(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2013/20 EP B1 (13) (51) T3 Int.Cl. C07K 14/54 ( ) C12N 15/24 ( ) C07K 16/24 ( ) A61K 38/20 ( ) A61K 39/395 ( ) G01N 33/53 ( ) (54) Tytuł wynalazku: Heterologiczne polipeptydy IL-17 A/F i ich zastosowania terapeutyczne (30) Pierwszeństwo: US P US P (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2006/14 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2013/10 (73) Uprawniony z patentu: Genentech, Inc., South San Francisco, US (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 DAVID ARNOTT, San Mateo, US AUSTIN GURNEY, Belmont, US PHILIP HASS, Moss Beach, US JAMES LEE, San Bruno, US YAN WU, Foster City, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Piotr Godlewski JWP RZECZNICY PATENTOWI DOROTA RZĄŻEWSKA SP. J. ul. Żelazna 28/30 Sienna Center Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 17386/13/P-RO/PG EP Opis Heterologiczne polipeptydy IL-17 A/F i ich zastosowania terapeutyczne [0001] Wynalazek dotyczy ogólnie identyfikacji i izolacji nowej, ludzkiej cytokiny, nazwanej interleukiną-17a/f (IL-17A/F). [0002] Białka zewnątrzkomórkowe odgrywają ważne rolę, między innymi, w tworzeniu, różnicowaniu i utrzymywaniu organizmów wielokomórkowych. Los wielu pojedynczych komórek, np. proliferacja, migracja, różnicowanie lub oddziaływanie z innymi komórkami, jest zazwyczaj sterowany informacją uzyskiwaną od innych komórek i/lub najbliższego środowiska. Informacja ta jest często przekazywana poprzez wydzielane polipeptydy (przykładowo, czynniki mitogenne, czynniki przeżywalności, czynniki cytotoksyczne, czynniki różnicowania, neuropeptydy i hormony), które są z kolei otrzymywane i interpretowane przez różne receptory komórkowe lub białka związane z błonami. Te wydzielane polipeptydy lub cząsteczki sygnałowe przechodzą normalnie przez komórkową ścieżkę wydzielniczą, aby osiągnąć swoje miejsce działania w środowisku zewnątrzkomórkowym. [0003] Wydzielane białka mają różne zastosowania przemysłowe, włączając farmaceutyki, czynniki diagnostyczne, biosensory i bioreaktory. Większość dostępnych obecnie leków białkowych, takich jak środki trombolityczne, interferony, interleukiny, erytropoetyny, czynniki stymulujące wzrost kolonii i różne inne cytokiny, są białkami wydzielniczymi. Ich receptory, które są białkami błonowymi, również mają potencjał jako środki terapeutyczne lub diagnostyczne. [0004] Białka związane z błonami i receptory mogą odgrywać ważne role, między innymi, w tworzeniu, różnicowaniu i utrzymywaniu organizmów wielokomórkowych. Los wielu pojedynczych komórek, np. proliferacja, migracja, różnicowanie lub oddziaływanie z innymi komórkami, jest zazwyczaj sterowany informacją uzyskiwaną od innych komórek i/lub najbliższego środowiska. Informacja ta jest często przekazywana poprzez wydzielane polipeptydy (przykładowo, czynniki mitogenne, czynniki przeżywalności, czynniki cytotoksyczne, czynniki różnicowania, neuropeptydy i hormony), które są z kolei otrzymywane i interpretowane przez różne receptory komórkowe lub białka związane z błonami. Takie białka związane z błonami i receptory komórkowe obejmują, ale w sposób nieograniczający, receptory cytokin, kinazy receptorowe, fosfatazy receptorowe, receptory zaangażowane w oddziaływania komórka-komórka oraz komórkowe cząsteczki adhezyjne, takie jak selektyny i integryny. Przykładowo, przekazywanie sygnałów, które regulują wzrost i różnicowanie komórek, regulowane jest częściowo przez fosforylację różnych białek komórkowych. Białkowe kinazy tyrozynowe, enzymy które katalizują ten proces, mogą również działać jako receptory czynników wzrostu. Przykłady obejmują receptor czynnika wzrostu fibroblastów i receptor czynnika wzrostu nerwów. [0005] Podobnie do białek wydzielanych, białka związane z błonami i cząsteczki receptorowe również mają zastosowania przemysłowe, włączając jako środki farmaceutyczne i diagnostyczne. Immunoadhezyny receptorowe, przykładowo, można zastosować jako środki

3 2 terapeutyczne do blokowania oddziaływań receptor-ligand. Białka związane z błonami można również stosować do badania przesiewowego potencjalnych peptydów lub inhibitorów drobnocząsteczkowych ważnych oddziaływań receptor/ligand. [0006] W przemyśle i środowisku akademickim podjęto wysiłki dla identyfikacji nowych, naturalnych białek wydzielanych i naturalnych receptorów lub białek związanych z błonami. Wiele wysiłków skupia się na badaniu przesiewowym ssaczych bibliotek rekombinowanego DNA dla identyfikacji sekwencji kodujących nowe białka wydzielane. Przykłady sposobów i technik badań przesiewowych opisano w literaturze [patrz, przykładowo, Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 93: (1996); patent USA nr )]. [0007] W związku z tym, wynalazek dotyczy identyfikacji nowych, wydzielanych polipeptydów z rodziny interleukiny-17 (IL-17), dla których pokazano związek z chorobami zapalnymi i o podłożu immunologicznym. Choroby zapalne i o podłożu immunologicznym są przejawem lub konsekwencją dość skomplikowanych szlaków biologicznych, często wielokrotnie wzajemnie połączonych, które w prawidłowej fizjologii są kluczowe dla odpowiedzi na obrażenie lub uraz, inicjują naprawę obrażenia lub urazu oraz organizują [odpowiedź] obronną wrodzoną i nabytą przeciwko organizmom obcym. Choroba lub patologia pojawia się wtedy, kiedy te prawidłowe szlaki fizjologiczne powodują dodatkowe obrażenie lub uraz, albo jako bezpośrednio związane z intensywnością odpowiedzi, albo jako konsekwencję nieprawidłowej regulacji lub nadmiernej stymulacji, albo jako reakcję na siebie albo jako ich kombinację. [0008] Choć geneza tych chorób obejmuje często szlaki wieloetapowe i często wiele różnych biologicznych systemów/szlaków, interwencja w krytycznych punktach w jednej lub większej ilości z tych szlaków może mieć wpływ łagodzący lub terapeutyczny. Interwencja terapeutyczna może zachodzić albo przez antagonizm szkodliwego procesu/szlaku, albo przez stymulację korzystnego procesu/szlaku. [0009] Znanych jest wiele chorób o podłożu immunologicznym i zostały one obszernie zbadane. Takie choroby obejmują choroby zapalne o podłożu immunologicznym (takie jak reumatoidalne zapalenie stawów, chorobę nerek o podłożu immunologicznym, choroby wątroby i dróg żółciowych, chorobę zapalną jelit (IBD, ang. inflammatory bowel disease), łuszczycę i astmę), choroby zapalne o podłożu innym niż immunologiczne, choroby infekcyjne, choroby niedoborów odporności, nowotwór itd. [0010] Limfocyty T (komórki T) są ważnym składnikiem ssaczej odpowiedzi immunologicznej. Komórki T rozpoznają antygeny związane z własnymi cząsteczkami kodowanymi przez geny w obrębie głównego układu zgodności tkankowej (MHC, ang. major histocompatibility complex). Antygen może być prezentowany razem z cząsteczkami MHC na powierzchni komórek prezentujących antygen, komórek zainfekowanych wirusem, komórek nowotworowych, przeszczepów itd. Układ komórek T eliminuje te zmienione komórki, które stanowią zagrożenie dla zdrowia ssaka będącego gospodarzem. Komórki T obejmują komórki T pomocnicze i komórki T cytotoksyczne. Komórki T pomocnicze proliferują rozlegle po rozpoznaniu kompleksu antygen-mhc na komórce prezentującej

4 3 antygen. Komórki T pomocnicze wydzielają również wiele różnych cytokin, np. limfokin, które odgrywają kluczową rolę w aktywacji komórek B, cytotoksycznych komórek T i wielu różnych innych komórek, które uczestniczą w odpowiedzi immunologicznej. [0011] Głównym wydarzeniem w odpowiedziach immunologicznych humoralnych i komórkowych jest aktywacja i ekspansja klonalna pomocniczych komórek T. Aktywacja pomocniczej komórki T inicjowana jest przez oddziaływanie receptora komórki T (TCR, ang. T cell receptor) - kompleksu CD3 z antygenem-mhc na powierzchni komórki prezentującej antygen. Oddziaływanie to pośredniczy w kaskadzie wydarzeń biochemicznych, która indukuje spoczynkowe komórki T pomocnicze do wejścia w cykl komórkowy (przejście G0 do G1) i skutkuje ekspresją receptora o wysokim powinowactwie dla IL-2 i czasami IL-4. Aktywowana komórka T przechodzi przez cykl proliferacji i różnicowania w komórki pamięci lub komórki efektorowe. [0012] W dodatku do sygnałów, w których pośredniczą TCR, aktywacja komórek T obejmuje dodatkową kostymulację indukowaną cytokinami uwalnianymi przez komórki prezentujące antygen lub przez oddziaływania z cząsteczkami związanymi z błoną na komórce prezentującej antygen i komórce T. Pokazano, że cytokiny IL-1 i IL-6 zapewniają sygnał kostymulujący. Ponadto, na aktywację komórek T wpływa oddziaływanie między cząsteczką B7, ekspresjonowaną na powierzchni komórki prezentującej antygen i cząsteczkami CD28 oraz CTLA-4, ekspresjonowanymi na powierzchni komórki T. Aktywowane komórki T ekspresjonują zwiększoną liczbę komórkowych cząsteczek adhezyjnych, takich jak ICAM-1, integryny, VLA-4, LFA-1, CD56 itd. [0013] Proliferacja komórek T w hodowli mieszanych limfocytów lub reakcji mieszanych limfocytów (MLR, ang. mixed lymphocyte reaction) jest uznanym wskaźnikiem zdolności związku do stymulacji układu immunologicznego. W wielu odpowiedziach immunologicznych komórki zapalne naciekają miejsce urazu lub infekcji. Komórki migrujące mogą być neutrofilami, eozynofilami, monocytami lub limfocytami, jak można określić poprzez badanie histologiczne dotkniętych komórek. Current Protocols in Immunology, red. John E. Coligan, 1994, John Wiley & Sons, Inc. [0014] Choroby o podłożu immunologicznym można leczyć poprzez supresję odpowiedzi immunologicznej. Stosowanie przeciwciał neutralizujących, które hamują cząsteczki mające aktywność immunostymulującą, byłoby korzystne w leczeniu chorób zapalnych i o podłożu immunologicznym. Cząsteczki, które hamują odpowiedź immunologiczną można wykorzystywać (białka bezpośrednio lub via zastosowanie agonistów przeciwciałowych) do hamowania odpowiedzi immunologicznej, a zatem łagodzenia choroby o podłożu immunologicznym. [0015] Interleukina-17 (IL-17) jest cząsteczką prozapalną pochodzącą od komórek T, która stymuluje komórki nabłonkowe, śródbłonkowe i fibroblastyczne do wytwarzania innych zapalnych cytokin i chemokin, włączając IL-6, IL-8, G-CSF i MCP-1 [patrz, Yao, Z. et al., J. Immunol., 122(12): (1995); Yao, Z. et al., Immunity, 3(6): (1995); Fossiez, F., et al., J. Exp. Med., 183(6): (1996); Kennedy, J., et al., J. Interferon Cytokine

5 4 Res., 16(8):611-7 (1996); Cai, X. Y., et al., Immunol. Lett, 62(1):51-8 (1998); Jovanovic, D.V., et al., J. Immunol. 160(7): (1998); Laan, M., et al., J. Immunol., 162(4): (1999); Linden, A., et al., Eur Respir J, 15(5):973-7 (2000); i Aggarwal, S. and Gurney, A.L., J Leukoc Biol, 71(1):1-8 (2002)]. IL-17 synergizuje również z innymi cytokinami, włączając TNF-α i IL-1β, aby dodatkowo indukować ekspresję chemokin (Chabaud, M., et al., J. Immunol. 161(1): (1998)). Interleukina 17 (IL-17) wykazuje plejotropowe działania biologiczne na różne typy komórek. IL-17 ma również zdolność indukowania ekspresji powierzchniowej ICAM-1, proliferacji komórek T oraz wzrostu i różnicowania ludzkich, progenitorowych CD34 + w neutrofile. IL-17 łączy się również z metabolizmem kostnym i sugeruje się, że odgrywa ona ważną rolę w patologicznych stanach chorobowych, charakteryzujących się obecnością aktywowanych komórek T i produkcją TNF- α, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów i obluzowywanie implantów kostnych (Van Bezooijen et al., J. Bone Miner. Res., 14: [1999]). Stwierdzono, że aktywowane komórki T z tkanki maziówki, pochodzącej od pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów, wydzielają większe ilości IL-17 niż te pochodzące od zdrowych osobników lub pacjentów z osteoartrozą (Chabaud et al., Arthritis Rheum., 42: [1999]). Zasugerowano, że ta cytokina prozapalna aktywnie przyczynia się do zapalenia maziówkowego w reumatoidalnym zapaleniu stawów. Poza swoją rolą prozapalną, IL-17 wydaje się przyczyniać do patologii reumatoidalnego zapalenia stawów przez jeszcze inny mechanizm. Przykładowo pokazano, że IL-17 indukuje ekspresję mrna dla czynnika różnicowania osteoklastów (ODF, ang. osteoclast differentiation factor) w osteoblastach (Kotake et al., J. Clin. Invest., 103: [1999]). ODF stymuluje różnicowanie komórek progenitorowych w osteoklasty, komórki zaangażowane w resorpcję kości. Ponieważ poziom IL-17 jest znacząco zwiększony w płynie maziówkowym u pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów, wydaje się, że tworzenie osteoklastów indukowane IL-17 odgrywa kluczową rolę w resorpcji kości w reumatoidalnym zapaleniu stawów. Uważa się również, że IL-17 odgrywa również kluczową rolę w niektórych innych zaburzeniach autoimmunologicznych, takich jak stwardnienie rozsiane (Matusevicius etal., Mult. Scler., 5: (1999); Kurasawa, K., et al., Arthritis Rheu 43(11): (2000)) i łuszczyca (Teunissen, M.B., et al., J Invest Dermatol 111(4):645-9 (1998); Albanesi, C., et al., J Invest Dermatol 115(1):81-7 (2000); oraz Homey, B., et al., J. Immunol. 164(12: (2000)). [0016] Ponadto, poprzez sygnaling wewnątrzkomórkowy pokazano, że IL-17 stymuluje napływ Ca 2+ i zmniejszenie [camp] w ludzkich makrofagach (Jovanovic et al., J. Immunol., 160:3513 [1998]). Fibroblasty traktowane IL-17 indukują aktywację NF-κB, [Yao et al., Immunity, 3:811 (1995), Jovanovic et al., supra], podczas gdy makrofagi traktowane nią aktywują NF-κB i kinazy białkowe aktywowane mitogenem (Shalom-Barek et al., J. Biol. Chem., 273:27467 [1998]). Dodatkowo, IL-17 dzieli również podobieństwo sekwencji ze ssaczym czynnikiem 7 podobnym do cytokin, który zaangażowany jest we wzrost kości i chrząstki. Innymi białkami, z którymi polipeptydy IL-17 dzielą podobieństwo sekwencyjne są ludzki czynnik pochodzenia embrionalnego, związany z interleukiną (EDIRF, ang. embryoderived interleukin-related factor) i interleukina-20.

6 5 [0017] -Zgodnie z szerokim zakresem działań IL-17 stwierdzono, że receptor na powierzchni komórki dla for IL-17 jest powszechnie ekspresjonowany w wielu tkankach i typach komórek (Yao et al., Cytokine, 9:794 [1997]). Podczas, gdy sekwencja aminokwasowa ludzkiego receptora IL-17 (IL-R) (866 aminokwasów) przewiduje białko z pojedynczą domeną transbłonową i długą, 525 aminokwasową domeną wewnątrzkomórkową, sekwencja receptora jest unikalna i niepodobna do tej dla któregokolwiek receptora z rodziny receptorów dla cytokin/czynników wzrostu. To, w połączeniu z brakiem podobieństwa samej IL-17 do innych znanych białek wskazuje, że IL-17 i jej receptor mogą być częścią nowej rodziny białek sygnałowych i receptorów. Pokazano, że w aktywności IL-17 pośredniczy wiązanie do jej unikalnego, powierzchniowego receptora komórkowego (nazywanego tu ludzkim IL-17R), przy czym wcześniejsze badania pokazały, że kontaktowanie komórek T z rozpuszczalną postacią polipeptydu receptorowego IL-17 hamuje proliferację komórek T i wytwarzanie IL-2 indukowane PHA, konkanawaliną A i przeciwciałem monoklonalnym anty-tcr (Yao et al., J. Immunol., 155: [1995]). Istnieje znaczne zainteresowanie identyfikowaniem i charakteryzowaniem nowych polipeptydów o homologii do znanych receptorów cytokin, szczególnie receptorów IL-17. [0018] Interleukinę 17 uważa się obecnie za prototypowego członka powstającej rodziny cytokin. Sekwencjonowanie na dużą skalę genomów ludzkiego i innych kręgowców ukazało obecność dodatkowych genów kodujących białka wyraźnie związane z IL-17, definiując zatem nową rodzinę cytokin. Istnieje co najmniej 6 członków rodziny IL-17 u ludzi i myszy, włączając IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E i IL-17F, jak również nowe receptory IL-17RH 1, IL-17RH2, IL-17RH3 i IL-17RH4 (patrz WO01/46420, opublikowany 28 czerwca 2001). Pokazano, że jeden taki członek IL-17 (nazywany IL-17F) wiąże się do ludzkiego receptora IL-17 (IL-17R) (Yao et al., Cytokine, 9(11): (1997)). Wstępna charakterystyka sugeruje, że podobnie jak IL-17, kilka z tych nowo zidentyfikowanych cząsteczek ma zdolność do modulowania funkcji immunologicznej. Dla kilku z tych czynników zidentyfikowano silne działania zapalne, a powstające powiązania z głównymi chorobami człowieka sugerują, że białka te mogą mieć znaczącą rolę w procesach zapalnych i mogą oferować możliwości interwencji terapeutycznej. [0019] Gen kodujący ludzką IL-17F umiejscowiony jest w sąsiedztwie IL-17 (Hymowitz, S.G., et al., Embo J, 20(19): (2001)). IL-17 i IL-17F dzielą 44% identyczności aminokwasowej, podczas gdy inni członkowie rodziny IL-17 dzielą bardziej ograniczoną identyczność aminokwasową, wynoszącą 15-27%, co sugeruje, że IL-17 i IL-17F tworzą odrębną podgrupę w obrębie rodziny IL-17 (Starnes, T., et al., J Immunol, 167(8): (2001); Aggarwal, S. i Gurney, A.L., J. Leukoc Biol, 71(1):1-8 (2002)). IL-17F wydaje się mieć podobne działania biologiczne do IL-17 i zdolna jest promować wytwarzanie IL-6, IL-8 i G-CSF z wielu różnych komórek. Podobnie do IL-17, zdolna jest ona do indukowania uwalniania macierzy chrząstki i hamowania syntezy nowej macierzy chrząstki (patrz US A1, opublikowany 28 listopada 2002). Zatem, podobnie jak IL-17, IL-17F może potencjalnie przyczyniać się do patologii chorób zapalnych. Niedawno autorzy ci zaobserwowali, że zarówno IL-17, jak i IL-17F są indukowane w komórkach T poprzez działanie interleukiny 23 (IL-23) (Aggarwal, S., et al., J. Biol. Chem., 278(3): (2003)).

7 6 Obserwacja, że IL-17 i IL-17F mają podobne umiejscowienie chromosomalne i znaczne podobieństwo sekwencyjne, jak również obserwacja, że IL-17 i IL-17F wydają się być indukowane za pomocą tej samej populacji komórkowej w odpowiedzi na specyficzny bodziec, doprowadziły do identyfikacji nowej ludzkiej cytokiny, którą stanowi heterodimer z kowalentnie [połączonych] IL-17 i IL-17F (nazywany tu IL-17A/F). Ludzka IL-17A/F jest wyraźnie nową cytokiną, odróżnialną od ludzkiej IL-17 i 1L-17F zarówno w oznaczeniach struktury białkowej, jak i w opartych na komórkach [oznaczeniach] aktywności. Poprzez zastosowanie oczyszczonej, ludzkiej IL-17A/F jako standardu, opracowano ELISA specyficzny dla ludzkiej IL-17AF. Poprzez zastosowanie tego specyficznego ELISA wykryto indukowaną ekspresję ludzkiej IL-17A/F, co potwierdziło, że w hodowli IL-17A/F wytwarzana jest naturalnie z aktywowanych, ludzkich komórek T. Stąd, IL-17A/F jest odrębną, nową cytokiną, wykrywalną jako naturalny produkt wyizolowanych, aktywowanych, ludzkich komórek T, której postać rekombinowaną scharakteryzowano, zarówno w oznaczeniu struktury białka, jak i oznaczeniu opartym na komórkach, jako będącą różną i odróżnialną od powiązanych cytokin. Z tego względu, badania te zapewniły i zidentyfikowały nowy stymulant immunologiczny (tj. IL-17A/F), który może pobudzać układ immunologiczny do odpowiedzi na specyficzny antygen, który wcześniej mógł nie być aktywny immunologicznie. Nowo zidentyfikowany stymulant immunologiczny ma ważne zastosowania kliniczne. Ta nowa cytokina IL-17A/F lub jej agoniści znajdą zatem praktyczne zastosowanie jako stymulatory immunologiczne, podczas gdy oczekiwane będzie, że cząsteczki hamujące aktywność IL-17A/F (antagoniści) znajdą praktyczne zastosowanie, gdy pożądane będzie hamowanie odpowiedzi immunologicznej, tak jak w chorobach autoimmunologicznych. Specyficznie, terapeutyczne cechy będą miały przeciwciała względem tej nowej cytokiny, które naśladują (przeciwciała agonistyczne) albo hamują (przeciwciała antagonistyczne) działania immunologiczne IL-17A/F. Potencjalne zastosowania terapeutyczne miałyby również małe cząsteczki, które działają dla hamowania aktywności tej nowej cytokiny. A. Przykłady wykonania [0020] Wynalazek dotyczy kompozycji i sposobów użytecznych do diagnostyki i leczenia chorób o podłożu immunologicznym u ssaków, włączając ludzi. Wynalazek oparty jest na identyfikacji białek (włączając przeciwciała agonistyczne i antagonistyczne), które stymulują lub hamują odpowiedź immunologiczną u ssaków. Choroby o podłożu immunologicznym można leczyć poprzez supresję lub wzmacnianie odpowiedzi immunologicznej. Cząsteczki wzmacniające odpowiedź immunologiczną stymulują lub wzmacniają odpowiedź immunologiczną na antygen. Cząsteczki stymulujące odpowiedź immunologiczną można stosować terapeutycznie, gdy korzystne byłoby wzmacnianie odpowiedzi immunologicznej. Alternatywnie, gdy korzystne byłoby osłabianie odpowiedzi immunologicznej (np. stan zapalny), terapeutycznie stosować można cząsteczki supresjonujące odpowiedź immunologiczną, osłabiające lub zmniejszające odpowiedź immunologiczną na antygen (np. przeciwciała neutralizujące). Odpowiednio, polipeptydy IL-17A/F według wynalazku i ich antagoniści, jak zdefiniowano w zastrzeżeniach, użyteczni są również w otrzymywaniu leków i medykamentów do leczenia chorób o podłożu immunologicznym i zapalnych. W

8 7 specyficznym przykładzie wykonania, takie leki i medykamenty zawierają terapeutycznie skuteczną ilość polipeptydu IL-17A/F lub jego antagonisty, jak zdefiniowano w zastrzeżeniach, z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. Korzystnie, domieszka jest sterylna. [0021] W kolejnym przykładzie wykonania, wynalazek dotyczy sposobu identyfikowania agonistów lub antagonistów polipeptydu IL-17A/F, który obejmuje kontaktowanie polipeptydu IL-17A/F z cząsteczką-kandydatem i monitorowanie aktywności biologicznej mediowanej przez polipeptyd IL-17A/F. Korzystnie, polipeptyd IL-17A/F jest polipeptydem IL-17A/F o sekwencji naturalnej. Korzystnie, agonistą lub antagonistą IL-17A/F jest przeciwciało anty-il-17a/f. [0022] W innym przykładzie wykonania wynalazek dotyczy kompozycji z substancji zawierającej polipeptyd IL-17A/F lub przeciwciało antagonistyczne, które wiąże polipeptyd w domieszce z nośnikiem lub rozczynnikiem. W jednym z przykładów wykonania, kompozycja zawiera terapeutycznie skuteczną ilość polipeptydu lub przeciwciała. Kiedy kompozycja zawiera cząsteczkę stymulującą immunologicznie, kompozycja jest użyteczna do: (a) wzmacniania naciekania komórek zapalnych do tkanki ssaka, który tego potrzebuje, (b) stymulowania lub wzmacniania odpowiedzi immunologicznej u ssaka, który tego potrzebuje, (c) zwiększania proliferacji limfocytów T ssaka, który tego potrzebuje, w odpowiedzi na antygen, (d) stymulowania aktywności limfocytów T lub (e) zwiększania przepuszczalności naczyniowej. Kiedy kompozycja 3 zawiera cząsteczkę stymulującą immunologicznie, kompozycja jest użyteczna do: (a) zmniejszania naciekania komórek zapalnych do tkanki ssaka, który tego potrzebuje, (b) hamowania lub zmniejszania odpowiedzi immunologicznej u ssaka, który tego potrzebuje, (c) zmniejszania aktywności limfocytów T lub (d) zmniejszania proliferacji limfocytów T ssaka, który tego potrzebuje, w odpowiedzi na antygen. Kompozycja może zawierać dodatkowy składnik aktywny, który może, przykładowo, być kolejnym przeciwciałem lub środkiem cytotoksycznym lub chemioterapeutycznym. Korzystnie, kompozycja jest sterylna. [0023] W innym przykładzie wykonania wynalazek dotyczy sposobu leczenia zaburzenia o podłożu immunologicznym u ssaka, który tego potrzebuje, obejmującego podawanie ssakowi terapeutycznie skutecznej ilości polipeptydu IL-17A/F, jego agonisty lub jego antagonisty. W korzystnym przykładzie wykonania, zaburzenie o podłożu immunologicznym wybiera się z grupy, składającej się z: tocznia rumieniowatego układowego, reumatoidalnego zapalenia stawów, osteoartrozy, młodzieńczego, przewlekłego zapalenia stawów, spondyloartropatii, twardziny układowej, idiopatycznych miopatii zapalnych, zespołu Sjögrena, układowego zapalenia naczyń, sarkoidozy, anemii autoimmunohemolitycznej, trombocytopenii autoimmunologicznej, zapalenia tarczycy, cukrzycy, choroby nerek o podłożu immunologicznym, chorób demielinizacyjnych układów nerwowych ośrodkowego i obwodowego, takich jak stwardnienie rozsiane, idiopatyczna, demielinizująca polineuropatia lub zespół Guillaina-Barréa oraz przewlekła, zapalna polineuropatia demielinizująca, chorób wątroby i dróg żółciowych, takich jak infekcyjne, autoimmunologiczne, przewlekłe, aktywne zapalenie wątroby, pierwotna marskość wątroby, zapalenie wątroby ziarniniakowe i

9 8 stwardniające zapalenie dróg żółciowych, nieswoistego zapalenia jelit, enteropatii z nadwrażliwości na gluten i choroby Whipplea, chorób skóry autoimmunologicznych lub o podłożu immunologicznym, włączając choroby pęcherzowe skóry, rumień wielopostaciowy i kontaktowe zapalenie skóry, łuszczycę, chorób alergicznych, takich jak astma, alergiczny nieżyt nosa, atopowe zapalenie skóry, nadwrażliwość pokarmowa i pokrzywka, chorób immunologicznych płuc, takich jak eozynofilowe zapalenie płuc, idiopatyczne zwłóknienie płuc i zapalenie płuc z nadwrażliwości, chorób związanych z przeszczepem, włączając odrzucenie przeszczepu i chorobę przeszczep przeciwko gospodarzowi. [0024] W innym przykładzie wykonania wynalazek zapewnia wyizolowane przeciwciało, które specyficznie wiąże się do któregokolwiek z polipeptydów IL-17A/F, opisanych powyżej lub poniżej. Opcjonalnie, przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym, przeciwciałem humanizowanym, fragmentem przeciwciała lub przeciwciałem jednołańcuchowym, jak zdefiniowano w zastrzeżeniach. Przeciwciało hamuje lub neutralizuje aktywność polipeptydu IL-17A/F (przeciwciało antagonistyczne). Korzystnie, przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym, które korzystnie ma reszty regionu determinującego dopasowanie (CDR, ang. complementarity determining region) innego niż ludzki i reszty ludzkiego regionu zrębowego (FR, ang. framework region). Przeciwciało może być wyznakowane i może być zimmobilizowane na stałym podłożu. W kolejnym przykładzie wykonania, przeciwciało jest fragmentem przeciwciała, przeciwciałem monoklonalnym, przeciwciałem jednołańcuchowym lub przeciwciałem anty-idiotypowym. [0025] Wynalazek może zapewniać wyizolowany fragment Fab, zdolny do wiązania IL- 17A/F, kodowany przez sekwencję nukleotydową, która koduje taką sekwencję aminokwasową, jak opisana powyżej. Procesy ich wytwarzania również opisano, przy czym procesy te obejmują hodowanie komórki gospodarza, zawierającej wektor, który zawiera odpowiednią cząsteczkę kodującego kwasu nukleinowego, w warunkach odpowiednich do ekspresji fragmentu Fab i odzyskiwania fragmentu Fab z hodowli komórkowej. [0026] W jeszcze innym przykładzie wykonania, wynalazek dotyczy kompozycji zawierającej przeciwciało anty-il-17a/f, jak zdefiniowano w zastrzeżeniach, w domieszce z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. W jednym z przykładów wykonania, kompozycja zawiera terapeutycznie skuteczną ilość przeciwciała. Korzystnie, kompozycja jest sterylna. Kompozycję można podawać w postaci płynnej formulacji farmaceutycznej, którą można konserwować dla uzyskania wydłużonej stabilności podczas przechowywania. Alternatywnie, przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym, fragmentem przeciwciała, przeciwciałem humanizowanym lub przeciwciałem jednołańcuchowym. [0027] W kolejnym przykładzie wykonania, wynalazek dotyczy wytwarzanego przedmiotu, zawierającego: (a) kompozycję z substancji, zawierającej polipeptyd IL-17A/F lub przeciwciało antagonistyczne, które specyficznie wiąże się do polipeptydu, jak zdefiniowano w zastrzeżeniach; (b) pojemnik zawierający kompozycję; i

10 9 (c) etykietę przytwierdzoną do pojemnika lub ulotkę dołączoną do pojemnika, dotyczącą stosowania polipeptydu IL-17A/F lub jego agonisty lub antagonisty, w leczeniu choroby o podłożu immunologicznym. Kompozycja może zawierać terapeutycznie skuteczną ilość polipeptydu IL-17A/F lub jego agonisty lub antagonisty. [0028] Opisano sposób diagnozowania choroby o podłożu immunologicznym u ssaka, obejmujący wykrywanie poziomu ekspresji genu kodującego polipeptyd IL-17A/F (a) w próbce testowej komórek z tkanki uzyskanej od ssaka i (b) w próbce kontrolnej ze znanych, prawidłowych komórek tkanki z tego samego typu komórek, przy czym wyższy lub niższy poziom ekspresji w próbce testowej, w porównaniu do próbki kontrolnej, wskazuje na obecność choroby o podłożu immunologicznym u ssaka, z którego uzyskano testowe komórki tkanki. [0029] W innym przykładzie wykonania, wynalazek dotyczy sposobu diagnozowania choroby immunologicznej u ssaka, obejmującego (a) kontaktowanie przeciwciała anty-il-17a/f z próbką testową komórek z tkanki uzyskanej od ssaka i (b) wykrywanie tworzenia kompleksu między przeciwciałem a polipeptydem IL-17A/F w próbce testowej; przy czym tworzenie kompleksu wskazuje na obecność lub brak choroby. Wykrywanie jest ilościowe i przeprowadzane w porównaniu z monitorowaniem tworzenia kompleksu w próbce kontrolnej ze znanych, prawidłowych komórek z tkanki z tego samego typu komórek. Większa ilość utworzonych kompleksów w próbce testowej wskazuje na obecność lub brak choroby immunologicznej u ssaka, od którego uzyskano testowe komórki z tkanki. Przeciwciało korzystnie ma wykrywalny znacznik. Tworzenie kompleksu można monitorować, przykładowo, za pomocą mikroskopii świetlnej, cytometrii przepływowej, fluorymetrii lub innych technik znanych w stanie techniki. Próbkę testową uzyskuje się zazwyczaj od osobnika, u którego podejrzewa się niedobór lub nieprawidłowość układu immunologicznego. [0030] W innym przykładzie wykonania, wynalazek zapewnia sposób określania obecności polipeptydu IL-17A/F w próbce, obejmujący eksponowanie próbki testowej z komórek podejrzanych o zawieranie polipeptydu IL-17A/F na przeciwciało anty-il-17a/f i określanie wiązania przeciwciała do próbki komórek. Korzystnie, próbka zawiera komórki podejrzane o zawieranie polipeptydu IL-17A/F, a przeciwciało wiąże się do komórki. Przeciwciało jest korzystnie wyznakowane w sposób wykrywalny i/lub związane do stałego podłoża. [0031] W innym przykładzie wykonania wynalazek może dotyczyć zestawu diagnostycznego dla choroby o podłożu immunologicznym, zawierającego przeciwciało anty-il-17a/f i nośnik, w odpowiednim opakowaniu. Zestaw zawiera korzystnie instrukcje do stosowania przeciwciała do wykrywania obecności polipeptydu IL-17A/F. Korzystnie, nośnik jest dopuszczalny farmaceutycznie. [0032] W innym przykładzie wykonania wynalazek może dotyczyć zestawu diagnostycznego, zawierającego przeciwciało anty-il-17a/f w odpowiednim opakowaniu. Zestaw zawiera korzystnie instrukcje do stosowania przeciwciała do wykrywania polipeptydu IL-17A/F. [0033] W innym przykładzie wykonania wynalazek dotyczy sposobu diagnozowania choroby o podłożu immunologicznym u ssaka, który obejmuje wykrywanie obecności lub

11 10 nieobecności polipeptydu IL-17A/F w próbce testowej z komórek z tkanki uzyskanej od ssaka, przy czym obecność lub nieobecność polipeptydu IL-17A/F w próbce testowej wskazuje na obecność choroby o podłożu immunologicznym u ssaka. [0034] W innym przykładzie wykonania wynalazek dotyczy sposobu identyfikowania agonisty polipeptydu IL-17A/F, obejmujący: (a) kontaktowanie komórek i związku testowego dla badania przesiewowego w warunkach indukcji odpowiedzi komórkowej, wywoływanej normalnie przez polipeptyd IL-17A/F; i (b) określania indukcji odpowiedzi komórkowej dla ustalenia, czy związek testowy jest skutecznym agonistą, przy czym indukcja odpowiedzi komórkowej wskazuje na to, że związek testowy jest skutecznym agonistą. [0035] W innym przykładzie wykonania wynalazek dotyczy sposobu identyfikowania związku zdolnego do hamowania aktywności polipeptydu IL-17A/F, obejmujący kontaktowanie związku-kandydata z polipeptydem IL-17A/F w warunkach i przez czas wystarczający, aby pozwolić na oddziaływanie tych dwóch komponentów i określanie czy hamowana jest aktywność polipeptydu IL-17A/F. Korzystnie, związek-kandydat lub polipeptyd IL-17A/F jest zimmobilizowany na stałym podłożu. Korzystnie, komponent niezimmobilizowany ma wykrywalny znacznik. Korzystnie, sposób obejmuje następujące etapy: (a) kontaktowania komórek i związku testowego dla badania przesiewowego w obecności polipeptydu IL-17A/F, w warunkach odpowiednich do indukowania odpowiedzi komórkowej, wywoływanej normalnie przez polipeptyd IL-17A/F; i (b) określania wywoływania odpowiedzi komórkowej dla ustalenia, czy związek testowy jest skutecznym antagonistą. [0036] W innym przykładzie wykonania wynalazek zapewnia sposób identyfikowania związku hamującego ekspresję polipeptydu IL-17A/F w komórkach, które normalnie ekspresjonują polipeptyd, przy czym sposób obejmuje kontaktowanie komórek ze związkiem testowym i ustalanie, czy hamowana jest ekspresja polipeptydu IL-17A/F. Korzystnie, sposób ten obejmuje etapy: (a) kontaktowania komórek i związku testowego dla badania przesiewowego, w warunkach odpowiednich do umożliwiania ekspresji polipeptydu IL-17A/F; i (b) określania hamowania ekspresji polipeptydu. [0037] W jeszcze innym przykładzie wykonania wynalazek dotyczy sposobu leczenia zaburzenia o podłożu immunologicznym u ssaka, który na nie cierpi, obejmujący podawanie ssakowi cząsteczki kwasu nukleinowego, kodującej (a) polipeptyd IL-17A/F lub (b) przeciwciało antagonistyczne polipeptydu IL-17A/F, jak zdefiniowano w zastrzeżeniach. W korzystnym przykładzie wykonania ssakiem jest człowiek. W innym, korzystnym przykładzie wykonania, kwas nukleinowy podawany jest vivo w terapii genowej. W kolejnym, korzystnym przykładzie wykonania, kwas nukleinowy zawarty jest w wektorze, korzystniej wektorze adenowirusowym, związanym z adenowirusem, lentiwirusowym lub retrowirusowym.

12 11 [0038] Wynalazek może zapewniać rekombinowaną cząstkę wirusową, zawierającą wektor wirusowy, składający się zasadniczo z promotora, kwasu nukleinowego kodującego (a) polipeptyd IL-17A/F lub (b) przeciwciało antagonistyczne polipeptydu IL-17A/F, jak zdefiniowano w zastrzeżeniach, oraz sekwencji sygnalnej do wydzielania komórkowego polipeptydu, przy czym wektor wirusowy występuje w połączeniu z wirusowymi białkami strukturalnymi. Korzystnie, sekwencja sygnalna pochodzi od ssaka, tak jak z naturalnego polipeptydu IL-17A/F. [0039] W jeszcze dalszym przykładzie wykonania, wynalazek może dotyczyć komórki wytwarzającej ex vivo, zawierającej konstrukt kwasu nukleinowego, ekspresjonującej retrowirusowe białka strukturalne i zawiera również wektor retrowirusowy, składający się zasadniczo z promotora, kwasu nukleinowego kodującego (a) polipeptyd IL-17A/F lub (c) przeciwciało antagonistyczne polipeptydu IL-17A/F, jak zdefiniowano w zastrzeżeniach, oraz sekwencji sygnalnej do wydzielania komórkowego polipeptydu, przy czym komórka wytwarzająca pakuje wektor wirusowy w połączeniu z białkami strukturalnymi dla wytwarzania rekombinowanych cząstek wirusowych. [0040] Opisano sposób wzmacniania naciekania komórek zapalnych z naczyń do tkanki ssaka, obejmujący podawanie ssakowi (a) polipeptydu IL-17A/F lub (b) agonisty polipeptydu IL-17A/F, przy czym wzmacniane jest naciekanie komórek zapalnych z naczyń u ssaka. [0041] W jeszcze dalszym przykładzie wykonania wynalazek dotyczy sposobu zmniejszania naciekania komórek zapalnych z naczyń do tkanki ssaka, obejmujący podawanie ssakowi (a) polipeptydu IL-17A/F lub (b) przeciwciała antagonistycznego wobec polipeptydu IL-17A/F, jak zdefiniowano w zastrzeżeniach, przy czym naciekanie komórek zapalnych z naczyń u ssaka jest zmniejszone. [0042] Opisano sposób zwiększania aktywności limfocytów T u ssaka, obejmujący podawanie ssakowi (a) polipeptydu IL-17A/F lub (b) agonisty polipeptydu IL-17A/F, przy czym aktywność limfocytów T u ssaka jest zwiększona. [0043] W jeszcze dalszym przykładzie wykonania wynalazek może dotyczyć sposobu zmniejszania aktywności limfocytów T u ssaka, obejmujący podawanie ssakowi (a) polipeptydu IL-17A/F lub (b) przeciwciała antagonistycznego wobec polipeptydu IL-17A/F, jak zdefiniowano w zastrzeżeniach, przy czym aktywność limfocytów T u ssaka jest zmniejszona. [0044] Opisano sposób zwiększania proliferacji limfocytów T u ssaka, obejmujący podawanie ssakowi (a) polipeptydu IL-17A/F lub (b) agonisty polipeptydu IL-17A/F, przy czym proliferacja limfocytów T u ssaka jest zwiększona. [0045] W jeszcze dalszym przykładzie wykonania wynalazek dotyczy sposobu zmniejszania proliferacji limfocytów T u ssaka, obejmujący podawanie ssakowi (a) polipeptydu IL-17A/F lub (b) przeciwciała antagonistycznego wobec polipeptydu IL-17A/F, jak zdefiniowano w zastrzeżeniach, przy czym proliferacja limfocytów T u ssaka jest zmniejszona.

