(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 PL/EP T3 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2009/26 EP B1 (13) T3 (51) Int. Cl. A61K39/395 C12N15/13 C07K16/28 ( ) ( ) ( ) (54) Tytuł wynalazku: Humanizowane przeciwciało anty-cd4 o właściwościach immunosupresyjnych (30) Pierwszeństwo: EP EP (43) Zgłoszenie ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2006/19 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 12/2009 (73) Uprawniony z patentu: Biotest AG, Dreieich, DE (72) Twórca (y) wynalazku: WIJDENES John, Larnod, FR JONULEIT Helmut, Ginsheim-Gustavsburg, DE (74) Pełnomocnik: Polservice Kancelaria Rzeczników Patentowych Sp. z o.o. rzecz. pat. Kawczyńska Marta Warszawa skr. pocz. 335 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejsk iego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 2 Wynalazek dotyczy humanizowanego przeciwciała anty-cd4 i jego zastosowania do immunomodulacji. Choroby autoimmunologiczne, jak również odrzucanie przeszczepu wynikają z nieodpowiedniej odpowiedzi immunologicznej na antygeny tkankowe: antygeny własne w pierwszym przypadku i antygeny alloprzeszczepu w drugim przypadku. Choroby autoimmunologiczne obejmują na przykład reumatoidalne zapalenie stawów, cukrzycę typu I, stwardnienie rozsiane, chorobę Crohna, wrzodziejące zapalenie jelita grubego, atopowe zapalenie skóry, itp. W konwencjonalnym leczeniu tych zaburzeń immunologicznych stosowane są leki immunosupresyjne. Jednakże leki te indukują uogólnioną immunosupresję, skutkującą hamowaniem nie tylko szkodliwych funkcji układu immunologicznego, ale również tych użytecznych. W konsekwencji indukują one skutki uboczne, takie jak zakażenia oportunistyczne. Jako alternatywne podejście zaproponowano zastosowanie immunosupresyjnych przeciwciał monoklonalnych (mab) przeciwko cząsteczkom powierzchniowo-komórkowym, w celu usunięcia specyficznych subpopulacji limfocytów (przeciwciała wywołujące eliminację, ang. depleting antibodies) albo hamowania funkcji docelowej cząsteczki powierzchniowej bez uśmiercania niosącej jej komórki (przeciwciała nie wywołujące eliminacji, ang. nondepleting-antibodies). Istnieje ogólna zgoda co do tego, że komórki T CD4+ odgrywają główną rolę w zapoczątkowywaniu i utrzymywaniu procesu autoimmunizacyjnego. Zgodnie z tym zaproponowano zastosowanie mab przeciwko cząsteczkom

3 3 powierzchniowym komórek T CD4+, a zwłaszcza mab anty- CD4, jako środków immunosupresyjnych. Chociaż liczne badania kliniczne potwierdziły potencjalne zainteresowanie tym podejściem, to również wyłoniły klika problemów, które należałoby rozwiązać aby uczynić mab anty-cd4 bardziej odpowiednimi do zastosowania w rutynowej praktyce klinicznej. Przykładowo, przeciwciało B-F5 (mysie IgG1 przeciwko-ludzkiemu CD4) testowano w różnych chorobach autoimmunologicznych: - w przypadku pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów kilka otwartych badań sugerowało pozytywny skutek kliniczny B-F5 w dziennej dawce wynoszącej co najmniej 20 mg (Racadot i wsp. Clin Exp Rheumatol 10(4):365-74; 1992; Wendling i wsp., Clin Rheumatol, 11(4):542-7, 1992). Jednakże wyniki zaobserwowane w badaniu z kontrolą placebo z zastosowaniem dziennej dawki wynoszącej 20 mg przez 10 dni nie wykazały znaczącej poprawy (Wendling i wsp. J Rheumatol;25(8): , 1998). - w przypadku łuszczycy zaobserwowano poprawę uszkodzeń łuszczycowych po leczeniu w dawce wynoszącej 0,2 mg/kg/dzień do 0,8 mg/kg/dzień przez 7 lub 8 dni (Morel i wsp. J Autoimmun., 5(4):465-77, 1992); - w przypadku pacjentów ze stwardnieniem rozsianym (MS) zaobserwowano pewne pozytywne wyniki po 10 dniach leczenia u pacjentów z postaciami rzutowymi, przy czym u części z nich nie wystąpił nawrót do 6 miesięcy po leczeniu (Racadot i wsp., J Autoimmun, 6(6):771-86, 1993); podobne skutki zaobserwował Rumbach i wsp. (Mult Scler;1(4):207-12, 1996);

