(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy / EP B1 (13) (51) T3 Int.Cl. A61K 39/395 (06.01) A61K 39/40 (06.01) A61K 39/42 (06.01) C07K 16/00 (06.01) C07K 16/18 (06.01) C12N /13 (06.01) C12N /85 (06.01) C12N 5/ (06.01) A61P /28 (06.01) C07K 16/46 (06.01) (54) Tytuł wynalazku: Humanizowane przeciwciała rozpoznające peptyd beta amyloidowy () Pierwszeństwo: US (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 06/02 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 11/06 (73) Uprawniony z patentu: Janssen Alzheimer Immunotherapy, Little Island, IE Wyeth LLC, Madison, US (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 GURIQ BASI, Palo Alto, US JOSE W. SALDANHA, Enfield, GB (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Marta Kawczyńska POLSERVICE KANCELARIA RZECZNIKÓW PATENTOWYCH SP. Z O.O. ul. Bluszczańska Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 3 17/P26913PL00 EP B1 5 Opis Tło wynalazku [0001] Choroba Alzheimera (ang. Alzheimer s disease - AD) jest postępującą chorobą prowadzącą do otępienia starczego. Patrz ogólnie Selkoe, TINS 16:403 (1993), Hardy i wsp., WO 92/169, Selkoe, J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53:438 (1994), Duff i wsp., Nature 373: 476 (1995), Games i wsp., Nature 373:523 (1995). W szerokim ujęciu choroba dzieli się na dwie kategorie: postać późna, która występuje w wieku podeszłym (65 lat i więcej), oraz postać wczesna, która rozwija się znacznie przed osiągnięciem wieku podeszłego, tzn. w wieku od do 60 lat. W przypadku obu postaci choroby patologia jest identyczna, jednak zaburzenia są zwykle cięższe i o szerszej dystrybucji w przypadkach rozpoczynających się w młodszym wieku. Choroba charakteryzuje się co najmniej dwoma rodzajami zmian w mózgu: splotami neurofibrylarnymi i blaszkami starczymi. Sploty neurofbrylarne to wewnątrzkomórkowe złogi białka tau związanego z mikrotubulami, składające się z dwóch zwiniętych ze sobą, tworzących pary włókien. Blaszki starcze (tzn. blaszki amyloidowe) to obszary niezorganizowanego neuropilu o szerokości do 0 µm z zewnątrzkomórkowymi złogami amyloidu w części środkowej, które są widoczne w analizie mikroskopowej skrawków tkanki mózgowej. Nagromadzenie blaszki amyloidowej w mózgu jest także powiązane z zespołem Downa i innymi zaburzeniami poznawczymi. [0002] Głównym składnikiem blaszki jest peptyd określany jako Aβ lub peptyd β-amyloidowy. Peptyd Aβ to wewnętrzny fragment o długości 4 kda, zawierający aminokwasów większej glikoproteiny przezbłonowej określanej jako białko prekursora amyloidu (ang. APP). W wyniku trawienia proteolitycznego APP przez różne enzymy typu sekretazy Aβ występuje głównie w postaci skróconej o długości 40 aminokwasów oraz w postaci długiej

3 4 mającej długość aminokwasów. Część hydrofobowej domeny przezbłonowej APP znajduje się na końcu karboksylowym Aβ i może odpowiadać za zdolność Aβ do agregacji w blaszki, w szczególności w przypadku postaci długiej. Gromadzenie blaszek amyloidowej w mózgu prowadzi w końcu do śmierci neuronów. Objawy fizyczne związane z tym rodzajem pogarszania się stanu komórek nerwowych są charakterystyczne dla choroby Alzheimera. [0003] Z występowaniem choroby Alzheimera powiązano szereg mutacji białka APP. Patrz np. Goate i wsp., Nature 349:704) (1991) (walina 717 na izoleucynę), Chartier Harlan i wsp. Nature 3:844 (1991)) (walina 717 na glicynę), Murrell i wsp., Science 4:97 (1991) (walina 717 na fenyloalaninę), Mullan i wsp., Nature Genet. 1:345 (1992) (podwójna mutacja zmieniająca lizynę metioninę 596 na asparaginę 595 -leucynę 596 ). Uważa się, że takie mutacje powodują chorobę Alzheimera wskutek nasilonego lub zmienionego trawienia APP do Aβ, w szczególności trawienia APP, w wyniku czego powstają większe ilości długiej postaci Aβ (tzn. Aβ1-42 i Aβ1-43). Uważa się, że mutacje w innych genach, na przykład w genach preseniliny (PS1 i PS2), w sposób pośredni wpływają na trawienie APP, w wyniku czego powstają większe ilości długiej postaci Aβ (patrz Hardy, TINS : 4 (1997)). [0004] Do określania znaczenia blaszki amyloidowej w chorobie Alzheimera wykorzystywano z powodzeniem modele mysie (Games i wsp., powyżej, Johnson-Wood i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:50 (1997)). W szczególności, jeśli myszom transgenicznym PDAPP (u których występuje ekspresja zmutowanej formy ludzkiego APP i choroba Alzheimera rozwija się w młodym wieku) wstrzyknie się długą postać Aβ, występuje u nich zarówno zmniejszenie progresji choroby Alzheimera, jak i zwiększenie miana przeciwciał przeciwko peptydowi Aβ (Schenk i wsp., Nature 400, 173 (1999)). Obserwacje, o których mowa powyżej, wskazują, że Aβ, w szczególności jego postać długa, jest czynnikiem sprawczym choroby Alzheimera. [0005] McMichael, w EP 526,511, proponuje podawanie dawek homeopatycznych (mniejszych lub równych -2 mg na dobę) Aβ pacjentom z rozpoznaną wcześniej chorobą Alzheimera (AD). U

4 5 typowego człowieka mającego około 5 litrów osocza należałoby oczekiwać, że nawet górna granica tego dawkowania nie pozwoli uzyskać stężenia większego niż 2 pg/ml. Prawidłowe stężenie Aβ w osoczu człowieka zawiera się zazwyczaj w zakresie 50-0 pg/ml (Seubert i wsp., Nature 9:3 (1992)). Ponieważ dawkowanie proponowane w EP 526,511 w niewielki sposób wpływałoby na poziom endogennego krążącego Aβ oraz ponieważ w EP 526,511 nie zaleca się zastosowania adiuwantu jako czynnika immunostymulującego, uzyskanie jakiegokolwiek działania terapeutycznego wydaje się niemożliwe. [0006] W WO 02/46237 ujawniono udoskonalone czynniki i metody dotyczące chorób związanych ze złogami amyloidowymi amyloidu beta w mózgu pacjenta. Do korzystnych czynników należą niektóre odmiany humanizowane i chimerowe przeciwciał 3D6 przeciwko amyloidowi beta, które zawierają ludzki region Fc typu dzikiego IgG1. [0007] Istnieje jednak zapotrzebowanie na nowe terapie i czynniki do leczenia choroby Alzheimera, w szczególności na terapie i czynniki zdolne do wywołania działania terapeutycznego w dawkach fizjologicznych (tzn. nietoksycznych). Krótki opis wynalazku [0008] Niniejszy wynalazek dotyczy nowych czynników terapeutycznych przeciwciał, o których mowa w zastrzeżeniach, do profilaktyki i leczenia choroby amyloidogennej (np. choroby Alzheimera). Opisuje się identyfikację i określanie charakterystyki przeciwciała monoklonalnego, które w sposób swoisty wiąże się z peptydem Aβ i skutecznie zmniejsza obciążenie blaszkami i(lub) zmniejsza dystrofię neurytów związaną z zaburzeniami amyloidogennymi. Analiza strukturalna i funkcjonalna tego przeciwciała prowadzi do opracowania różnych przeciwciał humanizowanych do zastosowań profilaktycznych i(lub) terapeutycznych. W szczególności opisuje się humanizowanie regionów zmiennych tych przeciwciał oraz humanizowane łańcuchy immunoglobulin lub przeciwciał, niezmienione humanizowane immunoglobuliny lub przeciwciała oraz funkcjonalne fragmenty immunoglobulin lub przeciwciał, w szczególności fragmenty

5 6 wiążące antygeny tych przeciwciał. [0009] Ujawnia się zastosowanie przeciwciał w leczeniu chorób lub zaburzeń amyloidogennych (np. choroby Alzheimera), a także kompozycje farmaceutyczne i zestawy do stosowania w takich zastosowaniach. [00] Ujawnia się także sposoby identyfikowania reszt w opisywanych przeciwciałach monoklonalnych, które są istotne dla właściwej czynności immunologicznej oraz do identyfikowania reszt, które można zastępować przy opracowywaniu przeciwciał humanizowanych o zwiększonym powinowactwie wiązania i(lub) zmniejszonej immunogenności przy zastosowaniu jako czynniki terapeutyczne. [0011] Przeciwciała (np. przeciwciała humanizowane) według wynalazku mają zmienione funkcje efektorowe oraz zastosowania terapeutyczne. Skrócony opis rysunków [0012] Fig. 1 przedstawia dopasowanie sekwencji aminokwasowych łańcucha lekkiego mysiego 3D6, humanizowanego 3D6, nr ident. według Kabata 92 i przeciwciał A19 linii płciowej. Regiony CDR zaznaczono strzałkami. Pogrubiona kursywa pokazuje rzadkie reszty mysie. Pogrubienie wskazuje reszty pakujące (VH+VL). Jednolite zacieniowanie wskazuje reszty kanoniczne i oddziałujące z CDR. Gwiazdki wskazują reszty wybrane do mutacji odwrotnej w humanizowanym 3D6, wersja 1. Fig. 2 przedstawia dopasowanie sekwencji aminokwasowych łańcucha ciężkiego mysiego 3D6, humanizowanego 3D6, nr ident. według Kabata i przeciwciał VH3-23 linii płciowej. Adnotacje są takie same, jak na Fig. 1. Fig. 3 przedstawia w sposób graficzny właściwości wiązania Aβ przez 3D6, chimerowe 3D6 i D5. Fig. 3A jest wykresem przedstawiającym wiązanie Aβ z chimerowym 3D6 (PK1614) w porównaniu do mysiego 3D6. Fig. 3B jest wykresem przedstawiającym współzawodnictwo biotynylowanego 3D6 z nieznakowanym 3D6, PK1614 i D5 o wiązanie z Aβ. Fig. 4 przedstawia model homologii VH i VL 3D6, ukazujący ślad

6 7 rdzenia atomów węgla α. VH ukazano w postaci linii przerywanej, VL zaś ukazano jako linię ciągłą. Regiony CDR zaznaczono w postaci wstęg. Fig. 5 ukazują w sposób graficzny właściwości wiązania Aβ przez chimerowe 3D6 i humanizowane 3D6. Fig. 5A przedstawia wyniki testu ELISA, w którym mierzono wiązanie humanizowanego 3D6v1 i chimerowego 3D6 ze zagregowanym Aβ. Fig. 5B przedstawia wyniki testu ELISA, w którym mierzono wiązanie humanizowanego 3D6v1 i humanizowanego 3D6v2 ze zagregowanym Aβ. Fig. 6 jest wykresem przedstawiającym w sposób ilościowy wiązanie humanizowanego 3D6 i chimerowego 3D6 z blaszkami Aβ ze skrawków mózgu myszy PDAPP. Fig. 7 jest wykresem przedstawiającym wyniki testu wiązania kompetycyjnego, w który badano zdolność humanizowanego 3D6, wersja 1 i 2, chimerowego 3D6, mysiego 3D6 i D5 do współzawodnictwa z mysim 3D6 o wiązanie z Aβ. Fig. 8 jest wykresem przedstawiającym graficznie wyniki testu fagocytozy ex vivo, w którym badano zdolność humanizowanego 3D6v2, chimerowego 3D6 i ludzkiej IgG do oddziaływania na wychwytywanie Aβ przez komórki mikrogleju. Fig. 9 przedstawia dopasowanie sekwencji aminokwasowych D5 VL i 3D6 VL. Pogrubienie wskazuje reszty dokładnie odpowiadające D5. Fig. przedstawia dopasowanie sekwencji aminokwasowych D5 VH i 3D6 VH. Pogrubienie wskazuje reszty dokładnie odpowiadające D5. Szczegółowy opis wynalazku [0013] Niniejszy wynalazek dotyczy nowych czynników immunologicznych, o których mowa w zastrzeżeniach, do profilaktyki i leczenia choroby Alzheimera lub innych chorób amyloidogennych. Opisuje się określanie charakterystyki immunoglobulin monoklonalnych, 3D6, które skutecznie wiążą amyloidowe białko beta (Aβ) (np. przez wiązanie rozpuszczalnego i(lub) zagregowanego Aβ), pośredniczą w fagocytozie (np. zagregowanego Aβ), zmniejszają obciążenie blaszkami i(lub) zmniejszają dystrofię (np. u pacjenta). Opisuje się także

7 8 określenie i określanie charakterystyki struktury pierwszorzędowej i drugorzędowej ciężkich i lekkich łańcuchów zmiennych tych immunoglobulin, a także identyfikowanie reszt istotnych dla aktywności i immunogenności. [0014] Immunoglobuliny obejmują humanizowany zmienny łańcuch lekki i humanizowany zmienny łańcuch ciężki. Zmienne łańcuchy lekkie i zmienne łańcuchy ciężkie obejmują region determinujący komplementarność (CDR) immunoglobuliny monoklonalnej (np. immunoglobuliny donorowej) i zmienne regiony zrębowe, pochodzące zasadniczo od ludzkiej immunoglobuliny akceptorowej. Określenie pochodzące zasadniczo od ludzkiej immunoglobuliny akceptorowej oznacza, że większość lub główne reszty zrębowe pochodzą od ludzkiej sekwencji akceptorowej, zezwala się jednak na zastąpienie reszt w niektórych pozycjach resztami wybranymi, aby zwiększyć aktywność humanizowanej immunoglobuliny (np. zmiana aktywności, tak by dokładniej naśladowała aktywność immunoglobuliny donorowej) lub wybranymi, aby zmniejszyć immunogenność humanizowanej immunoglobuliny. [00] Wynalazek dotyczy łańcucha lekkiego lub ciężkiego humanizowanej immunoglobuliny, który zawiera regiony determinujące komplementarność (CDR) regionu zmiennego 3D6 (np. zawiera trzy CDR sekwencji regionu zmiennego łańcucha lekkiego przedstawionej w sekwencji o nr. ident. 2 i zawiera trzy CDR sekwencji regionu zmiennego łańcucha ciężkiego przedstawionej w sekwencji o nr. ident. 4) oraz zawiera zmienny region zrębowy, pochodzący zasadniczo z sekwencji łańcucha lekkiego lub ciężkiego ludzkiej immunoglobuliny akceptorowej, pod warunkiem, że co najmniej jedna reszta zrębowa zostaje zastąpiona odpowiednią resztą aminokwasową z sekwencji regionu zmiennego łańcucha lekkiego lub ciężkiego mysiego 3D6, przy czym resztę zrębową wybiera się z grupy składającej się z (a) reszty, która w sposób niekowalencyjny bezpośrednio wiąże antygen; (b) reszty sąsiadującej z CDR; (c) reszty oddziałującej z CDR (np. zidentyfikowanej metodą modelowania łańcucha lekkiego lub ciężkiego w rozwiązanej strukturze homologicznego znanego łańcucha immunoglobulinowego) i (d) reszty uczestniczącej w

8 9 powierzchni styku VL-VH. [0016] Wynalazek dotyczy łańcucha lekkiego lub ciężkiego humanizowanej immunoglobuliny, który obejmuje CDR regionów zmiennych 3D6 i zmienne regiony zrębowe sekwencji łańcucha lekkiego lub ciężkiego ludzkiej immunoglobuliny akceptorowej, pod warunkiem, że co najmniej jedna reszta zrębowa zostaje zastąpiona odpowiednią resztą aminokwasową sekwencji regionu zmiennego łańcucha lekkiego lub ciężkiego mysiego 3D6, przy czym reszta zrębowa to reszta zdolna do wpływania na konformację lub funkcję regionu zmiennego łańcucha lekkiego, na podstawie analizy trójwymiarowego modelu regionu zmiennego, na przykład reszta zdolna do oddziaływania z antygenem, reszta położona niedaleko miejsca wiązania antygenu, reszta zdolna do oddziaływania z CDR, reszta sąsiadująca z CDR, reszta znajdująca się w odległości do 6 Å od reszty CDR, reszta kanoniczna, reszta w strefie Verniera, międzyłańcuchowa reszta pakująca, reszta nietypowa lub reszta w miejscu glikozylacji na powierzchni modelu strukturalnego. [0017] Wynalazek dotyczy łańcucha lekkiego humanizowanej immunoglobuliny, który zawiera CDR regionu zmiennego 3D6 (np. z sekwencji regionu zmiennego łańcucha lekkiego 3D6 przedstawionej w sekwencji o nr. ident. 2) oraz zawiera zmienny region zrębowy ludzkiej immunoglobuliny akceptorowej, pod warunkiem, że co najmniej jedna reszta zrębowa wybrana z grupy składającej się z L1, L2, L36 i L46 (konwencja numeracji według Kabata) zostaje zastąpiona odpowiednią resztą aminokwasową z mysiej sekwencji regionu zmiennego łańcucha lekkiego 3D6. W innej postaci wykonania wynalazek dotyczy łańcucha ciężkiego humanizowanej immunoglobuliny, który zawiera CDR regionu zmiennego 3D6 (np. z sekwencji regionu zmiennego łańcucha ciężkiego 3D6 przedstawionej w sekwencji o nr. ident. 4) oraz zawiera zmienny region zrębowy ludzkiej immunoglobuliny akceptorowej, pod warunkiem, że co najmniej jedna reszta zrębowa wybrana z grupy składającej się z H49, H93 i H94 (konwencja numeracji według Kabata) zostaje zastąpiona odpowiednią resztą aminokwasową z mysiej sekwencji regionu zmiennego łańcucha ciężkiego 3D6.

9 [0018] Do korzystnych łańcuchów lekkich należą regiony zrębowe kappa II podtypu kappa II (konwencja Kabata), na przykład regiony zrębowe immunoglobuliny akceptorowej: nr ident. według Kabata 0192, nr ident. według Kabata , nr ident. według Kabata , nr ident. według Kabata , nr ident. według Kabata , nr ident. według Kabata U240 i nr ident. według Kabata U Do korzystnych łańcuchów ciężkich należą regiony zrębowe podtypu kappa III (konwencja Kabata), na przykład regiony zrębowe immunoglobuliny akceptorowej: nr ident. według Kabata , nr ident. według Kabata , nr ident. według Kabata , nr ident. według Kabata i nr ident. według Kabata M [0019] Oprócz substytucji, o których mowa powyżej, wynalazek dotyczy zastąpienia co najmniej jednej rzadkiej ludzkiej reszty zrębowej. Rzadka reszta może na przykład zostać zastąpiona resztą aminokwasową, która często występuje w sekwencjach ludzkiego łańcucha zmiennego w tym położeniu. Ewentualnie rzadka reszta może zostać zastąpiona odpowiednią resztą aminokwasową z homologicznej sekwencji łańcucha zmiennego linii płciowej (np. rzadka reszta zrębowa łańcucha lekkiego może zostać zastąpiona odpowiednią resztą linii płciowej z sekwencji immunoglobuliny linii płciowej A1, A17, A18, A2 lub A19 bądź rzadka reszta zrębowa łańcucha ciężkiego może zostać zastąpiona odpowiednią resztą linii płciowej z sekwencji immunoglobuliny linii płciowej VH3-48, VH3-23, VH3-7, VH3-21 lub VH3-11. [00] Wynalazek dotyczy humanizowanej immunoglobuliny, która zawiera łańcuch lekki i łańcuch ciężki, zgodnie z opisem powyżej, lub fragmentu wiążącego antygen wspomnianej immunoglobuliny. W przykładowej postaci wykonania humanizowana immunoglobulina wiąże (np. wiąże w sposób swoisty) amyloidowy peptyd beta (Aβ) z powinowactwem wiązania co najmniej 7 M -1, 8 M -1 lub 9 M -1. W innej postaci wykonania immunoglobulina lub fragment wiążący antygen obejmuje łańcuch ciężki o izotypie γ1. W innej postaci wykonania immunoglobulina lub fragment wiążący antygen wiąże (np. wiąże w sposób swoisty) zarówno rozpuszczalny amyloidowy peptyd beta (Aβ), jak i zagregowany Aβ. W innej

10 11 postaci wykonania immunoglobulina lub fragment wiążący antygen pośredniczy w fagocytozie (np. indukuje fagocytozę) amyloidowego peptydu beta (Aβ). W jeszcze innej postaci wykonania immunoglobulina lub fragment wiążący antygen przenika przez barierę krew-mózg u osobnika. W jeszcze innej postaci wykonania immunoglobulina lub fragment wiążący antygen zmniejsza obciążenie amyloidowym peptydem beta (Aβ) i dystrofię neurytów u osobnika. [0021] W innej postaci wykonania wynalazek dotyczy chimerowych immunoglobulin, które zawierają regiony zmienne 3D6 (np. sekwencje regionu zmiennego przedstawione w sekwencji o nr. ident. 2 lub w sekwencji o nr. ident. 4). W rozumieniu niniejszego dokumentu sekwencja przeciwciała lub immunoglobuliny zawierająca sekwencję VL i(lub) VH, przedstawioną na przykład w sekwencji o nr. ident. 2 lub w sekwencji o nr. ident. 4, może zawierać pełną sekwencję VL lub VH lub może zawierać dojrzałą sekwencję VL lub VH (tzn. dojrzały peptyd bez peptydu sygnałowego lub liderowego). W jeszcze innej postaci wykonania wynalazek dotyczy immunoglobuliny lub jej fragmentu wiążącego antygen, który zawiera region zmienny łańcucha ciężkiego, przedstawiony w sekwencji o nr. ident. 8, i region zmienny łańcucha lekkiego przedstawiony w sekwencji o nr. ident. 5. W jeszcze innej postaci wykonania wynalazek dotyczy immunoglobuliny lub jej fragmentu wiążącego antygen, który zawiera region zmienny łańcucha ciężkiego, przedstawiony w sekwencji o nr. ident. 12, i region zmienny łańcucha lekkiego przedstawiony w sekwencji o nr. ident. 11. [0022] Immunoglobuliny przestawiane w niniejszym wynalazku nadają się szczególnie do zastosowania w sposobach terapeutycznych mających na celu profilaktykę chorób amyloidogennych lub leczenie chorób amyloidogennych. W jednej z postaci wykonania niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania w profilaktyce choroby amyloidogennej lub leczeniu choroby amyloidogennej (np. choroby Alzheimera), które obejmuje podawanie pacjentowi skutecznej dawki immunoglobuliny humanizowanej, opisanej w niniejszym wynalazku. W innej postaci

11 12 wykonania wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznych zawierających humanizowaną immunoglobulinę, o której mowa w wynalazku, i nośnik farmaceutyczny. Wynalazek dotyczy ponadto wyizolowanych cząsteczek kwasu nukleinowego, wektorów i komórek gospodarza do wytwarzania immunoglobulin lub fragmentów immunoglobulin lub łańcuchów, o których mowa w wynalazku, a także sposobów wytwarzania wspomnianych immunoglobulin, fragmentów immunoglobulin lub łańcuchów immunoglobulinowych. [0023] W immunoglobulinie według wynalazku zmieniony jest region Fc, przy czym co najmniej jedna reszta aminokwasowa regionu Fc została zastąpiona inną resztą lub łańcuchem bocznym. W jednej z postaci wykonania zmodyfikowana immunoglobulina należy do klasy IgG i zawiera co najmniej jedną substytucję reszty aminokwasowej regionu Fc, taką, że immunoglobulina ma zmienioną funkcję efektorową, na przykład w porównaniu z immunoglobuliną niezmienioną. W konkretnych postaciach wykonania immunoglobulina według wynalazku ma zmienioną funkcję efektorową w taki sposób, że jest mniej immunogenna (np. nie powoduje niepożądanej aktywności komórki efektorowej, lizy ani wiązania dopełniacza), ma lepsze właściwości usuwania amyloidu i(lub) wykazuje pożądany okres półtrwania. [0024] Zanim wynalazek zostanie opisany, pomocne w jego zrozumieniu może być przedstawienie definicji niektórych terminów stosowanych poniżej w dokumencie. [00] Określenia immunoglobulina" lub przeciwciało (stosowane w dokumencie zamiennie) oznaczają białko wiążące antygen, mające podstawową strukturę czterech łańcuchów polipeptydowych: dwa łańcuchy ciężkie i dwa lekkie, przy czym wspomniane łańcuchy są stabilizowane na przykład przez międzyłańcuchowe wiązania dwusiarczkowe, które mają zdolność swoistego wiązania antygenu. Zarówno łańcuchy ciężkie, jak i lekkie są zwinięte w domeny. Określenie domena oznacza region globularny polipeptydu łańcucha ciężkiego lub lekkiego, zawierający pętle peptydowe (np. zawierający 3-4 pętle peptydowe), stabilizowany na przykład arkuszem β i(lub) międzyłańcuchowym wiązaniem dwusiarczkowym. Domeny określa się

12 13 ponadto w niniejszym dokumencie jako stałe lub zmienne zależnie od względnego braku zmienności sekwencji w domenach różnych przedstawicieli klasy w przypadku domeny stałej lub znacznej zmienności sekwencji w domenach różnych przedstawicieli klasy w przypadku domeny zmiennej. Domeny stałe łańcucha lekkiego określa się zamiennie jako regiony stałe łańcucha lekkiego, domeny stałe łańcucha lekkiego, regiony CL lub domeny CL. Domeny stałe łańcucha ciężkiego określa się zamiennie jako regiony stałe łańcucha ciężkiego, domeny stałe łańcucha ciężkiego, regiony CH lub domeny CH. Domeny zmienne łańcucha lekkiego określa się zamiennie jako regiony zmienne łańcucha lekkiego, domeny zmienne łańcucha lekkiego, regiony VL lub domeny VL. Domeny zmienne łańcucha ciężkiego określa się zamiennie jako regiony stałe łańcucha ciężkiego, domeny stałe łańcucha ciężkiego, regiony CH lub domeny CH. [0026] Określenie region oznacza część lub element łańcucha przeciwciała, który obejmuje domeny stałe lub zmienne zdefiniowane w niniejszym dokumencie, a także bardziej odrębne części lub elementy wspomnianych domen. Do domen lub regionów zmiennych łańcucha lekkiego należą na przykład regiony determinujące komplementarność, czyli CDR, występujące między regionami zrębowymi, czyli FR, zdefiniowanymi w niniejszym dokumencie. [0027] Immunoglobuliny lub przeciwciała mogą występować w postaci monomerycznej lub polimerycznej. Określenie fragment wiążący antygen oznacza fragment polipeptydowy immunoglobuliny lub przeciwciała, który wiąże antygen lub konkuruje(współzawodniczy) z niezmienionym przeciwciałem (tzn. niezmienionym przeciwciałem, od którego pochodzi) o wiązanie antygenu (tzn. wiązanie swoiste). Określenie konformacja dotyczy struktury trzeciorzędowej białka lub polipeptydu (np. przeciwciała, łańcucha przeciwciała lub jego domeny lub regionu). Określenie konformacja łańcucha lekkiego (lub ciężkiego) dotyczy na przykład struktury trzeciorzędowej regionu zmiennego łańcucha lekkiego (lub ciężkiego), określenie

13 14 konformacja przeciwciała lub konformacja fragmentu przeciwciała dotyczy zaś struktury trzeciorzędowej przeciwciała lub jego fragmentu. [0028] Wiązanie swoiste" przeciwciała oznacza, że przeciwciało wykazuje znaczne powinowactwo do antygenu lub korzystnego epitopu i korzystnie nie wykazuje znacznej reaktywności krzyżowej. Znaczne lub korzystne wiązanie obejmuje wiązanie z powinowactwem co najmniej 6, 7, 8, 9 M -1 lub M -1. Korzystne jest powinowactwo powyżej 7 M -1, korzystnie powyżej 8 M- 1. Wartości pośrednie między wymienionymi w dokumencie także mają być objęte zakresem niniejszego wynalazku, korzystne powinowactwo wiązania można zaś wskazać jako zakres powinowactwa, na przykład od 6 do M -1, korzystnie od 7 do M -1, korzystniej od 8 do M -1. Przeciwciało, które nie wykazuje znacznej reaktywności krzyżowej, to przeciwciało, które nie wiąże się w znaczny sposób z niepożądaną jednostką (np. niepożądaną jednostką białkową). Przeciwciało, które w sposób swoisty wiąże się z Aβ, będzie na przykład w sposób znaczny wiązać Aβ, ale nie będzie reagować w znaczny sposób z białkami lub peptydami innymi niż Aβ (np. z zawartymi w blaszce białkami lub peptydami innymi niż Aβ). Przeciwciało swoiste wobec korzystnego epitopu nie będzie na przykład w znaczny sposób reagować krzyżowo z odległymi epitopami na tym samym białku lub peptydzie. Wiązanie swoiste można określić dowolnym sposobem określenia takiego wiązania znanym w stanie techniki. Korzystnie, wiązanie swoiste określa się na drodze analizy Scatcharda i(lub) testów wiązania kompetycyjnego. [0029] Fragmenty wiążące wytwarza się technikami rekombinacji DNA lub poprzez trawienie enzymatyczne lub chemiczne niezmienionych immunoglobulin. Do fragmentów wiążących należą Fab, Fab, F(ab ) 2, Fabc, Fv, łańcuchy pojedyncze i przeciwciała z łańcuchem pojedynczym. Poza immunoglobulinami lub przeciwciałami dwuswoistymi lub dwufunkcjonalnymi" rozumie się, że immunoglobulina lub przeciwciało ma identyczne każde miejsce wiązania. Przeciwciało dwuswoiste lub dwufunkcjonalne to sztuczne przeciwciało hybrydowe,

14 zawierające dwie różne pary łańcuchów ciężkich/lekkich oraz dwa różne miejsca wiązania. Przeciwciała dwuswoiste można wytwarzać różnymi metodami, w tym na drodze fuzji hybrydom lub łączenia fragmentów Fab. Patrz np. Songsivilai i Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:3-321 (1990), Kostelny i wsp., J. Immunol. 148, (1992). [00] Określenie immunoglobulina humanizowana lub przeciwciało humanizowane oznacza immunoglobulinę lub przeciwciało, zawierające co najmniej jeden łańcuch immunoglobuliny lub przeciwciała humanizowanego (tzn. co najmniej jeden humanizowany łańcuch lekki lub ciężki). Określenie humanizowany łańcuch immunoglobuliny lub humanizowany łańcuch przeciwciała (tzn. humanizowany łańcuch lekki immunoglobuliny lub humanizowany łańcuch ciężki immunoglobuliny ) oznacza łańcuch immunoglobuliny lub przeciwciała (tzn. odpowiednio łańcuch lekki lub ciężki), zawierający region zmienny, obejmujący zmienny region zrębowy zasadniczo z immunoglobuliny lub przeciwciała ludzkiego i regiony determinujące komplementarność (CDR) (np. co najmniej jeden CDR, korzystnie dwa CDR, korzystniej trzy CDR), zasadniczo z immunoglobuliny lub przeciwciała innego niż ludzkie, który ponadto obejmuje regiony stałe (co najmniej jeden region stały lub jego część w przypadku łańcucha lekkiego i korzystnie co najmniej trzy regiony stałe w przypadku łańcucha ciężkiego). Określenie humanizowany region zmienny (np. humanizowany region zmienny łańcucha lekkiego lub humanizowany region zmienny łańcucha ciężkiego oznacza region zmienny, który obejmuje region zrębowy zasadniczo z ludzkiej immunoglobuliny lub przeciwciała i regiony determinujące komplementarność zasadniczo z immunoglobuliny lub przeciwciała innego niż ludzkie. [0031] Określenie zasadniczo z ludzkiej immunoglobuliny lub przeciwciała lub zasadniczo ludzki oznacza, że po dopasowaniu sekwencji aminokwasowej ludzkiej immunoglobuliny lub przeciwciała w celach porównawczych region wykazuje co najmniej 80-90%, korzystnie 90-95%, korzystniej 95-99% identyczności

15 16 (tzn. lokalnej identyczności sekwencji) z ludzką sekwencją regionu zrębowego lub stałego, przy czym zezwala się na przykład na substytucje konserwatywne, substytucje sekwencji konsensusowej, substytucje linii płciowej, mutacje odwrotne i inne. Wprowadzanie substytucji konserwatywnych, substytucji sekwencji konsensusowej, substytucji linii płciowej, mutacji odwrotnych i innych określa się często jako optymalizację humanizowanego przeciwciała lub łańcucha. Określenie zasadniczo z immunoglobuliny lub przeciwciała innego niż ludzkie lub zasadniczo inny niż ludzki oznacza, że sekwencja immunoglobuliny lub przeciwciała wykazuje co najmniej 80-95%, korzystnie 90-95%, korzystniej 96%, 97%, 98% lub 99% identyczności z sekwencją organizmu innego niż człowiek, np. ssaka innego niż człowiek. [0032] W związku z tym wszystkie regiony lub reszty humanizowanej immunoglobuliny lub przeciwciała, lub łańcucha humanizowanej immunoglobuliny lub przeciwciała, oprócz być może CDR, są zasadniczo identyczne z odpowiadającymi im regionami lub resztami jednego lub większej liczby natywnych sekwencji immunoglobuliny ludzkiej. Określenie odpowiadający region lub odpowiadająca reszta oznacza region lub resztę drugiej sekwencji aminokwasowej lub nukleotydowej, która zajmuje to samo (tzn. równoważne) położenie, co region lub reszta w pierwszej sekwencji aminokwasowej lub nukleotydowej, kiedy sekwencje pierwszą i drugą dopasowuje się w sposób optymalny w celach porównawczych. [0033] Określenia immunoglobulina humanizowana lub przeciwciało humanizowane nie mają obejmować immunoglobulin lub przeciwciał chimerowych, zdefiniowanych poniżej. Jakkolwiek humanizowane immunoglobuliny lub przeciwciała mają budowę chimerową (tzn. zawierają regiony z więcej niż jednego białka), wykazują one cechy dodatkowe (tzn. obecność regionów zmiennych, zawierających donorowe reszty CDR, i akceptorowych reszt zrębowych), niewystępujące w immunoglobulinach lub przeciwciałach chimerowych, zgodnie z definicją w niniejszym dokumencie.

