(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2013/16 EP B1 (13) (51) T3 Int.Cl. C07K 16/30 ( ) C07K 16/40 ( ) A61P 35/00 ( ) (54) Tytuł wynalazku: Ludzkie przeciwciała monoklonalne przeciwko białku kinazy tyrozynowej 7 (PTK7) i ich zastosowanie (30) Pierwszeństwo: US P (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2008/34 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2013/08 (73) Uprawniony z patentu: Medarex, Inc., Princeton, US (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 LI-SHENG LU, Mountain View, US JONATHAN ALEXANDER TERRETT, Los Altos, US CHIN PAN, Los Altos, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Anna Grzelak WTS RZECZNICY PATENTOWI WITEK, ŚNIEŻKO I PARTNERZY ul. R. Weigla Wrocław Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 Opis Stan techniki [0001] Receptory związane z aktywnością kinazy tyrozynowej (RTK, ang. receptor tyrosine kinase) to transbłonowe białka sygnałowe, które przekazują sygnały biologiczne ze środowiska zewnątrzkomórkowego do wnętrza komórki. Regulacja sygnałów RTK jest ważna w regulacji wzrostu komórek, różnicowania, wzrostu aksonów, wzrostu nabłonka, rozwoju, adhezji, migracji oraz apoptozy (Prenzel et al. (2001) Endocr. Relat. Cancer 8:11-31; Hubbard i Till (2000) Annu. Rev. Biochem. 69:373-98). Wiadomo, że RTK biorą udział w rozwoju i progresji kilku form nowotworów. W większości nowotworów powiązanych z RTK występowała raczej amplifikacja białka receptora niż mutacja genu (Kobus i Fleming (2005) Biochemistry 44: ). [0002] Białko kinazy tyrozynowej 7 (PTK7, ang. protein tyrosine kinase 7), członek rodziny receptorów związanych z aktywnością kinazy tyrozynowej, zostało wyizolowane po raz pierwszy z prawidłowych ludzkich melanocytów i sklonowane przy pomocy RT-PCR (Lee et al., (1993) Oncogene 8: ; Park et al., (1996) J.Biochem 119:235-9). Niezależnie, gen sklonowano z linii komórkowej pochodzącej od ludzkiego raka okrężnicy i nazwano kinazą raka okrężnicy 4 (CCK4, ang. colon carcinoma kinase 4) (Mossie et al. (1995) Oncogene 11: ). PTK7 należy do podzbioru RTK nie posiadających wykrywalnej aktywności katalitycznej kinazy tyrozynowej, ale zachowujących aktywność przekazywania sygnału i uważa się, że mogą one funkcjonować jako cząsteczki adhezji komórkowej. [0003] Stwierdzono, że mrna dla PTK7 podlega zmiennej ekspresji w liniach komórkowych pochodzących od raka okrężnicy lecz nie podlega ekspresji w dojrzałych ludzkich tkankach okrężnicy (Mossie et al., supra). Ekspresję PTK7 obserwowano także w niektórych liniach komórkowych czerniaka oraz w biopsjach czerniaka (Easty, et al. (1997) Int. J. Cancer 71:1061-5). Stwierdzono ekspresję alternatywnej formy splicingowej (składania) w komórkach raka wątroby i jelita grubego (Jung et al. (2002) Biochim Biophys Acta 1579: ). Ponadto, stwierdzono wysoką nadekspresję PTK7 w próbkach ostrej białaczki szpikowej (Muller-Tidow et al., (2004) Clin. Cancer Res. 10:1241-9). Immunohistochemicznie, obserwowano specyficzne dla nowotworu barwienia PTK7 w rakach piersi, jelita grubego, płuc, trzustki, nerki i pęcherza moczowego, jak opisano w publikacji PCT WO 04/ WO 2004/ opisuje PTK7, środki, które oddziałują z lub modulują ekspresję lub aktywność PTK7, oraz ich zastosowanie w leczeniu raka. Kyriakos et al. (Cancer Research 52, luty 1992, nr. 4, strony ) opisują losy przeciwciał związanych do powierzchni komórek nowotworowych in vitro. [0004] Zgodnie z tym, pożądane są środki rozpoznające PTK7 oraz sposoby stosowania takich środków. Streszczenie wynalazku [0005] Niniejszy wynalazek dostarcza izolowanych przeciwciał monoklonalnych, w szczególności ludzkich przeciwciał monoklonalnych, które wiążą się z PTK7 i które wykazują wiele pożądanych właściwości. Właściwości te obejmują wiązanie z wysokim powinowactwem z ludzką PTK7 oraz wiązanie do komórek guza Wilmsa. Dostarczone są również przeciwciała i kompozycje według wynalazku do zastosowania w sposobach leczenia różnorodnych chorób powiązanych z PTK7. 1

3 [0006] Wynalazek dotyczy izolowanego ludzkiego przeciwciała monoklonalnego, lub jego części wiążącej antygen, przy czym przeciwciało: (a) swoiście wiąże się z ludzką PTK7; oraz (b) wiąże się do linii komórkowej guza Wilmsa o numerze dostępu ATCC CRL-1441 z EC 50 wynoszącym 4,0 nm lub mniejszym, w badaniu, które obejmuje inkubowanie 1 x 10 5 komórek z przeciwciałem przy początkowym stężeniu 30 µg/ml i seryjne rozcieńczanie przeciwciała w rozcieńczeniach 1:10; oraz (c) wiąże się z tym samym epitopem na ludzkiej PTK7 co przeciwciało odniesienia obejmujące: (i) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 2 oraz region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 7; lub (ii) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 3 oraz region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 8; lub (iii) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 4 oraz region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 10. [0007] Korzystne przeciwciało, lub jego część wiążąca antygen, obejmuje: (a) CDR1 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 12; (b) CDR2 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 16; (c) CDR3 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 20; (d) CDR1 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 25; (e) CDR2 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 31; oraz (f) CDR3 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 37; lub (a) CDR1 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 14; (b) CDR2 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 18; (c) CDR3 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 22; (d) CDR1 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 28; (e) CDR2 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 34; oraz (f) CDR3 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 40. lub (a) CDR1 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 13; (b) CDR2 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 17; (c) CDR3 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 21; (d) CDR1 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 26; (e) CDR2 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 32; oraz (f) CDR3 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 38. [0008] Inne korzystne przeciwciała według wynalazku, lub ich części wiążące antygen, obejmują: (a) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID:2; oraz (b) region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 7; 2