4 4 - w przypadku ciężkiej choroby Crohna nie zaobserwowano żadnej znaczącej poprawy u pacjentów otrzymujących B-F5 w dawce wynoszącej 0,5 mg/dzień/kg przez 7 kolejnych dni lub 0,5 mg/dzień/kg pierwszego dnia (dzień 0) i 1 mg/dzień/kg w dniach 1-6 (Canva- Delcambre i wsp., Aliment Pharmacol Ther 10(5):721-7, 1996); - w profilaktyce odrzucania alloprzeszczepu odnotowano modyfikację parametrów biologicznych, wskazujących na działanie B-F5 in vivo w dziennej dawce wynoszącej 30 mg. Jednakże odnotowano, że biodostępność B-F5 nie była wystarczająca aby pozwolić na profilaktykę odrzucania alloprzeszczepu (Dantal i wsp. Transplantation, 27;62(10):1502-6, 1996). W świetle powyższego wydaje się, że pierwszym problemem do rozwiązania jest potrzeba stosowania wysokich dawek mab w celu uzyskania poprawy klinicznej. Może to być wynikiem, między innymi, słabej dostępności limfocytów do mab w tkankach docelowych. Zastosowanie wyższych dawek może skutkować nadmiernym działaniem na limfocyty krwi, indukując niepożądane skutki uboczne. Inną wadą terapii z użyciem przeciwciał monoklonalnych u ludzi jest to, że te przeciwciała są zazwyczaj uzyskiwane z komórek mysich i wzbudzają odpowiedzi anty-mysie u przyjmujących je ludzi. Skutkuje to nie tylko mniejszą skutecznością leczenia, a szczególnie przyszłego leczenia, z użyciem mysich przeciwciał monoklonalnych, ale również zwiększonym ryzykiem anafilaksji. Wady tej można, co do zasady, uniknąć poprzez zastosowanie przeciwciał humanizowanych, uzyskanych

5 5 poprzez zaszczepienie regionów determinujących komplementarność (CDR) mysiego przeciwciała monoklonalnego, które determinują specyficzność wiązania, na regionach zrębowych (FR) cząsteczki ludzkiej immunoglobuliny. Celem humanizacji jest uzyskanie rekombinowanego przeciwciała posiadającego takie same właściwości wiązania jak mysie przeciwciała monoklonalne, z których pochodzą sekwencje CDR, a dużo mniej immunogennego u ludzi. W pewnych przypadkach podstawienie CDR z mysiego przeciwciała za ludzkie CDR w ludzkich regionach zrębowych jest wystarczające do przeniesienia właściwości wiązania antygenu (w tym nie tylko specyficzności, ale również powinowactwa do antygenu). Jednakże w wielu przeciwciałach pewne reszty FR są istotne dla wiązania antygenu, ponieważ bezpośrednio kontaktują się z antygenem w kompleksie antygenprzeciwciało, albo ponieważ wpływają na konformację CDR a zatem ich wydajność wiązania antygenu. Zatem w większości przypadków niezbędne jest również podstawienie jednej lub kliku reszt z regionu zrębowego z mysiego przeciwciała za odpowiadające ludzkie reszty FR. Ze względu na to, że liczba podstawionych reszt musi być możliwie jak najmniejsza, aby zapobiec odpowiedziom anty-mysim, problemem pozostaje określenie, która reszta aminokwasowa (reszty aminokwasowe) jest krytyczna dla utrzymania właściwości wiązania antygenu. Do przewidywania najbardziej odpowiednich miejsc substytucji zaproponowano różne metody. Chociaż dostarczają one ogólnych reguł, które mogą być pomocne w pierwszych etapach humanizacji, to