13 12 [0046] W jeszcze dalszym przykładzie wykonania wynalazek dotyczy zastosowania polipeptydu IL-17A/F lub jego przeciwciała agonistycznego lub antagonistycznego, jak zdefiniowano w zastrzeżeniach, lub przeciwciała anty-il-17 A/F, do otrzymywania leku użytecznego w leczeniu stanu chorobowego, który odpowiada na polipeptyd IL-17A/F lub jego antagonistę (np. anty-il-17 A/F). Wynalazek może dotyczyć zastosowania polipeptydu IL-17A/F lub jego przeciwciała antagonistycznego, jak zdefiniowano w zastrzeżeniach, w sposobie leczenia zaburzenia zwyrodnieniowego chrząstki. [0047] W jeszcze dalszym przykładzie wykonania wynalazek dotyczy sposobu leczenia zaburzenia zwyrodnieniowego chrząstki u ssaka, obejmującego podawanie terapeutycznie skutecznej ilości polipeptydu IL-17A/F lub jego przeciwciała antagonistycznego, jak zdefiniowano w zastrzeżeniach, ssakowi cierpiącemu na zaburzenie. [0048] W jeszcze dalszym przykładzie wykonania wynalazek dotyczy zestawu, zawierającego polipeptyd IL-17A/F lub jego przeciwciało antagonistyczne, jak zdefiniowano w zastrzeżeniach, w domieszce z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem; pojemnik zawierający kompozycję; i etykietę przymocowaną do pojemnika, dotyczącą stosowania kompozycji w leczeniu zaburzenia zwyrodnieniowego chrząstki. B. Dodatkowe Przykłady Wykonania [0049] W innych przykładach wykonania wynalazku, wynalazek zapewnia wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, obejmującą sekwencję nukleotydową, która koduje polipeptyd IL-17A/F. [0050] W jednym z przykładów wykonania, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera sekwencję nukleotydową, mającą co najmniej około 80% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 81% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 82% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 83% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 84% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 85% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 86% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 87% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 88% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 89% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 90% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 91% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 92% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 93% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 94% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 95% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 96% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 97% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 98% identyczności sekwencji kwasu

14 13 nukleinowego i alternatywnie co najmniej około 99% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego z (a) cząsteczką DNA kodującą polipeptyd IL-17A/F, jak zdefiniowano w zastrzeżeniach. [0051] Opisana jest wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego zawierająca sekwencję nukleotydową, mającą co najmniej około 80% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 81% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 82% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 83% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 84% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 85% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 86% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 87% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 88% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 89% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 90% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 91% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 92% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 93% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 94% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 95% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 96% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 97% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 98% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego i alternatywnie co najmniej około 99% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego z (a) cząsteczką DNA zawierającą sekwencję kodującą cdna polipeptydu IL-17A/F pełnej długości, jak ujawniono, sekwencję kodującą polipeptyd IL-17A/F, któremu brakuje polipeptydu sygnalnego, jak ujawniono lub sekwencję kodującą którykolwiek inny, specyficznie zdefiniowany fragment pełnej długości sekwencji aminokwasowej, jak ujawniono lub (b) dopełnienie [cząsteczkę komplementarną] cząsteczki DNA z (a). [0052] Opisana jest wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego zawierająca sekwencję nukleotydową, mającą co najmniej około 80% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 81 % identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 82% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 83% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 84% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 85% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 86% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 87% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 88% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 89% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 90% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 91 % identyczności sekwencji kwasu nukleinowego,

15 14 alternatywnie co najmniej około 92% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 93% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 94% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 95% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 96% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 97% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 98% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego i alternatywnie co najmniej około 99% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego z (a) cząsteczką DNA kodującą ten sam dojrzały polipeptyd kodowany przez którekolwiek z cdna ludzkich białek zdeponowanych w ATCC, jak ujawniono lub (b) dopełnienie [cząsteczkę komplementarną] cząsteczki DNA z (a). [0053] Opisano fragmenty sekwencji kodującej polipeptyd IL-17A/F lub do niej komplementarnej, które mogą znaleźć zastosowanie jako, przykładowo, sondy hybrydyzacyjne, do kodowania fragmentów polipeptydu IL-17A/F, które mogą opcjonalnie kodować polipeptyd zawierający miejsce wiązania dla przeciwciała anty-il-17a/f lub jako antysensowne sondy oligonukleotydowe. Takie fragmenty kwasu nukleinowego mają zazwyczaj co najmniej około 20 nukleotydów długości, alternatywnie co najmniej około 30 nukleotydów długości, alternatywnie co najmniej około 40 nukleotydów długości, alternatywnie co najmniej około 50 nukleotydów długości, alternatywnie co najmniej około 60 nukleotydów długości, alternatywnie co najmniej około 70 nukleotydów długości, alternatywnie co najmniej około 80 nukleotydów długości, alternatywnie co najmniej około 90 nukleotydów długości, alternatywnie co najmniej około 100 nukleotydów długości, alternatywnie co najmniej około 110 nukleotydów długości, alternatywnie co najmniej około 120 nukleotydów długości, alternatywnie co najmniej około 130 nukleotydów długości, alternatywnie co najmniej około 140 nukleotydów długości, alternatywnie co najmniej około 150 nukleotydów długości, alternatywnie co najmniej około 160 nukleotydów długości, alternatywnie co najmniej około 170 nukleotydów długości, alternatywnie co najmniej około 180 nukleotydów długości, alternatywnie co najmniej około 190 nukleotydów długości, alternatywnie co najmniej około 200 nukleotydów długości, alternatywnie co najmniej około 250 nukleotydów długości, alternatywnie co najmniej około 300 nukleotydów długości, alternatywnie co najmniej około 350 nukleotydów długości, alternatywnie co najmniej około 400 nukleotydów długości, alternatywnie co najmniej około 450 nukleotydów długości, alternatywnie co najmniej około 500 nukleotydów długości, alternatywnie co najmniej około 600 nukleotydów długości, alternatywnie co najmniej około 700 nukleotydów długości, alternatywnie co najmniej około 800 nukleotydów długości, alternatywnie co najmniej około 900 nukleotydów długości i alternatywnie co najmniej około 1000 nukleotydów długości, przy czym w tym kontekście wyrażenie "około" oznacza referencyjną długość sekwencji nukleotydowej plus lub minus 10% tej długości referencyjnej. Zauważono, że nowe fragmenty sekwencji nukleotydowej kodującej polipeptyd IL-17A/F można określać w sposób rutynowy poprzez przyrównanie sekwencji nukleotydowej, kodującej polipeptyd IL- 17A/F z innymi, znanymi sekwencjami nukleotydowymi, stosując którykolwiek z wielu dobrze znanych programów do przyrównań sekwencyjnych i określając, który fragment(y)

16 15 sekwencji nukleotydowej kodującej polipeptyd są nowe. Rozważa się wszystkie spośród takich sekwencji nukleotydowych kodujących polipeptyd. Rozważa się również fragmenty polipeptydu kodowane przez te fragmenty cząsteczek nukleotydowych, korzystnie te fragmenty polipeptydu IL-17A/F, które obejmują miejsce wiążące dla przeciwciała anty-il- 17A/F. [0054] Opisano również wyizolowany polipeptyd IL-17A/F, kodowany przez którąkolwiek ze zidentyfikowanych powyżej, wyizolowanych sekwencji kwasów nukleinowych. [0055] W pewnym przykładzie wykonania, wynalazek dotyczy wyizolowanego polipeptydu IL-17A/F, zawierającego sekwencję aminokwasową, mającą co najmniej około 80% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 81% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 82% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 83% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 84% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 85% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 86% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 87% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 88% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 89% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 90% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 91% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 92% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 93% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 94% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 95% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 96% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 97% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 98% identyczności sekwencji aminokwasowej i alternatywnie co najmniej około 99% identyczności sekwencji aminokwasowej z IL-17A/F, mającym sekwencje aminokwasowe pełnej długości, jak zdefiniowano w zastrzeżeniach. [0056] Opisany jest wyizolowany polipeptyd IL-17A/F, zawierający sekwencję aminokwasową, mającą co najmniej około 80% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 81% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 82% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 83% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 84% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 85% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 86% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 87% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 88% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 89% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 90% identyczności sekwencji

17 16 aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 91% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 92% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 93% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 94% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 95% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 96% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 97% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 98% identyczności sekwencji aminokwasowej i alternatywnie co najmniej około 99% identyczności sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową kodowaną przez którykolwiek z cdna dla białek ludzkich, zdeponowany w ATCC, jak ujawniono w przedmiotowym zgłoszeniu. [0057] Opisano również wyizolowany polipeptyd IL-17A/F, zawierający sekwencję aminokwasową, dającą co najmniej około 80% wyników pozytywnych, alternatywnie co najmniej około 81% wyników pozytywnych, alternatywnie co najmniej około 82% wyników pozytywnych, alternatywnie co najmniej około 83% wyników pozytywnych, alternatywnie co najmniej około 84% wyników pozytywnych, alternatywnie co najmniej około 85% wyników pozytywnych, alternatywnie co najmniej około 86% wyników pozytywnych, alternatywnie co najmniej około 87% wyników pozytywnych, alternatywnie co najmniej około 88% wyników pozytywnych, alternatywnie co najmniej około 89% wyników pozytywnych, alternatywnie co najmniej około 90% wyników pozytywnych, alternatywnie co najmniej około 91% wyników pozytywnych, alternatywnie co najmniej około 92% wyników pozytywnych, alternatywnie co najmniej około 93% wyników pozytywnych, alternatywnie co najmniej około 94% wyników pozytywnych, alternatywnie co najmniej około 95% wyników pozytywnych, alternatywnie co najmniej około 96% wyników pozytywnych, alternatywnie co najmniej około 97% wyników pozytywnych, alternatywnie co najmniej około 98% wyników pozytywnych i alternatywnie co najmniej około 99% wyników pozytywnych w porównaniu z sekwencją aminokwasową polipeptydu IL-17A/F, mającego sekwencję aminokwasową pełnej długości, jak ujawniono, sekwencją aminokwasową pozbawioną peptydu sygnalnego, jak ujawniono lub jakimkolwiek innym, specyficznie zdefiniowanym fragmentem ujawnionej sekwencji aminokwasowej pełnej długości. [0058] W szczególnym przykładzie wykonania, wynalazek zapewnia wyizolowany polipeptyd IL-17A/F bez N-końcowej sekwencji sygnalnej i/lub początkowej metioniny i kodowany jest przez sekwencję nukleotydową, która koduje taką sekwencję aminokwasową, jak opisano powyżej Procesy ich wytwarzania również opisano, przy czym procesy te obejmują hodowanie komórki gospodarza, zawierającej wektor, który zawiera odpowiednią cząsteczkę kodującego kwasu nukleinowego, w warunkach odpowiednich do ekspresji polipeptydu IL-17A/F i odzyskiwania polipeptydu IL-17A/F z hodowli komórkowej. [0059] W jeszcze innym przykładzie wykonania wynalazek dotyczy przeciwciał antagonistycznych naturalnego polipeptydu IL-17A/F, jak zdefiniowano w zastrzeżeniach. [0060] W kolejnym przykładzie wykonania, wynalazek dotyczy sposobu identyfikowania agonistów lub antagonistów polipeptydu IL-17A/F, który obejmuje kontaktowanie

18 17 polipeptydu IL-17A/F z cząsteczką-kandydatem i monitorowanie aktywności biologicznej mediowanej przez polipeptyd IL-17A/F. Korzystnie, polipeptyd IL-17A/F jest naturalnym polipeptydem IL-17A/F. [0061] W jeszcze dalszym przykładzie wykonania wynalazek dotyczy kompozycji z substancji, zawierającej polipeptyd IL-17A/F lub przeciwciało antagonistyczne polipeptydu IL-17A/F, jak zdefiniowano w zastrzeżeniach, w kombinacji z nośnikiem. Opcjonalnie, nośnik jest nośnikiem dopuszczalnym farmaceutycznie. [0062] Inny przykład wykonania wynalazku dotyczy zastosowania polipeptydu IL-17A/F lub jego przeciwciała antagonistycznego, jak zdefiniowano w zastrzeżeniach, do otrzymywania leku użytecznego w leczeniu stanu chorobowego, który odpowiada na polipeptyd IL-17A/F lub jego antagonistę. [0063] W dodatkowych przykładach wykonania wynalazku, wynalazek zapewnia wektory zawierające DNA kodujące którykolwiek z opisanych polipeptydów. Zapewnia się również komórkę gospodarza, zawierającą dowolny taki wektor. Celem przykładu, komórkami gospodarza mogą być komórki CHO, E. coli, drożdżowe lub komórki owadzie zainfekowane bakulowirusem. Zapewnia się ponadto proces otrzymywania dowolnych z opisanych polipeptydów, a obejmuje on hodowanie komórek gospodarza w warunkach odpowiednich do ekspresjonowania pożądanego polipeptydu i odzyskiwanie pożądanego polipeptydu z hodowli komórkowej. [0064] W innych przykładach wykonania wynalazek zapewnia cząsteczki chimerowe, zawierające dowolny z opisanych polipeptydów w fuzji z heterologicznym polipeptydem lub sekwencją aminokwasową. Przykłady takich cząsteczek chimerowych obejmują dowolne z opisanych polipeptydów w fuzji z sekwencją znacznika epitopowego lub regionem Fc immunoglobuliny. [0065] W jeszcze innym przykładzie wykonania wynalazek zapewnia przeciwciało, jak zdefiniowano w zastrzeżeniach, które specyficznie wiąże się do któregokolwiek z polipeptydów IL-17A/F, opisanych powyżej lub poniżej. Opcjonalnie, przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym, przeciwciałem humanizowanym, fragmentem przeciwciała lub przeciwciałem jednołańcuchowym. [0066] W jeszcze innych przykładach wykonania wynalazek może zapewniać sondy oligonukleotydowe, użyteczne do izolowania sekwencji nukleotydowych genomowych i cdna oraz jako sondy antysensowne, przy czym sondy te mogą pochodzić z dowolnej z sekwencji nukleotydowych, opisanych powyżej lub poniżej. KRÓTKI OPIS RYSUNKÓW [0067] Figura 1 przedstawia wyniki ekspresji i izolacji nowej, ludzkiej cytokiny, nazwanej IL- 17A/F Ludzkie komórki nerki 293 transfekowano za pomocą wektorów ekspresyjnych cdna, kodujących ludzką IL-17 i IL-17F, samych lub w kombinacji, jak wskazano na Fig. 1A i Fig. 1B. Pożywkę kondycjonowaną z transfekowanych komórek poddawano

19 18 immunoprecypitacji (IP), stosując przeciwciała zdolne do rozpoznawania IL-17 (ścieżki 1-5) lub IL-17F (ścieżki 6-10), jak wskazano na Fig. 1A i Fig. 1B. Przedstawiono analizę Western Blot pokazującą obecność dimerycznego kompleksu IL- 17A/F na ścieżce 8 na Fig. 1A i na ścieżce 3 na Fig. 1B. Dimeryczny kompleks IL-17A/F zgadza się pod względem rozmiaru z kowalentnymi, heterodimerycznymi rodzajami, zawierającymi jeden łańcuch polipeptydowy IL-17 i jeden łańcuch polipeptydowy IL- 17F. Figura 2 przedstawia oczyszczanie rekombinowanego IL-17A/F. Figura 2A przedstawia wynik SDS-PAGE z barwieniem srebrem frakcji białek z wyjściowego frakcjonowania IL-17A/F na kolumnie S-Sepharose. Frakcje 31 i 32 zawierają białko o pozornej masie cząsteczkowej wynoszącej w przybliżeniu 33 kd, zgodnej z IL-17A/F. Figura 2B przedstawia wyniki dodatkowego oczyszczania IL-17A/F z zastosowaniem kolumny chromatograficznej Vydac C4. Przedstawiono chromatogram wyeluowanych białek, mierzonych przy 214 nm i 280 nm. Figura 2C pokazuje, że oczyszczone frakcje białka IL-17A/F z oczyszczania na kolumnie Vydac C4, indukują wytwarzanie IL-8 w komórkach TK-10. Figura 3 przedstawia wyniki analizy sekwencji aminokwasowej IL-17A/F. Figura 3A przedstawia analizę SDS-PAGE w warunkach nieredukujących dla oczyszczonej IL- 17A/F. Rozwinięte białko przenoszono na membranę PVDF i wybarwiano barwnikiem białkowym Coomassie Blue. Ułożenie markerów masy cząsteczkowej przedstawiono po prawej stronie. Figura 3B przedstawia wyniki analizy sekwencjonowania N-końcowego wyizolowanej IL-17A/F (reszty aminokwasowe wykryte na podstawie analizy sekwencjonowania N-końcowego prążka przedstawiono na Fig. 3A). Analiza sekwencji pokazała dwie sekwencje N-końcowe (Sekwencję 1 nazwano SEKW. o NR ID:1, a Sekwencję 2 nazwano SEKW. o NR ID:2, odpowiednio). Figura 3C przedstawia sekwencję aminokwasową ludzkiej IL-17 (pokazana na Fig. 3C i Fig. 8, nazwana SEKW. o NR ID:3) i sekwencję aminokwasową ludzkiej IL-17F (pokazana na Fig. 3C i Fig. 10, nazwana SEKW. o NR ID:4). Podkreślono sekwencje sygnalne IL-17 i IL-17F. Dla przedstawionych sekwencji polipeptydowych IL-17 i IL-17F poprzez pogrubienie podkreślono sekwencje mające identyczność z dwiema N-końcowymi sekwencjami peptydowymi (SEKW. o NR ID:1 i SEKW. o NR ID:2), obecnymi w IL-17A/F. Figura 4 przedstawia analizę spektrometrii mas IL-17A/F. Figura 4A jest schematem, przedstawiającym sekwencję aminokwasową z jej wiązaniami disiarczkowymi międzyłańcuchowymi i wewnątrzłańcuchowymi z dojrzałego heterodimeru IL-17A/F (SEKW. o NR ID:77). Cysteiny zaangażowane w połączenia disiarczkowe pokazano za pomocą punktora ( ) i numeru reszty. Wiązania disiarczkowe wskazano poprzez czarne linie łączące związane cysteiny. Te z wiązań disiarczkowych, które tworzą międzyłańcuchowe połączenia disiarczkowe, podkreślono za pomocą czarnych, pogrubionych linii. Figura 4B przedstawia schemat fragmentów #1 i #2 peptydu IL- 17A/F, zawierających wiązania disiarczkowe między łańcuchem IL-17, a łańcuchem IL-17F, które wytypowano by jako tworzone poprzez trawienie IL-17A/F trypsyną

20 19 [fragment #1 wiązania disiarczkowego IL-17A/F nazwano SEKW. o NR ID:7; fragment #2 wiązania disiarczkowego IL-17A/F nazwano SEKW. o NR ID:8, odpowiednio]. Aminokwasy zawarte w obrębie tych fragmentów wskazano i ponumerowano względem początkowej metioniny z każdego łańcucha. Wskazano również obliczoną, przybliżoną masę cząsteczkową tych fragmentów, którą oczekiwano by zaobserwować w spektrometrii mas. Figura 4C przedstawia mapę peptydową IL-17A/F ze spektrometrii mas z użyciem desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej matrycą z analizatorem czasu przelotu (MALDI-TOF, ang. matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry). Powstała mapa peptydowa zawiera piki z [M+H]+ = 2420,12 Da i Da, w zgodzie z peptydami połączonymi disiarczkowo. Figura 4D przedstawia dalszą charakterystykę niezredukowanych próbek IL-17A/F za pomocą połączenia spektrometrii mas z jonizacją przez elektrorozpylanie oraz chromatografii cieczowej (LC-ESI-MS, ang. liquid-chromatography electrospray ionization ion trap mass spectrometry). Chromatogramy jonowe przedstawiają (od góry do dołu) całkowity chromatogram jonowy, zrekonstruowany chromatogram jonowy (RIC, ang. reconstructed ion chromatogram) fragmentu #2 wiązania disiarczkowego IL-17A/F [M+2H]2+ i fragmentu #1 wiązania disiarczkowego IL-17A/F [M+2H]3+. Zaobserwowano piki w zgodzie z oboma heterodimerami, podczas gdy nie zaobserwowano pików powyżej szumu tła chemicznego przy oczekiwanych masach dla peptydów homodimerycznych. Figura 5A przedstawia krzywe odpowiedzi na dawkę, porównujące odpowiedź prozapalną, indukowaną przez IL-17A/F, IL-17 i IL-17F. IL-17A/F, IL-17 i IL-17F inkubowano z komórkami TK-10 we wskazanych stężeniach przez 24 godziny. Pokazano, że IL-17A/F ma silne działanie indukujące IL-8, z zasadniczą aktywnością obserwowaną przy sub-nm stężeniach. Figura 5B przedstawia krzywe odpowiedzi na dawkę, porównujące indukcję IL-6 przez IL-17A/F, IL-17 i IL-17F. IL-17A/F, IL-17 i IL-17F inkubowano z komórkami TK-10 we wskazanych stężeniach przez 24 godziny. Zbierano pożywkę kondycjonowaną przez TK-10 i analizowano za pomocą IL-6 ELISA. Figura 6 przedstawia sekwencję aminokwasową regionu z regionu zmiennego łańcucha ciężkiego, zawierającego CDR H1-H3 z Fab, który wiąże IL-17A/F. Przedstawiono przyrównanie regionu z przewidywanej sekwencji aminokwasowej z trzydziestu czterech (34) klonów (od SEKW. o NR ID:9 do SEKW. o NR ID:42, odpowiednio), która koduje sekwencje łańcuchów ciężkich odrębnych przeciwciał, które zdolne są do wiązania IL-17A/F. Zacieniowano trzy regiony łańcucha ciężkiego CDR (CDR-H I, CDR-H2, CDR-H3). Figura 7 przedstawia sekwencję nukleotydową (SEKW. o NR ID:5) z cdna naturalnej sekwencji IL-17. Figura 8 przedstawia sekwencję aminokwasową (SEKW. o NR ID:3) wyprowadzoną z sekwencji kodującej SEKW. o NR ID:5, pokazanej na Fig. 7.

21 20 Figura 9 przedstawia sekwencję nukleotydową (SEKW. o NR ID:6) z cdna naturalnej sekwencji IL-17F. Figura 10 przedstawia sekwencję aminokwasową (SEKW. o NR ID:4) wyprowadzoną z sekwencji kodującej SEKW. o NR ID:6, pokazanej na Fig. 9. Figura 11 przedstawia pomiary IL-17A/F ELISA dla IL-17A/F otrzymanego z ludzkich komórek T aktywowanych anty-cd3/anty-cd28. Figura 12 przedstawia specyficznie IL-17A/F ELISA, w której pokazano, że trzy frakcje #31-#33, badane równocześnie, zawierają prawie równe ilości IL-17A/F (jako kontrole zastosowano IL-17A i IL-17F). SZCZEGÓŁOWY OPIS KORZYSTNYCH PRZYKŁADÓW WYKONANIA [0068] Polipeptyd IL-17A/F o sekwencji naturalnej" obejmuje polipeptyd mający taką samą sekwencję aminokwasową jak odpowiedni polipeptyd IL-17A/F o pochodzeniu naturalnym. Takie polipeptydy IL-17A/F o naturalnej sekwencji można izolować z natury lub wytwarzać za pomocą środków rekombinowanych lub syntetycznych. Wyrażenie polipeptyd IL-17A/F o sekwencji naturalnej obejmuje swoiście naturalnie występujące, skrócone lub wydzielone postacie specyficznego polipeptydu IL-17A/F (np. sekwencję domeny zewnątrzkomórkowej), naturalnie występujące postacie wariantów (np. postacie poddane alternatywnemu splicingowi) i naturalnie występujące alleliczne warianty polipeptydu. W różnych przykładach wykonania wynalazku, ujawnione polipeptydy IL-17A/F o sekwencji naturalnej są polipeptydami dojrzałymi lub o pełnej długości sekwencji naturalnej, zawierającymi pełnej długości sekwencje aminokwasowe przedstawione na załączonych figurach. Na figurach, kodony start i stop przedstawiono pogrubioną czcionką i podkreślono. Jednak, podczas gdy polipeptydy IL-17A/F ujawnione na załączonych figurach przedstawiono jako rozpoczynające się od reszt metioniny, nazwanej na figurach 1. pozycją aminokwasową, możliwe i prawdopodobne jest również, że inne reszty metioniny, umiejscowione na figurach przed lub za pozycją aminokwasową 1, mogą być zastosowane jako początkowa reszta aminokwasowa dla polipeptydów IL-17A/F. [0069] Przybliżone umiejscowienie "peptydów sygnalnych" różnych ujawnionych polipeptydów IL-17 7A/F przedstawiono w opisie i/lub na załączonych figurach. Zauważono jednak, że C-końcowa granica peptydu sygnalnego może się różnić, ale najprawdopodobniej nie więcej niż o około 5 aminokwasów z każdej strony granicy C-końcowej peptydu sygnalnego, jaką początkowo zidentyfikowano, przy czym C-końcową granicę peptydu sygnalnego można identyfikować zgodnie z kryteriami stosowanymi rutynowo w stanie techniki do identyfikowania tego typu elementu sekwencji aminokwasowej (np. Nielsen et al., Prot. Eng., 10:1-6 (1997) i von Heinje et al., Nucl. Acids. Res., 14: (1986)). Ponadto, zauważono również, że w niektórych przypadkach, odcięcie sekwencji sygnalnej od wydzielanego polipeptydu nie jest całkowicie identyczne, co skutkuje więcej niż jednym wydzielanym rodzajem [polipeptydu]. W wynalazku bierze się pod uwagę te dojrzałe polipeptydy, w których peptyd sygnalny odcinany jest w obrębie nie więcej niż około 5

22 21 aminokwasów na każdej ze stron granicy C-końcowej peptydu sygnalnego, jak zidentyfikowano, oraz kodujące je polinukleotydy. [0070] "Wariant polipeptydowy IL-17A/F" oznacza aktywny polipeptyd IL-17A/F, jak zdefiniowano powyżej lub poniżej, mający co najmniej około 80% identyczności sekwencji aminokwasowej z sekwencją pełnej długości, naturalną z sekwencji polipeptydu IL-17A/F, jak ujawniono, sekwencją polipeptydu IL-17A/F z brakującym peptydem sygnalnym, jak ujawniono lub jakimkolwiek innym fragmentem z pełnej długości sekwencji polipeptydu IL- 17A/F, jak ujawniono. Takie warianty polipeptydu IL-17A/F obejmują, przykładowo, polipeptydy IL-17A/F, w których jedną lub większą ilość reszt aminokwasowych dodano lub usunięto na - lub C-końcu pełnej długości, naturalnej sekwencji aminokwasowej. Zazwyczaj, wariant polipeptydu IL-17A/F będzie miał co najmniej około 80% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 81% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 82% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 83% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 84% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 85% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 86% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 87% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 88% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 89% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 90% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 91% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 92% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 93% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 94% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 95% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 96% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 97% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 98% identyczności sekwencji aminokwasowej, alternatywnie co najmniej około 99% identyczności sekwencji aminokwasowej i alternatywnie co najmniej około 99% identyczności sekwencji aminokwasowej z pełnej długości, naturalną sekwencją z sekwencji polipeptydu IL-17A/F jak ujawniono, sekwencją polipeptydu IL-17A/F z brakującym peptydem sygnalnym, jak ujawniono lub jakimkolwiek innym, specyficznie zdefiniowanym fragmentem z pełnej długości sekwencji polipeptydu IL-17A/F, jak ujawniono. Zazwyczaj, polipeptydy wariantowe IL-17A/F mają co najmniej około 10 aminokwasów długości, alternatywnie co najmniej około 20 aminokwasów długości, alternatywnie co najmniej około 30 aminokwasów długości, alternatywnie co najmniej około 40 aminokwasów długości, alternatywnie co najmniej około 50 aminokwasów długości, alternatywnie co najmniej około 60 aminokwasów długości, alternatywnie co najmniej około 70 aminokwasów długości, alternatywnie co najmniej około 80 aminokwasów długości, alternatywnie co najmniej około 90 aminokwasów długości, alternatywnie co najmniej około 100 aminokwasów długości, alternatywnie co

23 22 najmniej około 150 aminokwasów długości, alternatywnie co najmniej około 200 aminokwasów długości, alternatywnie co najmniej około 300 aminokwasów długości lub więcej. [0071] "Procent (%) identyczności sekwencji aminokwasowej", w odniesieniu do zidentyfikowanych tu sekwencji polipeptydu IL-17A/F definiuje się jako procent reszt aminokwasowych w sekwencji kandydata, które są identyczne z resztami aminokwasowymi w specyficznej sekwencji polipeptydu IL-17A/F, po przyrównaniu sekwencji i wprowadzeniu przerw, jeśli konieczne, dla uzyskania maksymalnego procentu identyczności sekwencji i nie biorąc pod uwagę jakichkolwiek podstawień konserwatywnych jako części identyczności sekwencji Porównanie dla celów określenia procentowej identyczności sekwencji aminokwasowej można uzyskać różnymi sposobami znanymi w stanie techniki, przykładowo, przy wykorzystaniu publicznie dostępnego oprogramowania komputerowego, takiego jak BLAST, BLAST-2, ALIGN lub oprogramowania Megalign (DNASTAR). Znawcy stanu techniki mogą określić odpowiednie parametry do mierzenia przyrównania, włączając wszelkie algorytmy wymagane do uzyskania maksymalnego przyrównania na całej długości porównywanych sekwencji. Jednak do własnych celów, wartości % identyczności sekwencji aminokwasowej generowane są z zastosowaniem programu komputerowego do porównywania sekwencji ALIGN-2, przy czym pełny kod źródłowy dla programu ALIGN-2 podano w Tabeli 1, poniżej. Program komputerowy do porównywania sekwencji ALIGN-2 napisany został w Genentech, Inc., a kod źródłowy przedstawiony w Tabeli I, poniżej, złożono wraz z dokumentacją użytkownika w Copyright Office, USA, Waszyngton DC, i wpisano do rejestru USA Copyright Registration pod nr TXU Program ALIGN-2 jest udostępniony publicznie przez Genentech, Inc., South San Francisco, Kalifornia lub może zostać skompilowany na podstawie kodu źródłowego podanego w Tabeli 1, poniżej. Program ALIGN-2 powinien być skompilowany do zastosowania z systemem operacyjnym UNIX, korzystnie Digital UNIX V4.0D. Wszystkie parametry przyrównywania sekwencji są określone przez program ALIGN-2 program i nie ulegają zmianie. [0072] W sytuacjach, w których ALIGN-2 stosuje się do porównywanie sekwencji aminokwasowej, % identyczności sekwencji aminokwasowej danej sekwencji aminokwasowej A do, z lub względem danej sekwencji aminokwasowej B (co można inaczej wyrazić, że dana sekwencja aminokwasowa A, która ma lub zawiera pewien % identyczności sekwencji aminokwasowej do, z lub względem danej sekwencji aminokwasowej B) oblicza się następująco: 100 razy ułamek X/Y przy czym X oznacza liczbę reszt aminokwasowych ocenionych jako identyczne dopasowania poprzez program do przyrównywania sekwencji ALIGN-2 w przyrównaniu A i B programu oraz gdzie Y oznacza łączną ilość reszt aminokwasowych w B. Zostanie docenione, że gdy długość sekwencji aminokwasowej A nie jest równa długości sekwencji aminokwasowej B, to % identyczności sekwencji aminokwasowej dla A względem B nie będzie równy % identyczności sekwencji aminokwasowej dla B względem A. Jako przykłady obliczeń % identyczności sekwencji aminokwasowej z zastosowaniem tego sposobu w Tabelach 2 i 3

24 23 przedstawiono, jak obliczać % identyczności sekwencji aminokwasowej z sekwencji aminokwasowej nazwanej "Białkiem Porównawczym" względem sekwencji aminokwasowej hipotetycznego polipeptydu, będącego przedmiotem zainteresowania, przy czym "Białko Porównawcze" reprezentuje sekwencję aminokwasową polipeptydu względem której porównuje się polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania, a każde z "X, "Y" i "Z" reprezentuje różne hipotetyczne reszty aminokwasowe. [0073] O ile wyraźnie nie zaznaczono inaczej, wszystkie zastosowane wartości % identyczności sekwencji aminokwasowej uzyskano jak opisano w powyższym paragrafie, stosując program komputerowy ALIGN-2. Wartości % identyczności sekwencji aminokwasowej można również uzyskać jak opisano poniżej, stosując program komputerowy WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: (1996)). Większość parametrów wyszukiwania z WU-BLAST-2 ustawiona jest na wartości domyślne. Te nie ustawione na wartości domyślne, tj. parametry zmienne, określa się z następującymi wartościami: zakres pokrywania się [ang. overlap span] = 1, ułamek pokrywania się [ang. overlap fraction] = 0,125, graniczna długość słowa [ang. word threshold] (T) = 11 i macierz punktująca [ang. scoring matrix] = BLOSUM62. Gdy zastosowany jest WU-BLAST-2, wartość % identyczności sekwencji aminokwasowej określa się dzieląc (a) liczbę dopasowanych, identycznych reszt aminokwasowych między sekwencją aminokwasową polipeptydu będącego przedmiotem zainteresowania, o sekwencji pochodzącej z polipeptydu naturalnego i porównywaną sekwencją aminokwasową, będącą przedmiotem zainteresowania (tj. sekwencją względem której porównuje się polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania, który może być polipeptydem wariantowym IL-17A/F), określoną za pomocą WU-BLAST-2 przez (b) łączną liczbę reszt aminokwasowych polipeptydu będącego przedmiotem zainteresowania. Przykładowo, w twierdzeniu "polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową A, która ma lub wykazuje co najmniej 80% identyczności sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową B", sekwencja aminokwasowa A jest porównawczą sekwencją aminokwasową z "Białka Porównawczego", będącego przedmiotem zainteresowania, a sekwencja aminokwasowa B jest sekwencją aminokwasową z polipeptydu będącego przedmiotem zainteresowania. [0074] Procent identyczności sekwencji aminokwasowej można również określać stosując program do porównywania sekwencji NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: (1997)). Program do porównywania sekwencji NCBI-BLAST2 można pobrać z lub uzyskać w inny sposób z Narodowego Instytutu Zdrowia (ang. National Institute of Health), Bethesda, MD. NCBI-BLAST2 wykorzystuje kilka parametrów wyszukiwania, przy czym wszystkie z tych parametrów wyszukiwania ustawia się na wartości domyślne, włączając przykładowo, ujawnienie [ang. unmask] = tak, nić [ang. strand] = wszystkie, oczekiwane zdarzenia [ang. expected occurrences] = 10, minimalna długość o niskiej złożoności [ang. minimum low complexity length] = 15/5, wartość e dla wielokrotnych skanów [ang. multi-pass e-value] = 0,01, wartość stała dla wielokrotnych skanów [ang. constant for multi-pass] = 25, zmniejszenie wartości dla końcowego przyrównania z przerwą [ang. dropoff for final gapped alignment] = 25 i macierz punktująca = BLOSUM62.

25 24 [0075] W sytuacjach, w których do porównywania sekwencji aminokwasowej stosuje się NCBI-BLAST2, % identyczności sekwencji aminokwasowej danej sekwencji aminokwasowej A do, z lub względem danej sekwencji aminokwasowej B (co można inaczej wyrazić, że dana sekwencja aminokwasowa A, która ma lub zawiera pewien % identyczności sekwencji aminokwasowej do, z lub względem danej sekwencji aminokwasowej B) oblicza się następująco: 100 razy ułamek X/Y przy czym X oznacza liczbę reszt aminokwasowych ocenionych jako identyczne dopasowania poprzez program do przyrównywania sekwencji NCBI-BLAST2 w przyrównaniu A i B programu oraz gdzie Y oznacza łączną ilość reszt aminokwasowych w B. Zostanie docenione, że gdy długość sekwencji aminokwasowej A nie jest równa długości sekwencji aminokwasowej B, to % identyczności sekwencji aminokwasowej dla A do B nie będzie równy % identyczności sekwencji aminokwasowej dla B do A. [0076] "Polinukleotyd wariantowy IL-17A/F" lub "wariantowa sekwencja kwasu nukleinowego IL-17A/F" oznacza cząsteczkę kwasu nukleinowego, która koduje aktywny polipeptyd IL-17A/F, jak zdefiniowano poniżej i która ma co najmniej około 80% identyczności sekwencji nukleotydowej z sekwencją nukleotydową kodującą pełnej długości, naturalną sekwencję z sekwencji polipeptydu IL-17A/F, jak ujawniono, pełnej długości, naturalną sekwencją z sekwencji polipeptydu IL-17A/F z brakującym peptydem sygnalnym, jak ujawniono lub jakimkolwiek innym fragmentem z pełnej długości sekwencji polipeptydu IL-17A/F, jak ujawniono. Zazwyczaj, polinukleotyd wariantowy IL-17A/F będzie miał co najmniej około 80% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 81% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 82% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 83% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 84% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 85% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 86% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 87% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 88% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 89% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 90% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 91% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 92% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 93% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 94% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 95% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 96% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 97% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 98% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, alternatywnie co najmniej około 99% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego i alternatywnie co najmniej około 99%

26 25 identyczności sekwencji kwasu nukleinowego z sekwencją kwasu nukleinowego kodującego pełnej długości, naturalną sekwencję z sekwencji polipeptydu IL-17A/F jak ujawniono, pełnej długości, naturalną sekwencję z sekwencji polipeptydu IL-17A/F z brakującym peptydem sygnalnym, jak ujawniono lub jakikolwiek inny fragment z pełnej długości sekwencji polipeptydu IL-17A/F, jak ujawniono. Warianty nie obejmują naturalnej sekwencji nukleotydowej. [0077] Zazwyczaj, polinukleotydy wariantowe IL-17A/F mają co najmniej około 30 nukleotydów długości, alternatywnie co najmniej około 60 nukleotydów długości, alternatywnie co najmniej około 90 nukleotydów długości, alternatywnie co najmniej około 120 nukleotydów długości, alternatywnie co najmniej około 150 nukleotydów długości, alternatywnie co najmniej około 180 nukleotydów długości, alternatywnie co najmniej około 210 nukleotydów długości, alternatywnie co najmniej około 240 nukleotydów długości, alternatywnie co najmniej około 270 nukleotydów długości, alternatywnie co najmniej około 300 nukleotydów długości, alternatywnie co najmniej około 450 nukleotydów długości, alternatywnie co najmniej około 600 nukleotydów długości, alternatywnie co najmniej około 900 nukleotydów długości lub więcej. [0078] "Procent (%) identyczności sekwencji kwasu nukleinowego" w odniesieniu do zidentyfikowanych sekwencji kwasu nukleinowego kodującego IL-17A/F, definiuje się jako procent nukleotydów w sekwencji kandydata, które są identyczne z nukleotydami w sekwencji kwasu nukleinowego IL-17A/F, będącej przedmiotem zainteresowania, po przyrównaniu sekwencji i wprowadzeniu przerw, jeśli wymagane, dla uzyskania maksymalnego procentu identyczności sekwencji. Porównanie dla celów określenia procentowej identyczności sekwencji kwasu nukleinowego można uzyskać różnymi sposobami znanymi w stanie techniki, przykładowo, przy wykorzystaniu publicznie dostępnego oprogramowania komputerowego, takiego jak BLAST, BLAST-2, ALIGN lub oprogramowania Megalign (DNASTAR). Jednak do własnych celów, wartości % identyczności sekwencji kwasu nukleinowego generowane są z zastosowaniem programu komputerowego do porównywania sekwencji ALIGN-2, przy czym pełny kod źródłowy dla programu ALIGN-2 podano w Tabeli I, poniżej. Program komputerowy do porównywania sekwencji ALIGN-2 napisany został w Genentech, Inc., a kod źródłowy przedstawiony w Tabeli I, poniżej, złożono wraz z dokumentacją użytkownika w Copyright Office, USA, Waszyngton DC, i wpisano do rejestru USA Copyright Registration pod nr TXU Program ALIGN-2 jest udostępniony publicznie przez Genentech, Inc., South San Francisco, Kalifornia lub może zostać skompilowany na podstawie kodu źródłowego podanego w Tabeli I, poniżej. Program ALIGN-2 powinien być skompilowany do zastosowania z systemem operacyjnym UNIX, korzystnie Digital UNIX V4.0D. Wszystkie parametry porównywania sekwencji są ustawione przez program ALIGN-2 i nie ulegają zmianie. [0079] W sytuacjach, w których ALIGN-2 stosuje się do porównywanie sekwencji kwasu nukleinowego, % identyczności sekwencji kwasu nukleinowego danej sekwencji kwasu nukleinowego C do, z lub względem danej sekwencji kwasu nukleinowego D (co można