4 lub (a) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID:4; oraz (b) region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 10; lub (a) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID:3; oraz (b) region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 8. [0009] Przeciwciała według wynalazku mogą być, na przykład, przeciwciałami pełnej długości, na przykład z izotypu IgG1 lub IgG4. Alternatywnie, przeciwciała mogą być fragmentami przeciwciał, takimi jak fragmenty Fab lub Fab 2, lub przeciwciała jednołańcuchowe. [0010] Wynalazek dostarcza także immunokoniugatu obejmującego przeciwciało według wynalazku, lub jego część wiążącą antygen, połączone z środkiem terapeutycznym, takim jak cytotoksyna lub izotop radioaktywny. [0011] Dostarczone są kompozycje obejmujące przeciwciało, lub jego część wiążącą antygen, lub immunokoniugat według wynalazku oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. [0012] Cząsteczki kwasów nukleinowych kodujące przeciwciała, lub ich części wiążące antygen, według wynalazku, również są objęte zakresem wynalazku, jak również wektory ekspresyjne obejmujące takie kwasy nukleinowe oraz komórki gospodarza obejmujące takie wektory ekspresyjne. [0013] Dostarczony jest także sposób in vitro dla przygotowania przeciwciała według wynalazku, który obejmuje wyrażanie przeciwciała w komórce gospodarzu według wynalazku i izolację przeciwciała z komórki gospodarza. [0014] Ponadto, ujawniono mysz transgeniczną obejmującą transgeny ludzkich ciężkich i lekkich łańcuchów immunoglobulin, przy czym mysz wyraża przeciwciało według wynalazku, jak również hybrydomy przygotowane z takiej myszy, przy czym hybrydoma wytwarza przeciwciało według wynalazku. [0015] W jeszcze innym aspekcie, wynalazek dostarcza przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen, według wynalazku do zastosowania w sposobie leczenia lub zapobiegania nowotworowi, charakteryzującemu się wzrostem komórek guza wyrażających PTK7. Nowotwór może być rakiem okrężnicy (obejmującym raka jelita cienkiego), rakiem płuc, rakiem piersi, rakiem trzustki, czerniakiem (np. przerzutowym czerniakiem złośliwym), ostrą białaczką szpikową, rakiem nerki, rakiem pęcherza, rakiem jajnika lub rakiem prostaty. Przykłady innych nowotworów obejmują raka nerek (np. raka nerkowokomórkowego), glejaka, guzy mózgu, przewlekłe lub ostre białaczki w tym ostrą białaczkę limfocytową (ALL, ang. acute lymphocytic leukemia), białaczkę T-komórkową dorosłych (T-ALL), przewlekłą białaczkę szpikową, ostrą białaczkę limfoblastyczną, przewlekłą białaczkę limfocytową, chłoniaki (np. chłoniak Hodgkina (ziarniczy) i nieziarniczy, chłoniak limfocytarny, pierwotny chłoniak centralnego układu nerwowego, chłoniak z komórek-t, chłoniak Burkitta, chłoniaki anaplastyczne z dużych komórek (ALCL, ang. anaplastic large-cell lymphoma), skórne chłoniaki T-komórkowe, chłoniaki z małych komórek z wpuklonym jądrem komórkowym, chłoniaki z obwodowych komórek T, chłoniaki 3

5 Lennerta (limfoepitelialne), chłoniaki immunoblastyczne, chłoniaki/białaczki T-komórkowe (ATLL), chłoniaki grudkowe centroblastyczne-centrocytarne (cb/cc), chłoniaki rozlane z dużych komórek B, typ angioimmunoblastycznych chłoniaków T-komórkowych (typu AILD, ang. angioimmunoblastic lymphadenopathy) oraz chłoniaki rozwijające się w jamach ciała związane z HIV), raki zarodkowe, niezróżnicowane raki nosa i gardła (np. guz Schminckego), chorobę Castlemana, mięsaka Kaposiego, szpiczaka mnogiego, makroglobulinemię Waldenströma i inne chłoniaki B-komórkowe, raki jamy nosowogardłowej, raka kości, raka skóry, raka głowy i szyi, złośliwego czerniaka skórnego lub śródocznego, raka macicy, raka odbytnicy, raka odbytu, raka żołądka, raka jąder, raka macicy, raka jajowodów, raka endometrium, raka szyjki macicy, raka pochwy, raka sromu, raka przełyku, raka jelita cienkiego, raka układu hormonalnego, raka tarczycy, raka przytarczyc, raka nadnercza, mięsaka tkanek miękkich, raka cewki moczowej, raka prącia, guzy lite wieku dziecięcego, raka pęcherza moczowego, raka nerki lub moczowodu, raka miedniczki nerwowej, nowotwory ośrodkowego układu nerwowego (OUN, ang. CNS), angiogenezę nowotworową, guzy rdzenia kręgowego, glejaka pnia mózgu, gruczolaka przysadki, raka naskórkowego, raka płaskonabłonkowego, nowotwory indukowane środowiskowo włączając indukowane przez azbest, np. międzybłoniaka oraz kombinacje wymienionych nowotworów. Krótki opis figur rysunku [0016] Figura 1A przedstawia sekwencję nukleotydową (SEKW NR ID: 41) i sekwencję aminokwasową (SEKW NR ID: 1) regionu zmiennego łańcucha ciężkiego ludzkich monoklonalnych przeciwciał 3G8 i 3G8a. Regiony CDR1 (SEKW NR ID: 11), CDR2 (SEKW NR ID: 15) i CDR3 (SEKW NR ID: 19) oznaczono kreskami oraz wskazano pochodzenie germinalne V, D i J (wyprowadzenia linii germinalnej). Figura 1B przedstawia sekwencję nukleotydową (SEKW NR ID: 45) i sekwencję aminokwasową (SEKW NR ID: 5) regionu zmiennego łańcucha lekkiego ludzkiego monoklonalnego przeciwciała 3G8. Regiony CDR1 (SEKW NR ID: 23), CDR2 (SEKW NR ID: 29) i CDR3 (SEKW NR ID: 35) oznaczono kreskami oraz wskazano pochodzenie germinalne V i J. Figura 1C przedstawia sekwencję nukleotydową (SEKW NR ID: 46) i sekwencję aminokwasową (SEKW NR ID: 6) regionu zmiennego łańcucha lekkiego ludzkiego monoklonalnego przeciwciała 3G8a. Regiony CDR1 (SEKW NR ID: 24), CDR2 (SEKW NR ID: 30) i CDR3 (SEKW NR ID: 36) oznaczono kreskami oraz wskazano pochodzenie germinalne V i J. Figura 2A przedstawia sekwencję nukleotydową (SEKW NR ID: 42) i sekwencję aminokwasową (SEKW NR ID: 2) regionu zmiennego łańcucha ciężkiego ludzkiego monoklonalnego przeciwciała 4D5. Regiony CDR1 (SEKW NR ID: 12), CDR2 (SEKW NR ID: 16) i CDR3 (SEKW NR ID: 20) oznaczono kreskami oraz wskazano pochodzenie germinalne V, D i J. Figura 2B przedstawia sekwencję nukleotydową (SEKW NR ID: 47) i sekwencję aminokwasową (SEKW NR ID: 7) regionu zmiennego łańcucha lekkiego ludzkiego monoklonalnego przeciwciała 4D5. Regiony CDR1 (SEKW NR ID: 25), CDR2 (SEKW NR ID: 31) i CDR3 (SEKW NR ID: 37) oznaczono kreskami oraz wskazano pochodzenie germinalne V i J. 4