6 6 wynik końcowy różni się w zależności od przeciwciała. Zatem dla danego przeciwciała trudno jest przewidzieć, które substytucje zapewnią pożądany skutek. Twórcy wynalazku podjęli jednak próbę humanizacji mysiego B-F5, i udało im się wytworzyć humanizowane B- F5 (nazywane tu dalej hb-f5) wykazujące te same właściwości wiązania CD4 jak macierzyste mysie B-F5. Ponadto stwierdzili oni nieoczekiwanie, że hb-f5 wywiera in vivo optymalny skutek immunosupresyjny w dużo niższych dawkach niż stosowane uprzednio w przypadku macierzystego B-F5, i niż dawki obecnie stosowane w przypadku innych przeciwciał anty-cd4. Faktycznie twórcy wynalazku zaobserwowali, że hb- F5 zapewniało skuteczny wpływ immunosupresyjny, odzwierciedlany przez dodatni efekt terapeutyczny u pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów, w przypadku stosowania w 10-dniowym leczeniu w tak niskiej dawce jak dawka wynosząca 1 mg/dzień, a korzystnie w dawce wynoszącej 5 mg co drugi dzień. Niniejszy wynalazek dostarcza humanizowanego przeciwciała (hb-f5) pochodzącego z mysiego MAb B-F5, które to przeciwciało hb-f5 posiada domeny V zdefiniowane następującymi sekwencjami polinukleotydowymi: - domena V łańcucha H: EEQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFSFSDCRMYWLRQAPGKGLEWIGVISVKS ENYGANYAESVRGRFTISRDDSKNTVYLQMNSLKTEDTAVYYCSASYYRYDVGAW FAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 1)

7 7 - domena V łańcucha L: DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSTSGYSYIYWYQQKPGQPPKLLIYLA SILESGVPORFSGSGSGTOFTLTISSLQAEOVAVXYCQHSRELPWTFGQGTKVEI K (SEQ ID NO: 2), zdolne do aktywacji specyficznych subpopulacji komórek T CD4+, mianowicie komórek CD4+CD25+. Ogólnie przeciwciało hb-f5 według wynalazku obejmuje ponadto ludzki region stały (Fc). Ten region stały może być wybrany spośród domen stałych z dowolnej klasy immunoglobulin, w tym IgM, IgG, IgD, IgA i IgE, i dowolnego izotopu, w tym IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. Korzystne regiony stałe wybrane są spośród domen stałych IgG, w szczególności IgG1. Niniejszy wynalazek obejmuje ponadto dowolny fragment przeciwciała hb-f5 zawierający jego regiony V. Obejmuje to w szczególności fragmenty Fab, Fab, F(ab) 2, Fv i scfv. Wynalazek obejmuje także polinukleotyd wybrany spośród: - polinukleotydu kodującego polipeptyd o sekwencji oznaczonej SEQ ID NO:1; - polinukleotydu kodującego polipeptyd o sekwencji oznaczonej SEQ ID NO:2. Korzystnie polinukleotyd ten wybrany jest spośród: - polinukleotydu o sekwencji oznaczonej SEQ ID NO:3; - polinukleotydu o sekwencji oznaczonej SEQ ID NO:4. Polinukleotydy według wynalazku można w łatwy sposób wytworzyć za pomocą dobrze znanych metod

8 8 technologii rekombinacji DNA i/lub syntezy chemicznej DNA. Polinukleotyd kodujący domenę V łańcucha H albo łańcucha L przeciwciała hb-f5 może być poddany fuzji z polinukleotydem kodującym region stały ludzkiego łańcucha H albo L, w celu ekspresji kompletnych łańcuchów H i L uzyskanych w ten sposób; ponadto można również dodać sekwencję kodującą peptyd sygnałowy pozwalający na wydzielanie białka. Te rekombinowane polinukleotydy są również częścią wynalazku. Wynalazek dostarcza również kaset ekspresyjnych, w których polinukleotyd według wynalazku połączony jest z odpowiednimi sekwencjami kontrolnymi pozwalającymi na regulację jego transkrypcji i translacji w wybranej komórce gospodarza, oraz rekombinowanych wektorów obejmujących polinukleotydy albo kasetę ekspresyjną według wynalazku. Te konstrukty rekombinowanego DNA można uzyskać i wprowadzić do komórek gospodarza za pomocą dobrze znanych technik rekombinacji DNA i inżynierii genetycznej. Wynalazek obejmuje również komórkę gospodarza, transformowaną polinukleotydem według wynalazku. Użytecznymi komórkami gospodarza w ramach niniejszego wynalazku mogą być komórki eukariotyczne albo prokariotyczne. Wśród odpowiednich komórek eukariotycznych wymienić można, na zasadzie przykładu, komórki drożdży, takich jak Saccharomyces, komórki owadów takich jak Drosophila albo Spodoptera, i komórki ssaków takie jak HeLa, CHO, 3T3, C127, BHK, COS, itp.