27 26 inaczej wyrazić, że dana sekwencja kwasu nukleinowego C, która ma lub zawiera pewien % identyczności sekwencji kwasu nukleinowego do, z lub względem danej sekwencji kwasu nukleinowego D) oblicza się następująco: 100 razy ułamek W/Z przy czym W oznacza liczbę nukleotydów ocenionych jako identyczne dopasowania poprzez program do przyrównywania sekwencji ALIGN-2 w przyrównaniu C i D programu oraz gdzie Z oznacza łączną ilość nukleotydów w D. Zostanie docenione, że gdy długość sekwencji kwasu nukleinowego C nie jest równa długości sekwencji kwasu nukleinowego D, to % identyczności sekwencji kwasu nukleinowego dla C względem D nie będzie równy % identyczności sekwencji kwasu nukleinowego dla D względem C. Jako przykłady obliczeń % identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, w Tabelach 4 i 5 przedstawiono, jak obliczać % identyczności sekwencji kwasu nukleinowego sekwencji kwasu nukleinowego nazwanej "DNA Porównawczym" względem sekwencji kwasu nukleinowego nazwanej "IL-17A/F- DNA", przy czym "IL-17A/F-DNA" reprezentuje hipotetyczną sekwencję kwasu nukleinowego kodującego IL-17A/F, będącą przedmiotem zainteresowania, "DNA Porównawcze" reprezentuje sekwencję kwasu nukleinowego z cząsteczki kwasu nukleinowego względem której porównuje się cząsteczkę kwasu nukleinowego "IL-17A/F- DNA" będącą przedmiotem zainteresowania, a każde z "N", "L" i "V" reprezentuje różne hipotetyczne nukleotydy. [0080] O ile wyraźnie nie zaznaczono inaczej, wszystkie zastosowane wartości % identyczności sekwencji kwasu nukleinowego uzyskano jak opisano w powyższym paragrafie, stosując program komputerowy ALIGN-2. Wartości % identyczności sekwencji kwasu nukleinowego można również uzyskać jak opisano poniżej, stosując program komputerowy WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: (1996)). Większość parametrów wyszukiwania z WU-BLAST-2 ustawiona jest na wartości domyślne. Te nie ustawione na wartości domyślne, tj. parametry zmienne, określa się z następującymi wartościami: zakres pokrywania się [ang. overlap span] = 1, ułamek pokrywania się [ang. overlap fraction] = 0,125, graniczna długość słowa [ang. word threshold] (T) = 11 i macierz punktująca [ang. scoring matrix] = BLOSUM62. Gdy zastosowany jest WU-BLAST-2, wartość % identyczności sekwencji kwasu nukleinowego określa się dzieląc (a) liczbę dopasowanych, identycznych nukleotydów między sekwencją kwasu nukleinowego cząsteczki kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd IL-17A/F, będący przedmiotem zainteresowania, o sekwencji pochodzącej z kwasu nukleinowego kodującego naturalną sekwencję polipeptydu IL-17A/F i porównania cząsteczki kwasu nukleinowego, będącego przedmiotem zainteresowania (tj. sekwencji względem której porównuje się cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd IL-17A/F, będący przedmiotem zainteresowania, która może być wariantem polinukleotydu IL-17A/F), określoną za pomocą WU-BLAST-2 przez (b) łączną liczbę nukleotydów z cząsteczki kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd IL- 17A/F, będący przedmiotem zainteresowania. Przykładowo, w twierdzeniu "wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego zawierająca sekwencję kwasu nukleinowego A, która ma lub wykazuje co najmniej 80% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego z sekwencją kwasu

28 27 nukleinowego B", sekwencja kwasu nukleinowego A jest porównawczą cząsteczką kwasu nukleinowego, będącego przedmiotem zainteresowania, a sekwencja kwasu nukleinowego B jest sekwencją kwasu nukleinowego z cząsteczki kwasu nukleinowego kodującego polipeptydu IL-17A/F, będący przedmiotem zainteresowania. [0081] Procent identyczności sekwencji kwasu nukleinowego można również określać stosując program do porównywania sekwencji NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: (1997)). Program do porównywania sekwencji NCBI-BLAST2 można pobrać z lub uzyskać w inny sposób z Narodowego Instytutu Zdrowia (ang. National Institute of Health), Bethesda, MD. NCBI-BLAST2 wykorzystuje kilka parametrów wyszukiwania, przy czym wszystkie z tych parametrów wyszukiwania ustawia się na wartości domyślne, włączając przykładowo, ujawnienie [ang. unmask] = tak, nić [ang. strand] = wszystkie, oczekiwane zdarzenia [ang. expected occurrences] = 10, minimalna długość o niskiej złożoności [ang. minimum low complexity length] = 15/5, wartość e dla wielokrotnych skanów [ang. multi-pass e-value] = 0,01, wartość stała dla wielokrotnych skanów [ang. constant for multi-pass] = 25, zmniejszenie wartości dla końcowego przyrównania z przerwą [ang. dropoff for final gapped alignment] = 25 i macierz punktująca = BLOSUM62. [0082] W sytuacjach, w których do porównywania sekwencji stosuje się NCBI-BLAST2, % identyczności sekwencji kwasu nukleinowego danej sekwencji kwasu nukleinowego C do, z lub względem danej sekwencji kwasu nukleinowego D (co można inaczej wyrazić, że dana sekwencja kwasu nukleinowego C, która ma lub zawiera pewien % identyczności sekwencji kwasu nukleinowego do, z lub względem danej sekwencji kwasu nukleinowego D) oblicza się następująco: 100 razy ułamek W/Z przy czym W oznacza liczbę nukleotydów ocenionych jako identyczne dopasowania poprzez program do przyrównywania sekwencji NCBI-BLAST2 w przyrównaniu C i D programu oraz gdzie Z oznacza łączną liczbę nukleotydów w D. Zostanie docenione, że gdy długość sekwencji kwasu nukleinowego C nie jest równa długości sekwencji kwasu nukleinowego D, to % identyczności sekwencji kwasu nukleinowego dla C względem D nie będzie równy % identyczności sekwencji kwasu nukleinowego dla D względem C. [0083] W innych przykładach wykonania, polinukleotydy wariantowe IL-17A/F są cząsteczkami kwasu nukleinowego, które kodują aktywny polipeptyd IL-17A/F i które są zdolne do hybrydyzowania, korzystnie w surowych warunkach hybrydyzacji i odmywania, do sekwencji nukleotydowych kodujących pełnej długości polipeptyd IL-17A/F, jak ujawniono. Polipeptydy wariantowe IL-17A/F mogą być tymi, które kodowane są przez polinukleotydy wariantowe IL-17A/F. [0084] "Wyizolowany," przy stosowaniu do opisywania różnych ujawnionych polipeptydów oznacza polipeptyd, który został zidentyfikowany i oddzielony i/lub odzyskany ze składnika swojego naturalnego środowiska. Składnikami zanieczyszczającymi z jego naturalnego środowiska są materiały, które zakłócałyby zazwyczaj zastosowania diagnostyczne lub

29 28 terapeutyczne polipeptydu i mogą obejmować enzymy, hormony i inne soluty białkowe lub niebiałkowe. W korzystnych przykładach wykonania, polipeptyd będzie oczyszczany (1) do stopnia wystarczającego dla uzyskania co najmniej 15 reszt sekwencji aminokwasowej końca N lub wewnętrznej, z zastosowaniem sekwenatora z naczyniem wirującym lub (2) do homogeniczności ocenianej za pomocą SDS-PAGE w warunkach nieredukujących lub redukujących, z zastosowaniem barwienia Coomassie Blue lub, korzystnie, srebrem. Wyizolowany polipeptyd obejmuje polipeptyd in situ w obrębie komórek rekombinowanych, ponieważ co najmniej jeden składnik naturalnego środowiska polipeptydu IL-17A/F nie będzie obecny. Jednakże, zwykle wyizolowany polipeptyd otrzymuje się za pomocą co najmniej jednego etapu oczyszczania. [0085] Wyizolowany" kwas nukleinowy kodujący polipeptyd IL-17A/F lub inny kwas nukleinowy kodujący polipeptyd oznacza cząsteczkę kwasu nukleinowego, zidentyfikowaną i oddzieloną od co najmniej jednej zanieczyszczającej cząsteczki kwasu nukleinowego, z którą zazwyczaj jest ona związana w naturalnym źródle kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd jest inna niż w postaci lub układzie, w których występuje w naturze. Z tego względu wyizolowane cząsteczki kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd odróżniają się od specyficznej cząsteczki kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd, jaka występuje w naturalnych komórkach. Jednakże, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd obejmuje cząsteczki kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd, zawarte w komórkach, które zazwyczaj wykazują ekspresję polipeptydu, przy czym, przykładowo, cząsteczka kwasu nukleinowego jest w innym położeniu na chromosomie niż to z naturalnych komórek. [0086] Wyrażenie sekwencje kontrolne dotyczy sekwencji DNA niezbędnych do ekspresji operacyjnie połączonej sekwencji kodującej w szczególnym organizmie gospodarza. Sekwencje kontrolne, które są odpowiednie dla prokariotów, przykładowo, zawierają promotor, opcjonalnie sekwencję operatorową i miejsce wiązania rybosomów. Wiadomo, że komórki eukariotyczne wykorzystują promotory, sygnały poliadenylacji i wzmacniacze. [0087] Kwas nukleinowy jest związany operacyjnie, gdy umieszczony jest w funkcjonalnej zależności z inną sekwencją kwasu nukleinowego. Przykładowo, DNA dla pre-sekwencji lub [sekwencji] liderowej wydzielania jest operacyjnie związane z DNA dla polipeptydu, jeśli ulega ekspresji jako pre-białko, które uczestniczy w wydzielaniu polipeptydu; promotor lub wzmacniacz jest operacyjnie związany z sekwencją kodującą, jeśli wpływa na transkrypcję sekwencji; lub miejsce wiązania rybosomu jest operacyjnie związane z sekwencją kodującą, jeśli jest umieszczone w taki sposób aby ułatwiać translację. Ogólnie, operacyjnie związany oznacza, że powiązane sekwencje DNA przylegają do siebie, a w przypadku [sekwencji] liderowej wydzielania, są ciągłe pod względem fazy odczytu. Jednakże, wzmacniacze nie muszą być przyległe. Powiązanie uzyskuje się przez łączenie w dogodnych miejscach restrykcyjnych. Jeśli takie miejsca nie istnieją, stosuje się syntetyczne oligonukleotydowe adaptery lub łączniki, zgodnie z typową praktyką. [0088] Znawca może łatwo określić "siłę" reakcji hybrydyzacji, a jest ona ogólnie empirycznym wyliczeniem zależnym od długości sondy, temperatury odmywania i stężenia

30 29 soli. Ogólnie, dłuższe sondy wymagają wyższych temperatur do prawidłowej hybrydyzacji, podczas gdy krótszym sondom potrzeba niższych temperatur, Ogólnie, hybrydyzacja zależy od zdolności zdenaturowanego DNA do ponownej hybrydyzacji poniżej swojej temperatury topnienia, gdy w środowisku dostępne są nici komplementarne. Im wyższy stopień pożądanej homologii między sondą a hybrydyzowaną sekwencją, tym wyższa względna temperatura, którą można zastosować. W rezultacie wynika, że wyższe względne temperatury miały by tendencję do czynienia warunków reakcji surowszymi, podczas gdy niższe temperatury łagodziłyby je. W celu zapoznania się z dodatkowymi szczegółami i wyjaśnienia surowości [warunków] reakcji hybrydyzacji, patrz Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995). [0089] "Surowe warunki" lub "bardzo surowe warunki", jak zdefiniowano, można zazwyczaj identyfikować przez tych, którzy: (1) stosują niską siłę jonową i wysoką temperaturę odmywania, przykładowo 0,015 M chlorek sodu/0,0015 M cytrynian sodu/0,1% siarczan dodecylu sodu w 50 C; (2) stosują środek denaturujący podczas hybrydyzacji, taki jak formamid, przykładowo, 50% (obj./obj.) formamid z 0,1% albuminą surowicy bydlęcej/0,1% Ficoll/0,1% poliwinylopirolidon/50mm bufor fosforanu sodu w ph 6,5 z 750 mm chlorku sodu, 75 mm cytrynianu sodu w 42 C; lub (3) stosują 50% formamid, 5 x SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M cytrynianu sodu), 50 mm fosforan sodu (ph 6,8), 0,1% pirofosforan sodu, 5 x roztwór Denhardta, sonikowane DNA spermy łososia (50 µg/ml), 0,1% SDS i 10% siarczan dekstranu w 42 C, z odmywaniami w 42 C w 0,2 x SSC (chlorek sodu/cytrynian sodu) i 50% formamidem w 55 C, po których następuje odmywanie o dużej surowości, składające się z 0,1 x SSC zawierającego EDTA w 55 C. [0090] "Warunki umiarkowanie surowe" można identyfikować jak opisano przez Sambrook et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989i obejmują stosowanie roztworu do odmywania i warunków hybrydyzacji (np. temperatury, siły jonowej i %SDS) mniej surowych niż te opisane powyżej. Przykładem umiarkowanie surowych warunków jest całonocna inkubacja w 37 C w roztworze zawierającym: 20% formamid, 5 x SSC (150 mm NaCl, 15 mm cytrynian trójsodowy), 50 mm fosforan sodu (ph 7,6), 5 x roztwór Denhardta, 10% siarczan dekstranu i 20 mg/ml zdenaturowanego, pofragmentowanego DNA ze spermy łososia, po czym następuje przemywanie filtrów w 1 x SSC w około C. Znawca rozpozna, jak dostosować temperaturę, siłę jonową itd. jakie są niezbędne do pogodzenia czynników, takich jak długość sondy i tym podobne. [0091] Wyrażenie "wyznakowany epitopowo" dotyczy polipeptydu chimerycznego, zawierającego polipeptyd IL-17A/F w fuzji z "polipeptydem znacznikowym". Polipeptyd znacznikowy na wystarczająco dużo reszt dla zapewnienia epitopu względem którego można wytworzyć przeciwciało, ale jest wystarczająco krótki aby nie zakłócać aktywności polipeptydu, do którego został dołączony. Polipeptyd znacznikowy korzystnie jest również dość unikalny, tak że przeciwciało zasadniczo nie reaguje krzyżowo z innymi epitopami. Odpowiednie polipeptydy znacznikowe mają ogólnie co najmniej sześć reszt aminokwasowych, a zazwyczaj między około 8 a 50 reszt aminokwasowych (korzystnie, między około 10 a 20 reszt aminokwasowych).

31 30 [0092] Wyrażenie "immunoadhezyna" oznacza cząsteczki podobne do przeciwciał, które łączą swoistość wiązania białka heterologicznego ("adhezyny") z funkcjami efektorowymi ze stałych domen immunoglobulinowych. Strukturalnie, immunoadhezyny stanowią fuzję sekwencji aminokwasowej o pożądanej swoistości wiązania, która jest inna niż miejsce rozpoznawania i wiązania antygenu z przeciwciała (tj. jest "heterologiczne") oraz sekwencji stałej domeny immunoglobulinowej. Część adhezynowa cząsteczki immunoadhezyny jest zazwyczaj ciągłą sekwencją aminokwasową, zawierającą co najmniej miejsce wiązania receptora lub liganda. Sekwencję stałą domeny immunoglobulinowej w immunoadhezynie można uzyskać z jakiejkolwiek immunoglobuliny, takie jak podtypy IgG-1, IgG-2, IgG-3 lub IgG-4, IgA (włączając IgA-1 i IgA-2), IgE, IgD lub IgM. [0093] Wyrażenie "antagonista" stosuje się w najszerszym znaczeniu i obejmuje ono jakąkolwiek cząsteczkę, która częściowo lub w całości blokuje, hamuje lub neutralizuje aktywność biologiczną ujawnionego, naturalnego polipeptydu IL-17A/F. W podobny sposób, wyrażenie "agonista" stosuje się w najszerszym znaczeniu i obejmuje ono jakąkolwiek cząsteczkę, która naśladuje biologiczną aktywność ujawnionego, naturalnego polipeptydu IL- 17A/F. Cząsteczki odpowiedniego agonisty lub antagonisty specyficznie obejmują agonistyczne lub antagonistyczne przeciwciała lub fragmenty przeciwciał, fragmenty lub warianty sekwencji aminokwasowej naturalnych polipeptydów IL-17A/F, peptydy, antysensowne oligonukleotydy, małe cząsteczki organiczne, itd. Sposoby identyfikacji agonistów lub antagonistów polipeptydu IL-17A/F mogą obejmować kontaktowanie polipeptydu IL-17A/F z cząsteczką-kandydatem na agonistę lub antagonistę i pomiar wykrywalnej zmiany w jednej lub większej ilości aktywności biologicznych, związanych normalnie z polipeptydem IL-17A/F. [0094] "Leczenie" dotyczy zarówno leczenia terapeutycznego, jak i profilaktycznego lub środków zapobiegawczych, przy czym celem jest zapobiegnięcie lub spowolnienie (zmniejszenie) docelowego, patologicznego stanu chorobowego lub zaburzenia. Wymagający leczenia obejmują tych już cierpiących na zaburzenie jak również tych mających skłonność do zaburzenia lub tych, u których należy zapobiegać zaburzeniu. [0095] Podawanie "przewlekłe" dotyczy podawania środka (środków) w trybie ciągłym, w przeciwieństwie do trybu ostrego, dla utrzymania początkowego efektu terapeutycznego (działania) przez wydłużony odcinek czasu. Podawanie "przerywane" oznacza leczenie, które nie jest przeprowadzane w sposób ciągły, bez przerywania, ale raczej ma charakter cykliczny. [0096] Ssak dla celów leczenia dotyczy dowolnego zwierzęcia zaklasyfikowanego jako ssak, włączając ludzi, zwierzęta gospodarcze i hodowlane oraz zwierzęta w ogrodach zoologicznych, sportowe lub domowe, takie jak psy, koty, bydło, konie, owce, świnie, kozy, króliki itp. Korzystnie, ssakiem jest człowiek. [0097] Podawanie w połączeniu z jednym lub większą ilością dodatkowych środków leczniczych obejmuje jednoczesne (równoczesne) i kolejne podawanie w dowolnej kolejności.

32 31 [0098] "Nośniki" obejmują farmaceutycznie dopuszczalne nośniki, rozczynniki lub stabilizatory, które nie są toksyczne dla eksponowanych na nie komórki lub ssaka w zastosowanych dawkach i stężeniach. Często, fizjologicznie dopuszczalnym nośnikiem jest wodny roztwór o buforowanym ph. Przykłady fizjologicznie dopuszczalnych nośników obejmują bufory, takie jak fosforanowy, cytrynianowy i innych kwasów organicznych; przeciwutleniacze, włączając kwas askorbinowy; polipeptydy o niskiej masie cząsteczkowej (mniej niż około 10 reszt); białka, takie jak albumina surowicy, żelatyna lub immunoglobuliny; polimery hydrofilowe, takie jak poliwinylopirolidon; aminokwasy, takie jak glicyna, glutamina, asparagina, arginina lub lizyna; monosacharydy, disacharydy i inne węglowodany, włączając glukozę, mannozę kub dekstryny; środki chelatujące, takie jak EDTA; alkohole cukrowe, takie jak mannitol lub sorbitol; przeciwjony tworzące sole, takie jak sodu; i/lub surfaktanty niejonowe, takie jak TWEEN, glikol polietylenowy (PEG) i PLURONICS. [0099] Wyrażenie "przeciwciało" stosuje się w najszerszym sensie i specyficznie obejmuje ono, przykładowo, pojedyncze przeciwciała monoklonalne anty-il-17a/f (włączając przeciwciała agonistyczne, antagonistyczne i neutralizujące), kompozycje przeciwciał anty- IL-17A/F o swoistości poliepitopowej, przeciwciała poliklonalne, przeciwciała jednołańcuchowe anty-il-17a/f oraz fragmenty przeciwciał anty-il-17a/f (patrz poniżej), o ile wykazują one pożądaną aktywność biologiczną lub immunologiczną. Wyrażenie "immunoglobulina" (Ig) stosuje się zamiennie z przeciwciałem. [0100] Przeciwciało wyizolowane oznacza to, które zidentyfikowano i oddzielono i/lub odzyskano ze składnika jego naturalnego środowiska. Składnikami zanieczyszczającymi z jego naturalnego środowiska są materiały, które przeszkadzałyby w zastosowaniach diagnostycznych lub terapeutycznych przeciwciała i mogą obejmować enzymy, hormony i inne soluty białkowe lub niebiałkowe. W korzystnych przykładach wykonania, przeciwciało będzie oczyszczane (1) do ponad 95% wagowych przeciwciała, określonych sposobem Lowry'ego, a najkorzystniej ponad 99% wagowych, (2) do stopnia wystarczającego dla uzyskania co najmniej 15 reszt sekwencji aminokwasowej końca N lub wewnętrznej, z zastosowaniem sekwenatora z naczyniem wirującym lub (3) do homogeniczności ocenianej za pomocą SDS-PAGE w warunkach redukujących lub nieredukujących, z zastosowaniem barwienia Coomassie Blue lub, korzystnie, srebrem. Wyizolowane przeciwciało obejmuje przeciwciało in situ w obrębie komórek rekombinowanych, ponieważ co najmniej jeden składnik naturalnego środowiska przeciwciała nie będzie obecny. Zwykle jednak wyizolowane przeciwciało będzie otrzymywane za pomocą co najmniej jednego etapu oczyszczania. [0101] Podstawowa 4-łańcuchowa jednostka przeciwciała jest heterotetrameryczną glikoproteiną złożoną z dwóch identycznych łańcuchów lekkich (L) i dwóch identycznych łańcuchów ciężkich (H) (przeciwciało IgM składa się z 5 jednostek podstawowego heterotetrameru razem z dodatkowym polipeptydem, nazywanym łańcuchem J, a zatem zawiera 10 miejsc wiążących antygen, podczas gdy wydzielane przeciwciała IgA mogą polimeryzować dla tworzenia poliwartościowych zbiorów zawierających 2-5 z podstawowych

33 32 4-łańcuchowych jednostek razem z łańcuchem J). W przypadku IgG, jednostka 4-łańcuchowa ma ogólnie około daltonów. Każdy łańcuch L jest przyłączony do łańcucha H przez jedno kowalencyjne wiązanie disiarczkowe, podczas gdy dwa łańcuchy H połączone są ze sobą przez inne, jedno lub większą ilość wiązań disiarczkowych, w zależności od izotypu łańcucha H. Każdy łańcuch H i L ma również równomiernie rozmieszczone mostki disiarczkowe wewnątrz łańcucha. Każdy łańcuch H ma na końcu N domenę zmienną (V H ), po której następują trzy domeny stałe (C H ) dla każdego z łańcuchów α i γ i cztery domeny C H dla izotopów µ i ε. Każdy łańcuch L ma na końcu N domenę zmienną (V L ), po której następuje domena stała (C L ) na jego drugim końcu. V L jest zrównana z V H, a C L jest zrównana z pierwszą stałą domeną łańcucha ciężkiego (C H 1). Uważa się, że poszczególne reszty aminokwasowe tworzą powierzchnię między domenami zmiennymi łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego. Parowanie razem V H i V L tworzy pojedyncze miejsce wiązania antygenu. W celu zapoznania się ze strukturą i właściwościami różnych klas przeciwciał, patrz Basic and Clinical Immunology, wydanie 8., Daniel P. Stites, Abba I. Terr i Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, strona 71 i Rozdział 6. [0102] Łańcuch L z dowolnego gatunku kręgowca można przypisać do jednego z dwóch wyraźnie odrębnych typów, zwanych kappa i lambda, w oparciu o sekwencje aminokwasowe ich domen stałych. Zależnie od sekwencji aminokwasowej domeny stałej ich ciężkich łańcuchów (C H ), immunoglobuliny można przypisać do różnych klas lub izotypów. Istnieje pięć klas immunoglobulin: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM o łańcuchach ciężkich określanych, odpowiednio, α, δ, ε, γ i µ. Klasy γ i α podzielone są ponadto na podklasy, na podstawie stosunkowo niewielkich różnic w sekwencji i funkcji C H, np. u ludzi ekspresjonowane są następujące podklasy: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2. [0103] Wyrażenie "zmienne" dotyczy faktu, że niektóre segmenty domen zmiennych różnią się znacznie pod względem sekwencji wśród przeciwciał. Domena V pośredniczy w wiązaniu antygenu i definiuje swoistość szczególnego przeciwciała względem jego szczególnego antygenu. Zmienność nie jest jednak rozłożona równomiernie w domenach zmiennych o rozpiętości 110-aminokwasów. Zamiast tego, regiony V składają się ze stosunkowo niezmiennych odcinków nazywanych regionami zrębowymi (FR, ang. framework region) o aminokwasach, poprzedzielanymi krótszymi regionami o ekstremalnej zmienności, nazywanymi "regionami hiperzmiennymi", z których każdy ma długość 9-12 aminokwasów. Każda z domen zmiennych naturalnych łańcuchów ciężkich i lekkich obejmuje cztery FR, w dużej mierze przyjmujące strukturę kartki β, połączone trzema regionami hiperzmiennymi, które tworzą pętle łączące, a w niektórych przypadkach tworzące, część struktury kartki β. Regiony hiperzmienne w każdym łańcuchu utrzymywane są w pobliżu siebie za pomocą FR i wraz z regionami hiperzmiennymi innego łańcucha, przyczyniają się do tworzenia miejsca wiązania antygenu w przeciwciałach (patrz Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Wyd. 5-te, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Domeny stałe nie uczestniczą bezpośrednio w wiązaniu się przeciwciała do antygenu, lecz wykazują różne funkcje efektorowe, takie jak uczestnictwo przeciwciała w cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC).

34 33 [0104] Wyrażenie "region hiperzmienny" dotyczy reszt aminokwasowych przeciwciała, które odpowiadają za wiązanie antygenu. Region hiperzmienny zawiera ogólnie reszty aminokwasowe z "regionu determinującego dopasowanie" lub "CDR" (np. reszty około (L1), (L2) i (L3) w V L oraz około 1-35 (H1), (H2) i (H3) w V H; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Wyd. 5-te. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) i/lub reszty z "pętli hiperzmiennej" (np. reszty (L1), (L2) i (L3) w V L oraz (H1), (H2) i (H3) w V H ; Chothia i Lesk J. Mol. Biol. 196: (1987)). [0105] Wyrażenie przeciwciało monoklonalne dotyczy przeciwciała uzyskiwanego z zasadniczo homogennej populacji przeciwciał tj. poszczególne przeciwciała stanowiące populację są identyczne, z wyjątkiem możliwych naturalnie występujących mutacji, które mogą być obecne w niewielkich ilościach. Przeciwciała monoklonalne są wysoce specyficzne, przy czym są skierowane przeciw pojedynczemu miejscu antygenowemu. Ponadto, w przeciwieństwie do preparatów przeciwciał poliklonalnych, które obejmują różne przeciwciała skierowane przeciw różnym determinantom (epitopom), każde przeciwciało monoklonalne skierowane jest przeciw pojedynczej determinancie na antygenie. W dodatku do swojej swoistości, przeciwciała monoklonalne są korzystne, ponieważ można je syntetyzować niezanieczyszczone przez inne przeciwciała. Przydawki monoklonalne nie należy interpretować jako wymagającej wytwarzania przeciwciała za pomocą jakiegokolwiek konkretnego sposobu. Przykładowo, przeciwciała monoklonalne użyteczne według wynalazku można otrzymywać za pomocą metodologii hybrydomy, opisanej po raz pierwszy przez Kohler et al., Nature, 256:495 (1975) lub można je wytwarzać stosując sposoby z rekombinowanym DNA w komórkach bakteryjnych, eukariotycznych zwierzęcych lub roślinnych (patrz, np. patent USA nr 4,816,567). Przeciwciała monoklonalne można również izolować z fagowych bibliotek przeciwciał, stosując techniki opisane, przykładowo, w Clackson et al., Nature, 352: (1991) i Marks et al., J. Mol. Biol., 222: (1991). [0106] Przeciwciała monoklonalne obejmują przeciwciała chimeryczne, w których część łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego jest taka sama lub homologiczna z odpowiednimi sekwencjami w przeciwciałach pochodzących od określonych gatunków lub należących do określonej klasy lub podklasy przeciwciał, podczas gdy pozostała część łańcucha (łańcuchów) jest taka sama lub homologiczna z odpowiednimi sekwencjami w przeciwciałach pochodzących od innych gatunków lub należących do innej klasy lub podklasy przeciwciał, jak również fragmenty takich przeciwciał, dopóki wykazują one pożądaną biologiczną aktywność (patrz patent USA nr 4,816,567; i Morrison et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 81: (1984)). Przeciwciała chimeryczne, będące przedmiotem zainteresowania, obejmują przeciwciała "unaczelnione", zawierające sekwencje domeny zmiennej wiążącej antygen, pochodzącej od naczelnych innych niż ludzie (np. Małp Wąskonosych, Małp Człekokształtnych, itd.) i ludzkie sekwencje regionu stałego. [0107] "Przeciwciało nienaruszone" jest tym, które zawiera miejsce wiążące antygen, jak również C L i co najmniej stałe domeny łańcucha ciężkiego C H 1, C H 2 i C H 3. Domeny stałe

35 34 mogą być domenami stałymi o sekwencji naturalnej (np. ludzkie domeny stałe o sekwencji naturalnej) lub wariantami ich sekwencji aminokwasowych. Korzystnie, przeciwciało nienaruszone ma jedną lub więcej funkcji efektorowych. [0108] "Fragmenty przeciwciał" stanowią część nienaruszonego przeciwciała, korzystnie regionu wiążącego antygen lub zmiennego z nienaruszonego przeciwciała. Przykłady fragmentów przeciwciał obejmują fragmenty Fab, Fab', F(ab') 2' i Fv; diciała; przeciwciała liniowe (patrz patent USA nr 5,641,870, Przykład 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10): [1995]); cząsteczki przeciwciał jednołańcuchowych; i przeciwciała wielospecyficzne, tworzone z fragmentów przeciwciał. [0109] Trawienie przeciwciał papainą powoduje powstanie dwóch identycznych fragmentów wiążących antygen, nazywanych fragmentami "Fab" i pozostałego fragmentu "Fc", którego nazwa odzwierciedla jego zdolność do łatwej krystalizacji. Fragment Fab składa się z całego łańcucha L razem z domeną regionu zmiennego łańcucha H (V H ) i pierwszą stałą domeną jednego łańcucha ciężkiego (C H 1). Każdy fragment Fab jest jednowartościowy w odniesieniu do wiązania antygenu, tj. ma pojedyncze miejsce wiązania antygenu. Traktowanie pepsyną przeciwciała dostarcza pojedynczego, dużego fragmentu F(ab') 2, który w przybliżeniu odpowiada dwóm, połączonym wiązaniem disiarczkowym fragmentom Fab o dwuwartościowej aktywności wiązania antygenu i wciąż zdolny jest do krzyżowego wiązania antygenu. Fragmenty Fab różnią się od fragmentów Fab dodatkiem kilku reszt na końcu karboksylowym domeny C H 1, włączając jedną lub więcej cystein z regionu zawiasowego przeciwciała. Fab -SH jest określeniem dla Fab w którym reszta (reszty) cysteiny domen stałych posiadają wolną grupę tiolową. Fragmenty przeciwciała F(ab ) 2 początkowo wytwarzano jako pary fragmentów Fab, mające między sobą zawiasowe cysteiny. Znane są również inne, chemiczne sprzężenia fragmentów przeciwciał. [0110] Fragment Fc zawiera części z końców karboksylowych obu łańcuchów H, utrzymywanych razem przez dwusiarczki. Funkcje efektorowe przeciwciał zdeterminowane są przez sekwencje w regionie Fc, który to region jest również częścią rozpoznawaną przez receptory Fc (FcR), znajdowane na niektórych typach komórek. [0111] "Fv" oznacza minimalny fragment przeciwciała, który zawiera kompletne miejsce rozpoznawania antygenu i wiązania antygenu. Fragment ten składa się z dimeru jednej domeny regionu zmiennego łańcucha ciężkiego i jednej lekkiego w ścisłym, niekowalencyjnym związku. Ze zwinięcia tych dwóch domen powstaje sześć hiperzmiennych pętli (3 pętle, każda z łańcucha H i L), które dostarczają reszt aminokwasowych do wiązania antygenu i nadają przeciwciału specyficzność wiązania antygenu. Jednakże, nawet jedna domena zmienna (lub połowa Fv, zawierająca jedynie trzy CDR swoiste wobec antygenu) ma zdolność rozpoznawania i wiązania antygenu, chociaż z niższym powinowactwem niż całe miejsce wiążące. [0112] "Jednołańcuchowe Fv", skracane również do "sfv" lub "scfv" są fragmentami przeciwciał, które zawierają domeny V H i V L przeciwciała, połączone w pojedynczy łańcuch polipeptydowy. Korzystnie, polipeptyd sfv zawiera ponadto łącznik polipeptydowy między

36 35 domenami V H i V L, który pozwala sfv tworzyć strukturę pożądaną dla wiązania antygenu. W celu zapoznania się z pracami przeglądowymi, dotyczącymi scfv, patrz Pluckthun w The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, t. 113, red. Rosenburg i Moore, Springer-Verlag, New York, str (1994); Borrebaeck 1995, infra. [0113] Wyrażenie "diciała" dotyczy małych fragmentów przeciwciał, otrzymywanych przez konstruowanie fragmentów sfv (patrz poprzedni akapit) z krótkimi łączniami (około 5-10 reszt) między domenami V H i V L, tak że uzyskuje się parowanie domen V między łańcuchami, ale nie wewnątrzłańcuchowo, co skutkuje fragmentem dwuwartościowym, tj. fragmentem o dwóch miejscach wiązania antygenu. Diciała dwuwartościowe są heterodimerami dwóch "skrzyżowanych" fragmentów sfv, w których domeny V H i V L dwóch przeciwciał obecne są na różnych łańcuchach polipeptydowych. Diciała opisano bardziej szczegółowo w, przykładowo, EP 404,097; WO 93/11161; i Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: (1993). [0114] Humanizowane postacie przeciwciał innych niż ludzkie (np. gryzoni) są przeciwciałami chimerycznymi, zwierającymi minimalną sekwencję pochodzącą od przeciwciała innego niż ludzkie. W większości przypadków, przeciwciała humanizowane są ludzkimi immunoglobulinami (przeciwciało biorcy), w których reszty regionu hiperzmiennego biorcy zastąpiono resztami z regionu hiperzmiennego gatunków innych niż ludzie (przeciwciało dawcy), takich jak mysz, szczur, królik lub inny naczelny nie będący człowiekiem, mających pożądaną swoistość, powinowactwo i pojemność. W niektórych przypadkach, reszty regionów zrębowych (FR) ludzkiej immunoglobuliny zastąpiono odpowiednimi resztami innymi niż ludzkie. Ponadto, przeciwciała humanizowane mogą zawierać reszty, które nie występują w przeciwciele biorcy ani w przeciwciele dawcy. Te modyfikacje wykonuje się dla dodatkowej poprawy działania przeciwciała. Ogólnie, przeciwciało humanizowane będzie zawierało zasadniczo całość z co najmniej jednej, a zazwyczaj dwóch domen zmiennych, w których całość lub zasadniczo całość pętli hiperzmiennych odpowiada tym z immunoglobuliny innej niż ludzka i całość lub zasadniczo całość FR jest tymi o sekwencji immunoglobuliny ludzkiej. Przeciwciało humanizowane opcjonalnie będzie zawierało co najmniej część regionu stałego immunoglobuliny (Fc), zazwyczaj z ludzkiej immunoglobuliny. W celu poznania dalszych szczegółów patrz Jones et al., Nature 321: (1986); Riechmann et al., Nature 332: (1988); i Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: (1992). [0115] "Przeciwciało zależne gatunkowo", np. ssacze przeciwciało anty-ludzka IgE jest przeciwciałem mającym silniejsze powinowactwo wiązania dla antygenu z jednego gatunku ssaków, niż dla homologu tego antygenu z innego gatunku ssaków. Prawidłowo, przeciwciało zależne gatunkowo "specyficznie wiąże się" do ludzkiego antygenu (tj. ma wartość powinowactwa wiązania (Kd) wynoszącą nie więcej niż około 1 x 10-7 M, korzystnie nie więcej niż około 1 x 10-8, a najkorzystniej nie więcej niż około 1 x 10-9 M), ale ma powinowactwo wiązania dla homologu antygenu z drugiego, innego niż ludzki gatunku ssaka, które jest co najmniej około 50-razy lub co najmniej około 500-razy lub co najmniej około 1000-razy słabsze niż jego powinowactwo wiązania dla antygenu ludzkiego. Przeciwciało

37 36 zależne gatunkowo może być dowolnym z różnych typów przeciwciał zdefiniowanych powyżej, ale korzystnie jest przeciwciałem humanizowanym lub ludzkim. [0116] "Oligopeptyd wiążący IL-17A/F" oznacza oligopeptyd wiążący się, korzystnie specyficznie, do polipeptydu IL-17A/F, jak opisano. Oligopeptydy wiążące IL-17A/F można syntezować chemicznie stosując znaną metodologię syntezy oligopeptydów lub można je otrzymywać i oczyszczać stosując technologię rekombinacyjną. Oligopeptydy wiążące IL- 17A/F mają zazwyczaj co najmniej około 5 aminokwasów długości, alternatywnie co najmniej około 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 lub 100 aminokwasów długości lub więcej, przy czym takie oligopeptydy zdolne są do wiązania, korzystnie specyficznie, polipeptydu IL-17A/F, jak opisano. Oligopeptydy wiążące IL-17A/F można identyfikować bez niepotrzebnego eksperymentowania stosując dobrze znane techniki. W odniesieniu do tego zauważono, że techniki do badania przesiewowego bibliotek oligopeptydów zdolnych do specyficznego wiązania się do polipeptydu-celu, są dobrze znane w stanie techniki (patrz, np. Patenty USA nr 5,556,762, 5,750,373, 4,708,871, 4,833,092, 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 5,663,143; Publikacje PCT nr WO 84/03506 i WO84/03564; Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81: (1984); Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: (1985); Geysen et al., w Synthetic Peptides as Antigens, (1986); Geysen et al., J. Immunol. Meth., 102: (1987); Schoofs et al., J. Immunol., 140: (1988), Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378; Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363i Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668). [0117] "Cząsteczka organiczna wiążąca IL-17A/F" oznacza cząsteczkę organiczną inną niż oligopeptyd lub przeciwciało, jak zdefiniowano, która wiąże się, korzystnie specyficznie, do polipeptydu IL-17A/F, jak opisano. Cząsteczki organiczne wiążące IL-17A/F można identyfikować i chemicznie syntezować stosując znaną metodologię (patrz, np. Publikacje PCT nr WO00/00823 i WO00/39585). Cząsteczki organiczne wiążące IL-17A/F mają zazwyczaj rozmiar mniejszy niż około 2000 daltonów, alternatywnie rozmiar mniejszy niż około 1500, 750, 500, 250 lub 200 daltonów, przy czym takie cząsteczki organiczne, które zdolne są do wiązania się, korzystnie specyficznego, do polipeptydu IL-17A/F, jak opisano, można identyfikować bez niepotrzebnego eksperymentowania stosując dobrze znane techniki. W odniesieniu do tego zauważono, że te techniki do badania przesiewowego bibliotek cząsteczek organicznych pod kątem cząsteczek, które zdolne są do wiązania się do polipeptydu-celu, są dobrze znane w stanie techniki (patrz, np. Publikacje PCT nr WO00/00823 i WO00/39585). [0118] Przeciwciało, oligopeptyd lub inna cząsteczka organiczna, "która wiąże" antygen będący przedmiotem zainteresowania, np. cel w postaci antygenu będącego polipeptydem związanym z guzem jest tą, która wiąże antygen z wystarczającym powinowactwem, tak że

38 37 przeciwciało, oligopeptyd lub inna cząsteczka organiczna jest użyteczna jako środek diagnostyczny i/lub terapeutyczny, ukierunkowany na komórkę lub tkankę ekspresjonującą antygen oraz nie oddziałuje krzyżowo w sposób znaczny z innymi białkami. W takich przykładach wykonania, zakres wiązania przeciwciała, oligopeptydu lub innej cząsteczki organicznej do białka "nie będącego celem" wynosił będzie mniej niż około 10% wiązania przeciwciała, oligopeptydu lub innej cząsteczki organicznej do ich szczególnego białka-celu, jak określa się za pomocą analizy fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS) lub radioimmunoprecypitacji (RIA). W odniesieniu do wiązania przeciwciała, oligopeptydu lub innej cząsteczki organicznej do cząsteczki docelowej, wyrażenie "wiązanie specyficzne" lub "wiąże się specyficznie do" lub jest "specyficzne wobec" szczególnego polipeptydu lub epitopu na szczególnym polipeptydzie-celu oznacza wiązanie, które jest wymiernie inne od oddziaływania niespecyficznego. Wiązanie specyficzne można mierzyć, przykładowo, określając wiązanie cząsteczki w porównaniu do wiązania cząsteczki kontrolnej, która jest ogólnie cząsteczką o podobnej strukturze, która nie ma zdolności wiązania. Przykładowo, wiązanie specyficzne można określać poprzez współzawodniczenie z cząsteczką kontrolną podobną do celu, przykładowo, nadmiarem niewyznakowanego celu. W takim przypadku, wiązanie specyficzne jest wykazane, jeśli wiązanie celu wyznakowanego do sondy jest w sposób kompetycyjny hamowane przez nadmiar celu niewyznakowanego. Wyrażenie "wiązanie specyficzne" lub "wiąże się specyficznie do" lub jest "specyficzne wobec" szczególnego polipeptydu lub epitopu na szczególnym polipeptydzie-celu może być wykazywane, przykładowo, przez cząsteczkę o Kd wobec celu wynoszącej co najmniej około 10 4 M, alternatywnie co najmniej około 10-5 M, alternatywnie co najmniej około 10-6 M, alternatywnie co najmniej około 10-7 M, alternatywnie co najmniej około 10-8 M, alternatywnie co najmniej około 10-9 M, alternatywnie co najmniej około M, alternatywnie co najmniej około M, alternatywnie co najmniej około M lub więcej. W jednym z przykładów wykonania, wyrażenie "wiązanie specyficzne" dotyczy wiązania, w którym cząsteczka wiąże się do szczególnego polipeptydu lub epitopu na szczególnym polipeptydzie zasadniczo bez wiązania się do jakiegokolwiek innego polipeptydu lub epitopu polipeptydu. [0119] - Przeciwciało, oligopeptyd lub inna cząsteczka organiczna, która "hamuje wzrost komórek guza ekspresjonujących "polipeptyd IL-17A/F" lub przeciwciało, oligopeptyd lub inna cząsteczka organiczna będąca "inhibitorem wzrostu" oznacza tą, która skutkuje wymiernym zahamowaniem wzrostu komórek nowotworowych ekspresjonujących lub nadekspresjonujących odpowiedni polipeptyd IL-17A/F. Korzystne przeciwciała, oligopeptydy lub cząsteczki organiczne anty-il-17a/f będące inhibitorami wzrostu, hamują wzrost komórek guza ekspresjonujących IL-17A/F o więcej niż 20%, korzystnie od około 20% do około 50%, a jeszcze korzystniej o więcej niż 50% (np. od około 50% do około 100%), w porównaniu do odpowiedniej kontroli, przy czym kontrolą jest zazwyczaj komórka guza nie poddana działaniu testowanego przeciwciała, oligopeptydu lub innej cząsteczki organicznej. W jednym z przykładów wykonania, hamowanie wzrostu można mierzyć przy stężeniu przeciwciała wynoszącym około 0,1 do 30 µg/ml lub około 0,5 nm do 200 nm w hodowli komórkowej, przy czym hamowanie wzrostu określa się 1-10 dni po ekspozycji