6 Figura 3A przedstawia sekwencję nukleotydową (SEKW NR ID: 43) i sekwencję aminokwasową (SEKW NR ID: 3) regionu zmiennego łańcucha ciężkiego ludzkich monoklonalnych przeciwciał 12C6. Regiony CDR1 (SEKW NR ID: 13), CDR2 (SEKW NR ID: 17) i CDR3 (SEKW NR ID: 21) oznaczono kreskami oraz wskazano pochodzenie germinalne V, D i J. Figura 3B przedstawia sekwencję nukleotydową (SEKW NR ID: 48) i sekwencję aminokwasową (SEKW NR ID: 8) regionu zmiennego łańcucha lekkiego ludzkiego monoklonalnego przeciwciała 12C6. Regiony CDR1 (SEKW NR ID: 26), CDR2 (SEKW NR ID: 32) i CDR3 (SEKW NR ID: 38) oznaczono kreskami oraz wskazano pochodzenie germinalne V i J. Figura 3C przedstawia sekwencję nukleotydową (SEKW NR ID: 49) i sekwencję aminokwasową (SEKW NR ID: 9) regionu zmiennego łańcucha lekkiego ludzkiego monoklonalnego przeciwciała 12C6a. Regiony CDR1 (SEKW NR ID: 27), CDR2 (SEKW NR ID: 33) i CDR3 (SEKW NR ID: 39) oznaczono kreskami oraz wskazano pochodzenie germinalne V i J. Figura 4A przedstawia sekwencję nukleotydową (SEKW NR ID: 44) i sekwencję aminokwasową (SEKW NR ID: 4) regionu zmiennego łańcucha ciężkiego ludzkiego monoklonalnego przeciwciała 7C8. Regiony CDR1 (SEKW NR ID: 14), CDR2 (SEKW NR ID: 18) i CDR3 (SEKW NR ID: 22) oznaczono kreskami oraz wskazano pochodzenie germinalne V, D i J. Figura 4B przedstawia sekwencję nukleotydową (SEKW NR ID: 50) i sekwencję aminokwasową (SEKW NR ID: 10) regionu zmiennego łańcucha lekkiego ludzkiego monoklonalnego przeciwciała 7C8. Regiony CDR1 (SEKW NR ID: 28), CDR2 (SEKW NR ID: 34) i CDR3 (SEKW NR ID: 40) oznaczono kreskami oraz wskazano pochodzenie germinalne V i J. Figura 5 przedstawia dopasowanie sekwencji aminokwasowych zmiennych regionów łańcucha ciężkiego 3G8 (SEKW NR ID: 1) i 3G8a (SEKW ID NR: 1) do sekwencji aminokwasowej ludzkiego germinalnego V H (SEKW NR ID: 51) (germinalny JH4b ujawniony jako SEKW NR ID: 59). Figura 6 przedstawia dopasowanie sekwencji aminokwasowych zmiennego regionu łańcucha ciężkiego 4D5 (SEKW NR ID: 2) do sekwencji aminokwasowej ludzkiego germinalnego V H (SEKW NR ID: 51) (germinalny JH4b ujawniony jako SEKW NR ID: 60). Figura 7 przedstawia dopasowanie sekwencji aminokwasowych zmiennych regionów łańcucha ciężkiego 12C6 (SEKW NR ID: 3) i 12C6a (SEKW NR ID: 2) do sekwencji aminokwasowej ludzkiego germinalnego V H DP44 (SEKW NR ID: 52) (germinalne 3-7, 3-23 oraz JH4b ujawnione odpowiednio jako SEKW NR ID: 61-63). Figura 8 przedstawia dopasowanie sekwencji aminokwasowych zmiennego regionu łańcucha ciężkiego 7C8 (SEKW NR ID: 4) do sekwencji aminokwasowej ludzkiego germinalnego V H 3-33 (SEKW NR ID: 53) (germinalny 3H6b ujawniony jako SEKW NR ID: 64). Figura 9 przedstawia dopasowanie sekwencji aminokwasowych zmiennych regionów łańcucha lekkiego 3G8 (SEKW NR ID: 5) i 3G8a (SEKW ID NR: 6) do sekwencji aminokwasowej ludzkiego germinalnego V k L15 (SEKW NR ID: 54) (germinalny JK1 ujawniony jako SEKW NR ID: 65). 5

7 Figura 10 przedstawia dopasowanie sekwencji aminokwasowych zmiennego regionu łańcucha lekkiego 4D5 (SEKW NR ID: 7) do sekwencji aminokwasowej ludzkiego germinalnego V k A10 (SEKW NR ID: 55) (germinalny JK5 ujawniony jako SEKW NR ID: 66). Figura 11 przedstawia dopasowanie sekwencji aminokwasowych zmiennego regionu łańcucha lekkiego 12C6 (SEKW NR ID: 8) do sekwencji aminokwasowej ludzkiego germinalnego V k A27 (SEKW NR ID: 56) (germinalny JK2 ujawniony jako SEKW NR ID: 67). Figura 12 przedstawia dopasowanie sekwencji aminokwasowych zmiennego regionu łańcucha lekkiego 12C6a (SEKW NR ID: 9) do sekwencji aminokwasowej ludzkiego germinalnego V k L15 (SEKW NR ID: 54) (germinalny JK2 ujawniony jako SEKW NR ID: 68). Figura 13 przedstawia dopasowanie sekwencji aminokwasowych zmiennego regionu łańcucha lekkiego 7C8 (SEKW NR ID: 10) do sekwencji aminokwasowej ludzkiego germinalnego V k L6 (SEKW NR ID: 57) (germinalny JK3 ujawniony jako SEKW NR ID: 69). Figura 14 przedstawia wyniki doświadczeń cytometrii przepływowej wykazujące, że ludzkie przeciwciało monoklonalne 7C8, skierowane przeciwko ludzkiej PTK7, wiąże się do powierzchni komórek HEK3 transfekowanych ludzką PTK7 pełnej długości. Figura 15 przedstawia wyniki doświadczeń ELISA wykazujące, że ludzkie przeciwciała monoklonalne przeciwko ludzkiej PTK7 wiążą swoiście PTK7. Figura 16 przedstawia wyniki doświadczeń cytometrii przepływowej wykazujące, że przeciwciała skierowane przeciwko ludzkiej PTK7 wiążą się do powierzchni komórek guza Wilmsa. Figura 17 przedstawia wyniki doświadczeń cytometrii przepływowej wykazujące, że przeciwciała skierowane przeciwko ludzkiej PTK7 wiążą się do powierzchni komórek różnych nowotworowych linii komórkowych. Figura 18 przedstawia wyniki doświadczeń cytometrii przepływowej wykazujące, że przeciwciała skierowane przeciwko ludzkiej PTK7 wiążą się do powierzchni komórek dendrytycznych. Figura 19 przedstawia wyniki doświadczeń cytometrii przepływowej wykazujące, że przeciwciała skierowane przeciwko ludzkiej PTK7 wiążą się do limfocytów T CD4+ i CD8+, ale nie do limfocytów B. Figura 20 przedstawia wyniki doświadczeń internalizacji Hum-Zap wykazujące, że ludzkie przeciwciała monoklonalne przeciwko PTK7 mogą ulegać internalizacji do komórek PTK7+. (A) Internalizacja ludzkich przeciwciał 3G8, 4D5 i 7C8 do komórek guza Wilmsa. (B) Internalizacja ludzkiego przeciwciała 12C6 do komórek guza Wilmsa. (C) Internalizacja ludzkich przeciwciał 7C8 i 12C6 do komórek guza A-431. (D) Internalizacja ludzkich przeciwciał 7C8 i 12C6 do komórek guza PC3. Figura 21 przedstawia wyniki testu proliferacji komórek wykazujące, że ludzkie monoklonalne przeciwciała anty-ptk7 sprzężone z toksyną zabijają komórki z linii ludzkiego raka nerki. 6