9 9 Konstrukcję wektorów ekspresyjnych według wynalazku i transformację komórek gospodarza można przeprowadzić za pomocą standardowych technik biologii molekularnej. Przeciwciało hb-f5 według wynalazku można otrzymać poprzez hodowlę komórki gospodarza zawierającej wektor ekspresyjny zawierający sekwencję kwasu nukleinowego kodującą wspomniane przeciwciało, w warunkach odpowiednich do jego ekspresji, i odzysk wspomnianego przeciwciała z hodowli komórki gospodarza. Niniejszy wynalazek obejmuje również kompozycję terapeutyczną zawierającą przeciwciało hb-f5 według wynalazku lub jego fragment, jak zdefiniowano powyżej. Korzystnie wspomnianą kompozycję stanowi kompozycja do podawania pozajelitowego, preparowana tak, aby umożliwić podawanie dawki od 0,1 do 10 mg, korzystnie od 1 do 5 mg hb-f5. Dokładniej, wynalazek obejmuje zastosowanie przeciwciała hb-f5 według wynalazku lub jego fragmentu, do wytwarzania kompozycji immunosupresyjnej. Wspomniana kompozycja immunosupresyjna jest użyteczna w szczególności do leczenia lub profilaktyki chorób takich jak odrzucanie przeszczepu, reakcja przeszczep przeciwko gospodarzowi czy reakcja gospodarz przeciwko przeszczepowi, albo chorób autoimmunologicznych w tym na przykład zapalenia mięśnia sercowego, cukrzycy, łuszczycy, tocznia rumieniowatego, choroby Crohna, stwardnienia rozsianego, reumatoidalnego zapalenia stawów, itp.

10 10 Ponadto, twórcy wynalazku stwierdzili, że hb-f5 było zdolne do aktywacji szczególnych subpopulacji komórek T CD4+, mianowicie komórek CD4+CD25+. Regulatorowe komórki T CD25+CD4+ (komórki T reg) stanowią 5-10 % obwodowych komórek T CD4+. Zostały one opisane po raz pierwszy w 1995 przez Sakaguchi i wsp. (J. Immunol., 155: ) jako komórki regulatorowe u myszy. Po aktywacji komórki te są w stanie wywołać supresję aktywacji i proliferacji zarówno komórek T CD4+ jak i CD8+. Następnie stwierdzono występowanie supresorowych komórek T CD25+CD4+ u ludzi (Jonuleit i wsp., J. Exp. Med.193, , 2001; Levings i wsp., J. Exp. Med. 193, , 2001; Dieckmann i wsp., J. Exp. Med. 193, ). Opublikowano liczne artykuły, w których opisano immunosupresyjną rolę tych komórek w różnych modelach chorób autoimmunologicznych i układach in vitro (dla przeglądu zobacz na przykład Shevach, J. Exp. Med., 193, 11, 41-46, 2001). Wykazano również, że aktywowane ex vivo komórki T reg CD4+CD25+ są skuteczne w profilaktyce choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (Taylor i wsp., Blood, 99, , 2002; Cohen i wsp., J. Exp. Med. 196, , 2002; Hoffmann i wsp., J. Exp. Med. 196, , 2002). Zatem duże zainteresowanie budzi zapewnienie środków do aktywacji komórek T reg CD4+CD25+. Wynalazek dotyczy również zastosowania przeciwciała hb-f5 według wynalazku albo macierzystego przeciwciała B-F5, do aktywacji in vitro regulatorowych komórek T CD25+CD4+.

11 11 Korzystnie przeciwciało hb-f5 według wynalazku jest dodawane do regulatorowych komórek T CD25+CD4+ w stężeniu wynoszącym 1 μg/ml do 10 μg/ml. Niniejszy wynalazek zostanie dalej zilustrowany za pomocą następującego dodatkowego opisu, który odnosi się do przykładów ilustrujących właściwości przeciwciał hb-f5 według wynalazku. Należy rozumieć jednak, że te przykłady są podane jedynie dla ilustracji wynalazku i nie stanowią w żaden sposób jego ograniczenia. Przykład 1: Konstrukcja humanizowanego B-F5 Projekt regionów V H i V k humanizowanego B-F5 Sekwencje DNA kodujące regiony V H i V k mysiego B- F5 przedstawiono odpowiednio na Figurze 1 i Figurze 2 oraz pod identyfikatorami sekwencji SEQ ID NO:5 i SEQ ID NO: 6. Ludzkie V H i V k na których zaszczepione są mysie CDR wybrano poprzez przeszukiwanie baz danych dla ludzkich V H najbardziej podobnych do oryginalnych mysich V H i V k przeciwciała B-F5. Największą homologię z V H B- F5 wykazywał region V H ludzkiego przeciwciała (M26; Numer dostępu A36006). Największą homologię z V k B-F5 wykazywał region V k innego ludzkiego przeciwciała (FK-001; NAKATANI i wsp., Biotechnology, 7 (1989), )). Skonstruowano dwa typy V k różniących się między sobą tym, że resztę 4 stanowiła leucyna albo metionina, i oznaczono je jako L4L i L4M. Skonstruowano dwa typy V H różniących się między sobą tym, że resztę 37 stanowiła leucyna albo walina, i oznaczono je H37L i

