> Sztuczna <220> <223> sekwencja aminokwasowa ektodomeny IGF-1R ze znacznikiem His-peptyd wiążący streptawidynę (ECD IGF-1R-His-SBP) <400>

37 36

38 37

39 38 <210> 6 <211> 471 <212> PRT <213> Sztuczna <220> <223> sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego przeciwciała przeciw Angiopoetynie 2 <ANGPT2> typu dzikiego <400> 6

40 39

41 40 <210> 7 <211> 219 <212> PRT <213> Sztuczna <220> <223> sekwencja aminokwasowa łańcucha lekkiego przeciwciała przeciw Angiopoetynie 2 <ANGPT2> typu dzikiego <400> 7

42 41 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> Sztuczna <220> <223> sekwencja aminokwasowa domeny CH3 ( gałka ) z zamianą T366W do stosowania w technologii knobs-into-holes <400> 8

43 42 <210> 9 <211> 107 <212> PRT <213> Sztuczna <220> <223> sekwencja aminokwasowa domeny CH3 ( dołek ) z zamianą T366S, L368A, Y407V do stosowania w technologii knobs-into-holes <400> 9

44 43 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Sztuczna <220> <223> sekwencja aminokwasowa ektodomeny IGF-1R ze znacznikiem His-peptyd wiążący streptawidynę (ECD IGF-1R-His-SBP) <400> 10

45 44

46 4

47 46 Zastrzeżenia patentowe Dwuwartościowe, bispecyficzne przeciwciało, zawierające: a) łańcuch lekki i łańcuch ciężki przeciwciała specyficznie wiążącego się z pierwszym antygenem; oraz b) łańcuch lekki i łańcuch ciężki przeciwciała specyficznie wiążącego się z drugim antygenem, w którym domeny stałe CL i CH1 są wzajemnie zastąpione. 2. Przeciwciało według zastrzeżenia 1 znamienne tym, że domena CH3 z jednego łańcucha ciężkiego i domena CH3 z drugiego łańcucha ciężkiego spotykają się w miejscu zetknięcia, które stanowi pierwotne miejsce zetknięcia między domenami CH3 przeciwciała; przy czym to miejsce zetknięcia jest zmienione, tak że sprzyja tworzeniu się dwuwartościowego, bispecyficznego przeciwciała, przy czym ta zmiana jest znamienna tym, że: a) domena CH3 z jednego łańcucha ciężkiego jest zmieniona, tak że w pierwotnym miejscu zetknięcia domeny CH3 z jednego łańcucha ciężkiego, które spotyka się z pierwotnym miejscem zetknięcia domeny CH3 z drugiego łańcucha ciężkiego w dwuwartościowym, bispecyficznym przeciwciele, reszta aminokwasowa jest zastąpiona resztą aminokwasową z łańcuchem bocznym o większej objętości, tworząc tym samym wypukłość w miejscu zetknięcia domeny CH3 z jednego łańcucha ciężkiego, która mieści się we wnęce w miejscu zetknięcia domeny CH3 z drugiego łańcucha ciężkiego oraz b) domena CH3 z drugiego łańcucha ciężkiego jest zmieniona, tak że w pierwotnym miejscu zetknięcia drugiej domeny CH3, które spotyka się z pierwotnym miejscem zetknięcia pierwszej domeny CH3 w dwuwartościowym, bispecyficznym przeciwciele, reszta aminokwasowa jest zastąpiona resztą aminokwasową z łańcuchem bocznym o mniejszej objętości, tworząc tym samym wnękę w miejscu zetknięcia drugiej domeny CH3, w której mieści się wypukłość z miejsca zetknięcia pierwszej domeny CH3; 3. Przeciwciało według zastrzeżenia 2, znamienne tym, że ta reszta aminokwasowa z łańcuchem bocznym o większej objętości jest wybrana z grupy obejmującej argininę (R), fenyloalaninę (F), tyrozynę (Y), tryptofan (W). 4. Przeciwciało według któregokolwiek z zastrzeżeń 2 albo 3, znamienne tym, że ta reszta aminokwasowa z łańcuchem bocznym o mniejszej objętości jest wybrana z grupy obejmującej alaninę (A), serynę (S), treoninę (T), walinę (V).. Przeciwciało według któregokolwiek z zastrzeżeń 2 do 4, znamienne tym, że obie domeny CH3 są ponadto zmienione przez wprowadzenie cysteiny (C) jako aminokwasu w odpowiednich pozycjach w każdej domenie CH3. 6. Przeciwciało według zastrzeżenia 1, znamienne tym, że jedna z domen stałych łańcucha ciężkiego CH3 obu łańcuchów ciężkich jest zastąpiona domeną stałą łańcucha ciężkiego CH1; a druga domena stała łańcucha ciężkiego CH3 jest zastąpiona domeną stałą łańcucha lekkiego CL. 7. Sposób wytwarzania dwuwartościowego, bispecyficznego przeciwciała według zastrzeżenia 1 obejmujący etapy a) transformowania komórki gospodarza z użyciem

48 wektorów zawierających cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące łańcuch lekki i łańcuch ciężki przeciwciała specyficznie wiążącego się z pierwszym antygenem - wektorów zawierających cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące łańcuch lekki i łańcuch ciężki przeciwciała specyficznie wiążącego się z drugim antygenem, w którym domeny stałe CL i CH1 są wzajemnie zastąpione; b) hodowania komórki gospodarza w warunkach umożliwiających syntezę tej cząsteczki przeciwciała; i c) odzyskiwania tej cząsteczki przeciwciała z tej hodowli. 8. Komórka gospodarz, zawierająca - wektory zawierające cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące łańcuch lekki i łańcuch ciężki przeciwciała specyficznie wiążącego się z pierwszym antygenem - wektory zawierające cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące łańcuch lekki i łańcuch ciężki przeciwciała specyficznie wiążącego się z drugim antygenem, w którym domeny stałe CL i CH1 są wzajemnie zastąpione. 9. Kompozycja dwuwartościowego, bispecyficznego przeciwciała według zastrzeżeń 1 do Kompozycja farmaceutyczna zawierająca dwuwartościowe, bispecyficzne przeciwciało według zastrzeżeń 1 do 6 i co najmniej jedną farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę. Uprawniony: F. Hoffmann-La Roche AG Pełnomocnik: mgr inż. Zofia Sulima Rzecznik patentowy

49 48

50 49

51 0

52 1

53 2

54 3

55 4

56

57 6