8 Figura 22 przedstawia wyniki testu proliferacji komórek wykazujące, że ludzkie monoklonalne przeciwciała anty-ptk7 sprzężone z toksyną zabijają komórki linii wyrażających PTK7 o poziomach ekspresji od niskiego do wysokiego. Figura 23 przedstawia wyniki testu inwazji wykazujące, że przeciwciała anty-ptk7 hamują ruchliwość inwazyjną komórek wyrażających PTK7 na powierzchni. Figura 24 przedstawia wyniki badania ksenoprzeszczepu guza in vivo wykazujące, że przeciwciała anty- PTK7 sprzężone z toksyną spowolniły progresję wzrostu guza w raku trzustki. Figura 25 przedstawia wyniki badania ksenoprzeszczepu guza in vivo wykazujące, że przeciwciała anty- PTK7 sprzężone z toksyną spowolniły progresję wzrostu guza w raku piersi. Szczegółowy opis wynalazku [0017] W jednym aspekcie, niniejszy wynalazek odnosi się do izolowanych przeciwciał monoklonalnych, w szczególności ludzkich przeciwciał monoklonalnych, wiążących swoiście PTK7. W niektórych wykonaniach, przeciwciała według wynalazku wykazują jedną lub więcej pożądanych właściwości funkcjonalnych, takich jak wiązanie z wysokim powinowactwem z PTK7 i/lub zdolność do hamowania wzrostu komórek guza in vitro i in vivo. W niektórych wykonaniach, przeciwciała według wynalazku pochodzą od szczególnych sekwencji germinalnych łańcucha ciężkiego i lekkiego i/lub obejmują szczególne cechy strukturalne, takie jak regiony CDR obejmujące szczególne sekwencje aminokwasowe. Wynalazek dostarcza izolowanych przeciwciał, sposobów wytwarzania takich przeciwciał, immunokoniugatów i cząsteczek dwuspecyficznych obejmujących takie przeciwciała oraz kompozycji farmaceutycznych zawierających przeciwciała, immunokoniugaty lub cząsteczki dwuspecyficzne według wynalazku. Wynalazek odnosi się także do sposobów stosowania przeciwciał, takich jak dla leczenia chorób takich jak nowotwór. [0018] Aby niniejszy wynalazek mógł być lepiej zrozumiany, zdefiniowano najpierw pewne terminy. Dodatkowe definicje są umieszczone w szczegółowym opisie. [0019] Terminy PTK7 i CCK4 stosowane są zamiennie i obejmują warianty, izoformy i homologi gatunkowe ludzkiej PTK7. Zgodnie z tym, ludzkie przeciwciała według wynalazku mogą, w niektórych przypadkach, reagować krzyżowo z PTK7 z gatunków innych niż człowiek. W niektórych wykonaniach, przeciwciała mogą być zupełnie swoiste dla jednej lub więcej ludzkich PTK7 i mogą nie wykazywać reaktywności krzyżowej dla innych gatunków niż człowiek lub innej. Kompletna sekwencja aminokwasowa przykładowej ludzkiej PTK7 ma numer dostępu Genbank NM_ (SEKW NR ID: 58). [0020] Termin odpowiedź immunologiczna odnosi się do działania, na przykład, limfocytów, komórek prezentujących antygen, komórek fagocytujących, granulocytów, oraz rozpuszczalnych makromolekuł wytwarzanych przez powyższe komórki lub wątrobę (włączając przeciwciała, cytokiny i białka dopełniacza), które skutkuje selektywnymi uszkodzeniami, zniszczeniem lub usunięciem z ciała ludzkiego infekujących patogenów, komórek lub tkanek zainfekowanych patogenami, komórek nowotworowych lub, 7

9 w przypadkach autoimmunizacji lub patologicznej reakcji zapalnej, normalnych ludzkich komórek lub tkanek. [0021] Szlak transdukcji sygnału odnosi się do biochemicznej zależności pomiędzy różnymi cząsteczkami transdukcji sygnału, które odgrywają rolę w przekazywaniu sygnału z jednej części komórki do innej części komórki. Stosowany tutaj zwrot receptor na powierzchni komórki obejmuje, na przykład, cząsteczki lub kompleksy cząsteczek zdolne do odbierania sygnału i przekazywania takiego sygnału poprzez błonę komórkową. Przykładem receptora na powierzchni komórki według niniejszego wynalazku jest receptor PTK7. [0022] Termin przeciwciało, w rozumieniu niniejszego opisu, obejmuje całe przeciwciała oraz dowolny fragment wiążący antygen (tj. część wiążącą antygen ) lub ich pojedyncze łańcuchy. Przeciwciało odnosi się do glikoproteiny obejmującej co najmniej dwa łańcuchy ciężkie (H, ang. heavy) i dwa łańcuchy lekkie (L, ang. light) wzajemnie połączone wiązaniami dwusiarczkowymi, lub jej części wiążącej antygen. Każdy łańcuch ciężki obejmuje region zmienny łańcucha ciężkiego (skracany tutaj do V H, ang. variable heavy) oraz region stały łańcucha ciężkiego. Rejon stały łańcucha ciężkiego obejmuje trzy domeny, C H1, C H2 i C H3. Każdy łańcuch lekki obejmuje region zmienny łańcucha lekkiego (skracany tutaj do V L, ang. variable light) oraz region stały łańcucha lekkiego. Region stały łańcucha lekkiego obejmuje jedną domenę, C L. Regiony V H i V L można dalej podzielić na regiony hiperzmienne, nazywane regionami determinującymi dopasowanie (komplementarność) (CDR, ang. complementarity determining regions), poprzedzielane regionami bardziej konserwowanymi, nazywanymi regionami zrębowymi (szkieletowymi) (FR, ang. framework regions). Każdy V H i V L składa się trzech CDR i czterech FR, ułożonych od końca aminowego do końca karboksylowego w następującej kolejności: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Regiony zmienne łańcuchów ciężkich i lekkich zawierają domenę wiążącą, która oddziałuje z antygenem. Regiony stałe przeciwciał mogą pośredniczyć w wiązaniu immunoglobuliny do tkanek lub czynników gospodarza, włączając różne komórki układu immunologicznego (np. komórki efektorowe) oraz pierwszy składnik (CIq) klasycznego układu dopełniacza. [0023] Stosowany tutaj termin część wiążąca antygen przeciwciała (lub po prostu część przeciwciała ), odnosi się do jednego lub więcej fragmentów przeciwciała, które zachowują zdolność swoistego wiązania antygenu (np. PTK7). Wykazano, że funkcja wiązania antygenu przeciwciała może być pełniona przez fragmenty przeciwciała pełnej długości. Przykłady wiążących fragmentów objętych terminem część wiążąca antygen przeciwciała obejmują (i) fragment Fab, monowalentny fragment składający się z domen V L, V H, C L, i C H 1; (ii) fragment F(ab ) 2, biwalentny fragment obejmujący dwa fragmenty Fab połączone mostkiem dwusiarczkowym w regionie zawiasowym; (iii) fragment Fab, będący w zasadzie Fab z częścią regionu zawiasowego (patrz, FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul wyd. 3 uzupełnione 1993); (iv) fragment Fd składający się z domen V H i C H 1; (v) fragment Fv składający się z domen V L i V H jednego ramienia przeciwciała, (vi) fragment dab (Ward et al., (1989) Nature 341: ), który składa się z domeny V H ; (vii) izolowany region determinujący dopasowanie (CDR); oraz (viii) nanociało, region zmienny łańcucha ciężkiego zawierający jedną domenę zmienną i dwie domeny stałe. Ponad to, mimo że dwie domeny fragmentu Fv, V L i V H kodowane są przez osobne geny, mogą być one połączone, z zastosowaniem metod rekombinacyjnych, syntetycznym łącznikiem, który umożliwia ich połączenie w jeden łańcuch białkowy, w którym regiony V L i V H tworzą pary dając cząsteczki monowalentne (znane 8