12 12 H37V. Przyrównanie sekwencji polipeptydowych B-F5, FK- 001, L4L i L4M pokazano na Figurze 3. Przyrównanie sekwencji polipeptydowych B-F5, M26, H37L i H37V pokazano na Figurze 4. Reszty FR, które jak uprzednio opisywano są istotne dla pakowania CDR (Chothia i wsp., Nature, 342(1989), 8777; Foote i wsp., J. Mol. Biol., 224(1992), 487) są przedstawione w kwadratach. Poprzez połączenie tych V H i V k zaprojektowano 4 wersje regionów V. Ekspresja humanizowanego B-F5 Kolejne etapy wytwarzania humanizowanego B-F5 były takie jak te opisane w patencie US nr 5,886,152 dla humanizowanego B-B10. W skrócie, oddzielnie skonstruowano plazmidy ekspresyjne dla łańcucha H (humanizowany region V H poddany fuzji z regionem stałym ludzkiego łańcucha γ-1 (TAKAHASHI i wsp., Cell, 29 (1982), )) i łańcucha L (humanizowany region V K poddany fuzji z regionem stałym łańcucha κ FK-001) humanizowanego B-F5. W tych plazmidach ekspresja humanizowanego B-F5 kierowana jest przez promotor/wzmacniacz genu ludzkiego monoklonalnego IgM, FK-001. Figury 5 i 6 przedstawiają odpowiednio fragmenty plazmidów kodujących regiony V H i V K humanizowanego BF-5. Sekwencje kodujące region V są podkreślone a odpowiadające sekwencje polipeptydowe są zaznaczone nad sekwencją nukleotydową. Oba plazmidy i psv2neo jednocześnie wprowadzano do komórek mysiego szpiczaka Sp2/0 (ATCC CRL-1581) przy użyciu Lipofectin. Transfektomy wytwarzające ludzką IgG wybrano z użyciem ELISA, stosując przeciwciało

13 13 przeciwko ludzkiemu IgG (łańcuch γ) i przeciwciała przeciwko ludzkiemu łańcuchowi κ Ig. Przykład 2: Charakterystyka różnych wersji humanizowanego B-F5 Ocena aktywności wiązania CD4 Supernatanty z hodowli transfektom wytwarzających cztery wersje hb-f5 zebrano i zatężono. Różne przeciwciała oczyszczono z supernatantów z hodowli z użyciem chromatografii powinowactwa stosując sefarozę z białkiem A i oceniano pod kątem ich aktywności wiązania CD4 poprzez pomiar, za pomocą kompetycyjnego ELISA, ich aktywności hamujących przeciwko wiązaniu biotynylowanego mb-f5 z rozpuszczalnym CD4 opłaszczonym na płytkach do mikromiareczkowania. Czas inkubacji wynosi 2 godziny dla 37 C i całą noc dla 4 C. Względne aktywności wiązania hb-f5 (aktywność wiązania mb-f5 przyjęto jako 100%) pokazano w Tabeli I poniżej: Tabela I Przeciwciało Temp ( C) Względna aktywność wiązania H37L/L4L H37L/L4M H37V/L4L H37V/L4M