16 17 [0034] Określenie znaczna identyczność oznacza, że dwie sekwencje polipeptydowe, przy optymalnym dopasowaniu, na przykład za pomocą programów GAP lub BESTFIT przy użyciu domyślnych parametrów przerw, wykazują co najmniej 50-60% identyczności sekwencji, korzystnie 60-70% identyczności sekwencji, korzystniej 70-80% identyczności sekwencji, korzystniej co najmniej 80-90% identyczności sekwencji, jeszcze korzystniej co najmniej 90-95% identyczności sekwencji i jeszcze korzystniej co najmniej 95% identyczności sekwencji lub więcej (np. 99% identyczności sekwencji lub więcej). Określenie duża identyczność oznacza, że dwie sekwencje polipeptydowe, przy optymalnym dopasowaniu, na przykład za pomocą programów GAP lub BESTFIT przy użyciu domyślnych parametrów przerw, wykazują co najmniej 80-90% identyczności sekwencji, korzystnie 90-95% identyczności sekwencji i korzystniej co najmniej 95% identyczności sekwencji lub więcej (np. 99% identyczności sekwencji lub więcej). Do celów porównania sekwencji zazwyczaj jedna sekwencja stanowi sekwencję odniesienia, do której porównywane są sekwencje badane. Podczas stosowania algorytmu porównywania sekwencji sekwencje badane i odniesienia wprowadza się do komputera, określa się w razie potrzeby współrzędne podsekwencji i określa się parametry programu algorytmu sekwencji. Następnie algorytm porównywania sekwencji oblicza procentową identyczność sekwencji dla sekwencji testowej lub testowych względem sekwencji odniesienia na podstawie wyznaczonych parametrów programu. Określenia identyczność sekwencji i identyczność sekwencji są w dokumencie stosowane zamiennie. [00] Optymalne dopasowanie sekwencji w celu porównania można wykonać na przykład z wykorzystaniem algorytmu homologii lokalnej Smitha i Watermana, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), algorytmu dopasowania homologii Needlemana i Wunscha, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), metody poszukiwania podobieństwa Pearsona i Lipmana, Proc. Nat l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), z użyciem skomputeryzowanych zastosowań tych algorytmów (GAP, BESTFIT, FASTA i TFASTA w pakiecie oprogramowania Wisconsin Genetics

17 18 Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, USA) lub z wykorzystaniem kontroli wzrokowej (patrz ogólnie Ausubel i wsp., Current Protocols in Molecular Biology). Jednym z przykładów algorytmu odpowiedniego do określania procentowej identyczności sekwencji i podobieństwa sekwencji jest algorytm BLAST, opisywany w Altschul i wsp., J. Mol. Biol. 2:403 (1990). Oprogramowanie do analizy BLAST jest dostępne publicznie w National Center for Biotechnology Information (dostępne publicznie przez serwer internetowy National Institutes of Health, NCBI). Zazwyczaj do przeprowadzenia porównania sekwencji można zastosować domyślne parametry programu, chociaż można także zastosować parametry dostosowane. W przypadku sekwencji aminokwasowych program BLAST wykorzystuje jako wartości domyślne długość słowa (W) wynoszącą 3, oczekiwanie (E) wynoszące i macierz wyników BLOSUM62 (patrz Henikoff i Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9 (1989)). [0036] Korzystnie, położenia reszt, które nie są identyczne, różnią się substytucjami aminokwasów konserwatywnych. Do celów klasyfikacji substytucji aminokwasów jako konserwatywnych lub niekonserwatywnych aminokwasy grupuje się w następujący sposób: grupa I (hydrofobowe łańcuchy boczne): leu, met, ala, val, leu, ile; grupa II (obojętne hydrofilowe łańcuchy boczne): cys, ser, thr; grupa III (kwasowe łańcuchy boczne): asp, glu; grupa IV (zasadowe łańcuchy boczne): asn, gln, his, lys, arg; grupa V (reszty wpływające na orientację łańcucha): gly, pro i grupa VI (aromatyczne łańcuchy boczne): trp, tyr, phe. Substytucje konserwatywne to substytucje między aminokwasami z tej samej klasy. Substytucje niekonserwatywne polegają na wymianie przedstawiciela jednej z tych klas na przedstawiciela innej. [0037] Korzystnie, immunoglobuliny lub przeciwciała humanizowane wiążą antygen z powinowactwem trzy-, cztero- lub pięciokrotnie większym od odpowiedniego przeciwciała innego niż ludzkie. Jeżeli powinowactwo wiązania przeciwciała inne niż ludzkie wynosi na przykład 9 M -1, powinowactwo wiązania przeciwciał humanizowanych będzie wynosić co najmniej 3 x 9 M -1, 4 x 9 M -1

18 19 lub 9 M -1. Przy opisywaniu właściwości wiązania łańcucha immunoglobuliny lub przeciwciała, łańcuch można opisywać na podstawie jego zdolności do kierowania wiązaniem antygenu (np. Aβ). Stwierdza się, że łańcuch kieruje wiązaniem antygenu, jeśli nadaje niezmienionej immunoglobulinie lub przeciwciału (lub ich fragmentowi wiążącemu antygen) właściwość swoistego wiązania lub powinowactwa wiązania. Stwierdza się, że mutacja (np. mutacja odwrotna) w znaczny sposób wpływa na zdolność łańcucha ciężkiego lub lekkiego do kierowania wiązaniem antygenu, jeśli wpływa na powinowactwo wiązania niezmienionej immunoglobuliny lub przeciwciała (lub ich fragmentu wiążącego antygen) zawierających wspomniany łańcuch (np. zmniejsza je) o co najmniej rząd wielkości w porównaniu z powinowactwem przeciwciała (lub jego fragmentu wiążącego antygen) zawierającego równoważny łańcuch bez wspomnianej mutacji. Mutacja nie wpływa w znaczny sposób (np. zmniejsza) zdolność łańcucha do kierowania wiązaniem antygenu, jeśli wpływa (np. zmniejsza) powinowactwo wiązania niezmienionej immunoglobuliny lub przeciwciała (lub ich fragmentu wiążącego antygen) zawierających wspomniany łańcuch jedynie dwu-, trzy- lub czterokrotnie w porównaniu z powinowactwem przeciwciała (lub jego fragmentu wiążącego antygen) zawierającego równoważny łańcuch bez wspomnianej mutacji. [0038] Określenie immunoglobulina chimerowa lub przeciwciało dotyczy immunoglobuliny lub przeciwciała, których regiony zmienne pochodzą od pierwszego gatunku, a których regiony stałe pochodzą od drugiego gatunku. Immunoglobuliny lub przeciwciała chimerowe można konstruować na przykład metodami inżynierii genetycznej z segmentów genów immunoglobulin należących do różnych gatunków. [0039] Antygen jest jednostką (np. jednostką białkową lub peptydem), z którą przeciwciało wiąże się w sposób swoisty. [0040] Określenie epitop lub determinanta antygenowa oznacza miejsce na antygenie, z którym immunoglobulina lub przeciwciało (lub ich fragment wiążący antygen) wiąże się w sposób swoisty. Epitopy mogą być utworzone zarówno z aminokwasów kolejnych, jak

19 i aminokwasów innych niż kolejne, które sąsiadują ze sobą wskutek zwinięcia białka w strukturze trzeciorzędowej. Epitopy utworzone z aminokwasów kolejnych są zazwyczaj zachowywane po ekspozycji na rozpuszczalniki denaturujące, natomiast epitopy utworzone przez strukturę trzeciorzędową zazwyczaj ulegają eliminacji po ekspozycji na rozpuszczalniki denaturujące. Epitop zazwyczaj zawiera co najmniej 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,, 11, 12, 13, 14 lub aminokwasów w unikalnej konformacji przestrzennej. Sposoby określania konformacji przestrzennej epitopów obejmują na przykład krystalografię rentgenowską i 2-wymiarowy jądrowy rezonans magnetyczny. Patrz np. protokoły mapowania epitopów w Methods in Molecular Biology, tom 66, G. E. Morris, red. (1996). [0041] Przeciwciała rozpoznające ten sam epitop można zidentyfikować na podstawie prostego testu immunologicznego, wykazującego zdolność jednego przeciwciała do blokowania wiązania innego przeciwciała z antygenem docelowym, tzn. na drodze testu wiązania kompetycyjnego. Wiązanie kompetycyjne wyznacza się w teście, w którym badana immunoglobulina powoduje hamowanie swoistego wiązania przeciwciała odniesienia ze wspólnym antygenem, na przykład Aβ. Znanych jest wiele rodzajów testów wiązania kompetycyjnego, na przykład: bezpośredni lub pośredni test radioimmunologiczny w fazie stałej (RIA), bezpośredni lub pośredni test immunoenzymatyczny w fazie stałej (EIA), wielowarstwowy test kompetycji (patrz Stahli i wsp., Methods in Enzymology 9:242 (1983)), bezpośredni EIA biotynaawidyna w fazie stałej (patrz Kirkland i wsp., J. Immunol. 137:3614 (1986)), bezpośredni test znakowania w fazie stałej, bezpośredni test wielowarstwowy znakowania w fazie stałej (patrz Harlow i Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)), bezpośredni test znakowania RIA w fazie stałej z użyciem znacznika I-1 (patrz Morel i wsp., Mol. Immunol. (1):7 (1988)), bezpośredni EIA biotyna-awidyna w fazie stałej (Cheung i wsp., Virology 176:546 (1990)) i bezpośredni test znakowania RIA (Moldenhauer i wsp., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990)). Zazwyczaj taki test obejmuje zastosowanie oczyszczonego antygenu związanego z powierzchnią

20 21 stałą lub komórkami zawierającymi nieznakowaną immunoglobulinę badaną lub znakowaną immunoglobulinę odniesienia. Hamowanie kompetycyjne mierzy się, określając ilość znacznika związanego z powierzchnią stałą lub komórkami w obecności immunoglobuliny badanej. Immunoglobulina badana jest zwykle obecna w nadmiarze. Zazwyczaj, jeśli immunoglobulina konkurująca jest obecna w nadmiarze, powoduje hamowanie swoistego wiązania przeciwciała odniesienia ze wspólnym antygenem o co najmniej 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70% 70-75% lub więcej. [0042] Epitop jest także rozpoznawany przez komórki układu odpornościowego, na przykład komórki B i(lub) komórki T. Rozpoznawanie komórkowe epitopu można określić z wykorzystaniem testów in vitro, w których mierzy się namnażanie zależne od antygenu, określane na postawie wbudowywania 3 H-tymidyny, wydzielania cytokin, wydzielania przeciwciał lub niszczenia komórek zależnego od antygenu (test cytotoksycznych limfocytów T). [0043] Przykładowe epitopy lub determinanty antygenowe mogą znajdować się w ludzkim białku prekursora amyloidu (APP), ale korzystnie znajdują się w peptydzie Aβ APP. Istnieje wiele izoform APP, na przykład APP 695, APP 751 i APP 770. Aminokwasom w obrębie APP przypisuje się numery zgodnie z sekwencją izoformy APP 770 (patrz np. GenBank, nr dostępowy P05067, przedstawiona także jako sekwencja o nr. ident. 38). Peptyd Aβ (określany w niniejszym dokumencie także jako amyloidowy peptyd beta i A- beta) to wewnętrzny fragment o długości ~4 kda, zawierający aminokwasów APP (Aβ39, Aβ40, Aβ41, Aβ42 i Aβ43). Aβ40 składa się na przykład z reszt APP, Aβ42 składa się zaś z reszt APP. W wyniku trawienia proteolitycznego APP przez różne enzymy sekretazy in vivo lub in situ Aβ występuje w postaci skróconej o długości 40 aminokwasów oraz w postaci długiej o długości aminokwasów. Korzystne epitopy lub determinanty antygenowe opisywane w niniejszym dokumencie znajdują się na końcu N peptydu Aβ i obejmują reszty w obrębie aminokwasów 1- Aβ, korzystnie reszty 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7 lub 3-7 Aβ42. Dodatkowe konkretne epitopy lub determinanty antygenowe obejmują

21 22 reszty 2-4, 5, 6, 7 lub 8 Aβ, reszty 3-5, 6, 7, 8 lub 9 Aβ lub reszty 4-7, 8, 9 lub Aβ42. [0044] Określenie choroba amyloidogenna obejmuje dowolną chorobę związaną z wytwarzaniem lub odkładaniem nierozpuszczalnych włókien amyloidowych lub powodowaną przez takie wytwarzanie/odkładanie. Do przykładowych chorób amyloidogennych należą między innymi amyloidoza układowa, choroba Alzheimera, cukrzyca o początku w wieku dorosłym, choroba Parkinsona, choroba Huntingtona, otępienie czołowoskroniowe i związane z prionami zakaźne encefalopatie gąbczaste (choroba kuru i Creutzfeldta-Jacoba u ludzi oraz scrapie i BSE odpowiednio u owiec i bydła). Różne choroby amyloidogenne definiuje się lub charakteryzuje na podstawie typu składnika polipeptydowego odkładanych włókien. U osobników lub pacjentów cierpiących na chorobę Alzheimera charakterystycznym składnikiem polipeptydowym złogu amyloidowego jest białko ß (np. białko ß- amyloidu typu dzikiego, odmiana lub skrócone). W związku z tym choroba Alzheimera jest przykładem choroby charakteryzującej się złogami Aβ lub choroby związanej ze złogami Aβ w mózgu osobnika lub pacjenta. Określenia białko β-amyloidu, peptyd β-amyloidowy, β-amyloid, Aβ i peptyd Aβ są w niniejszym dokumencie stosowane zamiennie. [0045] Określenie dawka skuteczna lub skuteczne dawkowanie definiuje się jako ilość wystarczającą do uzyskania lub co najmniej częściowego uzyskania pożądanego efektu. Określenie dawka skuteczna terapeutycznie definiuje się jako ilość wystarczającą do wyleczenia lub co najmniej częściowego zatrzymania postępu choroby i jej powikłań u pacjenta, który już cierpi na tę chorobę. Ilości skuteczne przy tym zastosowaniu zależą od ciężkości infekcji i ogólnego stanu układu odpornościowego pacjenta. [0046] Określenie pacjent obejmuje człowieka i inne ssaki poddawane postępowaniu profilaktycznemu lub terapeutycznemu. [0047] Rozpuszczalne lub zdysocjowane Aβ oznacza polipeptyd Aβ nieulegający agregacji lub w stanie zdeagregowanym. Nierozpuszczalny Aβ oznacza polipeptyd Aβ ulegający agregacji,

22 23 na przykład Aβ utrzymywany przez wiązania niekowalencyjne. Uważa się, że Aβ (np. Aβ42) ulega agregacji, co najmniej w części, wskutek obecności reszt hydrofobowych na końcu C peptydu (części domeny przezbłonowej APP). Jedną z metod otrzymywania rozpuszczalnego Aβ jest rozpuszczenie liofilizowanego peptydu w czystym DMSO z zastosowaniem sonikacji. Powstały roztwór odwirowuje się w celu usunięcia wszelkich nierozpuszczalnych cząstek stałych. [0048] W niniejszym dokumencie funkcja efektorowa oznacza aktywność, która jest zlokalizowana w regionie Fc przeciwciała (np. przeciwciała IgG) i obejmuje na przykład zdolność przeciwciała do wiązania cząsteczek efektorowych, takich jak dopełniacz i(lub) receptory Fc, które mogą regulować szereg funkcji immunologicznych przeciwciała, takich jak aktywność komórek efektorowych, liza, aktywność z udziałem dopełniacza, eliminacja przeciwciał i okres półtrwania przeciwciała. [0049] Określenie cząsteczka efektorowa oznacza cząsteczkę zdolną do wiązania regionu Fc przeciwciała (np. przeciwciała IgG), w tym między innymi białka dopełniacza lub receptora Fc. [0050] Określenie komórka efektorowa oznacza komórkę zdolną do wiązania części Fc przeciwciała (np. przeciwciała IgG), zazwyczaj poprzez receptor Fc ulegający ekspresji na powierzchni komórki efektorowej, w tym między innymi limfocytów, np. komórek prezentujących antygen i limfocytów T. [0051] Określenie region Fc oznacza C-końcowy region przeciwciała IgG, w szczególności C-końcowy region łańcucha lub łańcuchów ciężkich wspomnianego przeciwciała IgG. Jakkolwiek granice regionu Fc łańcucha ciężkiego IgG mogą nieco się różnić, region Fc definiuje się zazwyczaj jako region od mniej więcej reszty aminokwasowej Cys226 do końca karboksylowego łańcucha lub łańcuchów ciężkich IgG. [0052] Określenie numeracja według Kabata definiuje się, jeśli nie zaznaczono inaczej, jako numerację reszt, np. łańcucha ciężkiego przeciwciała IgG, z użyciem indeksu EU zgodnie z Kabat i wsp. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, wyd. 5. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda,

23 24 Md. (1991)). [0053] Określenie receptor Fc lub FcR oznacza receptor wiążący region Fc przeciwciała. Do typowych receptorów Fc wiążących region Fc przeciwciała (np. przeciwciała IgG) należą między innymi receptory podklas FcγRI, FcγRII i FcγRIII, w tym warianty alleliczne i formy tych receptorów, które uległy alternatywnemu splicingowi. Przegląd receptorów Fc zamieszczono w Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: (1991), Capel i wsp., Immunomethods 4:-34 (1994) i de Haas i wsp., J. Lab. Clin. Med. 126:3-41 (1995). I. Czynniki immunologiczne i terapeutyczne [0054] Czynniki immunologiczne i terapeutyczne według wynalazku zawierają immunogeny lub przeciwciała bądź ich fragmenty funkcjonalne lub wiążące antygen, zdefiniowane w niniejszym dokumencie, lub składają się z takich immunogenów, przeciwciał bądź ich fragmentów. Wiadomo, że podstawowa jednostka strukturalna przeciwciała zawiera tetramer podjednostek. Każdy tetramer składa się z dwóch identycznych par łańcuchów polipeptydowych, przy czym każda para zawiera jeden łańcuch lekki (około kda) i jeden łańcuch ciężki (około kda). Część na końcu aminowym każdego łańcucha zawiera region zmienny mający 0-1 lub więcej aminokwasów, odpowiedzialnych głównie za rozpoznawanie antygenu. Część na końcu karboksylowym każdego łańcucha definiuje region stały, odpowiedzialny głównie za funkcję efektorową. [0055] Łańcuchy lekkie klasyfikuje się jako kappa lub lambda; mają one długość około 2 reszt. Łańcuchy ciężkie klasyfikuje się jako gamma (γ), mi (µ), alfa (α), delta (δ) lub epsilon (ε); mają one długość około i definiują izotyp przeciwciała jako odpowiednio IgG, IgM, IgA, IgD i IgE. Zarówno łańcuchy ciężkie, jak i lekkie są zwinięte w domeny. Określenie domena oznacza region globularny białka, na przykład immunoglobuliny lub przeciwciała. Do domen immunoglobuliny lub przeciwciała należą na przykład trzy lub cztery pętle peptydowe stabilizowane arkuszem ß oraz międzyłańcuchowym mostkiem dwusiarczkowym.

24 Niezmienione łańcuchy lekkie zawierają na przykład dwie domeny (V L i C L ), niezmienione łańcuchy ciężkie zawierają zaś na przykład cztery lub pięć domen (V H, C H 1, C H 2 i C H 3). [0056] W obrębie łańcuchów lekkich i ciężkich regiony zmienne i stałe są połączone regionem J o długości około 12 lub więcej aminokwasów, przy czym łańcuch ciężki obejmuje także region D o długości około lub więcej aminokwasów (patrz ogólnie Fundamental Immunology (Paul, W., red., wyd. 2. Raven Press, N.Y. (1989), rozdz. 7). [0057] Regiony zmienne każdej pary łańcuchów lekkiego i ciężkiego tworzą miejsce wiązania przeciwciała. W ten sposób niezmienione przeciwciało ma dwa miejsca wiązania. Z wyjątkiem przeciwciał dwufunkcjonalnych lub dwuswoistych oba miejsca wiązania są identyczne. Wszystkie łańcuchy mają tę samą strukturę ogólną ze stosunkowo konserwatywnymi regionami zrębowymi (FR) połączonymi przez trzy regiony hiperzmienne, określane także jako regiony determinujące komplementarność (CDR). Łańcuchy występujące w przyrodzie lub łańcuchy wytwarzane metodami rekombinacji mogą ulegać ekspresji z sekwencją liderową, która jest usuwana podczas trawienia w komórce z utworzeniem dojrzałego łańcucha. Dojrzałe łańcuchy można także wytwarzać metodami rekombinacji z sekwencją liderową inną niż naturalna, na przykład w celu zwiększenia wydzielania lub zmiany trawienia określonego łańcucha. [0058] CDR dwóch dojrzałych łańcuchów w każdej parze są dopasowywane przez regiony zrębowe, co umożliwia wiązanie swoistego epitopu. Od końca N do końca C łańcuchy lekkie i ciężkie zawierają domeny FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. FR4 jest określany w stanie techniki także jako region D/J zmiennego łańcucha ciężkiego i region J zmiennego łańcucha lekkiego. Przypisanie aminokwasów do każdej domeny jest zgodne z definicjami Kabata, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA, 1987 i 1991). Alternatywną definicję strukturalną zaproponowali Chothia i wsp., J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Nature 342:878 (1989) oraz J. Mol. Biol. 186:651 (1989) (publikacje te

25 26 określane są dalej łącznie jako Chothia i wsp. ). A. Przeciwciała Aβ [0059] Czynniki terapeutyczne według wynalazku obejmują przeciwciała, które w sposób swoisty wiążą się z Aβ lub innym składnikiem blaszki amyloidowej. Takie przeciwciała mogą być monoklonalne lub poliklonalne. Niektóre takie przeciwciała wiążą się swoiście z formą zagregowaną Aβ i nie wiążą się z formą rozpuszczalną. Niektóre wiążą się swoiście z formą rozpuszczalną bez wiązania z formą zagregowaną. Niektóre wiążą się zarówno z formą rozpuszczalną, jak i zagregowaną. Niektóre takie przeciwciała wiążą się z występującą naturalnie krótką formą Aβ (tzn. Aβ39, 40 lub 41) i nie wiążą się z występującą naturalnie długą formą Aβ (tzn. Aβ42 i Aβ43). Niektóre przeciwciała wiążą się z formą długą Aβ i nie wiążą się z formą krótką. Niektóre przeciwciała wiążą się z Aβ i nie wiążą się z pełnej długości białkiem prekursora amyloidu. Przeciwciała wykorzystywane w sposobach terapeutycznych zawierają korzystnie niezmieniony region stały lub co najmniej część regionu stałego wystarczającą, aby oddziaływać z receptorem Fc. Korzystny jest ludzki izotyp IgG1 ze względu na to, że powinowactwo izotypów ludzkich do receptora FcRI komórek fagocytujących jest największe. Można także wykorzystywać dwuswoiste fragmenty Fab; jedno ramię takiego przeciwciała jest swoiste wobec Aβ, drugie zaś wobec receptora Fc. Korzystne przeciwciała wiążą się z Aβ z powinowactwem wiązania przekraczającym (lub równym) około 6, 7, 8, 9 lub M -1 (w tym powinowactwa pomiędzy tymi wartościami). [0060] Surowice poliklonalne zawierają zazwyczaj mieszane populacje przeciwciał, wiążące szereg epitopów wzdłuż długości Aβ. Surowice poliklonalne mogą jednak być swoiste wobec określonego segmentu Aβ, na przykład Aβ1-. Przeciwciała monoklonalne wiążą się ze swoistym epitopem w Aβ, który może być epitopem konformacyjnym lub niekonformacyjnym. Skuteczność profilaktyczną i terapeutyczną przeciwciał można badać z zastosowaniem procedur w modelu zwierzęcia transgenicznego, opisanych w przykładach. Korzystne przeciwciała monoklonalne

26 27 wiążą się z epitopem w obrębie reszt 1- Aβ (przy czym pierwsza reszta N-końcowa naturalnego Aβ jest oznaczona jako 1). Niektóre korzystne przeciwciała monoklonalne wiążą się z epitopem w obrębie reszt 1-5, niektóre zaś z epitopem w obrębie reszt 5-. Niektóre korzystne przeciwciała wiążą się z epitopami w obrębie reszt 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7 lub 3-7. Niektóre korzystne przeciwciała wiążą się z epitopem rozpoczynającym się w obrębie reszt 1-3 i kończącym się w obrębie reszt 7-11 Aβ. Do mniej korzystnych przeciwciał należą przeciwciała wiążące się z epitopami w obrębie reszt -, -, -, -,, lub - Aβ. Zaleca się, aby takie przeciwciała przed zastosowaniem badać przesiewowo w kierunku aktywności w modelach mysich opisanych w przykładach. Stwierdzono na przykład, że niektóre przeciwciała wobec epitopów w obrębie reszt -18, 16-24, i nie wykazują aktywności (np. są pozbawione aktywności zmniejszającej obciążenie płytkami i(lub) eliminującej patologię tkanki nerwowej związaną z chorobą Alzheimera). W niektórych sposobach wykorzystuje się więcej przeciwciał monoklonalnych wiążących się swoiście z różnymi epitopami. Takie przeciwciała można podawać sekwencyjnie lub jednocześnie. Można wykorzystywać także przeciwciała przeciwko składnikom amyloidu innym niż Aβ (np. podawane lub podawane jednocześnie). Przeciwciała mogą być na przykład skierowane przeciwko białku związanemu z amyloidem synukleinie. [0061] Jeśli stwierdza się, że przeciwciało wiąże się z epitopem w obrębie określonych reszt, na przykład 1-5 Aβ, oznacza to, że przeciwciało w sposób swoisty wiąże się z polipeptydem zawierającym określone reszty (tzn. 1-5 Aβ w tym przykładzie). Takie przeciwciało niekoniecznie styka się z każdą resztą w obrębie Aβ 1-5. Nie oznacza to także, że każda substytucja lub delecja aminokwasu w obrębie Aβ1-5 koniecznie w znaczny sposób będzie wpływać na powinowactwo wiązania. Swoistość epitopową przeciwciała można na przykład określić, tworząc bibliotekę fagowej ekspresji peptydów, w której różni przedstawiciele prezentują różne podsekwencje Aβ. Następnie w bibliotece fagowej ekspresji peptydów wybiera się przedstawicieli, którzy w sposób

27 28 swoisty wiążą się z badanym przeciwciałem. Wyodrębnia się rodzinę sekwencji. Taka rodzina zawiera zazwyczaj wspólną sekwencję rdzeniową i różnej długości sekwencje otaczające u różnych przedstawicieli. Najkrótsza sekwencja rdzeniowa wykazująca swoiste wiązanie z przeciwciałem definiuje epitop wiązany przez przeciwciało. Można także badać przeciwciała pod kątem swoistości epitopowej w teście kompetycji z przeciwciałem, którego swoistość epitopową wcześniej określono. Przeciwciała konkurujące (współzawodniczące) z przeciwciałem 3D6 o wiązanie z Aβ wiążą się na przykład z tym samym lub podobnym epitopem co 3D6, tzn. w obrębie reszt 1-5 Aβ. Badanie przesiewowe przeciwciał w odniesieniu do swoistości epitopowej jest użyteczną metodą przewidywania skuteczności terapeutycznej. Jeśli na przykład stwierdzono, że przeciwciało wiąże się z epitopem w obrębie reszt 1-7 Aβ, prawdopodobnie będzie ono skutecznie zapobiegało chorobie Alzheimera i leczyło tę chorobę zgodnie z metodyką niniejszego wynalazku. [0062] Przeciwciała monoklonalne lub poliklonalne wiążące się swoiście z korzystnym segmentem Aβ i niewiążące się z innymi regionami Aβ mają szereg zalet w porównaniu do przeciwciał monoklonalnych wiążących się z innymi regionami lub surowic poliklonalnych z niezmienionym Aβ. Po pierwsze, w przypadku dawek o równej masie dawka przeciwciał, które swoiście wiążą się z korzystnymi fragmentami, zawiera większą dawkę molową przeciwciał, które skutecznie usuwają blaszki amyloidowe. Po drugie, przeciwciała wiążące się swoiście z korzystnymi segmentami mogą indukować odpowiedź powodującą usuwanie złogów amyloidowych bez indukcji odpowiedzi powodującej usuwanie niezmienionego polipeptydu APP, dzięki czemu zmniejszają się potencjalne działania niepożądane. 1. Przeciwciała chimerowe i humanizowane [0063] Niniejszy wynalazek dotyczy przeciwciał chimerowych i(lub) humanizowanych (tzn. chimerowych i(lub) humanizowanych immunoglobulin) swoistych wobec peptydu beta-amyloidowego. Przeciwciała chimerowe i(lub) humanizowane wykazują tę samą lub podobną swoistość i powinowactwo wiązania, co przeciwciało mysie

28 29 lub inne przeciwciało inne niż ludzkie, które stanowi materiał wyjściowy do konstruowania przeciwciała chimerowego i(lub) humanizowanego. A. Wytwarzanie przeciwciał chimerowych [0064] Określenie przeciwciało chimerowe oznacza przeciwciało, którego geny łańcucha lekkiego i ciężkiego skonstruowano, zazwyczaj metodami inżynierii genetycznej, z segmentów genów immunoglobulin należących do różnych gatunków. Można na przykład połączyć segmenty zmienne (V) genów mysiego przeciwciała monoklonalnego z ludzkimi segmentami stałymi (C), takimi jak na przykład IgG1 i IgG4. Korzystny jest ludzki izotyp IgG1. Typowe przeciwciało chimerowe jest więc białkiem hybrydowym, składającym się z domeny V lub wiążącej antygen z przeciwciała mysiego i domeny C lub efektorowej z przeciwciała ludzkiego. B. Wytwarzanie przeciwciał humanizowanych [0065] Określenie przeciwciało humanizowane oznacza przeciwciało, w skład którego wchodzi co najmniej jeden łańcuch zawierający reszty zrębowe regionu zmiennego zasadniczo z ludzkiego łańcucha przeciwciała (określanego jako immunoglobulina lub przeciwciało akceptorowe) i co najmniej jednego regionu determinującego komplementarność, zasadniczo z przeciwciała mysiego (określanego jako immunoglobulina lub przeciwciało donorowe). Patrz Queen i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: (1989), US 5,5,1, US 5,585,089, US 5,693,761, US 5,693,762, Selick i wsp., WO 90/07861 i Winter, US 5,2,539. Region lub regiony stałe, jeśli są obecne, także pochodzą zasadniczo lub całkowicie z ludzkiej immunoglobuliny. [0066] Podstawienie mysich CDR do zrębu ludzkiej domeny zmiennej najprawdopodobniej doprowadzi do utrzymania ich właściwej orientacji przestrzennej, jeśli zrąb ludzkiej domeny zmiennej przyjmie tę samą lub podobną konformację względem mysiego zrębu zmiennego, z której pochodzą CDR. Uzyskuje się to, otrzymując ludzkie domeny zmienne z przeciwciał ludzkich, których sekwencje zrębowe wykazują znaczną identyczność sekwencji z mysimi domenami zrębu zmiennego, z których pochodzą CDR. Regiony zrębowe zmienne łańcucha ciężkiego i lekkiego mogą pochodzić z

29 tych samych lub różnych sekwencji przeciwciał ludzkich. Ludzkie sekwencje przeciwciał mogą stanowić sekwencje przeciwciał ludzkich występujące naturalnie lub mogą stanowić sekwencje konsensusowe kilku przeciwciał ludzkich. Patrz Kettleborough i wsp., Protein Engineering 4:773 (1991), Kolbinger i wsp., Protein Engineering 6:971 (1993) oraz Carter i wsp., WO 92/ [0067] Po identyfikacji regionów determinujących komplementarność mysiej immunoglobuliny donorowej i odpowiednich ludzkich immunoglobulin akceptorowych kolejnym etapem jest ustalenie, które reszty tych elementów, jeśli w ogóle, należy zastąpić w celu zoptymalizowania właściwości powstałego przeciwciała humanizowanego. Ogólnie należy do minimum zmniejszyć substytucję ludzkich reszt aminokwasowych mysimi, ponieważ wprowadzenie reszt mysich zwiększa ryzyko tego, że przeciwciało wywoła odpowiedź ludzkich przeciwciał antymysich (HAMA) u człowieka. Do monitorowania odpowiedzi HAMA u konkretnego pacjenta lub podczas badań klinicznych można zastosować znane w stanie techniki metody określania odpowiedzi immunologicznej. U pacjentów, którym podaje się przeciwciała humanizowane, można dokonać oceny immunogenności na początku stosowania wspomnianej terapii i podczas tej terapii. Odpowiedź HAMA mierzy się, na przykład, przez wykrywanie przeciwciał przeciwko humanizowanemu czynnikowi terapeutycznemu w próbkach surowicy pobranych od pacjenta metodą znanej w stanie techniki, taką jak powierzchniowy rezonans plazmonowy (BIACORE) i(lub) testy ELISA w fazie stałej. [0068] Niektóre aminokwasy z reszt zrębowych regionu zmiennego człowieka wybiera się do substytucji na podstawie ich możliwego wpływu na konformację CDR i(lub) wiązanie z antygenem. Nienaturalne zestawienie mysich regionów CDR z ludzkim regionem zmiennym zrębu może doprowadzić do nienaturalnych ograniczeń konformacyjnych, które prowadzą do utraty powinowactwa wiązania, jeśli nie zostaną skorygowane przez substytucję niektórych reszt aminokwasowych. [0069] Wybór reszt aminokwasowych do substytucji prowadzi się

30 31 częściowo z wykorzystaniem modelowania komputerowego. W niniejszym dokumencie opisuje się sprzęt komputerowy i oprogramowanie do uzyskiwania trójwymiarowych obrazów cząsteczek immunoglobulin. Modele cząsteczkowe powstają zasadniczo na podstawie rozwiązanych struktur łańcuchów immunoglobulin lub ich domen. W przypadku łańcuchów, które mają być modelowane, porównuje się podobieństwo sekwencji aminokwasowej z łańcuchami lub domenami rozwiązanych struktur trójwymiarowych i łańcuchy lub domeny wykazujące największe podobieństwo sekwencji wybiera się jako punkty wyjścia do konstrukcji modelu cząsteczkowego. Do modelowania wybiera się łańcuchy lub domeny wykazujące co najmniej 50% identyczności sekwencji; korzystnie, wykazujące co najmniej 60%, 70%, 80%, 90% identyczności sekwencji lub więcej. Rozwiązane struktury wyjściowe modyfikuje się, aby uwzględnić różnice między rzeczywistymi aminokwasami w modelowanych łańcuchach lub domenach immunoglobulin a aminokwasami struktury wyjściowej. Zmodyfikowane struktury składa się następnie w złożoną immunoglobulinę. Model udoskonala się wreszcie poprzez minimalizację energii i sprawdzenie, czy wszystkie atomy znajdują się w odpowiedniej odległości od siebie i czy długości oraz kąty między wiązaniami mieszczą się w granicach dopuszczalnych chemicznie. [0070] Wybór reszt aminokwasowych do substytucji można także częściowo określić z zastosowaniem analizy charakterystyki aminokwasów w konkretnych miejscach lub przez obserwację empiryczną skutków substytucji lub mutagenezy określonych aminokwasów. Jeśli na przykład istnieje różnica między aminokwasem reszty zrębowej regionu zmiennego myszy a aminokwasem wybranej reszty zrębowej regionu zmiennego człowieka, aminokwas zrębowy człowieka należałoby zazwyczaj zastąpić równoważnym aminokwasem zrębowym przeciwciała mysiego, jeśli w sposób uzasadniony można oczekiwać, że aminokwas: (1) w sposób niekowalencyjny bezpośrednio wiąże się z antygenem, (2) sąsiaduje z regionem CDR, (3) w inny sposób oddziałuje z regionem CDR (np. modelowanie komputerowe wskazuje, że znajduje się on w odległości około 3-6

31 32 Å od regionu CDR) lub (4) znajduje się na styku VL i VH. [0071] Reszty, które w sposób niekowalencyjny bezpośrednio wiążą się z antygenem, obejmują aminokwasy w położeniach regionów zrębowych, w których istnieje duże prawdopodobieństwo bezpośredniego oddziaływania z aminokwasami antygenu na drodze działania odpowiednich sił chemicznych, na przykład przez wiązania wodorowe, siły Van der Waalsa, oddziaływania hydrofobowe i inne. [0072] CDR i regiony zrębowe ustala się zgodnie z definicją Kabata i wsp. lub Chothia i wsp., patrz wyżej. Jeśli reszty zrębowe, zdefiniowane przez Kabata i wsp., patrz wyżej, stanowią reszty pętli strukturalnej, zdefiniowane przez Chothia i wsp., patrz wyżej, aminokwasy występujące w przeciwciele mysim można wybrać do substytucji przeciwciała humanizowanego. Reszty, które sąsiadują z regionem CDR obejmują aminokwasy w położeniach bezpośrednio sąsiadujących z jednym lub większą liczbą CDR w sekwencji pierwszorzędowej łańcucha immunoglobuliny humanizowanej, na przykład w położeniach bezpośrednio sąsiadujących z CDR, zdefiniowanych przez Kabata, lub z CDR zdefiniowanym przez Chothia (patrz np. Chothia i Lesk JMB 196:901 (1987)). Te aminokwasy ze szczególnym prawdopodobieństwem będą oddziaływać z aminokwasami w CDR i, jeśli zostaną wybrane z akceptora, będą zniekształcać CDR donora i zmniejszać powinowactwo. Ponadto sąsiednie aminokwasy mogą bezpośrednio oddziaływać z antygenem (Amit i wsp., Science, 233:747 (1986)) i wybór tych aminokwasów z donora może być pożądany, aby utrzymać wszystkie punkty styku antygenu, które nadają powinowactwo w przeciwciele pierwotnym. [0073] Reszty, które w inny sposób oddziałują z regionem CDR obejmują reszty, które na podstawie analizy struktury drugorzędowej znajdują się w orientacji przestrzennej wystarczającej, aby wpływać na region CDR. W jednej z postaci wykonania reszty, które w inny sposób oddziałują z regionem CDR, identyfikuje się, analizując model trójwymiarowy immunoglobuliny donorowej (np. model wygenerowany komputerowo).