10 jako jednołańcuchowe Fv (scfv, ang. single chain Fv); patrz np. Bird et al. (1988) Science 242: ; i Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: ). Takie jednołańcuchowe przeciwciała również są w zamierzeniu objęte terminem część wiążąca antygen przeciwciała. Te fragmenty przeciwciała uzyskiwane są konwencjonalnymi technikami znanymi specjalistom w dziedzinie, a fragmenty są sprawdzane pod kątem użyteczności w ten sam sposób co całe przeciwciała. [0024] Stosowane tutaj izolowane przeciwciało, ma w zamierzeniu odnosić się do przeciwciała, które jest zasadniczo wolne od innych przeciwciał mających inne swoistości antygenowe (np. izolowane przeciwciało, które swoiście wiąże PTK7 jest zasadniczo wolne od przeciwciał, które swoiście wiążą antygeny inne niż PTK7). Izolowane przeciwciało, które swoiście wiąże PTK7 może jednak reagować krzyżowo z innymi antygenami, takimi jak cząsteczki PTK7 z innych gatunków. Ponad to, izolowane przeciwciało może być zasadniczo wolne od innych składników komórkowych i substancji. [0025] Stosowane tutaj terminy przeciwciało monoklonalne lub kompozycja przeciwciał monoklonalnych odnoszą się do preparatu cząsteczek przeciwciał o pojedynczym składzie cząsteczkowym. Kompozycja przeciwciał monoklonalnych wykazuje pojedynczą swoistość wiązania i powinowactwo do konkretnego epitopu. [0026] Stosowany tutaj termin ludzkie przeciwciało, ma w zamierzeniu obejmować przeciwciała o regionach zmiennych, w których zarówno zrąb jak i regiony CDR pochodzą od ludzkich germinalnych sekwencji immunoglobulin (ang. human germline immunoglobulin sequences).. Ponad to, jeśli przeciwciało zawiera region stały, ten region stały również pochodzi od ludzkich germinalnych sekwencji immunoglobulin. Ludzkie przeciwciała według wynalazku mogą obejmować reszty aminokwasowe nie kodowane przez sekwencje ludzkich germinalnych immunoglobulin (np. mutacje wprowadzone przez mutagenezę losową lub ukierunkowaną in vitro lub poprzez mutacje somatyczne in vivo). Jednakże, stosowany tutaj termin ludzkie przeciwciało, nie ma w zamierzeniu obejmować przeciwciał, w których sekwencje CDR pochodzące z linii zarodkowej ssaka innego gatunku, takiego jak mysz, zostały wstawione do ludzkich sekwencji zrębowych. [0027] Termin ludzkie przeciwciało monoklonalne odnosi się do przeciwciał wykazujących pojedynczą swoistość wiązania, które zawierają regiony zmienne, w których zarówno regiony zrębowe jak i CDR pochodzą od sekwencji immunoglobulin ludzkiej linii zarodkowej. W jednym wykonaniu, ludzkie przeciwciała monoklonalne wytwarzane są przez hybrydomę, obejmującą komórki B (limfocyty typu B) pozyskane z transgenicznego zwierzęcia niebędącego człowiekiem, np. transgenicznej myszy, mającej genom zawierający transgen ludzkiego łańcucha ciężkiego i transgen łańcucha lekkiego, włączone do unieśmiertelnionej komórki. [0028] Stosowany tutaj termin rekombinowane ludzkie przeciwciało" obejmuje wszystkie ludzkie przeciwciała przygotowywane, wyrażane, tworzone lub izolowane sposobami rekombinacyjnymi, takie jak (a) przeciwciała wyizolowane ze zwierzęcia (np. myszy), które jest transgeniczne lub transchromosomalne pod względem genów ludzkich immunoglobulin lub z otrzymanej z nich hybrydomy (szerzej opisanej poniżej), (b) przeciwciała wyizolowane z komórki gospodarza transformowanej w celu ekspresji ludzkiego przeciwciała, np. z transfektomy, (c) przeciwciała wyizolowane z rekombinowanych, kombinatorycznych bibliotek ludzkich przeciwciał i (d) przeciwciała przygotowane, wyrażane, tworzone 9

11 lub izolowane wszelkimi innymi sposobami, obejmującymi splicing (składanie) sekwencji genów ludzkich immunoglobulin do innych sekwencji DNA. Takie rekombinowane ludzkie przeciwciała mają regiony zmienne, w których regiony zrębowe i CDR pochodzą od sekwencji immunoglobulin ludzkiej linii zarodkowej. Jednakże, w niektórych wykonaniach, takie rekombinowane ludzkie przeciwciała mogą być poddane mutagenezie in vitro (lub somatycznej mutagenezie in vivo, gdy stosowane jest zwierzę transgeniczne pod względem ludzkich sekwencji Ig) i tym sposobem sekwencje aminokwasowe regionów V H i V L rekombinowanych przeciwciał są sekwencjami, które, pomimo pochodzenia i powiązania z sekwencjami V H i V L ludzkiej linii zarodkowej, nie muszą naturalnie występować w ludzkim repertuarze przeciwciał linii zarodkowej (germinalnej) in vivo. [0029] Stosowany tutaj izotyp odnosi się do klasy przeciwciała (np. IgM lub IgG1), kodowanej przez geny regionu stałego łańcucha ciężkiego. [0030] Zwroty przeciwciało rozpoznające antygen oraz przeciwciało swoiste wobec antygenu stosowane są tutaj zamiennie z terminem przeciwciało, które wiąże się swoiście z antygenem. [0031] Termin pochodne ludzkiego przeciwciała odnosi się do jakiejkolwiek zmodyfikowanej formy ludzkiego przeciwciała, np. koniugatu przeciwciała z innym środkiem lub przeciwciałem. [0032] Termin przeciwciało humanizowane ma w zamierzeniu odnosić się do przeciwciał, w których sekwencje CDR pochodzące z linii zarodkowych innych gatunków ssaków, takich jak mysz, wstawiono do ludzkich sekwencji zrębowych. W obrębie ludzkich sekwencji zrębowych mogą być wykonane dodatkowe modyfikacje regionów zrębowych. [0033] Termin przeciwciało chimeryczne ma w zamierzeniu odnosić się do przeciwciał, w których sekwencje regionów zmiennych pochodzą z jednego gatunku, a sekwencje regionów stałych pochodzą z innego gatunku, tak jak przeciwciało, w którym sekwencje regionów zmiennych pochodzą z przeciwciała mysiego, a sekwencje regionów stałych pochodzą z przeciwciała ludzkiego. [0034] Stosowane tutaj przeciwciało, które swoiście wiąże się z ludzką PTK7 ma w zamierzeniu odnosić się do przeciwciała, które wiąże się z ludzką PTK7 z K D wynoszącą 1x10-7 M lub mniejszą, korzystniej 5x10-8 M lub mniejszą, korzystniej 1x10-8 M lub mniejszą, korzystniej 5x10-9 M lub mniejszą. [0035] Stosowany tutaj termin zasadniczo nie wiąże się z białkiem lub komórkami, oznacza nie wiąże się lub nie wiąże się z wysokim powinowactwem z białkiem lub komórkami, tj. wiąże się z białkiem lub komórkami z K D wynoszącą 1x10-6 M lub większą, korzystniej 1x10-5 M lub większą, korzystniej 1x10-4 M lub większą, korzystniej 1x10-3 M lub większą, jeszcze korzystniej 1x10-2 M lub większą. [0036] Stosowany tutaj termin "K assoc " lub "K a " ma w zamierzeniu odnosić się do szybkości asocjacji danego oddziaływania przeciwciało-antygen, podczas gdy stosowany tutaj termin "K dis " lub "K d," ma w zamierzeniu odnosić się do szybkości dysocjacji danego oddziaływania przeciwciało-antygen. Stosowany tutaj termin "K D " ma za zadanie odnosić się do stałej równowagi dysocjacji, którą uzyskuje się ze stosunku K d do K a (tj. K d /K a ) i wyraża jako stężenie molowe (M). Wartości K D dla przeciwciał można określić stosując sposoby powszechnie uznane w stanie techniki. Korzystnym sposobem określania K D 10