14 14 Na podstawie wyników pokazanych w Tabeli I wydaje się, że 37-ma reszta V H, leucyna, jest krytyczna dla utrzymania aktywności wiązania CD4 hb-f5, ponieważ aktywność wiązania CD4 jest kilkukrotnie obniżona przez konwersję 37 Leu do 37 Val. Przeciwnie, stwierdzono, że 4- ta reszta V K nie jest tak istotna dla aktywności wiązania CD4. Ze względu na to, że różnica strukturalna pomiędzy 37 Leu a 37 Val V H nie jest wyraźnie widoczna w modelowaniu molekularnym, wyższość H37L względem H37V w aktywności wiązania CD4 była nieoczekiwana. [0045] Do oceny aktywności biologicznych in vitro wybrano H37L/L4L i H37L/L4M. Badanie aktywności biologicznych in vitro humanizowanego B-F5 Oceniano aktywności biologiczne in vitro mysiego B-F5 i humanizowanych B-F5 (H37L/L4M IgG1 i H37L/L4L IgG 1). Testowano również humanizowane B-F5 typu IgG2 (H37L/L4M IgG2 i H37L/L4L IgG2). Aktywności biologiczne in vitro mb-f5 i czterech typów hb-f5 oceniano z użyciem komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) od zdrowych dawców. PBMC aktywowano z użyciem ConA (2,5 μg/ml, 3 dni) albo PPD (10 μg/ml, 4 dni) w obecności mysich hb-f5, i monitorowano pod kątem ich odpowiedzi proliferacyjnych poprzez inkorporację 3 H-tymidyny. Wyniki pokazano na Figurach 7 i 8. Mysie i hb-f5 mogły umiarkowanie hamować proliferację indukowaną ConA, ale aktywności różniły się pomiędzy przeciwciałami i/lub pomiędzy dawcami (Figura 7).

15 15 Ponadto mysie i hb-f5 były w stanie hamować specyficzną dla Ag proliferację PBMC indukowaną przez PPD (Figura 8). hb-f5 typu IgG1 hamowało proliferację indukowaną PPD skuteczniej (aż 70% hamowania, Fig. 7 i 8) niż mb- F5. Typ IgG1 wydawał się być bardziej skuteczny niż typ IgG2, którego aktywność hamująca była prawie taka sama jak mb-f5. W przypadku typu IgG1, H37L/L4M były bardziej skuteczne niż H37L/L4L. Typ IgG2 H37L/L4M i H37L/L4L wykazywał prawie takie same aktywności hamujące. W skrócie, aktywności hamujące B-F5 przeciwko indukowanej PPD proliferacji PBMC były następujące: H37L/L4M IgG1 > H37L/L4L IgG1 > H37L/L4M IgG2 = H37L/L4L IgG2 = mb-f5 Biorąc pod uwagę skuteczność aktywności biologicznej in vitro i mniejszą liczbę mysich aminokwasów do dalszej oceny wybrano H37L/L4M IgG1. Przykład 3: Wstępna ocena wpływu hb-f5 na pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów (RZS) Wpływ hb-f5 (H37L/L4M IgG1) testowano na pacjentach z RZS. Warunki oznaczenia były następujące: Każdy pacjent poddany został 10-dniowemu leczeniu składającemu się z 5 wstrzyknięć 5 mg hb-f5 (wstrzyknięcie co drugi dzień). Wyniki dla trzech różnych pacjentów pokazano w Tabelach II-IV poniżej:

16 16 Pacjent 1 (Tabela II): Rozpoznanie: Reumatoidalne zapalenie stawów, Aktywność 2 Czynnik reumatoidalny: 2; Stadium: 2 Płeć: F; Wiek: 65; Wystąpienie choroby: 1965 Dodatkowa terapia: diklofenak 150 mg/dzień Ocena kliniczna Tabela II Przed leczeniem Podczas leczenia (dni) Po leczeniu (tygod nie) Ocena bólu stawów (0-10) 4, ,5 3 2,2 3,5 Poranna sztywność w minutach Stopień , ciężkości stanu (1-5) Lekarz Pacjent Liczba opuchniętych stawów Liczba bolesnych stawów Współczynnik opuchnięcia (0-30) Siła w Prawa Lewa ręku Ocena zmęczenia (0-10) 7,7 4 2,3 2 2,3 3,1 3 Ocena Pacjent skutków Lekarz leczenia Szybkość sedymentacji erytrocytów Białko C-reaktywne 4,0 2 2,5