39 38 komórek guza na przeciwciało. Hamowanie wzrostu komórek guza in vivo można określać na różne sposoby. Przeciwciało hamuje wzrost in vivo, jeżeli podawanie przeciwciała anty-il- 17A/F w ilości od około 1 µg/kg do około 100 mg/kg masy ciała skutkuje zmniejszeniem rozmiaru guza lub proliferacji komórek guza w ciągu od około 5 dni do 3 miesięcy od pierwszego podania przeciwciała, korzystnie w ciągu od około 5 do 30 dni. [0120] Przeciwciało, oligopeptyd lub inna cząsteczka organiczna, która "indukuje apoptozę" jest tą, która indukuje programowaną śmierć komórki, co określa się poprzez wiązanie aneksyny V, fragmentację DNA, kurczenie komórek, rozszerzanie retikulum endoplazmatycznego, fragmentację komórek i/lub tworzenie pęcherzyków błonowych (nazywanych ciałkami apoptotycznymi). Komórka jest zazwyczaj tą, która nadekspresjonuje polipeptyd IL-17A/F. Korzystnie, komórką jest komórka guza, np. komórka prostaty, sutka, jajnika, żołądka, endometrium, płuc, nerki, okrężnicy, pęcherza. Dostępne są różne sposoby oceniania zdarzeń komórkowych związanych z apoptozą. Przykładowo, translokację fosfatydyloseryny (PS) można mierzyć wiązaniem aneksyny; fragmentację DNA można oceniać na podstawie drabinek DNA; a kondensację jądrową/chromatyny łącznie z fragmentacją DNA można oceniać jakimkolwiek wzrostem w ilości komórek hypodiploidalnych. Korzystnie, przeciwciało, oligopeptyd lub inna cząsteczka organiczna indukująca apoptozę jest tą, która skutkuje około 2 do 50-krotną, korzystnie około 5 do 50- krotną, a najkorzystniej około 10 do 50-krotną indukcją wiązania aneksyny w porównaniu do komórek nie poddanych działaniu [przeciwciała, oligopeptydu lub innej cząsteczki organicznej] w badaniu wiązania aneksyny. [0121] "Funkcje efektorowe" przeciwciała dotyczą tych aktywności biologicznych, przypisywalnych regionowi Fc przeciwciała (regionowi Fc o sekwencji naturalnej lub wariantowi sekwencji aminokwasowej regionu Fc). Przykłady funkcji efektorowych przeciwciała obejmują: wiązanie C1q i cytotoksyczność zależną od dopełniacza; wiązanie receptora Fc; cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał (ADCC); fagocytozę; regulację "w dół" receptorów powierzchniowych komórki (np. receptorów komórek B); i aktywację komórek B. [0122] "Cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał" lub "ADCC" dotyczy postaci cytotoksyczności, w której wydzielane Ig wiążą się na receptorach Fc (FcR) obecnych na niektórych komórkach cytotoksycznych (np. naturalnych komórkach cytotoksycznych (NK), neutrofilach i makrofagach), umożliwiając tym cytotoksycznym komórkom efektorowym wiązanie specyficzne do komórki docelowej noszącej antygen, a następnie zabicie komórki docelowej za pomocą cytotoksyn. Przeciwciała "uzbrajają" komórki cytotoksyczne i są absolutnie niezbędne do takiego zabijania. Podstawowe komórki pośredniczące w ADCC, komórki NK, ekspresjonują wyłącznie FcγRIII, podczas gdy monocyty ekspresjonują FcγRI, FcγRII i FcγRIII. Ekspresję FcR na komórkach hematopoetycznych podsumowano w Tabeli 3 na stronie 464 Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: (1991). Aby oszacować aktywność ADCC cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania, można przeprowadzić badanie ADCC in vitro, tak jak to opisane w patencie USA nr 5,500,362 lub 5,821,337. Komórki efektorowe użyteczne do takich badań obejmują komórki jednojądrzaste krwi

40 39 obwodowej (PBMC) i naturalne komórki cytotoksyczne (NK). Alternatywnie lub dodatkowo, aktywność ADCC cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania można oceniać in vivo, np. w modelu zwierzęcym, takim jak ten ujawniony w Clynes et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: (1998). [0123] Receptor Fc lub FcR opisują receptor, który wiąże się do regionu Fc przeciwciała. Korzystny FcR jest ludzkim FcR o sekwencji naturalnej. Ponadto, korzystny FcR jest tym, który wiąże przeciwciało IgG (receptor gamma) i obejmuje receptory z podklas FcγRI, FcγRII i FcγRIII, włączając warianty alleliczne i składane alternatywnie postacie tych receptorów. Receptory FcγRII obejmują FcγRIIA ( receptor aktywujący ) oraz FcγRIIB ( receptor hamujący ), mające podobne sekwencje aminokwasowe, które różnią się przede wszystkim w obrębie swoich domen cytoplazmatycznych. Receptor aktywujący FγRIIA zawiera w swojej domenie cytoplazmatycznej aktywujący motyw immunoreceptorowy, oparty na tyrozynie (ITAM). Receptor hamujący FγRIIB zawiera w swojej domenie cytoplazmatycznej hamujący motyw immunoreceptorowy, oparty na tyrozynie (ITIM). (patrz praca przeglądowa M. in Daëron, Annu. Rev. Immunol. 15: (1997)). Przeglądu FcR dokonano w Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); oraz de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: (1995). Inne FcR, włączając te, które zostaną zidentyfikowane w przyszłości, objęto wyrażeniem FcR". Wyrażenie to obejmuje także receptor neonatalny, FcRn, odpowiedzialny za przenoszenie matczynych IgG do płodu (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) i Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)). [0124] Ludzkimi komórkami efektorowymi są leukocyty, które ekspresjonują jeden lub większą ilość FcR i pełnią funkcje efektorowe. Korzystnie, komórki ekspresjonują co najmniej FcγRIII i pełnią funkcję efektorową ADCC. Przykłady ludzkich leukocytów, które pośredniczą w ADCC, obejmują jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC), naturalne komórki cytotoksyczne (NK), monocyty, cytotoksyczne komórki T i neutrofile; przy czym korzystne są PBMC i komórki NK. Komórki efektorowe można izolować z naturalnego źródła, np. z krwi. [0125] Cytotoksyczność zależna od dopełniacza lub CDC dotyczą lizy komórki docelowej w obecności dopełniacza. Aktywacja klasycznej ścieżki dopełniacza inicjowana jest najpierw poprzez wiązanie pierwszego składnika układu dopełniacza (C1q) do przeciwciał (z odpowiedniej podklasy), które związane są do rozpoznawanego przez siebie antygenu. Dla oceny aktywacji dopełniacza przeprowadzać można oznaczenie CDC, np. jak opisano w Gazzano-Santoro et al., Immunol. Methods 202:163 (1996). [0126] Słowo znacznik dotyczy wykrywalnego związku lub kompozycji sprzężonych bezpośrednio lub pośrednio z przeciwciałem dla wytworzenia przeciwciała "wyznakowanego". Znacznik może być wykrywalny sam z siebie (np. znaczniki radioizotopowe lub znaczniki fluorescencyjne) lub w przypadku znacznika enzymatycznego, może katalizować chemiczną przemianą substratowego związku lub kompozycji, które są wykrywalne.

41 40 [0127] "Faza stała" oznacza macierz, która nie jest wodna, do której przylegać może przeciwciało według wynalazku. Przykłady ujętych tu faz stałych obejmują te tworzone częściowo lub w całości ze szkła (np. szkła o kontrolowanej porowatości), polisacharydów (np. agarozy), poliakrylamidów, polistyrenu, alkoholu poliwinylowego i silikonów. W niektórych przykładach wykonania, w zależności od kontekstu, faza stała może obejmować dołek płytki do oznaczeń; w innych, jest to kolumna do oczyszczania (np. kolumna do chromatografii powinowactwa). Wyrażenie to obejmuje również nieciągłą fazę stałą cząstek nieciągłych, takich jak te opisane w patencie USA nr 4,275,149. [0128] "Liposom" oznacza mały pęcherzyk, utworzony z różnych typów lipidów, fosfolipidów i/lub surfaktantu, który jest użyteczny w dostarczaniu ssakowi leku (takiego jak polipeptyd IL-17A/F lub ukierunkowane na niego przeciwciało). Składniki liposomu są zazwyczaj ułożone w formację dwuwarstwową, podobną do ułożenia lipidów z błon biologicznych. [0129] "Drobną cząsteczkę" definiuje się jako mającą masę cząsteczkową poniżej około 500 Daltonów. [0130] Wyrażenie "moduluje" oznacza wpływa (np. zarówno reguluje "w górę", reguluje "w dół", jak i kontroluje w inny sposób) na poziom szlaku sygnalnego. Procesy komórkowe pod kontrolą przekazywania sygnałów obejmują, ale w sposób nieograniczający, transkrypcję specyficznych genów, prawidłowe funkcje komórkowe, takie jak metabolizm, proliferacja, różnicowanie, adhezja, apoptoza i przeżywanie, jak również procesy nieprawidłowe, takie jak transformacja, blokowanie różnicowania i metastaza. [0131] "Aktywny" lub "aktywność" oznacza postać (postacie) polipeptydu IL-17A/F, które zachowują aktywność biologiczną i/lub immunologiczną naturalnych lub naturalnie występujących polipeptydów IL-17A/F, przy czym aktywność "biologiczna" dotyczy funkcji biologicznej (zarówno hamującej, jak i stymulującej) powodowanej przez naturalny lub występujący naturalnie polipeptyd IL-17A/F, innej niż zdolność do indukowania wytwarzania przeciwciała przeciw epitopowi antygenowemu, który ma naturalny lub występujący naturalnie polipeptyd IL-17A/F, a aktywność "immunologiczna" dotyczy zdolności do indukowania wytwarzania przeciwciała przeciwko epitopowi antygenowemu, który ma naturalny lub występujący naturalnie polipeptyd IL-17A/F. Jedna z korzystnych aktywności biologicznych obejmuje indukowanie aktywacji NF i stymulowanie wytwarzania chemokin prozapalnych IL-8 i IL-6. Inna korzystna aktywność biologiczna obejmuje stymulowanie jednojądrzastych komórek krwi obwodowej lub komórek CD4 +. Inna korzystna aktywność biologiczna obejmuje stymulowanie proliferacji limfocytów T. Inna korzystna aktywność biologiczna obejmuje, przykładowo, uwalnianie TNF-α z komórek THP1. Inna aktywność obejmuje wzmaganie syntezy macierzy w chrząstce stawowej. Alternatywnie, inna aktywność obejmuje promowanie rozpadu macierzy chrząstki stawowej, jak również hamowanie syntezy macierzy. Inna, korzystna aktywność biologiczna obejmuje modulowanie poziomu szlaku sygnalnego interleukiny-17 podczas łagodnych do ciężkich etapów nieswoistego zapalenia jelit lub podczas udaru.

42 41 [0132] Aktywność "immunologiczna" dotyczy zdolności do indukowania wytwarzania przeciwciała przeciwko epitopowi antygenowemu, który ma naturalny lub występujący naturalnie polipeptyd IL-17A/F. [0133] "Zaburzenie zwyrodnieniowe chrząstki" opisuje zaburzenia gospodarza, charakteryzujące się głównie niszczeniem macierzy chrząstki. Dodatkowe patologie obejmują wytwarzanie tlenku azotu i zwiększone niszczenie proteoglikanów. Przykładowe zaburzenia objęte tą definicją obejmują, przykładowo, zapalenie stawów (np. osteoartrozę, reumatoidalne zapalenie stawów, łuszczycowe zapalenie stawów). [0134] Wyrażenie "choroba o podłożu immunologicznym" oznacza chorobę, w której składnik układu immunologicznego ssaka powoduje, pośredniczy lub w inny sposób przyczynia się do zachorowalności u ssaka. Włączone są również choroby, w których stymulacja lub interwencja w postaci odpowiedzi immunologicznej ma łagodzący wpływ na progresję choroby. Wyrażeniem tym objęte są choroby zapalne o podłożu immunologicznym, choroby zapalne o podłożu innym niż immunologiczne, choroby zakaźne, choroby z niedoboru odporności, nowotwory, itd. [0135] Wyrażenie "choroba z udziałem komórek T" oznacza chorobę, w której komórki T, bezpośrednio lub pośrednio, pośredniczą lub w inny sposób przyczyniają się do zachorowalności u ssaka. Choroba z udziałem komórek T może być związana z efektami z udziałem komórek, efektami z udziałem limfokin itd., a nawet z efektami związanymi z komórkami B, jeśli komórki B są stymulowane, przykładowo, poprzez limfokiny wydzielane przez komórki T. [0136] Przykłady chorób zapalnych i o podłożu immunologicznym, z których niektóre przebiegają z udziałem komórek T, które można leczyć według wynalazku obejmują toczeń rumieniowaty układowy, reumatoidalne zapalenie stawów, młodzieńcze, przewlekłe zapalenie stawów, spondyloartropatię, twardzinę układową (sklerodermę), idiopatyczne miopatie zapalne (zapalenie skórno-mięśniowe, zapalenie wielomięśniowe), zespół Sjögrena, układowe zapalenie naczyń, sarkoidozę, anemię autoimmunohemolityczną (pancytopenię immunologiczną, napadową hemoglobinurię nocną); trombocytopenię autoimmunologiczną (idiopatyczną plamicę małopłytkową, trombocytopenię o podłożu immunologicznym), zapalenia tarczycy (chorobę Grave'a, zapalenie tarczycy Hashimoto, młodzieńcze, limfocytowe zapalenie tarczycy, zanikowe zapalenie tarczycy), cukrzycę, chorobę nerek o podłożu immunologicznym (zapalenie kłębuszków nerkowych, cewkowo-śródmiąższowe zapalenie nerek), choroby demielinizacyjne układów nerwowych ośrodkowego i obwodowego, takie jak stwardnienie rozsiane, idiopatyczna, demielinizująca polineuropatia lub zespół Guillaina-Barréa oraz przewlekła, zapalna polineuropatia demielinizująca, choroby wątroby i dróg żółciowych, takie jak zakaźne zapalenie wątroby (zapalenie wątroby A, B, C, D, E i innymi wirusami nie-hepatotropowymi), autoimmunologiczne, przewlekłe, aktywne zapalenie wątroby, pierwotną marskość wątroby, zapalenie wątroby ziarniniakowe i stwardniające zapalenie dróg żółciowych, nieswoiste zapalenie jelit (wrzodziejące zapalenie okrężnicy: choroba Crohna), enteropatię z nadwrażliwości na gluten i chorobę Whipplea, choroby skóry autoimmunologiczne lub o podłożu immunologicznym, włączając choroby

43 42 pęcherzowe skóry, rumień wielopostaciowy i kontaktowe zapalenie skóry, łuszczycę, choroby alergiczne, takie jak astma, alergiczny nieżyt nosa, atopowe zapalenie skóry, nadwrażliwość pokarmowa i pokrzywka, choroby immunologiczne płuc, takie jak eozynofilowe zapalenie płuc, idiopatyczne zwłóknienie płuc i zapalenie płuc z nadwrażliwości, choroby związane z przeszczepem, włączając odrzucenie przeszczepu i chorobę przeszczep przeciwko gospodarzowi. Choroby zakaźne, włączając choroby wirusowe, takie jak AIDS (infekcja HIV), wirusowe zapalenie wątroby A, B, C, D i E, opryszczka itd., infekcje bakteryjne, infekcje grzybowe, infekcje pierwotniakami i infekcje pasożytami. Wyrażenie "skuteczna ilość" oznacza stężenie lub ilość polipeptydu IL-17A/F i/lub agonisty/antagonisty, które skutkuje osiąganiem szczegółowo określonego celu. "Skuteczną ilość" polipeptydu IL-17A/F lub jego agonisty lub antagonisty można określać empirycznie. Ponadto, "terapeutycznie skuteczna ilość" oznacza stężenie lub ilość polipeptydu IL-17A/F i/lub agonisty/antagonisty, które jest skuteczna dla osiągania określonego efektu terapeutycznego. Ilość tą również można określać empirycznie. [0137] Wyrażenie środek cytotoksyczny dotyczy substancji hamującej lub zapobiegającej funkcjonowaniu komórek i/lub powodującej rozpad komórek. Wyrażenie ma obejmować izotopy radioaktywne (np. I 131, I 125, Y 90 i Re 186 ), środki chemioterapeutyczne i toksyny, takie jak enzymatycznie aktywne toksyny pochodzenia bakteryjnego, roślinnego lub zwierzęcego lub ich fragmenty. [0138] Środek chemioterapeutyczny jest związkiem chemicznym użytecznym w leczeniu raka. Przykłady środków chemioterapeutycznych obejmują adriamycynę, doksorubicynę, epirubicynę, 5-fluorouracyl, arabinozyd cytozyny ("Ara-C"), cyklofosfamid, tiotepę, busulfan, cytoksynę, taksoidy, np. paklitaksel (Taksol, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) i doksetaksel (Taksoter, Rhône-Poulenc Rorer, Antony, Francja), toksoter, metotreksat, cisplatynę, melfalan, winblastynę, bleomycynę, etopozyd, ifosfamid, mitomycynę C, mitoksantron, winkrystynę, winorelbinę, karboplatynę, tenipozyd, daunomycynę, karminomycynę, aminopterynę, daktynomycynę, mitomycyny, esperamycyny (patrz patent USA nr 4,675,187), melfalan i inne powiązane iperyty azotowe. Definicja obejmuje również środki hormonalne, które działają dla regulacji lub hamowania działania hormonu na guzy, takie jak tamoksyfen i onapriston. [0139] Środek hamujący wzrost dotyczy związku lub kompozycji hamującej wzrost komórek, zwłaszcza komórek nowotworowych nadekspresjonujących jakiekolwiek zidentyfikowane tu geny, in vitro lub in vivo. A zatem, środek hamujący wzrost oznacza ten, który znacznie obniża procent komórek nadekspresjonujących takie geny w fazie S. Przykłady środków hamujących wzrost obejmują środki blokujące progresję cyklu komórkowego (w miejscu innym niż faza S), takie jak środki powodujące zatrzymanie fazy G1 i M. Klasyczne blokery fazy M obejmują alkaloidy barwinka (winkrystynę i winblastynę), taksol i inhibitory topo II takie jak doksorubicyna, epirubicyna, daunorubicyna, etopozyd i bleomycyna. Te środki, które zatrzymują G1 wpływają również na zatrzymanie fazy S, przykładowo, środki alkilujące DNA, takie jak tamoksyfen, prednizon, dakarbazyna, mechloretamina, cisplatyna, metotreksat, 5-fluorouracyl i ara-c. Dodatkowe informacje

44 43 można znaleźć w The Molecular Basis of Cancer, red. Mendelsohn i Israel, Rozdział 1, zatytułowany "Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs", Murakami et al., (WB Saunders: Philadelphia, 1995), szczególnie str. 13. [0140] Wyrażenie "cytokina jest ogólnym określeniem białek uwalnianych przez jedną populację komórek, które oddziałują na inne komórki jako mediatory międzykomórkowe. Przykładami takich cytokin są limfokiny, monokiny i tradycyjne hormony polipeptydowe. Wśród cytokin znajdują się hormon wzrostu, taki jak ludzki hormon wzrostu, N- metionylowany ludzki hormon wzrostu i bydlęcy hormon wzrostu; hormon przytarczycy; tyroksyna; insulina; proinsulina; relaksyna; prorelaksyna; hormony glikoproteinowe, takie jak hormon folikulotropowy (FSH), tyreotropina (TSH) i hormon luteinizujący (LH); czynnik wzrostu wątroby; czynnik wzrostu fibroblastów; prolaktyna; laktogen łożyskowy; czynnik martwicy guza -α i -β; inhibitor müllerianowy; mysi peptyd gonadotropinowy; inhibina; aktywina; czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego; integryna; trombopoetyna (TPO); czynniki wzrostu nerwów, takie jak NGF-β; czynnik wzrostu płytek; transformujące czynniki wzrostu (TGF), takie jak TGF-α i TGF-β; insulinowy czynnik wzrostu I i II; erytropoetyna (EPO); czynniki osteoindukcyjne; interferony, takie jak interferon α, -β i -γ; czynniki pobudzające wzrost kolonii (CSF), takie jak makrofagowy-csf (M-CSF); granulocytomakrofagowy-csf (GM-CSF); i granulocyto-csf (G-CSF); interleukiny (IL-y), takie jak IL- 1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL- 7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 lub IL-17; czynnik martwicy guza, taki jak TNF-α lub TNF-β; i inne czynniki polipeptydowe, włączając czynnik hamujący białaczkę (LIF) i ligand KIT (KL). Wyrażenie cytokina obejmuje białka ze źródeł naturalnych lub z hodowli komórek rekombinowanych i biologicznie aktywne równoważniki cytokin o sekwencjach naturalnych.

45 44

46 45

47 46

48 47

49 48

50 49

51 50

52 51

53 52

54 53

55 54

56 55

57 56

58 57

59 58

60 59

61 60 Tabela 2 Białko IL-17A/F XXXXXXXXXXXXXXX (Długość = 15 aminokwasów) Białko porównawcze XXXXXYYYYYYY (Długość = 12 aminokwasów) % identyczności sekwencji aminokwasowej = (liczba identycznie dopasowanych reszt aminokwasowych między dwiema sekwencjami polipeptydowymi, jak określono za pomocą ALIGN-2) podzielona przez (łączną liczbę reszt aminokwasowych z białka IL-17A/F) = 5 podzielić przez 1,5 = 33,3% Tabela 3 Białko IL-17A/F XXXXXXXXXX (Długość = 10 aminokwasów) Białko porównawcze XXXXXYYYYYYZZYZ % identyczności sekwencji aminokwasowej = (Długość = 15 aminokwasów) (liczba identycznie dopasowanych reszt aminokwasowych między dwiema sekwencjami polipeptydowymi, jak określono za pomocą ALIGN-2) podzielona przez (łączną liczbę reszt aminokwasowych z białka IL-17A/F) = 5 podzielić przez 10 = 50% Tabela 4 DNA IL-17A/F NNNNNNNNNNNNNN (Długość = 14 nukleotydów) DNA porównawcze NNNNNNLLLLLLLLLL (Długość = 16 nukleotydów)

62 61 % identyczności sekwencji kwasu nukleinowego = (liczba identycznie dopasowanych nukleotydów między dwiema sekwencjami kwasów nukleinowych, jak określono za pomocą ALIGN-2) podzielona przez (łączną liczbę nukleotydów z sekwencji kwasu nukleinowego DNA IL-17A/F) = 6 podzielić przez 14 = 42,9% Tabela 5 DNA IL-17A/F NNNNNNNNNNNN (Długość = 12 nukleotydów) DNA porównawcze NNNNLLLVV (Długość = 9 nukleotydów) % identyczności sekwencji kwasu nukleinowego = (liczba identycznie dopasowanych nukleotydów między dwiema sekwencjami kwasów nukleinowych, jak określono za pomocą ALIGN-2) podzielona przez (łączną liczbę nukleotydów z sekwencję kwasu nukleinowego DNA IL-17A/F) = 4 podzielić przez 12 = 33,3% II. Kompozycje i Sposoby Według Wynalazku A. Pełnej długości polipeptydy IL-17A/F [0141] Wynalazek dostarcza nowo zidentyfikowane i wyizolowane sekwencje nukleotydowe kodujące polipeptydy określane w zgłoszeniu jako polipeptydy IL-17A/F. W szczególności, zidentyfikowano i wyizolowano cdna kodujące różne polipeptydy IL-17A/F, jak ujawniono bardziej szczegółowo w Przykładach, poniżej. B. Warianty polipeptydów IL-17A/F [0142] W dodatku do opisanych polipeptydów IL-17A/F o naturalnej sekwencji pełnej długości, pod uwagę bierze się możliwość otrzymania wariantów IL-17A/F. Warianty IL- 17A/F można otrzymywać wprowadzając odpowiednie zmiany nukleotydowe do DNA IL- 17A/F i/lub poprzez syntezę pożądanego polipeptydu IL-17A/F. Znawcy docenią, że zmiany aminokwasowe mogą wpływać na procesy potranslacyjne IL-17A/F, tak jak zmieniać liczbę lub pozycje miejsc glikozylacji lub zmieniać cechy zakotwiczania w błonie. [0143] Zmian w sekwencji naturalnej pełnej długości IL-17A/F lub w różnych opisanych domenach IL-17A/F dokonywać można, przykładowo, stosując dowolne techniki i wytyczne dla mutacji konserwatywnych i niekonserwatywnych, określone, przykładowo, w patencie USA nr 5,364,934. Zmianą może być substytucja, delecja lub insercja jednego lub większej liczby kodonów kodujących IL-17A/F, która skutkuje zmianą w sekwencji aminokwasowej IL-17A/F w porównaniu z naturalną sekwencją IL-17A/F. Opcjonalnie, zmiany dokonuje się przez substytucję co najmniej jednego aminokwasu innym aminokwasem w jednej lub większej ilości domen IL-17A/F. Wskazówki dotyczące określania, która reszta aminokwasowa może być wstawiona, podstawiona lub usunięta bez niekorzystnego wpływu na pożądaną aktywność można uzyskać porównując sekwencję IL-17A/F z tymi z cząsteczek znanych białek homologicznych i minimalizując liczbę zmian w sekwencji aminokwasowej

63 62 dokonywanych w regionach o wysokiej homologii. Podstawienia aminokwasowe mogą być wynikiem zastępowania jednego aminokwasu innym aminokwasem o podobnych właściwościach strukturalnych i/lub chemicznych, tak jak zastąpienie leucyny seryną, tj. konserwatywne zastąpienie aminokwasowe. Insercje lub delecje mogą opcjonalnie mieścić się w zakresie wynoszącym około 1 do 5 aminokwasów. Dozwoloną zmianę można określać systematycznie dokonując insercji, delecji lub substytucji aminokwasów w sekwencji i testując powstające warianty pod kątem aktywności wykazywanej przez naturalną sekwencję pełnej długości lub dojrzałą. [0144] Zapewnia się fragmenty polipeptydu IL-17A/F. Takie fragmenty mogą być skrócone na końcu N lub końcu C lub mogą nie mieć reszt wewnętrznych, przykładowo, w porównaniu z białkiem naturalnym o pełnej długości. Niektóre fragmenty nie mają reszt aminokwasowych, które nie są niezbędne dla pożądanej aktywności biologicznej polipeptydu IL-17A/F. [0145] Fragmenty IL-17A/F można otrzymywać za pomocą dowolnej w wielu konwencjonalnych technik. Pożądane fragmenty peptydowe można syntetyzować chemicznie. Podejście alternatywne obejmuje wytwarzanie fragmentów IL-17A/F poprzez trawienie enzymatyczne, np. poprzez traktowanie białka enzymem znanym z rozcinania białek w miejscach zdefiniowanych przez szczególne reszty aminokwasowe lub poprzez trawienie DNA za pomocą odpowiednich enzymów restrykcyjnych i izolowanie pożądanego fragmentu. Jeszcze inna, odpowiednia technika obejmuje izolowanie i amplifikowanie fragmentu DNA kodującego pożądany fragment polipeptydu za pomocą łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR). Oligonukleotydy definiujące pożądany koniec fragmentu DNA stosuje się w starterach 5' i 3' w PCR. Korzystnie, fragmenty polipeptydu IL-17A/F mają wspólną co najmniej jedną aktywność biologiczną i/lub immunologiczną z naturalnym, ujawnionym polipeptydem IL-17A/F. [0146] W szczególnych przykładach wykonania, podstawienia konserwatywne będące przedmiotem zainteresowania przedstawiono w Tabeli 6 pod nagłówkiem o podstawieniach korzystnych. Jeśli takie podstawienia skutkują zmianą aktywności biologicznej, to do badanych produktów wprowadza się zmiany bardziej zasadnicze, nazwane w Tabeli 6 podstawieniami przykładowymi lub jak dodatkowo opisano poniżej w odniesieniu do klas aminokwasów. Tabela 6 Reszta Oryginalna Podstawienia Przykładowe Podstawienia Korzystne Ala (A) val; leu; ile val Arg (R) lys; gln; asn lys Asn (N) gln; his; lys; arg gln ASD (D) glu glu

64 63 Reszta Oryginalna Podstawienia Przykładowe Podstawienia Korzystne Cys (C) ser ser Gln (Q) asn asn Glu (E) asp asp Gly (G) pro; ala ala His (H) asn; gln; lys; arg arg Ile (I) leu; val; met; ala; phe; norleucyna leu Leu (L) norleucyna; ile; val; met; ala; phe ile Lys (K) arg; gln; asn arg Met (M) leu; phe; ile leu Phe (F) leu; val; ile; ala; tyr leu Pro (P) ala ala Ser (S) thr thr Thr (T) ser ser Trp (W) tyr; phe tyr Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe Val (V) ile; leu; met; phe; ala; norleucyna leu [0147] Zasadniczych modyfikacji funkcji lub tożsamości immunologicznej polipeptydu IL- 17A/F dokonuje się poprzez wybór podstawień, które znacznie różnią się swoim wpływem na utrzymanie (a) struktury szkieletu polipeptydowego w okolicach podstawienia, przykładowo, w postaci konformacji kartki lub helisy (b) ładunku lub hydrofobowości cząsteczki w miejscu docelowym lub (c) wielkości łańcucha bocznego. Naturalnie występujące reszty dzieli się na grupy, w oparciu o wspólne właściwości łańcuchów bocznych: (1) hydrofobowe: norleucyna, met, ala, val, leu, ile; (2) neutralne hydrofilowe: cys, ser, thr; (3) kwasowe: asp, glu; (4) zasadowe: asn, gln, his, lys, arg; (5) reszty mające wpływ na orientację łańcucha: gly, pro; i

65 64 (6) aromatyczne: trp, tyr, phe. [0148] Podstawienia niekonserwatywne będą powodować wymianę członka jednej z tych klas na inną klasę. Takie podstawione reszty można również wprowadzać w miejsca podstawień konserwatywnych lub, korzystnie, w miejsca pozostałe (niekonserwatywne). [0149] Zmian można dokonywać stosując sposoby znane w stanie techniki, takie jak mutageneza za pośrednictwem oligonukleotydów (ukierunkowana), skaning alaninowy i mutageneza poprzez PCR. Mutagenezę ukierunkowaną [Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)], mutagenezę kasetową (Wells et al., Gene, 34:315 [1985]), mutagenezę ograniczonego wyboru (Wells etal., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 [1986]) lub inne znane techniki można stosować na sklonowanym DNA dla wytwarzania wariantu DNA IL-17A/F. [0150] Do identyfikacji jednego lub większej liczby aminokwasów w ciągłej sekwencji stosować można również analizę skaningową aminokwasów. Wśród korzystnych aminokwasów skaningowych są aminokwasy stosunkowo małe, neutralne. Takie aminokwasy obejmują alaninę, glicynę, serynę i cysteinę. W tej grupie korzystnym aminokwasem skaningowym jest zazwyczaj alanina, ponieważ eliminuje to łańcuch boczny poza węglem beta i wykazuje mniejsze prawdopodobieństwo zmiany konformacji łańcucha głównego wariantu (Cunningham i Wells, Science, 244: [1989]). Alanina jest również zazwyczaj korzystna, ponieważ jest najpopularniejszym aminokwasem. Ponadto, stwierdza się ją często zarówno na pozycjach zagrzebanych, jak i eksponowanych (Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 [1976]). Jeśli podstawienie alaninowe nie skutkuje adekwatną ilością wariantów, zastosować można aminokwas izoteryczny. C. Modyfikacje IL-17A/F [0151] W zakres tego wynalazku włączono kowalentne modyfikacje IL-17A/F. Jeden z typów modyfikacji kowalentnych obejmuje poddawanie reakcji docelowych reszt aminokwasowych z polipeptydu IL-17A/F z organicznym środkiem derywatyzującym, który zdolny jest do reagowania z wybranymi łańcuchami bocznymi lub resztami na końcu N lub C IL-17A/F. Derywatyzacja za pomocą środków bifunkcjonalnych jest użyteczna, przykładowo, do sieciowania IL-17A/F do nierozpuszczalnej w wodzie, wspierającej matrycy lub powierzchni dla zastosowania w sposobie oczyszczania przeciwciał anty-il-17a/f i odwrotnie. Powszechnie stosowane środki sieciujące obejmują np. 1,1-bis(diazoacetylo)-2-fenyloetan, glutaraldehyd, estry N-hydroksysukcynoimidowe, przykładowo, estry z kwasem 4- azydosalicylowym, imidoestry homobifunkcjonalne, włączając estry disukcynoimidowe, takie jak 3,3'-ditiobis(sukcynoimidylopropionian), bifunkcjonalne maleimidy, takie jak bis-nmaleimido-1,8-oktan i środki takie jak metylo-3-[(p-azydofenylo)ditio]propioimidan. [0152] Inne modyfikacje obejmują deamidację reszt glutaminylu i asparaginylu do odpowiadających im reszt glutamylu i aspartylu, odpowiednio, hydroksylację proliny i lizyny, fosforylację grup hydroksylowych reszt serylu lub treonylu, metylację grup α-amino z łańcuchów bocznych lizyny, argininy i histydyny [T.E. Creighton, Proteins: Structure and

66 65 Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, str (1983)], acetylację aminy końca N i amidację grup karboksylowych końca C. [0153] Inny typ modyfikacji kowalentnej polipeptydu IL-17A/F, objęty zakresem tego wynalazku, obejmuje zmianę naturalnego wzorca glikozylacji polipeptydu. "Zmianę naturalnego wzorca glikozylacji" należy rozumieć jako oznaczającą usuwanie jednego lub większej ilości cząstek węglowodanów stwierdzanych w naturalnej sekwencji IL-17A/F (poprzez usuwanie odpowiedniego miejsca glikozylacji lub poprzez usuwanie glikozylacji za pomocą środków chemicznych i/lub enzymatycznych) i/lub dodawanie jednego lub większej ilości miejsc glikozylacji, które nie są obecne w naturalnej sekwencji IL-17A/F. Dodatkowo, określenie obejmuje zmiany jakościowe w glikozylacji naturalnych białek, włączając zmianę w charakterze i proporcjach różnych, obecnych cząstek węglowodanów. [0154] Dodawanie miejsc glikozylacji dla polipeptydu IL-17A/F można osiągnąć zmieniając sekwencję aminokwasową. Zmiana może być, przykładowo, poprzez dodanie lub podstawienie jednej lub większej liczbą reszt seryny lub treoniny do sekwencji naturalnej IL- 17A/F (dla miejsc O-glikozylacji). Sekwencję aminokwasową IL-17A/F można opcjonalnie zmieniać poprzez zmiany na poziomie DNA, szczególnie mutując DNA kodujące polipeptyd IL-17A/F przy wybranych wcześniej zasadach, tak że powstają kodony, które ulegną translacji na pożądane aminokwasy. [0155] Innym sposobem zwiększania liczby cząstek węglowodanów na polipeptydzie IL- 17A/F jest chemiczne lub enzymatyczne sprzęganie glikozydów do polipeptydu. Takie sposoby opisano w stanie techniki, np. w WO 87/05330, opublikowanym 11 września 1987 i w Aplin i Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., str (1981). [0156] Usuwanie cząstek węglowodanów obecnych na polipeptydzie IL-17A/F można uzyskać chemicznie lub enzymatycznie lub przez podstawienie mutacyjne kodonów kodujących reszty aminokwasowe, służące jako cele dla glikozylacji. Techniki deglikozylacji chemicznej znane są w stanie techniki i opisane, przykładowo, przez Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) i przez Edge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981). Enzymatyczne rozszczepienie cząstek węglowodanowych na polipeptydzie można uzyskać poprzez zastosowanie różnych endo- i egzoglikozydaz, takich jak opisali Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987). [0157] Inny typ kowalentnej modyfikacji IL-17A/F obejmuje przyłączanie polipeptydu IL- 17A/F do jednego z wielu różnych polimerów niebiałkowych, np. glikolu polietylenowego (PEG), glikolu polipropylenowego lub polioksyalkilenów, w sposób określony w patentach USA nr 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 lub 4,179,337. [0158] IL-17A/F według wynalazku można również modyfikować w taki sposób, aby wytworzyć cząsteczkę chimeryczną, zawierającą IL-17A/F w fuzji z innym heterologicznym polipeptydem lub sekwencją aminokwasową. [0159] W jednym z przykładów wykonania, taka cząsteczka chimeryczna stanowi fuzję IL- 17A/F z polipeptydem znacznikowym, który zapewnia epitop, do którego selektywnie wiąże się przeciwciało anty-znacznik. Epitop znacznikowy umieszcza się ogólnie na końcu amino-

67 66 lub karboksylo- IL-17A/F. Obecność takich postaci IL-17A/F wyznakowanych epitopem można wykrywać, stosując przeciwciało przeciwko polipeptydowi znacznikowemu. Ponadto, zapewnienie znacznika epitopowego pozwala na łatwe oczyszczanie IL-17A/F poprzez oczyszczanie na podstawie powinowactwa, stosując przeciwciało anty-znacznik lub inny typ matrycy powinowactwa, wiążącej się do znacznika epitopowego. Różne znaczniki polipeptydowe lub odpowiadające im przeciwciała są dobrze znane w stanie techniki. Przykłady obejmują znaczniki polihistydynowe (poli-his) lub polihistydynowo-glicynowe (poli-his-gly); znacznik polipeptydowy HA [wirusa] grypy i jego przeciwciało 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8: (1988)]; znacznik c-myc oraz przeciwciała wobec niego 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 i 9E10 [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5: (1985)]; oraz znacznik w postaci glikoproteiny D z wirusa opryszczki pospolitej (gd) i jego przeciwciało [Paborsky etal., Protein Engineering, 3(6): (1990)]. Inne polipeptydy znacznikowe obejmują peptyd Flag [Hop et al., BioTechnology, 6: (1988)]; peptyd epitopowy KT3 [Martin et al., Science, 255: (1992)]; peptyd epitopowy α-tubulinowy [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266: (19991)]; i znacznik peptydowy z białka 10 genu T7 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: (1990)]. [0160] W alternatywnym przykładzie wykonania, cząsteczka chimeryczna może obejmować fuzję IL-17A/F z immunoglobuliną lub szczególnym regionem immunoglobuliny. Dla postaci dwuwartościowej cząsteczki chimerycznej (określanej również jako "immunoadhezyna"), taka fuzja może być do regionu Fc cząsteczki IgG. Fuzje Ig korzystnie obejmują podstawienie rozpuszczalnej (o usuniętej lub dezaktywowanej domenie transbłonowej) postaci polipeptydu IL-17A/F w miejsce co najmniej jednego, zmiennego regionu w obrębie cząsteczki Ig. W szczególnie korzystnym przykładzie wykonania, fuzja immunoglobuliny obejmuje regiony zawiasowy, CH2 i CH3 lub zawiasowy, CH1, CH2 i CH3 cząsteczki IgG1. Dla wytwarzania fuzji immunoglobulin patrz również Patent USA nr 5,428,130, wydany 27 czerwca, [0161] W jeszcze dalszym przykładzie wykonania, polipeptydy IL-17A/F według wynalazku można również modyfikować w taki sposób, aby wytwarzać cząsteczkę chimeryczną, zawierającą polipeptyd IL-17A/F w fuzji z zamkiem leucynowym. W stanie techniki opisano różne polipeptydowe zamki leucynowe. Patrz, np. Landschulz et al., Science, 240:1759 (1988); WO94/10308; Hoppe et al., FEBS Letters, 344:1991 (1994); Maniatis et al., Nature, 341:24 (1989). Uważa się, że zastosowanie zamka leucynowego w fuzji z polipeptydem IL- 17A/F może być pożądane dla ułatwiania dimeryzacji lub trimeryzacji rozpuszczalnego polipeptydu IL-17A/F w roztworze. Znawcy stanu techniki docenią, że zamek leucynowy może być w fuzji na końcu N lub C cząsteczki IL-17A/F. D. Otrzymywanie IL-17A/F [0162] Opis poniżej dotyczy przede wszystkim wytwarzania IL-17A/F poprzez hodowanie komórek transformowanych lub transfekowanych wektorem zawierającym kwas nukleinowy IL-17A/F. Pod uwagę bierze się oczywiście możliwość zastosowania alternatywnych sposobów do otrzymywania IL-17A/F, dobrze znanych w stanie techniki. Przykładowo, sekwencję IL-17A/F lub jej część można wytwarzać poprzez bezpośrednią syntezę peptydów, stosując techniki fazy stałej [patrz, np. Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H.