12 przeciwciała jest stosowanie powierzchniowego rezonansu plazmonowego, korzystniej stosowanie systemu biosensorowego, takiego jak system Biacore. [0037] Stosowany tutaj termin wysokie powinowactwo (duże powinowactwo) dla przeciwciała IgG, odnosi się do przeciwciała mającego K D wynoszącą 10-8 M lub mniejszą, korzystniej 10-9 M lub mniejszą, a jeszcze korzystniej M lub mniejszą wobec docelowego antygenu. Jednakże, wysokie powinowactwo wiązania może różnić się dla innych izotypów przeciwciała. Na przykład, wysokie powinowactwo wiązania dla izotypu IgM odnosi się do przeciwciała mającego K D wynoszącą 10-7 M lub mniejszą, korzystniej 10-8 M lub mniejszą, jeszcze korzystniej 10-9 M lub mniejszą. [0038] Stosowany tutaj termin osobnik obejmuje dowolne zwierzę będące lub niebędące człowiekiem. Termin zwierzę niebędące człowiekiem obejmuje wszystkie kręgowce, np. ssaki i nie-ssaki, takie jak naczelne inne niż człowiek, owce, psy, koty, konie, krowy, kury, płazy, gady itd. [0039] Różne aspekty wynalazku opisane są bardziej szczegółowo w dalszych podrozdziałach. Przeciwciała anty-ptk7. [0040] Przeciwciała według wynalazku są scharakteryzowane przez szczególne cechy funkcjonalne lub właściwości przeciwciał. Na przykład, przeciwciała specyficznie wiążą się z PTK7. Korzystnie, przeciwciało według wynalazku wiąże się z PTK7 z wysokim powinowactwem, na przykład z K D wynoszącą 1x10-7 M lub mniejszą. Korzystnie, przeciwciało wiąże się z ludzką PTK7 z K D wynoszącą 5x10-8 M lub mniejszą, wiąże się z ludzką PTK7 z K D wynoszącą 1x10-8 M lub mniejszą, wiąże się z ludzką PTK7 z K D wynoszącą 5x10-9 M lub mniejszą, lub wiąże się z ludzką PTK7 z K D pomiędzy 1x10-8 M a 1x10-10 M lub mniejszą. Przeciwciało wiąże się z komórkami guza Wilmsa z EC 50 wynoszącym 4,0 nm lub mniejszym, lub wiąże się z komórkami guza Wilmsa z EC 50 wynoszącym 3,5 nm lub mniejszym. W stanie techniki znane są badania oceniające zdolność wiązania przeciwciał względem PTK7, w tym na przykład testy ELISA, Western blot i RIA. Kinetykę wiązania (np. powinowactwo wiązania) przeciwciał można również ocenić standardowymi, znanymi w stanie techniki badaniami, takimi jak test ELISA, analizy Scatchard i Biacore. W innym przykładzie, przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą wiązać się do komórek guza linii raka nerki, na przykład do linii komórkowej guza Wilmsa. Odpowiednie badania oceniające dowolną z opisanych powyżej cech opisano szczegółowo w Przykładach. Przeciwciała monoklonalne 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8 [0041] Przeciwciała według wynalazku obejmują ludzkie przeciwciała monoklonalne 4D5, 12C6 oraz 7C8. Inne ujawnione tutaj przeciwciała obejmują 3G8, 3G8a oraz 12C6. Wszystkie przeciwciała zostały wyizolowane i scharakteryzowane strukturalnie jak opisano w Przykładach 1 i 2. Specjaliści w dziedzinie zauważą, że przeciwciała 3G8 i 3G8a, tak jak i przeciwciała 12C6 i 12C6a mają te same sekwencje łańcuchów ciężkich, różniąc się w sekwencjach łańcuchów lekkich. Sekwencje aminokwasowe V H dla 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8 przedstawiono w SEKW NR ID: 1 (3G8 i 3G8a), 2 (4D5), 3 (12C6 i 12C6a) oraz 4 (7C8). Sekwencje aminokwasowe V L dla 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8 przedstawiono w SEKW NR ID: odpowiednio 5, 6, 7, 8, 9 i

13 [0042] Z uwagi na to, że każde z tych przeciwciał może wiązać się z PTK7, sekwencje V H i V L mogą być mieszane i dopasowywane w celu stworzenia innych cząsteczek wiążących anty-ptk7. Wiązanie PTK7 przez takie zmieszane i dopasowane przeciwciała można być sprawdzane przy zastosowaniu testów wiązania opisanych powyżej oraz w Przykładach (np. testy ELISA). Korzystnie, kiedy łańcuchy V H i V L są mieszane i dopasowywane, sekwencja V H z konkretnej pary V H /V L podmieniana jest sekwencją V H podobną strukturalnie. Podobnie, korzystnie sekwencja V L z konkretnej pary V H /V L podmieniana jest sekwencją V L podobną strukturalnie. [0043] Zgodnie z tym, w jednym aspekcie, ujawniono tutaj izolowane przeciwciało monoklonalne, lub jego część wiążącą antygen, obejmujące: (a) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z SEKW NR ID: 1, 2, 3 i 4; oraz (b) region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z SEKW NR ID: 5, 6, 7, 8, 9 i 10; przy czym przeciwciało swoiście wiąże PTK7, korzystnie ludzką PTK7. [0044] Przeciwciało, lub jego część wiążąca antygen, według wynalazku może obejmować: (a) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 2; oraz (b) region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 7; lub (a) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 4; oraz (b) region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 10; lub (a) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 3; oraz (b) region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 8. [0045] Inne ujawnione kombinacje łańcucha ciężkiego i lekkiego obejmują: (a) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 1; oraz (b) region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 5; lub (a) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 1; oraz (b) region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 6; lub (a) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 3; oraz (b) region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 9. [0046] W innym aspekcie, ujawniono tutaj przeciwciała, które obejmują CDR1, CDR2 i CDR3 łańcuchów ciężkich i lekkich z 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8 lub ich kombinacje. Sekwencje aminokwasowe CDR1 z V H z 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8 przedstawiono w SEKW NR ID: 11 (3G8 i 3G8a), 12 (4D5), 13 (12C6 i 12C6a) oraz 14 (7C8). Sekwencje aminokwasowe CDR2 z V H z 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8 przedstawiono w SEKW NR ID: 15 (3G8 i 3G8a), 16 (4D5), 17 (12C6 i 12C6a) oraz 18 (7C8). Sekwencje aminokwasowe CDR3 z V H z 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8 przedstawiono w SEKW NR ID: 19 (3G8 i 3G8a), 20 (4D5), 21 (12C6 i 12C6a) oraz 22 (7C8). Sekwencje aminokwasowe CDR1 z V k z 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8 przedstawiono w SEKW NR ID: odpowiednio 23, 24, 25, 26, 27 i 28. Sekwencje aminokwasowe CDR2 z V k z 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8 przedstawiono w SEKW NR ID: odpowiednio 29, 30, 31, 32, 33 i 34. Sekwencje aminokwasowe CDR3 z V k z 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8 przedstawiono w SEKW NR ID: odpowiednio 35, 36, 37, 38, 39 i 40. Regiony CDR są wytyczone z zastosowaniem systemu Kabata (Kabat, E. A., et al. (1991) 12