32 33 Model trójwymiarowy, zazwyczaj pierwotnego przeciwciała donorowego, ukazuje, że niektóre aminokwasy poza CDR położone są blisko CDR i istnieje duże prawdopodobieństwo ich oddziaływania z aminokwasami CDR poprzez wiązanie wodorowego, siły van der Waalsa, oddziaływania hydrofobowe itd. W położeniach tych aminokwasów można wybrać raczej aminokwas immunoglobuliny donorowej, a nie aminokwas immunoglobuliny akceptorowej. Atom łańcucha bocznego aminokwasów według tego kryterium będzie się zasadniczo znajdować w obrębie około 3 angstremów (Å) od jednego z atomów w CDR i muszą zawierać atom, który może oddziaływać z atomami CDR poprzez odpowiednie siły chemiczne, na przykład wymienionych powyżej. [0074] W przypadku atomów, które mogą tworzyć wiązanie wodorowe, odległość 3 Å mierzy się między ich jądrami, jednak w przypadku atomów, które nie tworzą wiązania, odległość 3 Å mierzy się między ich powierzchniami van der Waalsa. Z związku z tym, w przypadku drugiej z tych możliwości jądra muszą znajdować się w obrębie 6 Å (3 Å plus suma promieni van der Waalsa), żeby uznać, że dane atomy mogą ze sobą oddziaływać. W wielu wypadkach jądra znajdują się w odległości od 4 lub 5 do 6 Å. Jeśli określa się, czy aminokwas może oddziaływać z CDR, korzystnie jest nie uwzględniać ostatnich 8 aminokwasów łańcucha ciężkiego CDR 2 jako części CDR, ponieważ z punktu widzenia struktury tych 8 aminokwasów zachowują się one bardziej jako część zrębu. [0075] Aminokwasy zdolne do oddziaływania z aminokwasami w CDR można zidentyfikować jeszcze w inny sposób. Pole powierzchni dostępnej dla rozpuszczalnika dla każdego aminokwasu zrębowego oblicza się na dwa sposoby: (1) w przeciwciele niezmienionym i (2) w hipotetycznej cząsteczce, składającej się z przeciwciała, z którego usunięto CDR. Znaczna różnica między tymi liczbami, wynosząca około angstremów kwadratowych lub więcej, wskazuje na to, że dostęp aminokwasu zrębowego do rozpuszczalnika jest co najmniej częściowo blokowany przez CDR i że dlatego aminokwas pozostaje w styczności z CDR. Pole powierzchni dostępnej dla rozpuszczalnika można obliczyć na podstawie trójwymiarowego modelu przeciwciała z użyciem algorytmów znanych w stanie

33 34 techniki (np. Connolly, J. Appl. Cryst. 16:548 (1983) oraz Lee i Richards, J. Mol. Biol. 55:379 (1971)). Aminokwasy zrębowe także mogą niekiedy oddziaływać pośrednio z CDR, wpływając na konformację innego aminokwasu zrębowego, który z kolei styka się z CDR. [0076] Wiadomo, że aminokwasy w kilku położeniach zrębu są zdolne do oddziaływania z CDR w wielu przeciwciałach (Chothia i Lesk, patrz wyżej, Chothia i wsp., patrz wyżej oraz Tramontano i wsp., J. Mol. Biol. 2:175 (1990)). W szczególności wiadomo, że aminokwasy w położeniach 2, 48, 64 i 71 łańcucha lekkiego oraz 26-, 71 i 94 łańcucha ciężkiego (numeracja według Kabata) są zdolne do oddziaływania z CDR w wielu przeciwciałach. Aminokwasy w położeniach łańcucha lekkiego oraz 93 i 3 łańcucha ciężkiego także z dużym prawdopodobieństwem oddziałują z CDR. We wszystkich tych numerowanych położeniach korzystny jest wybór do immunoglobuliny humanizowanej raczej aminokwasu donorowego, a nie aminokwasu akceptorowego (jeśli się różnią). Z drugiej strony niektóre reszty zdolne do oddziaływania z regionem CDR, na przykład pierwszych 5 aminokwasów łańcucha lekkiego, można niekiedy wybierać z immunoglobuliny akceptorowej bez utraty powinowactwa w immunoglobulinie humanizowanej. [0077] Reszty, które znajdują się na styku VL i VH lub reszty pakujące obejmują reszty na powierzchni styku VL i VH zdefiniowanej na przykład przez Novotny i Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: (1985) lub Chothia i wsp., patrz wyżej. Zasadniczo w przeciwciele humanizowanym należy zachować nietypowe reszty pakujące, jeśli są inne od reszt zrębowych człowieka. [0078] Ogólnie zastępuje się jeden lub więcej aminokwasów spełniających powyższe kryteria. W niektórych postaciach wykonania zastępuje się wszystkie lub większość aminokwasów spełniających powyższe kryteria. Niekiedy występuje pewna niejasność, czy dany aminokwas spełnia powyższe kryteria, i wytwarza się alternatywne odmiany immunoglobulin, z których jedna ma daną substytucję, zaś inna jej nie ma. Alternatywne odmiany immunoglobulin wytworzone w ten sposób można badać

34 dowolnym z testów opisywanych w niniejszym dokumencie w odniesieniu do pożądanej aktywności i wybierać korzystną immunoglobulinę. [0079] Regiony CDR przeciwciał humanizowanych są zazwyczaj zasadniczo identyczne, częściej identyczne, względem odpowiednich regionów CDR przeciwciała donorowego. Jakkolwiek nie jest to zazwyczaj pożądane, możliwe jest niekiedy wytworzenie jednej lub większej liczby konserwatywnych substytucji aminokwasów w obrębie reszt CDR bez istotnego wpływu na powinowactwo wiązania powstałej immunoglobuliny humanizowanej. Substytucja konserwatywna ma oznaczać kombinacje takie, jak gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gln; ser, thr; lys, arg; phe, tyr. [0080] Dodatkowe możliwości substytucji to akceptorowe aminokwasy zrębowe człowieka, które w immunoglobulinie ludzkiej w danym położeniu są nietypowe lub rzadkie. Te aminokwasy można zastąpić aminokwasami z równoważnego położenia w mysim przeciwciele donorowym lub z równoważnego położenia w bardziej typowych immunoglobulinach ludzkich. Substytucja może być na przykład pożądana, jeśli aminokwas w ludzkim regionie zrębowym immunoglobuliny akceptorowej jest rzadki w tym położeniu, a odpowiedni aminokwas immunoglobuliny donorowej jest typowy dla tego położenia w sekwencjach immunoglobulin ludzkich lub jeśli aminokwas w immunoglobulinie akceptorowej jest rzadki w tym położeniu, a odpowiedni aminokwas immunoglobuliny donorowej jest także rzadki w porównaniu do innych sekwencji ludzkich. To kryterium jest pomocne w zapewnieniu, że nietypowy aminokwas w ludzkim regionie zrębowym nie zakłóci struktury przeciwciała. Ponadto poprzez zastąpienie nietypowego ludzkiego aminokwasu akceptorowego aminokwasem z przeciwciała donorowego, który jest typowy dla przeciwciał ludzkich, przeciwciało humanizowane można uczynić mniej immunogennym. [0081] Określenie rzadki stosowane w niniejszym dokumencie wskazuje, że aminokwas występujący w danym położeniu znajduje się w mniej niż około %, a zazwyczaj mniej niż około % sekwencji w reprezentatywnej próbce sekwencji, natomiast

35 36 określenie częsty stosowane w niniejszym dokumencie wskazuje, że aminokwas występujący w danym położeniu znajduje się w więcej niż około %, a zazwyczaj więcej niż około 50% sekwencji w reprezentatywnej próbce. Wszystkie sekwencje regionu zmiennego łańcuchów lekkiego i ciężkiego człowieka klasyfikuje się na przykład odpowiednio do podgrup sekwencji, które są szczególnie homologiczne wobec siebie i zawierają te same aminokwasy w pewnych istotnych położeniach (Kabat i wsp., patrz wyżej). Jeśli określa się, czy aminokwas w ludzkiej sekwencji akceptorowej jest rzadki czy częsty w sekwencjach człowieka, korzystne jest często uwzględnienie jedynie sekwencji ludzkich z tej samej podgrupy, co sekwencja akceptorowa. [0082] Dodatkowe możliwości substytucji to akceptorowe aminokwasy zrębowe człowieka, które identyfikuje się jako część regionu CDR na podstawie alternatywnej definicji zaproponowanej przez Chothia i wsp., patrz wyżej. Dodatkowe możliwości substytucji to akceptorowe aminokwasy zrębowe człowieka, które identyfikuje się jako część regionu CDR na podstawie definicji AbM i(lub) styku. W szczególności CDR1 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego definiuje się tak, że zawiera reszty [0083] Dodatkowe możliwości substytucji to akceptorowe aminokwasy zrębowe, odpowiadające reszcie rzadkiej lub nietypowej w zrębie donorowym. Rzadkie lub nietypowe donorowe reszty zrębowe to reszty rzadkie lub nietypowe (zgodnie z definicją w niniejszym dokumencie) w przeciwciałach mysich w tym położeniu. W przypadku przeciwciał mysich podgrupę można określić według Kabata i zidentyfikować położenia reszt różniących się od sekwencji konsensusowej. Takie różnice specyficzne dla donora mogą wskazywać na zwiększające aktywność mutacje somatyczne w sekwencji mysiej. Zachowuje się reszty nietypowe, co do których przewiduje się, że wpływają na wiązanie, natomiast reszty, co do których przewiduje się, że są nieistotne dla wiązania, można zastąpić. [0084] Dodatkowe możliwości substytucji to reszty inne niż z linii płciowej występujące w regionie zrębowym akceptora. Jeśli na przykład łańcuch przeciwciała akceptorowego (tzn. łańcuch

36 37 przeciwciała ludzkiego o znacznej identyczności sekwencji z łańcuchem przeciwciała donorowego) zostanie dopasowany do łańcucha przeciwciała z linii płciowej (także o znacznej identyczności sekwencji z łańcuchem donorowym), reszty niezgodne między zrębem łańcucha akceptorowego a zrębem łańcucha linii płciowej można zastąpić odpowiednimi resztami sekwencji linii płciowej. [0085] Oprócz konkretnych substytucji aminokwasowych omawianych powyżej regiony zrębowe immunoglobulin humanizowanych są zazwyczaj zasadniczo identyczne, a częściej identyczne, względem regionów zrębowych przeciwciał ludzkich, od których pochodzą. Oczywiście wiele aminokwasów w regionie zrębowym ma niewielki bezpośredni udział w swoistości lub powinowactwie przeciwciała lub nie ma go wcale. W związku z tym można tolerować wiele pojedynczych konserwatywnych substytucji reszt zrębowych bez znacznej zmiany swoistości lub powinowactwa powstałej immunoglobuliny humanizowanej. I tak w jednej z postaci wykonania zmienny region zrębowy immunoglobuliny humanizowanej wykazuje co najmniej 85% identyczności sekwencji z sekwencją zmiennego regionu zrębowego człowieka lub sekwencją konsensusową wobec nich. W innej postaci wykonania zmienny region zrębowy immunoglobuliny humanizowanej wykazuje co najmniej 90%, korzystnie 95%, korzystniej 96%, 97%, 98% lub 99% identyczności sekwencji z sekwencją zmiennego regionu zrębowego człowieka lub sekwencją konsensusową wobec nich. Zasadniczo jednak takie substytucje nie są pożądane. [0086] Korzystnie, powinowactwo swoistego wiązania antygenu przez przeciwciała humanizowane wynosi co najmniej 7, 8, 9 lub M -1. Zazwyczaj górna wartość graniczna powinowactwa wiązania przeciwciał humanizowanych z antygenem jest trzy-, cztero- lub pięciokrotnie większa od immunoglobuliny donorowej. Często dolna wartość graniczna powinowactwa wiązania także jest trzy-, cztero- lub pięciokrotnie większa od immunoglobuliny donorowej. Powinowactwo wiązania można ewentualnie porównać z powinowactwem przeciwciała humanizowanego bez substytucji (np. przeciwciało z donorowymi CDR i akceptorowymi FR, ale bez

37 38 substytucji FR). W takim wypadku wiązanie przeciwciała zoptymalizowanego (z substytucjami) jest korzystnie co najmniej 2-3-krotnie większe lub 3-4-krotnie większe niż przeciwciała bez substytucji. W celach porównawczych można oznaczyć aktywność różnych przeciwciał, na przykład metodą BIACORE, czyli powierzchniowego rezonansu plazmonowego z użyciem odczynników nieznakowanych, lub w testach wiązania kompetycyjnego. C. Wytwarzanie przeciwciał humanizowanych 3D6 [0087] Korzystna postać zastosowania niniejszego wynalazku dotyczy przeciwciała humanizowanego przeciwko końcowi N Aβ, w szczególności do zastosowania w sposobach terapeutycznych i(lub) diagnostycznych opisywanych w niniejszym dokumencie. Szczególnie korzystnym materiałem wyjściowym do wytwarzania przeciwciał humanizowanych jest 3D6. 3D6 jest swoiste wobec końca N Aβ; wykazano, że pośredniczy ono w fagocytozie (tzn. indukuje fagocytozę) blaszki amyloidowej (patrz przykłady I-V). Klonowanie i sekwencjonowanie cdna kodującego regiony zmienne łańcucha ciężkiego i lekkiego przeciwciała 3D6 omówiono w przykładzie VI. [0088] Odpowiednie sekwencje ludzkich przeciwciał akceptorowych identyfikuje się z zastosowaniem komputerowego porównania sekwencji aminokwasowych mysich regionów zmiennych z sekwencjami znanych przeciwciał ludzkich. Porównanie przeprowadza się oddzielnie dla łańcuchów ciężkich i lekkich, jednak jego zasady są podobne. W szczególności domeny zmienne z przeciwciał ludzkich, których sekwencje zrębowe wykazują znaczną identyczność sekwencji z mysimi regionami zrębowymi VL i VH, zidentyfikowano przez poszukiwanie w bazie danych Kabata z zastosowaniem NCBI BLAST (dostępny publicznie przez serwer internetowy National Institutes of Health NCBI) z użyciem odpowiednich mysich sekwencji zrębowych. W jednej z postaci wykonania wybiera się sekwencje akceptorowe o ponad 50% identyczności sekwencji z mysimi sekwencjami donorowymi. Korzystnie wybiera się sekwencje przeciwciał akceptorowych o 60%, 70%, 80%, 90% lub większej identyczności sekwencji. [0089] Porównanie komputerowe 3D6 wykazało, że łańcuch lekki 3D6

38 39 wykazuje największą identyczność sekwencji z ludzkimi łańcuchami lekkimi podtypu kappa II i że łańcuch ciężki 3D6 wykazuje największą identyczność sekwencji z ludzkimi łańcuchami ciężkimi podtypu III, zgodnie z definicją Kabata i wsp., patrz wyżej. Ludzkie zrębowe regiony lekkie i ciężkie korzystnie pochodzą zatem z przeciwciał ludzkich tych podtypów lub z sekwencji konsensusowych takich podtypów. Korzystne regiony zmienne ludzkiego łańcucha lekkiego o największej identyczności sekwencji wobec odpowiedniego regionu 3D6 pochodzą z przeciwciał o numerach identyfikacyjnych według Kabata 0192, , , , , U240 i U41645, przy czym korzystniejszy jest Korzystne regiony zmienne ludzkiego łańcucha ciężkiego o największej identyczności sekwencji wobec odpowiedniego regionu 3D6 pochodzą z przeciwciał o numerach identyfikacyjnych według Kabata , , , i M23691, przy czym korzystniejszy jest [0090] Następnie w następujący sposób wybiera się reszty do substytucji. Jeśli istnieje różnica co do aminokwasu między zrębowym regionem zmiennym 3D6 a równoważnym zrębowym regionem zmiennym człowieka, aminokwas zrębowy człowieka należałoby zazwyczaj zastąpić równoważnym aminokwasem mysim, jeśli w sposób uzasadniony można oczekiwać, że aminokwas: (1) w sposób niekowalencyjny bezpośrednio wiąże się z antygenem, (2) sąsiaduje z regionem CDR, jest częścią regionu CDR zgodnie z alternatywną definicją zaproponowaną przez Chothia i wsp., patrz wyżej, lub w inny sposób oddziałuje z regionem CDR (np. znajduje się w obrębie około 3Å od regionu CDR) (np. aminokwasy w położeniach L2, H49 i H94 3D6) lub (3) znajduje się na styku VL i VH (np. aminokwasy w położeniach L36, L46 i H93 3D6). [0091] Modelowanie komputerowe regionów zmiennych łańcucha ciężkiego i lekkiego przeciwciała 3D6 i humanizowanie przeciwciała 3D6 omówiono w przykładzie VII. W skrócie, na podstawie najbliższych rozwiązanych struktur przeciwciał mysich w odniesieniu do łańcuchów ciężkich i lekkich wygenerowano model trójwymiarowy. W tym celu jako matrycę do modelowania łańcucha

39 40 lekkiego 3D6 wybrano przeciwciało oznaczone jako 1CR9 (Protein Data Bank (PDB), nr ident. 1CR9, Kanyo i wsp., J. Mol. Biol. 293:855 (1999)), a jako matrycę do modelowania łańcucha ciężkiego wybrano przeciwciało oznaczone jako 1OPG (nr ident. PDB: 1OPG, Kodandapani i wsp., J. Biol. Chem. 270:2268 (1995)). Model następnie udoskonalano poprzez serię etapów minimalizacji energii, aby usunąć niekorzystne punkty styku atomów oraz zoptymalizować oddziaływania elektrostatyczne i van der Waalsa. Jako matrycę do modelowania CDR3 łańcucha ciężkiego CDR3 wybrano rozwiązaną strukturę 1qkz (nr ident. PDB: 1QKZ, Derrick i wsp., J. Mol. Biol. 293:81 (1999)), ponieważ 3D6 i 1OPG nie wykazywały znacznej homologii sekwencji w tym regionie po dopasowaniu w celu porównania. [0092] Trójwymiarowe informacje strukturalne o przeciwciałach omawianych w dokumencie są dostępne publicznie, na przykład w Protein Data Bank (PDB) należącym do Research Collaboratory for Structural Bioinformatics. PDB jest dostępny bez opłat przez Internet; został omówiony przez Berman i wsp. (00) Nucleic Acids Research, 28:2. Modelowanie komputerowe pozwala na identyfikację reszt oddziałujących z CDR. Model komputerowy struktury 3D6 może z kolei służyć za punkt wyjściowy do przewidywania struktury trójwymiarowej przeciwciała zawierającego regiony determinujące komplementarność 3D6, zastępowane w ludzkich strukturach zrębowych. Po wprowadzeniu kolejnych substytucji aminokwasów można konstruować dodatkowe modele przedstawiające strukturę. [0093] Ogólnie pożądana jest substytucja jednego, większości lub wszystkich aminokwasów spełniających powyższe kryteria. W związku z tym przeciwciała humanizowane według niniejszego wynalazku zawierają zazwyczaj substytucję reszty zrębowej ludzkiego łańcucha lekkiego przez odpowiednią resztę 3D6 w co najmniej 1, 2 lub 3 i więcej, zazwyczaj 4 z następujących położeń: L1, L2, L36 i L46. Przeciwciała humanizowane zawierają ponadto zazwyczaj substytucję reszty zrębowej ludzkiego łańcucha ciężkiego przez odpowiednią resztę 3D6 w co najmniej 1, 2 i niekiedy 3 z następujących położeń: H49, H93 i H94. Przeciwciała

40 41 humanizowane mogą ponadto zawierać substytucję reszty zrębowej łańcucha ciężkiego przez odpowiednią resztę linii płciowej w co najmniej 1, 2 i niekiedy 3 z następujących położeń: H74, H77 i H89. [0094] Niekiedy jednak występuje pewna niejasność, czy dany aminokwas spełnia powyższe kryteria i wytwarza się alternatywne odmiany immunoglobulin, z których jedna zawiera daną substytucję, inna zaś jej nie zawiera. Jeśli substytucja przez resztę mysią wprowadziłaby resztę, która w danym położeniu w immunoglobulinach ludzkich jest rzadka, pożądane może być zbadanie aktywności przeciwciała z konkretną substytucją lub bez niej. Jeśli aktywność (np. powinowactwo wiązania i(lub) swoistość wiązania) jest w przybliżeniu taka sama z substytucją i bez niej, korzystne może być przeciwciało bez substytucji, ponieważ można oczekiwać, że będzie wywoływać mniejszą odpowiedź HAHA, zgodnie z opisem w niniejszym dokumencie. [0095] Dodatkowe możliwości substytucji to akceptorowe aminokwasy zrębowe człowieka, które są nietypowe w immunoglobulinie ludzkiej w danym położeniu. Te aminokwasy można zastąpić aminokwasami z równoważnego położenia w bardziej typowych immunoglobulinach ludzkich. Ewentualnie aminokwasy z równoważnych położeń w mysim 3D6 można wprowadzić do ludzkich regionów zrębowych, jeśli takie aminokwasy są typowe dla immunoglobulin ludzkich w równoważnych położeniach. [0096] W dodatkowych postaciach wykonania, w których region zrębowy ludzkiego łańcucha lekkiego immunoglobuliny akceptorowej ma nr ident. według Kabata 0192, łańcuch lekki zawiera substytucje w co najmniej 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,, 11, 12 lub częściej 13, z następujących położeń: L7, L, L12, L, L17, L39, L45, L63, L78, L83, L85, L0 lub L4. W dodatkowych postaciach wykonania, w których region zrębowy ludzkiego łańcucha ciężkiego immunoglobuliny akceptorowej ma nr ident. według Kabata , łańcuch ciężki zawiera substytucje w co najmniej 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,, 11, 12, 13, 14 lub częściej, z następujących położeń: H3, H5, H13, H16, H19, H40, H41, H42, H44, H72, H77, H82A, H83, H84 lub H8. Te

41 42 położenia zastępuje się aminokwasem z równoważnego położenia w immunoglobulinie ludzkiej, zawierającej bardziej typową resztę aminokwasową. Przykłady odpowiednich aminokwasów zastępujących przedstawiono na Fig. 1 i 2. [0097] Dodatkowe możliwości substytucji to reszty inne niż z linii płciowej występujące w regionie zrębowym. Porównanie komputerowe 3D6 ze znanymi sekwencjami linii płciowej wykazało, że łańcuchy ciężkie o największej identyczności sekwencji obejmują sekwencje regionu zmiennego linii płciowej VH3-48, VH3-23, VH3-7, VH3-21 i VH3-11, przy czym korzystniejszy jest VH3-23. Dopasowanie nr. ident. według Kabata z VH3-23 wskazuje, że reszty H74, H77 i(lub) H89 można wybierać do substytucji przez odpowiednie reszty linii płciowej (np. reszty H74, H77 i(lub) H89 przy porównaniu nr. ident. według Kabata i VH3-23). Podobnie najbardziej korzystne sekwencje linii płciowej, o największej identyczności wobec łańcucha lekkiego 3D6, obejmują A1, A17, A18, A2 i A19, przy czym najkorzystniejszy jest A19. Reszty niewykazujące dopasowania między wybranym akceptorowym regionem zrębowym łańcucha lekkiego a jedną z tych sekwencji linii płciowej można wybrać do substytucji odpowiednią resztą linii płciowej. [0098] W tabeli 1 podsumowano analizę sekwencji regionów VH i VL 3D6. Przedstawiono dodatkowe struktury mysie i ludzkie, które można wykorzystać do modelowania komputerowego przeciwciała 3D6 i dodatkowych przeciwciał ludzkich wraz z sekwencjami linii płciowej, które można wykorzystać do wyboru substytucji aminokwasowych. W tabeli 1 przedstawiono także rzadkie reszty mysie. Rzadkie reszty mysie identyfikuje się, porównując sekwencje donorowe VL i(lub) VH z sekwencjami innych przedstawicieli podgrupy, do której należą sekwencje donorowe VL i(lub) VH (według Kabata) i ustalając położenia reszt różniące się od sekwencji konsensusowej. Takie różnice specyficzne dla donora mogą wskazywać na mutacje somatyczne zwiększające aktywność. Reszty nietypowe lub rzadkie w pobliżu miejsca wiązania mogą ewentualnie stykać się z antygenem, przez co pożądane jest zachowanie reszty mysiej. Jeśli jednak nietypowa

42 43 reszta mysia nie jest istotna dla wiązania, korzystne jest zastosowanie odpowiedniej reszty akceptorowej, ponieważ reszta mysia może tworzyć immunogenne neoepitopy w przeciwciele humanizowanym. Jeśli reszta nietypowa w sekwencji donorowej jest w rzeczywistości wspólną resztą w odpowiedniej sekwencji akceptorowej, korzystną resztą jest oczywiście reszta akceptorowa. Tabela 1: Podsumowanie sekwencji regionu V 3D6 Łańcuch Ciężki Lekki Podgrupa mysia (nr ident. sekwencji wg Kabata) Homologi mysie (Kabat/Genbank) Rzadkie aminokwasy (% częstości występowania w klasie) IIID (002688) II ( , , ,005863) /163.1 CL /H-C6 CL / (A2-1) CL 0027/ASWA2 CL 0669/#14 CL N40 (0,233%) D42 (0,699%) / /42.4b.12.2 CL /BXW-14 CL /42.7B3.2 CL /36-60CRI- Y1 (0,0%) I (3,3%) D27 (0,867%)-CDR1 I78 (0,677%) L85 (0,6%) W89 (0,8%)-CDR3 K6A (0,295%) Podgrupa ludzka III ( ,000503, ) II (005046) Kanoniczne grupy CDR H1: klasa 1 [2fbj] według Chothia H2: klasa 3 [ligc] (przykład z pdb) Najbliższe rozwiązane struktury mysie Najbliższe rozwiązane struktury ludzkie Wyniki przeszukiwania linii płciowej (Hu) (4 najwyższe) Nr ident. PDB: 1OPG Kodandapani i wsp., patrz wyżej; (72% 2Å) 1VH (68%, nmr) 4460 (65%, IgG, szpiczak λ, 1,8Å) KOL/2FB4H (60%, szpiczak, 3Å) VH3-48 ( /BAA ) VH3-23 ( /BAA ) VH3-7 (45120/BAA ) VH3-21 ( /BAA ) VH3-11 (420/BAA ) L1: klasa 4 [1rmf] L2: klasa 1 [1lmk] L3: klasa 1 [1tet] Nr ident. PDB: 1CR9; Kanyo i wsp., patrz wyżej; (94%, 2Å) Nr ident. PDB: 1NLD; Davies i wsp., Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallog. 53:186 (1997); (98%, 2,8Å) 1LVE (57%, LEN) 1B6DA (54%, dimer B-J, 2,8Å); 1VGEL (54%, autoab) A1(x63402) A17 (x63403) A18 (X63396) A2 (m31952) A19 (x63397) * łańcuch ciężki i łańcuch lekki z tego samego przeciwciała (O-81, Hirabayashi i wsp. NAR :2601).

43 44 5 [0099] Numery ident. według Kabata wymienione w dokumencie są dostępne publicznie, na przykład w Kabat s Database of Sequences of Proteins of Immunological Interest (Bazie Danych Sekwencji Białek o Znaczeniu Immunologicznym Kabata) należącej do Wydziału Inżynierii Biomedycznej Northwestern University. Informacje o strukturze o trójwymiarowej przeciwciał omawianych w dokumencie są dostępne publicznie, na przykład w Protein Data Bank (PDB) należącym do Research Collaboratory for Structural Bioinformatics. PDB jest dostępny bez opłat przez Internet; został omówiony przez Berman i wsp. (00) Nucleic Acids Research, str Oryginalne sekwencje genów, o których mowa w dokumencie, są dostępne publicznie, na przykład w bazie danych sekwencji National Center for Biotechnology Information (NCBI) w zbiorach genów V linii płciowej Igh, Ig kappa i Ig lambda (oddział National Library of Medicine (NLM) w National Institutes of Health (NIH)). Poszukiwanie homologii genów linii płciowej Ig w NCBI zapewnia IgG BLAST. [00] W korzystnej postaci wykonania przeciwciało humanizowane według niniejszego wynalazku zawiera (i) łańcuch lekki, w skład którego wchodzi domena zmienna, zawierająca mysie CDR VL 3D6 i ludzki zrąb akceptorowy, przy czym w zrębie co najmniej jedna, korzystnie dwie, trzy lub cztery reszty wybrane z grupy składającej się z L1, L2, L36 i L46 są podstawione odpowiednią resztą z 3D6 i (ii) łańcuch ciężki, w skład którego wchodzi domena zmienna, zawierająca mysie CDR VH 3D6 i ludzki zrąb akceptorowy, przy czym w zrębie co najmniej jedna, korzystnie dwie lub trzy reszty, wybrane z grupy składającej się z H49, H93 i H94, są podstawione odpowiednią resztą z 3D6 i ewentualnie jedna, korzystnie dwie lub trzy reszty wybrane z grupy składającej się z H74, H77 i H89, są podstawione odpowiednią resztą ludzkiej linii płciowej. [01] W korzystniejszej postaci wykonania przeciwciało humanizowane według niniejszego wynalazku zawiera (i) łańcuch lekki, w skład którego wchodzi domena zmienna, zawierająca mysie CDR VL 3D6 i ludzki zrąb akceptorowy, przy czym w zrębie reszta

44 45 1 jest podstawiona tyr (Y), reszta 2 jest podstawiona val (V), reszta 36 jest podstawiona leu (L) i(lub) reszta 46 jest podstawiona arg (R) oraz (ii) łańcuch ciężki, w skład którego wchodzi domena zmienna, zawierająca mysie CDR VH 3D6 i ludzki zrąb akceptorowy, przy czym w zrębie reszta 49 jest podstawiona ala (A), reszta 93 jest podstawiona val (V) i(lub) reszta 94 jest podstawiona arg (R) i ewentualnie reszta 74 jest podstawiona ser (S), reszta 77 jest podstawiona thr (T) i(lub) reszta 89 jest podstawiona val (V). [02] W szczególnie korzystnej postaci wykonania przeciwciało humanizowane według niniejszego wynalazku ma cechy strukturalne opisane w niniejszym dokumencie i ponadto wykazuje co najmniej jedną (korzystnie dwie, trzy, cztery lub wszystkie) z następujących aktywności: (1) wiąże zagregowane Aβ1-42 (co ustala się np. na podstawie testu ELISA); (2) wiąże Aβ w blaszce (co ustala się np. w barwieniu blaszki AD i(lub) PDAPP); (3) wiąże Aβ z powinowactwem wiązania 2-3-krotnie większym w porównaniu do chimerowego 3D6 (np. 3D6 zawierającego sekwencje mysiego regionu zmiennego i sekwencje ludzkiego regionu stałego); (4) pośredniczy w fagocytozie Aβ (np. w teście fagocytozy ex vivo omawianym w niniejszym dokumencie) i (5) przenika przez barierę krew-mózg (np. wykazuje krótkotrwałą lokalizację w mózgu, na przykład w modelu zwierzęcym PDAPP omawianym w niniejszym dokumencie). [03] W innej postaci wykonania przeciwciało humanizowane według niniejszego wynalazku ma cechy strukturalne opisane w niniejszym dokumencie i wiąże Aβ w sposób wystarczający do wywołania co najmniej jednego z następujących działań in vivo lub z powinowactwem wystarczającym do wywołania co najmniej jednego z następujących działań in vivo: (1) zmniejszenie obciążenie blaszką Aβ; (2) zapobieganie tworzeniu blaszek; (3) zmniejszenie poziomu rozpuszczalnego Aβ; (4) zmniejszenie patologii neurytów związanej z zaburzeniem amyloidogennym; (5) zmniejszenie lub łagodzenie co najmniej jednego objawu fizjologicznego związanego z zaburzeniem amyloidogennym i(lub) (6) poprawa w zakresie czynności poznawczych.