17 17 Pacjent 2 (Tabela III) Rozpoznanie: Reumatoidalne zapalenie stawów, Aktywność 3 Czynnik reumatoidalny: 2; Stadium: 2 Płeć: F; Wiek: 48; Wystąpienie choroby: 2000 Dodatkowa terapia: diklofenak 150 mg/dzień Ocena kliniczna Ocena bólu stawów (0-10) Poranna sztywność w minutach Stopień Lekarz ciężkości Pacjent stanu (1-5) Tabela III Przed leczeniem Podczas leczenia (dni) ,2 8,2 5 2,9 2,2 0, Liczba opuchniętych stawów Liczba bolesnych stawów Po leczeniu (tygodnie) Współczynnik opuchnięcia (0-30) Siła w Prawa Lewa ręku Ocena zmęczenia (0-10) 8,7 5,1 2,2 2,2 1,1 0,7 Ocena Pacjent /5 5 skutków leczenia Lekarz /5 5 Szybkość sedymentacji erytrocytów Białko C-reaktywne 1,2 0,2 0,8

18 18 Pacjent 3 (Tabela IV) Rozpoznanie: Reumatoidalne zapalenie stawów, Aktywność 3 Czynnik reumatoidalny:3 ; Stadium: 2 Płeć: F; Wiek: 49; Wystąpienie choroby: 1989 Dodatkowa terapia: diklofenak 150 mg/dzień Tabela IV Ocena kliniczna Przed leczeniem Podczas leczenia (dni) Po leczeniu (tygodnie) Ocena bólu stawów (0-10) Poranna sztywność w minutach Stopień ciężkości stanu (1-5) Lekarz Pacjent ,9 7,6 7,6 7,2 5,0 3,0 1,5 1, Liczba opuchniętych stawów Liczba bolesnych stawów Współczynnik opuchnięcia (0-30) Siła w Prawa Lewa ręku Ocena zmęczenia 8,5 7,2 5, (0-10) Ocena Pacjent skutków leczenia Lekarz 3 4/ Szybkość sedymentacji erytrocytów Białko C-reaktywne 8 3,7 3,3

19 19 Przykład 4: Aktywacja komórek T reg CD4+CD25+ przez hb-f5 Izolacja komórek T: 1) Regulatorowe komórki T (T reg): - Komórki CD25+ izoluje się z użyciem mikrokulek CD25; - Eliminacja zanieczyszczeń: komórki CD14-, CD8-, CD19-dodatnie przeprowadza się z użyciem kulek DYNALbeads CD14/CD8/CD19; - Eliminację komórek CD45RA+ przeprowadza się z użyciem kulek CD45RA mab + anty-mysie DYNALbeads: czystość:> 95% T Reg CD4+CD25+ 2) Komórki efektorowe - Komórki T CD4+ izoluje się z użyciem mikrokulek CD4 - Eliminację komórek CD45RO+ przeprowadza się z użyciem kulek CD45RO + mab + anty-mysie DYNALbeads; czystość:> 98% komórek efektorowych CD4/CD45RA+, CD25 3) Układ testu: Komórki T reg CD25+ od dawcy A współhoduje się przez 2 dni z syngenicznymi PBMC z wyeliminowanymi CD2, bez dodatków (kontrola ujemna = bez aktywacji = bez aktywności supresorowej), albo w obecności 0,5 μg/ml anty-cd3 (OKT-3 = kontrola dodatnia = pełna aktywacja T reg), albo w obecności 5 μg/ml lub 30 μg/ml hb-f5. Po dokładnym płukaniu poddanych wstępnej hodowli komórek, komórki T reg CD25+ izoluje się i traktuje promieniowaniem γ (3000 rad).

20 20 4) Test aktywności supresorowej: Poddane wstępnej hodowli komórki T reg CD25+ poddaje się współhodowli przez 4 dni ze świeżo wyizolowanymi efektorowymi komórkami T CD4+ (1:1) od dawcy B w obecności APC (PBMC z wyeliminowanymi CD2) od dawcy A (syngeniczne dla poddanych wstępnej hodowli komórek T (bez dodatkowej aktywacji), allogenicznych dla efektorowych komórek T (= mieszana reakcja alogenicznych limfocytów). Następnie komórki inkubuje się przez 16 godz. z 3 H-tymidyną, i wykrywa się proliferację efektorowych komórek T. Wyniki pokazano na Figurze 9. Legenda do Figury 9: - kontrola ujemna (brak aktywacji) = precd25; - 0,5 μg/ml OKT-3 (kontrola dodatnia, pełna aktywacja) = precd25-cd3; - 5 μg/ml hb-f5 (Test-1) = precd25-cd4; - 30 μg/ml hb-f5 (Test-2) = precd25-cd4.