14 Sequences of Proteins of Immunological Interest, wydanie piąte, U.S. Department of Health and Human Services, NIH nr publikacji ). [0047] Z uwagi na to, że każde z tych przeciwciał może wiązać się z PTK7 oraz że swoistość wiązania antygenu zapewniana jest głównie przez regiony CDR1, CDR2 i CDR3, sekwencje CDR1, CDR2 i CDR3 z V H oraz sekwencje CDR1, CDR2 i CDR3 z V k mogą być mieszane i dopasowywane (tj. CDRy z różnych przeciwciał mogą być mieszane i dopasowywane, ale każde przeciwciało musi zawierać CDR1, CDR2 i CDR3 z V H oraz CDR1, CDR2 i CDR3 z V k ) w celu stworzenia innych cząsteczek wiążących anty- PTK7 według wynalazku. Wiązanie z PTK7 dla takich zmieszanych i dopasowanych przeciwciał można sprawdzić stosując testy wiązania opisane powyżej i w Przykładach (np. ELISA, analiza Biacore). Korzystnie, kiedy sekwencje CDR z V H są mieszane i dopasowywane, sekwencja CDR1, CDR2 i/lub CDR3 z konkretnej sekwencji V H podmieniana jest sekwencją (/ami) CDR podobną (/ymi) strukturalnie. Podobnie, kiedy sekwencje CDR z V k są mieszane i dopasowywane, sekwencja CDR1, CDR2 i/lub CDR3 z konkretnej sekwencji V k podmieniana jest korzystnie sekwencją (/ami) CDR podobną (/ymi) strukturalnie. Dla specjalisty w dziedzinie oczywiste będzie, że nowe sekwencje V H i V L mogą być tworzone poprzez zastępowanie jednej lub więcej sekwencji regionu CDR z V H i/lub V L sekwencjami podobnymi strukturalnie, z sekwencji CDR ujawnionych tutaj dla przeciwciał monoklonalnych 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8. [0048] Zgodnie z tym, w innym aspekcie, ujawniono tutaj izolowane przeciwciało monoklonalne, lub jego część wiążąca antygen, obejmujące: (a) CDR1 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z SEKW NR ID: 11, 12, 13 i 14; (b) CDR2 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z SEKW NR ID: 15, 16, 17 i 18; (c) CDR3 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z SEKW NR ID: 19, 20, 21 i 22; (d) CDR1 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z SEKW NR ID: 23, 24, 25, 26, 27 i 28; (e) CDR2 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z SEKW NR ID: 29, 30, 31, 32, 33 i 34; oraz (f) CDR3 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z SEKW NR ID: 35, 36, 37, 38, 39 i 40; przy czym przeciwciało swoiście wiąże PTK7, korzystnie ludzką PTK7. [0049] Przeciwciało, lub jego część wiążąca antygen, według wynalazku może obejmować: (a) CDR1 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 12; (b) CDR2 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 16; (c) CDR3 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 20; (d) CDR1 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 25; (e) CDR2 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 31; oraz (f) CDR3 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 37; 13

15 lub (a) CDR1 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 14; (b) CDR2 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 18; (c) CDR3 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 22; (d) CDR1 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 28; (e) CDR2 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 34; oraz (f) CDR3 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 40; lub (a) CDR1 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 13; (b) CDR2 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 17; (c) CDR3 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 21; (d) CDR1 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 26; (e) CDR2 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 32; oraz (f) CDR3 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 38. [0050] Ujawniono tutaj również przeciwciała obejmujące: (a) CDR1 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 11; (b) CDR2 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 15; (c) CDR3 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 19; (d) CDR1 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 23; (e) CDR2 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 29; oraz (f) CDR3 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 35; lub (a) CDR1 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 11; (b) CDR2 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 15; (c) CDR3 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 19; (d) CDR1 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 24; (e) CDR2 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 30; oraz (f) CDR3 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 36; lub (a) CDR1 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 13; (b) CDR2 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 17; (c) CDR3 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 21; (d) CDR1 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 27; (e) CDR2 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 33; oraz (f) CDR3 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 39. [0051] W stanie techniki znany jest fakt, że domena CDR3, niezależnie od domen(-y) CDR1 i/lub CDR2, sama może determinować swoistość wiązania przeciwciała dla odpowiedniego antygenu oraz, że można wytworzyć w przewidywalny sposób liczne przeciwciała o tej samej swoistości wiązania w oparciu o wspólną sekwencję CDR3. Patrz, na przykład, Klimka et al., British J. of Cancer 83(2): (2000) (opisujące wytwarzanie humanizowanego przeciwciała anty-cd30 z zastosowaniem jedynie zmiennej domeny CDR3 łańcucha ciężkiego z mysiego przeciwciała Ki-4 anty-cd30); Beiboer et al., J. Mol. Biol. 14