68 67 Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: (1963)]. Syntezę białek in vitro można przeprowadzać stosując techniki manualne lub działania zautomatyzowane. Syntezy zautomatyzowanej można dokonywać stosując Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA), stosując instrukcje producenta. Różne części IL-17A/F można syntetyzować chemicznie oddzielnie i łączyć, stosując sposoby chemiczne lub enzymatyczne dla wytwarzania pełnej długości IL-17A/F. 1. Izolacja DNA Kodującego IL-17A/F [0163] DNA kodujące IL-17A/F można uzyskiwać z biblioteki cdna otrzymanej z tkanki uważanej za taką, która ma mrna IL-17A/F i ekspresjonuje je na wykrywalnym poziomie. Z tego powodu ludzkie DNA IL-17A/F można dogodnie uzyskiwać z biblioteki cdna otrzymanej z ludzkiej tkanki, jak opisano w Przykładach. Gen kodujący IL-17A/F można uzyskiwać również z biblioteki genomowej lub za pomocą znanych procedur syntetycznych (np. zautomatyzowanej syntezy kwasów nukleinowych). [0164] Biblioteki można badać przesiewowo za pomocą sond (takich jak przeciwciała względem IL-17A/F lub oligonukleotydy o co najmniej około zasadach) zaprojektowanych do identyfikowania genu będącego przedmiotem zainteresowania lub kodowanego przez niego białka. Badanie przesiewowe biblioteki cdna lub genomowej za pomocą wybranej sondy można przeprowadzać stosując standardowe procedury, takie jak opisano w Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Alternatywnym sposobem izolacji genu kodującego IL-17A/F jest zastosowanie metodologii PCR [Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)]. [0165] Przykłady poniżej opisują techniki do badania przesiewowego biblioteki cdna. Sekwencje oligonukleotydowe wybrane jako sondy powinny mieć wystarczającą długość i wystarczającą jednoznaczność dla minimalizowania [wyników] fałszywie pozytywnych. Oligonukleotyd jest korzystnie wyznakowany, tak że może być wykrywany po hybrydyzacji do DNA w bibliotece badanej przesiewowo. Sposoby znakowania są dobrze znane w stanie techniki i obejmują zastosowanie znaczników radioaktywnych, ATP wyznakowanego P, biotynylację lub znakowanie enzymem. Warunki hybrydyzacji, włączając o umiarkowanej ostrości i o wysokiej ostrości, podano w Sambrook et al., supra. [0166] Sekwencje zidentyfikowane w takich sposobach badania przesiewowego bibliotek można porównywać i przyrównywać z innymi, znanymi sekwencjami, złożonymi i dostępnymi w publicznych bazach danych, takich jak GenBank lub innych, prywatnych bazach danych sekwencji. Identyczność sekwencji (na poziomie aminokwasowym lub nukleotydowym) w obrębie zdefiniowanych regionów cząsteczki lub w sekwencji pełnej długości można określać stosując sposoby znane w stanie techniki i jak tu opisano. [0167] Kwas nukleinowy o sekwencji kodującej białko można uzyskiwać poprzez badanie przesiewowe wybranych bibliotek cdna lub bibliotek genomowych, stosując wydedukowaną sekwencję aminokwasową, ujawnioną tu po raz pierwszy i, o ile konieczne, stosując konwencjonalne procedury wydłużania starterami, jak opisano w Sambrook et al.,

69 68 supra, dla wykrywania mrna prekursorowego i produktów pośrednich [jego] obróbki, które mogły nie zostać poddane odwrotnej transkrypcji na cdna. 2. Selekcja i Transformacja Komórek Gospodarza [0168] Komórki gospodarza transfekuje się lub transformuje wektorami ekspresyjnymi lub klonującymi, opisanymi do otrzymywania IL-17A/F i hoduje w konwencjonalnych pożywkach odżywczych, zmodyfikowanych w sposób odpowiedni do indukowania promotorów, selekcji transformantów lub amplifikowania genów kodujących pożądane sekwencje. Warunki hodowli, takie jak pożywki, temperatura, ph i tym podobne, znawca stanu techniki może wybrać bez niepotrzebnego eksperymentowania. Zasady, protokoły i techniki praktyczne do maksymalizowania produktywności hodowli komórkowych znaleźć można ogólnie w Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, red. M. Butler, (IRL Press, 1991) oraz Sambrook et al., supra. [0169] Sposoby transfekcji komórek eukariotycznych i transformacji komórek prokariotycznych znane są znawcy, przykładowo, CaCl 2, CaPO 4 i elektroporacja za pośrednictwem liposomów. W zależności od zastosowanych komórek gospodarza, transformację przeprowadza się z zastosowaniem standardowych technik odpowiednich wobec takich komórek. Traktowanie wapniem z zastosowaniem chlorku wapnia, jak opisano w Sambrook et al., supra lub elektroporację stosuje się najczęściej dla prokariontów. Zakażanie Agrobacterium tumefaciens stosuje się do transformacji niektórych komórek roślinnych, jak opisano przez Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) i WO 89/05859, opublikowanym 29 czerwca Dla komórek ssaczych bez takich ścian komórkowych zastosować można sposób z wytrącaniem fosforanu wapnia z Graham i van der Eb, Virology, 52: (1978). Ogólne aspekty systemu transfekcji ssaczych komórek gospodarza opisano w patencie USA nr 4,399,216. Transformacje do komórek drożdżowych przeprowadza się zazwyczaj według sposobu Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977) i Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979). Stosować można jednak również inne sposoby wprowadzania DNA do komórek, takie jak poprzez mikroiniekcję jądrową, elektroporację, fuzję protoplastów bakteryjnych z komórkami nienaruszonymi lub polikationy, np. polibren, poliornityna. Dla zapoznania się z różnymi technikami transformowania komórek ssaczych, patrz Keown et al., Methods in Enzymology, 185: (1990) i Mansour et al., Nature, 336: (1988). [0170] Komórki gospodarza odpowiednie do klonowania lub ekspresji DNA w wektorach obejmują komórki prokariotyczne, drożdże lub wyższych eukariontów. Odpowiednie prokarionty obejmują, ale w sposób nieograniczający, bakterie właściwe, takie jak organizmy Gram-negatywne lub Gram-pozytywne, przykładowo, Enterobacteriaceae, takie jak E. coli. Publicznie dostępne są różne szczepy E. coli, takie jak szczep E. coli K12 MM294 (ATCC 31,446); E. coli X1776 (ATCC 31,537); szczep E. coli W3110 (ATCC 27,325) i K5 772 (ATCC 53,635). Inne, odpowiednie, prokariotyczne komórki gospodarzy obejmują Enterobacteriaceae, takie jak Escherichia, np. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, np. Salmonella typhimurium, Serratia, np. Serratia marcescans i Shigella, jak również Bacilli, takie jak B. subtilis i B. licheniformis (np. B. licheniformis 41P,

70 69 ujawniony w DD 266,710, opublikowanym 12 kwietnia 1989), Pseudomonas, takie jak P. aeruginosa i Streptomyces. Przykłady te są ilustracyjne i nie ograniczają wynalazku. Szczep W3110 jest szczególnie korzystnym gospodarzem lub gospodarzem macierzystym, ponieważ jest on szczepem wspólnym dla dróg fermentacji rekombinowanego IL-17A/F. Korzystnie, komórka gospodarza wydziela minimalne ilości enzymów proteolitycznych. Przykładowo, szczep W3110 można modyfikować dla osiągnięcia mutacji genetycznej w genach kodujących białka endogenne dla gospodarza, przy czym przykłady takich gospodarzy obejmują E. coli W3110 szczep 1A2, który ma kompletny genotyp tona; E. coli W3110 szczep 9E4, który ma kompletny genotyp tona ptr3, E. coli W3110 szczep 27C7 (ATCC 55,244), który ma kompletny genotyp tona ptr3 phoa E15 (argf-lac)169 degp ompt kan, E. coli W3110 szczep 37D6, który ma kompletny genotyp tona ptr3 phoa E15 (argf-lac)169 degp ompt rbs7 ilvg kan, E. coli W3110 szczep 40B4, który jest szczepem 37D6 z mutacją delecyjną degp braku odporności na kanamycynę; i szczep E. coli o zmutowanej proteazie periplazmatycznej, ujawniony w patencie USA nr 4,946,783, przyznanym 7 sierpnia Alternatywnie, odpowiednie są również sposoby in vitro klonowania, np. PCR lub inne reakcje polimerazy kwasów nukleinowych. [0171] Oprócz prokariontów, odpowiednimi gospodarzami do klonowania lub ekspresji wektorów kodujących IL-17A/F są mikroorganizmy eukariotyczne, takie jak grzyby strzępkowe lub drożdże. Saccharomyces cerevisiae jest stosowanym powszechnie gospodarzem - mikroorganizmem niższych eukariontów. Inne obejmują Schizosaccharomyces pombe [Beach i Nurse, Nature, 290: 140 (1981); EP 139,383 opublikowany 2 maja 1985]; gospodarzy Kluyveromyces (patent USA nr 4,943,529; Fleer et al., Bio/Technology, 9: [1991]), takich jak np. K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt etal., J. Bacteriol., 154(2): [1983]), K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135 [1990]), K. thermotolerans i K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28: [1988]); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: [1979]); Schwanniomyces, takie jak Schwanniomyces occidentalis (EP 394,538 opublikowany 31 października 1990); i grzyby strzępkowe, takie jak np. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 opublikowany 10 stycznia 1991) i gospodarzy Aspergillus, takich jak A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: [1983]; Tilburn et al., Gene, 26: [1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: [1984]) i A. niger (Kelly i Hynes, EMBO J., 4: [1985]). Odpowiednie są drożdże metylotropowe i obejmują one, ale w sposób nieograniczający,, drożdże zdolne do wzrostu na metanolu, wybrane z rodzaju składającego się z Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis i Rhodotorula. Wykaz specyficznych gatunków, które stanowią przykłady tej klasy drożdży, znaleźć można w C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982). [0172] Odpowiednie komórki gospodarza do ekspresji glikozylowanego IL-17A/F pochodzą z organizmów wielokomórkowych. Przykłady komórek bezkręgowców obejmują komórki

71 70 owadzie, takie jak komórki Drosophila S2 i Spodoptera Sf9 lub Spodoptera High 5, jak również komórki roślinne. Przykłady użytecznych linii komórkowych ssaczych gospodarzy obejmują komórki jajnika chomika chińskiego (CHO) i COS. Bardziej specyficzne przykłady obejmują linię CV1 nerki małpy, transformowanej przez SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linię komórek nerki ludzkiego zarodka (komórki 293 lub 293 subklonowane do wzrostu w hodowli zawiesinowej, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); komórki jajnika chomika chińskiego/-dhfr (CHO, Urlaub i Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 [1980]); mysie komórki Sertoliego (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: [1980]); ludzkie komórki płuc (W138, ATCC CCL 75); ludzkie komórki nerki (Hep G2, HB 8065); i mysiego guza sutka (MMT , ATCC CCL51). Selekcję odpowiedniej komórki gospodarza uznaje się za będącą w zakresie kompetencji znawców dziedziny. 3. Selekcja i Zastosowanie Wektora Replikującego [0173] Kwas nukleinowy (np. cdna lub DNA genomowe) kodujący IL-17A/F można wprowadzać do wektora replikującego się do klonowania (amplifikacji DNA) lub do ekspresji. Różne wektory dostępne są publicznie. Wektory mogą być w postaci, przykładowo, plazmidu, kosmidu, cząstki wirusowej lub faga. Odpowiednie sekwencje kwasu nukleinowego można wprowadzać do wektora za pomocą wielu różnych procedur. Ogólnie, DNA wprowadza się w odpowiednie miejsce (miejsca) restrykcyjne endonukleazy, stosując techniki znane w stanie techniki. Składowe wektora obejmują ogólnie, ale w sposób nieograniczający, jedną lub większą ilość sekwencji sygnałowych, miejsca inicjacji replikacji, jeden lub większą ilość genów markerowych, element wzmacniający, promotor i sekwencję terminacji transkrypcji. Konstrukcja odpowiednich wektorów, zawierających jeden lub większą liczbę tych komponentów, obejmuje techniki standardowej ligacji, znane znawcy. [0174] IL-17A/F można otrzymywać w sposób rekombinacyjny nie tylko bezpośrednio, ale również w postaci polipeptydu fuzyjnego z polipeptydem heterologicznym, który może być sekwencją sygnalną lub innym polipeptydem, mającym specyficzne miejsce rozszczepiania na końcu N dojrzałego białka lub polipeptydu. Ogólnie, sekwencja sygnalna może być składnikiem wektora lub może być częścią DNA kodującego IL-17A/F, która jest wstawiona do wektora. Sekwencja sygnalna może być prokariotyczną sekwencją sygnalną wybraną, przykładowo, z grupy fosfatazy alkalicznej, penicylinazy, lpp lub [sekwencji] liderowych termostabilnej enterotoksyny II. Dla wydzielania drożdżowego sekwencją sygnalną może być, np. [sekwencja] liderowa drożdżowej inwertazy, [sekwencja] liderowa czynnika alfa (włączając [sekwencje] liderowe czynników α Saccharomyces i Kluyveromyces, przy czym tą ostatnią opisano w patencie USA nr 5,010,182) lub [sekwencja] liderowa kwaśnej fosfatazy, [sekwencja] liderowa glukoamylazy C. albicans (EP 362,179, opublikowany 4 kwietnia, 1990) lub sygnałowa, opisana w WO 90/13646, opublikowanym 15 listopada W ekspresji w komórkach ssaczych stosować można ssacze sekwencje sygnalne do kierowania wydzielaniem białka, takie jak sekwencje sygnalne z polipeptydów wydzielanych z tego samego lub powiązanych gatunków, jak również wirusowe, liderowe [sekwencje] wydzielnicze.

72 71 [0175] Zarówno wektory ekspresyjne, jak i klonujące zawierają sekwencję kwasu nukleinowego, która umożliwia replikację wektora w jednej lub większej liczbie wybranych komórek gospodarza. Sekwencje takie są dobrze znane dla wielu różnych bakterii, drożdży i wirusów. Miejsce początku replikacji z plazmidu pbr322 jest odpowiednie dla większości bakterii Gram ujemnych, miejsce początku replikacji plazmidu 2μ jest odpowiednie dla drożdży, a różne wirusowe miejsca początku replikacji (SV40, poliomy, adenowirusa, VSV lub BPV) są użyteczne dla wektorów w komórkach ssaków. [0176] Wektory ekspresyjne i klonujące będą zazwyczaj zawierać gen selekcyjny, nazywany także markerem selekcyjnym. Typowe geny selekcyjne kodują białka, które (a) nadają oporność na antybiotyki lub inne toksyny, np. ampicylinę, neomycynę, metotreksat lub tetracyklinę, (b) komplementują niedobory auksotroficzne lub (c) dostarczają składniki odżywcze o krytycznym znaczeniu, niedostępne z pożywek złożonych, np. gen kodujący racemazę D-alaniny dla Bacilli. [0177] Przykładem markerów selekcyjnych odpowiednich dla komórek ssaczych są te, które umożliwiają identyfikację komórek kompetentnych dla pobrania kwasu nukleinowego kodującego IL-17A/F, takie jak DHFR lub kinaza tymidynowa. Komórką gospodarza odpowiednią przy zastosowaniu dzikiego typu DHFR jest linia komórkowa CHO z niedoborem aktywności DHFR, otrzymana i namnażana jak opisano przez Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). Odpowiednim genem selekcyjnym do stosowania w drożdżach jest gen trp1, obecny w plazmidzie drożdżowym YRp7 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]. Gen trp1 zapewnia marker selekcyjny dla zmutowanego szczepu drożdży, pozbawionego zdolności do wzrostu w obecności tryptofanu, przykładowo, ATCC nr lub PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)]. [0178] Wektory ekspresyjne i klonujące zawierają zazwyczaj promotor połączony operacyjnie z sekwencją kwasu nukleinowego kodującego IL-17A/F do kierowania syntezą mrna. Dobrze znane są promotory rozpoznawane przez wiele różnych potencjalnych komórek gospodarza. Promotory odpowiednie do stosowania z gospodarzami prokariotycznymi obejmują systemy promotorowe β-laktamazy i laktozy [Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel etal., Nature, 281:544 (1979)], fosfatazy alkalicznej, system promotora tryptofanu (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776] i promotory hybrydowe, takie jak promotor tac [deboer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)]. Promotory do zastosowania w systemach bakteryjnych będą również zawierały sekwencję Shine-Dalgarno (S.D.) połączoną operacyjnie z DNA kodującym IL-17A/F. [0179] Przykłady odpowiednich sekwencji promotorowych do stosowania z gospodarzami drożdżowymi obejmują promotory dla kinazy 3-fosfoglicerynianu [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] lub innych enzymów glikolitycznych [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], takich jak enolaza, dehydrogenaza gliceraldehydo-3-fosforanowa, heksokinaza, dekarboksylaza pirogronianowa, fosfofruktokinaza, izomeraza glukozo-6-fosforanowa, mutaza 3-fosfoglicerynianowa, kinaza pirogronianowa, izomeraza triozofosforanowa, izomeraza fosfoglukozowa i glukokinaza.

73 72 [0180] Innymi promotorami drożdżowymi, będącymi promotorami indukowalnymi, które mają dodatkową zaletę polegającą na kontrolowaniu transkrypcji przez warunki wzrostu, są regiony promotorowe dla dehydrogenazy alkoholowej 2, izocytochromu C, kwaśnej fosfatazy, enzymów degradujących, związanych z metabolizmem azotowym, metalotioneiny, dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej oraz enzymów odpowiedzialnych za wykorzystywanie maltozy i galaktozy. Odpowiednie wektory i promotory do zastosowania w ekspresji drożdżowej opisano ponadto w EP 73,657. [0181] Transkrypcję IL-17A/F z wektorów w komórkach gospodarza ssaczych kontrolują, przykładowo, promotory otrzymane z genomów wirusów takich jak wirus polioma, wirus ospy ptasiej (UK 2,211,504 opublikowany 5 lipca 1989), adenowirus (taki jak Adenowirus 2), wirus brodawczaka bydlęcego, ptasi wirus mięsaka, wirus cytomegalii, retrowirus, wirus zapalenia wątroby typu B i małpi wirus 40 (SV40), z heterologicznych promotorów ssaczych, np. promotora aktyny lub promotora immunoglobuliny, z promotorów białek szoku cieplnego, pod warunkiem, że takie promotory są kompatybilne z systemami komórek gospodarza. [0182] Transkrypcję DNA kodującego IL-17A/F przez wyższe eukarionty można zwiększać poprzez wstawienie do wektora sekwencji wzmacniającej. Wzmacniaczami są elementy DNA działające cis, zazwyczaj około od 10 do 300 pz, które działają na promotor dla zwiększania jego transkrypcji. Obecnie znanych jest wiele sekwencji wzmacniających z genów ssaczych (globiny, elestazy, albuminy, α-fetoproteiny i insuliny). Zazwyczaj jednak stosuje się wzmacniacz z wirusa komórek eukariotycznych. Przykłady obejmują wzmacniacz SV40 po późnej stronie miejsca początku replikacji (pz ), wzmacniacz wczesnego promotora wirusa cytomegalii, wzmacniacz polioma po późnej stronie miejsca początku replikacji oraz wzmacniacze adenowirusowy. Wzmacniacz można włączyć do wektora w położeniu 3' lub 5' w stosunku do sekwencji kodującej IL-17A/F, ale korzystnie jest on umiejscowiony po stronie 5' od promotora. [0183] Wektory ekspresyjne stosowane w eukariotycznych komórkach gospodarza (komórki drożdży, grzybów, owadów, roślin, zwierząt, człowieka lub posiadające jądra z innych organizmów wielokomórkowych) będą również zawierały sekwencje wymagane do terminacji transkrypcji i stabilizacji mrna. Takie sekwencje są powszechnie dostępne od 5', a niekiedy 3' regionów niepoddanych translacji z DNA lub cdna eukariotycznych lub wirusowych. Regiony te zawierają odcinki nukleotydowe ulegające transkrypcji w postaci poliadenylowanych fragmentów w niepoddanej translacji części mrna kodującego IL- 17A/F. [0184] Jeszcze inne sposoby, wektory i komórki gospodarza odpowiednie do przystosowania do syntezy IL-17A/F w hodowli rekombinowanych komórek kręgowców opisano w Gething et al., Nature, 293: (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060; i EP 117, Wykrywanie Amplifikacji/Ekspresji Genu

74 73 [0185] Amplifikację i/lub ekspresję genu można mierzyć w próbce bezpośrednio, przykładowo za pomocą konwencjonalnej metody Southern blotting, Northern blotting dla obliczenia transkrypcji mrna (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: [1980]), metody dot-blotting (analiza DNA) lub hybrydyzacji in situ, stosując odpowiednio wyznakowaną sondę, w oparciu o zapewnioną tu sekwencję. Alternatywnie, zastosować można przeciwciała, które mogą rozpoznawać specyficzne dupleksy, włączając dupleksy DNA, dupleksy RNA i hybrydowe dupleksy DNA-RNA lub dupleksy DNA-białko. Przeciwciała z kolei mogą być wyznakowane, a oznaczenie można przeprowadzać, gdy dupleks związany jest do powierzchni, tak że po uformowaniu dupleksu na powierzchni wykrywać można obecność przeciwciała związanego do dupleksu. [0186] Ekspresję genów można mierzyć alternatywnie za pomocą sposobów immunologicznych, takich jak barwienie immunohistochemiczne komórek lub skrawków histologicznych i badanie hodowli komórkowej lub płynów ciała dla bezpośredniego zliczania ekspresji produktu genu. Przeciwciała użyteczne do barwienia immunohistochemicznego i/lub badania próbek płynów mogą być albo monoklonalne, albo poliklonalne i mogą być otrzymywane w dowolnym ssaku. Dla wygody, przeciwciała można otrzymywać względem naturalnej sekwencji polipeptydu IL-17A/F lub względem syntetycznego peptydu opartemu na zapewnionych sekwencjach DNA lub względem sekwencji egzogennej w fuzji z DNA IL- 17A/F i kodującej specyficzny epitop przeciwciała. 5. Oczyszczanie Polipeptydu [0187] Postacie IL_17A/F można odzyskiwać z pożywki hodowlanej lub z lizatów komórek gospodarza. Jeśli są związane z błoną, można je uwalniać z błony stosując odpowiedni roztwór detergentu (np. Triton-X 100) lub za pomocą enzymatycznego rozszczepiania. Komórki zastosowane w ekspresji IL-17A/F można rozrywać za pomocą różnych środków fizycznych lub chemicznych, takich jak cykliczne zamrażanie i rozmrażanie, sonifikacja, rozrywanie mechaniczne lub środki lizujące komórki. [0188] Pożądane może być oczyszczanie IL-17A/F z rekombinowanych białek komórkowych lub polipeptydów. Następujące procedury stanowią przykłady odpowiednich procedur oczyszczania: za pomocą frakcjonowania na kolumnie wymiany jonowej; wytrącanie etanolem; HPLC odwrotnej fazy; chromatografia na żywicy krzemionkowej lub kationowymiennej, takiej jak DEAE; ogniskowanie chromatograficzne; SDS-PAGE; wytrącanie siarczanem amonu; filtracja żelowa z zastosowaniem, przykładowo, Sephadex G- 75; kolumny Sepharose z białkiem A dla usuwania zanieczyszczeń, takich jak IgG; i kolumny chelatującej metale dla wiązania wyznakowanych epitopem postaci IL-17A/F. Zastosować można różne sposoby oczyszczania białka, a takie sposoby znane są w stanie techniki i zostały opisane, przykładowo, w Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982). Wybrany etap (etapy) oczyszczania zależeć będą, przykładowo, od cech zastosowanego procesu otrzymywania i szczególnego, otrzymanego IL-17A/F. E. Zastosowania dla IL_17A/F

75 74 [0189] Sekwencje nukleotydowe (lub do nich komplementarne) kodujące IL-17A/F mają różne zastosowania w dziedzinie biologii molekularnej, włączając zastosowania jako sondy hybrydyzacyjne, w mapowaniu chromosomów lub genów i w wytwarzaniu anty-sensownego RNA i DNA. Kwas nukleinowy IL-17A/F również będzie użyteczny w otrzymywaniu polipeptydów IL-17A/F za pomocą opisanych technik rekombinacyjnych. [0190] Gen dla pełnej długości, naturalnej sekwencji IL-17A/F lub jego część stosować można jako sondy hybrydyzacyjne dla biblioteki cdna do izolowania cdna pełnej długości IL-17A/F lub do izolowania jeszcze innych cdna (przykładowo, kodujących naturalnie występujące warianty IL-17A/F lub IL-17A/F z innych gatunków), które mają pożądaną identyczność sekwencji z ujawnioną sekwencją naturalnego IL-17A/F. Opcjonalnie, długość sond wynosić będzie od około 20 do około 50 zasad. Sondy hybrydyzacyjne można uzyskiwać z co najmniej częściowo nowych regionów pełnej długości, naturalnej sekwencji nukleotydowej, przy czym regiony te można ustalać bez niepotrzebnego eksperymentowania lub z sekwencji genomowych, włączając promotory, elementy wzmacniające i introny z naturalnej sekwencji IL-17A/F. Przykładowo, sposób badania przesiewowego obejmował będzie izolację regionu kodującego z genu IL-17A/F z zastosowaniem znanej sekwencji DNA dla syntezy wybranej sondy [o długości] około 40 zasad. Sondy hybrydyzacyjne można znakować wieloma różnymi znacznikami, włączając radionukleotydy, takie jak 32 P lub 35 S lub znaczniki enzymatyczne, takie jak kwaśna fosfataza sprzężona z sondą via system sprzęgania awidyna/biotyna. Wyznakowane sondy o sekwencji komplementarnej do tej z genu IL-17A/F według wynalazku stosować można do badania przesiewowego bibliotek ludzkiego cdna, genomowego DNA lub mrna dla określania do których członków takich bibliotek hybrydyzuje sonda. Techniki hybrydyzacyjne opisano bardziej szczegółowo w Przykładach, poniżej. [0191] Jakiekolwiek sekwencje EST ujawnione w zgłoszeniu można podobnie stosować jako sondy, stosując opisane sposoby. [0192] Inne użyteczne fragmenty kwasów nukleinowych IL-17A/F obejmują antysensowne lub sensowne oligonukleotydy, zawierające sekwencję jednoniciowego kwasu nukleinowego (RNA lub DNA), zdolne do wiązania się do celu w postaci sekwencji mrna IL-17A/F (sensowne) lub DNA IL-17A/F (antysensowne). Antysensowne lub sensowne oligonukleotydy według wynalazku zawierają fragment regionu kodującego DNA IL-17A/F. Taki fragment zawiera ogólnie co najmniej około 14 nukleotydów, korzystnie od około 14 do 30 nukleotydów. Możliwość uzyskania antysensownego lub sensownego oligonukleotydu w oparciu o sekwencję cdna kodującą dane białko opisano w, przykładowo, Stein i Cohen (Cancer Res. 48:2659, [1988]) oraz van der Krol et al. (BioTechniques, 6:958, [1988]). [0193] Wiązanie antysensownych lub sensownych oligonukleotydów do docelowych sekwencji kwasu nukleinowego skutkuje tworzeniem dupleksów, które blokują transkrypcję lub translację sekwencji docelowej na jeden z kilku sposobów, włączając zwiększoną degradację dupleksów, przedwczesną terminację transkrypcji lub translacji lub na inne sposoby. Antysensowne oligonukleotydy można z tego względu stosować do blokowania ekspresji białek IL-17A/F. Antysensowne lub sensowne oligonukleotydy obejmują ponadto

76 75 oligonukleotydy o zmodyfikowanych szkieletach cukrowo-fosfodiestrowych (lub innych połączeniach cukrowych, tak jak te opisane w WO 91/06629) i przy czym takie połączenia cukrowe są odporne na endogenne nukleazy. Takie oligonukleotydy z połączeniami cukrowymi są stabilne in vivo (tj. zdolne do odporności na degradację enzymatyczną), ale zachowują specyficzność sekwencji dla zdolności wiązania się do docelowych sekwencji nukleotydowych. [0194] Inne przykłady sensownych lub antysensownych oligonukleotydów obejmują te oligonukleotydy, które są przyłączone kowalencyjnie do cząsteczek organicznych, takich jak te opisane w WO 90/10048i innych cząsteczek zwiększających powinowactwo oligonukleotydu dla docelowej sekwencji kwasu nukleinowego, takich jak poli-(l-lizyna). Dodatkowo jeszcze, do sensownych lub antysensownych oligonukleotydów przyłączać można środki interkalujące, takie jak eliptycyna oraz środki alkilujące lub kompleksy metali dla modyfikowania specyficzności wiązania antysensownego lub sensownego oligonukleotydu do docelowej sekwencji nukleotydowej. [0195] Antysensowne lub sensowne oligonukleotydy wprowadzać można do komórki zawierającej docelową sekwencję kwasu nukleinowego za pomocą sposobu transferu genów, włączając, przykładowo, tranfsekcję DNA za pośrednictwem CaPO 4, elektroporację lub stosując wektory do transferu genów, takie jak wirus Epsteina-Barra. W korzystnej procedurze antysensowny lub sensowny oligonukleotyd wprowadza się do odpowiedniego wektora retrowirusowego. Komórkę zawierającą docelową sekwencję kwasu nukleinowego kontaktuje się z rekombinowanym wektorem retrowirusowym, in vivo lub ex vivo. Odpowiednie wektory rekombinacyjne obejmują, ale w sposób nieograniczający, te pochodzące od mysiego retrowirusa M-MuLV, N2 (retrowirus wyprowadzony z M-MuLV), lub wektory dwukopijne, nazwane DCT5A, DCT5B i DCT5C (patrz WO 90/13641). [0196] Sensowne lub antysensowne oligonukleotydy wprowadzać można również do komórki zawierającej docelową sekwencję nukleotydową, poprzez tworzenie koniugatu z cząsteczką wiążącą ligand, jak opisano w WO 91/ Odpowiednie cząsteczki wiążące ligand obejmują, ale w sposób nieograniczający, receptory powierzchniowe komórki, czynniki wzrostu, inne cytokiny lub inne ligandy wiążące receptory powierzchniowe komórki. Korzystnie, sprzężenie cząsteczki wiążącej ligand nie zakłóca zasadniczo zdolności cząsteczki wiążącej ligand do wiązania się do odpowiedniej dla niej cząsteczki lub receptora lub blokowania wnikania sensownego lub antysensownego oligonukleotydu lub jego wersji koniugatowej do komórki. [0197] Alternatywnie, sensowny lub antysensowny oligonukleotyd wprowadzać można do komórki zawierającej docelową sekwencję kwasu nukleinowego, poprzez tworzenie kompleksu oligonukleotyd-lipid, jak opisano w WO 90/ Korzystnie, kompleks sensowny lub antysensowny oligonukleotyd-lipid jest rozszczepiany w obrębie komórki przez endogenną lipazę. [0198] Cząsteczki sensownego lub antysensownego RNA lub DNA mają ogólnie co najmniej około 5 zasad długości, około 10 zasad długości, około 15 zasad długości, około 20 zasad

77 76 długości, około 25 zasad długości, około 30 zasad długości, około 35 zasad długości, około 40 zasad długości, około 45 zasad długości, około 50 zasad długości, około 55 zasad długości, około 60 zasad długości, około 65 zasad długości, około 70 zasad długości, około 75 zasad długości, około 80 zasad długości, około 85 zasad długości, około 90 zasad długości, około 95 zasad długości, około 100 zasad długości lub więcej. [0199] Sondy można również stosować w technikach PCR do wytwarzania puli sekwencji dla identyfikacji blisko powiązanych sekwencji kodujących IL-17A/F. [0200] Sekwencje nukleotydowe kodujące IL-17A/F można również stosować do konstrukcji sond hybrydyzacyjnych do mapowania genu kodującego ten IL-17A/F i do analiz genetycznych osobników z zaburzeniami genetycznymi. Zapewnione sekwencje nukleotydowe można mapować do chromosomu i specyficznych regionów chromosomu stosując znane techniki, takie jak hybrydyzacja in situ, analiza połączenia względem znanych markerów chromosomalnych i badania przesiewowe hybrydyzacji z bibliotekami. [0201] Gdy sekwencje kodujące dla IL-17A/F kodują białko wiążące inne białko (przykładowo, gdy białkiem jest receptor), białko można stosować w badaniu dla identyfikacji innych białek lub cząsteczek zaangażowanych w oddziaływanie wiążące. Za pomocą takich sposobów identyfikować można oddziaływanie wiążące inhibitorów receptora/liganda. Białka zaangażowane w takie oddziaływania wiążące można również stosować do badania przesiewowego pod kątem peptydowych lub drobnocząsteczkowych inhibitorów lub agonistów oddziaływania wiążącego. Białko receptorowe można również stosować do izolacji korelatywnego liganda (ligandów). Badania przesiewowe można projektować do znajdowania związków ołowiu naśladujących aktywność biologiczną naturalnego IL-17A/F lub receptora dla IL-17A/F. Takie badania przesiewowe obejmować będą badania dostępne do wysokowydajnego badania przesiewowego bibliotek chemicznych, czyniąc je szczególnie odpowiednimi do identyfikowania drobnocząsteczkowych lekówkandydatów. Brane pod uwagę drobne cząsteczki obejmują syntetyczne związki organiczne i nieorganiczne. Badania można przeprowadzać w wielu różnych formatach, włączając oznaczenia oddziaływań białko-białko, biochemiczne badania przesiewowe, badania immunologiczne i badania oparte na komórkach, które dobrze charakteryzowano w stanie techniki. [0202] Kwasy nukleinowe kodujące IL-17A/F lub ich postacie zmodyfikowane stosować można również do wytwarzania zwierząt transgenicznych innych niż ludzie lub zwierząt pozbawionych [genu] (ang. knock out) innych niż ludzie, które z kolei są użyteczne w opracowywaniu i badaniu przesiewowym odczynników użytecznych terapeutycznie. Zwierzę transgeniczne (np. mysz lub szczur) oznacza zwierzę o komórkach zawierających transgen, przy czym transgen wprowadzono do zwierzęcia lub przodka zwierzęcia na etapie przedurodzeniowym, np. zarodkowym. Transgen jest DNA wkomponowanym w genom komórki, z której rozwija się zwierzę transgeniczne. W jednym z przykładów wykonania, cdna kodujące IL-17A/F stosować można do klonowania DNA genomowego kodującego IL-17A/F według ustalonych technik oraz sekwencji genomowych stosowanych do wytwarzania zwierząt transgenicznych, które zawierają komórki ekspresjonujące DNA

78 77 kodujące IL-17A/F. Sposoby wytwarzania zwierząt transgenicznych, szczególnie zwierząt takich jak mysz lub szczur, stały się konwencjonalnymi w stanie techniki i są opisane, przykładowo, w patentach USA nr 4,736,866 i 4,870,009. Poszczególne komórki będą zazwyczaj ukierunkowywane na inkorporację transgenu IL-17A/F za pomocą wzmacniaczy specyficznych tkankowo. Zwierzęta transgeniczne, zawierające kopię transgenu kodującego IL-17A/F wprowadzonego do linii zarodkowej zwierzęcia na etapie zarodkowym, stosować można do badania efektu zwiększonej ekspresji DNA kodującego IL-17A/F. Takie zwierzęta stosować można jako zwierzęta testowe dla odczynników uważanych za nadające ochronę przed, przykładowo, patologicznymi stanami chorobowymi związanymi z jego nadekspresją. W związku z tym zwierzę leczy się odczynnikiem, a zmniejszona częstość patologicznego stanu chorobowego w porównaniu do zwierząt nieleczonych noszących transgen będzie wskazywała na potencjalną interwencję terapeutyczną dla patologicznego stanu chorobowego. [0203] Alternatywnie, inne niż ludzkie homologi IL-17A/F stosować można do tworzenia zwierzęcia pozbawionego IL-17A/F, które ma wadliwy lub zmieniony gen kodujący IL- 17A/F w wyniku rekombinacji homologicznej między genem endogennym, kodującym IL- 17A/F, a zmienionym DNA genomowym, kodującym IL-17A/F wprowadzone do zarodkowych komórek macierzystych zwierzęcia. Przykładowo, cdna kodujące IL-17A/F stosować można do klonowania DNA genomowego, kodującego IL-17A/F, według ustalonych technik. Część DNA genomowego kodującego IL-17A/F można usunąć lub zastąpić innym genem, takim jak gen kodujący marker selektywny, który można zastosować do monitorowania wprowadzenia. Zazwyczaj, w wektorze zawartych jest kilka kilozasad niezmienionego DNA flankującego (na końcach 5' i 3') [patrz, np. Thomas i Capecchi, Cell, 51:503 (1987) pod kątem opisu wektorów do rekombinacji homologicznej]. Wektor wprowadza się do linii macierzystych komórek zarodkowych (np. poprzez elektroporację) i wybiera się komórki, w których wprowadzone DNA zrekombinowało homologicznie z endogennym DNA [patrz, np. Li et al., Cell, 69:915 (1992)]. Wybrane komórki wstrzykuje się następnie do blastocysty zwierzęcia (np. myszy lub szczura) dla utworzenia chimer agregacyjnych [patrz, np. Bradley, w Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, red. E. J. Robertson (IRL, Oxford, 1987), str ]. Chimeryczny zarodek można następnie implantować odpowiedniej samicy-przybranej matce w ciąży rzekomej dla utworzenia zwierzęcia "knock-out" z donoszonego zarodka. Potomstwo noszące DNA zrekombinowane homologicznie w swoich komórkach zarodkowych można identyfikować standardowymi technikami i stosować do hodowania zwierząt, w których wszystkie komórki zwierzęcia zawierają DNA zrekombinowane homologicznie. Zwierzęta "knock-out" można charakteryzować, przykładowo, pod kątem ich zdolności do obrony przed niektórymi patologicznymi stanami chorobowymi i pod kątem rozwoju ich patologicznych stanów chorobowych, wynikających z nieobecności polipeptydu IL-17A/F. [0204] Kwas nukleinowy kodujący polipeptydy IL-17A/F można również stosować w terapii genowej. Do zastosowań w terapii genowej, geny wprowadza się do komórek dla uzyskania syntezy in vivo terapeutycznie skutecznego produktu genetycznego, przykładowo, do zastąpienia wadliwego genu. Terapia genowa obejmuje zarówno konwencjonalną terapię genową, w której trwały skutek uzyskuje się poprzez pojedyncze leczenie i podawanie

79 78 środków terapii genowej, obejmujące jednorazowe lub powtarzane podawanie leczniczo skutecznego DNA lub mrna. Antysensowne RNA i DNA stosować można jako środki lecznicze do blokowania in vivo ekspresji niektórych genów. Wykazano już, że do komórek można wprowadzać krótkie oligonukleotydy antysensowne, gdzie działają one w roli inhibitorów, pomimo ich niskich stężeń wewnątrzkomórkowych, spowodowanych ich ograniczoną absorpcją przez błonę komórkową. (Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: [1986]). Oligonukleotydy można modyfikować dla zwiększenia ich wychwytu, np. poprzez podstawianie ich ujemnie naładowanych grup fosfodiestrowych grupami nienaładowanymi. [0205] Istnieje wiele różnych dostępnych technik wprowadzania kwasów nukleinowych do żywotnych komórek. Techniki te różnią się w zależności od tego, czy kwas nukleinowy jest przekazywany do komórek hodowanych in vivo czy in vitro w komórkach danego gospodarza. Techniki odpowiednie do transferu kwasu nukleinowego do komórek ssaczych in vitro obejmują zastosowanie liposomów, elektroporacji, mikroiniekcji, fuzji komórek, DEAEdekstranu, sposobu precypitacji fosforanem wapnia itd. Obecnie, korzystne techniki transferu genów in vivo obejmują transfekcję wektorami wirusowymi (zazwyczaj retrowirusowymi) i transfekcję za pośrednictwem białka płaszcza wirusowego-liposomu (Dzau et al., Trends in Biotechnology, 11: [1993]). W niektórych sytuacjach pożądane jest zapewnienie źródła kwasu nukleinowego ze środkiem, który ukierunkowany jest na komórki docelowe, takiego jak przeciwciało specyficzne wobec białka błonowego z powierzchni komórki lub komórki docelowej, ligand dla receptora na komórce docelowej itd. Kiedy stosuje się liposomy, białka wiążące się do błonowego białka z powierzchni komórki, związanego z endocytozą stosować można do ukierunkowywania i/lub do ułatwiania wychwytu np. białek kapsydu lub ich fragmentów tropowych dla szczególnego typu komórek, przeciwciał dla białek przechodzących cykliczną internalizację, białek ukierunkowanych na lokalizację wewnątrzkomórkową i zwiększających wewnątrzkomórkowy okres półtrwania. Technikę endocytozy za pośrednictwem receptora opisano, przykładowo, przez Wu et al., J. Biol. Chem., 262: (1987); i Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: (1990). Dla zapoznania się z przeglądem protokołów dotyczących znakowania genów i terapii genowej patrz Anderson et al., Science, 256: (1992). [0206] Opisane polipeptydy IL-17A/F można również stosować jako markery masy cząsteczkowej do celów elektroforezy białek, a wyizolowane sekwencje kwasów nukleinowych można stosować do rekombinacyjnej ekspresji tych markerów. [0207] Cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące opisane polipeptydy IL-17A/F lub ich fragmenty są użyteczne do identyfikacji chromosomowej. W związku z tym istnieje ciągła potrzeba identyfikacji nowych markerów chromosomowych, ponieważ obecnie dostępnych jest stosunkowo niewiele odczynników znakujących chromosomy, opartych na aktualnych danych sekwencyjnych. Każdą cząsteczkę kwasu nukleinowego IL-17A/F według wynalazku można zastosować jako marker chromosomowy. [0208] Polipeptydy IL-17A/F i cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku można również stosować diagnostycznie do typowania tkankowego, gdzie polipeptydy IL-17A/F

80 79 według wynalazku mogą być ekspresjonowane inaczej w jednej tkance w porównaniu do innej, korzystnie w chorej tkance w porównaniu z tkanką zdrową z tkanki tego samego typu. Cząsteczki kwasu nukleinowego IL-17A/F znajdą zastosowanie do wytwarzania sond do PCR, analizy typu Northern, analizy typu Southern i analizy typu Western. [0209] Opisane polipeptydy IL-17A/F można również stosować jako środki terapeutyczne. Polipeptydy IL-17A/F według wynalazku można formułować według znanych sposobów dla otrzymywania kompozycji użytecznych farmaceutycznie, przy czym produkt IL-17A/F połączony jest w domieszce z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. Formulacje terapeutyczne przygotowuje się do przechowywania poprzez mieszanie składnika aktywnego o pożądanym stopniu czystości z opcjonalnymi, fizjologicznie dopuszczalnymi nośnikami, rozczynnikami lub stabilizatorami (Remington's Pharmaceutical Sciences, wydanie 16-te, Red. Osol, A. (1980)), w postaci formulacji liofilizowanych lub roztworów wodnych. Dopuszczalne nośniki, rozczynniki lub stabilizatory są nietoksyczne dla przyjmującego w zastosowanych dawkowaniach i stężeniach i obejmują bufory, takie jak fosforanowy, cytrynianowy i innych kwasów organicznych; przeciwutleniacze, włączając kwas askorbinowy; polipeptydy o niskiej masie cząsteczkowej (mniej niż około 10 reszt); białka, takie jak albumina surowicy, żelatyna lub immunoglobuliny; polimery hydrofilowe, takie jak poliwinylopirolidon; aminokwasy, takie jak glicyna, glutamina, asparagina, arginina lub lizyna; monosacharydy, disacharydy i inne węglowodany, włączając glukozę, mannozę lub dekstryny; środki chelatujące, takie jak EDTA; alkohole cukrowe, takie jak mannitol lub sorbitol; przeciwjony tworzące sole, takie jak sodu; i/lub surfaktanty niejonowe, takie jak TWEEN, PLURONICS lub PEG. [0210] Formulacje do stosowania w podawaniu in vivo muszą być sterylne. Jest to łatwo osiągalne poprzez filtrację przez sterylne membrany filtracyjne, przed lub po liofilizacji i ponownym rozpuszczaniu. [0211] Terapeutyczne kompozycje umieszcza się na ogół w pojemniku mającym jałowe miejsce dostępu, przykładowo w torebce dla roztworu dożylnego lub fiolce mającej zatyczkę, którą można przekłuć igłą do iniekcji podskórnej. [0212] Droga podawania jest zgodna ze znanymi sposobami, np. iniekcją lub infuzją drogami dożylną, dootrzewnową, do mózgu, domięśniową, do oka, dotętniczą lub doogniskową, podawaniem miejscowym lub przez system przedłużonego uwalniania. [0213] Dawkowania i pożądane stężenia leku z kompozycjami farmaceutycznymi według wynalazku mogą się różnić, w zależności od poszczególnego, przewidzianego zastosowania. Określenie odpowiedniego dawkowania lub dróg podawania leży w zakresie kompetencji lekarza. Doświadczenia na zwierzętach zapewniają rzetelne wytyczne dla ustalania dawek skutecznych do leczenia ludzi. Międzygatunkowe skalowanie skutecznych dawek przeprowadzać można postępując zgodnie z regułami podanymi przez Mordenti, J. i Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" w Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., wyd., Pergamon Press, New York 1989, str

81 80 [0214] Gdy stosuje się podawanie in vivo polipeptydu IL-17A/F lub jego agonisty lub antagonisty, prawidłowe, dawkowane ilości mogą mieścić się w zakresie od około 10 ng/kg do 100 mg/kg masy ciała ssaka lub więcej na dzień, korzystnie około 1 µg/kg/dzień do 10 mg/kg/dzień, w zależności od drogi podawania. Wytyczne dla poszczególnych dawkowań i sposobów dostarczania zapewniono w literaturze; patrz, przykładowo, Patenty USA nr 4,657,760; 5,206,344; lub 5,225,212. Przewiduje się, że różne formulacje będą skuteczne dla różnych związków leczniczych i różnych zaburzeń, że podawanie ukierunkowane na jeden organ lub tkankę, przykładowo, może czynić koniecznym dostarczanie w sposób odmienny od tego dla innego organu lub tkanki. [0215] Gdy podawanie polipeptydu IL-17A/F o wydłużonym uwalnianiu jest pożądane w formulacji z charakterystyką uwalniania odpowiednią do leczenia dowolnej choroby lub zaburzenia wymagającego podawania polipeptydu IL-1A/F, pod uwagę bierze się mikrokapsulację polipeptydu IL-17A/F. Mikrokapsulację rekombinowanych białek do wydłużonego uwalniania przeprowadzano z sukcesem z ludzkim hormonem wzrostu (rhgh), interferonem-(rhifn-), interleukiną-2 i MN rgp120. Johnson et al., Nat. Med., 2: (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27: (1993); Hora et al., Bio/Technology, 8: (1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems," w Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, red. Powell i Newman (Plenum Press: New York, 1995), pp ; WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; i patent USA nr 5,654,010. [0216] Formulacje o wydłużonym uwalnianiu tych białek opracowano stosując kopolimer kwasu polimlekowego i glikolowego (PLGA) ze względu na jego biokompatybilność i szeroki zakres właściwości biodegradowalności. Produkty biodegradacji PLGA, kwasy mlekowy i glikolowy, mogą być szybko uprzątane w ludzkim ciele. Ponadto, degradowalność tego polimeru można dostosowywać, od miesięcy do lat, w zależności od jego masy cząsteczkowej i kompozycji. Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer," w: M. Chasin i R. Langer (Red.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery-Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), str [0217] Wynalazek ten obejmuje sposoby badania przesiewowego związków dla identyfikowania tych, które naśladują (agoniści) polipeptyd IL-17A/F lub zapobiegają działaniu (antagoniści) polipeptydu IL-17A/F. Badania przesiewowe pod kątem leków antagonistycznych-kandydatów projektuje się do identyfikowania związków, które wiążą się lub tworzą kompleksy z polipeptydami IL-17A/F kodowanymi przez zidentyfikowane geny lub w inny sposób przeszkadzają w oddziaływaniu kodowanych polipeptydów z innymi białkami komórkowymi. Takie badania przesiewowe obejmować będą badania dostępne do wysokowydajnego badania przesiewowego bibliotek chemicznych, czyniąc je szczególnie odpowiednimi do identyfikowania drobnocząsteczkowych leków-kandydatów. [0218] Badania można przeprowadzać w wielu różnych formatach, włączając oznaczenia oddziaływań białko-białko, biochemiczne badania przesiewowe, badania immunologiczne i badania oparte na komórkach, które dobrze charakteryzowano w stanie techniki.