45 46 [04] W innej postaci wykonania przeciwciało humanizowane według niniejszego wynalazku ma cechy strukturalne opisane w niniejszym dokumencie i wiąże się w sposób swoisty z epitopem zawierającym reszty 1-5 lub 3-7 Aβ. [05] Aktywność omawianą powyżej można oznaczyć, wykorzystując jeden z szeregu testów omawianych w niniejszym dokumencie lub znanych w stanie techniki (takich jak np. testy wiązania, testy fagocytozy itd.). Aktywność można oznaczać in vivo (np. z wykorzystaniem znakowanych elementów testu i(lub) metodami obrazowania) lub in vitro (np. z wykorzystaniem próbek pobranych od osobnika). Aktywność można oznaczać w sposób bezpośredni lub pośredni. W niektórych korzystnych postaciach wykonania bada się neurologiczne punkty końcowe (np. obciążenie amyloidem, obciążenie neurytów). Takie punkty końcowe można badać u osobników żywych (np. w modelach zwierzęcych choroby Alzheimera lub u ludzi, na przykład poddawanych immunoterapii) nieinwazyjnymi metodami wykrywania. Ewentualnie takie punkty końcowe można badać u osobników po śmierci. Badanie takich punktów końcowych w modelach zwierzęcych i(lub) u ludzi po śmierci jest użyteczne do oceny skuteczności różnych środków (np. przeciwciał humanizowanych), które mają być wykorzystywane w podobnych zastosowaniach immunoterapeutycznych. W innych korzystnych postaciach wykonania można oceniać parametry behawioralne lub neurologiczne jako wskaźniki aktywności neuropatologicznej lub punktów końcowych, o których mowa powyżej. 2. Wytwarzanie regionów zmiennych [06] Po dokonaniu koncepcyjnego wyboru CDR i składników zrębu przeciwciał humanizowanych można zastosować rozmaite metody wytwarzania takich immunoglobulin. W związku z degeneracją kodu sekwencja aminokwasowa każdej immunoglobuliny będzie kodowana przez wiele sekwencji kwasu nukleinowego. Pożądane sekwencje kwasu nukleinowego można wytwarzać na drodze syntezy DNA w fazie stałej de novo lub na drodze mutagenezy PCR otrzymanego wcześniej wariantu pożądanego polinukleotydu. Korzystną metodą uzyskiwania wariantów substytucyjnych, delecyjnych i

46 47 insercyjnych DNA odpowiedniego polipeptydu jest mutageneza z użyciem oligonukleotydów. Patrz Adelman i wsp., DNA 2:183 (1983). W skrócie, DNA odpowiedniego polipeptydu modyfikuje się przez hybrydyzację oligonukleotydu kodującego pożądaną mutację z jednoniciową matrycą DNA. Po hybrydyzacji wykorzystuje się polimerazę DNA do syntezy całej drugiej nici komplementarnej matrycy, która zawiera starter oligonukleotydowy i koduje wybraną zmianę DNA odpowiedniego polipeptydu. 3. Wybór regionów stałych [07] Segmenty zmienne przeciwciał wytworzonych zgodnie z powyższym opisem (np. regiony zmienne łańcucha ciężkiego i lekkiego przeciwciał chimerowych, humanizowanych lub ludzkich) są zazwyczaj połączone z co najmniej częścią regionu stałego immunoglobuliny (Fc), zazwyczaj immunoglobuliny ludzkiej. Ludzkie sekwencje DNA regionów stałych można izolować z różnych komórek człowieka, korzystnie jednak z unieśmiertelnionych limfocytów B, zgodnie z dobrze znanymi procedurami (patrz Kabat i wsp., patrz wyżej i Liu i wsp., W087/02671)). Przeciwciało zawiera zazwyczaj regiony stałe zarówno łańcucha lekkiego, jak i ciężkiego. Region stały łańcucha ciężkiego obejmuje zazwyczaj regiony CH1, zawiasowy, CH2, CH3 i CH4. Do przeciwciał opisywanych w niniejszym dokumencie należą przeciwciała zawierające wszystkie rodzaje regionów stałych, w tym IgM, IgG, IgD, IgA i IgE oraz dowolny izotyp, w tym IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. Wybór regionu stałego zależy częściowo od tego, czy pożądana jest zależna od przeciwciał toksyczność dopełniacza i(lub) komórkowa. Izotypy IgG1 i IgG3 wykazują na przykład aktywność wobec dopełniacza, izotypy IgG2 i IgG4 zaś jej nie wykazują. Jeśli pożądane jest, aby przeciwciało (np. przeciwciało humanizowane) wykazywało aktywność cytotoksyczną, domena stała stanowi zazwyczaj domenę stałą wiążącą dopełniacz, klasą zaś jest zwykle IgG1. Jeśli taka aktywność cytotoksyczna nie jest pożądana, domena stała może należeć do klasy IgG2. Wybór izotypu może także wpływać na przenikanie przeciwciała do mózgu. Korzystny jest ludzki izotyp IgG1. Regionami stałymi łańcucha lekkiego mogą być lambda lub kappa. Przeciwciało

47 48 humanizowane może zawierać sekwencje pochodzące z więcej niż jednej klasy lub izotypu. Przeciwciała mogą ulegać ekspresji jako tetramery zawierające dwa łańcuchy lekkie i dwa ciężkie, jako oddzielne łańcuchy ciężkie, łańcuchy lekkie, jako Fab, Fab, F(ab )2 i Fv lub jako przeciwciała jednołańcuchowe, w których domeny zmienne łańcucha ciężkiego i lekkiego są połączone łącznikiem. 4. Ekspresja przeciwciał rekombinowanych [08] Przeciwciała chimerowe, humanizowane i ludzkie wytwarza się zazwyczaj poprzez ekspresję rekombinacyjną. Kwasy nukleinowe kodujące regiony zmienne łańcucha lekkiego i ciężkiego, ewentualnie połączone z regionami stałymi, wprowadza się do wektorów ekspresyjnych. Łańcuchy lekkie i ciężkie można klonować w tych samych lub różnych wektorach ekspresyjnych. Segmenty DNA kodujące łańcuchy immunoglobulinowe są funkcjonalnie połączone z sekwencjami regulacyjnymi w wektorze lub wektorach ekspresyjnych, zapewniających ekspresję polipeptydów immunoglobulinowych. Do sekwencji regulujących ekspresję należą między innymi promotory (np. promotory powiązane w sposób naturalny lub heterologiczne), sekwencje sygnałowe, elementy wzmacniające i sekwencje terminacji transkrypcji. Korzystnie, sekwencje regulujące ekspresję stanowią systemy promotorów eukariotycznych w wektorach zdolnych do transformacji lub transfekcji eukariotycznych komórek gospodarza. Po wprowadzeniu wektora do odpowiedniego gospodarza gospodarz ten jest utrzymywany w warunkach odpowiednich do uzyskania wysokiego poziomu ekspresji sekwencji nukleotydowych oraz zebrania i oczyszczenia przeciwciał reagujących krzyżowo. [09] Takie wektory ekspresyjne mogą zazwyczaj ulegać replikacji w organizmach gospodarza jako episomy lub jako integralna część chromosomowego DNA gospodarza. Wektory ekspresyjne często zawierają markery selekcyjne (np. oporności na ampicylinę, oporności na higromycynę, oporności na tetracyklinę lub oporności na neomycynę), umożliwiające wykrywanie komórek transformowanych pożądanymi sekwencjami DNA (patrz np. Itakura i wsp., patent Stanów Zjednoczonych Ameryki

48 49 4,704,362). [01] Jednym z gospodarzy prokariotycznych, szczególnie użytecznym do klonowania polinukleotydów (np. sekwencji DNA) według niniejszego wynalazku, jest E. coli. Do innych gospodarzy bakteryjnych odpowiednich do zastosowania należą laseczki, na przykład Bacillus subtilis oraz inne Enterobacteriaceae, na przykład Salmonella, Serratia i różne gatunki Pseudomonas. U tych gospodarzy prokariotycznych można także wytwarzać wektory ekspresyjne, które zazwyczaj zawierają sekwencje regulujące ekspresję, dostosowane do komórki gospodarza (np. początek replikacji). Ponadto występuje dowolna liczba różnorodnych dobrze znanych promotorów, na przykład system promotora laktozy, system promotora tryptofanu (trp), system promotora betalaktamazy lub system promotora z faga lambda. Promotory zazwyczaj regulują ekspresję, ewentualnie z udziałem sekwencji operatorowej, i zawierają sekwencje miejsc wiązania rybosomu i tym podobne, do inicjacji i prowadzenia transkrypcji i translacji. [0111] Do ekspresji użyteczne są także inne drobnoustroje, takie jak drożdże. Korzystnym gospodarzem drożdżowym są Saccharomyces, przy czym odpowiednie wektory zawierają sekwencje regulujące ekspresję (np. promotory), początek replikacji, sekwencje terminacji i inne, zależnie od potrzeb. Do typowych promotorów należą promotory kinazy 3-fosfoglicerynianowej i innych enzymów glikolitycznych. Do indukowalnych promotorów drożdży należą między innymi promotory dehydrogenazy alkoholowej, izocytochromu C i enzymów odpowiedzialnych za wykorzystanie maltozy i galaktozy. [0112] Oprócz drobnoustrojów do ekspresji i wytwarzania polipeptydów według niniejszego wynalazku (np. polinukleotydów kodujących immunoglobuliny lub ich fragmenty) można także wykorzystywać hodowle komórek tkanek ssaków. Patrz Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987). Korzystne są w istocie komórki eukariotyczne, ponieważ w stanie techniki znanych jest wiele odpowiednich linii komórek gospodarza zdolnych do wydzielania białek heterologicznych (np.

49 50 niezmienionych immunoglobulin), takich jak linie komórkowe CHO, różne linie komórkowe Cos, komórki HeLa, korzystnie linie komórkowe szpiczaka lub transformowane komórki B lub hybrydomy. Korzystnie, komórki są inne niż ludzkie. Wektory ekspresyjne do tych komórek mogą zawierać sekwencje regulujące ekspresję, na przykład początek replikacji, promotor i wzmacniacz (Queen i wsp., Immunol. Rev. 89:49 (1986)) oraz niezbędne miejsca obróbki informacji, takie jak miejsca wiązania rybosomu, miejsca splicingu RNA, miejsca poliadenylacji oraz sekwencje terminacji transkrypcji. Do korzystnych sekwencji regulujących ekspresję należą promotory pochodzące z genów immunoglobulin, SV40, adenowirusów, wirusa brodawczaka bydlęcego, cytomegalowirusa i innych. Patrz Co i wsp., J. Immunol. 148:1149 (1992). [0113] Ewentualnie sekwencje kodujące przeciwciała można umieścić w transgenach celem wprowadzenia do genomu zwierzęcia transgenicznego i późniejszej ekspresji w mleku zwierzęcia transgenicznego (patrz np. Deboer i wsp., US 5,741,957, Rosen, US 5,4,489 oraz Meade i wsp., US 5,849,992). Do odpowiednich transgenów należą sekwencje kodujące łańcuchy lekkie i(lub) ciężkie, połączone funkcjonalnie z promotorem i wzmacniaczem z genu swoistego dla gruczołu sutkowego, na przykład kazeiny lub beta-laktoglobuliny. [0114] Wektory zawierające odpowiednie sekwencje polinukleotydowe (np. sekwencje kodujące łańcuchy ciężki i lekki oraz sekwencje regulujące ekspresję) można przenosić do komórki gospodarza dobrze znanymi metodami, zależnymi od rodzaju komórki gospodarza. W przypadku komórek prokariotycznych często wykorzystuje się na przykład transfekcję z użyciem chlorku wapnia, w przypadku innych komórek gospodarza można zaś zastosować fosforan wapnia, elektroporację, lipofekcję, biolistykę lub transfekcję z udziałem wirusa (patrz ogólnie Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, wyd. 2, 1989). Do innych metod wykorzystywanych do transformacji komórek ssaków należą zastosowanie polibrenu, fuzji protoplastów, liposomów, elektroporacji i mikroiniekcji (patrz ogólnie Sambrook i wsp.,

50 51 jak wyżej). W przypadku uzyskiwania zwierząt transgenicznych transgeny można wprowadzać poprzez mikroiniekcję do zapłodnionych oocytów lub można je wprowadzać do genomu zarodkowych komórek macierzystych i jądra takich komórek wprowadzać do oocytów pozbawionych jądra. [01] Jeśli łańcuchy ciężkie i lekkie klonuje się w oddzielnych wektorach ekspresyjnych, wektory poddaje się kotransfekcji, aby uzyskać ekspresję i składanie niezmienionych immunoglobulin. Po ekspresji całe przeciwciała, ich dimery, pojedyncze łańcuchy lekkie i ciężkie lub inne formy immunoglobulin według niniejszego wynalazku można oczyszczać z zastosowaniem standardowych procedur znanych w stanie techniki, w tym wytrącania siarczanem amonu, kolumn powinowactwa, chromatografii kolumnowej, oczyszczania metodą HPLC, elektroforezy na żelu i innych (patrz ogólnie Scopes, Protein Purification (Springer- Verlag, N.Y., (1982)). Do zastosowania farmaceutycznego orzystne są zasadniczo czyste immunoglobuliny o jednorodności co najmniej około 90-95%, a korzystniejsze są immunoglobuliny o jednorodności 98-99% lub większej są najbardziej korzystne. 5. Badanie skuteczności terapeutycznej przeciwciał na modelach zwierzęcych [0116] Osobnikom z grup myszy PDAPP w wieku 7-9 miesięcy wstrzyknięto 0,5 mg przeciwciał poliklonalnych anty-aβ lub swoistych monoklonalnych anty-aβ w PBS. Wszystkie preparaty przeciwciał oczyszczono, aby uzyskać niski poziom endotoksyn. Można otrzymać przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko fragmentowi, wstrzykując myszy fragment lub dłuższą formę Aβ, wytwarzając hybrydomy i wykonując badanie przesiewowe hybrydom w kierunku przeciwciał, wiążących się swoiście z pożądanym fragmentem Aβ bez wiązania z nienakładającymi się fragmentami Aβ. [0117] Wstrzyknięcia u myszy wykonuje się dootrzewnowo zależnie od potrzeb przez okres 4 miesięcy, tak aby utrzymać stężenie przeciwciał krążących mierzone w teście ELISA ponad 1/00 wobec testu ELISA dla Aβ42 lub innego immunogenu. Miana monitoruje się i myszy usypia się pod koniec 6 miesiąca wstrzykiwania. Po

51 52 uśpieniu wykonuje się badania histochemiczne, poziomu Aβ i toksykologiczne. Grupy liczą po myszy. 6. Badanie przesiewowe przeciwciał pod kątem aktywności usuwania określonych substancji [0118] Wynalazek dotyczy także sposobów badań przesiewowych przeciwciał pod kątem aktywności polegającej na usuwaniu złogów amyloidowych lub innego antygenu bądź powiązanej jednostki biologicznej, której usuwanie jest pożądane jako aktywność. W celu zbadania przesiewowego aktywności przeciwko złogom amyloidowym próbkę tkanki mózgowej pacjenta z chorobą Alzheimera lub modelu zwierzęcego o patologii charakterystycznej dla choroby Alzheimera styka się z komórkami fagocytującymi, posiadającymi receptor Fc, takimi jak komórki mikrogleju, i z badanym przeciwciałem w ośrodku in vitro. Komórki fagocytujące mogą stanowić hodowlę pierwotną lub linię komórkową, taką jak na przykład BV-2, C8-B4 lub THP-1. W niektórych sposobach składniki łączy się na szkiełku mikroskopowym, aby ułatwić kontrolę mikroskopową. W niektórych sposobach przeprowadza się równolegle wiele reakcji w dołkach płytki do mikromiareczkowania. W takim wypadku można zamontować oddzielne miniaturowe szkiełko mikroskopowe w oddzielnych studzienkach lub można zastosować inną niż mikroskopowa metodę detekcji, na przykład wykrywanie Aβ testem ELISA. Korzystnie, wykonuje się serię pomiarów ilości złogów amyloidowych w mieszaninie reakcyjnej in vitro, od wartości początkowej przed rozpoczęciem reakcji, z jedną lub większą liczbą wartości badanych podczas reakcji. Antygen można wykrywać na przykład przez barwienie z użyciem przeciwciała znakowanego fluorescencyjnie przeciwko Aβ lub innemu składnikowi blaszki amyloidowej. Przeciwciało stosowane do barwienia może być identyczne z przeciwciałem badanym w kierunku aktywności usuwania, ale może też nie być identyczne. Zmniejszenie ilości złogów amyloidowych podczas reakcji w porównaniu z wartością początkową wskazuje, że badane przeciwciało wykazuje aktywność usuwania. Jest prawdopodobne, że takie przeciwciała będą użyteczne w profilaktyce lub leczeniu choroby Alzheimera i innych chorób amyloidogennych.

52 53 [0119] W celu przesiewowego zbadania aktywności przeciwciał, polegającej na usuwaniu innych rodzajów jednostek biologicznych, można zastosować metody analogiczne. Test można wykorzystywać do wykrywania aktywności usuwania absolutnie dowolnego rodzaju jednostek biologicznych. Zazwyczaj jednostka biologiczna ma pewne znaczenie w chorobie ludzkiej lub zwierzęcej. Jednostka biologiczna może mieć postać próbki tkanki lub postać wyizolowaną. Jeśli ma ona postać próbki tkanki, korzystnie, próbka tkanki nie jest utrwalona, co zapewnia łatwy dostęp do składników próbki tkanki i uniknięcie zakłócenia konformacji składników wskutek utrwalania. Przykłady próbek tkanek, które można badać w tym teście, obejmują tkankę nowotworową, tkankę przednowotworową, tkankę zawierającą łagodne rozrosty, takie jak brodawki lub znamiona, tkankę zakażoną drobnoustrojami chorobotwórczymi, tkankę nacieczoną komórkami zapalnymi, tkankę zawierającą między komórkami substancję patologiczną (np. włókniste zapalenie osierdzia), tkankę zawierającą nieprawidłowe antygeny i tkankę bliznowatą. Przykłady wyizolowanych jednostek biologicznych, które można wykorzystać, obejmują Aβ, antygeny wirusowe lub wirusy, proteoglikany, antygeny innych drobnoustrojów chorobotwórczych, antygeny nowotworowe i cząsteczki adhezyjne. Takie antygeny można otrzymać między innymi ze źródeł naturalnych, na drodze ekspresji rekombinacyjnej lub syntezy chemicznej. Próbkę tkanki lub wyizolowaną jednostkę biologiczną styka się z komórkami fagocytującymi, posiadającymi receptory Fc, takimi jak monocyty lub komórki mikrogleju, i z badanym przeciwciałem w ośrodku. Przeciwciało może być skierowane przeciwko badanej jednostce biologicznej lub przeciwko antygenowi związanemu z tą jednostką. W drugiej z tych sytuacji celem jest zbadanie, czy jednostka biologiczna ulega fagocytozie za pośrednictwem antygenu. Zazwyczaj, chociaż niekoniecznie, przeciwciało i jednostkę biologiczną (niekiedy z powiązanym z nim antygenem) styka się ze sobą przed dodaniem do komórek fagocytujących. Następnie monitoruje się stężenie jednostki biologicznej i(lub) pozwiązanego antygenu pozostającego w ośrodku, jeśli występuje.

53 54 Zmniejszenie ilości lub stężenia antygenu lub powiązanej jednostki biologicznej w ośrodku wskazuje, że przeciwciało wykazuje odpowiedź usuwającą przeciwko antygenowi i(lub) powiązanej jednostce biologicznej w połączeniu z komórkami fagocytującymi (patrz np. przykład IV). 7. Przeciwciała chimerowe i humanizowane o zmienionej funkcji efektorowej [01] Omawiane powyżej przeciwciała według wynalazku zawierają region stały (region Fc) o zmienionej funkcji efektorowej cząsteczki. Zasadniczo funkcja efektorowa przeciwciała jest zlokalizowana w regionie stałym, czyli Fc cząsteczki, który może pośredniczyć w wiązaniu z różnymi cząsteczkami efektorowymi, np. białkami dopełniacza lub receptorami Fc. Wiązanie dopełniacza z regionem Fc jest istotne na przykład w opsonizacji i lizie patogenów komórkowych oraz aktywacji reakcji zapalnej. Wiązanie przeciwciała na przykład z receptorami Fc na powierzchni komórek efektorowych może uruchamiać szereg istotnych i różnorodnych reakcji biologicznych, w tym na przykład otaczanie i niszczenie patogenów lub cząstek pokrytych przeciwciałami, usuwanie kompleksów immunologicznych, lizę komórek docelowych pokrytych przeciwciałami przez komórki cytotoksyczne (tzn. cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał, ang. ADCCC), uwalnianie czynników pośredniczących w reakcji zapalnej, przenikanie przeciwciał przez łożysko i regulację wytwarzania immunoglobulin. [0121] W związku z tym, zależnie od określonego zastosowania terapeutycznego lub diagnostycznego pożądane mogą być powyższe funkcje immunologiczne lub jedynie wybrane funkcje immunologiczne. Wskutek zmiany regionu Fc przeciwciała uzyskuje się różne aspekty funkcji efektorowych cząsteczki, w tym zwiększanie lub hamowanie różnych reakcji układu odpornościowego ze skutkami korzystnymi dla diagnostyki i leczenia. [0122] Można wytwarzać przeciwciała według wynalazku, reagujące jedynie z niektórymi rodzajami receptorów Fc, na przykład przeciwciała według wynalazku można modyfikować tak, żeby wiązały się jedynie z niektórymi receptorami Fc lub w razie

54 55 potrzeby w ogóle nie wiązały się z receptorami Fc, poprzez delecję lub modyfikację miejsca wiązania receptora Fc, zlokalizowanego w regionie Fc przeciwciała. Pozostałe pożądane modyfikacje regionu Fc przeciwciała według wynalazku wymieniono poniżej. Zazwyczaj do zaznaczania, która reszta lub reszty aminokwasowe regionu Fc (np. przeciwciała IgG) są zmodyfikowane (np. przez substytucję aminokwasu) w celu uzyskania pożądanej zmiany funkcji efektorowej, wykorzystuje się system numeracji według Kabata. Ten system numeracji wykorzystuje się także do porównywania przeciwciał między gatunkami, tak że pożądaną funkcję efektorową obserwowaną na przykład w przeciwciele mysim można wtedy w sposób systematyczny wprowadzić do przeciwciała ludzkiego, humanizowanego lub chimerowego według wynalazku. [0123] Stwierdzono na przykład, że przeciwciała (np. przeciwciała IgG) można pogrupować w przeciwciała, które wykazują silne, pośrednie lub słabe wiązanie z receptorem Fc (np. receptor Fc ludzkich monocytów (FcγRI)). Przez porównanie sekwencji aminokwasowych tych grup o różnym powinowactwie zidentyfikowano miejsce wiązania monocytów w regionie łączącym zawiasu (Leu234-Ser239). Ponadto ludzki receptor FcγRI wiąże się z ludzką IgG1 i mysią IgG2a jako monomer, jednak wiązanie mysiej IgG2b jest 0-krotnie słabsze. Porównanie sekwencji tych białek w regionie łączącym zawiasu wykazuje, że sekwencja , tzn. Leu-Leu-Gly-Gly-Pro, w białkach wiążących się silnie staje się Leu-Glu-Gly-Gly-Pro w mysich gamma 2b, czyli białkach wiążących się słabo. W związku z tym do sekwencji zawiasu przeciwciała ludzkiego można wprowadzić odpowiednią zmianę, jeśli pożądane jest zmniejszone wiązanie receptora FcγI. Należy rozumieć, że można wprowadzać inne modyfikacje, aby uzyskać te same lub podobne wyniki. Powinowactwo wiązania FcγRI można na przykład zmodyfikować przez zastąpienie określonej reszty inną resztą, zawierającą nieodpowiednią grupę funkcjonalną w łańcuchu bocznym, lub przez wprowadzanie naładowanej elektrycznie grupy funkcyjnej (np. Glu lub Asp) albo na przykład aromatycznej reszty niepolarnej (np. Phe, Tyr lub Trp).

55 56 [0124] Te zmiany można wprowadzać również do układów mysich, ludzkich i szczurzych, zważywszy na homologię sekwencji między różnymi immunoglobulinami. Stwierdzono, że w przypadku ludzkiej IgG3, która wiąże się z ludzkim receptorem FcγRI, zmiana Leu 2 na Glu znosi oddziaływanie mutanta z receptorem. W związku z tym miejsce wiązania dla tego receptora można włączać i wyłączać, wprowadzając odpowiednią mutację. [01] Mutacje na sąsiadujących ze sobą lub położonych w pobliżu miejscach regionu łączącego zawiasu (np. zastąpienie reszt 234, 236 lub 237 przez Ala) wskazują, że modyfikacje reszt 234, 2, 236 i 237 co najmniej wpływają na powinowactwo do receptora FcγRI. W związku z tym przeciwciała według wynalazku mają zmieniony region Fc ze zmienionym powinowactwem wiązania FcγRI w porównaniu z przeciwciałem niezmodyfikowanym. Takie przeciwciało zawiera, korzystnie, modyfikację reszty aminokwasowej 234, 2, 236 lub 237. [0126] W podobny sposób można zmieniać powinowactwo do innych receptorów Fc w celu regulowania odpowiedzi odpornościowej w różny sposób. [0127] Kolejnym przykładem jest możliwość zmiany właściwości litycznych przeciwciał IgG po związaniu ze składnikiem CI dopełniacza. [0128] Pierwszy składnik układu dopełniacza, CI, obejmuje trzy białka oznaczane jako Clq, Ck i Cls, które silnie wiążą się ze sobą. Wykazano, że CIq jest odpowiedzialne za wiązanie kompleksu tych trzech białek z przeciwciałem. [0129] W związku z tym aktywność wiązania CIq przeciwciała można modyfikować, uzyskując przeciwciało o zmienionej domenie CH 2, w której co najmniej jedna z reszt aminokwasowych 318, 3 i 322 łańcucha ciężkiego została zastąpiona resztą z innym łańcuchem bocznym. Numeracja reszt łańcucha ciężkiego jest zgodna z indeksem EU (patrz Kabat i wsp., patrz wyżej). Do innych odpowiednich modyfikacji służących do zmiany, np. zmniejszania lub znoszenia, swoistego wiązania CIq z przeciwciałem, należą zmiana jednej z reszt 318 (Glu), 3 (Lys) i 322 (Lys) na Ala.

56 57 [01] Ponadto, wprowadzając mutację w tych resztach wykazano, że wiązanie CIq jest zachowywane, pod warunkiem, że reszta 318 zawiera łańcuch boczny wiążący atom wodoru, a obie reszty 3 i 322 zawierają łańcuch boczny naładowany dodatnio. [0131] Aktywność wiązania CIq można znieść, zastępując dowolną z trzech określonych reszt inną resztą z nieodpowiednią grupą funkcyjną w łańcuchu bocznym. Do zniesienia wiązanie CIq nie jest konieczne zastępowanie jedynie reszt jonowych przez Ala. W celu zniesienia wiązania CIq można także wykorzystywać reszty niejonowe z podstawnikiem alkilowym, takich jak Gly, Ile, Leu lub Val, lub aromatyczne reszty niepolarne, takie jak Phe, Tyr, Trp i Pro, w miejscu którejkolwiek z trzech reszt. W celu zniesienia aktywności wiązania CIq można także zastosować polarne reszty niejonowe, takie jak Ser, Thr, Cys i Met, w miejsce reszt 3 i 322, ale nie 318. [0132] Należy ponadto zauważyć, że łańcuchy boczne jonowych lub niejonowych reszt polarnych są zdolne do tworzenia wiązań wodorowych w sposób podobny do wiązań tworzonych przez resztę Glu. Zastąpienie reszty 318 (Glu) resztą polarną może więc doprowadzić do zmiany, ale nie zniesienia aktywności wiązania CIq. [0133] Wiadomo ponadto, że zastąpienie reszty 297 (Asn) przez Ala powoduje eliminację aktywności litycznej, jedynie w niewielkim stopniu (około trzykrotnie) zmniejsza zaś powinowactwo do CIq. Ta modyfikacja niszczy miejsce glikozylacji i eliminuje obecność węglowodanu niezbędną do aktywacji dopełniacza. Każda inna substytucja w tym miejscu także niszczy miejsce glikozylacji. [0134] Wynalazek dotyczy także przeciwciała o zmienionej funkcji efektorowej, przy czym przeciwciało ma zmieniony region zawiasowy. Zmodyfikowany region zawiasowy może zawierać pełny region zawiasowy pochodzący od przeciwciała z innej klasy lub podklasy przeciwciał w porównaniu do domeny CH1. Do regionu zawiasowego przeciwciała klasy IgG4 może być na przykład dołączona domena stała (CH1) przeciwciała klasy IgG. Ewentualnie nowy region zawiasowy może zawierać część naturalnego zawiasu

57 58 lub jednostkę powtarzającą się, w których każda jednostka w powtórzeniu pochodzi od naturalnego regionu zawiasowego. W jednym z przykładów naturalny region zawiasowy jest zmodyfikowany przez przekształcenie jednej lub więcej reszt cysteiny w resztę obojętną, na przykład alaninę, lub przez przekształcenie odpowiednio zlokalizowanych reszt w reszty cysteiny. Takie modyfikacje wprowadza się metodami chemii białek uznawanymi w stanie techniki i, korzystnie, metodami inżynierii genetycznej opisywanych w niniejszym dokumencie. [01] W jednej z postaci wykonania wynalazku zmniejsza się liczbę reszt cysteiny w regionie zawiasowym przeciwciała, na przykład do jednej reszty cysteiny. Modyfikacja ta ma zaletę polegającą na ułatwieniu składania przeciwciała, na przykład dwuswoistych cząsteczek przeciwciał i cząsteczek przeciwciał, w których część Fc została zastąpiona cząsteczką efektorową lub reporterową, ponieważ jest ona niezbędna jedynie do wytworzenia pojedynczego mostka dwusiarczkowego. Taka modyfikacja zapewnia ponadto swoiste miejsce docelowe do dołączenia regionu zawiasowego do innego regionu zawiasowego lub do cząsteczki efektorowej lub reporterowej, w sposób bezpośredni lub pośredni, na przykład metodami chemicznymi. [0136] W odwrotnym przypadku zwiększa się liczbę reszt cysteiny w regionie zawiasowym przeciwciała, na przykład co najmniej o jedną więcej od liczby normalnie występujących reszt cysteiny. Zwiększenie liczby reszt cysteiny można wykorzystać do stabilizacji oddziaływań między sąsiednimi zawiasami. Inną zaletą tej modyfikacji jest ułatwienie wykorzystania grup tiolowych cysteiny do przyłączania cząsteczek efektorowych lub reporterowych do zmodyfikowanego przeciwciała, na przykład znacznika promieniotwórczego. [0137] W związku z tym wynalazek dotyczy wymiany regionów zawiasowych między klasami przeciwciał, w szczególności klasami IgG, i(lub) zwiększenia lub zmniejszenia liczby reszt cysteiny w regionie zawiasowym w celu uzyskania zmienionej funkcji efektorowej (patrz na przykład patent Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5,677,4). Określenie zmodyfikowanej funkcji

58 59 efektorowej przeciwciała przeprowadza się z użyciem testów opisywanych w niniejszym dokumencie lub innych metod znanych w stanie techniki. [0138] Co istotne, powstałe przeciwciało można poddawać jednemu lub większej liczbie testów w celu oceny zmiany aktywności biologicznej w porównaniu z przeciwciałem wyjściowym. Można na przykład dokonywać oceny zdolności przeciwciała o zmienionym regionie Fc do wiązania dopełniacza lub receptorów Fc na drodze testów ujawnianych w niniejszym dokumencie, a także dowolnych testów znanych w stanie techniki. [0139] Wytwarzanie przeciwciał według wynalazku prowadzi się dowolną odpowiednią metodą, w tym metodami opisywanymi w niniejszym dokumencie, a także metodami znanymi specjalistom z danej dziedziny. Można na przykład zsyntetyzować odpowiednią sekwencję białkową, np. tworzącą część lub całość odpowiedniej domeny stałej, np. regionu Fc, tzn. domeny lub domen CH2 i(lub) CH3 przeciwciała i obejmującą odpowiednio zmienioną resztę lub reszty, i następnie połączyć ją chemicznie z odpowiednim miejscem cząsteczki przeciwciała. [0140] Korzystnie, do wytworzenia zmodyfikowanego przeciwciała wykorzystuje się metody inżynierii genetycznej. Do korzystnych metod należą na przykład otrzymywanie odpowiednich starterów do zastosowania w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), w taki sposób, że zmodyfikowana zostaje sekwencja DNA, kodująca co najmniej część łańcucha ciężkiego IgG, np. regionu Fc, czyli stałego (np. CH2 i(lub) CH3), na jednej lub większej liczbie reszt. Następnie segment można połączyć funkcjonalnie z pozostałą częścią przeciwciała, np. z regionem zmiennym przeciwciała i elementami regulatorowymi niezbędnymi do ekspresji w komórce. [0141] Niniejszy wynalazek dotyczy ponadto wektorów wykorzystywanych do transformacji linii komórkowej, wektorów wykorzystywanych do otrzymywania wektorów do transformacji, linii komórkowych transformowanych wektorami do transformacji, linii komórkowych transformowanych wektorami preparatywnymi i sposobów ich wytwarzania.

59 60 [0142] Korzystnie, linia komórkowa transformowana w celu uzyskania przeciwciała ze zmodyfikowanym regionem Fc (tzn. zmienioną funkcją efektorową) stanowi unieśmiertelnioną ludzką linię komórkową (np. komórki CHO). [0143] Jakkolwiek linią komórkową wykorzystywaną do wytwarzania przeciwciała ze zmodyfikowanym regionem Fc jest korzystnie linia komórkowa ssaka, można ewentualnie wykorzystać dowolną inną odpowiednią linię komórkową, na przykład bakteryjną linię komórkową lub linię komórkową drożdży. B. Kwas nukleinowy kodujący czynniki immunologiczne i terapeutyczne [0144] Odpowiedź odpornościową przeciwko złogom amyloidowym można także indukować przez podawanie kwasów nukleinowych kodujących przeciwciała oraz łańcuchów, które się na nie składają, wykorzystywanych do immunizacji biernej. Takim kwasami nukleinowymi mogą być DNA lub RNA. Segment kwasu nukleinowego kodujący immunogen jest zazwyczaj połączony z elementami regulatorowymi, takimi jak promotor i wzmacniacz, które umożliwiają ekspresję segmentu DNA w odpowiednich komórkach docelowych pacjenta. W przypadku ekspresji w komórkach krwi, co jest pożądane do indukcji odpowiedzi immunologicznej, do ukierunkowywania ekspresji odpowiednie są elementy promotorowe i wzmacniające genów łańcuchów lekkich lub ciężkich immunoglobulin lub główny wczesny pośredni promotor i wzmacniacz CMV. Połączone elementy regulatorowe i sekwencje kodujące klonuje się często do wektora. W celu podawania przeciwciał z dwoma łańcuchami oba łańcuchy można klonować do tych samych lub różnych wektorów. [0145] Dostępnych jest wiele układów wektorów wirusowych, w tym układy retrowirusowe (patrz np. Lawrie i Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3:2-9 (1993)), układy adenowirusowe (patrz np. Bett i wsp., J. Virol. 67:5911 (1993)), układy wirusów związanych z adenowirusami (adenosatelitarnych) (patrz np. Zhou i wsp., J. Exp. Med. 179:1867 (1994)), wektory wirusowe z rodziny pokswirusów, w tym wirus krowianki i wirusy ospy ptasiej, wektory wirusowe z rodzaju alfawirusów, na przykład pochodzące od wirusów Sindbis i Semliki Forest (patrz np.