16 296: (2000) (opisujące rekombinowane przeciwciała przeciw glikoproteinie nabłonkowej-2 (EGP- 2, ang. epithelial glycoprotein-2), z zastosowaniem jedynie sekwencji CDR3 ciężkiego łańcucha wyjściowego mysiego przeciwciała MOC-31 anty-egp-2); Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: (1998) (opisujący panel humanizowanych przeciwciał anty-integryna α v β 3, z zastosowaniem zmiennych domen CDR3 łańcucha ciężkiego i lekkiego mysiego przeciwciała LM609 anty-integryna αvβ3, gdzie każde z przeciwciał zawiera odmienną sekwencję poza domeną CDR3 i zdolne jest do wiązania się z tym samym epitopem, co wyjściowe, mysie przeciwciało, z powinowactwami tak wysokimi jak lub wyższymi niż wyjściowe, mysie przeciwciało); Barbas et al., J. Am. Chem. Soc. 116: (1994) (ujawniający, że domena CDR3 zapewnia najistotniejszy wkład w wiązanie antygenu); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: (1995) (opisujący przeszczepienie sekwencji CDR3 łańcucha ciężkiego trzech Fab (SI-1, SI-40 i SI-32) przeciw ludzkiemu, łożyskowemu DNA, na łańcuch ciężki Fab toksoida przeciw-tężcowego, zastępujące w ten sposób istniejący CDR3 łańcucha ciężkiego i wykazujące, że sama domena CDR3 nadaje swoistość wiązania); oraz Ditzel et al., J. Immunol. 157: (1996) (opisujący badania przeszczepiania, w których przeniesienie jedynie CDR3 łańcucha ciężkiego wyjściowego wieloswoistego Fab LNA3 na łańcuch ciężki monoswoistego przeciwciała Fab p313 IgG, wiążącego się z tężcowym toksoidem, było wystarczające do zachowanie swoistości wiązania wyjściowego Fab). [0052] Zgodnie z tym, ujawnione zostały przeciwciała monoklonalne obejmujące jedną lub więcej domen CDR3 łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego z przeciwciała pochodzącego od człowieka lub zwierzęcia nie będącego człowiekiem, przy czym przeciwciało monoklonalne jest zdolne do swoistego wiązania z PTK7. Ujawniono tutaj także przeciwciała monoklonalne obejmujące jedną lub więcej domen CDR3 łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego z przeciwciała z gatunku innego niż człowiek, takiego jak przeciwciało mysie lub szczurze, przy czym przeciwciało monoklonalne jest zdolne do swoistego wiązania z PTK7. Takie przeciwciała obejmujące jedną lub więcej domen CDR3 łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego z przeciwciała z gatunku innego niż człowiek (a) są zdolne do współzawodniczenia o wiązanie z; (b) zachowują charakterystykę funkcjonalną; (c) wiążą się z tym samym epitopem; i/lub (d) mają podobne powinowactwa wiązania jak odpowiadające wyjściowe przeciwciało z gatunku innego niż człowiek. [0053] Ujawnione zostały także przeciwciała monoklonalne obejmujące jedną lub więcej domen CDR3 łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego z przeciwciała ludzkiego, takiego jak, na przykład, ludzkie przeciwciało otrzymane od zwierzęcia innego niż człowiek, przy czym ludzkie przeciwciało jest zdolne do swoistego wiązania z PTK7. Ujawniono tutaj również przeciwciała monoklonalne obejmujące jedną lub więcej domen CDR3 łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego z pierwszego ludzkiego przeciwciała, takiego jak, na przykład, ludzkie przeciwciało otrzymane od zwierzęcia innego niż człowiek, przy czym pierwsze przeciwciało jest zdolne do swoistego wiązania z PTK7 i gdzie domena CDR3 z pierwszego ludzkiego przeciwciała zastępuje domenę CDR3 w ludzkim przeciwciele któremu brak swoistości wiązania dla PTK7, w celu stworzenia drugiego ludzkiego przeciwciała, które jest zdolne do swoistego wiązania z PTK7. Takie przeciwciała obejmujące jedną lub więcej domen CDR3 łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego z pierwszego ludzkiego przeciwciała (a) są zdolne do współzawodniczenia o wiązanie z; (b) zachowują charakterystykę funkcjonalną; (c) wiążą się z tym samym epitopem; i/lub (d) mają podobne 15

17 powinowactwa wiązania jak odpowiadające wyjściowe pierwsze ludzkie przeciwciało. Pierwszym ludzkim przeciwciałem może być 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a oraz 7C8. Przeciwciała wiążące się z tym samym epitopem co przeciwciała anty-ptk7 według wynalazku [0054] Wynalazek dostarcza przeciwciał, które wiążą się z tym samym epitopem na ludzkiej PTK7 co dowolne z przeciwciał monoklonalnych PTK7 według wynalazku.(tj. przeciwciał, które mają zdolność do krzyżowego współzawodniczenia o wiązania z PTK7 z dowolnym z przeciwciał monoklonalnych według wynalazku). Przeciwciałem odniesienia dla badań krzyżowego współzawodniczenia może być przeciwciało monoklonalne 4D5 (mające sekwencje V H i V L jak przedstawiono w SEKW NR ID: odpowiednio 2 i 7), lub przeciwciało monoklonalne 12C6 (mające sekwencje V H i V L jak przedstawiono w SEKW NR ID: odpowiednio 3 i 8), lub przeciwciało monoklonalne 7C8 (mające sekwencje V H i V L jak przedstawiono w SEKW NR ID: odpowiednio 4 i 10). Takie przeciwciała współzawodniczące krzyżowo mogą być identyfikowane w oparciu o ich zdolność do krzyżowego współzawodniczenia z 4D5, 12C6 lub 7C8 w standardowych testach wiązania z PTK7. Na przykład, do wykazania krzyżowego współzawodniczenia z przeciwciałami według niniejszego wynalazku, zastosowana może być analiza BIAcore, testy ELISA lub cytometria przepływowa. Zdolność badanego przeciwciała do hamowania wiązania, na przykład, 4D5, 12C6 lub 7C8 z ludzką PTK7 wykazuje, że badane przeciwciało może współzawodniczyć z 4D5, 12C6 lub 7C8 o wiązanie z ludzką PTK7, a więc wiąże się z tym samym epitopem na ludzkiej PTK7 co 4D5, 12C6 lub 7C8. Przeciwciało, które wiąże się z tym samym epitopem na ludzkiej PTK7 co 4D5, 12C6 lub 7C8 jest ludzkim przeciwciałem monoklonalnym. Takie ludzkie przeciwciała monoklonalne mogą być przygotowane i izolowane jak opisano w Przykładach. Cząsteczki kwasów nukleinowych kodujące przeciwciała według wynalazku [0055] Kolejny aspekt wynalazku dotyczy cząsteczek kwasów nukleinowych, które kodują przeciwciała według wynalazku. Kwasy nukleinowe mogą być obecne w całych komórkach, w lizacie komórkowym, lub w postaci częściowo oczyszczonej albo zasadniczo oczyszczonej. Kwas nukleinowy jest wyizolowany lub uznany za zasadniczo oczyszczony gdy jest oczyszczony z innych składników komórkowych lub innych zanieczyszczeń, np. innych kwasów nukleinowych lub białek, standardowymi technikami, włączając metodę alkaliczną/sds, gradient CsCl, chromatografię kolumnową, elektroforezę w żelu agarozowym i inne dobrze znane w stanie techniki. Patrz, F. Ausubel, et al., wyd. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, Nowy York. Kwasem nukleinowym według wynalazku może być, na przykład, DNA lub RNA i może on obejmować sekwencje intronowe lub nie. W korzystnym wykonaniu, kwas nukleinowy jest cząsteczką cdna. [0056] Kwasy nukleinowe mogą być otrzymane z zastosowaniem standardowych technik biologii molekularnej. Dla przeciwciał wyrażanych w hybrydomach (np. hybrydomach wytworzonych z myszy transgenicznych niosących ludzkie geny immunoglobulin jak opisano poniżej), cdna kodujące łańcuchy lekkie i ciężkie przeciwciała wytwarzanego przez hybrydomę może być otrzymany poprzez standardową amplifikację PCR lub techniki klonowania cdna. Dla przeciwciał otrzymywanych z biblioteki genowej immunoglobulin (np. z zastosowaniem technik ekspozycji fagowej (ang. phage display), kwasy nukleinowe kodujące przeciwciało mogą być odzyskane z biblioteki. 16