82 81 [0219] Wspólne dla wszystkich badań pod kątem antagonistów jest to, że wymagają one kontaktowania kandydata na lek z polipeptydem IL-17A/F, kodowanym przez zidentyfikowany kwas nukleinowy, w warunkach i czasie wystarczającym dla umożliwienia oddziaływania tych dwóch komponentów. [0220] W badaniach wiązania oddziaływaniem jest wiązanie, a utworzony kompleks można izolować lub wykrywać w mieszaninie reakcyjnej. W szczególnym przykładzie wykonania, polipeptyd IL-17A/F, kodowany przez zidentyfikowany gen, lub kandydat na lek immobilizuje się na fazie stałej, np. na płytce do mikromiareczkowania, poprzez przyłączenia kowalencyjne lub niekowalencyjne. Przyłączenia niekowalencyjnego dokonuje się ogólnie pokrywając stałą powierzchnię roztworem polipeptydu IL-17A/F i osuszając. Alternatywnie, immobilizowane przeciwciało, np. przeciwciało monoklonalne, swoiste wobec polipeptydu IL-17A/F, który ma być immobilizowany, stosować można do zakotwiczenia go do powierzchni stałej. Badanie to przeprowadza się dodając komponent nieimmobilizowany, który może być wyznakowany wykrywalnym znacznikiem, do komponentu immobilizowanego, np. pokrytej powierzchni, zawierającej zakotwiczony komponent. Gdy reakcja jest zakończona, komponenty nieprzereagowane usuwa się, np. poprzez odpłukiwanie, a kompleksy zakotwiczone na stałej powierzchni wykrywa się. Gdy wyjściowo nieimmobilizowany komponent ma wykrywalny znacznik, wykrywanie znacznika immobilizowanego na powierzchni wskazuje, że doszło do utworzenia kompleksu. Gdy wyjściowo nieimmobilizowany komponent nie ma znacznika, utworzenie kompleksu można wykrywać, przykładowo, stosując wyznakowane przeciwciało swoiście wiążące zimmobilizowany kompleks. [0221] Jeśli kandydat na związek oddziałuje z, ale nie wiąże się do szczególnego polipeptydu IL-17A/F kodowanego przez zidentyfikowany gen, jego oddziaływanie z tym polipeptydem można badać sposobami dobrze znanymi dla wykrywania oddziaływań białko-białko. Takie oznaczenia obejmują podejścia tradycyjne, takie jak np. sieciowanie, koimmunoprecypitację i kooczyszczanie poprzez kolumny gradientowe lub chromatograficzne. Dodatkowo, oddziaływania białko-białko można monitorować stosując system genetyczny oparty na drożdżach, opisany przez Fields i współpracowników (Fields i Song, Nature (London), 340: [1989]); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: [1991]), jak ujawniono przez Chevray i Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: (1991). Wiele aktywatorów transkrypcyjnych, takich jak drożdżowy GAL4, składa się z dwóch fizycznie odrębnych domen modułowych, przy czym jedna działa jako domena wiążąca DNA, druga funkcjonuje jako domena aktywująca transkrypcję. Drożdżowy system ekspresyjny, opisany we wcześniejszych publikacjach (określany ogólnie jako "system dwuhybrydowy"), wykorzystuje tą właściwość i stosuje dwa białka hybrydowe, jedno w którym docelowe białko przyłączone jest do domeny wiążącej DNA z GAL4 oraz drugie, w którym białka aktywujące-kandydaci związani są do domeny aktywacyjnej. Ekspresja genu reporterowego GAL1-lacZ pod kontrolą promotora aktywowanego GAL4 zależy od rekonstytucji aktywności GAL4 via oddziaływanie białko-białko. Kolonie zawierające oddziałujące polipeptydy wykrywa się za pomocą chromogennego substratu dla β-galaktozydazy. Kompletny zestaw (MATCHMAKER ) do identyfikacji oddziaływań białko-białko między

83 82 dwoma specyficznymi białkami z zastosowaniem techniki dwuhybrydowej dostępny jest handlowo od Clontech. System ten można również rozszerzyć dla mapowania domen białka zaangażowanych w specyficzne oddziaływania białkowe, jak również dla dokładnego określenia reszt aminokwasowych, które są kluczowe dla tych oddziaływań. [0222] Związki, które zakłócają oddziaływanie zidentyfikowanego genu kodującego polipeptyd IL-17A/F i innych wewnątrz- lub zewnątrzkomórkowych komponentów można testować następująco: zazwyczaj przygotowuje się mieszaninę reakcyjną zawierającą produkt genu i komponent wewnątrz- lub zewnątrzkomórkowy w warunkach i czasie pozwalającym na oddziaływanie i wiązanie dwóch produktów. Dla testowania zdolności związku-kandydata do hamowania wiązania reakcję przeprowadza się w nieobecności i w obecności związku testowego. Dodatkowo, do trzeciej mieszaniny reakcyjnej dodawać można placebo, aby służyło jako kontrola pozytywna. Wiązanie (tworzenie kompleksu) między związkiem testowym a komponentem wewnątrz- lub zewnątrzkomórkowym, obecnym w mieszaninie, monitoruje się jak opisano powyżej. Tworzenie kompleksu w reakcji (reakcjach) kontrolnych, ale nie w mieszaninie reakcyjnej zawierającej związek testowy wskazuje, że związek testowy zaburza oddziaływanie związku testowego i jego partnera reakcyjnego. [0223] Dla badania pod kątem antagonistów, polipeptyd IL-17A/F można dodawać do komórki razem ze związkiem mającym być badanym przesiewowo pod kątem szczególnej aktywności, a zdolność związku do hamowania aktywności będącej przedmiotem zainteresowania w obecności polipeptydu IL-17A/F wskazuje, że związek jest antagonistyczny wobec polipeptydu IL-17A/F. Alternatywnie, antagonistów można wykrywać łącząc polipeptyd IL-17A/F i potencjalnego antagonistę ze związanymi z błoną receptorami polipeptydu IL-17A/F lub receptorami rekombinowanymi w warunkach odpowiednich do badania hamowania kompetycyjnego. Polipeptyd IL-17A/F można wyznakować, tak jak poprzez radioaktywność, tak że liczne cząsteczki polipeptydu IL-17A/F związane do receptora stosować można do określania skuteczności potencjalnego antagonisty. Gen kodujący receptor identyfikować można licznymi sposobami znanymi znawcom stanu techniki, przykładowo, procedurą przeszukiwania liganda [ang. panning] i sortowania FACS. Coligan et al., Current Protocols in Immun., 1(2): Rozdział 5 (1991). Korzystnie, stosuje się klonowanie ekspresyjne, w którym poliadenylowane RNA otrzymuje się z komórek odpowiadających na polipeptyd IL-17A/F, a bibliotekę cdna utworzoną z tego RNA dzieli się na pule i stosuje do transfekowania komórek COS lub innych komórek, które nie odpowiadają na polipeptyd IL-17A/F. Transfekowane komórki hoduje się na szkiełkach i eksponuje na wyznakowany polipeptyd IL-17A/F. Polipeptyd IL-17A/F można znakować wieloma różnymi sposobami, włączając jodowanie lub wprowadzanie miejsca rozpoznania dla miejscowo specyficznej kinazy białkowej. Po utrwaleniu i inkubacji, płytki poddawane są analizie autoradiograficznej. Identyfikuje się pule pozytywne, a sub-pule przygotowuje i retransfekuje stosując proces interaktywnego tworzenia sub-puli i ponownego badania przesiewowego, dającego ostatecznie pojedynczy klon kodujący domniemany receptor. [0224] W alternatywnym podejściu dla identyfikacji receptora, wyznakowany polipeptyd IL- 17A/F można przyłączyć poprzez fotopowinowactwo do błony komórkowej lub

84 83 wyekstrahować preparaty ekspresjonujące cząsteczkę receptora. Usieciowany materiał rozdzielić za pomocą PAGE i na naświetlić na kliszę rentgenowską. Wyznakowany kompleks zawierający receptor można wyciąć, rozdzielić na fragmenty peptydowe i poddać mikrosekwencjonowaniu białek. Sekwencja aminokwasowa uzyskana z mikrosekwencjonowania stosowana będzie do zaprojektowania zestawu zdegenerowanych sond oligonukleotydowych do badania przesiewowego biblioteki cdna pod kątem identyfikacji genu kodującego domniemany receptor. [0225] W innym badaniu pod kątem antagonistów, komórki ssacze lub preparaty błon wykazujących receptor inkubowane będą z wyznakowanym polipeptydem IL-17A/F w obecności związku-kandydata. Następnie będzie można mierzyć zdolność związku do wzmacniania lub blokowania tego oddziaływania. [0226] Bardziej specyficzne przykłady potencjalnych antagonistów obejmują oligonukleotyd wiążący się do fuzji immunoglobuliny z polipeptydem IL-17A/F oraz, w szczególności, przeciwciała, włączając bez ograniczania, przeciwciała poli- i monoklonalne oraz fragmenty przeciwciał, przeciwciała jednołańcuchowe, przeciwciała anty-idiotypowe i chimeryczne lub humanizowane wersje takich przeciwciał lub fragmentów, jak również ludzkie przeciwciała i fragmenty przeciwciał. Alternatywnie, potencjalny antagonista może być białkiem blisko spokrewnionym, przykładowo, zmutowaną postacią polipeptydu IL-17A/F, która rozpoznaje receptor, ale nie wywiera wpływu, a zatem kompetycyjnie hamuje działanie polipeptydu IL- 17A/F. [0227] Innym potencjalnym antagonistą polipeptydu IL-17A/F jest konstrukt antysensownego RNA lub DNA, otrzymany z zastosowaniem technologii antysensownej, w której cząsteczka antysensownego RNA lub DNA działa dla bezpośredniego blokowania translacji mrna poprzez hybrydyzowanie do docelowego mrna i zapobieganie translacji białka. Technologię antysensowną można stosować do kontrolowania ekspresji genów poprzez tworzenie potrójnej helisy lub antysensownego DNA lub RNA, przy czym oba z tych sposobów oparte są na wiązaniu polinukleotydu do DNA lub RNA. Przykładowo, część kodującą 5' sekwencji polinukleotydowej, która koduje dojrzałe polipeptydy IL-17A/F, stosuje się do projektowania antysensownych oligonukleotydów RNA o długości od około 10 do 40 par zasad. Oligonukleotyd DNA projektuje się, aby był komplementarny do regionu genu zaangażowanego w transkrypcję (potrójna helisa - patrz Lee et al., Nucl. Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney et al., Science, 241:456 (1988); Dervan et al., Science, 251:1360 (1991)), zapobiegając w ten sposób transkrypcji i wytwarzaniu polipeptydu IL-17A/F. Antysensowny oligonukleotyd RNA hybrydyzuje do mrna in vivo i blokuje translację cząsteczki mrna do polipeptydu IL-17A/F (antysensowny - Okano, Neurochem., 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988). Oligonukleotydy opisane powyżej można również dostarczać do komórek, tak że można ekspresjonować antysensowne RNA lub DNA in vivo dla hamowania wytwarzania polipeptydu IL-17A/F. Kiedy stosuje się DNA, korzystne są oligodeoksyrybonukleotydy pochodzące z miejsca początku translacji, np. między pozycjami około -10 i +10 sekwencję nukleotydowej docelowego genu.

85 84 [0228] Potencjalni antagoniści obejmują drobne cząsteczki wiążące się do miejsca aktywnego, miejsca wiązania receptora lub czynnika wzrostu, lub innego istotnego miejsca wiązania z polipeptydu IL-17A/F, blokujące w ten sposób prawidłową aktywność biologiczną polipeptydu IL-17A/F. Przykłady drobnych cząsteczek obejmują, ale w sposób nieograniczający, małe peptydy lub cząsteczki podobne do peptydów, korzystnie peptydy rozpuszczalne i syntetyczne, niepeptydowe związki organiczne lub nieorganiczne. [0229] Rybozymy są enzymatycznymi cząsteczkami RNA, zdolnymi do katalizowania specyficznego rozszczepiania RNA. Rybozymy działają poprzez sekwencyjnie specyficzną hybrydyzację do komplementarnego, docelowego RNA, po której następuje rozszczepianie endonukleolityczne. Specyficzne, rybozymowe miejsca cięcia w obrębie potencjalnego, docelowego RNA identyfikować można znanymi technikami. Dla zapoznania się z dalszymi szczegółami patrz Rossi, Current Biology, 4: (1994) i Publikacja PCT nr WO 97/33551 (opublikowana 18 września 1997). [0230] Cząsteczki kwasu nukleinowego w formacji trzech helis, stosowane do hamowania transkrypcji, powinny być jednoniciowe i złożone z deoksynukleotydów. Podstawowy skład tych oligonukleotydów projektuje się dla promowania tworzenia potrójnej helisy via regułę parowania zasad Hoogsteena, która wymaga ogólnie znacznych rozciągnięć puryn lub pirymidyn jednej z nici dupleksu. Dla zapoznania się z dalszymi szczegółami patrz, np. Publikacja PCT nr WO 97/33551, supra. [0231] Te małe cząsteczki można identyfikować za pomocą jednego lub większej liczby badań przesiewowych omówionych powyżej i/lub za pomocą jakichkolwiek innych technik przesiewowych, dobrze znanych znawcom stanu techniki. [0232] Zastosowania diagnostyczne i terapeutyczne ujawnionych cząsteczek mogą opierać się również na pozytywnych wynikach badań funkcjonalnych, ujawnionych i opisanych poniżej. F. Rozmieszczenie Tkanek [0233] Umiejscowienie tkanek ekspresjonujących IL-17A/F można identyfikować określając ekspresję mrna w różnych, ludzkich tkankach. Umiejscowienie takich genów dostarcza informacji o tym, które tkanki mają największe prawdopodobieństwo znalezienia się pod wpływem stymulujących i hamujących aktywności polipeptydów IL-17A/F. Umiejscowienie genu w danej tkance dostarcza również próbki tkanki dla omówionych poniżej badań aktywności blokowania. [0234] Jak zauważono wcześniej, ekspresję genu w różnych tkankach można mierzyć za pomocą konwencjonalnego sposobu Southern blotting, Northern blotting, dla obliczenia transkrypcji mrna (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: [1980]), sposobu "dot-blotting" (analizy DNA) lub hybrydyzacji in situ, stosując odpowiednio wyznakowaną sondę, w oparciu o zapewnione tu sekwencje. Alternatywnie, zastosować można przeciwciała, które mogą rozpoznawać specyficzne dupleksy, włączając dupleksy DNA, dupleksy RNA i hybrydowe dupleksy DNA-RNA lub dupleksy DNA-białko.

86 85 [0235] Ekspresję genów w różnych tkankach można mierzyć alternatywnie za pomocą sposobów immunologicznych, takich jak barwienie immunohistochemiczne skrawków histologicznych i badanie hodowli komórkowej lub płynów ciała dla bezpośredniego zliczania ekspresji produktu genowego. Przeciwciała użyteczne do barwienia immunohistochemicznego i/lub badania próbek płynów mogą być monoklonalne lub poliklonalne i mogą być otrzymywane w dowolnym ssaku. Dla wygody, przeciwciała można otrzymywać względem naturalnej sekwencji polipeptydu IL-17A/F lub względem peptydu syntetycznego, opartego na sekwencjach DNA kodujących polipeptyd IL-17A/F lub względem sekwencji egzogennej w fuzji z DNA kodującym polipeptyd IL-17A/F i kodującej specyficzny epitop przeciwciała. Poniżej podano ogólne techniki wytwarzania przeciwciał i specjalne protokoły dla Northern blotting i hybrydyzacji in situ. G. Badania Wiązania Przeciwciał [0236] Aktywność polipeptydów IL-17A/F można ponadto weryfikować poprzez badania wiązania przeciwciał, w których testuje się zdolność przeciwciał anty-il-17a/f do hamowania wpływu polipeptydów IL-17A/F, odpowiednio, na komórki tkanki. Przykładowe przeciwciała obejmują przeciwciała poliklonalne, monoklonalne, humanizowane, bispecyficzne i heterokoniugaty, których otrzymywanie zostanie opisane poniżej. [0237] Badania wiązania przeciwciał można przeprowadzać dowolnym, znanym sposobem badania, takim jak badanie wiązania kompetycyjnego, bezpośrednie i pośrednie oznaczenia kanapkowe i oznaczenia immunoprecypitacyjne. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, str (CRC Press, Inc., 1987). [0238] Oznaczenia wiązania kompetycyjnego polegają na zdolności wyznakowanego standardu do konkurowania z analitem - próbką testową, analizowaną pod kątem wiązania z ograniczoną ilością przeciwciała. Ilość białka-celu w próbce testowej jest odwrotnie proporcjonalna do ilości standardu, który wiąże się do przeciwciała. Dla ułatwienia określania ilości związanego standardu, przeciwciała korzystnie czyni się nierozpuszczalnymi przed lub po kompetycji, aby standard i analit, które są związane do przeciwciał, można być łatwo oddzielić od standardu i analitu, które pozostają niezwiązane. [0239] Oznaczenia kanapkowe obejmują zastosowanie dwóch przeciwciał, z których każde zdolne jest do wiązania innej części immunogennej lub epitopu białka, które ma być wykryte. W oznaczeniu kanapkowym, analit próbki testowej wiązany jest przez pierwsze przeciwciało, które jest zimmobilizowane na stałej podporze, a następnie do analitu wiąże się drugie przeciwciało, tworząc w ten sposób nierozpuszczalny, trzyczęściowy kompleks. Patrz, np. patent USA nr 4,376,110. Drugie przeciwciało może być wyznakowane samo, za pomocą wykrywalnej cząsteczki (bezpośrednie oznaczenia kanapkowe) lub można je mierzyć z zastosowaniem przeciwciała anty-immunoglobulinowego, które jest wyznakowane za pomocą wykrywalnej cząsteczki (pośrednie oznaczenie kanapkowe). Przykładowo, jednym z typów oznaczenia kanapkowego jest oznaczenie ELISA, w przypadku którego wykrywalną cząsteczką jest enzym.

87 86 Dla immunohistochemii próbka tkanki może być świeża lub mrożona, lub może być zanurzona w parafinie i utrwalona konserwantem, takim jak, przykładowo, formalina. H. Oznaczenia Oparte na Komórkach [0240] Dla dalszego zrozumienia zależności między genami i zidentyfikowanymi polipeptydami, a rozwojem i patogenezą choroby o podłożu immunologicznym, stosować można oznaczenia oparte na komórkach i modele zwierzęce dla chorób o podłożu immunologicznym. [0241] W innym podejściu, komórki z typu komórek znanych z uczestniczenia w szczególnej chorobie o podłożu immunologicznym transfekuje się opisanymi cdna i analizuje się zdolność tych cdna do stymulowania lub hamowania funkcji. Odpowiednie komórki można transfekować pożądanym genem i monitorować pod kątem działania funkcji immunologicznej. Takie transfekowane linie komórkowe można następnie stosować do testowania zdolności przeciwciał poli- i monoklonalnych lub kompozycji przeciwciałowych do hamowania lub stymulowania funkcji immunologicznej, przykładowo, do modulowania proliferacji komórek T lub naciekania komórek zapalnych. Komórki transfekowane sekwencjami kodującymi zidentyfikowanych genów można ponadto stosować do identyfikowania leków-kandydatów do leczenia chorób o podłożu immunologicznym. [0242] Dodatkowo, w oznaczeniach opartych na komórkach stosować można hodowle pierwotne, wyprowadzone od zwierząt transgenicznych (jak opisano poniżej), choć korzystne są stabilne linie komórkowe. Techniki do wyprowadzania ciągłych linii komórkowych od zwierząt transgenicznych są dobrze znane w stanie techniki (patrz, np. Small et al., Mol. Cell. Biol., 5: [1985]). [0243] Jednym z odpowiednich oznaczeń opartych na komórkach jest reakcja mieszanych limfocytów (MLR). Current Protocols in Immunology, część 3.12; redakcja J E Coligan, A M Kruisbeek, D H Marglies, E M Shevach, W Strober, National Institutes of Health, Wydane przez John Wiley & Sons, Inc. W tym oznaczeniu bada się zdolność związku testowego do stymulowania lub hamowania proliferacji aktywowanych komórek T. Zawiesinę komórek T odpowiadających hoduje się z allogenicznymi komórkami stymulatorowymi, a proliferację komórek T mierzy się poprzez wychwyt trytowanej tymidyny. Oznaczenie to jest ogólną miarą reaktywności komórek T. Ponieważ większość komórek T odpowiada na i wytwarza IL-2 po aktywacji, różnice w responsywności w tym oznaczeniu odzwierciedlają częściowo różnice w wytwarzaniu IL-2 przez komórki odpowiadające. Wyniki MLR można weryfikować standardowym oznaczeniem do wykrywania limfokiny (IL-2). Current Protocols in Immunology, powyżej, 3.15, 6.3. [0244] Odpowiedź proliferatywnych komórek T w oznaczeniu MLR może wynikać z bezpośrednich właściwości mitogennych oznaczanej cząsteczki lub z aktywacji indukowanej antygenem zewnętrznym. Dodatkową weryfikację działania stymulującego komórki T polipeptydów IL-17A/F uzyskać można poprzez badanie kostymulacji. Aktywacja komórek T wymaga sygnału specyficznego antygenowo za pośrednictwem receptora T-komórkowego (TCR) i sygnału kostymulującego przez oddziaływanie wiązania drugiego liganda,

88 87 przykładowo, oddziaływania wiązania B7 (CD80, CD86)/CD28. Sieciowanie CD28 zwiększa wydzielanie limfokin przez aktywowane komórki T. Aktywacja komórek T ma zarówno kontrole negatywne, jak i pozytywne przez wiązanie ligandów, co ma skutek negatywny lub pozytywny. CD28 i CTLA-4 są powiązanymi glikoproteinami w nadrodzinie Ig, które wiążą się do B7. Wiązanie się CD28 do B7 ma pozytywny, kostymulujący wpływ w postaci aktywacji komórek T; wiązanie CTLA-4 do B7, przeciwnie, ma negatywny wpływ w postaci dezaktywacji komórek T. Chambers, C. A. i Allison, J. P., Curr. Opin. Immunol., (1997) 9:396. Schwartz, R. H., Cell (1992) 71:1065; Linsley, P. S. i Ledbetter, J. A., Annu. Rev. Immunol. (1993) 11:191; June, C. H. et al., Immunol. Today (1994) 15:321; Jenkins, M. K., Immunity (1994) 1:405. W badaniu kostymulacji, polipeptydy IL-17A/F bada się pod kątem działania kostymulującego lub hamującego komórki T. [0245] Polipeptydy IL-17A/F, które są stymulatorami (kostymulatorami) proliferacji komórek T i jej agonistami, np. przeciwciała agonistyczne, jak określa się w MLR i badaniach kostymulacji, przykładowo, są użyteczne do leczenia chorób o podłożu immunologicznym, charakteryzujących się słabą, suboptymalną lub niewystarczającą funkcją immunologiczną. Choroby te leczy się stymulując proliferację i aktywację komórek T (i odporności zależnej od komórek T) i wzmacniając odpowiedź immunologiczną u ssaka poprzez podawanie związku stymulatorowego, takiego jak stymulujące polipeptydy IL-17A/F. Polipeptyd stymulujący może być, przykładowo, polipeptydem IL-17A/F lub jego przeciwciałem agonistycznym. [0246] Bezpośrednie zastosowanie związku stymulującego jak w wynalazku, potwierdzono w eksperymentach z glikoproteiną 4-1BB, członkiem rodziny receptorów czynnika martwicy guza, która wiąże się do liganda (4-1 BBL) ekspresjonowanego na przygotowanych komórkach T i daje sygnał do aktywacji i wzrostu komórek T. Alderson, M. E. et al., J. Immunol., 24:2219 (1994). [0247] Zastosowanie agonistycznego związku stymulującego również potwierdzono eksperymentalnie. Aktywacja 4-1BB poprzez leczenie agonistycznym przeciwciałem anty-4-1bb wzmaga niszczenie guzów. Hellstrom, I. i Hellstrom, K. E., Crit. Rev. Immunol., 18:1 (1998). Terapia immunoadiuwantowa do leczenia guzów, opisana bardziej szczegółowo poniżej, jest następnym przykładem zastosowania związków stymulujących według wynalazku. Wpływ immunostymulujący lub wzmacniający można również uzyskać poprzez antagonizowanie lub blokowanie aktywności IL-17A/F, którą stwierdzono jako hamującą w oznaczeniu MLR. Anulowanie działania hamującego związku daje sieciowy wpływ stymulujący. Odpowiednimi związkami antagonistycznymi/blokującymi są przeciwciała lub ich fragmenty, które rozpoznają i wiążą białko hamujące, blokując w ten sposób skuteczne oddziaływanie białka z jego receptorem i hamując przekazywanie sygnału przez receptor. Wpływ ten potwierdzono w eksperymentach z zastosowaniem przeciwciał anty-ctla-4, które wzmagają proliferację komórek T, przypuszczalnie poprzez usuwanie sygnału hamującego, powodowanego wiązaniem CTLA-4. Walunas, T. L. et al., Immunity, 1:405 (1994).

89 88 [0248] Alternatywnie, stymulację immunologiczną lub wpływ wzmacniający można również uzyskać poprzez podawanie polipeptydu IL-17A/F, który ma właściwości wzmagania przepuszczalności naczyń. Zwiększona przepuszczalność wakuolarna będzie korzystna dla zaburzeń, które mogą być tłumione przez miejscowe naciekanie komórek immunologicznych (np. monocytów, eozynofili, PMN) i stan zapalny. [0249] Z drugiej strony, polipeptydy IL-17A/F, jak również inne związki, które są bezpośrednimi inhibitorami proliferacji/aktywacji komórek T, wydzielania limfokin i/lub przepuszczalności naczyń stosować można bezpośrednio dla supresjonowania odpowiedzi immunologicznej. Związki te są użyteczne dla zmniejszania stopnia odpowiedzi immunologicznej i do leczenia chorób o podłożu immunologicznym, charakteryzujących się odpowiedzią w postaci nadczynności, nadmierną lub autoimmunologiczną. To zastosowanie związków według wynalazku potwierdzono poprzez eksperymenty opisane powyżej, w których wiązanie się CTLA-4 do receptora B7 inaktywuje komórki T. Związki hamujące bezpośrednio według wynalazku funkcjonują w analogiczny sposób. Oczekiwano by, że zastosowanie związków, które zmniejszają przepuszczalność naczyń, zmniejszać będzie stan zapalny. Takie zastosowania były by korzystne w leczeniu stanów chorobowych związanych z nadmiernym stanem zapalnym. [0250] Alternatywnie, związki, np. przeciwciała, które wiążą się do stymulujących polipeptydów IL-17A/F i blokują stymulujący wpływ tych cząsteczek, wytwarzają sieciowy efekt hamujący i mogą być stosowane do supresjonowania odpowiedzi immunologicznej mediowanej przez komórki T poprzez hamowanie proliferacji/aktywacji komórek T i/lub wydzielania limfokin. Blokowanie stymulującego wpływu polipeptydów supresjonuje odpowiedź immunologiczną ssaka. Zastosowanie to potwierdzono w eksperymentach z zastosowaniem przeciwciała anty-il2. W tych eksperymentach, przeciwciało wiąże się do IL2 i blokuje wiązanie IL2 do jej receptora, uzyskując w ten sposób efekt hamowania komórek T. I. Modele Zwierzęce [0251] Wyniki badań opartych na komórkach in vitro można ponadto potwierdzać in vivo, stosując modele zwierzęce i badania pod kątem funkcji komórek T. Wiele różnych, dobrze znanych modeli zwierzęcych stosować można dla dalszego zrozumienia roli zidentyfikowanych tu genów w rozwoju i patogenezie choroby o podłożu immunologicznym oraz dla testowania skuteczności kandydatów na środki terapeutyczne, włączając przeciwciała i innych antagonistów naturalnych polipeptydów, włączając antagonistów w postaci małych cząsteczek. Właściwość in vivo takich modeli sprawia, że na ich podstawie można przewidywać odpowiedzi u pacjentów będących ludźmi. Modele zwierzęce chorób o podłożu immunologicznym obejmują zarówno zwierzęta (transgeniczne) nierekombinowane, jak i rekombinowane. Modele zwierząt rekombinowanych obejmują, przykładowo, gryzonie, np. modele mysie. Takie modele można wytwarzać wprowadzając komórki do myszy syngenicznych stosując standardową technikę, np. iniekcję podskórną, iniekcję do żyły ogonowej, implantację do śledziony, implantację dootrzewnową, implantację pod torebkę nerkową, itd.

90 89 [0252] Choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi pojawia się, gdy komórki immunokompetentne przeszczepia się pacjentom z immunosupresją lub tolerancją. Komórki donora rozpoznają i odpowiadają na komórki gospodarza. Odpowiedź może być zróżnicowana, od zagrażającego życiu, ostrego stanu zapalnego do łagodnych przypadków biegunki i utraty wagi. Modele choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi zapewniają sposoby oceniania reaktywności komórek T względem antygenów MHC i słabych antygenów z przeszczepu. Odpowiednią procedurę opisano szczegółowo w Current Protocols in Immunology, powyżej, część 4.3. [0253] Model zwierzęcy dla odrzucenia allogenicznego przeszczepu skóry jest sposobem testowania zdolności komórek T do mediowania zniszczenia tkanek in vivo i mierzenia ich roli w odrzuceniu przeszczepu. W najpowszechniejszych i najbardziej akceptowanych modelach stosuje się mysie przeszczepy skóry ogona. Powtarzane eksperymenty wykazały, że odrzucenie allogenicznego przeszczepu skóry mediowane jest przez komórki T, komórki T pomocnicze i komórki T efektorowe-zabójców, a nie przeciwciała. Auchincloss, H. Jr. i Sachs, D. H. Fundamental Immunology, wyd. 2-gie, red. W. E. Paul., Raven Press, NY, (1989). Odpowiednią procedurę opisano szczegółowo w Current Protocols in Immunology, powyżej, część 4.4. Innymi modelami odrzucenia przeszczepu, które można stosować do testowania związków według wynalazku, są modele allogenicznego przeszczepu serca, opisane przez Tanabe, M. et al., Transplantation, 58:23 (1994) i Tinubu, S. A. et al., J. Immunol., (1994). [0254] Modele zwierzęce dla nadwrażliwości typu opóźnionego zapewniają również badanie funkcji immunologicznej mediowanej komórkami. Reakcje nadwrażliwości typu opóźnionego są odpowiedzią immunologiczną mediowaną komórkami T in vivo, charakteryzującą się stanem zapalnym, który nie osiąga wartości szczytowej zanim nie upłynie odcinek czasu po prowokacji antygenem. Reakcje te zachodzą również w chorobach autoimmunologicznych specyficznych tkankowo, takich jak stwardnienie rozsiane (MS) i eksperymentalnym, autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia (EAE, model dla MS). Odpowiednią procedurę opisano szczegółowo w Current Protocols in Immunology, powyżej, część 4.5. [0255] EAE jest chorobą autoimmunologiczną mediowaną komórkami T, charakteryzującą się stanem zapalnym komórek T i komórek jednojądrzastych, a w konsekwencji demielinizacją aksonów w centralnym układzie nerwowym. EAE uważa się ogólnie za istotny model zwierzęcy dla MS u ludzi. Bolton, C. Multiple Sclerosis. 1:143 (1995). Opracowano zarówno model ostry, jak i nawracająco-ustępujący. Związki według wynalazku testować można pod kątem aktywności stymulującej lub hamującej komórki T względem choroby demielinizacyjnej o podłożu immunologicznym, stosując protokół opisany w Current Protocols in Immunology, powyżej, części 15.1 i Patrz również na modele dla choroby mieliny, w których oligodendrocyty lub komórki Schwanna przeszczepia się do centralnego układu nerwowego, jak opisano w Duncan, I. D. et al., Molec. Med. Today (1997). [0256] Nadwrażliwość kontaktowa jest prostym badaniem in vivo nadwrażliwości typu opóźnionego dla funkcji immunologicznej mediowanej komórkami. W tej procedurze [przeprowadza się] ekspozycję skórną na egzogenne hapteny wywołujące reakcję

91 90 nadwrażliwości typu opóźnionego, którą mierzy się i określa ilościowo. Wrażliwość kontaktowa obejmuje początkową fazę uczulającą, po której następuje faza aktywizacji. Faza aktywizacji pojawia się, gdy limfocyty T napotykają antygen, z którym miały wcześniej kontakt. Pojawia się opuchlizna i stan zapalny, co czyni go doskonałym modelem ludzkiego alergicznego wyprysku kontaktowego. Odpowiednią procedurę opisano szczegółowo w Current Protocols in Immunology, red. J. E. Cologan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach i W. Strober, John Wiley & Sons, Inc., część 4.2 (1994). Również Grabbe, S. i Schwarz, T, Immun. Today, 19 (1): (1998). [0257] Modelem zwierzęcym zapalenia stawów jest zapalenie stawów wywoływane kolagenem. Model ten ma cechy kliniczne, histologiczne i immunologiczne wspólne z autoimmunologicznym reumatoidalnym zapaleniem stawów u ludzi i jest modelem dopuszczalnym dla autoimmunologicznego zapalenia stawów u ludzi. Modele mysie i szczurze charakteryzują się z zapaleniem błony maziowej, nadżerką chrząstki i kości podchrząstkowej. Związki według wynalazku testować można pod kątem aktywności względem autoimmunologicznego zapalenia stawów, stosując protokoły opisane w Current Protocols in Immunology, powyżej, części Patrz również model z zastosowaniem przeciwciała monoklonalnego wobec integryn CD18 i VLA-4, opisany w Issekutz, A.C. et al., Immunology, 88:569 (1996). [0258] Opisano model astmy, w którym nadreaktywność dróg oddechowych indukowaną antygenem, eozynofilię płucną i stan zapalny wywołuje się uczulając zwierzę za pomocą owalbuminy, a następnie poddając zwierzę prowokacji tym samym białkiem dostarczonym poprzez aerozol. Kilka modeli zwierzęcych (świnka morska, szczur, naczelne inne niż ludzie) pod wpływem prowokacji antygenami w aerozolu wykazuje objawy podobne do astmy atopowej u ludzi. Modele mysie mają wiele z cech astmy u ludzi. Procedury odpowiednie do testowania związków według wynalazku pod kątem aktywności i skuteczności w leczeniu astmy opisano przez Wolyniec, W. W. et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 18:777 (1998) i przytaczanych tam odniesieniach. [0259] Dodatkowo, związki według wynalazku można testować na modelach zwierzęcych pod kątem chorób podobnych do łuszczycy. Dowody wskazują na patogenezę komórek T w łuszczycy. Związki według wynalazku można testować w modelu mysim SCID/SCID, opisanym przez Schon, M. P. et al., Nat. Med., 3:183 (1997), w którym myszy wykazują histopatologiczne zmiany skórne przypominające łuszczycę. Innym odpowiednim modelem jest chimera skóra ludzka/mysz SCID, otrzymana jak opisano przez Nickoloff, B. J. et al., Am. J. Path., 146:580 (1995). [0260] Modele rekombinowanych zwierząt (transgenicznych) innych niż ludzie można uzyskiwać inżynieryjnie poprzez wprowadzenie kodującej części zidentyfikowanych genów do genomów zwierząt będących przedmiotem zainteresowania, z zastosowaniem standardowych technik do otrzymywania zwierząt transgenicznych. Zwierzęta, które mogą służyć jako cel dla manipulacji transgenicznej obejmują, bez ograniczeń, myszy, szczury, króliki, świnki morskie, owce, kozy, świnie i naczelne inne niż ludzie, np. pawiany, szympansy i małpy. Techniki znane w stanie techniki dla wprowadzania transgenu do takich