60 61 Dubensky i wsp., J. Virol. 70:508 (1996)), wirus wenezuelskiego wirusa końskiego zapalenia mózgu (patrz Johnston i wsp., US 5,643,576) i rabdowirusy, takie jak wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (patrz Rose, WO 96/346) oraz wirusy brodawczaka (Ohe i wsp., Human Gene Therapy 6:3 (1995), Woo i wsp., WO 94/12629 oraz Xiao i Brandsma, Nucleic Acids. Res. 24, (1996)). [0146] DNA kodujący immunogen lub wektor go zawierający można wprowadzać do liposomów. Odpowiednie lipidy i powiązane analogi zostały opisane przez Eppstein i wsp., US 5,8,036, Felgner i wsp., US 5,264,618, Rose, US 5,279,833 i Epand i wsp., US 5,283,185. Wektory i DNA kodujące immunogen można także adsorbować lub dołączać do odpowiednich nośników, do których należą na przykład polimery poli(metakrylanu metylu) i polilaktydy oraz kopolimery laktydów i glikolidów, patrz np. McGee i wsp., J. Micro Encap. (1996). [0147] Wektory do terapii genowej lub nagie polipeptydy (np. DNA) można dostarczać in vivo przez podawanie konkretnemu pacjentowi, zazwyczaj ogólnoustrojowo (np. dożylnie, dootrzewnowo, donosowo, dożołądkowo, śródskórnie, domięśniowo, podskórnie lub przez wlew doczaszkowy) bądź zewnętrznie (patrz np. Anderson i wsp., US 5,399,346). Określenie nagi polinukleotyd oznacza polinukleotyd nieskompleksowany z materiałami koloidowymi. Nagie polinukleotydy klonuje się niekiedy do wektora plazmidowego. Takie wektory mogą ponadto obejmować środki ułatwiające wnikanie, takie jak bupiwakaina (Attardo i wsp., US 5,593,970). DNA można także podawać za pomocą strzelby genowej. Patrz Xiao i Brandsma, jak wyżej. DNA kodujący immunogen wytrąca się na powierzchni mikroskopijnych metalowych kulek. Mikropociski przyspiesza się z użyciem fali uderzeniowej lub rozszerzającego się gazowego helu; wnikają one w tkanki do głębokości kilku warstw komórek. Odpowiednie jest na przykład urządzenie do podawania genów Accel wytwarzane przez Agacetus, Inc. Middleton, WI, USA. Ewentualnie nagi DNA może przenikać przez skórę do krwiobiegu po prostu przez nałożenie

61 62 DNA na skórę podrażnioną chemicznie lub mechanicznie (patrz Howell i wsp., WO 95/05853). [0148] W kolejnej odmianie wektory kodujące immunogeny można dostarczać do komórek ex vivo, na przykład komórek pobranych od konkretnego pacjenta (np. limfocytów, aspiratów szpiku kostnego, bioptatów tkankowych) lub uniwersalnych, pochodzących od dawców macierzystych komórek krwiotwórczych, a następnie ponownie wszczepiać komórki pacjentowi, zazwyczaj po selekcji pod kątem komórek, do których wektor wniknął. II. Zastosowania profilaktyczne i terapeutyczne [0149] Niniejszy wynalazek dotyczy między innymi leczenia choroby Alzheimera i innych chorób amyloidogennych przez podawanie pacjentowi terapeutycznych czynników immunologicznych (np. humanizowanych immunoglobulin) wobec określonych epitopów w obrębie Aβ w warunkach, w których u pacjenta powstaje korzystna odpowiedź lecznicza (np. indukcja fagocytozy Aβ, zmniejszenie obciążenia blaszką, hamowanie wytwarzania blaszki, zmniejszenie dystrofii neurytów, poprawa czynności poznawczych i(lub) odwrócenie, leczenie lub profilaktyka zaniku funkcji poznawczych) u pacjenta, na przykład w celu profilaktyki lub leczenia choroby amyloidogennej. Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania ujawnionych czynników immunologicznych (np. immunoglobulin humanizowanych) do wytwarzania leku do profilaktyki lub leczenia choroby amyloidogennej. [00] Określenie leczenie stosowane w dokumencie oznacza zastosowanie lub podawanie czynnika terapeutycznego pacjentowi bądź zastosowanie lub podawanie czynnika terapeutycznego do tkanki lub linii komórkowej pobranej od pacjenta, u którego występuje choroba, objaw choroby lub predyspozycja do choroby, w celu leczenia, wyleczenia, złagodzenia, zmniejszenia, zmiany, zaradzenia, polepszenia, poprawy lub wpłynięcia na chorobę, objaw choroby lub predyspozycję do choroby. [01] W jednym z aspektów wynalazek dotyczy przeciwciał do zastosowania w profilaktyce lub leczeniu choroby związanej ze złogami amyloidowymi Aβ w mózgu pacjenta. Do takich chorób należą choroba Alzheimera, zespół Downa i zaburzenie funkcji

62 63 poznawczych. Ostatnie z nich może wystąpić wraz z innymi cechami charakterystycznymi dla choroby amyloidogennej lub bez nich. Niektóre sposoby według wynalazku obejmują podawanie skutecznej dawki przeciwciała, które swoiście wiąże się ze składnikiem złogu amyloidowego u pacjenta. Takie zastosowania są szczególnie użyteczne w profilaktyce lub leczeniu choroby Alzheimera u ludzi. Przykładowe sposoby obejmują podawanie skutecznej dawki przeciwciała wiążącego się z Aβ. Korzystne zastosowania obejmują podawanie skutecznej dawki przeciwciała wiążącego się swoiście z epitopem w obrębie reszt 1- Aβ, na przykład przeciwciał wiążących się swoiście z epitopem w obrębie reszt 1-3 Aβ, przeciwciał wiążących się swoiście z epitopem w obrębie reszt 1-4 Aβ, przeciwciał wiążących się swoiście z epitopem w obrębie reszt 1-5 Aβ, przeciwciał wiążących się swoiście z epitopem w obrębie reszt 1-6 Aβ, przeciwciał wiążących się swoiście z epitopem w obrębie reszt 1-7 Aβ lub przeciwciał wiążących się swoiście z epitopem w obrębie reszt 3-7 Aβ. W jeszcze innym aspekcie wynalazek dotyczy podawania przeciwciał wiążących się z epitopem zawierającym wolną N-końcową resztę Aβ. W jeszcze innym aspekcie wynalazek dotyczy podawania przeciwciał wiążących się z epitopem w obrębie reszt 1- Aβ, przy czym resztą 1 i(lub) resztą 7 Aβ jest kwas asparaginowy. W jeszcze innym aspekcie wynalazek dotyczy podawania przeciwciał wiążących się swoiście z peptydem Aβ i niewiążących się z pełnej długości białkiem prekursora amyloidu (APP). W jeszcze innym aspekcie izotypem przeciwciała jest ludzka IgG1. [02] W jeszcze innym aspekcie wynalazek dotyczy podawania przeciwciał wiążących się ze złogiem amyloidowym u pacjenta i indukowania odpowiedzi usuwającej przeciwko złogowi amyloidowemu. Taką odpowiedź usuwającą można wywołać na przykład na drodze fagocytozy, w której uczestniczy receptor Fc. [03] Środki terapeutyczne według wynalazku są zazwyczaj zasadniczo wolne od niepożądanych zanieczyszczeń. Oznacza to, że czystość środka wynosi zwykle co najmniej około 50% w/w (wagowo), a także jest on zasadniczo wolny od białek i zanieczyszczeń zakłócających jego czynność. Niekiedy czystość

63 64 środków wynosi co najmniej około 80% wagowo, korzystniej co najmniej 90 lub około 95% wagowo. Stosując jednak tradycyjne metody oczyszczania białek można otrzymać peptydy o jednorodności co najmniej 99% wagowo. [04] Leczenie można stosować zarówno u pacjentów, u których nie występują objawy, jak i u pacjentów wykazujących objawy choroby. Stosowane przeciwciała mogą być przeciwciałami humanizowanymi lub chimerowymi bądź ich fragmentami (np. fragmentami wiążącymi antygen), zgodnie z opisem w wynalazku. W jeszcze innym aspekcie wynalazek dotyczy podawania przeciwciał otrzymanych od człowieka immunizowanego peptydem Aβ, przy czym człowiekiem tym może być pacjent, który ma być leczony przeciwciałem. [05] W jeszcze innym aspekcie wynalazek dotyczy podawania przeciwciała z nośnikiem farmaceutycznym w postaci kompozycji farmaceutycznej. Ewentualnie przeciwciało można podawać pacjentowi przez podawanie polinukleotydu kodującego co najmniej jeden łańcuch przeciwciała. Polinukleotyd ulega ekspresji w celu wytworzenia u pacjenta łańcucha przeciwciała. Ewentualnie polinukleotyd koduje łańcuchy ciężkie i lekkie przeciwciała. Polinukleotyd ulega ekspresji w celu wytworzenia u pacjenta łańcuchów ciężkich i lekkich przeciwciała. W przykładowych postaciach wykonania wynalazku monitoruje się u pacjenta poziom podanego przeciwciała we krwi pacjenta. [06] W ten sposób wynalazek wypełnia występujące od dłuższego czasu zapotrzebowanie na schematy terapeutyczne do profilaktyki i leczenia patologii układu nerwowego, u niektórych pacjentów zaś zaburzenia funkcji poznawczych związanego z chorobą Alzheimera. A. Pacjenci kwalifikujący się do leczenia [07] Do pacjentów kwalifikujących się do leczenia należą osoby narażone na ryzyko choroby, ale niewykazujące objawów, a także osoby, u których objawy już wystąpiły. W przypadku choroby Alzheimera praktycznie każdy jest narażony na ryzyko choroby Alzheimera, jeśli dożyje odpowiedniego wieku. W związku z tym niniejsze sposoby można zastosować profilaktycznie w populacji

64 65 ogólnej bez konieczności oceny ryzyka u danego pacjenta. Niniejsze sposoby są szczególnie użyteczne w przypadku osób, o których wiadomo, że występuje u nich ryzyko genetyczne choroby Alzheimera. Są to osoby, u których krewnych wystąpiła ta choroba, i osoby, u których ryzyko określa się na podstawie analizy markerów genetycznych lub biochemicznych. Do genetycznych markerów ryzyka choroby Alzheimera należą mutacje genu APP, w szczególności mutacje w położeniu 717 oraz położeniach 670 i 671, określane odpowiednio jako mutacje Hardy ego i szwedzkie (patrz Hardy, jak wyżej). Innymi markerami ryzyka są mutacje w genach preseniliny, PS1 i PS2 oraz ApoE4, występowanie AD w rodzinie, hipercholesterolemia lub miażdżyca tętnic. Osoby, u których aktualnie występuje choroba Alzheimera, można rozpoznać na podstawie charakterystycznego otępienia, a także występowania czynników ryzyka, o których mowa powyżej. Ponadto dostępnych jest wiele testów diagnostycznych do rozpoznawania osób, u których występuje AD. Należą do nich oznaczanie poziomu Aβ42 i tau w CSF. Podwyższony poziom tau i obniżony poziom Aβ42 oznacza występowanie AD. Osoby, u których występuje choroba Alzheimera, można także diagnozować na podstawie kryteriów ADRDA omawianych w przykładach. [08] U pacjentów bezobjawowych leczenie może rozpocząć się w dowolnym wieku (np.,, lat). Zazwyczaj jednak rozpoczynanie leczenia nie jest konieczne do momentu osiągnięcia przez pacjenta wieku 40, 50, 60 lub 70 lat. Leczenie zazwyczaj obejmuje podawanie wielu dawek w pewnym okresie. Leczenie można monitorować, oznaczając poziom przeciwciał w czasie. Jeśli reakcja nie wystąpi, wskazana jest dawka wzmacniająca. W przypadku pacjentów, u których może występować zespół Downa, leczenie można rozpocząć przed urodzeniem poprzez podanie czynnika terapeutycznego matce lub dziecku krótko po urodzeniu. B. Schematy leczenia i dawkowanie [09] W zastosowaniach profilaktycznych kompozycje farmaceutyczne lub leki podaje się pacjentowi podatnemu na chorobę Alzheimera lub narażonego na jej ryzyko w ilości wystarczającej do wyeliminowania lub zmniejszenia ryzyka,

65 66 zmniejszenia nasilenia lub opóźnienia początku choroby, w tym objawów biochemicznych, histologicznych i(lub) behawioralnych choroby, jej powikłań oraz pośrednich fenotypów patologicznych występujących podczas rozwoju choroby. W zastosowaniach terapeutycznych kompozycje lub leki podaje się pacjentowi, u którego podejrzewa się taką chorobę lub już ona u niego występuje, w ilości wystarczającej do wyleczenia lub co najmniej częściowego zahamowania objawów choroby (biochemicznych, histologicznych i(lub) behawioralnych), w tym powikłań oraz pośrednich fenotypów patologicznych występujących podczas rozwoju choroby. [0160] W niektórych zastosowaniach podawanie czynnika zmniejsza lub eliminuje zaburzenia czynności mięśni i poznawcze u pacjentów, u których charakterystyczna patologia choroby Alzheimera jeszcze nie wystąpiła. Ilość odpowiednią do postępowania terapeutycznego lub profilaktycznego określa się jako dawkę skuteczną terapeutycznie lub profilaktycznie. W schematach postępowania profilaktycznego i terapeutycznego czynniki podaje się zazwyczaj w kilku dawkach do uzyskania odpowiedniej odpowiedzi odpornościowej. Określenie odpowiedź odpornościowa lub odpowiedź immunologiczna obejmuje rozwój odpowiedzi humoralnej (w której pośredniczą przeciwciała) i(lub) komórkowej (w której pośredniczą komórki T swoiste wobec antygenu lub produkty przez nie wydzielane) skierowanej przeciwko antygenowi u odbiorcy. Taką odpowiedzią może być odpowiedź czynna, tzn. indukowana przez podanie immunogenu, lub odpowiedź bierna, tzn. indukowana przez podanie immunoglobuliny, przeciwciała lub pobudzonych komórek T. [0161] Czynnik immunogenny lub immunogen" jest zdolny do indukowania odpowiedzi odpornościowej przeciwko sobie samemu po podaniu ssakowi, ewentualnie w połączeniu z adiuwantem. Zazwyczaj monitoruje się odpowiedź odpornościową i podaje dawki wielokrotne, jeśli odpowiedź odpornościowa zaczyna się zmniejszać. [0162] Skuteczne dawki kompozycji według niniejszego wynalazku do leczenia chorób, o których mowa powyżej, różnią się w

66 67 zależności od wielu różnych czynników, w tym sposobu podawania, miejsca docelowego, stanu fizjologicznego pacjenta, tego, czy pacjent jest człowiekiem czy zwierzęciem, innych podawanych leków i tego, czy postępowanie jest profilaktyczne czy terapeutyczne. Pacjent jest zazwyczaj człowiekiem, jednak może także być ssakiem innym niż człowiek, w tym ssakiem transgenicznym. Dawkowanie lecznicze należy zmieniać w celu optymalizacji bezpieczeństwa i skuteczności. [0163] W przypadku immunizacji biernej z użyciem przeciwciała dawkowanie zawiera się w zakresie od około 0,0001 do 0 mg/kg, częściej 0,01-5 mg/kg masy ciała gospodarza. Dawkowanie może wynosić na przykład 1 mg/kg masy ciała lub mg/kg masy ciała lub mieścić się w zakresie 1- mg/kg, korzystnie co najmniej 1 mg/kg. Pacjentom można podawać takie dawki raz na dobę, co dwa dni, co tydzień lub według innego schematu określonego na podstawie analizy empirycznej. Przykładowe postępowanie obejmuje podawanie wielu dawek przez dłuższy czas, na przykład przez co najmniej sześć miesięcy. Dodatkowe przykładowe przykłady postępowania obejmują podawanie raz na dwa tygodnie, raz na miesiąc lub raz na 3-6 miesięcy. Przykładowe schematy dawkowania obejmują 1- mg/kg lub mg/kg w kolejne dni, mg/kg co drugi dzień lub 60 mg/kg raz na tydzień. W niektórych sposobach jednocześnie podaje się dwa lub więcej przeciwciał monoklonalnych o różnej swoistości wiązania; w takim wypadku dawkowanie każdego podawanego przeciwciała zawiera się we wskazanym zakresie. [0164] Przeciwciało podaje się zazwyczaj wiele razy. Odstępy między podaniem pojedynczych dawek mogą być liczone w tygodniach, miesiącach lub latach. Odstępy mogą ponadto być nieregularne, uzależnione na przykład od wyniku pomiaru poziomu przeciwciała przeciwko Aβ we krwi pacjenta. W niektórych sposobach dawkowanie dostosowuje się tak, żeby uzyskać stężenie przeciwciała w osoczu 1-00 µg/ml, w niektórych sposobach -0 µg/ml. Ewentualnie przeciwciała można podawać w postaci preparatu o przedłużonym uwalnianiu; w tym wypadku konieczne jest rzadsze

67 68 podawanie. Dawkowanie i częstość podawania zmieniają się w zależności od okresu półtrwania przeciwciała u pacjenta. Ogólnie najdłuższy okres półtrwania mają przeciwciała ludzkie, a następnie przeciwciała humanizowane, przeciwciała chimerowe i przeciwciała inne niż ludzkie. [0165] Dawkowanie i częstość podawania mogą się zmieniać w zależności od tego, czy postępowanie jest profilaktyczne czy terapeutyczne. W zastosowaniach profilaktycznych kompozycje zawierające niniejsze przeciwciała lub ich mieszaniny podaje się pacjentowi, u którego dotychczas nie wystąpił stan chorobowy, w celu zwiększenia jego odporności. Taką ilość definiuje się jako dawkę skuteczną profilaktycznie. W takim zastosowaniu dokładne ilości także zależą od stanu zdrowia pacjenta i ogólnej odporności, jednak ogólnie mieszczą się w zakresie od 0,1 do mg na dawkę, w szczególności od 0,5 do 2,5 mg na dawkę. Podaje się stosunkowo niską dawkę w stosunkowo nieczęstych odstępach czasu przez długi okres. U niektórych pacjentów postępowanie prowadzi się do końca życia. [0166] W zastosowaniach terapeutycznych konieczna jest niekiedy stosunkowo duża dawka (np. od około 1 do 0 mg przeciwciała na dawkę, przy czym dawkowanie 5- mg jest stosowane częściej) w stosunkowo krótkich odstępach czasu do momentu zmniejszenia lub zakończenia progresji choroby, korzystnie do momentu częściowego lub całkowitego ustąpienia objawów choroby u pacjenta. Następnie u pacjenta można zastosować schemat profilaktyczny. [0167] W przypadku kwasów nukleinowych kodujących przeciwciała dawki mieszczą się w zakresie od około ng do 1 g, od 0 ng do 0 mg, od 1 µg do mg lub -0 µg DNA na pacjenta. W przypadku zakaźnych wektorów wirusowych dawki wynoszą -0 lub więcej wirionów na dawkę. [0168] Czynniki terapeutyczne można podawać pozajelitowo, miejscowo, dożylnie, doustnie, podskórnie, dotętniczo, doczaszkowo, dootrzewnowo, donosowo lub domięśniowo w postępowaniu profilaktycznym i(lub) terapeutycznym. Najbardziej typową drogą podania czynnika immunogennego jest droga

68 69 podskórna, chociaż inne drogi mogą być tak samo skuteczne. Kolejną najczęstszą drogą podawania jest wstrzyknięcie domięśniowe. Ten rodzaj wstrzyknięcia wykonuje się najczęściej w mięśnie ramienia lub nogi. W niektórych sposobach czynniki wstrzykuje się bezpośrednio w odpowiednią tkankę, w której nagromadziły się złogi, na przykład przez wstrzyknięcie doczaszkowe. Do podawania przeciwciała korzystne są wstrzyknięcia domięśniowe lub wlewy dożylne. W niektórych sposobach określone przeciwciała terapeutyczne wstrzykuje się bezpośrednio w czaszkę. W niektórych sposobach przeciwciała podaje się w kompozycji lub wyrobie do przedłużonego uwalniania, takim jak urządzenie Medipad. [0169] Czynniki według wynalazku można ewentualnie podawać w połączeniu z innymi czynnikami, które są co najmniej częściowo skuteczne w leczeniu choroby amyloidogennej. W przypadku choroby Alzheimera i zespołu Downa, w których złogi amyloidowe występują w mózgu, czynniki według wynalazku można także podawać w połączeniu z innymi czynnikami, które zwiększają przenikanie czynników według wynalazku przez barierę krew-mózg. C. Kompozycje farmaceutyczne [0170] Czynniki według wynalazku często podaje się w postaci kompozycji farmaceutycznych, zawierających czynnik terapeutyczny i różnorodne inne składniki dopuszczalne farmaceutycznie. Patrz Remington s Pharmaceutical Science (wyd., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, USA (1980)). Postać korzystna zależy od zamierzonego sposobu podawania i zastosowania terapeutycznego. Kompozycje mogą ponadto zawierać, zależnie od pożądanego preparatu, dopuszczalne farmaceutycznie, nietoksyczne nośniki lub rozcieńczalniki, definiowane jako nośniki powszechnie stosowane do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych do podawania zwierzętom lub ludziom. Rozcieńczalnik wybiera się tak, żeby nie wpływał na aktywność biologiczną kombinacji. Do przykładów takich rozcieńczalników należą woda destylowana, fizjologiczny roztwór chlorku sodu buforowany fosforanem, płyny Ringera, roztwór dekstrozy i płyn Hanka. Ponadto kompozycja lub preparat farmaceutyczny może także zawierać inne nośniki,

69 70 adiuwanty lub nietoksyczne, nieterapeutyczne, nieimmunogenne środki stabilizujące i tym podobne. [0171] Kompozycje farmaceutyczne mogą także zawierać duże, wolno metabolizowane makrocząsteczki, takie jak białka, polisacharydy, takie jak chitozan, poli(kwasy mlekowe), poli(kwasy glikolowe) i kopolimery (takie jak funkcjonalizowana lateksem Sepharose TM, agaroza, celuloza i tym podobne), aminokwasy polimeryczne, kopolimery aminokwasów i agregaty lipidowe (takie jak kropelki oleju lub liposomy). Ponadto te nośniki mogą służyć jako środki immunostymulujące (tzn. adiuwanty). [0172] W przypadku podawania pozajelitowego środki według wynalazku można podawać w postaci dawek roztworu lub zawiesiny do wstrzyknięć, zawierających substancję w dopuszczalnym fizjologicznie rozcieńczalniku z nośnikiem farmaceutycznym, którym może być jałowa ciecz, taka jak woda, oleje, fizjologiczny roztwór chlorku sodu, glicerol lub etanol. Ponadto w kompozycjach mogą być obecne substancje dodatkowe, takie jak środki zwilżające lub emulgatory, środki powierzchniowo czynne, substancje buforujące ph i inne. Inne składniki kompozycji farmaceutycznych to substancje pochodzące z ropy naftowej, substancje pochodzenia zwierzęcego, roślinnego lub syntetycznego, na przykład olej arachidowy, olej sojowy i olej mineralny. Ogólnie korzystnymi nośnikami ciekłymi, w szczególności do roztworów do wstrzykiwań, są glikole, takie jak glikol propylenowy lub poli(glikol etylenowy). Przeciwciała można podawać w postaci wstrzyknięć typu depot lub preparatów do wszczepiania, których skład opracowuje się w taki sposób, aby umożliwiać przedłużone uwalnianie substancji czynnej. Przykładowa kompozycja zawiera przeciwciało monoklonalne (5 mg/ml), w preparacie buforu będącego roztworem wodnym, zawierającym 50 mm L-histydyny, 0 mm NaCl, o ph doprowadzonym do 6,0 przez dodanie HCl. [0173] Kompozycje otrzymuje się zazwyczaj w postaci roztworów lub zawiesin do wstrzykiwań; można także wytwarzać postacie stałe do sporządzania roztworu lub zawiesiny w nośnikach ciekłych przed wstrzyknięciem. Preparat może także być

70 71 zemulgowany lub zamknięty w liposomach lub mikrocząstkach, takich jak polilaktyd, poliglikolid lub kopolimer, w celu zwiększenia działania adiuwantu, o czym mowa powyżej (patrz Langer, Science 249: 27 (1990) i Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28:97 (1997)). Środki według niniejszego wynalazku można podawać w postaci wstrzyknięć typu depot lub preparatów do wszczepiania, których skład opracowuje się w taki sposób, aby umożliwiać przedłużone lub pulsacyjne uwalnianie substancji czynnej. [0174] Dodatkowe preparaty, które są odpowiednie w przypadku innych sposobów podawania, obejmują preparaty doustne, donosowe i dopłucne, czopki i zastosowania przezskórne. W przypadku czopków do typowych środków wiążących i nośników należą na przykład glikole lub triglicerydy; takie czopki można wytwarzać z mieszanin zawierających składnik czynny w zakresie od 0,5% do %, korzystnie 1%-2%. Preparaty doustne zawierają substancje pomocnicze, takie jak mannitol, laktoza, skrobia, stearynian magnezu, sacharynian sodu, celuloza i węglan magnezu o czystości farmaceutycznej. Kompozycje takie można wytwarzać w postaci roztworów, zawiesin, tabletek, pigułek, kapsułek, preparatów o przedłużonym uwalnianiu lub proszków i zawierają %-95% składnika czynnego, korzystnie %-70%. [0175] Zastosowanie zewnętrzne może obejmować podawanie przezskórne lub śródskórne. Podawanie zewnętrzne można ułatwić przez jednoczesne podawanie środka z toksyną cholery lub jej pochodnymi lub podjednostkami poddanymi detoksykacji lub z innymi toksynami bakteryjnymi (patrz Glenn i wsp., Nature 391, 851 (1998)). Jednoczesne podawanie można przeprowadzić z użyciem składników w mieszaninie lub w postaci połączonych cząsteczek otrzymanych przez usieciowanie chemiczne lub ekspresję w postaci białka fuzyjnego. [0176] Podawanie przeskórne można ewentualnie zrealizować z użyciem plastra na skórę lub transferosomów (Paul i wsp., Eur. J. Immunol. :21 (1995), Cevc i wsp., Biochem. Biophys. Acta 1368:1- (1998)). III. Monitorowanie przebiegu leczenia

71 72 [0177] Wynalazek dotyczy sposobów monitorowania leczenia pacjenta cierpiącego na chorobę Alzheimera lub na nią podatnego, czyli do monitorowania przebiegu leczenia stosowanego u pacjenta. Można zastosować sposoby monitorowania postępowania terapeutycznego u pacjentów objawowych i postępowania profilaktycznego u pacjentów bezobjawowych. W szczególności sposoby te są użyteczne do monitorowania immunizacji biernej (np. pomiaru poziomu podawanego przeciwciała). [0178] Niektóre sposoby obejmują określenie wartości wyjściowej, na przykład poziomu lub profilu przeciwciała u pacjenta przed podaniem dawki środka i jej porównanie z wartością profilu lub poziomu po leczeniu. Znaczny wzrost (tzn. większy od typowego marginesu błędu doświadczalnego w wielokrotnych pomiarach tej samej próbki, wyrażonego w postaci jednego odchylenia standardowego od średniej takich pomiarów) wartości poziomu lub profilu wskazuje na pozytywny wynik postępowania (tzn. podanie środka doprowadziło do pożądanej odpowiedzi). Jeśli wartość odpowiedzi immunologicznej nie zmienia się znacznie lub spada, wskazuje to na negatywny wynik postępowania. [0179] W innych sposobach wyznacza się wartość kontrolną (tzn. średnią i odchylenie standardowe) poziomu lub profilu dla populacji kontrolnej. Zazwyczaj osoby lub osobniki w populacji kontrolnej nie były wcześniej leczone. Następnie porównuje się zmierzone wartości poziomu lub profilu u pacjenta po podaniu czynnika terapeutycznego z wartością kontrolną. Znaczny wzrost w porównaniu do wartości kontrolnej (np. większy od jednego odchylenia standardowego od średniej) wskazuje na pozytywny lub wystarczający wynik postępowania. Brak znacznego wzrostu lub spadek wskazuje na negatywny lub niewystarczający wynik postępowania. Podczas wzrostu poziomu względem wartości kontrolnej podawanie środka jest zwykle kontynuowane. Podobnie jak wcześniej, osiągnięcie plateau względem wartości kontrolnej wskazuje na to, że stosowanie postępowania można zakończyć bądź zmniejszyć dawkę i(lub) częstość. [0180] W innych sposobach wyznacza się wartość kontrolną poziomu lub profilu (średnią i odchylenie standardowe) na podstawie

72 73 populacji kontrolnej osób (osobników), które poddawano leczeniu z użyciem środka terapeutycznego i u których w odpowiedzi na leczenie poziom lub profil osiągnął plateau. Zmierzone wartości poziomu lub profilu u pacjenta po podaniu środka terapeutycznego porównuje się z wartością kontrolną. Jeśli poziom zmierzony u pacjenta nie różni się znacznie (np. o więcej niż jedno odchylenie standardowe) od wartości kontrolnej, postępowanie można zakończyć. Jeśli poziom u pacjenta jest znacznie niższy od wartości kontrolnej, należy kontynuować podawanie czynnika. Jeśli u pacjenta utrzymuje się poziom niższy od wartości kontrolnej, wskazana może być zmiana leczenia. [0181] W innych sposobach, u pacjenta, który obecnie nie jest poddawany leczeniu, ale był mu poddawany wcześniej, monitoruje się poziom lub profil przeciwciała, aby stwierdzić, czy konieczne jest wznowienie leczenia. Zmierzony u pacjenta poziom lub profil można porównać z wcześniej uzyskaną u pacjenta wartością po poprzednim cyklu leczenia. Znaczny spadek względem poprzedniego pomiaru (tzn. większy od typowego marginesu błędu w pomiarach wielokrotnych tej samej próbki) wskazuje na to, że leczenie można wznowić. Ewentualnie wartość zmierzoną u pacjenta można porównać z wartością kontrolną (średnia plus odchylenie standardowe) wyznaczoną w populacji pacjentów po zakończeniu cyklu leczenia. Ewentualnie wartość zmierzoną u pacjenta można porównać z wartością kontrolną w populacjach pacjentów poddawanych postępowaniu profilaktycznemu, u których nie występują objawy choroby, lub w populacjach pacjentów poddawanych postępowaniu terapeutycznemu, u których występuje poprawa stanu chorobowego. We wszystkich tych wypadkach znaczny spadek względem poziomu kontrolnego (tzn. o więcej niż jedno odchylenie standardowe) wskazuje na to, że postępowanie u pacjenta należy wznowić. [0182] Próbką tkanki do analizy jest zazwyczaj krew, osocze, surowica, płyn śluzowy lub płyn mózgowo-rdzeniowy pacjenta. W próbce analizuje się na przykład poziom lub profil przeciwciał przeciwko peptydowi Aβ, np. poziom lub profil przeciwciał humanizowanych. Metody ELISA wykrywania przeciwciał swoistych

73 74 przeciwko Aβ opisano w przykładach. W niektórych sposobach poziom lub profil podanego przeciwciała wyznacza się testem usuwania, na przykład w teście fagocytozy in vitro, omawianym w niniejszym dokumencie. W takich sposobach próbkę tkanki od badanego pacjenta styka się ze złogami amyloidowymi (np. od myszy PDAPP) i komórkami fagocytującymi, posiadającymi receptory Fc. Następnie monitoruje się usuwanie złogu amyloidowego. Występowanie i zakres odpowiedzi usuwającej wskazuje na występowanie i poziom przeciwciał skutecznie usuwających Aβ w próbce tkanki badanego pacjenta. [0183] Profil przeciwciała po immunizacji biernej zazwyczaj wykazuje natychmiastowe maksymalne stężenie przeciwciała, po którym następuje wykładniczy zanik. Jeśli nie zostanie podana kolejna dawka, zanik prowadzi do osiągnięcia poziomu sprzed leczenia w czasie od kilku dni do kilku miesięcy, w zależności od okresu półtrwania podanego przeciwciała. Okres półtrwania niektórych przeciwciał ludzkich jest na przykład rzędu dni. [0184] W niektórych sposobach przed podaniem dokonuje się pomiaru wyjściowego poziomu przeciwciała Aβ u pacjenta; drugi pomiar wykonuje się krótko po tym w celu określenia maksymalnego poziomu przeciwciała, a następnie w pewnych odstępach czasu wykonuje się kolejne pomiary w celu monitorowania zaniku poziomu przeciwciała. Jeśli poziom przeciwciała spadł do poziomu wyjściowego lub określonego odsetka różnicy wartości maksymalnej i poziomu wyjściowego (np. 50%, % lub %), podaje się kolejną dawkę przeciwciała. W niektórych sposobach poziom najwyższy lub kolejne mierzone, pomniejszone o sygnał tła, porównuje się z określonym uprzednio poziomem odniesienia, w celu ustalenia schematu korzystnego postępowania profilaktycznego lub terapeutycznego u innych pacjentów. Jeśli zmierzony poziom przeciwciała jest znacznie niższy od poziomu odniesienia (np. mniejszy od średniej pomniejszonej o jedno odchylenie standardowe wartości odniesienia w populacji pacjentów, którzy odnieśli korzyść z postępowania), wskazane jest podawanie dodatkowych dawek przeciwciała.

74 75 [0185] Do dodatkowych sposobów należą monitorowanie w cyklu leczenia wszelkich objawów fizjologicznych znanych w stanie techniki (np. objawów fizycznych lub umysłowych), z których badacze lub lekarze korzystają rutynowo przy rozpoznawaniu lub monitorowaniu chorób amyloidogennych (np. choroby Alzheimera). Można monitorować na przykład zaburzenia czynności poznawczych. Są one objawem choroby Alzheimera i zespołu Downa, ale mogą także występować bez innych cech charakterystycznych tych chorób. Zaburzenie czynności poznawczych można na przykład monitorować, określając wynik pacjenta w teście Mini-Mental zgodnie z konwencją przez cały cykl leczenia. [0186] Zamieszczone poniżej nieograniczające przykłady służą wyłącznie celom ilustracyjnym. PRZYKŁADY Przykład I. Skuteczność lecznicza przeciwciał anty-aβ: mab 2H3, mab D5, mab 266, mab 21F12 i pab Aβ1-42 [0187] W tym przykładzie badano zdolność różnych przeciwciał monoklonalnych i poliklonalnych przeciwko Aβ do hamowania kumulacji Aβ w mózgu heterozygotycznych myszy transgenicznych. A. Schemat badania [0188] 60 samców i samic heterozygotycznych, transgenicznych myszy PDAPP w wieku od 8,5 do,5 miesięcy otrzymano z Charles River Laboratory. Myszy podzielono na sześć grup, którym miano podawać różne przeciwciała skierowane przeciwko Aβ. Zwierzęta podzielono tak, by uzyskać możliwie najlepsze dopasowanie płci, wieku, pochodzenia i źródła zwierząt w grupach. Tabela 2 przedstawia schemat doświadczenia.

75 76 Tabela 2: Schemat doświadczenia Grupa dawkowania Podawane przeciwciało Swoistość przeciwciała Izotyp przeciwciała 1 9 Brak (wyłącznie n.d. b n.d. PBS) 2 Poliklonalne Aβ1-42 Mieszane 3 0 mab d 2H3 Aβ1-12 IgG1 4 8 mab D5 Aβ3-7 IgG1 5 6 mab 266 Aβ13-28 IgG1 6 8 mab 21F12 Aβ33-42 IgG2a a. Liczba myszy w grupie po zakończeniu doświadczenia. We wszystkich grupach rozpoczęto od osobników w grupie. b. n.d.: nie dotyczy c. mysie poliklonalne: przeciwko zagregowanemu Aβ42 d. mab: przeciwciało monoklonalne N a 5 [0189] Jak ukazano w tabeli 2, przeciwciała stanowiły cztery mysie przeciwciała monoklonalne swoiste wobec Aβ, 2H3 (skierowane przeciwko resztom Aβ 1-12), D5 (skierowane przeciwko resztom Aβ3-7), 266 (skierowane przeciwko resztom Aβ i wiążące się z rozpuszczalnym, ale nie ze zagregowanym AN1792), 21F12 (skierowane przeciwko resztom Aβ 33-42). Piątej grupie podawano frakcję przeciwciała poliklonalnego swoistego wobec Aβ (uzyskanego w wyniku immunizacji zagregowanym AN1792). Grupa będąca kontrolą ujemną otrzymała sam rozcieńczalnik (PBS) bez przeciwciała. B. Monitorowanie przebiegu leczenia [0190] Przeciwciała monoklonalne wstrzyknięto w dawce około mg/kg (przy założeniu, że masa ciała myszy wynosi 50 g). Przez 28 tygodni trwania postępowania monitorowano miana przeciwciał. Wstrzyknięcia wykonywano dootrzewnowo średnio co 7 dni, aby utrzymać miano przeciwciał przeciwko Aβ powyżej 00. Jakkolwiek w przypadku mab 266 zmierzono niższe wartości miana, ponieważ nie wiąże się ono silnie ze zagregowanym AN1792 stosowanym jako antygen wychwytujący w badaniu, w tej grupie utrzymano ten sam schemat dawkowania. Badanie w grupie otrzymującej przeciwciało monoklonalne 2H3 zakończono w ciągu pierwszych trzech tygodni, ponieważ przeciwciało było zbyt szybko usuwane in vivo. [0191] W celu wyznaczenia miana przeciwciał od podgrupy trzech myszy wybranych przypadkowo z każdej grupy bezpośrednio przed

76 77 każdym szczepieniem dootrzewnowym pobierano krew (w sumie próbek). Mierzono miano przeciwciał w odniesieniu do przeciwciała wiążącego Aβ1-42 z zastosowaniem testu podwójnego wiązania ELISA na wielodołkowych płytkach z tworzywa sztucznego za pomocą Aβ1-42, jak opisano szczegółowo w części Ogólne informacje o materiałach i metodach. Średnie miana przeciwciała poliklonalnego i przeciwciał monoklonalnych D5 i 21F12 w poszczególnych próbkach krwi przedstawiono w tabeli 3. Tygodnie, 21F12 21F12 Tygodnie, D5 Tabela 3: D5 Tygodnie, poliklonalne 0, 500 0, 00 0, , , , , , , , , , , Poliklonalne

77 78 [0192] Średnie miano przeciwciała w tym okresie wynosiło około 00 w przypadku preparatu przeciwciała poliklonalnego i nieco więcej w przypadku osobników, którym podawano D5 i 21F12. [0193] Postępowanie kontynuowano przez sześć miesięcy, w sumie przez 196 dni. Tydzień po podaniu ostatniej dawki zwierzęta uśpiono. C. Poziom Aβ i APP w mózgu: [0194] Po około sześciu miesiącach podawania preparatów różnych przeciwciał anty-aβ osobnikom wycięto mózgi, po perfuzji roztworu chlorku sodu. Jedną półkulę wypreparowano do analizy immunohistochemicznej, drugą zaś wykorzystano do oznaczenia ilościowego poziomu Aβ i APP. W celu pomiaru stężenia różnych form peptydu beta-amyloidu i białka prekursora amyloidu (APP), półkulę rozcięto i wypreparowano homogenaty obszarów hipokampu, kory mózgowej i móżdżku w 5 M guanidynie. Otrzymano z nich rozcieńczenia seryjne i oznaczono ilościowo poziom peptydu amyloidu lub APP, porównując z serią rozcieńczeń wzorców peptydu Aβ lub APP o znanym stężeniu w teście ELISA. [0195] Poziom całkowitego Aβ i Aβ1-42 zmierzony w teście ELISA na podstawie homogenatów kory mózgowej i hipokampu oraz poziom całkowitego Aβ w móżdżku przedstawiono odpowiednio w tabelach 4, 5 i 6. Mediana stężenia całkowitego Aβ w grupie kontrolnej, której podano PBS, była 3,6-krotnie wyższa w hipokampie niż w korze mózgowej (mediana 63,389 ng/g w tkance hipokampu w porównaniu do 17,818 ng/g w korze mózgowej). Mediana poziomu w móżdżku grupy kontrolnej (,6 ng/g tkanki) była ponad 00 razy niższa niż w hipokampie. Poziomy te są podobne do podawanych wcześniej w przypadku heterozygotycznych transgenicznych myszy PDAPP w tym wieku (Johnson-Wood i wsp., patrz wyżej). [0196] W przypadku kory mózgowej w jednej grupie dawkowania mediana poziomu Aβ, mierzona na podstawie Aβ1-42, różniła się znacznie od wartości w grupie kontrolnej (p<0,05), przy czym te osobniki otrzymywały przeciwciało poliklonalne anty-aβ, co przedstawia tabela 4. Mediana poziomu Aβ1-42 zmniejszyła się o 65% w tej grupie dawkowania w porównaniu do grupy kontrolnej. Mediana poziomu Aβ1-42 także znacznie zmniejszyła się - o 55% -

78 79 w porównaniu do grupy kontrolnej w jeszcze jednej grupie dawkowania; tym osobnikom podawano mab D5 (p=0,0433). 5 Tabela 4 KORA MÓZGOWA N a Mediana Średnia Grupa dawkowania % Suma Aβ Aβ42 Suma Aβ Aβ42 Wartość Wartość Wartość Wartość % Wartość Wartość w teście ELISA b P c zmiany w teście ELISA P zmiany w teście ELISA w teście ELISA PBS n.d. d n.d n.d. n.d. 160+/ /- Poliklonalne anty- Aβ42 mab D5 mab 266 mab , , / F12 Przypisy: a. Liczba osobników w grupie na końcu doświadczenia b. ng/g tkanki c. Test Manna-Whitneya d. n.d.: nie dotyczy e. Odchylenie standardowe / , , / , , / , , / / / / [0197] Średnia procentowa redukcja całkowitego Aβ w hipokampie, związana z poliklonalnym przeciwciałem anty-aβ (50%, p=0,0055), nie była tak wysoka, jak obserwowana w korze mózgowej (65%) (tabela 5). Bezwzględna wielkość redukcji była jednak niemal 3- krotnie większa w hipokampie niż w korze mózgowej: redukcja wynosiła netto 31,683 ng/g tkanki w hipokampie wobec 11,658 ng/g tkanki w korze mózgowej. W przypadku pomiaru na podstawie poziomu bardziej amyloidogennej postaci Aβ, Aβ1-42, zamiast całkowitego Aβ, redukcja uzyskiwana w przypadku przeciwciała poliklonalnego była znaczna (p=0,00). Mediana poziomu w grupach, którym podawano przeciwciała monoklonalne D5 i 266, zmniejszyła się odpowiednio o 33% i 21%.