21 21 Lista sekwencji <110> DIACLONE WIJDENES, John <120> HUMANIZOWANE PRZECIWCIAŁO ANTY-CD4 O WŁAŚCIWOŚCIACH IMMUNOSUPPRESYJNYCH <130> MJP/ah-884/5EP <160> 6 <170> PatentIn wersja 3.1 <210> 1 <211> 124 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Domena V łańcucha H humanizowanego przeciwciała hbf-5 <400> 1

22 22 <210> 2 <211> 111 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Domena V łańcucha κ humanizowanego przeciwciała hbf-5 <400> 2 <210> 3 <211> 372 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Domena V łańcucha H humanizowanego przeciwciała hbf-5 <400> 3

23 23 <210> 4 <211> 336 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Domena V łańcucha κ humanizowanego przeciwciała hbf-5 <400> 4 <210> 5 <211> 372 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 5

24 24 <210> 6 <211> 383 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 6

25 25 Zastrzeżenia patentowe 1. Humanizowane przeciwciało (hb-f5) pochodzące z mysiego przeciwciała monoklonalnego anty-cd4 B-F5, które to przeciwciało hb-f5 posiada domeny V zdefiniowane następującymi sekwencjami polipeptydowymi: - domena V łańcucha H: - domena V łańcucha L: zdolne do aktywacji specyficznej subpopulacji komórek T CD4+, mianowicie komórek CD4+CD Fragment przeciwciała hb-f5 określonego w zastrz.1, który to fragment obejmuje domeny V o sekwencjach SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: Polinukleotyd wybrany spośród : - polinukleotydu obejmującego sekwencję kodującą domenę V łańcucha H o sekwencji SEQ ID NO:1; - polinukleotydu obejmującego sekwencję kodującą domenę V łańcucha L o sekwencji SEQ ID NO:2. 4. Polinukleotyd według zastrz. 3, który wybrany jest spośród:

26 26 - polinukleotydu obejmującego sekwencję SEQ ID NO: 3: - polinukleotydu obejmującego sekwencję SEQ ID NO: Kompozycja terapeutyczna zawierająca humanizowane przeciwciało określone w zastrz. 1, albo fragment określony w zastrz Zastosowanie humanizowanego przeciwciała określonego w zastrz. 1 albo fragmentu określonego w zastrz. 2, do wytwarzania kompozycji immunosupresyjnej. 7. Zastosowanie humanizowanego przeciwciała określonego w zastrz. 1 do aktywacji in vitro regulatorowych komórek T CD25+CD Przeciwciało hb-f5 określone w zastrz. 1 albo jego fragment określony w zastrz. 2 do zastosowania jako lek. 9. Przeciwciało hb-f5 albo jego fragment według zastrz. 8 do leczenia lub profilaktyki odrzucenia przeszczepu, reakcji przeszczep przeciwko gospodarzowi albo reakcji gospodarz przeciwko przeszczepowi. 10. Przeciwciało hb-f5 albo jego fragment według zastrz. 8 do leczenia lub profilaktyki choroby autoimmunologicznej. 11. Przeciwciało hb-f5 albo jego fragment według zastrz. 10, w którym chorobę autoimmunologiczną stanowi zapalenie mięśnia sercowego, cukrzyca, łuszczyca, toczeń rumieniowaty, choroba Crohna, stwardnienie rozsiane albo reumatoidalne zapalenie stawów. 12. Zastosowanie przeciwciała hb-f5 określonego w zastrz. 1 albo jego fragmentu określonego w zastrz. 2 do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki odrzucenia przeszczepu, reakcji przeszczep przeciwko

27 27 gospodarzowi albo reakcji gospodarz przeciwko przeszczepowi. 13. Zastosowanie przeciwciała hb-f5 określonego w zastrz. 1 albo jego fragmentu określonego w zastrz. 2 do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki choroby autoimmunologicznej. 14. Zastosowanie według zastrz. 13, w którym chorobę autoimmunologiczną stanowi zapalenie mięśnia sercowego, cukrzyca, łuszczyca, toczeń rumieniowaty, choroba Crohna, stwardnienie rozsiane albo reumatoidalne zapalenie stawów. Biotest AG Pełnomocnik:

28 28 Figura 1

29 29 Figura 2

30 30 Figura 3

31 31 Figura 4

32 32 Figura 5

33 33 Figura 6

34 34 Figura 7

35 35 Figura 8

36 36 Figura 9