92 91 zwierząt obejmują mikroiniekcję dojądrową (Hoppe i Wanger, patent USA nr 4,873,191); transfer genów do linii zarodkowych za pośrednictwem retrowirusa (np. Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, [1985]); celowanie w gen (ang. gene targeting) w zarodkowych komórkach macierzystych (Thompson et al., Cell, 56, [1989]); elektroporację zarodków (Lo, Mol. Cel. Biol. 3, [1983]); transfer genów za pośrednictwem nasienia (Lavitrano et al., Cell, 57, [1989]). W celu zapoznania się z pracą przeglądową, patrz, przykładowo, patent USA nr 4,736,866. [0261] Dla celów wynalazku, zwierzęta transgeniczne obejmują te, które noszą transgen jedynie w części swoich komórek ("zwierzęta mozaikowe"). Transgen można wprowadzać jako transgen pojedynczy lub w konkatamerach, np. tandemach głowa-do-głowy lub głowado-ogona. Selektywne wprowadzanie transgenu do komórki szczególnego typu możliwe jest również poprzez następującą, przykładowo, technikę z Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, (1992). [0262] Ekspresję transgenu w zwierzętach transgenicznych monitorować można standardowymi technikami. Przykładowo, do weryfikacji integracji transgenu stosować można analizę Southern blot lub amplifikację PCR. Następnie, stosując techniki takie jak hybrydyzacja in situ, analiza Northern blot, PCR lub immunocytochemia, analizować można poziom ekspresji mrna. [0263] Zwierzęta można ponadto badać pod kątem objawów patologii choroby immunologicznej, przykładowo, poprzez badanie histologiczne dla określenia naciekania komórek immunologicznych na specyficzne tkanki. Przeprowadzać można również eksperymenty blokowania, w których zwierzęta transgeniczne traktuje się związkami według wynalazku dla określenia skali stymulacji lub hamowania proliferacji komórek T przez związki. W tych eksperymentach przeciwciała blokujące, które wiążą się do polipeptydu IL- 17A/F, otrzymane jak opisano powyżej, podaje się zwierzęciu i określa wpływ na funkcje immunologiczną. [0264] Alternatywnie, konstruować można zwierzęta "knock-out", które mają wadliwy lub zmieniony gen kodujący zidentyfikowany tu polipeptyd, jako wynik rekombinacji homologicznej między genem endogennym, kodującym polipeptyd, a zmienionym DNA genomowym, kodującym ten sam polipeptyd wprowadzony w komórę zarodkową zwierzęcia. Przykładowo, cdna kodujące szczególny polipeptyd stosować można do klonowania DNA genomowego, kodującego ten polipeptyd, zgodnie z ustalonymi technikami. Część DNA genomowego, kodującego szczególny polipeptyd można usunąć lub zastąpić innym genem, takim jak gen kodujący marker selektywny, który można zastosować do monitorowania integracji. Zazwyczaj, w wektorze zawartych jest kilka kilozasad niezmienionego DNA flankującego (na końcach 5' i 3') [patrz, np. Thomas i Capecchi, Cell, 51:503 (1987) pod kątem opisu wektorów do rekombinacji homologicznej]. Wektor wprowadza się do linii macierzystych komórek zarodkowych (np. poprzez elektroporację) i wybiera się komórki, w których wprowadzone DNA zrekombinowało homologicznie z endogennym DNA [patrz, np. Li et al., Cell, 69:915 (1992)]. Wybrane komórki wstrzykuje się następnie do blastocysty zwierzęcia (np. myszy lub szczura) dla utworzenia chimer agregacyjnych [patrz, np. Bradley,

93 92 w Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, red. E. J. Robertson (IRL, Oxford, 1987), str ]. Chimeryczny zarodek można następnie implantować odpowiedniej samicy-przybranej matce w ciąży rzekomej dla utworzenia zwierzęcia "knockout" z donoszonego zarodka. Potomstwo noszące DNA zrekombinowane homologicznie w swoich komórkach zarodkowych można identyfikować standardowymi technikami i stosować do hodowania zwierząt, w których wszystkie komórki zwierzęcia zawierają DNA zrekombinowane homologicznie. Zwierzęta "knock-out" można charakteryzować, przykładowo, pod kątem ich zdolności do obrony przed niektórymi patologicznymi stanami chorobowymi i pod kątem rozwoju w nich patologicznych stanów chorobowych, wynikających z nieobecności polipeptydu. J. Terapia Immunoadiuwantowa [0265] W jednym z przykładów wykonania związki immunostymulujące według wynalazku stosować można w terapii immunoadiuwantowej do leczenia guzów (raka). Obecnie dostatecznie dowiedziono, że komórki T rozpoznają antygeny specyficzne dla ludzkich guzów. Jedna z grup antygenów guzowych, kodowana przez rodziny genów MAGE, BAGE i GAGE, jest wyciszona we wszystkich dorosłych, zdrowych tkankach, ale ekspresjonowana w znacznych ilościach w guzach, takich jak czerniaki, guzy płuc, guzy głowy i szyi oraz nowotwory pęcherza. DeSmet, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:7149 (1996). Pokazano, że kostymulacja komórek T indukuje regresję guza i odpowiedź przeciwguzową, zarówno in vitro, jak i in vivo. Melero, I. et al., Nature Medicine, 3:682 (1997); Kwon, E. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 8099 (1997); Lynch, D. H. et al., Nature Medicine, 3:625 (1997); Finn, O. J. i Lotze, M. T., J. Immunol., 21:114 (1998). Związki stymulujące według wynalazku podawać można jako adiuwanty, same lub razem ze środkiem regulującym wzrost, środkiem cytotoksycznym lub środkiem chemioterapeutycznym dla stymulowania proliferacji/aktywacji komórek T i odpowiedzi przeciwguzowej na antygeny guzowe. Środek regulujący wzrost, cytotoksyczny lub chemioterapeutyczny podawać można w konwencjonalnych ilościach, stosując znane schematy podawania. Działanie immunostymulujące, wykazywane przez związki według wynalazku, pozwala zmniejszać ilości środków regulujących wzrost, cytotoksycznych lub chemioterapeutycznych, potencjalnie zmniejszając w ten sposób toksyczność dla pacjenta. K. Badania Przesiewowe pod Kątem Kandydatów na Leki [0266] Badania przesiewowe pod kątem kandydatów na leki projektuje się do identyfikowania związków, które wiążą się lub tworzą kompleksy z polipeptydami kodowanymi przez zidentyfikowane geny lub ich fragmentami aktywnymi biologicznie, lub w inny sposób przeszkadzają w oddziaływaniu kodowanych polipeptydów z innymi białkami komórkowymi. Takie badania przesiewowe obejmować będą badania dostępne do wysokowydajnego badania przesiewowego bibliotek chemicznych, czyniąc je szczególnie odpowiednimi do identyfikowania drobnocząsteczkowych kandydatów na leki. Brane pod uwagę małe cząsteczki obejmują syntetyczne związki organiczne lub nieorganiczne, włączając peptydy, korzystnie peptydy rozpuszczalne, fuzje (poli)peptydów-immunoglobulin oraz, w szczególności, przeciwciała, włączając bez ograniczania przeciwciała poli- i

94 93 monoklonalne i fragmenty przeciwciał, przeciwciała jednołańcuchowe, przeciwciała antyidiotypowe i chimeryczne lub humanizowane wersje takich przeciwciał lub fragmentów, jak również ludzkie przeciwciała i fragmenty przeciwciał. Badania można przeprowadzać w wielu różnych formatach, włączając oznaczenia oddziaływań białko-białko, biochemiczne badania przesiewowe, badania immunologiczne i badania oparte na komórkach, które dobrze charakteryzowano w stanie techniki. Wspólne dla wszystkich badań jest to, że wymagają one kontaktowania kandydata na lek z polipeptydem kodowanym przez zidentyfikowany kwas nukleinowy, w warunkach i czasie wystarczającym dla umożliwienia oddziaływania tych dwóch komponentów. [0267] W badaniach wiązania oddziaływaniem jest wiązanie, a utworzony kompleks można izolować lub wykrywać w mieszaninie reakcyjnej. W szczególnym przykładzie wykonania, polipeptyd kodowany przez zidentyfikowany gen lub kandydat na lek immobilizuje się na fazie stałej, np. na płytce do mikromiareczkowania, poprzez przyłączenia kowalencyjne lub niekowalencyjne. Przyłączenia niekowalencyjnego dokonuje się ogólnie pokrywając stałą powierzchnię roztworem polipeptydu i osuszając. Alternatywnie, immobilizowane przeciwciało, np. przeciwciało monoklonalne, swoiste wobec polipeptydu, który ma być immobilizowany, stosować można do zakotwiczenia go do powierzchni stałej. Badanie przeprowadza się dodając komponent nieimmobilizowany, który może być wyznakowany wykrywalnym znacznikiem, do komponentu immobilizowanego, np. pokrytej powierzchni, zawierającej zakotwiczony komponent. Gdy reakcja jest zakończona, komponenty nieprzereagowane usuwa się, np. poprzez odpłukiwanie, a kompleksy zakotwiczone na stałej powierzchni wykrywa się. Gdy wyjściowo nieimmobilizowany komponent ma wykrywalny znacznik, wykrywanie znacznika immobilizowanego na powierzchni wskazuje, że doszło do utworzenia kompleksu. Gdy wyjściowo nieimmobilizowany komponent nie ma znacznika, utworzenie kompleksu można wykrywać, przykładowo, stosując wyznakowane przeciwciało swoiście wiążące zimmobilizowany kompleks. [0268] Jeśli związek-kandydat oddziałuje z, ale nie wiąże się do szczególnego białka kodowanego przez zidentyfikowany gen, jego oddziaływanie z tym białkiem można badać sposobami dobrze znanymi do wykrywania oddziaływań białko-białko. Takie oznaczenia obejmują podejścia tradycyjne, takie jak np. sieciowanie, koimmunoprecypitację i kooczyszczanie poprzez kolumny gradientowe lub chromatograficzne. Dodatkowo, oddziaływania białko-białko można monitorować z zastosowaniem systemu genetycznego opartego na drożdżach, opisanego przez Fields i współpracowników [Fields i Song, Nature (Londyn), 340, (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, (1991)] jak ujawniono przez Chevray i Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, (1991). Wiele aktywatorów transkrypcyjnych, takich jak drożdżowy GAL4, składa się z dwóch fizycznie odrębnych domen modułowych, przy czym jedna działa jako domena wiążąca DNA, a druga funkcjonuje jako domena aktywująca transkrypcję. Drożdżowy system ekspresyjny, opisany we wcześniejszych publikacjach (określany ogólnie jako "system dwuhybrydowy"), wykorzystuje tą właściwość i stosuje dwa białka hybrydowe, jedno w którym docelowe białko przyłączone jest do domeny wiążącej DNA z GAL4 oraz drugie, w którym białka aktywujące-kandydaci związani są do domeny aktywacyjnej. Ekspresja genu

95 94 reporterowego GAL1-lacZ pod kontrolą promotora aktywowanego GAL4 zależy od przywracania aktywności GAL4 via oddziaływanie białko-białko. Kolonie zawierające oddziałujące polipeptydy wykrywa się za pomocą chromogennego substratu dla β- galaktozydazy. Kompletny zestaw (MATCHMAKER ) do identyfikacji oddziaływań białko-białko między dwoma specyficznymi białkami z zastosowaniem techniki dwuhybrydowej dostępny jest handlowo od Clontech. System ten można również rozszerzyć dla mapowania domen białka zaangażowanych w specyficzne oddziaływania białkowe, jak również dla dokładnego określenia reszt aminokwasowych, które są kluczowe dla tych oddziaływań. [0269] Dla znalezienia związków, które zakłócają oddziaływanie zidentyfikowanego genu i innych wewnątrz- lub zewnątrzkomórkowych komponentów można przeprowadzać testy, [w których] zazwyczaj przygotowuje się mieszaninę reakcyjną zawierającą produkt genu i komponent wewnątrz- lub zewnątrzkomórkowy w warunkach i czasie pozwalającym na oddziaływanie i wiązanie dwóch produktów. Dla testowania zdolności związku testowego do hamowania wiązania, reakcję przeprowadza się w nieobecności i w obecności związku testowego. Dodatkowo, do trzeciej mieszaniny reakcyjnej dodawać można placebo, aby służyło jako kontrola pozytywna. Wiązanie (tworzenie kompleksu) między związkiem testowym a komponentem wewnątrz- lub zewnątrzkomórkowym, obecnym w mieszaninie, monitoruje się jak opisano powyżej. Tworzenie kompleksu w reakcji (reakcjach) kontrolnych, ale nie w mieszaninie reakcyjnej zawierającej związek testowy wskazuje, że związek testowy zaburza oddziaływanie związku testowego i jego partnera reakcyjnego. L. Kompozycje i Sposoby Leczenia Chorób o Podłożu Immunologicznym [0270] Kompozycje użyteczne do leczenia chorób o podłożu immunologicznym obejmują, bez ograniczenia, białka, przeciwciała, małe cząsteczki organiczne, peptydy, fosfopeptydy, cząsteczki antysensowne i rybozymowe, cząsteczki potrójnej helisy itd., które hamują lub stymulują funkcję immunologiczną, przykładowo, proliferację/aktywację komórek T, uwalnianie limfokin lub naciekanie komórek immunologicznych. [0271] Przykładowo, antysensowne RNA i cząsteczki RNA działają dla bezpośredniego blokowania translacji mrna, hybrydyzując do docelowego mrna i zapobiegając w ten sposób translacji białka. Kiedy stosuje się antysensowne DNA, korzystne są oligodeoksyrybonukleotydy pochodzące z miejsca początku translacji, np. między pozycjami około -10 i +10 sekwencję nukleotydowej docelowego genu. [0272] Rybozymy są enzymatycznymi cząsteczkami RNA, zdolnymi do katalizowania specyficznego rozszczepiania RNA. Rybozymy działają poprzez sekwencyjnie specyficzną hybrydyzację do komplementarnego, docelowego RNA, po której następuje rozszczepianie endonukleolityczne. Specyficzne, rybozymowe miejsca cięcia w obrębie potencjalnego, docelowego RNA identyfikować można znanymi technikami. Dla zapoznania się z dalszymi szczegółami patrz, np. Rossi, Current Biology, 4, (1994) i Publikacja PCT nr WO 97/33551 (opublikowana 18 września, 1997).

96 95 [0273] Cząsteczki kwasu nukleinowego w formacji trzech helis, stosowane do hamowania transkrypcji, powinny być jednoniciowe i złożone z deoksynukleotydów. Podstawowy skład tych oligonukleotydów projektuje się dla promowania tworzenia potrójnej helisy via regułę parowania zasad Hoogsteena, która wymaga ogólnie znacznych rozciągnięć puryn lub pirymidyn jednej z nici dupleksu. Dla zapoznania się z dalszymi szczegółami patrz, np. Publikacja PCT nr WO 97/33551, supra. [0274] Te małe cząsteczki można identyfikować za pomocą jednego lub jakiejkolwiek kombinacji badań przesiewowych omówionych powyżej i/lub za pomocą jakichkolwiek innych technik przesiewowych, dobrze znanych znawcom stanu techniki. M. Przeciwciała anty-il-17a/f [0275] W jednym z przykładów wykonania wynalazek zapewnia przeciwciała anty-il-17a/f, które mogą znaleźć zastosowanie jako środki terapeutyczne i/lub diagnostyczne. Przykładowe przeciwciała obejmują przeciwciała poliklonalne, monoklonalne, humanizowane, bispecyficzne i heterokoniugatowe. 1. Przeciwciała Poliklonalne [0276] Przeciwciała poliklonalne korzystnie wzbudza się u zwierząt poprzez wielokrotne iniekcje podskórne (sc) lub dootrzewnowe (ip) odpowiedniego antygenu i adjuwanta. Użyteczne może być skoniugowanie istotnego antygenu (szczególnie gdy stosuje się peptydy syntetyczne) do białka, które jest immunogenne w gatunkach, które mają być zaszczepiane. Przykładowo, antygen można koniugować z hemocyjaniną z keyhole limpet (KLH), albuminą surowicy, tyroglobuliną bydlęcą lub inhibitorem trypsyny sojowej, z zastosowaniem środka bifunkcyjnego lub wytwarzającego pochodne, przykładowo, estru maleimidobenzoilosulfosukcynoimidowego (sprzężenie przez reszty cysteinowe), N- hydroksysukcynimidu (przez reszty lizynowe), aldehydu glutarowego, bezwodnika bursztynowego, SOCl 2 lub R 1 N=C=NR, przy czym R i R 1 są różnymi grupami alkilowymi. [0277] [0277] Zwierzęta immunizuje się względem antygenu, immunogennych koniugatów lub pochodnych poprzez połączenie np. 100 μg lub 5 μg białka lub koniugatu (odpowiednio, dla królików lub myszy) z 3 objętościami pełnego adiuwanta Freunda i wielomiejscowe wstrzyknięcie śródskórne roztworu. Miesiąc później zwierzęta stymuluje się za pomocą od 1/5 do 1/10 początkowej ilości peptydu lub koniugatu w pełnym adiuwancie Freunda poprzez wielomiejscowe wstrzyknięcia śródskórne. Od siedmiu do 14 dni później zwierzęta skrwawia się, a surowicę oznacza pod kątem miana przeciwciał. Zwierzęta stymuluje się do uzyskania plateau miana. Koniugaty można również wytwarzać w rekombinacyjnej hodowli komórek, jako białka fuzyjne. Dla wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej stosuje się odpowiednio również środki agregujące, takie jak ałun. 2. Przeciwciała Monoklonalne [0278] Przeciwciała monoklonalne można wytwarzać stosując sposób hybrydomy, opisany po raz pierwszy przez Kohler et al., Nature, 256:495 (1975) lub można wytwarzać sposobami zrekombinowanego DNA (patent USA nr 4,816,567).

97 96 [0279] W sposobie hybrydomy, mysz lub inne, odpowiednie zwierzę-gospodarza, takie jak chomik, immunizuje się, jak opisano powyżej, dla uzyskania limfocytów wytwarzających lub zdolnych do wytwarzania przeciwciał, które będą się swoiście wiązać się do białka zastosowanego do immunizacji. Alternatywnie, limfocyty można immunizować in vitro. Po immunizacji limfocyty izoluje się, a następnie poddaje fuzji z linią komórkową szpiczaka, stosując odpowiedni środek do fuzji, taki jak glikol polietylenowy, dla utworzenia komórki hybrydomy (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, str (Academic Press, 1986)). [0280] Tak otrzymane komórki hybrydomy wysiewa się i hoduje w odpowiedniej pożywce hodowlanej, która to pożywka korzystnie zawiera jedną lub większą ilość substancji hamujących wzrost lub przeżywanie macierzystych komórek szpiczaka, które nie uległy fuzji (określanych również jako partner fuzyjny). Przykładowo, jeżeli macierzyste komórki szpiczaka nie posiadają enzymu transferazy hipoksantynowo-guaninowo-fosforybozylowej (HGPRT lub HPRT), selektywna pożywka hodowlana dla hybrydom będzie zazwyczaj zawierać hipoksantynę, aminopterynę i tymidynę (pożywka HAT), które to substancje zapobiegają wzrostowi komórek nie posiadających HGPRT. [0281] Korzystnymi komórkami szpiczaka-partnerami fuzyjnymi są te, które skutecznie ulegają fuzji, wspomagają stabilną produkcję przeciwciał na wysokim poziomie dzięki wybranym komórkom wytwarzającym przeciwciała oraz są wrażliwe na pożywkę wybiórczą, która selekcjonuje pod względem macierzystych komórek nie będących w fuzji. Korzystnymi liniami komórek szpiczaka są mysie linie szpiczaka, takie jak te pochodzące z mysich guzów MOPC-21 i MPC-11, dostępnych od Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Kalifornia, USA i pochodne, np. komórki X63-Ag8-653, dostępne od American Type Culture Collection, Rockvile, Maryland, USA. Do wytwarzania ludzkich przeciwciał monoklonalnych opisano również linie komórkowe ludzkiego szpiczaka i myszo-ludzkiego heteroszpiczaka (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); i Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, str (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). [0282] Pożywkę hodowlaną, w której wzrastają komórki hybrydomy, poddaje się badaniom pod kątem wytwarzania przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko antygenowi. Korzystnie, swoistość wiązania przeciwciał monoklonalnych wytwarzanych przez komórki hybrydomy określa się za pomocą immunoprecypitacji lub badania wiązania in vitro, takiego jak badanie radioimmunologiczne (RIA) lub enzymatyczne badanie immunoabsorpcyjne (ELISA). [0283] Powinowactwo wiązania przeciwciała monoklonalnego można określać, przykładowo, poprzez analizę Scatcharda, opisaną w Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980). [0284] Po identyfikacji komórek hybrydomy, wytwarzających przeciwciała o pożądanej swoistości, powinowactwie i/lub aktywności, klony można subklonować poprzez procedury ograniczonego rozcieńczania i hodować za pomocą standardowych sposobów (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, str (Academic Press, 1986)). Pożywki hodowlane odpowiednie do tego celu obejmują, przykładowo, pożywkę D-MEM lub

98 97 RPMI Dodatkowo, komórki hybrydomy można hodować in vivo jako raki puchlinowe u zwierzęcia, np. poprzez iniekcję i.p. komórek do myszy. [0285] Przeciwciała monoklonalne wydzielane przez subklony odpowiednio wydziela się z pożywki hodowlanej, płynu wysiękowego lub surowicy konwencjonalnymi procedurami oczyszczania przeciwciał, takimi jak, przykładowo, chromatografia powinowactwa (np. z zastosowaniem Sefarozy z białkiem A lub białkiem G) lub chromatografia jonowymienna, chromatografia hydroksyloapatytowa, elektroforeza żelowa, dializa itp. [0286] DNA kodujące przeciwciała monoklonalne łatwo izolować i poddawać sekwencjonowaniu z zastosowaniem konwencjonalnych procedur (np. przez zastosowanie sond oligonukleotydowych, zdolnych do swoistego wiązania genów kodujących ciężkie i lekkie łańcuchy przeciwciał mysich). Komórki hybrydomy służą jako korzystne źródło takiego DNA. Po wyizolowaniu, DNA można wprowadzać do wektorów ekspresyjnych, które są następnie transfekowane do komórek gospodarza, takich jak komórki E.coli, małpie komórki COS, komórki jajnika chomika chińskiego (CHO) lub komórki szpiczaka, które inaczej nie wytwarzałyby białka przeciwciałowego, dla uzyskania syntezy przeciwciał monoklonalnych w rekombinowanych komórkach gospodarza. Artykuły przeglądowe na temat rekombinacyjnej ekspresji bakteryjnej DNA kodującego przeciwciało obejmuję Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: (1993) i Plückthun, Immunol. Revs. 130: (1992). [0287] W dalszym przykładzie wykonania, przeciwciała monoklonalne lub fragmenty przeciwciał można izolować z fagowych bibliotek przeciwciałowych, wytwarzanych z zastosowaniem technik opisanych w McCafferty et al., Nature, 348: (1990). Clackson et al., Nature, 352: (1991) i Marks et al., J. Mol. Biol., 222: (1991) opisują izolację przeciwciał mysich i ludzkich, odpowiednio, z zastosowaniem bibliotek fagowych. Kolejne publikacje opisują wytwarzanie ludzkich przeciwciał o wysokim powinowactwie (rzędu nm) za pomocą tasowania łańcuchów (Marks et al., Bio/Technology, 10: (1992)), jak również kombinatorycznego zakażenia i rekombinacji in vivo jako strategii do konstrukcji bardzo dużych bibliotek fagowych (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21: (1993)). Zatem, techniki te są realnymi alternatywami dla tradycyjnych technik hybrydomy dla przeciwciał monoklonalnych do izolowania przeciwciał monoklonalnych. [0288] DNA kodujące przeciwciało można modyfikować do wytwarzania chimerycznych lub fuzyjnych polipeptydów przeciwciałowych, przykładowo, poprzez podstawianie sekwencji ludzkich domen stałych łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego (C H i C L ) za homologiczne sekwencje mysie (patent USA nr 4,816,567; i Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)) lub poprzez fuzję sekwencji kodującej immunoglobulinę z całością lub częścią sekwencji kodującej polipeptyd nieimmunoglobulinowy (polipeptyd heterologiczny). Sekwencje polipeptydów nieimmunoglobulinowych mogą podstawiać domeny stałe przeciwciała lub podstawia się je za domeny zmienne jednego łączącego antygen miejsca przeciwciała dla utworzenia chimerycznego przeciwciała biwalentnego, zawierającego jedno miejsce łączące antygen o swoistości dla antygenu i drugie miejsce łączące antygen o swoistości dla innego antygenu.

99 98 3. Przeciwciała Ludzkie i Humanizowane [0289] Przeciwciała anty IL-17A/F według wynalazku mogą obejmować ponadto przeciwciała humanizowane lub przeciwciała ludzkie. "Humanizowane" postacie przeciwciał innych niż ludzkie (np. mysich) są chimerycznymi immunoglobulinami, łańcuchami immunoglobulinowymi lub ich fragmentami (takimi jak Fv, Fab, Fab, F(ab ) 2 lub inne wiążące antygen podsekwencje przeciwciał), które zawierają minimalną sekwencję pochodzącą z immunoglobuliny innej niż ludzka. Przeciwciała humanizowane obejmują ludzkie immunoglobuliny (przeciwciało biorcy), w których reszty regionu determinującego dopasowanie (CDR) biorcy zastąpiono resztami z CDR gatunków innych niż ludzie (przeciwciało dawcy), takich jak mysz, szczur lub królik, mających pożądaną swoistość, powinowactwo i pojemność. W niektórych przypadkach reszty zrębowe Fv ludzkiej immunoglobuliny zastępuje się odpowiednimi resztami innymi niż ludzkie. Przeciwciała humanizowane mogą również zawierać reszty, które nie są znajdowane w przeciwciele biorcy ani w zaimportowanym CDR lub sekwencjach zrębowych. Ogólnie, przeciwciało humanizowane będzie zawierało zasadniczo całość z co najmniej jednej, a zazwyczaj dwóch domen zmiennych, w których wszystkie lub zasadniczo wszystkie regiony CDR odpowiadają tym z immunoglobuliny innej niż ludzka i wszystkie lub zasadniczo wszystkie regiony FR są tymi o uwspólnionej sekwencji ludzkiej immunoglobuliny. Przeciwciało humanizowane zawierać będzie optymalnie również co najmniej część regionu stałego immunoglobuliny (Fc), zazwyczaj tą z immunoglobuliny ludzkiej [Jones et al., Nature, 321: (1986); Riechmann et al., Nature, 332: (1988); i Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: (1992)]. [0290] Sposoby humanizowania przeciwciał innych niż ludzkie są dobrze znane w stanie techniki. Ogólnie, przeciwciało humanizowane ma jedną lub większą liczbę reszt aminokwasowych, wprowadzonych do niego ze źródła innego niż ludzkie. Te inne niż ludzkie reszty aminokwasowe określa się często jako reszty importowane, pochodzące zazwyczaj z importowanej domeny zmiennej. Humanizowanie można zasadniczo przeprowadzać postępując zgodnie ze sposobem Wintera i współpracowników (Jones et al., Nature, 321: (1986); Riechmann et al., Nature, 332: (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: (1988)), podstawiając CDR gryzoni lub sekwencje CDR za odpowiednie sekwencje przeciwciała ludzkiego. Odpowiednio, takie przeciwciała humanizowane są przeciwciałami chimerycznymi (patent USA nr 4,816,567), przy czym zasadniczo mniej niż całą ludzką domenę zmienną zastąpiono w nich odpowiednią sekwencją z gatunków innych niż ludzki. W praktyce, przeciwciałami humanizowanymi są zazwyczaj przeciwciała ludzkie, w których niektóre reszty CDR i ewentualnie niektóre reszty FR podstawiono resztami z analogicznych miejsc w przeciwciałach gryzoni. [0291] Kiedy przeciwciało przeznaczone jest do zastosowania leczniczego u ludzi, wybór ludzkich domen zmiennych, zarówno lekkich, jak i ciężkich, do zastosowania w wytwarzaniu przeciwciał humanizowanych jest bardzo ważny dla zmniejszania antygenowości i odpowiedzi HAMA (ludzkiego przeciwciała przeciwko [przeciwciału] mysiemu). Zgodnie z tak zwanym sposobem najlepszego dopasowania, sekwencję domeny zmiennej przeciwciała

100 99 gryzonia wyszukuje się w całej bibliotece znanych ludzkich sekwencji domeny zmiennej. Identyfikuje się sekwencję ludzkiej domeny V, która jest najbliższa tej u gryzoni, a dla przeciwciała humanizowanego akceptuje ludzki region zrębowy (FR) w jej obrębie (Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Inny sposób wykorzystuje szczególny region zrębowy, pochodzący z sekwencji uwspólnionej wszystkich przeciwciał ludzkich z określonej podgrupy łańcuchów lekkich lub ciężkich. Ten sam [region] zrębowy stosować można dla kilku różnych przeciwciał humanizowanych (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)). [0292] Ponadto istotne jest, aby przeciwciała były humanizowane z zachowaniem wysokiego powinowactwa wiązania dla antygenu i innych korzystnych właściwości biologicznych. Aby osiągnąć ten cel, według korzystnego sposobu, przeciwciała humanizowane otrzymuje się w procesie analizy sekwencji macierzystych i różnych koncepcyjnych humanizowanych produktów, z zastosowaniem trójwymiarowych modeli sekwencji macierzystych i humanizowanych. Trójwymiarowe modele immunoglobulin są powszechnie dostępne i znane znawcom. Dostępne są programy komputerowe obrazujące i prezentujące prawdopodobne, trójwymiarowe struktury konformacyjne wybranych kandydatów na sekwencje immunoglobulin. Przegląd tych prezentacji pozwala na analizę prawdopodobnej roli reszt w funkcjonowaniu proponowanej sekwencji immunoglobulinowej, tj. analizę reszt, które wpływają na zdolność immunoglobuliny-kandydata do wiązania jej antygenu. W ten sposób można wybierać i łączyć reszty FR z sekwencji otrzymującej i importowanej dla osiągnięcia pożądanych cech przeciwciała, takich jak zwiększone powinowactwo wobec antygenu (antygenów) docelowych. Ogólnie, reszty regionu hiperzmiennego są bezpośrednio i najbardziej zasadniczo związane z wpływaniem na wiązanie antygenu. [0293] Pod uwagę bierze się różne postacie przeciwciała humanizowanego anty-il-17a/f. Przykładowo, przeciwciało humanizowane może być fragmentem przeciwciała, takim jak Fab, który jest opcjonalnie sprzężony z jednym lub większą liczbą środka (środków) cytotoksycznych dla utworzenia immunokoniugatu. Alternatywnie, przeciwciało humanizowane może być przeciwciałem pełnym, takim jak pełne przeciwciało IgG1. [0294] Jako alternatywa do humanizowania, wytwarzać można przeciwciała ludzkie. Przykładowo, możliwe jest obecnie otrzymywanie zwierząt transgenicznych (np. myszy), które są zdolne, po immunizacji, do wytwarzania pełnego repertuaru przeciwciał ludzkich, przy braku wytwarzania immunoglobulin endogennych. Przykładowo opisano, że delecja homozygotyczna genu regionu łączącego łańcuchy ciężkie (J H ) przeciwciała u myszy chimerycznych i o zmutowanej linii zarodkowej skutkuje całkowitym zahamowaniem wytwarzania przeciwciał endogennych. Przeniesienie układu ludzkich genów immunoglobulin linii zarodkowej do takich myszy o zmutowanej linii zarodkowej skutkować będzie, po prowokacji antygenem, wytwarzaniem przeciwciał ludzkich. Patrz, np. Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno. 7:33 (1993); Patenty USA nr 5,545,806, 5,569,825, 5,591,669 (wszystkie dla GenPharm); 5,545,807; i WO 97/17852.

101 100 [0295] Alternatywnie, można stosować technologię prezentacji fagowej (McCafferty et al., Nature 348: [1990]) do wytwarzania ludzkich przeciwciał i fragmentów przeciwciał in vitro z repertuarów genów domeny zmiennej (V) immunoglobulin od nieimmunizowanych dawców. Zgodnie z tą techniką, geny domen V przeciwciała klonuje się zgodnie z ramką odczytu do genu głównego lub pobocznego białka otoczki bakteriofaga filamentowego, takiego jak M13 lub fd, i prezentuje jako fragmenty funkcjonalnego przeciwciała na powierzchni cząstki fagowej. Ponieważ cząstki filamentowe zawierają kopię jednoniciowego DNA genomu faga, selekcja oparta na właściwościach funkcjonalnych przeciwciała skutkuje również selekcją genu kodującego przeciwciało wykazujące te cechy. A zatem, fag naśladuje pewne własności komórki B. Prezentację fagową można przeprowadzać na wiele sposobów, których przegląd przedstawiono np. w Johnson, Kevin S. i Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3: (1993). Do prezentacji fagowej zastosować można kilka źródeł segmentów genu V. Clackson et al., Nature, 352: (1991) wyizolowali różne układy przeciwciał antyoksazolowych z małej, losowej, kombinatorycznej biblioteki genów V, pochodzących ze śledzion immunizowanych myszy. Można utworzyć repertuar genów V od nieimmunizowanych, ludzkich dawców i można wyizolować przeciwciała względem różnych układów antygenów (włączając auto-antygeny), zasadniczo postępując zgodnie z technikami opisanymi przez Marks et al.,.j. Mol. Biol. 222: (1991) lub Griffith et al., EMBO J. 12: (1993). Patrz również Patenty USA nr 5,565,332 i 5,573,905. [0296] Jak omówiono powyżej, ludzkie przeciwciała można również wytwarzać stosując aktywowane in vitro komórki B (patrz Patenty USA 5,567,610 i 5,229,275). 4. Fragmenty Przeciwciał [0297] W niektórych okolicznościach istnieją zalety stosowania fragmentów przeciwciał zamiast całych przeciwciał. Mniejszy rozmiar fragmentów pozwala na szybki klirens i może prowadzić do lepszego dostępu do guzów litych. [0298] Do wytwarzania fragmentów przeciwciał opracowano różne techniki. Tradycyjnie, fragmenty te pochodziły z trawienia proteolitycznego pełnych przeciwciał (patrz, np. Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: (1992); i Brennan et al., Science, 229:8 (1985)). Obecnie fragmenty można jednak wytwarzać bezpośrednio z rekombinowanych komórek gospodarza. Wszystkie spośród fragmentów Fab, Fv i scfv przeciwciał mogą być ekspresjonowane w i wydzielane przez E. coli, co pozwala na łatwe otrzymywanie dużych ilości tych fragmentów. Fragmenty przeciwciał można izolować z omówionych powyżej fagowych bibliotek przeciwciałowych. Alternatywnie, fragmenty Fab'-SH można bezpośrednio odzyskiwać z E. coli i sprzęgać chemicznie dla utworzenia fragmentów F(ab') 2 (Carter et al., Bio/Technology 10: (1992)). Zgodnie z innym podejściem, fragmenty F(ab') 2 można izolować bezpośrednio z hodowli rekombinowanych komórek gospodarza. Fragmenty Fab i F(ab') 2 o zwiększonym okresie półtrwania, zawierające reszty epitopu wiążącego receptor ratujący, opisano w patencie USA nr 5,869,046. Inne techniki wytwarzania fragmentów przeciwciał będą oczywiste dla znawcy. W innych przykładach wykonania, wybranym przeciwciałem jest jednołańcuchowy fragment Fv (scfv).

102 101 Patrz WO 93/16185; patent USA nr 5,571,894; i patent USA nr 5,587,458. Fv i sfv są jedynymi rodzajami z pełnymi miejscami łączącymi, które są pozbawione regionów stałych; z tego względu są one odpowiednie dla zmniejszonego, niespecyficznego wiązania podczas stosowania in vivo. Dla uzyskania fuzji białka efektorowego, zarówno na końcu aminokwasowym, jak i karboksylowym scfv, konstruować można białka fuzyjne sfv. Patrz, Antibody Engineering, red. Borrebaeck, supra. Fragmentem przeciwciała może również być przeciwciało liniowe", np. jak przykładowo opisano w patencie USA nr 5,641,870. Takie fragmenty przeciwciała liniowego mogą być monospecyficzne lub bispecyficzne. 5. Przeciwciała Bispecyficzne [0299] Przeciwciała bispecyficzne są przeciwciałami o swoistości wiązania dla co najmniej dwóch różnych epitopów. Przykładowe przeciwciała bispecyficzne mogą wiązać się do dwóch różnych epitopów na białku IL-17A/G, jak opisano. Inne takie przeciwciała mogą łączyć miejsce wiązania IL-17A/F z miejscem wiązania dla innego białka. Alternatywnie, ramię [przeciwciała] anty-il-17a/f można łączyć z ramieniem [przeciwciała], które wiąże się do cząsteczki wyzwalającej na leukocycie, takiej jak cząsteczka receptora komórki T (np. CD3) lub receptorów Fc dla IgG (FcyR), takich jak FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) i FcγRIII (CD16) dla skupienia i umiejscowienia komórkowych mechanizmów obronnych na komórkach ekspresjonujących Il-17A/F. Przeciwciała bispecyficzne można również stosować do lokalizowania środków cytotoksycznych przy komórkach ekspresjonujących IL-17A/F. Przeciwciała te mają ramię wiążące IL-17A/F i ramię wiążące środek cytotoksyczny (np. saporynę, anty-interferon-α, alkaloid barwinka, łańcuch A rycyny, metotreksat lub hapten w postaci izotopu radioaktywnego). Przeciwciała bispecyficzne można otrzymywać jako przeciwciała pełnej długości lub fragmenty przeciwciał (np. przeciwciała bispecyficzne F(ab') 2 ). [0300] WO 96/16673 opisuje bispecyficzne przeciwciało anty-erbb2/anty-fcγriii, a patent USA nr 5,837,234 ujawnia bispecyficzne przeciwciało anty-erbb2/anty-fcγri. Bispecyficzne przeciwciało anty-erbb2/fc α przedstawiono w WO98/ patent USA nr 5,821,337 przekazuje wiedzę na temat bispecyficznego przeciwciała anty-erbb2/anty-cd3 [0301] Sposoby wytwarzania przeciwciał bispecyficznych są znane w stanie techniki. Tradycyjne wytwarzanie przeciwciał bispecyficznych pełnej długości oparte jest na koekspresji dwóch par łańcuch ciężki łańcuch lekki immunoglobuliny, przy czym dwa łańcuchy mają różne swoistości (Millstein et al., Nature, 305: (1983)). Ze względu na losowy dobór łańcuchów ciężkich i lekkich immunoglobulin, te hybrydomy (kwadromy) wytwarzają potencjalnie mieszaninę 10 różnych cząsteczek przeciwciał, z których tylko jedna ma właściwą strukturę bispecyficzną. Oczyszczanie właściwej cząsteczki, którego dokonuje się zazwyczaj poprzez etapy chromatografii powinowactwa, jest stosunkowo niewygodne, a wydajność produktu jest mała. Podobne procedury ujawniono w WO 93/08829i w Traunecker et al., EMBO J. 10: (1991). [0302] Zgodnie z innym podejściem, domeny zmienne przeciwciał o pożądanych swoistościach wiązania (miejscach wiązania przeciwciała z antygenem) są łączone z

103 102 sekwencjami domen stałych immunoglobulin. Korzystnie, fuzji dokonuje się z domeną stałą łańcucha ciężkiego Ig, zawierającą co najmniej część regionów zawiasowego, C H 2 i C H 3. Korzystne jest, aby pierwszy region stały łańcucha ciężkiego (C H 1), zawierający miejsce konieczne do wiązania łańcucha lekkiego, występował w co najmniej jednej z fuzji. DNA kodujące fuzje łańcucha ciężkiego immunoglobuliny i, w razie potrzeby, łańcucha lekkiego immunoglobuliny, wprowadza się do oddzielnych wektorów ekspresyjnych i kotransfekuje się do komórki odpowiedniego gospodarza. Zapewnia to dużą elastyczność w dostosowywaniu wzajemnych proporcji trzech fragmentów polipeptydowych w przykładach wykonania, w których optymalną wydajność pożądanego przeciwciała bispecyficznego zapewnia nierówny stosunek trzech łańcuchów polipeptydowych, zastosowanych podczas konstrukcji. Możliwe jest jednak wprowadzanie sekwencji kodujących dla dwóch lub wszystkich trzech łańcuchów polipeptydowych do jednego wektora ekspresyjnego, gdy ekspresja co najmniej dwóch łańcuchów polipeptydowych w równych stosunkach skutkuje uzyskaniem dużej wydajności, lub gdy stosunki nie wpływają znacząco na "uzysk" pożądanej kombinacji łańcuchów. [0303] W jednym z korzystnych przykładów wykonania takiego podejścia, przeciwciała bispecyficzne składają się z łańcucha ciężkiego immunoglobuliny hybrydowej o pierwszej swoistości wiązania w jednym ramieniu i parą łańcuch ciężki - łańcuch lekki immunoglobuliny hybrydowej (zapewniającą drugą swoistość wiązania) w drugim ramieniu. Stwierdzono, że ta asymetryczna struktura ułatwia oddzielenie pożądanego bispecyficznego związku od niepożądanych kombinacji łańcuchów immunoglobulin, ponieważ obecność łańcucha lekkiego immunoglobuliny tylko w połowie cząsteczki bispecyficznej pozwala na łatwe rozdzielenie. Takie podejście ujawniono WO 94/ W celu zapoznania się z dalszymi szczegółami wytwarzania przeciwciał bispecyficznych patrz, przykładowo, Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986). [0304] Według innego podejścia, opisanego w patencie USA nr 5,731,168, powierzchnia oddziaływania pomiędzy parą cząsteczek przeciwciał może zostać przekształcona tak, aby zmaksymalizować procent heterodimerów odzyskiwanych z hodowli komórek rekombinowanych. Korzystna powierzchnia oddziaływania zawiera co najmniej część domeny C H 3. W tym sposobie, jeden lub więcej łańcuchów bocznych małych aminokwasów z powierzchni oddziaływania pierwszej cząsteczki przeciwciała zastępuje się większymi łańcuchami bocznymi (np. tyrozyny lub tryptofanu). Na powierzchni oddziaływania drugiej cząsteczki przeciwciała wytwarza się kompensujące zagłębienia o identycznym lub podobnym rozmiarze jak większy łańcuch (łańcuchy) boczne poprzez zastąpienie dużych łańcuchów bocznych aminokwasów mniejszymi (np. alaniny lub treoniny). Zapewnia to mechanizm zwiększający wydajność powstawania heterodimeru w porównaniu z niepożądanymi produktami końcowymi, takimi jak homodimery. [0305] Przeciwciała bispecyficzne obejmują przeciwciała usieciowane lub "heterokoniugaty". Przykładowo, jedno z przeciwciał w heterokoniugacie może być sprzężone z awidyną, a drugie z biotyną. Zasugerowano, przykładowo, że takie przeciwciała nakierowują komórki układu immunologicznego na komórki niepożądane (patent USA nr 4,676,980) i do leczenia

104 103 infekcji HIV (WO 91/00360, WO 92/200373i EP 03089). Przeciwciała heterokoniugatowe można wytwarzać z zastosowaniem jakichkolwiek dogodnych sposobów sieciowania. Odpowiednie środki sieciujące są dobrze znane w stanie techniki i ujawniono je w patencie USA nr 4,676,980, razem z licznymi technikami sieciowania. [0306] Techniki wytwarzania przeciwciał bispecyficznych z fragmentów przeciwciał opisano również w literaturze. Przykładowo, przeciwciała bispecyficzne można otrzymywać z zastosowaniem wiązania chemicznego. Brennan et al., Science 229:81 (1985) opisują procedurę, w której przeciwciała nienaruszone cięte są proteolitycznie dla utworzenia fragmentów F(ab') 2. Fragmenty te redukuje się w obecności ditiolowego środka kompleksującego, arsenianu sodowego, dla stabilizowania sąsiednich ditioli i zapobiegania tworzeniu międzycząsteczkowych mostków disiarczkowych. Otrzymane fragmenty Fab' przekształca się następnie w pochodne tionitrobenzoesowe (TNB). Jedną z pochodnych Fab'- TNB przekształca się następnie w Fab'-tiol na drodze redukcji merkaptoetyloaminą i miesza się z równomolową ilością innej pochodnej Fab'-TNB, dla utworzenia przeciwciała bispecyficznego. Wytworzone przeciwciała bispecyficzne można stosować jako środki do wybiórczej immobilizacji enzymów. [0307] Niedawny postęp ułatwił bezpośrednie odzyskiwanie fragmentów Fab'-SH z E. coli, które można sprzęgać chemicznie dla utworzenia przeciwciał bispecyficznych. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: (1992) opisali wytwarzanie w pełni humanizowanej, bispecyficznej cząsteczki przeciwciała F(ab ) 2. Każdy fragment Fab' był oddzielnie wydzielany z E. coli i poddawany bezpośredniemu sprzęganiu chemicznemu in vitro dla utworzenia przeciwciała bispecyficznego. Tak wytworzone przeciwciało bispecyficzne było zdolne do wiązania się do komórek nadekspresjonujących receptor ErbB2 i prawidłowych, ludzkich komórek T, jak również do wyzwalania aktywności litycznej ludzkich limfocytów cytotoksycznych przeciwko celom na ludzkim nowotworze sutka. Opisano również różne techniki wytwarzania i izolowania fragmentów przeciwciał bispecyficznych bezpośrednio z hodowli komórek rekombinowanych. Przykładowo, przeciwciała bispecyficzne wytwarzano z zastosowaniem zamków leucynowych. Kostelny et al J. Immunol. 148(5): (1992). Peptydy zamka leucynowego białek Fos i Jun związano z częściami Fab' dwóch różnych przeciwciał przez fuzję genów. Homodimery przeciwciał zredukowano w regionie zawiasowym dla utworzenia monomerów, a następnie ponownie utleniono dla utworzenia heterodimerów przeciwciał. Sposób ten można również wykorzystać do otrzymywania homodimerów przeciwciał. Technologia "diciał", opisana przez Hollinger et a Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: (1993) zapewniła alternatywny mechanizm wytwarzania fragmentów przeciwciał bispecyficznych Fragmenty zawierają V H połączoną z V L za pośrednictwem łącznika, który jest za krótki aby umożliwić sparowanie między dwiema domenami tego samego łańcucha. Odpowiednio, na domenach V H i V L jednego fragmentu wymusza się łączenie w pary z komplementarnymi domenami V L i V H drugiego fragmentu, tworząc w ten sposób dwa miejsca wiązania antygenu. Przedstawiono również inną strategię wytwarzania fragmentów przeciwciał bispecyficznych poprzez zastosowanie dimerów jednołańcuchowego Fv (scfv). Patrz Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).