79 80 Tabela 5 HIPOKAMP N a Mediana Średnia Grupa dawkowania % Suma Aβ Aβ42 Suma Aβ Aβ42 Wartość Wartość Wartość Wartość % Wartość w Wartość w w teście ELISA b P c zmiany w teście ELISA P zmiany teście ELISA teście ELISA /- PBS n.d. d n.d n.d. n.d. 581+/- 138 e Poliklonalne anty-aβ , , / / mab D , , / / mab , , / /- 372 mab 21F , , / / a. Liczba osobników w grupie na końcu doświadczenia b. ng/g tkanki c. Test Manna-Whitneya d. n.d.: nie dotyczy e. Odchylenie standardowe [0198] Całkowite Aβ mierzono także w móżdżku (tabela 6). W grupach otrzymujących poliklonalne przeciwciało anty-aβ i przeciwciało 266 stwierdzono znaczną redukcję poziomu całkowitego Aβ (odpowiednio 43% i 46%, p=0,0033 i p=0,0184); w grupie, której podawano D5, stwierdzono niemal istotną redukcję (29%, p=0,0675). Tabela 6 P c % zmiany teście MÓŻDŻEK Grupa dawkowania N a Mediana Średnia Suma Aβ Suma Aβ Wartość w Wartość Wartość w teście ELISA b ELISA PBS 9,64 b.d. d b.d. 40,00+/-31,89 e Poliklonalne anty-aβ42 17,61 0, ,+/-4,36 mab D5 8 21,68 0, ,29+/-19,43 mab ,59 0, ,59+/-6,59 mab 21F ,80 >0, ,88+/-9,90 a. Liczba osobników w grupie na końcu doświadczenia b. ng/g tkanki c. Test Manna-Whitneya d. n.d.: nie dotyczy e. Odchylenie standardowe

80 81 [0199] Stężenie APP określono także z zastosowaniem testu ELISA w korze mózgowej i móżdżku u myszy, którym podano przeciwciało oraz u myszy kontrolnych (PBS). Zastosowano dwa różne testy APP. Pierwszy, oznaczony APP-α/FL, pozwala identyfikować APP-alfa (α, wydzielaną formę APP, która została przecięta w sekwencji Aβ) i formy APP o pełnej długości (FL); z kolei drugi pozwala identyfikować jedynie APP-α. W przeciwieństwie do związanego z leczeniem zmniejszenia poziomu Aβ w części grup otrzymujących leczenie, poziom APP praktycznie nie zmieniał się u wszystkich osobników leczonych w porównaniu do osobników kontrolnych. Wyniki te wskazują, że immunizacja z użyciem przeciwciał Aβ zmniejsza poziom Aβ, nie zmniejszając poziomu APP. [00] W podsumowaniu stwierdza się, że poziom Aβ znacznie się zmniejszył w korze mózgowej, hipokampie i móżdżku osobników, którym podawano przeciwciało poliklonalne przeciwko AN1792. Przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko regionowi na końcu aminowym Aβ1-42, w szczególności aminokwasom 1-16 i 13-28, także wykazywały znaczący efekt leczenia, jednak w mniejszym stopniu. D. Analizy histochemiczne: [01] Oznaczono ilościowo morfologię blaszek immunoreaktywnych Aβ w podgrupach mózgów pobranych od myszy w grupach otrzymujących PBS, poliklonalne Aβ42, 21F12, 266 i D5 w porównaniu do poprzednich badań, w których korzystano ze standardowych procedur immunizacji z użyciem Aβ42. [02] Największa zmiana zarówno wielkości, jak i wyglądu blaszek amyloidowych wystąpiła u osobników immunizowanych poliklonalnym przeciwciałem Aβ42. Zmniejszenie obciążenia amyloidem, zerodowana morfologia blaszki i immunoreaktywność komórkowa Aβ przypominała ściśle wyniki uzyskane z zastosowaniem standardowej procedury immunizacji. Te obserwacje potwierdzają wyniki testu ELISA, w uzyskano których znaczne zmniejszenie poziomu całkowitego Aβ i Aβ42 przez podawanie poliklonalnego przeciwciała Aβ42. [03] W podobnych badaniach ilościowych stwierdzono zmniejszenie ilości i występowania blaszek amyloidowych w grupie

81 82 D5, przy pewnych dowodach na komórkową immunoreaktywność Aβ. W porównaniu do osobników kontrolnych poliklonalna frakcja Ig przeciwko Aβ i jedno z przeciwciał monoklonalnych (D5) zmniejszały obciążenie blaszką odpowiednio o 93% i 81%, (p<0,005). Okazało się, że 21F12 ma stosunkowo umiarkowany wpływ na obciążenie blaszką. Mikrografie mózgu po podaniu pabaβ 1-42 wykazują rozproszone złogi i brak wielu większych, zwartych blaszek w grupie, której podawano pabaβ 1-42 w porównaniu do osobników kontrolnych. E. Odpowiedź limfoproliferacyjna [04] Limfoproliferację zależną od Aβ mierzono przy użyciu komórek śledziony pobranych osiem dni po ostatnim wlewie przeciwciał. Świeżo pobrane komórki hodowano w ilości 5 na dołek przez 5 dni w obecności Aβ1-40 w stężeniu 5 µm, aby wywołać stymulację. Jako kontrolę dodatnią hodowano dodatkowe komórki z mitogenem komórek T, PHA, a jako kontrolę ujemną hodowano dodatkowe komórki bez dodatku peptydu. [05] Splenocyty pobrane od starszych myszy PDAPP immunizowanych biernie z użyciem różnych przeciwciał anty-aβ stymulowano in vitro z użyciem AN1792 i mierzono odpowiedź proliferacyjną i cytokinową. Celem tych badań było stwierdzenie, czy immunizacja bierna ułatwiła prezentację antygenu i w ten sposób pobudzenie reakcji komórek T swoistej wobec AN1792. U myszy immunizowanych biernie z użyciem przeciwciał anty-aβ nie stwierdzono swoistej wobec AN1792 odpowiedzi proliferacyjnej ani cytokinowej. Przykład II: Skuteczność lecznicza przeciwciał anty-aβ: mab 2H3, mab D5, mab 266, mab 21F12, mab 3D6, mab 16C11 i pab Aβ1-42 [06] W drugim badaniu powtórzono podawanie D5 i przebadano dwa dodatkowe przeciwciała anty-aβ, przeciwciała monoklonalne 3D6 (Aβ1-5) i 16C11 (Aβ33-42). Grupom kontrolnym podano PBS lub nieistotne przeciwciało o dopasowanym izotypie (TM2a). Myszy były starsze (heterozygotyczne w wieku 11,5-12 miesięcy) niż w poprzednim badaniu; poza tym schemat doświadczenia był identyczny. Również w tym badaniu po sześciu miesiącach leczenia

82 83 przeciwciało D5 zmniejszyło obciążenie blaszką o ponad 80% względem grup kontrolnych, którym podawano PBS lub nieistotne przeciwciało o dopasowanym izotypie (p=0,003). Jedno z pozostałych przeciwciał przeciwko Aβ, 3D6, było równie skuteczne i doprowadziło do 86% redukcji (p=0,003). W przeciwieństwie do tego trzecie przeciwciało przeciwko peptydowi, 16C11, nie miało żadnego wpływu na obciążenie blaszką. Podobne rezultaty otrzymano w pomiarach Aβ42 z zastosowaniem testu ELISA. [07] Wyniki te wykazują, że odpowiedź przeciwciał przeciwko peptydowi Aβ przy braku odporności związanej z komórkami T jest wystarczająca do zmniejszenia odkładania się amyloidu u myszy PDAPP, jednak nie wszystkie przeciwciała anty-aβ są jednakowo skuteczne. Szczególnie skuteczne są przeciwciała skierowane przeciwko epitopom zawierającym aminokwasy 1-5 lub 3-7 Aβ. W podsumowaniu stwierdza się, że można wykazać, iż podane w sposób bierny przeciwciała przeciwko Aβ (tzn. immunizacja bierna) zmniejszają nasilenie odkładania blaszki w mysim modelu choroby Alzheimera. Przykład III: Monitorowanie wiązania przeciwciała w OUN [08] Ten przykład wykazuje, że jeśli stężenie przeciwciał w surowicy jest umiarkowane (-70 µg/ml), mają one dostęp do OUN na poziomie wystarczającym do osadzenia się na blaszce β- amyloidowej. [09] W celu stwierdzenia, czy przeciwciała przeciwko Aβ mogą oddziaływać bezpośrednio na OUN, zbadano, czy w mózgach myszy po perfuzji fizjologicznym roztworem chlorku sodu na końcu przykładu II występowały przeciwciała podane obwodowo. Nieutrwalone skrawki mózgu z kriostatu poddano działaniu odczynnika fluorescencyjnego przeciwko immunoglobulinie mysiej (kozia antymysia IgG-Cy3). Blaszki w mózgach grup D5 i 3D6 były silnie obsadzone przeciwciałami, natomiast w grupie 16C11 barwienia nie stwierdzono. Aby określić całkowity zakres odkładania blaszki, seryjne skrawki każdego mózgu poddano najpierw immunoreakcji z przeciwciałem anty-aβ, a następnie z drugim odczynnikiem. Po podaniu obwodowym D5 i 3D6 uzyskały

83 84 dostęp do większości blaszek w OUN. Obciążenie blaszką znacznie się zmniejszyło w tych grupach dawkowania w porównaniu z grupą 16C11. Dostęp przeciwciała do OUN nie wynikał z nieprawidłowej nieszczelności bariery krew-mózg, ponieważ przy oznaczaniu z użyciem błękitu Evansa u myszy PDAPP nie stwierdzono przepuszczalności naczyniowej. Ponadto stężenie przeciwciała w miąższu mózgu starszych myszy PDAPP było identyczne w porównaniu z myszami nietransgenicznymi, stanowiąc 0,1% stężenia przeciwciała w surowicy (niezależnie od izotypu). [02] Te dane wskazują, że przeciwciała podane obwodowo mogą wnikać do OUN, w którym mogą bezpośrednio powodować usuwanie amyloidu. Jest prawdopodobne, że 16C11 także miał dostęp do blaszki, nie mógł się jednak wiązać. Przykład IV: Badanie przesiewowe ex vivo aktywności przeciwciała przeciwko złogom amyloidowym [0211] W celu zbadania wpływu przeciwciał na usuwanie blaszki opracowano test ex vivo, w którym pierwotne komórki mikrogleju hodowano z nieutrwalonymi skrawkami mózgu z kriostatu mózgów myszy PDAPP lub ludzi z AD. Komórki mikrogleju otrzymano z kory mózgowej noworodków myszy DBA/2N (w wieku 1-3 dni). Korę mózgową poddano rozdzieleniu mechanicznemu w HBSS - (zrównoważony roztwór soli Hanka, Sigma) z 50 µg/ml DNazy I (Sigma). Rozdzielone komórki przesączono przez sita do komórek o wielkości oczek 0 µm (Falcon) i wirowano przy 00 obr./min przez 5 minut. Osad zawieszono w pożywce hodowlanej (DMEM o dużej zawartości glukozy, % FBS, ng/ml rmgm-csf) i komórki wysiano przy gęstości 2 mózgów w kolbie z tworzywa sztucznego do hodowli T- 75. Po 7-9 dniach kolby wirowano na wytrząsarce orbitalnej przy 0 obr./min przez 2h w temperaturze 37 C. Zawiesinę komórek wirowano przy 00 obr./min i zawieszono w środowisku testowym. [0212] -µm skrawki z kriostatu z mózgów myszy PDAPP lub ludzi z AD (czas po śmierci <3 h) rozmrożono, nałożono na szklane okrągłe szkiełka nakrywkowe pokryte polilizyną i umieszczono w dołkach 24-dołkowych płytek do hodowli tkankowych. Szkiełka nakrywkowe przemyto dwukrotnie pożywką testową, zawierającą H-

84 85 SFM (wolna od surowicy pożywka do hodowli hybrydom, Gibco BRL) z 1% FBS, glutaminą, penicyliną/streptomycyną i 5 ng/ml rmgm-csf (R&D). Dodawano przeciwciała kontrolne lub anty-aβ w stężeniu 2x (ostateczne stężenie 5 µg/ml) przez 1 godzinę. Następnie komórki mikrogleju wysiewano przy gęstości 0,8 x 6 komórek/ml pożywki testowej. Komórki utrzymywano w inkubatorze z nawilżaczem (37 C, 5% CO 2 ) przez 24 h lub dłużej. Pod koniec inkubacji hodowle utrwalono w 4% paraformaldehydzie i zakonserwowano w 0,1% Triton-X0. Skrawki barwiono z użyciem biotynylowanego 3D6, a następnie koniugatu streptawidyny/cy3 (Jackson ImmunoResearch). Egzogenne komórki mikrogleju wizualizowano poprzez barwienie jąder komórkowych (DAPI). Hodowle obserwowano z użyciem odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego (Nikon, TE0) i wykonywano mikrofotografie za pomocą aparatu cyfrowego SPOT oraz oprogramowania SPOT (Diagnostic Instruments). Do analizy metodą Western blot hodowle ekstrahowano 8M mocznikiem, rozcieńczano w stosunku 1:1 redukującym buforem do próbek z tricyną i nakładano na 16% żel tricynowy (Novex). Po przeniesieniu na Immobilon odciski poddawano działaniu 5 µg/ml pabaβ42, a następnie przeciwciała antymysiego sprzężonego z HRP i wywoływano z użyciem ECL (Amersham). [0213] Jeśli test wykonywano na skrawkach mózgu PDAPP w obecności 16C11 (jednego z przeciwciał przeciwko Aβ, które nie były skuteczne in vivo), blaszka β-amyloidowa pozostawała niezmieniona i nie stwierdzano fagocytozy. W przeciwieństwie do tego, kiedy sąsiednie skrawki hodowano w obecności D5, złogi amyloidowe w znacznej mierze zanikały, a w komórkach mikrogleju obecnych było wiele pęcherzyków fagocytotycznych, zawierających Aβ. Identyczne wyniki uzyskano w przypadku skrawków mózgów z AD. D5 indukowało fagocytozę blaszki AD, natomiast 16C11 było nieskuteczne. Ponadto test dostarczył porównywalnych wyników, jeśli wykonywano go z użyciem mysich lub ludzkich komórek mikrogleju oraz z przeciwciałami przeciwko Aβ mysimi, króliczymi lub od naczelnych.

85 86 [0214] W tabeli 7 porównano wiązanie Aβ wobec fagocytozy dla swoistości wiązania kilku różnych przeciwciał. Widać, że przeciwciała wiążące się z epitopami w obrębie aminokwasów 1-7 wiążą się i usuwają złogi amyloidu, natomiast przeciwciała wiążące się z epitopami w obrębie aminokwasów 4- wiążą się, jednak nie usuwają złogów amyloidu. Przeciwciała wiążące się z epitopami C-końcowymi do reszty nie wiążą się ani nie usuwają złogów amyloidowych. Tabela 7: Analiza swoistości wobec epitopów Przeciwciało Epitop Izotyp Barwienie Fagocytoza N-końcowe mab 3D6 1-5 IgG2b + + D5 3-7 IgG C8 3-7 IgG2a + + 6E 5- IgG A8 4- Szczurza IgG1 + - Aminokwasy G11-18 Szczurza IgG IgG D IgG2b - - C-końcowe 2G3-40 IgG C11-40/-42 IgG F12-42 IgG2a - - Surowica odpornościowa Królicza (CFA) Mysia (CFA) Mysia (QS-21) Małpia (QS-21) Mysia (MAP1-7) + + [02] W tabeli 8 przedstawiono wyniki uzyskane z zastosowaniem szeregu przeciwciał przeciwko Aβ - porównanie ich zdolność do indukcji fagocytozy w teście ex vivo i do zmniejszania obciążenia blaszką w badaniach transferu biernego. Jakkolwiek 16C11 i 21F12 wiązały się ze zagregowanym syntetycznym peptydem

86 87 Aβ z dużą awidnością, te przeciwciała nie były zdolne do reagowania z blaszką β-amyloidową w nieutrwalonych skrawkach mózgu i nie wywoływały fagocytozy w teście ex vivo oraz nie były skuteczne in vivo. D5, 3D6 i przeciwciało poliklonalne przeciwko Aβ były aktywne we wszystkich trzech pomiarach. Wyniki te wskazują, że skuteczność in vivo wynika z usuwania blaszki w OUN wskutek bezpośredniego działania przeciwciała oraz że test ex vivo pozwala przewidywać skuteczność in vivo. Tabela 8: Test ex vivo jako czynnik predykcyjny skuteczności in Przeciwciało Izotyp Awidność wobec zagregowanego Aβ (pm) vivo Wiązanie z blaszką β- amyloidową Skuteczność ex vivo Skuteczność in vivo Monoklonalne 3D6 IgG2b D5 IgG C11 IgG F12 IgG2a TM2a IgG Poliklonalne 1-42 Mieszanina [0216] Ten sam test wykorzystano do badania aktywności usuwania przeciwciała przeciwko fragmentowi synukleiny, oznaczanemu jako NAC. Wykazano, że synukleina jest białkiem związanym z blaszką amyloidową. Przeciwciało przeciwko NAC zetknięto z próbką tkanki mózgowej zawierającej blaszkę amyloidową i komórki mikrogleju, jak opisano powyżej. Jako kontrolę zastosowano surowicę króliczą. Późniejsze monitorowanie wykazało znaczny spadek liczby i wielkości blaszek, co wskazywało na aktywność usuwania przeciwciała. [0217] W celu potwierdzenia internalizacji Aβ podczas testu ex vivo zastosowano mikroskopię konfokalną. W obecności przeciwciał kontrolnych egzogenne komórki mikrogleju pozostawały na płaszczyźnie konfokalnej nad tkanką, nie było pęcherzyków fagocytycznych zawierających Aβ, a blaszki w skrawku pozostawały niezmienione. W obecności D5 niemal cały materiał blaszki znajdował się w pęcherzykach w egzogennych komórkach mikrogleju.

87 88 Aby określić, co stało się ze zinternalizowanym peptydem, hodowle, które traktowano D5, ekstrahowano 8M mocznikiem w różnych punktach czasowych i badano metodą Western blot. Po jednej godzinie, kiedy fagocytoza jeszcze nie zaszła, reakcja z przeciwciałem poliklonalnym przeciwko Aβ wykazała silny prążek przy 4 kd (odpowiadający peptydowi Aβ). Immunoreaktywność Aβ zmniejszała się po 1. dniu i nie występowała od 3. dnia. Fagocytoza Aβ, w której pośredniczą przeciwciała, prowadzi zatem do jego rozpadu. [0218] W celu stwierdzenia, czy fagocytoza w teście ex vivo była związana z Fc, otrzymano fragmenty F(ab )2 przeciwciała anty-aβ 3D6. Jakkolwiek fragmenty F(ab )2 zachowały pełną zdolność do reagowania z blaszką, nie były zdolne do wywoływania fagocytozy przez komórki mikrogleju. Ponadto fagocytozę w przypadku całego przeciwciała można było zablokować odczynnikiem przeciwko mysim receptorom Fc (anty-cd16/32). Dane te wskazują, że usuwanie Aβ in vivo następuje w wyniku fagocytozy, w której pośredniczy receptor Fc. Przykład V: Przechodzenie przeciwciał przez barierę krew-mózg [0219] W tym przykładzie oznaczono stężenie przeciwciała, które dostało się do mózgu po wstrzyknięciu dożylnym do tkanki obwodowej u myszy zdrowych lub PDAPP. Po zabiegu u myszy PDAPP lub zdrowych myszy kontrolnych wykonano perfuzję z użyciem 0,9% NaCl. Wypreparowano obszary mózgu (hipokamp lub korę mózgową) i natychmiast zamrożono. Mózg homogenizowano w 0,1% Triton z inhibitorami proteazy. W ekstraktach wykrywano immunoglobulinę testem ELISA. F(ab) 2 koziej antymysiej IgG nałożono na płytkę RIA (odczynnik wychwytujący). Ekstrakty surowicy lub mózgu inkubowano przez 1 h. Izotypy wykrywano z użyciem antymysiego IgG1-HRP, IgG2a-HRP lub IgG2b-HRP (Caltag). Niezależnie od izotypu przeciwciała występowały w OUN w stężeniu stanowiącym 1:00 wartości występującej we krwi. Jeśli stężenie IgG1 było na przykład trzykrotnie większe od stężenia IgG2a we krwi, było także trzykrotnie większe od IgG2a w mózgu; oba występowały w stężeniu stanowiącym 0,1% odpowiedniego poziomu we krwi. Wynik ten zaobserwowano zarówno u myszy transgenicznych, jak i

88 89 nietransgenicznych, co wskazuje na to, że u PDAPP nie występuje wyjątkowa nieszczelność bariery krew-mózg. Przykład VI. Klonowanie i sekwencjonowanie regionów zmiennych mysiego 3D6 [02] Klonowanie i analiza sekwencji 3D6 VH. Region zmienny łańcucha ciężkiego VH 3D6 klonowano metodą RT-PCR, wykorzystując mrna otrzymany z komórek hybrydom dwoma niezależnymi metodami. W pierwszej z nich zastosowano startery konsensusowe wobec peptydu liderowego regionu VH, zawierające kodon inicjacji translacji jako starter 5 (DNA nr ) i starter 3 swoisty wobec regionów stałych g2b (DNA nr 3832). Sekwencje produktu powielonego metodą PCR, a także z wielu niezależnie otrzymanych klonów były całkowicie zgodne ze sobą. Aby jeszcze raz zbadać sekwencję regionu 3D6 VH, wynik potwierdzono poprzez sekwencjonowanie fragmentu VH uzyskanego z użyciem metody 5 RACE RT-PCR i swoistego startera 3 g2b (DNA nr 3832). Także w tym przypadku sekwencję otrzymano z produktu PCR, a także wielu niezależnie otrzymanych klonów. Obie sekwencje były całkowicie zgodne ze sobą (z wyjątkiem substytucji V8I w regionie liderowym z produktu 5 RACE), co wskazuje na to, że sekwencje pochodzą z mrna kodującego region VH 3D6. Nukleotyd (sekwencja o nr. ident. 3) i sekwencję aminokwasową (sekwencja o nr. ident. 4) regionu VH 3D6 przedstawiono odpowiednio w tabeli 9A i na Fig. 2. Tabela 9A: Sekwencja nukleotydowa VH mysiego 3D6 ATGAACTTCGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGA AGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGCGTCTCTGAAACTCT CCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTATGGCATGTCTTGGGTTCGCCAGAAT TCAGACAAGAGGCTGGAGTGGGTTGCATCCATTAGGAGTGGTGGTGGTAGAACCTACTA TTCAGACAATGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGAGAATGCCAAGAACACCCTGT ACCTGCAAATGAGTAGTCTGAAGTCTGAGGACACGGCCTTGTATTATTGTGTCAGATAT GATCACTATAGTGGTAGCTCCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACT (sekwencja o nr. ident. 3) *Peptyd liderowy podkreślono [0221] Klonowanie i analiza sekwencji 3D6VL. Region zmienny VL łańcucha lekkiego 3D6 klonowano w sposób analogiczny do regionu

89 90 VH. W pierwszym badaniu zaprojektowano zestaw starterów konsensusowych do powielania mysich regionów VL w sposób następujący: opracowano startery 5 (DNA nr ) do hybrydyzacji z regionem VL, zawierającym kodon inicjacji translacji, a starter 3 (DNA nr 3817) był swoisty wobec mysiego regionu CK w dół od regionu łączącego V-J. Analiza sekwencji DNA fragmentu PCR, a także wielu niezależnie otrzymanych klonów wyizolowanych z użyciem zestawu konsensusowych starterów wobec łańcucha lekkiego wykazała, że otrzymany cdna pochodził od przegrupowanej niefunkcjonalnie sekwencji, ponieważ sekwencja zawierała mutację ramki odczytu między połączeniem regionu V-J. [0222] W drugim badaniu do klonowania drugiego VL kodującego cdna zastosowano 5 RACE. Analiza sekwencji DNA tego produktu (konsensus 11) wykazała, że koduje on funkcjonalny mrna. Można więc stwierdzić, że sekwencja ta koduje prawidłowy mrna łańcucha lekkiego 3D6. Nukleotyd (sekwencja o nr. ident. 1) i sekwencję aminokwasową (sekwencja o nr. ident. 2) regionu VL 3D6 przedstawiono odpowiednio w tabeli 9B i na Fig. 1. Tabela 9B: Sekwencja nukleotydowa VL mysiego 3D6 ATGATGAGTCCTGCCCAGTTCCTGTTTCTGTTAGTGCTCTGGATTCGGGAAACCAACGG TTATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCT CCATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGACATATTTGAAT TGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACT GGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTTACACTGA AAATCAGCAGAATAGAGGCTGAGGATTTGGGACTTTATTATTGCTGGCAAGGTACACAT TTTCCTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA (sekwencja o nr. ident. l) *Peptyd liderowy podkreślono [0223] Startery wykorzystane do klonowania cdna 3D6 VL przedstawiono w tabeli.

90 91 DNA Wielkość Nić Sekwencja DNA kodująca? Tak ACT.AGT.CGA.CAT.GAA.GTT.GCC.TGT.TA G.GCT.GTT.GGT.GCT.G (SEKWENCJA O NR. IDENT. 39) Tak ACT.AGT.CGA.CAT.,GGA.GWC.AGA.CAC.AC T.CCT.GYT.ATG.GGT (SEKWENCJA O NR. IDENT. 40) Tak ACT.AGT.CGA.CAT.GAG.TGT.GCT.CAC.TC A.GGT.CCT.GGS.GTT.G (SEKWENCJA O NR. IDENT. 41) Tak ACT.AGT.CGA.CAT.GAG.GRC.CCC.TGC.TC A.GWT.TYT.TGG.MWT.CTT.G (SEKWENCJA O NR. IDENT. 42) Tak ACT.AGT.CGA.CAT.GGA.TTT.WCA.GGT.GC A.GAT.TWT.CAG.CTT.C (SEKWENCJA O NR. IDENT. 43) Tak ACT.AGT.CGA.CAT.GAG.GTK.CYY.TGY.TS A.GYT.YCT.GRG.G (SEKWENCJA O NR. IDENT. 44) Tak ACT.AGT.CGA.CAT.GGG.CWT.CAA.GAT.GG A.GTC.ACA.KWY.YCW.GG (SEKWENCJA O NR. IDENT. 45) Tak ACT.AGT.CGA.CAT.GTG.GGG.AYC.TKT.TT Y.CMM.TTT.TTC.AAT.TG (SEKWENCJA O NR. IDENT. 46) 3814 Tak ACT.AGT.CGA.CAT.GGT.RTC.CWC.ASC.TC A.GTT.CCT.TG (SEKWENCJA O NR. IDENT. 47) Uwagi Starter 1 do mysiego zmiennego kappa %A+T= 50,00 []; % C+G = 50,00 [] Davis, Botstein, Roth; temp. topnienia, C. 72,90 Starter 2 do mysiego zmiennego kappa STARTER 2 MKV, MRC A+T= 46, [18];%C+G=48,72 [19] Davis, Botstein, Roth; temp. topnienia, C. 72,05 Starter 3 do mysiego zmiennego kappa STARTER 3 MKV, MRC; % A+T = 45,00 [18] ; % C+G = 52,50 [21] Davis, Botstein,Roth; temp. topnienia, C. 73,93 Starter 4 do mysiego zmiennego kappa STARTER 4, MKV, MRC; % A+T = 41,86 [18]; % C+G = 46,51 [] Davis, Botstein, Roth; temp. topnienia, C. 72,34 Starter 5 do mysiego zmiennego kappa STARTER 5, MRC A+T= 52,50 [21]; % C+G = 42,50 [17] Davis, Botstein, Roth; temp. topnienia, C. 69,83 Starter 6 do mysiego zmiennego kappa %A+T= 37,84 [14]; % C+G = 40,54 [] Davis, Botstein, Roth; temp. topnienia, C. 68,01 Starter 7 do mysiego zmiennego kappa STARTER 7, MRC; % A+T = 39,02 [16]; % C+G = 46,34 [19] Davis, Botstein, Roth; temp. topnienia, C. 71,70 Starter 8 do mysiego zmiennego kappa STARTER 8, MRC; % A+T = 53,66 [22]; % C+G = 34, [14] Davis, Botstein, Roth; temp. topnienia, C. 66,70 Starter 9 do mysiego zmiennego kappa % A+T= 45,71 [16];%C+G=45,71[16]

91 Tak ACT.AGT.CGA.CAT.GTA.TAT.ATG.TTT.GT T.GTC.TAT.TTC.T (SEKWENCJA O NR. IDENT. 48) Tak ACT.AGT.CGA.CAT.GGA.AGC.CCC.AGC.TC A.GCT.TCT.CTT.CC (SEKWENCJA O NR. IDENT. 49) Brak GGA.TCC.CGG.GTG.GAT.GGT.GGG.AAG.AT G (SEKWENCJA O NR. IDENT. 50) Tak ACT.AGT.CGA.CAT.GAA.ATG.CAG.CTG.GG T.CAT.STT.CTT.C(SEKWENCJA O NR. IDENT. 51) Tak ACT.AGT.CGA.CAT.GGG.ATG.GAG.CTR.TA T.CAT.SYT.CTT(SEKWENCJA O NR. IDENT. 52) Tak ACT.AGT.CGA.CAT.GAA.GWT.GTG.GTT.AA A.CTG.GGT.TTT.T(SEKWENCJA O NR. IDENT. 53) 3821 Tak ACT.AGT.CGA.CAT.GRA.CTT.TGG.GYT.CAG. CTT.GRT.TT(SEKWENCJA O NR. IDENT. 54) Tak ACT.AGT.CGA.CAT.GGA.CTC.CAG.GCT.CA A.TTT.AGT.TTT.CCT.T(SEKWENCJA O NR. IDENT. 55) Tak ACT.AGT.CGA.CAT.GGC.TGT.CYT.RGS.GC T.RCT.CTT.CTG.C(SEKWENCJA O NR. IDENT. 56) Tak ACT.AGT.CGA.CAT.GGR.ATG.GAG.CKG.GR T.CTT.TMT.CTT(SEKWENCJA O NR. IDENT. 57) Tak ACT.AGT.CGA.CAT.GAG.AGT.GCT.GAT.TC T.TTT.GTG(SEKWENCJA O NR. IDENT. 58) Tak ACT.AGT.CGA.CAT.GGM.TTG.GGT.GTG.GA yi.ctt.gct.att.cct.g (SEKWENCJA O NR. IDENT. 59) Tak ACT.AGT.CGA.CAT.GGG.CAG.ACT.TAC.AT T.CTC.ATT.CCT.G (SEKWENCJA O NR. IDENT. 60) Tak ACT.AGT.CGA.CAT.GGA.TTT.TGG.GCT.GA T.TTT.TTT.TAT.TG (SEKWENCJA O NR. IDENT. 61) Tak ACT.AGT.CGA.CAT.GAT.GGT.GTT.AAG.TC T.TCT.GTA.CCT.G (SEKWENCJA O NR. IDENT. 62) Davis, Botstein, Roth; temp. topnienia, C. 69,36 Starter do mysiego zmiennego kappa STARTER, MRC; % A+T = 70,27 [26]; % C+G = 29,73 [11] Davis, Botstein, Roth; temp. topnienia, C. 63,58 Starter 11 do mysiego zmiennego kappa STARTER 11, MRC; % A+T = 44,74 [17]; % C+G = 55,26 [21] Davis, Botstein, Roth; temp. topnienia, C. 74,40 Starter odwrotny do mysiego łańcucha lekkiego, aa ; starter Ck do regionu stałego, MRC + miejsce dla SmaI;% A+T = 47,06 [8] ; % C+G = 52,94 [9] Davis, Botstein, Roth; temp. topnienia, C. 57,19 Starter 1 do mysiego ciężkiego zmiennego starter 1 MHV, MRC; Starter 2 do mysiego ciężkiego zmiennego starter 2 MHV, MRC; Starter 3 do mysiego ciężkiego zmiennego starter 3 MHV, MRC; Starter 4 do mysiego ciężkiego zmiennego starter 4 MHV, MRC; Starter 5 do mysiego ciężkiego zmiennego; MRC; starter 5 MHV, MRC; Starter 6 do mysiego ciężkiego zmiennego starter 6 MHV, MRC; Starter 7 do mysiego ciężkiego zmiennego starter 7 MHV, MRC; Starter 8 do mysiego ciężkiego zmiennego starter 8 MHV, MRC; Starter 9 do mysiego ciężkiego zmiennego; starter 9, MRC Starter do mysiego ciężkiego zmiennego starter MHV, MRC; Starter 11 do mysiego ciężkiego zmiennego starter 11 MHV, MRC; Starter 12 do mysiego ciężkiego zmiennego starter 12 MHV, MRC;

92 ,7 Brak GGA.TCC.CGG.GAG.TGG.ATA.GAC.tGA.TG G (SEKWENCJA O NR. IDENT. 63) Mysi łańcuch ciężki IgG2b, położenia aminokwasów , MRC; 5 [0224] Od końca N do końca C łańcuchy lekkie i ciężkie zawierają domeny FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Przypisanie aminokwasów do każdej domeny jest zgodne z definicjami Kabata i wsp., patrz wyżej. [02] Ekspresja chimerowego przeciwciała 3D6: Regiony zmienne łańcucha ciężkiego i lekkiego poddano ponownym modyfikacjom tak, by kodowały sekwencje donorowe po splicingu w dół od odpowiednich połączeń VDJ lub VJ, i klonowano do pochodzącego od ssaka wektora ekspresyjnego pcmv-hγ1 w przypadku łańcucha ciężkiego i pcmv-hκ1 w przypadku łańcucha lekkiego. Wektory te kodują ludzkie regiony stałe γ1 i Ck jako fragmenty egzonowe w dół od wprowadzonej kasety regionu zmiennego. Po sprawdzeniu sekwencji wektory ekspresyjne łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego kotransfekowano do komórek COS. W celu potwierdzenia odtwarzalności wyniku kotransfekowano niezależnie dwa różne klony łańcucha ciężkiego (H2.2 i H3.2) z użyciem 3 różnych chimerowych klonów łańcucha lekkiego (L3, L4, i L). Jako kontrolę dodatnią wektorów przeprowadzono transfekcję dla chimerowego przeciwciała Pożywki kondycjonowane zebrano 48 h po transfekcji i badano metodą Western blot (wytwarzanie przeciwciał) lub ELISA (wiązanie Aβ). [0226] Wszystkie z wielu transfektantów wykazywały ekspresję kombinacji łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego, rozpoznawanej przez kozie przeciwciało anty-ludzkie IgG (H+L) w metodzie Western blot. [0227] Bezpośrednie wiązanie przeciwciał 3D6 i chimerowych 3D6 (PK1614) przeciwko Aβ zbadano testem ELISA. Stwierdzono, że chimerowe 3D6 wiąże się z Aβ z dużą awidnością, podobną do wykazywanej przez 3D6 (Fig. 3A). Ponadto test hamowania kompetycyjnego metodą ELISA wykazał, że przeciwciało chimerowe 3D6 i mysie 3D6 konkurowały w równy sposób z wiązaniem

93 94 biotynylowanego 3D6 z Aβ (Fig. 3B). Przeciwciało chimerowe wykazywało właściwości wiązania niemożliwe do odróżnienia od próbki odniesienia 3D6. 5 Tabela 11 Stężenie 3D6 PK1614 lgg1 (µg/ml) 0, ,3 0,11 118,6 118,9 0,33 99,7 71, 1 98,63 84,53 134,4 [0228] Ponadto zarówno 3D6, jak i PK1614 skutecznie usuwały blaszkę Aβ. Test ex vivo wykazuje, że w miarę wzrostu stężenia przeciwciała ilość Aβ zmniejsza się w podobny sposób dla mysich i chimerowych przeciwciał 3D6. Można więc stwierdzić, że te sekwencje kodują odpowiednio funkcjonalne łańcuchy ciężkie i lekkie 3D6. Przykład VII. Humanizowanie 3D6 [0229] Modelowanie homologii i modelowanie cząsteczkowe. W celu identyfikacji najważniejszych strukturalnych reszt zrębowych mysiego przeciwciała 3D6 wygenerowano model trójwymiarowy na podstawie najbliższych rozwiązanych struktur przeciwciał mysich w odniesieniu do łańcuchów ciężkich i lekkich. W tym celu jako matrycę do modelowania łańcucha lekkiego 3D6 wybrano przeciwciało oznaczone jako 1 CR9 (nr ident. PDB: 1CR9, Kanyo i wsp., patrz wyżej), jako matrycę do modelowania łańcucha ciężkiego wybrano zaś przeciwciało oznaczone jako 1OPG (nr ident. PDB: 1OPG Kodandapani i wsp., patrz wyżej). (Patrz także tabela 1). Dopasowanie sekwencji aminokwasowej 3D6 z łańcuchem lekkim i łańcuchem ciężkim tych przeciwciał wykazało, że z wyjątkiem CDR3 łańcucha ciężkiego - przeciwciała 1CR9 i 1OPG wykazują znaczną homologię sekwencji z 3D6. Ponadto pętle CDR wybranych przeciwciał należą do tych samych kanonicznych klas strukturalnych według Chothii, co pętle CDR 3D6, ponownie z wyjątkiem CDR3 łańcucha ciężkiego. W związku z tym do

94 95 modelowania homologii 3D6 wybrano początkowo 1CR9 i 1OPG jako przeciwciała o rozwiązanej strukturze. [02] Pierwszy model homologii regionu zmiennego 3D6 na podstawie przeciwciał wymienionych powyżej skonstruowano za pomocą modułów Look i SegMod pakietu oprogramowania GeneMine (wer. 3.5). Oprogramowanie zakupiono z licencją wieczystą w firmie Molecular Applications Group (Palo Alto, CA, USA). Ten pakiet oprogramowania, autorstwa dr. Michaela Levitta i dr. Chrisa Lee, ułatwia proces modelowania cząsteczkowego dzięki zautomatyzowaniu etapów niezbędnych do modelowania struktury sekwencji pierwszorzędowej na matrycy znanej struktury na podstawie homologii sekwencji. Korzystając ze stacji roboczej Silicon Graphics IRIS w środowisku UNIX, modelowaną strukturę udoskonalano następnie automatycznie w serii etapów minimalizacji energii, aby usunąć niekorzystne punkty styku atomów i zoptymalizować oddziaływania elektrostatyczne i van der Waalsa. [0231] Kolejny udoskonalony model skonstruowano, wykorzystując modelowanie za pomocą Quanta. Do bazy danych PDB wysłano zapytanie dotyczące CDR3 łańcucha ciężkiego 3D6; zidentyfikowano 1 qkz jako najbardziej homologiczny i zawierający identyczną liczbę reszt, co 3D6. CDR3 łańcucha ciężkiego 3D6 modelowano zatem, stosując jako matrycę strukturę krystaliczną 1 qkz. Ślad zrębu atomów węgla α modelu 3D6 przedstawiono na Fig. 4. Domenę VH ukazano jako linię przerywaną, domenę VL zaś jako linię ciągłą; CDR zaznaczono w postaci wstążki. [0232] Wybór sekwencji ludzkich przeciwciał akceptorowych. Odpowiednie ludzkie sekwencje przeciwciał akceptorowych zidentyfikowano poprzez komputerowe porównanie sekwencji aminokwasowych mysich regionów zmiennych z sekwencjami znanych przeciwciał ludzkich. Porównanie przeprowadzono oddzielnie dla łańcuchów ciężkich i lekkich 3D6. W szczególności domeny zmienne z przeciwciał ludzkich, których sekwencje zrębowe wykazywały znaczną identyczność sekwencji z mysimi regionami zrębowymi VL i VH, zidentyfikowano przez poszukiwanie w bazie danych Kabata z zastosowaniem NCBI BLAST (dostępny publicznie przez serwer

95 96 internetowy National Institutes of Health NCBI) z użyciem odpowiednich mysich sekwencji zrębowych. [0233] Jako sekwencje akceptorowe wybrano dwie proponowane sekwencje, na podstawie następujących kryteriów: (1) homologia z daną sekwencją; (2) wspólne sekwencje kanoniczne CDR z sekwencją donorową i (3) brak rzadkich reszt aminokwasowych w regionach zrębowych. Wybrana sekwencja akceptorowa dla VL ma numer identyfikacyjny według Kabata (KABID) 0192 (nr dostępowy w Genbank S40342), a dla VH jest to KABID (nr dostępowy w Genbank AF11). W pierwszych wersjach humanizowanego przeciwciała 3D6 wykorzystano te wybrane sekwencje przeciwciał akceptorowych. [0234] Substytucja reszt aminokwasowych. Jak stwierdzono powyżej, przeciwciała humanizowane według wynalazku zawierają zrębowe regiony zmienne, zasadniczo z immunoglobuliny ludzkiej (immunoglobulina akceptorowa), i regiony determinujące komplementarność zasadniczo z immunoglobuliny mysiej (immunoglobulina donorowa), oznaczane jako 3D6. Po identyfikacji regionów determinujących komplementarność 3D6 i odpowiednich ludzkich immunoglobulin akceptorowych kolejnym etapem było stwierdzenie, które reszty tych elementów, jeśli w ogóle, należy zastąpić w celu zoptymalizowania właściwości powstałego przeciwciała humanizowanego. Do wyboru reszt do substytucji wykorzystano kryteria opisywane powyżej. [02] Na Fig. 1 i 2 przedstawiono odpowiednio dopasowanie pierwotnych mysich VL i VH 3D6 z odpowiednią wersją 1 sekwencji humanizowanej, odpowiadającą ludzką akceptorową sekwencją zrębową i na końcu sekwencją ludzkiego regionu V linii płciowej, wykazującą największą homologię do ludzkiej akceptorowej sekwencji zrębowej. Reszty zacieniowane wskazują aminokwasy kanoniczne (jednolite wypełnienie), Verniera (zarys kropkowany), pakujące (wytłuszczone) i rzadkie (wytłuszczone, kursywa); zaznaczono je na rysunku. Gwiazdki oznaczają reszty poddane mutacji wstecznej do reszt mysich w ludzkiej akceptorowej sekwencji zrębowej, regiony CDR zaś podkreślono. Podsumowanie

96 97 zmian wprowadzonych do wersji 1 VH i VL humanizowanego 3D6 przedstawiono w tabeli Tabela 12. Podsumowanie zmian wprowadzonych do humanizowanego 3D6, wer. 1 Zmiany VL (112 reszt) VH (119 reszt) Hu->Mu: zrębowe 4/112 3/119 (1 kanoniczna, 1 pakująca) CDR1 6/16 3/5 CDR2 4/7 7/14 CDR3 5/8 4/ Hu->Mu 19/112 (17%) 17/119 (14%) Mu->Hu: zrębowe 13/112 14/119 Uwagi dotyczące mutacji wstecznych Uwagi dotyczące akceptorów Akceptorowa linia płciowa 1. I2V stanowiąca położenie kanoniczne 2. Y36L będąca resztą pakującą i ponadto w obrębie CDR 3. L46R będąca resztą pakującą i ponadto pod CDR 7. KABID 0192/nr dost. Genbank S Hu κ LC podgrupa II 9. CDR z tej samej kanonicznej grupy strukturalnej, co donor (m3d6) L1=klasa 4 1 L2=klasa L3=klasa 1. Swoistość nieznana. VH A3 i A19 4. S49A Vernier/pod CDR. 5. A93V będąca resztą pakującą i w strefie Verniera 6. K94R będąca resztą kanoniczną 11. KABID045919/nr dost. Genbank AF Hu HC podgrupa III 13. CDR z tej samej kanonicznej grupy strukturalnej, co donor (m3d6) H1= klasa 1 H2=klasa Rozpoznaje polisacharyd otoczki Neisseria meningitidis [0236] W tabelach 13 i 14 przedstawiono klucz do numeracji według Kabata odpowiednio dla różnych łańcuchów lekkich i ciężkich. Tabela 13: Klucz do numeracji według Kabata dla łańcucha lekkiego KAB Nr Nr Mysie VL 3D6 Rodzaj Ludzkie VL 3D6 KABID 0192 A19, linia płciowa Uwagi 1 1 FR1 Y Y D D Rzadka mysia, może stykać się z CDR 2 2 V V I I Kanoniczna/kontakt z CDR 3 3 V V V V 4 4 M M M M

97 T T T T 6 6 Q Q Q Q 7 7 T S S S 8 8 P P P P 9 9 L L L L T S S S L L L L S P P P V V V V T T T T I P P P G G G G Q E E E P P P P A A A A S S S S I I I I S S S S C c c C CDR1 K K R R S S S S S S S S Q Q Q Q 27A 28 S S S S 27B 29 L L L L 27C L L L L 27D 31 D D H H 27E 32 S S S S D D N N G G G G K K Y Y T T N N Y Y Y Y L L L L N N D D 40 FR2 W W W W L L Y Y Reszta pakująca L L L L Q Q Q Q R K K K P P P P G G G G Q Q Q Q S S S S P P P P K Q Q Q R R L L Reszta pakująca L L L L I I I I Y Y Y Y

98 CDR2 L L L L V V G G S S S S K K N N L L R R D D A A S S S S FR3 G G G G V V V V P P P P D D D D R R R R F F F F T S S S G G G G S S S S G G G G S S S S G G G G T T T T D D D D F F F F T T T T L L L L K K K K I I I I S S S S R R R R I V V V E E E E A A A A E E E E D D D D L V V V G G G G L V V V Y Y Y Y Y Y Y Y C C C C CDR3 W W M M Q Q Q Q G G A A T T L L H H Q Q F F T T 95 0 P P P P 96 1 R R R 97 2 T T T 98 3 FR4 F F F 99 4 G G G 0 5 G Q Q

99 1 6 G G G 2 7 T T T 3 8 K K K 4 9 L V V 5 1 E E E I I I 6A 112 K K K 0 KAB Nr Tabela 14. Klucz do numeracji według Kabata dla łańcucha Nr Mysie VH 3D6 Rodzaj Ludzkie VH 3D6 ciężkiego KABID FR1 E E E E 2 2 V V V V 3 3 K Q Q Q 4 4 L L L L 5 5 V L L L 6 6 E E E E 7 7 S S S S 8 8 G G G G 9 9 G G G G G G G G L L L L V V V V K Q Q Q P P P P G G G G A G G G S S S S L L L L K R R R L L L L S S S S C C C C A A A A A A A A S S S S G G G G F F F F T T T T F F F F S S S S CDR1 N N S S Y Y Y Y G G A A M M V M S S S S VH3-23, linia płciowa Uwagi

100 FR2 W W W W V V V V R R R R Q Q Q Q N A A A Rzadka mysia, zastąpić ludzką S P P P D G G G Rzadka mysia, zastąpić ludzką K K K K R G G G L L L L E E E E W W W W V V V V A A S S Kontakt z CDR/Vernier CDR2 S S A A I I I I R R S S 52A 53 S S G G G G S S G G G G G G G G R R S S T T T T Y Y Y Y Y Y Y Y S S A A D D D D N N S S V V V V K K K K G G G G FR3 R R R R F F F F T T T T I I I I S S S S R R R R E D D D N N N N A A A S K K K K N N N N T S S T L L L L Y Y Y Y L L L L Q Q Q Q M M M M 82A 84 S N N N

101 2 82B 85 S S S S 82C 86 L L L L K R R R S A A A E E E E D D D D T T T T A A A A L L L V Y Y Y Y Y Y Y Y C C C C V V A A Reszta pakująca, zastosować mysią R R K K Kanoniczna, zastosować mysią CDR3 Y Y D 96 0 D D N 97 1 H H Y 98 2 Y Y D 99 3 S S F 0 4 G G W 0A 5 S S S 0B 6 S S G 0C T 0D F 1 9 D D D 2 1 Y Y Y FR4 W W W G G G Q Q Q G G G 7 1 T T T T L L V V V T T T V V V S S S S S S 5 [0237] Korzystnie, powinowactwo wiązania przeciwciał humanizowanych względem Aβ wynosi co najmniej 7, 8, 9 lub M -1. Zazwyczaj górna wartość graniczna powinowactwa wiązania przeciwciał humanizowanych z Aβ jest trzy-, cztero- lub pięciokrotnie większa niż 3D6 (tzn. ~ 9 M -1 ). Często dolna

102 3 wartość graniczna powinowactwa wiązania także jest trzy-, cztero- lub pięciokrotnie większa od 3D6. [0238] Składanie i ekspresja VH i VL humanizowanego 3D6, wersja 1. W skrócie, dla każdego regionu V zsyntetyzowano 4 duże, jednoniciowe, nakładające się nukleotydy. Ponadto dla każdego regionu V zsyntetyzowano 4 krótkie startery do PCR, aby jeszcze bardziej ułatwić składanie danego regionu V. Sekwencje DNA oligonukleotydów zastosowanych w tym celu przedstawiono w tabeli. Tabela : Oligonukleotydy DNA Nr DNA Wielkość Kodujący? Sekwencja Tak tccgc aagct tgccg ccacc ATGGA CATGC GCGTG CCCGC CCAGC TGCTG GGCCT GCTGA TGCTG TGGGT GTCCG GCTCC TCCGG CTACG TGGTG ATGAC CCAGT CCCCC CTGTC CCTGC CCGTG ACCCC CGGCG A (SEKWENCJA O NR. IDENT. 17) Nie CTGGG GGGAC TGGCC GGGCT TCTGC AGCAG CCAGT TCAGG TAGGT CTTGC CGTCG GAGTC CAGCA GGGAC TGGGA GGACT TGCAG GAGAT GGAGG CGGGC TCGCC GGGGG TCACG GGCAG GGACA GGGGG G SEKWENCJA O NR. IDENT. 18) Tak ACCTG AACTG GCTGC TGCAG AAGCC CGGCC AGTCC CCCCA GCGCC TGATC TACCT GGTGT CCAAG CTGGA CTCCG GCGTG CCCGA CCGCT TCTCC GGCTC CGGCT CCGGC ACCGA CTTCA CCCTG AAGAT CTCCC GCGTG GAGGC C (SEKWENCJA O NR. IDENT. 19) Uwagi hum 3D6 VL-A hum 3D6 VL-B hum 3D6 VL-C Nie aattc tagga tccac tcacg CTTGA TCTCC ACCTT GGTGC CCTGG CCGAA GGTGC GGGGG AAGTG GGTGC CCTGC CAGCA GTAGT ACACG CCCAC GTCCT CGGCC TCCAC GCGGG AGATC TTCAG GGTGA AGTCG GTGCC GG (SEKWENCJA O NR. IDENT. ) Nie CTGGG GGGAC TGGCC G (SEKWENCJA O NR. IDENT. 21) Tak ACCTG AACTG GCTGC TGCAG AA (SEKWENCJA O NR. IDENT. 22) hum 3D6 VL-D hum 3D6 VL A+B prawy %A+T =18,75 [3]; % C+G = 81,2[13] Davis, Botstein, Roth Temp. topnienia, C. 66,96 hum 3D6 VL C+D lewy

103 Tak acaga aagct tgccg ccacc ATGGA GTTTG GGCTG AGCTG GCTTT TTCTT GTGGC TATTT TAAAA GGTGT CCAGT GTGAG GTGCA GCTGC TGGAG TCCGG CGGCG GCCTG GTGCA GCCCG GCGGC TCCCT GCGCC TGT (SEKWENCJA O NR. IDENT. 23) Nie GCCGC CGGAG CGGAT GGAGG CCACC CACTC CAGGC CCTTG CCGGG GGCCT GGCGC ACCCA GGACA TGCCG TAGTT GGAGA AGGTG AAGCC GGAGG CGGCG CAGGA CAGGC GCAGG GAGCC GCCGG GCTGC ACCAG (SEKWENCJA O NR. IDENT. 24) Tak CTGGA GTGGG TGGCC TCCAT CCGCT CCGGC GGCGG CCGCA CCTAC TACTC CGACA ACGTG AAGGG CCGCT TCACC ATCTC CCGCG ACAAC GCCAA GAACT CCCTG TACCT GCAGA TGAAC TCCCT GCGCG CCGAG GACAC CG (SEQIDNO:) Nie ctgca aggat ccact caccg GAGGA CACGG TCACC AGGGT GCCCT GGCCC CAGTA GTCGG AGGAG CCGGA GTAGT GGTCG TAGCG CACGC AGTAG TACAG GGCGG TGTCC TCGGC GCGCA GGGAG TTCAT CTGCA GGTAC AGGG (SEKWENCJA O NR. IDENT. 26) Nie GCCGC CGGAG CGGAT G (SEKWENCJA O NR. IDENT. 27) 4071 Tak CTGGAGTGGGTGGCCTCCAT (SEKWENCJA O NR. IDENT. 28) Tak tcc gca agc ttg ccg cca c (SEKWENCJA O NR. IDENT. 29) Nie aat tct agg atc cac tca cgc TTG ATC TC (SEKWENCJA O NR. IDENT. ) % A+T = 45,45 []; % C+G = 54,55 [12] Davis, Botstein, Roth Temp. topnienia, C. 64,54 hum 3D6 VH-A hum 3D6 VH-B hum 3D6 VH-C hum 3D6 VH-D hum 3D6 VH A+B prawy % A+T = 18,75 [3]; % C+G = 81,[13] Davis, Botstein, Roth Temp. topnienia, C. 66,96 hum 3D6 VH C+D lewy % A+T =,00 [7]; % C+G = 65,00 [13] Davis, Botstein, Roth Temp. topnienia, C. 66,55 Hum 3D6 VL A+B lewy % A+T = 31,58 [6]; % C+G = 68,42[13] Davis, Botstein, Roth Temp. topnienia, C. 66,64 Hum 3D6 VL C+D prawy

104 Tak aca gaa agc ttg ccg cca ccatg (SEKWENCJA O NR. IDENT. 31) Nie ctg caa gga tcc act cac cgg A (SEKWENCJA O NR. IDENT. 32) % A+T = 55,17[16]; % C+G = 44,83 [13] Davis, Botstein, Roth Temp. topnienia, C. 66,04 Hum 3D6 VH A+B lewy % A+T = 43,48 []; % C+G = 56,52 [13] Davis, Botstein, Roth Temp. topnienia, C. 66,33 Hum 3D6 VH C+D prawy % A+T = 40,91 [9]; % C+G = 59,09[13] Davis, Botstein, Roth Temp. topnienia, C. 66,40 5 [0239] Humanizowany łańcuch lekki został złożony metodą PCR. Analiza sekwencji DNA więcej niż dwudziestu czterech klonów wykazała rozproszone mutacje punktowe i delecje w całym regionie VL w odniesieniu do sekwencji oczekiwanej. Analiza sekwencji wykazała, że w klonie 2.3 można było dokonać naprawy dwóch położonych blisko siebie delecji pojedynczych nukleotydów w regionie aminoterminalnym. W związku z tym na klonie pcrshum3d6v12.3 przeprowadzono mutagenezę ukierunkowaną z użyciem oligonukleotydów w celu wprowadzenia dwóch usuniętych nukleotydów i naprawę mutacji punktowych potwierdzono metodą analizy sekwencji; insert VL klonowano do wektora ekspresyjnego łańcucha lekkiego pcmv-ck. [0240] Składanie humanizowanego VH metodami PCR doprowadziło do uzyskania klonów z dużymi delecjami w połowie sekwencji od strony 5. Kolejne próby optymalizacji warunków PCR zakończyły się częściowym sukcesem. Klony złożone z zastosowaniem zoptymalizowanych warunków PCR nadal miały delecje o długości - nukleotydów w regionie mapowanym na nałożeniu fragmentów A+B. W związku z tym w przypadku składania VH zastosowano inną strategię z wykorzystaniem polimerazy DNA (T4, Klenow i sekwenaza), która wydłużyła nałożenie, a następnie ligaza DNA T4 kowalencyjnie połączyła nakładające się końce. Analiza sekwencji

105 6 DNA podgrupy klonów uzyskanych w wyniku składania VH tą ostatnią metodą wykazała rozproszone mutacje punktowe i delecje w klonach. Analiza ponad dwudziestu czterech klonów wykazała zasadniczo ten sam wzorzec, co przedstawiony w odniesieniu do poprzednich klonów. Podobne wyniki obserwowane po pierwszym składaniu klonów VH i VL sugerują, że stwierdzone błędy w sekwencji DNA wynikały z błędów automatycznego syntetyzera podczas syntezy długich DNA zastosowanych do pierwszego składania. [0241] Do naprawy trzech delecji nukleotydowych, które stwierdzono, wybrano klon humanizowany VH 2.7 w celu naprawy na drodze mutagenezy ukierunkowanej. Przykład XIII: Określanie charakterystyki przeciwciała humanizowanego 3D6v2 [0242] Drugą wersję humanizowanego 3D6 wytworzono tak, że zawierała każdą z substytucji wskazanych dla wersji 1, z wyjątkiem substytucji D Y reszty 1. Substytucję na tej reszcie przeprowadzono w wersji 1, ponieważ stwierdzono, że reszta oddziałuje z CDR. W wyniku substytucji usunięta została jednak reszta rzadka w immunoglobulinie ludzkiej w tym położeniu. Dlatego wytworzono wersję bez tej substytucji. Ponadto reszty inne niż linii płciowej w regionach zrębowych łańcucha ciężkiego podstawiono odpowiednimi resztami linii płciowej: H74 = S, H77 = T i H89 = V. Numeracja według Kabata w przypadku wersji 2 łańcucha lekkiego i ciężkiego jest taka sama, jak odpowiednio w tabelach 13 i 14, oprócz tego, że reszta 1 wersji 2 łańcucha lekkiego to Asp (D), reszta 74 łańcucha ciężkiego to Ser (S), reszta 77 łańcucha ciężkiego to Thr (T), a reszta 89 łańcucha ciężkiego to Val (V). Sekwencję nukleotydową humanizowanego 3D6 wersji 1 łańcuchów lekkich i ciężkich przedstawiono odpowiednio w sekwencjach o nr. ident. 34 i 36. Sekwencję nukleotydową humanizowanego 3D6 wersji 2 łańcuchów lekkich i ciężkich przedstawiono odpowiednio w sekwencjach o nr. ident. i 37. Przykład IX: Badanie funkcjonalne przeciwciał humanizowanych 3D6 [0243] Wiązanie humanizowanego 3D6v1 ze zagregowanym Aβ. Badanie funkcjonalne przeciwciała humanizowanego 3D6v1 przeprowadzono z

106 7 użyciem pożywek kondycjonowanych z przejściowo transfekowanych komórek COS. Komórki transfekowano przeciwciałem w pełni chimerowym, mieszaniną chimerowego łańcucha ciężkiego i humanizowanego łańcucha lekkiego lub chimerowego łańcucha lekkiego i humanizowanego łańcucha ciężkiego i na koniec przeciwciałem w pełni humanizowanym. Zbadano wiązanie pożywek kondycjonowanych ze zagregowanym Aβ1-42 h, stosując test ELISA. Przeciwciało humanizowane wykazywało wysoką aktywność w granicach błędu doświadczalnego i właściwości wiązania nieodróżnialne od próbki referencyjnej chimerowego 3D6. Wyniki przedstawiono w tabeli 16. Tabela 16: ng/ml Chimerowe hu VH/ ChVL ChVH/ HuVL Hu VH/ HuVL 690 0, , ,83 2 0, , , , , , , ,45 0, , ,438 9,6 0,1 8,5 0,198 7,4 0, ,232 3,2 0,129 2,3 0,124 [0244] W celu porównania powinowactwa wiązania humanizowanych przeciwciał 3D6v1 i 3D6v2 przeprowadzono analizę metodą ELISA, wykorzystując jako antygen zagregowany Aβ. Wyniki wskazują, że 3D6v1 (H1L1) i 3D6v2 (H2L2) mają niemal identyczne właściwości wiązania Aβ (Fig. 5).

107 8 [0245] Analiza metodą substytucyjną NET (rnet) h3d6v2. Test mapy epitopu rnet pozwala uzyskać informacje o wkładzie poszczególnych reszt w obrębie epitopu w ogólną aktywność wiązania przeciwciała. W analizie rnet wykorzystuje się zsyntetyzowane systematyczne pojedynczo podstawione analogi peptydów. Wiązanie badanego przeciwciała określa się względem peptydu natywnego (antygen natywny) i względem 19 alternatywnych peptydów pojedynczo podstawionych, przy czym każdy peptyd jest podstawiony w pierwszym położeniu jednym z 19 nienatywnych aminokwasów dla tego położenia. Generuje się profil odzwierciedlający skutek substytucji w tym położeniu różnymi resztami nienatywnymi. Podobnie generuje się profile w kolejnych położeniach wzdłuż peptydu antygenowego. Połączony profil lub mapę epitopu (uwzględniającą substytucję w każdym położeniu 19 resztami nienatywnymi) można wtedy porównać z podobnie utworzoną mapą dla drugiego przeciwciała. Zasadniczo podobne lub identyczne mapy wskazują, że porównywane przeciwciała mają identyczną lub podobną swoistość epitopową. [0246] Analizę przeprowadzono dla 3D6 i humanizowanego 3D6, wersja 2. Zbadano wiązanie przeciwciał z natywnym peptydem Aβ DAEFRHDSGY (sekwencja o nr. ident. 33). Reszty 1-8 podstawiono systematycznie każdą z 19 nienatywnych reszt dla tego położenia. Wygenerowano odpowiednie mapy dla 3D6 i h3d6v2. Wyniki przedstawiono w postaci tabelarycznej w tabeli 17.

108 9 Tabela 17: Aβ: mapowanie substytucyjne epitopu wypadkowego (rnet) wt3d6 i humanizowanego 3D6

109 1 5 [0247] W szczególności profile są praktycznie identyczne w przypadku 3D6 i h3d6v2, jeśli uwzględni się substytucje w każdym położeniu (tzn. wartości ulegają fluktuacjom w sposób identyczny, jeśli porównuje się dane w kolumnie 1 (3D6) z kolumną 2 (h3d6v2). Dane te wskazują, że swoistość h3d6v2 jest zachowana, ponieważ mapa rnet epitopu h3d6v2 jest praktycznie identyczna z m3d6, jeśli wykorzystuje się reszty Aβ 1-4 i 5-8. [0248] Badanie immunohistochemiczne skrawków mózgu PDAPP dowodzi swoistości przeciwciała h3d6v1. Humanizowane przeciwciało 3D6v1

110 111 rozpoznawało Aβ w skrawkach mózgu wypreparowanych w kriostacie, pobranych od myszy PDAPP. Humanizowane 3D6v1 i PK1614 wiązały się z blaszką PDAPP przy tej samej zależności odpowiedzi od dawki, mierzonej na podstawie fluorescencji (wyrażanej ilościowo w pikselach) na szkiełko w porównaniu z ilością przeciwciała wykorzystaną do barwienia tkanki (Fig. 6). W tym doświadczeniu wykorzystano identyczne antyludzkie przeciwciała drugorzędowe. Uzyskiwanie skrawków, barwienie i procedury obrazowania omówiono wcześniej. W identycznych doświadczeniach analiza obrazów barwienia h3d6v2 w przypadku skrawków mózgu PDAPP i AD wykazała, że h3d6v2 rozpoznaje blaszkę Aβ w sposób podobny do 3D6v1 (np. blaszka silnie obsadzona). [0249] Analiza wiązania kompetycyjnego h3d6. Zdolność przeciwciał h3d6 v1 i v2 do konkurowania z mysim 3D6 mierzono testem ELISA, wykorzystując biotynylowane przeciwciało 3D6. Analiza wiązania kompetycyjnego wykazała, że h3d6v1, h3d6v2 oraz chimerowe PK1614 mogą konkurować z m3d6 o wiązanie z Aβ (Fig. 7). h3d6v1 i h3d6v2 miały identyczną zdolność konkurowania z 3D6 wobec Aβ. Jako kontrolę ujemną wykorzystano przeciwciało D5, ponieważ ma ono inny epitop wiązania niż 3D6. Analiza BIAcore także wykazała duże powinowactwo h3d6v1 i h3d6v2 do Aβ (tabela 18). Tabela 18: Pomiary powinowactwa przeciwciał Aβ techniką BIAcore Przeciwciało ka1 (1/Ms) kd1 (1/s) Kd (nm) Mu 3D6 4,06E +05 3,57E-04 0,88 Chimerowe 3D6 4,58E+05 3,86E-04 0,84 Hu 3D6v1 1,85E+05 3,82E-04 2,06 Hu 3D6v2 1,70E+05 3,78E-04 2,24 [00] W porównaniu do 3D6, którego Kd wynosi 0,88 nm, h3d6v1 i h3d6v2 wykazują około 2-3-krotnie mniejsze powinowactwo wiązania, wynoszące 2,06 nm i 2,24 nm odpowiednio dla h3d6v1 i h3d6v2. W teście wiązania kompetycyjnego metodą ELISA stwierdzono około 6-krotnie mniejsze powinowactwo wiązania w przypadku h3d6v1 i h3d6v2. Zazwyczaj przeciwciała humanizowane wykazują około 3-4-krotnie mniejsze powinowactwo wiązania w

111 112 porównaniu z ich mysimi odpowiednikami. W związku z tym spadek około 3-krotny (średnia wyników uzyskanych metodami ELISA i BIAcore) dla h3d6v1 i h3d6v2 mieści się w akceptowanym zakresie. [01] Badanie ex vivo z wykorzystaniem przeciwciała h3d6v2. Zdolność h3d6v2 do stymulacji komórek mikrogleju badano w teście fagocytozy ex vivo (Fig. 8). h3d6v2 indukował fagocytozę agregatów z tkanki mózgowej myszy PDAPP tak samo skutecznie, jak chimerowe 3D6. W tym doświadczeniu jako kontrolę ujemną zastosowano IgG, ponieważ jest niezdolna do wiązania Aβ i dlatego nie może indukować fagocytozy. [02] Lokalizacja h3d6 w mózgu in vivo. h3d6v2, m3d6 i przeciwciało DAE13 znakowane 1 I wstrzyknięto oddzielnie dożylnie 14 osobnikom myszy PDAPP w oddzielnych doświadczeniach. Myszy uśpiono po 7. dniu i przed dalszą analizą wykonano perfuzję. Wypreparowano okolice mózgu i zmierzono aktywność 1 I w określonych okolicach mózgu. Aktywność znacznika promieniotwórczego w mózgu porównano z aktywnością w próbkach surowicy. Wyniki przedstawiono w tabelach 19 i odpowiednio dla surowicy i okolic mózgu. Tabela 19 m3d6 DAE13 Hu3D6 389, , , , ,8 108, ,8 498, , , , ,9 1, ,7 421, , , , ,5 460,7 233,1 7119, , , , ,8 242, , , , ,9 338, ,9 144,5 126, , , ,7 671,4

112 113 Tabela m3d6 DAE13 Hu3D6 (H2L2) Móżdżek Kora Hipokamp Móżdżek Kora Hipokamp Móżdżek Kora Hipokamp 1991,9 238,9 645, , ,4 542, ,2 778,6 1199,3 21,8 742,1 1273,7 11,1 746, ,2 3737,9 2398,7 24,4 812,4,5 997,5 1291,9 1683,4 3234,5 56,7 13, ,1 4644,2 7975,8 7731,1 7124,1 2456,8 8693,5 24,4 5654,4 4887,3 8036,2 3405,2 4262,6 1277,5 502, ,7 891,6 12,6 1650,6 712,9 1172,9 67,9 1952,2 05,2 961,5 852,3 997,5 22,9 2123,5 28,2 849, ,5 3488,4 2318,5 1953,6 3697,2 21,7 1852,5 3382,9 1943,2 65,7 5711,9 6965,8 7801,6 1891,9 8245,2 7292,3 284,8 6643, ,7 6412,7 5121,4 8473,1 6717,4 213,1 2424,6 09, ,2 1192,2 2269,4 26,7 38,1 1245,7 2708,8 21,3 29,6 644,1 16,4 3759,4 2274,9 2265,9 5703, , ,1 1699, ,5 1772,2 1663,4 16, ,2 5316,3 395, ,6 8331, ,8 6831,2 7887, ,5 7986,9 5056, [03] Dane wykazują, że h3d6v2 był zlokalizowany w mózgu, a szczególnie duże stężenie występowało w okolicy hipokampu; wiadomo, że Aβ ulega tam agregacji. Ilość m3d6 i DAE13 w mózgu była porównywalna do h3d6v2. Wszystkie trzy przeciwciała były zdolne do przechodzenia przez barierę krew-mózg, co potwierdzono poprzez wiązanie blaszki Aβ in vivo. Przykład X. Klonowanie i sekwencjonowanie regionów zmiennych mysiego D5 [04] Klonowanie i analiza sekwencji D5 VH. Regiony VH i VL D5 klonowano metodą RT-PCR, stosując procedury 5 RACE z komórek hybrydom. Sekwencję nukleotydową (sekwencja o nr. ident. 13) i wywnioskowaną sekwencję aminokwasową (sekwencja o nr. ident. 14) pochodzącą od dwóch niezależnych klonów cdna kodujących domniemaną domenę VL D5 przedstawiono w tabeli 21 i

113 114 na Fig. 9. Sekwencję nukleotydową (sekwencja o nr. ident. ) i wywnioskowaną sekwencję aminokwasową (sekwencja o nr. ident. 16) pochodzącą od dwóch niezależnych klonów cdna kodujących domniemaną domenę VH D5 przedstawiono w tabeli 22 i na Fig.. Sekwencje VL i VH D5 spełniają kryteria funkcjonalnych regionów V, ponieważ zawierają ciągłą ORF od inicjatorowej metioniny do regionu C i mają wspólne reszty konserwatywne charakterystyczne dla genów regionu V immunoglobulin. Tabela 21: Sekwencja DNA VL mysiego D5 ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTACTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTGA TGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCA TCTCTTGCAGATCTAGTCAGAACATTATACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGG TACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTeCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATT TTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGA TCAAGAAAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAATTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTT CCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGGAA (SEKWENCJA O NR. IDENT. 13) *Peptyd liderowy podkreślono Tabela 22: Sekwencja DNA VH mysiego D5 ATGGACAGGCTTACTTCCTCATTCCTGCTGCTGATTGTCCCTGCATATGTCCTGTCCCA GGCTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGAATATTGCAGTCCTCCCAGACCCTCAGTCTGA CTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGCACTTCTGGTATGGGAGTGAGCTGGATTCGT CAGCCTTCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTACTGGGATGATGACAAGCG CTATAACCCATCCCTGAAGAGCCGGCTCACAATCTCCAAGGATACCTCCAGAAAGCAGG TATTCCTCAAGATCACCAGTGTGGACCCTGCAGATACTGCCACATACTACTGTGTTCGA AGGCCCATTACTCCGGTACTAGTCGATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGT CACCGTCTCCTCA (SEKWENCJA O NR. IDENT. ) *Peptyd liderowy podkreślono Przykład XI: Skuteczność mab 3D6 w przypadku różnych neuropatologicznych punktów końcowych u myszy PDAPP

114 1 [05] W tym przykładzie opisano skuteczność mysiego mab 3D6 w przypadku różnych neuropatologicznych punktów końcowych. Porównano immunizację bierną 3D6 (w różnych dawkach) i immunizację czynną z użyciem peptydu Aβ. Immunizacje [06] Myszy PDAPP immunizowano w sposób bierny z użyciem mab 3D6 w trzech różnych dawkach: mg/kg, 1 mg/kg i mg/kg raz w miesiącu (1 x 4). Jako kontrola służyły wstrzyknięcia niepowiązanego przeciwciała IgGγ2a (TY 11/) i PBS. Za porównanie służyła immunizacja czynna z użyciem peptydu Aβ. W każdej grupie analizowano od do osobników. [07] Do badanych neuropatologicznych punktów końcowych należały obciążenie amyloidem i obciążenie neurytów. Obciążenie amyloidem [08] Stopień zajęcia kory czołowej przez złogi amyloidowe określono poprzez barwienie immunologiczne z użyciem 3D6, a następnie ilościową analizę obrazową. Wyniki tej analizy przedstawiono w tabeli 6. Każda z immunoterapii doprowadziła do znacznej redukcji obciążenia amyloidem. Obciążenie neurytów [09] Obciążenie neurytów po immunizacji biernej z zastosowaniem 3D6 określono u myszy PDAPP na drodze barwienia immunologicznego skrawków mózgu z użyciem przeciwciała anty-app 8E5, a następnie ilościowej analizy obrazowej. Na dystrofię neurytów wskazuje występowanie dystroficznych neurytów (np. neurytów o wyglądzie globularnym), umiejscowionych w bezpośrednim sąsiedztwie blaszki amyloidowej. Wyniki tej analizy przedstawiono w tabeli 7. 3D6 (izotyp IgGγ2a rozpoznający Aβ1-5) nie zmniejszył w znacznym stopniu obciążenia neurytów w porównaniu z immunizacją czynną peptydem Aβ. Zaobserwowano wcześniej, że D5 (izotyp IgGγ1 rozpoznający 3-7) nie był zdolny do znacznego zmniejszenia obciążenia neurytów.

115 116 Tabela 23: Obciążenie amyloidem kory czołowej PBS TY 11/ 3D6, mg/kg 3D6,1 mg/kg 3D6, mg/kg/ 4 tygodnie Czynna N Mediana (%AB), ,3288 0, , , , Zakres 0, , ,064 0,077-0-,688 0-,7 31,961 63,362 Wartość p 0,94 ns ***0,0001 ***, *** <0,0001 ***0,0004 (*M-W) <0,0001 % zmiany b.d. 12% 94% 85% 90% 86% 5 Tabela 24: Obciążenie neurytów kory czołowej PBS TY 3D6, 3D6,1 3D6, mg/kg/4 Czynna 11/ mg/kg mg/kg tygodnie N Mediana (%NB) 0,3946 0,3958 0,4681 0,3649 0,4228 0,2344 Zakres 0-1, , ,98 0-1, ,82 0-1,1942 Wartość p 0,8967 0,9587 ns 0,6986 ns >0,9999 ***0,0381 (*M-W) ns % zmiany 0% 0% 7% 0% 41% [0260] Określenie charakterystyki różnych neuropatologicznych punktów końcowych w mysim modelu PDAPP choroby Alzheimera może pomóc specjaliście w opracowaniu odpowiednich protokołów immunizacji terapeutycznej u ludzi. Przykład XII. Profilaktyka i leczenie u ludzi [0261] W celu określenia bezpieczeństwa dla ludzi prowadzi się badanie I fazy dawki pojedynczej. Środek terapeutyczny podaje się w zwiększających się dawkach różnym pacjentom, poczynając od około 0,01 do oczekiwanego poziomu skuteczności i zwiększając je trzykrotnie do poziomu około -krotnie przekraczającego skuteczne dawkowanie u myszy. [0262] W celu określenia skuteczności terapeutycznej prowadzi się badanie II fazy. Wybrano pacjentów z chorobą Alzheimera w

116 117 stadium wczesnym lub średnim, określonym z zastosowaniem kryteriów Stowarzyszenia Choroby Alzheimera i Zaburzeń Pokrewnych (ADRDA) AD prawdopodobnej. Odpowiedni pacjenci uzyskują wynik w badaniu Mini-Mental (MMSE). Inne kryteria wyboru były następujące: pacjenci rokujący przeżycie czasu trwania badania i brak problemów zakłócających, takich jak jednoczesne stosowanie leków, które mogą powodować interakcje. Ocenę wyjściową funkcjonowania pacjenta przeprowadzono z wykorzystaniem tradycyjnych metod psychometrycznych, takich jak MMSE i ADAS, które stanowią pełną skalę oceny stanu i funkcjonowania pacjentów z chorobą Alzheimera. Metody psychometryczne stanowią miernik progresji choroby Alzheimera. Do monitorowania leczenia można także zastosować odpowiednie skale jakości życia. Progresję choroby można także monitorować metodą MRI. Można także monitorować profil krwi pacjentów, w tym badać odpowiedź przeciwciał swoistych wobec immunogenu i komórek T. [0263] Po dokonaniu oceny wyjściowej u pacjentów rozpoczyna się leczenie. Pacjenci są przypisywani losowo do grup i otrzymują czynnik terapeutyczny lub placebo w warunkach zaślepionych. Pacjentów monitoruje się co najmniej raz na sześć miesięcy. Skuteczność oznacza znaczne zmniejszenie progresji w grupie leczonej w porównaniu do grupy placebo. [0264] W celu określenia zmiany wczesnej utraty pamięci niezwiązanej z chorobą Alzheimera, którą niekiedy nazywa się zaburzeniem pamięci związanym z wiekiem (AAMI) lub łagodnym zaburzeniem poznawczym (MCI) w kierunku prawdopodobnej choroby Alzheimera definiowanej kryteriami ADRDA, prowadzi się drugie badanie II fazy. Pacjentów z dużym ryzykiem zmiany w kierunku choroby Alzheimera wybiera się z populacji nieleczonej klinicznie, badając przesiewowo populacje odniesienia w odniesieniu do wczesnych objawów utraty pamięci lub innych trudności związanych z objawami poprzedzającymi chorobę Alzheimera, choroby Alzheimera w wywiadzie rodzinnym, czynników ryzyka genetycznego, wieku, płci i innych cech predykcyjnych dużego ryzyka choroby Alzheimera. Gromadzi się wyniki wyjściowe

117 118 zgodnie z odpowiednimi metodami oceny, w tym MMSE i ADAS oraz innymi miernikami opracowywanymi w celu oceny bardziej zdrowej populacji. Te populacje pacjentów dzieli się na odpowiednie grupy z uwzględnieniem grupy porównawczej placebo względem alternatywnych dawek czynnika. Populacje pacjentów kontroluje się co około sześciu miesięcy; punktem końcowym u każdego pacjenta jest to, czy nastąpi zmiana w kierunku prawdopodobnej choroby Alzheimera definiowanej kryteriami ADRDA pod koniec obserwacji, czy też nie. Ogólne informacje o materiałach i metodach A. Otrzymywanie poliklonalnych i monoklonalnych przeciwciał Aβ. [0265] Przeciwciało poliklonalne anty-aβ otrzymano z krwi pobranej od dwóch grup zwierząt. Pierwsza grupa składała się ze 0 samic myszy Swiss Webster w wieku od 6 do 8 tygodni. Myszy immunizowano w dniu 0,. i 29. przez wstrzyknięcie 0 µg AN1792 w połączeniu z CFA/IFA. Czwarte wstrzyknięcie wykonano w 36. dniu, podając połowę dawki AN1792. Po uśpieniu w 42. dniu pobrano krew zwierząt, wyizolowano surowicę i wszystkie surowice połączono, otrzymując w sumie 64 ml. Druga grupa składała się z 24 samic myszy izogenicznych z myszami PDAPP, ale nietransgenicznych wobec ludzkiego genu APP, w wieku od 6 do 9 tygodni. Myszy immunizowano w dniu 0, 14., 28. i 56. przez wstrzyknięcie 0 µg AN1792 w połączeniu z CFA/IFA. Po uśpieniu w 63. dniu od zwierząt tych także pobrano krew, wyizolowano surowicę i połączono, otrzymując w sumie 14 ml. Obie partie surowic połączono. Frakcję przeciwciał oczyszczono przez dwa kolejne cykle wytrącania 50% nasyconym siarczanem amonu. Ostateczny strąt dializowano wobec PBS i badano na obecność endotoksyn. Poziom endotoksyn był niższy od 1 EU/mg. [0266] Przeciwciała monoklonalne anty-aβ otrzymano z płynu puchlinowego. Z płynu wpierw usunięto lipidy, dodając stężony roztwór dekstranosiarczanu sodu do lodowatego płynu puchlinowego, mieszając na lodzie do uzyskania ostatecznego stężenia 0,238%. Następnie dodano stężony CaCl 2, mieszając do

118 119 uzyskania ostatecznego stężenia 64 mm. Roztwór wirowano przy 000 x g i osad odrzucono. Nadsącz mieszano na lodzie z równą objętością nasyconego siarczanu amonu dodawanego kroplami. Roztwór ponownie wirowano przy 000 x g i supernatant odrzucono. Osad zawieszono i dializowano wobec mm Tris-HCl, 0,4 M NaCl, ph 7,5. Frakcję nałożono na kolumnę Pharmacia FPLC Sepharose Q i eluowano gradientem odwrotnym od 0,4 M do 0,275 M NaCl w mm Tris-HCl, ph 7,5. [0267] Na podstawie absorbancji przy 280 nm zidentyfikowano pik przeciwciała i odpowiednie frakcje połączono. Określono właściwości oczyszczonego preparatu przeciwciała, oznaczając stężenie białka metodą BCA i czystość metodą SDS-PAGE. Połączone frakcje badano ponadto na obecność endotoksyn. Poziom endotoksyn był niższy od 1 EU/mg. Mianom poniżej 0 przypisano arbitralnie wartość miana. B. Pomiar miana przeciwciał [0268] Od myszy pobrano krew przez niewielkie zadrapanie żyły ogonowej i około 0 µl krwi przenoszono do mikroprobówki. Od świnek morskich pobrano krew, goląc uprzednio obszar tylnego stawu skokowego, a następnie za pomocą igły rozmiaru 18 zadrapano żyłę śródstopia i krew pobrano do mikroprobówki. Krew pozostawiono do skrzepnięcia przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, wymieszano na worteksie i odwirowano przy x g przez min w celu oddzielenia skrzepu od surowicy. Następnie surowicę przeniesiono do czystej mikroprobówki i przechowywano w temperaturze 4 C do oznaczania miana. [0269] Miano przeciwciał oznaczano testem ELISA. Płytki 96- dołkowe do mikromiareczkowania (płytki Costar EIA) pokryto 0 µl roztworu zawierającego µg/ml Aβ42 lub SAPP bądź innych antygenów podanych w każdym sprawozdaniu w buforze do pokrywania dołków (0,1 M fosforan sodu, ph 8,5, 0,1% azydek sodu) i przechowywano przez noc w temperaturze pokojowej. Zawartość dołków pobrano i surowice dodano do dołków, zaczynając od rozcieńczenia 1/0 w rozcieńczalniku do próbek (0,014 M fosforan sodu, ph 7,4, 0, M NaCl, 0,6% albumina surowicy

119 1 bydlęcej, 0,05% timerosal). Otrzymano siedem kolejnych trzykrotnych rozcieńczeń próbek bezpośrednio na płytkach do ostatecznego rozcieńczenia 1/ Rozcieńczenia inkubowano w powleczonych dołkach płytek przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie płytki przemyto czterokrotnie PBS zawierającym 0,05% Tween. Drugie przeciwciało, kozią, antymysią Ig sprzężoną z peroksydazą chrzanową (otrzymaną z Boehringer Mannheim), dodano do dołków w postaci 0 µl rozcieńczenia 1/00 w rozcieńczalniku do próbek i inkubowano przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Płytki ponownie przemyto czterokrotnie PBS i Tween. W celu wizualizacji chromogenu do każdego dołka dodano 0 µl Slow TMB (3,3,5,5 - tetrametylobenzydyna otrzymana z Pierce Chemicals) i inkubowano przez min w temperaturze pokojowej. Reakcję zatrzymano, dodając µl 2 M H 2 SO 4. Dokonano następnie odczytu natężenia barwy za pomocą Molecular Devices Vmax przy ( nm). [0270] Miana definiowano jako odwrotność rozcieńczenia surowicy, dającego połowę maksymalnej gęstości optycznej (OD). Maksymalną OD odczytywano zasadniczo na podstawie początkowego rozcieńczenia 1/0, chyba że miano było bardzo wysokie. W takim wypadku do wyznaczenia maksymalnej OD niezbędne było większe rozcieńczenie początkowe. Jeśli punkt 50% wypadał między dwoma rozcieńczeniami, w celu obliczenia ostatecznego miana wykonywano ekstrapolację liniową. Aby obliczyć średnią geometryczną mian przeciwciał mianom poniżej 0 przypisano arbitralnie wartość miana. C. Preparowanie tkanki mózgowej [0271] Po uśmierceniu zwierząt mózgi wyjęto i jedną półkulę wypreparowano do analizy immunohistochemicznej, natomiast z drugiej półkuli wycięto trzy okolice mózgu (hipokamp, kora mózgowa i móżdżek) i wykorzystano je do pomiaru stężenia różnych białek Aβ i form APP z użyciem swoistych testów ELISA (Johnson- Wood i wsp., patrz wyżej). [0272] Tkanki przeznaczone do testów ELISA homogenizowano w objętościach lodowatego buforu guanidynowego (5,0 M

120 121 chlorowodorek guanidyny, 50 mm Tris-HCl, ph 8,0). Homogenaty mieszano delikatnie za pomocą nutatora Adamsa (Fisher) przez 3-4 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie przechowywano w temperaturze - C do momentu oznaczania ilościowego Aβ i APP. Wcześniejsze doświadczenia wykazały, że anality były trwałe w tych warunkach przechowywania i że syntetyczne białko Aβ (Bachem) można było odzyskać ilościowo po dodaniu w określonej ilości do homogenatów kontrolnej tkanki mózgowej od osobników myszy z tego samego miotu (Johnson-Wood i wsp., patrz wyżej). D. Pomiar poziomu Aβ [0273] Homogenaty tkanki mózgowej rozcieńczono w stosunku 1: lodowatym rozcieńczalnikiem kazeinowym (0,% kazeina, PBS, 0,05% azydek sodu, µg/ml aprotynina, 5 mm EDTA ph 8,0, µg/ml leupeptyna), a następnie odwirowano w x g przez min w temperaturze 4 C. Otrzymano wzorce syntetycznego białka Aβ (aminokwasy 1-42) i wzorce APP zawierające 0,5 M guanidynę i 0,1% albuminę z surowicy bydlęcej (BSA) w ostatecznej kompozycji. W teście podwójnego wiązania ELISA dla całkowitego Aβ jako przeciwciało wychwytujące wykorzystuje się przeciwciało monoklonalne 266 swoiste wobec aminokwasów Aβ (Seubert i wsp., patrz wyżej), a jako przeciwciało reporterowe biotynylowane przeciwciało monoklonalne 3D6 swoiste wobec aminokwasów 1-5 Aβ (Johnson-Wood i wsp., patrz wyżej). Przeciwciało monoklonalne 3D6 nie rozpoznaje wydzielanego APP ani APP pełnej długości, wykrywając jedynie formy Aβ z kwasem asparaginowym na końcu aminowym. Ten test charakteryzuje się dolną granicą czułości 50 ng/ml (11 nm) i nie wykazuje reaktywności krzyżowej wobec endogennego mysiego białka Aβ w stężeniu do 1 ng/ml (Johnson-Wood i wsp., patrz wyżej). [0274] W teście podwójnego wiązania ELISA swoistym wobec Aβ1-42 jako przeciwciało wychwytujące wykorzystuje się maβ 21F12 swoiste wobec aminokwasów Aβ (Johnson-Wood i wsp., patrz wyżej). Również w tym teście, charakteryzującym się dolną granicą czułości około 1 µg/ml (28 µm, Johnson-Wood i wsp., patrz wyżej), przeciwciałem reporterowym jest Biotynylowane maβ

121 122 3D6. W przypadku testów ELISA wobec Aβ dołki 96-dołkowych płytek do testów immunologicznych (Costar) powleczono 0 µl maβ (stężenie µg/ml) lub maβ 21F12 (stężenie 5 µg/ml), prowadząc inkubację przez noc w temperaturze pokojowej. Roztwór pobrano przez aspirację i dołki zablokowano, dodając 0 µl 0,% albuminy z surowicy bydlęcej w buforze PBS przez co najmniej 1 h w temperaturze pokojowej. Roztwór blokujący usunięto i płytki przechowywano w warunkach suchych w temperaturze 4 C do wykorzystania. Przed wykorzystaniem płytki nawodniono buforem do płukania [roztwór chlorku sodu buforowany Tris (0, M NaCl, 0,01 M Tris-HCl, ph 7,5) z dodatkiem 0,05% Tween ]. Próbki i wzorce dodano w trzech powtórzeniach w ilości 0 µl na dołek i następnie inkubowano przez noc w temperaturze 4 C. Płytki płukano co najmniej trzykrotnie buforem do płukania między poszczególnymi etapami testu. Dodano biotynylowane maβ3 3D6, rozcieńczone do stężenia 0,5 µg/ml w buforze testowym z kazeiną (0,% kazeina, PBS, 0,05% Tween, ph 7,4) i inkubowano w dołkach przez 1 h w temperaturze pokojowej. Peroksydazę chrzanową sprzężoną z awidyną (Avidin-HRP, otrzymane z firmy Vector, Burlingame, CA, USA) i rozcieńczoną w stosunku 1:4000 w buforze testowym z kazeiną dodawano do dołków przez 1 h w temperaturze pokojowej. Dodano substrat kolorymetyczny, Slow TMB-ELISA (Pierce), i pozostawiono do przereagowania przez minut w temperaturze pokojowej; następnie reakcję enzymatyczną zatrzymano, dodając µl N H 2 SO 4. Produkt reakcji oznaczano ilościowo za pomocą urządzenia Molecular Devices Vmax, mierząc różnicę absorbancji przy 450 nm i 650 nm. E. Pomiar poziomu APP [0275] Zastosowano dwa różne testy APP. Pierwszy, oznaczony APPα/FL, rozpoznaje zarówno APP-alfa (α), jak i formy APP o pełnej długości (FL). Drugi jest swoisty wobec APP-α. Test APP-α/FL rozpoznaje wydzielane APP, zawierające pierwszych 12 aminokwasów Aβ. Ponieważ przeciwciało reporterowe (2H3) nie jest swoiste wobec miejsca przecięcia α, występującego między aminokwasami

122 APP 695 (Esch i wsp., Science 248: (1990)), ten test rozpoznaje także APP o pełnej długości (APP-FL). Wstępne doświadczenia z wykorzystaniem unieruchomionych przeciwciał APP przeciwko końcowi cytoplazmatycznemu APP-FL w celu zmniejszenia ilości homogenatów APP-FL w mózgu wskazują, że około -40% APPα/FL APP stanowi FL (danych nie pokazano). Przeciwciałem wychwytującym w przypadku testów APP-α/FL i APP-α jest mab 8E5, swoiste wobec aminokwasów formy APP 695 (Games i wsp., patrz wyżej). Reporterowym mab w teście APP-α/FL jest mab 2H3, swoiste wobec aminokwasów APP 695 (Johnson-Wood i wsp., patrz wyżej), przeciwciałem reporterowym w teście APP-α jest zaś biotynylowana pochodna mab 16H9, swoista wobec aminokwasów APP. Dolna granica czułości testu APP-αFL wynosi około 11 ng/ml (0 pm) (Johnson-Wood i wsp.), w przypadku testu swoistego wobec APP-α wynosi ona zaś 22 ng/ml (0,3 nm). W przypadku obu testów APP, dołki 96-dołkowych płytek EIA pokryto mab 8E5, zgodnie z opisem powyżej, dotyczącym mab 266. Jako wzorzec odniesienia w teście APP-α i w teście APP-α/FL (Esch i wsp., patrz wyżej) wykorzystano oczyszczone, rekombinowane, wydzielane APP-α. Próbki homogenatu mózgowego w 5 M guanidynie rozcieńczono w stosunku 1: w rozcieńczalniku do próbek ELISA (0,014 M bufor fosforanowy, ph 7,4, 0,6% albumina z surowicy bydlęcej, 0,05% timerosal, 0,5 M NaCl, 0,1% NP40). Następnie rozcieńczono je w stosunku 1:4 w rozcieńczalniku do próbek, zawierającym 0,5 M guanidynę. Rozcieńczone homogenaty odwirowano następnie przy x g przez sekund w temperaturze pokojowej. Dodano wzorce APP i próbki w dwóch powtórzeniach i inkubowano przez 1,5 h w temperaturze pokojowej. Biotynylowane przeciwciało reporterowe 2H3 lub 16H9 inkubowano z próbkami przez 1 h w temperaturze pokojowej. Fosfatazę alkaliczną sprzężoną ze streptawidyną (Boehringer Mannheim), rozcieńczoną w stosunku 1:00 w rozcieńczalniku do próbek inkubowano w dołkach przez 1 h w temperaturze pokojowej. Dodawano substrat fluorescencyjny 4-metyloumbelliferylofosforan w ciągu - minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej i płytki

123 124 odczytywano za pomocą fluorymetru Cytofluor tm 20 (Millipore) przy wzbudzeniu przy 365 nm i emisji przy 450 nm. F. Immunohistochemia [0276] Mózgi utrwalano przez trzy dni w temperaturze 40 C w 4% paraformaldehydzie w PBS i następnie przechowywano przez 1-7 dni w temperaturze 4 C w 1% paraformaldehydzie i PBS do podzielenia na skrawki. Za pomocą wibratomu w temperaturze pokojowej uzyskano przekroje w płaszczyźnie czołowej o grubości 40 mikronów i przechowywano je w środku krioprotekcyjnym (% glicerol, % glikol etylenowy w buforze fosforanowym) w temperaturze - C przed obróbką immunohistochemiczną. Z każdego mózgu sześć skrawków, wykonanych na poziomie grzbietowym hipokampu co 240 µm, inkubowano przez noc z jednym z następujących przeciwciał: (1) biotynylowanym anty-aβ (mab, 3D6, swoistym wobec ludzkiego Aβ) rozcieńczonym do stężenia 2 µg/ml w PBS i 1% surowicy końskiej, (2) biotynylowanym mab swoistym wobec ludzkiego APP, 8E5, rozcieńczonym do stężenia 3 µg/ml w PBS i 1,0% surowicy końskiej, (3) mab swoistym wobec kwaśnego białka włókienkowego gleju (GFAP; Sigma Chemical Co.), rozcieńczonym w stosunku 1:500 w 0,% Triton X-0 i 1% surowicy końskiej, w roztworze chlorku sodu buforowanym Tris, ph 7,4 (TBS), (4) mab swoistym wobec CD11b, antygen MAC-1 (Chemicon International) rozcieńczonym w stosunku 1:0 w 0,% Triton X-0 i 1% surowicy króliczej w TBS, (5) mab swoistym wobec antygenu MHC II (Pharmingen) rozcieńczonym w stosunku 1:0 w 0,% Triton X-0 i 1% surowicy króliczej w TBS, (6) szczurzym mab swoistym wobec CD 43 (Pharmingen) rozcieńczonym w stosunku 1:0 1% surowicy króliczej w PBS, (7) szczurzym mab swoistym wobec CD 45RA (Pharmingen) rozcieńczonym w stosunku 1:0 w 1% surowicy króliczej w PBS, (8) szczurzym monoklonalnym Aβ swoistym wobec CD 45RB (Pharmingen) rozcieńczonym w stosunku 1:0 w 1% surowicy króliczej w PBS, (9) szczurzym monoklonalnym Aβ swoistym wobec CD 45 (Pharmingen) rozcieńczonym w stosunku 1:0 w 1% surowicy króliczej w PBS, () biotynylowanym poliklonalnym Aβ chomika swoistym wobec CD3e (Pharmingen) rozcieńczonym w

124 1 stosunku 1:0 w 1% surowicy króliczej w PBS, (11) szczurzym mab swoistym wobec CD3 (Serotec) rozcieńczonym w stosunku 1:0 w 1% surowicy króliczej w PBS lub (12) z roztworem PBS bez przeciwciała pierwszorzędowego, zawierającym 1% prawidłowej surowicy końskiej. [0277] Skrawki, które poddano reakcji z roztworami przeciwciał wymienionymi w punktach 1, 2 i 6-12 powyżej, traktowano 1,0% Triton X-0, 0,4% nadtlenkiem wodoru w PBS przez min w temperaturze pokojowej w celu zablokowania endogennej peroksydazy. Następnie inkubowano je przez noc w temperaturze 4 C z przeciwciałem pierwszorzędowym. Skrawki, które poddano reakcji z mab 3D6, 8E5 lub CD3e, poddano następnie reakcji przez 1 h w temperaturze pokojowej z kompleksem peroksydazy chrzanowej z awidyną i biotyną ze składnikami zestawu A i B rozcieńczonymi w stosunku 1:75 w PBS (zestaw standardowy Vector Elite, Vector Labs, Burlingame, CA, USA). Skrawki, które poddano reakcji z przeciwciałami swoistymi wobec CD 45RA, CD 45RB, CD 45, CD3 i roztworem PBS bez przeciwciała pierwszorzędowego, inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej odpowiednio z biotynylowaną antyszczurzą IgG (Vector) rozcieńczoną w stosunku 1:75 w PBS lub z biotynylowaną antymysią IgG (Vector) rozcieńczoną w stosunku 1:75 w PBS. Skrawki poddano następnie reakcji przez 1 h w temperaturze pokojowej z kompleksem peroksydazy chrzanowej z awidyną i biotyną ze składnikami zestawu A i B rozcieńczonymi w stosunku 1:75 w PBS (zestaw standardowy Vector Elite, Vector Labs, Burlingame, CA, USA). [0278] Skrawki wywołano w 0,01% nadtlenku wodoru i 0,05% 3,3 - diaminobenzydynie (DAB) w temperaturze pokojowej. Skrawki przeznaczone do inkubacji z przeciwciałami swoistymi wobec GFAP, MAC-1 i MHC II traktowano 0,6% nadtlenkiem wodoru w temperaturze pokojowej w celu zablokowania endogennej peroksydazy, a następnie inkubowano przez noc z przeciwciałem pierwszorzędowym w temperaturze 4 C. Skrawki, które poddano reakcji z przeciwciałem GFAP, inkubowano przez 1 h w temperaturze pokojowej z biotynylowanym antymysim IgG otrzymanym u konia

125 126 (Vector Laboratories; zestaw Vectastain Elite ABC) rozcieńczonym w stosunku 1:0 w TBS. Skrawki poddano następnie reakcji przez 1 h z kompleksem peroksydazy chrzanowej z awidyną i biotyną (Vector Laboratories; zestaw Vectastain Elite ABC) rozcieńczonym w stosunku 1:00 w TBS. Skrawki inkubowane z przeciwciałem monoklonalnym swoistym wobec MAC-1 lub MHC II jako przeciwciałem pierwszorzędowym poddano następnie reakcji przez 1 h w temperaturze pokojowej z biotynylowanym antyszczurzym IgG otrzymanym u królika, rozcieńczonym w stosunku 1:0 w TBS, a następnie inkubowano przez 1 h z kompleksem peroksydazy chrzanowej z awidyną i biotyną rozcieńczonym w stosunku 1:00 w TBS. Skrawki inkubowane z przeciwciałami monoklonalnymi swoistymi wobec GFAP, MAC-1 i MHC II wizualizowano następnie, traktując w temperaturze pokojowej 0,05% DAB, 0,01% nadtlenkiem wodoru, 0,04% chlorkiem niklu, TBS odpowiednio przez 4 i 11 min. [0279] Znakowane immunologicznie skrawki nakładano na szkiełka (szkiełka VWR, Superfrost), suszono na powietrzu przez noc, zanurzano w środku Propar (Anatech) i przykrywano szkiełkami nakrywkowymi z użyciem Permount (Fisher) jako środka do nakładania. [0280] W celu zabarwienia kontrastowego blaszki Aβ podgrupę skrawków GFAP-dodatnich nałożono na szkiełka Superfrost i inkubowano w wodnym roztworze 1% tioflawiny S (Sigma) przez 7 min po obróbce immunohistochemicznej. Skrawki następnie odwodniono i oczyszczono środkiem Propar, a następnie przykrywano szkiełkami nakrywkowymi z użyciem środka Permount. G. Analiza obrazów [0281] Zastosowano system do analizy obrazów Videometric 0 (Oncor, Inc., Gaithersburg, MD, USA) połączony z mikroskopem Nikon Microphot-FX przez kamerę wideo z CCD; do oznaczania ilościowego szkiełek immunoreaktywnych zastosowano monitor Sony Trinitron. Obraz skrawka przechowywano w buforze wideo i określono wartość progową na podstawie barwy i nasycenia w celu wyboru i obliczenia całkowitej powierzchni pikseli zajętych przez struktury znakowane immunologicznie. W przypadku każdego skrawka hipokamp oznaczano ręcznie i obliczano całkowitą

126 127 powierzchnię pikseli zajętych przez hipokamp. Procentowe obciążenie amyloidem mierzono jako (ułamek okolicy hipokampa zawierający złogi Aβ immunoreaktywne z mab 3D6) x 0. Podobnie procentowe obciążenie neurytów mierzono jako: (ułamek okolicy hipokampa zawierający dystroficzne neuryty reaktywne z przeciwciałem monoklonalnym 8E5) x 0. System C-Imaging (Compix, Inc., Cranberry Township, PA, USA) korzystający z programu Simple 32 Software Application połączono z mikroskopem Nikon Microphot-FX przez kamerę Optronics i wykorzystano do oznaczenia ilościowego odsetka retrosplenial cortex (RSC - kory tylnej części zakrętu obręczy) zajętej przez astrocyty GFAPdodatnie oraz mikrogleju MAC-1- i MHC II-dodatniego. Obraz skrawka immunoreaktywnego przechowywano w buforze wideo i określono wartość progową na podstawie parametru monochromatycznego do wyboru i obliczenia całkowitej powierzchni pikseli zajętych przez komórki znakowane immunologicznie. W przypadku każdego skrawka RSC oznaczano ręcznie i obliczano całkowitą powierzchnię pikseli zajętych przez RSC. Procent astrocytozy zdefiniowano w sposób następujący: (ułamek RSC zajęty przez astrocyty GFAP-reaktywne) X 0. Podobnie procent mikroglejozy zdefiniowano w sposób następujący: (ułamek RSC zajęty przez mikroglej MAC-1- lub MHC II-reaktywny) X 0. W przypadku wszystkich analiz obrazów dla każdego osobnika oznaczono ilościowo sześć skrawków na poziomie części grzbietowej hipokampa, odległych od siebie o 240 µm. We wszystkich przypadkach przydział osobnika do grupy nie był obserwatorowi znany. [0282] Na podstawie powyższego niewątpliwe jest, że wynalazek dotyczy szeregu zastosowań. Wynalazek dotyczy na przykład zastosowania któregokolwiek z przeciwciał przeciwko Aβ opisywanych powyżej w leczeniu i profilaktyce chorób amyloidogennych lub przy wytwarzaniu leku stosowanego w tych przypadkach.

127 [[0283] <1> NEURALAB LIMITED, et al. 128 LISTA SEKWENCJI <1> PRZECIWCIAŁA HUMANIZOWANE, KTÓRE ROZPOZNAJĄ PEPTYD BETA-AMYLOIDU <1> ELN-002CPPC <0> US /388,389 <1> <160> 63 <170> FastSEQ for Windows wersja 4.0 <2> 1 <211> 396 <212> DNA <213> Mus musculus <2> <221> CDS <222> (1)... (396) <221> sig_peptide <222> (1)... (60) <400> 1 <2> 2 <211> 132

128 129 5 <212> PRT <213> Mus musculus <2> <221> SIGNAL <222> (1)... () <400> 2 <2> 3 <211> 414 <212> DNA <213> Mus musculus <2> <221> CDS <222> (1)...(414) <221> sig_peptide <222> (1)...(57) <400> 3

129 1 5 <2> 4 <211> 138 <212> PRT <213> Mus musculus <2> <221> SIGNAL <222> (1)...(19) <400> 4 <2> 5 <211> 132 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <2> <221> SIGNAL <222> (1)... ()

130 131 <223> Region zmienny łańcucha lekkiego humanizowanego 3D6 <400> 5 5 <2> 6 <211> 1 <212> PRT <213> Homo sapiens <2> <221> SIGNAL <222> (1)...(13) <400> 6 <2> 7 <211> 0 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7

131 132 5 <2> 8 <211> 138 <212 PRT <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Region zmienny łańcucha cieżkiego humanizowanego 3D6 <221> SIGNAL <222> (1)...(19) <400> 8 <2> 9 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9

132 133 5 <2> <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> <2> 11 <211> 132 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <2> <221> SIGNAL <222> (1)...() <223> Region zmienny łańcucha lekkiego humanizowanego 3D6 <400> 11

133 134 5 <2> 12 <211> 138 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Region zmienny łańcucha lekkiego humanizowanego 3D6 <221> SIGNAL <222> (1)...(19) <400> 12 <2> 13 <211> 393 <212> DNA <213> Mus musculus <2> <221> CDS <222> (1)...(393) <221> sig_peptide <222> (1)...(57) <400> 13

134 1 5 <2> 14 <211> 131 <212> PRT <213> Mus musculus <2> <221> SIGNAL <222> (1)... (19) <400> 14

135 136 5 <2> <211> 426 <212> DNA <213> Mus musculus <2> <221> CDS <222> (1)... (426) <221> sig_peptide <222> (1)... (57) <400>

136 137 5 <2> 16 <211> 142 <212> PRT <213> Mus musculus <2> <221> SIGNAL <222> (1)... (19) <400> 16

137 138 5 <2> 17 <211> 136 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> starter <400> 17 <2> 18 <211> 131 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> starter <400> 18 <2> 19 <211> 146 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> starter <400> 19 <2> <211> 142 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna

138 139 <2> <223> starter <400> 5 <2> 21 <211> 16 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> starter <400> 21 ctggggggac tggccg 16 <2> 22 <211> 22 <212> DNA <<213> Sekwencja sztuczna <2> <223> starter <400> 22 acctgaactg gctgctgcag aa 22 <2> 23 <211> 138 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> starter <400> 23 <2> 24 <211> 1 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> starter <400> <2> <211> 142 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> starter <400> 50 <2> 26 <211> 144 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> starter <400> 26

139 140 5 <2> 27 <211> 16 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> starter <400> 27 gccgccggag cggatg <2> 28 <211> <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> starter <400> 28 ctggagtggg tggcctccat <2> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> starter <400> 29 tccgcaagct tgccgccac 19 <2> <211> 29 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> starter <400> aattctagga tccactcacg cttgatctc 29 <2> 31 <211> 23 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> starter <400> 31 acagaaagct tgccgccacc atg 23 <2> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> starter <400> 32 ctgcaaggat ccactcaccg ga 22

140 141 5 <2> 33 <211> <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> natywny peptyd ABeta <400> 33 <2> 34 <211> 402 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> h3d6 wersja 1 VL <400> 34 <2> <211> 402 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> h3d6 wersja 2 VL <400> <2> 36 <211> 414 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> h3d6 wersja 1 VH <400> 36

141 142 5 <2> 37 <211> 414 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> h3d6 wersja 2 VH <400> 37 <2> 38 <211> 770 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38