105 104 [0308] Rozważa się przeciwciała o więcej niż dwóch wartościowościach. Przykładowo, można otrzymywać przeciwciała trójspecyficzne. Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991). 6. Przeciwciała Heterokoniugatowe [0309] Przeciwciała heterokoniugatowe są ujawnione.przeciwciała heterokoniugatowe złożone są z dwóch przeciwciał połączonych kowalencyjnie. Przykładowo zasugerowano, że takie przeciwciała nakierowują komórki układu immunologicznego na komórki niepożądane (patent USA nr 4,676,980) i leczą infekcję HIV (WO 91/00360, WO 92/200373i EP 03089). Pod uwagę bierze się, że przeciwciała można otrzymywać in vitro, stosując sposoby znane w chemii syntetycznej białek, włączając te obejmujące środki sieciujące. Przykładowo, stosując reakcję wymiany disiarczkowej lub tworząc wiązanie tioeterowe konstruować można immunotoksyny. Przykłady odczynników odpowiednich do tego celu obejmują iminotiolan i metylo-4-merkaptobutyroimidan oraz te ujawnione, przykładowo, w patencie USA nr 4,676, Przeciwciała Wielowartościowe [0310] Przeciwciało wielowartościowe może być zinternalizowane (i/lub katabolizowane) szybciej niż przeciwciało dwuwartościowe przez komórkę ekspresjonującą antygen, z którym przeciwciała się wiążą. Przeciwciała według wynalazku mogą być przeciwciałami wielowartościowymi (które są inne niż z klasy IgM) z trzema lub większą ilością miejsc wiązania antygenu (np. przeciwciała czterowartościowe), które można łatwo otrzymywać poprzez rekombinacyjną ekspresję kwasu nukleinowego kodującego łańcuchy polipeptydowe przeciwciała. Przeciwciało wielowartościowe może zawierać domenę dimeryzacji i trzy lub większą ilość miejsc wiązania antygenu. Korzystna domena dimeryzacji zawiera (lub składa się z) regionu Fc lub regionu zawiasowego. W takiej sytuacji, przeciwciało będzie zawierać region Fc i trzy lub większą ilość miejsc wiązania antygenu na końcu aminowym regionu Fc. Korzystne przeciwciało wielowartościowe obejmuje (lub składa się z) trzech do około ośmiu, lecz korzystnie czterech miejsc wiązania antygenu. Przeciwciało wielowartościowe zawiera co najmniej jeden łańcuch polipeptydowy (a korzystnie dwa łańcuchy polipeptydowe), przy czym łańcuch (łańcuchy) polipeptydowe zawierają dwie lub większą liczbę domen zmiennych. Przykładowo, łańcuch (łańcuchy) polipeptydowe mogą zawierać VD1-(X1) n - VD2-(X2) n -Fc, przy czym VD1 jest pierwszą domeną zmienną, VD2 jest drugą domeną zmienną, Fc jest jednym łańcuchem polipeptydowym regionu Fc, X1 i X2 reprezentują aminokwas lub polipeptyd, a n oznacza 0 lub 1. Przykładowo, łańcuch (łańcuchy) polipeptydowe mogą zawierać: łańcuch VH-CH1-elastyczny łącznik-vh-ch1-regionu Fc; lub łańcuch VH-CH1-VH-CH1- regionu Fc. Przeciwciało wielowartościowe zawiera ponadto korzystnie co najmniej dwa (a korzystnie cztery) polipeptydy domen zmiennych łańcucha lekkiego. Przeciwciało wielowartościowe może, przykładowo, zawierać od około dwóch do około ośmiu polipeptydów domen zmiennych łańcucha lekkiego. Brane pod uwagę polipeptydy domen zmiennych łańcucha lekkiego zawierają domenę zmienną łańcucha lekkiego i opcjonalnie, zawierają ponadto domenę CL. 8. Opracowywanie Funkcji Efektorowej

106 105 [0311] Pożądane może być modyfikowanie przeciwciała według wynalazku w odniesieniu do funkcji efektorowej, np. aby wzmacniać przeciwciałową cytotoksyczność komórkową zależną od antygenu (ADCC) i/lub cytotoksyczność zależną od dopełniacza (CDC). Można to osiągać przez wprowadzanie jednego lub większej ilości podstawień aminokwasowych do regionu Fc przeciwciała. Alternatywnie lub dodatkowo, reszta (reszty) cysteinowe można wprowadzić do regionu Fc, umożliwiając w ten sposób tworzenie w tym regionie międzyłańcuchowych wiązań disiarczkowych. Wytworzone w ten sposób przeciwciało homodimeryczne może wykazywać lepszą zdolność do internalizacji i/lub zwiększoną, zależną od dopełniacza zdolność do zabijania komórek i zależną od przeciwciał cytotoksyczność komórkową (ADCC). Patrz Caron et al., J. Exp Med. 176: (1992) i Shopes, B. J. Immunol. 148: (1992). Przeciwciała homodimeryczne o zwiększonej aktywności przeciwguzowej można również otrzymywać z zastosowaniem heterobifunkcjonalnych łączników sieciujących, jak opisano w Wolff et al. Cancer Research 53: (1993). Alternatywnie, można zaprojektować przeciwciało posiadające podwójne regiony Fc i dzięki temu można wzmocnić lizę pod wpływem dopełniacza i zdolności do ADCC. Patrz Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3: (1989). Dla wydłużenia czasu półtrwania przeciwciała w surowicy, do przeciwciała (w szczególności fragmentu przeciwciała) można włączać epitop wiążący receptor ratujący, jak opisano przykładowo w patencie USA 5,739,277. Wyrażenie "epitop wiążący receptor ratujący" dotyczy epitopu z regionu Fc cząsteczki IgG (np. IgG 1, IgG 2, IgG 3 lub IgG 4 ), który jest odpowiedzialny za zwiększanie okresu półtrwania cząsteczki IgG w surowicy, in vivo. 9. Immunokoniugaty [0312] Ujawnione są również immunokoniugaty zawierające przeciwciało skoniugowane do środka cytotoksycznego, takiego jak środek chemioterapeutyczny, środek hamujacy wzrost, toksyna (np. toksyna aktywna enzymatycznie pochodzenia bakteryjnego, grzybowego, roślinnego lub zwierzęcego, lub jej fragmenty) lub izotop radioaktywny (tj. radiokoniugat). [0313] Środki chemioterapeutyczne użyteczne w tworzeniu takich immunokoniugatów opisano powyżej. Toksyny aktywne enzymatycznie i ich fragmenty, które można stosować, obejmują łańcuch A błonicy, niewiążące, aktywne fragmenty toksyny błoniczej, łańcuch A egzotoksyny (z Pseudomonas aeruginosa), łańcuch A rycyny, łańcuch A abryny, łańcuch A modecyny, alfa-sarcynę, białka Aleurites fordii, białka diantyny, białka Phytolacca americana (PAPI, PAPII i PAP-S), inhibitor balsamki ogórkowatej, kurcynę, krotynę, inhibitor mydlnicy lekarskiej, geloninę, mitogelinę, restryktocynę, fenomycynę, enomycynę i trikotekany. Liczne radionuklidy dostępne są do wytwarzania przeciwciał radiokoniugatowych. Przykłady obejmują 212 Bi, 131 I, 131 In, 90 Y i 186 Re. Koniugaty przeciwciała i środka cytotoksycznego wytwarza się stosując różne dwufunkcyjne środki sprzęgające białka, takie jak N- sukcynoimidylo-3-(2-pirydyloditiolo) propionian (SPDP), iminotiolan (IT), dwufunkcyjne pochodne imidoestrów (takie jak adypimidan dimetylu HCL), czynne estry (takie jak suberan sukcynoimidylu), aldehydy (takie jak aldehyd glutarowy), związki bis-azydowe (takie jak bis(p-azydobenzoilo)heksanodiamina), pochodne bis-diazoniowe (takie jak bis-(pdiazoniobenzoilo)-etylenodiamina), diizocyjaniany (takie jak 2,6-diizocyjanian toluenu) i bis-

107 106 aktywne związki fluoru (takie jak 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). Przykładowo, immunotoksynę rycynową otrzymywać można jak opisano w Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). Wyznakowany węglem 14 kwas 1-izotiocyjanianobenzylo-3- metylodietylenotriaminopentaoctowy (MX-DTPA) jest przykładowym czynnikiem chelatującym do koniugowania radionukleotydu z przeciwciałem. Patrz WO94/ [0314] Pod uwagę bierze się również koniugaty przeciwciała i jednej lub większej ilości toksyn drobnocząsteczkowych, takich jak kalicheamycyna, maitanzynoidy, trichoten i CC1065 oraz pochodne tych toksyn o aktywności toksyny. Maitanzyna i maitanzynoidy [0315] Alternatywnie, przeciwciało anty-il-17a/f (pełnej długości lub fragmenty) według wynalazku skoniugowane jest z jedną lub większą ilością cząsteczek maitanzynoidu. [0316] Maitanzynoidy są mitotoksycznymi inhibitorami, które działają poprzez hamowanie polimeryzacji tubuliny. Maitanzynę wyizolowano po raz pierwszy z wschodnioafrykańskiego krzewu Maytenus serrata (patent USA nr 3,896,111). Następnie odkryto, że niektóre mikroorganizmy również wytwarzają maitanzynoidy takie jak maitanzynol i estry C-3 maitanzynolu (patent USA nr 4,151,042). Syntetyczny maitanzynol oraz jego pochodne i analogi ujawniono, przykładowo, w patentach USA nr 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929;4,317,821;4,322,348;4,331,598;4,361,650;4,364,866;4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; i 4,371,533. Koniugaty maitanzynoid-przeciwciało [0317] Usiłując poprawić ich indeks terapeutyczny, maitanzynę i maitanzynoidy koniugowano z przeciwciałami specyficznie wiążącymi się do antygenów komórki guza. Immunokoniugaty zawierające maitanzynoidy oraz ich zastosowanie terapeutyczne ujawniono, przykładowo, w patentach USA nr 5,208,020, 5,416,064 i patencie Europejskim EP B1,. Liu et al.,proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: (1996) opisali immunokoniugaty zawierające maitanzynoid, nazywany DM I, przyłączony do przeciwciała monoklonalnego C242, skierowanego przeciwko ludzkiemu rakowi jelita grubego. Stwierdzono, że koniugat jest wysoce toksyczny względem hodowanych komórek raka okrężnicy i wykazuje działanie przeciwguzowe w badaniu wzrostu guza in vivo. Chari et al., Cancer Research 52: (1992) opisują immunokoniugaty, w których maitanzynoid skoniugowano via łącznik disiarczkowy z mysim przeciwciałem A7, wiążącym się do antygenu na komórkach linii ludzkiego raka okrężnicy lub z innym, mysim przeciwciałem monoklonalnym TA.1, które wiąże onkogen HER-2/ neu. Cytotoksyczność koniugatu TA.1- maitanzynoid testowano in vitro na linii komórkowej ludzkiego raka piersi SK-BR-3, która ekspresjonuje 3 x 10 5 antygenów powierzchniowych HER-2 na komórkę. Koniugat leku osiągnął stopień cytotoksyczności podobny do leku w postaci wolnego maitanzynoidu, który mógł być zwiększony poprzez zwiększenie liczby cząsteczek maitanzynoidu na cząsteczkę przeciwciała. Koniugat A7-maitanzynoid wykazał niską cytotoksyczność ogólnoustrojową u myszy.

108 107 Koniugaty przeciwciało anty-polipeptyd IL-17A/F-maitanzynoid (immunokoniugaty) [0318] Koniugaty przeciwciało anty-il-17a/f-maitanzynoid otrzymuje się poprzez chemiczne połączenie przeciwciała anty-il-17a/f z cząsteczką maitanzynoidu, bez znacznego zmniejszania aktywności biologicznej cząsteczki przeciwciała lub maitanzynoidu. Średnio 3-4 cząsteczki maitanzynoidu sprzężone z cząsteczką przeciwciała wykazały skuteczność we wzmacnianiu cytotoksyczności komórek docelowych bez negatywnego wpływu na działanie lub rozpuszczalność przeciwciała, pomimo że oczekiwano, iż nawet jedna cząsteczka toksyny/przeciwciała zwiększy cytotoksyczność ponad zastosowanie nagiego przeciwciała. Maitanzynoidy są dobrze znane w stanie techniki i mogą być syntezowane znanymi technikami lub izolowane ze źródeł naturalnych. Odpowiednie maitanzynoidy ujawniono, przykładowo, w patencie USA nr 5,208,020 i w innych patentach i publikacjach niepatentowych przywołanych powyżej Korzystnymi maitanzynoidami są maitanzynol i analogi maitanzynolu zmodyfikowane w pierścieniu aromatycznym lub na innych pozycjach cząsteczki maitanzynolu, takie jak różne estry maitanzynolu. [0319] Istnieje wiele grup łącznikowych znanych w stanie techniki, służących do wytwarzania koniugatów przeciwciało-maitanzynoid, obejmujących, przykładowo, te ujawnione patencie USA nr 5,208,020 lub patencie EP B1i Chari et al., Cancer Research 52: (1992). Grupy łącznikowe obejmują grupy disiarczkowe, grupy tioeterowe, grupy kwasowo-labilne, grupy fotolabilne, grupy peptydazowo-labilne lub grupy esterazowo-labilne, jak ujawniono w powyżej zdefiniowanych patentach, przy czym preferowane są grupy disiarczkowe i tioeterowe. [0320] Koniugaty przeciwciała i maitanzynoidu można wytwarzać stosując różne dwufunkcyjne środki sprzęgające białka, takie jak N-sukcynoimidylo-3-(2-pirydyloditio) propionian (SPDP), sukcynoimidylo-4-(n-maleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylan, iminotiolan (IT), dwufunkcyjne pochodne imidoestrów (takie jak adipimidan dimetylu HCL), czynne estry (takie jak suberan disukcynoimidylu), aldehydy (takie jak aldehyd glutarowy), związki bis-azydowe (takie jak bis (p-azydobenzoilo)heksanodiamina), pochodne bisdiazoniowe (takie jak bis-(p-diazoniobenzoilo)-etylenodiamina), diizocyjaniany (takie jak 2,6- diizocyjanian toluenu) i bis-aktywne związki fluoru (takie jak 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). Szczególnie korzystne środki sprzęgające dla zapewniania połączenia disiarczkowego obejmują N-bursztynoimidylo-3-(2-pirydyloditio)propionian (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173: [1978]) i N-sukcynoimidylo-4-(2-pirydylotio)pentanian (SPP). [0321] Łącznik można przyłączać do cząsteczki maitanzynoidu na różnych pozycjach, zależnie od rodzaju wiązania. Przykładowo, przyłączenie estru można utworzyć poprzez reakcję z grupą hydroksylową, stosując konwencjonalne techniki sprzęgania. Reakcja może zachodzić na pozycji C-3, mającej grupę hydroksylową, pozycji C-14 zmodyfikowanej hydroksymetylem, pozycji C-15 zmodyfikowanej grupą hydroksylową i pozycji C-20, mającej grupę hydroksylową. W korzystnym przykładzie wykonania, połączenie tworzy się na pozycji C-3 maitanzynolu lub analogu maitanzynolu. Kalicheamycyna

109 108 [0322] Inny immunokoniugat będący przedmiotem zainteresowania, zawiera przeciwciało anty-il-17a/f skoniugowane do jednej lub większej ilości cząsteczek kalicheamycyny. Rodzina antybiotyków kalicheamycyny w stężeniach sub-pikomolowych jest zdolna do wytwarzania dwuniciowych przerw DNA. Dla otrzymania koniugatów z rodziny kalicheamycyny patrz patenty USA 5,712,374,5,714,586,5,739,116,5,767,285,5,770,701,5,770,710,5,773,001,5,877,296 (wszystkie dla American Cyanamid Company). Analogi strukturalne kalicheamycyny, które można stosować, obejmują, ale w sposób nieograniczający, γ 1 1, α 2 1, α 3 1, N-acetylo-γ 1 1, PSAG i θ 1 1 (Hinman et al., Cancer Research 53: (1993), Lode et al., Cancer Research 58: (1998) i wymienione wyżej patenty USA dla American Cyanamid). Innym lekiem przeciwrakowym, z którym można sprzęgać przeciwciało, jest QFA będący antyfolianem. Zarówno kalicheamycyna, jak i QFA mają wewnątrzkomórkowe miejsca działania i z trudem przenikają przez błonę komórkową. Komórkowa absorpcja tych środków poprzez internalizację za pośrednictwem przeciwciała w olbrzymim stopniu zwiększa zatem ich działania cytotoksyczne. Inne środki cytotoksyczne [0323] Inne środki przeciwguzowe, które można koniugować do przeciwciał anty-il-17a/f według wynalazku obejmują BCNU, streptozoicynę, winkrystynę i 5-fluorouracyl, rodzinę środków znanych łącznie jako kompleks LL-E33288, opisano w patentach USA 5,053,394, 5,770,710, jak również esperamicyny (patent USA 5,877,296). [0324] Toksyny aktywne enzymatycznie i ich fragmenty, które można stosować, obejmują łańcuch A błonicy, niewiążące, aktywne fragmenty toksyny błoniczej, łańcuch A egzotoksyny (z Pseudomonas aeruginosa), łańcuch A rycyny, łańcuch A abryny, łańcuch A modecyny, alfa-sarcynę, białka Aleurites fordii, białka diantyny, białka Phytolacca americana (PAPI, PAPII i PAP-S), inhibitor balsamki ogórkowatej, kurcynę, krotynę, inhibitor mydlnicy lekarskiej, geloninę, mitogelinę, restryktocynę, fenomycynę, enomycynę i trikotekany. Patrz, przykładowo WO 93/21232, opublikowany 28 października [0325] Ujawniono również immunokoniugat utworzony między przeciwciałem, a związkiem o aktywności nukleolitycznej (np. rybonukleazą lub endonukleazą DNA, taką jak dezoksyrybonukleaza; DNaza). [0326] Dla selektywnego niszczenia guza, przeciwciało może zawierać silnie radioaktywny atom. Do otrzymywania skoniugowanych radioaktywnie przeciwciał anty-il-17a/f dostępnych jest wiele różnych izotopów radioaktywnych. Przykłady obejmują At 211, I 131, I 125, Y 90, Re 186, Re 188, Sm 153, Bi 212, P 32, Pb 212 i izotopy radioaktywne Lu. Jeżeli koniugat stosuje się do diagnozowania, może zawierać on radioaktywny atom służący do badań scyntygraficznych, przykładowo tc 99m lub I 123, lub znacznik spinowy dla obrazowania jądrowego rezonansu magnetycznego (NMR, ang. nuclear magnetic resonance) (znanego również jako obrazowanie rezonansu magnetycznego MRI, ang. magnetic resonance imaging), taki jak jod-123, jod-131, ind-111, fluor-19, węgiel- 13, azot-15, tlen-17, gadolin, mangan lub żelazo.

110 109 [0327] Znaczniki radiologiczne lub inne można włączyć do koniugatu znanymi sposobami. Przykładowo, peptyd może być biosyntezowany lub może być syntezowany poprzez chemiczną syntezę aminokwasów z zastosowaniem odpowiednich prekursorów aminokwasów, włączając, przykładowo, fluor-19 w miejscu wodoru. Znaczniki takie jak tc 99m or I 123, Re 186, Re 188 i In 111 przyłączać można via resztę cysteiny w polipeptydzie. Itr-90 można przyłączać via resztę lizynową. Sposób IODOGEN (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: stosować można do wprowadzania jodu-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal,CRC Press 1989) opisuje szczegółowo inne sposoby. [0328] Koniugaty przeciwciała i i środka cytotoksycznego można wytwarzać stosując różne dwufunkcyjne środki sprzęgające białka, takie jak N-sykcynoimidylo-3-(2-pirydyloditio) propionian (SPDP), sukcynoimidylo-4-(n-maleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylan, iminotiolan (IT), dwufunkcyjne pochodne imidoestrów (takie jak adypimidan dimetylu HCL), czynne estry (takie jak suberan disukcynoimidylu), aldehydy (takie jak aldehyd glutarowy), związki bis-azydowe (takie jak bis(p-azydobenzoilo)heksanodiamina), pochodne bisdiazoniowe (takie jak bis-(p-diazoniobenzoilo)-etylenodiamina), diizocyjaniany (takie jak 2,6- diizocyjanian toluenu) i bis-aktywne związki fluoru (takie jak 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). Przykładowo, immunotoksynę rycynową otrzymywać można jak opisano w Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). Wyznakowany węglem 14 kwas 1-izotiocyjanianobenzylo-3- metylodietylenotriaminopentaoctowy (MX-DTPA) jest przykładem środka chelatującego do sprzęgania radionukleotydu z przeciwciałem. Patrz WO94/ Łącznik może być łącznikiem rozszczepialnym, ułatwiającym uwalnianie leku cytotoksycznego w komórce. Przykładowo, zastosować można łącznik kwasowo-labilny, łącznik wrażliwy na peptydazę, łącznik fotolabilny, łącznik dimetylowy lub łącznik zawierający disiarczek (Chari et al., Cancer Research 52: (1992); patent USA nr 5,208,020). [0329] Alternatywnie, można utworzyć białko fuzyjne, zawierające przeciwciało anty- IL17A/F i środek cytotoksyczny, np. za pomocą technik rekombinacyjnych lub syntezy peptydów. Długość DNA może obejmować odpowiednie regiony kodujące dwie części koniugatu, sąsiadujące ze sobą lub oddzielone regionem kodującym peptyd łącznikowy, który nie niszczy pożądanych właściwości koniugatu. [0330] Alternatywnie, przeciwciało może być skoniugowane z receptorem (takim jak streptawidyna) do zastosowania we wstępnym nakierowywaniu na guz, przy czym koniugat przeciwciało-receptor podaje się pacjentowi, po czy następuje usunięcie niezwiązanego koniugatu z krążenia przy zastosowaniu środka oczyszczającego, a następnie podawanie liganda (np. awidyny), sprzężonego ze środkiem cytotoksycznym (np. radionukleotydem). 10. Immunoliposomy [0331] Ujawnione przeciwciała anty-il-17a/f można również formułować jako immunoliposomy. "Liposom" oznacza mały pęcherzyk, utworzony z różnych typów lipidów, fosfolipidów i/lub surfaktantu, który jest użyteczny w dostarczaniu leku ssakowi. Składniki liposomu są zazwyczaj ułożone w formację dwuwarstwową, podobną do ułożenia lipidów z

111 110 błon biologicznych. Liposomy zawierające przeciwciało otrzymuje się sposobami znanymi w stanie techniki, takimi jak opisano w Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); Patenty USA nr 4,485,045 i 4,544,545; oraz WO97/38731, opublikowany 23 października, Liposomy o zwiększonym czasie cyrkulacji ujawniono w patencie USA nr 5,013,556. [0332] Szczególnie użyteczne liposomy można wytwarzać sposobem ewaporacji w układzie faz odwróconych z kompozycją lipidową zawierającą fosfatydylocholinę, cholesterol i fosfatydyloetanoloaminę pochodzącą od PEG (PEG-PE). Liposomy wytłacza się przez filtry o określonym rozmiarze otworów w celu uzyskania liposomów o pożądanej średnicy. Poprzez reakcję wymiany disiarczkowej do liposomów można koniugować fragmenty Fab przeciwciała według wynalazku, jak opisano w Martin et al., J. Biol. Chem. 257: (1982). Środek chemioterapeutyczny jest opcjonalnie zawarty w liposomie. Patrz, Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19):1484 (1989). N. Oligopeptydy Wiążące IL-17A/F [0333] Oligopeptydy wiążące IL-17A/F są oligopeptydami wiążącymi się, korzystnie specyficznie, do polipeptydu IL-17A/F, jak opisano. Oligopeptydy wiążące IL-17A/F można syntezować chemicznie stosując znaną metodologię syntezy oligopeptydów lub można je otrzymywać i oczyszczać stosując technologię rekombinacyjną. Oligopeptydy wiążące IL- 17A/F mają zazwyczaj co najmniej około 5 aminokwasów długości, alternatywnie co najmniej około 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 lub 100 aminokwasów długości lub więcej, przy czym takie oligopeptydy zdolne są do wiązania, korzystnie specyficznego, polipeptydu IL-17A/F, jak opisano. Oligopeptydy wiążące IL- 17A/F można identyfikować bez niepotrzebnego eksperymentowania, stosując dobrze znane techniki. W odniesieniu do tego zauważono, że techniki do badania przesiewowego bibliotek oligopeptydów zdolnych do specyficznego wiązania się do polipeptydu-celu, są dobrze znane w stanie techniki (patrz np. Patenty USA nr 5,556,762, 5,750,373, 4,708,871, 4,833,092, 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 5,663,143; Publikacje PCT nr WO 84/03506 i WO84/03564; Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81: (1984); Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: (1985); Geysen et al., w Synthetic Peptides as Antigens, (1986); Geysen et al., J. Immunol. Meth., 102: (1987); Schoofs et al., J. Immunol., 140: (1988), Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378; Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363 i Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668). [0334] W odniesieniu do tego, prezentacja bakteriofagowa (fagowa) jest jedną z dobrze znanych technik, pozwalających na badanie przesiewowe dużych bibliotek oligopeptydowych dla identyfikowania członka (członków) tych bibliotek, które zdolne są do specyficznego wiązania celu polipeptydowego. Prezentacja fagowa jest techniką, za pomocą której warianty

112 111 polipeptydów prezentowane są jako białka fuzyjne z białkiem płaszcza na powierzchni cząstek bakteriofagowych (Scott, J.K. i Smith, G. P. (1990) Science 249: 386). Użyteczność prezentacji fagowej polega na tym, że duże biblioteki wybiórczo randomizowanych wariantów białka (lub losowo sklonowanych cdna) można szybko i skutecznie sortować pod kątem tych sekwencji, które wiążą się do cząsteczki docelowej z wysokim powinowactwem. Prezentację bibliotek peptydowych (Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378) lub białkowych (Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363) na fagach stosuje się do badania przesiewowego milionów polipeptydów lub oligopeptydów pod kątem tych o specyficznych właściwościach wiążących (Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668). Przesiewanie bibliotek fagowych losowych mutantów wymaga strategii dla konstruowania i namnażania dużej liczby wariantów, procedury oczyszczania na zasadzie powinowactwa z zastosowaniem receptora docelowego i sposobów oceniania wzbogaceń [w warianty] wiążące. Patenty USA nr 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689i 5,663,143. [0335] Chociaż większość sposobów prezentacji fagowej stosuje fagi włókienkowe, znane są również systemy prezentacji na fagach lambdoidalnych (WO 95/34683; USA 5,627,024), systemy prezentacji na fagach T4 (Ren, Z-J. et al. (1998) Gene 215:439; Zhu, Z. (1997) CAN 33:534; Jiang, J. et al. (1997) can 128:44380; Ren, Z-J. et al. (1997) CAN 127:215644; Ren, Z-J. (1996) Protein Sci. 5:1833; Efimov, V. P. et al. (1995) Virus Genes 10:173) i systemy prezentacji na fagach T7 (Smith, G. P. i Scott, J.K. (1993) Methods in Enzymology, 217, ; USA 5,766,905). [0336] Obecnie opracowano wiele innych ulepszeń i wariacji podstawowej koncepcji prezentacji fagowej. Ulepszenia te zwiększają możliwości systemu prezentacji pod kątem badania przesiewowego bibliotek peptydowych dla wiązania wybranych cząsteczek docelowych i pod kątem prezentowania funkcjonalnych białek o potencjale do badania przesiewowego tych białek dla pożądanych właściwości. Opracowano kombinatoryczne narzędzia reakcji dla reakcji prezentacji fagowej (WO 98/14277) oraz stosowano biblioteki prezentacji fagowej do analizowania i kontrolowania oddziaływań dwucząsteczkowych (WO 98/20169; WO 98/20159) oraz właściwości unieruchomionych peptydów helikalnych (WO 98/20036). W WO 97/35196 opisano sposób izolowania liganda powinowactwa, w którym bibliotekę do prezentacji fagowej kontaktuje się z jednym roztworem, w którym ligand będzie się wiązał do cząsteczki docelowej i drugim roztworem, w którym ligand powinowactwa nie będzie wiązał się do cząsteczki docelowej, do selektywnego izolowania ligandów wiążących. W WO 97/46251 opisano sposób przeszukiwania [ang. biopanning] losowej biblioteki do prezentacji fagowej z przeciwciałem oczyszczonym na zasadzie powinowactwa, a następnie izolowania fagów wiążących, po czym następował proces mikroprzeszukiwania [ang. micropanning] z zastosowaniem dołków mikropłytek do izolacji fagów o wysokim powinowactwie wiązania. Donoszono również o zastosowaniu białka A Staphlylococcus aureus jako znacznika powinowactwa (Li et al. (1998) Mol Biotech., 9:187). W WO 97/47314 opisano zastosowanie bibliotek subtrakcyjnych substratu dla rozpoznawania specyficzności enzymu z zastosowaniem biblioteki kombinatorycznej, którą może stanowić

113 112 biblioteka do prezentacji fagowej. Sposób selekcjonowania enzymów odpowiednich do stosowania w detergentach z użyciem prezentacji fagowej opisano w WO 97/ Dodatkowe sposoby selekcjonowania specyficznych białek wiążących opisano w patentach USA nr 5,498,538, 5,432,018i WO 98/ [0337] Sposoby wytwarzania bibliotek peptydowych i badania przesiewowego tych bibliotek ujawniono również w patentach USA nr 5,723,286, 5,432,018, 5,580,717, 5,427,908, 5,498,530, 5,770,434, 5,734,018, 5,698,426, 5,763,192i 5,723,323. O. Organiczne Cząsteczki Wiążące IL-17A/F [0338] Cząsteczki organiczne wiążące IL-17A/F są cząsteczkami organicznymi innymi niż oligopeptydy lub przeciwciała, jak zdefiniowano, które wiążą się, korzystnie specyficznie, do polipeptydów IL-17A/F, jak opisano. Cząsteczki organiczne wiążące IL-17A/F można identyfikować i chemicznie syntezować stosując znaną metodologię (patrz, np. Publikacje PCT nr WO00/00823 i WO00/39585). Cząsteczki organiczne wiążące IL-17A/F mają zazwyczaj rozmiar mniejszy niż około 2000 daltonów, alternatywnie rozmiar mniejszy niż około 1500,750, 500, 250 lub 200 daltonów, przy czym takie cząsteczki organiczne, które zdolne są do wiązania się, korzystnie specyficznego, do polipeptydu IL-17A/F, jak opisano, można identyfikować bez zbędnego eksperymentowania stosując dobrze znane techniki. W odniesieniu do tego zauważono, że techniki do badania przesiewowego bibliotek cząsteczek organicznych pod kątem cząsteczek, które zdolne są do wiązania się do docelowego polipeptydu, są dobrze znane w stanie techniki (patrz, np. Publikacje PCT nr WO00/00823 i WO00/39585). Cząsteczki organiczne wiążące IL-17A/F mogą stanowić, przykładowo, aldehydy, ketony, oksymy, hydrazony, semikarbazony, karbazydy, aminy pierwszorzędowe, aminy drugorzędowe, aminy trzeciorzędowe, N-podstawione hydrazyny, hydrazydy, alkohole, etery, tiole, tioetery, disiarczki, kwasy karboksylowe, estry, amidy, moczniki, karbaminiany, węglany, ketale, tioketale, acetale, tioacetale, halogenki arylowe, sulfoniany arylowe, halogenki alkilowe, sulfoniany alkilowe, związki aromatyczne, związki heterocykliczne, aniliny, alkeny, alkiny, diole, aminoalkohole, oksazolidyny, oksazoliny, tiazolidyny, tiazoliny, enaminy, sulfonamidy, epoksydy, azyrydyny, izocyjaniany, chlorki sulfonylu, związki diazowe, chlorki kwasowe i tym podobne. P. Badania Przesiewowe pod Kątem Przeciwciał anty-il-17a/f, Polipeptydów Wiążących IL-17A/F i Cząsteczek Organicznych Wiążących IL-17A/F o Pożądanych Właściwościach [0339] Techniki do wytwarzania przeciwciał, oligopeptydów i cząsteczek organicznych wiążących się do polipeptydów 1L-17A/F opisano powyżej. Ponadto, jeżeli jest to pożądane, selekcjonować można przeciwciała, oligopeptydy lub inne cząsteczki organiczne o pewnych cechach biologicznych,. [0340] Hamujący wpływ na wzrost [wykazywany] przez przeciwciało anty-il17a/f, oligopeptyd lub inną cząsteczkę organiczną według wynalazku można oceniać sposobami znanymi w stanie techniki, np. z zastosowaniem komórek ekspresjonujących polipeptyd IL- 17A/F endogennie lub po transfekcji genem IL-17A/F. Przykładowo, odpowiednie linie komórkowe guza i komórki transfekowane IL-17A/F traktować można przeciwciałem

114 113 monoklonalnym anty-il-17a/f, oligopeptydem lub inną cząsteczką organiczną według wynalazku w różnych stężeniach przez kilka dni (np. 2-7) i wybarwiać fioletem krystalicznym lub MTT, lub analizować poprzez inne oznaczenie kolorymetryczne. Innym sposobem pomiaru proliferacji będzie porównanie wychwytu 3 H-tymidyny przez komórki traktowane w obecności lub nieobecności przeciwciała anty-il-17a/f, oligopeptydu wiążącego IL-17A/F lub cząsteczki organicznej wiążącej IL-17A/F według wynalazku. Po potraktowaniu komórki zbiera się, a ilość radioaktywności wbudowanej w DNA określa ilościowo na liczniku scyntylacyjnym. Odpowiednie kontrole pozytywne obejmują traktowanie wybranej linii komórkowej przeciwciałem hamującym wzrost, znanym z hamowania wzrostu tej linii komórkowej. Hamowanie wzrostu komórek guza in vivo można określać na różne sposoby znane w stanie techniki. Korzystnie, komórka guza jest tą, która nadekspresjonuje polipeptyd IL-17A/F. Korzystnie, przeciwciało anty-il-17a/f, oligopeptyd wiążący IL-17A/F lub cząsteczka organiczna wiążąca IL-17A/F będą hamować proliferację komórek z komórek guza ekspresjonujących IL-17A/F in vitro lub in vivo o około % w porównaniu do nietraktowanych komórek guza, korzystniej o około %, a jeszcze korzystniej o około % lub %, w jednym z przykładów wykonania, przy stężeniu przeciwciała wynoszącym około od 0,5 do 30 µg/ml. Hamowanie wzrostu można mierzyć przy stężeniu przeciwciała wynoszącym około 0,5 do 30 µg/ml lub około 0,5 nm do 200 nm w hodowli komórkowej, przy czym hamowanie wzrostu określa się 1-10 dni po ekspozycji komórek guza na przeciwciało. Przeciwciało hamuje wzrost in vivo, jeżeli podawanie przeciwciała anty-il-17a/f w ilości od około 1 µg/kg do około 100 mg/kg masy ciała skutkuje zmniejszeniem rozmiaru guza lub zmniejszeniem proliferacji komórek guza w ciągu od około 5 dni do 3 miesięcy od pierwszego podania przeciwciała, korzystnie w ciągu od około 5 do 30 dni. [0341] Dla selekcji przeciwciała anty-il-17a/f, oligopeptydu wiążącego IL-17A/F lub cząsteczki organicznej wiążącej IL-17A/F, która indukuje śmierć komórki, oceniać można, w stosunku do kontroli, utratę integralności błony wykazaną np. poprzez wychwyt jodku propidyny (PI), błękitu trypanu lub 7AAD. Oznaczanie wychwytu PI przeprowadzać można przy braku komplementu i immunologicznych komórek efektorowych. Komórki guza ekspresjonujące polipeptyd IL-17A/F inkubuje się z samą pożywką lub z pożywką zawierającą odpowiednie przeciwciało anty-il-17a/f (np. około 10µg/ml), oligopeptyd wiążący IL-17A/F lub cząsteczkę organiczną wiążącą IL-17A/F. Komórki inkubuje się przez okres 3-dniowy. Po każdym traktowaniu komórki przemywa się i porcjuje do probówek 12 x 75 zamkniętych filtrem 35 mm (1ml na probówkę, 3 probówki na grupę traktowania) dla usunięcia agregatów komórkowych. Do tubek dodaje się PI (10 µg/ml). Próbki można analizować z zastosowaniem cytometru przepływowego FACSCAN i oprogramowania FACSCONVERT CellQuest (Becton Dickinson). Te przeciwciała anty-il-17a/f, oligopeptydy wiążące IL-17A/F lub cząsteczki organiczne wiążące IL-17A/F, które indukują śmierć komórek na statystycznie znaczących poziomach, określanych poprzez wychwyt PI, wybierać można jako przeciwciała anty-il-17a/f, oligopeptydy wiążące IL-17A/F lub cząsteczki organiczne wiążące IL-17A/F, które indukują śmierć komórek.

115 114 [0342] Dla badania przesiewowego pod kątem przeciwciał, oligopeptydów lub innych cząsteczek organicznych wiążących się z epitopem na polipeptydzie IL-17A/F, związanym przez przeciwciało będące przedmiotem zainteresowania, przeprowadzać można rutynowe badanie blokowania krzyżowego, takie jak opisano w Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow i David Lane (1988). Badanie to można stosować dla określania czy testowe przeciwciało, oligopeptyd lub inna cząsteczka organiczna wiąże to samo miejsce lub epitop, jak znane przeciwciało anty-il-17a/f. Alternatywnie lub dodatkowo, mapowanie epitopu przeprowadzać można sposobami znanymi w stanie techniki. Przykładowo, do identyfikowania reszt kontaktowych, można przeprowadzać mutowanie sekwencji przeciwciała, tak jak poprzez skaning alaninowy. Dla upewnienia się o prawidłowym zwinięciu, mutowane przeciwciało testuje się początkowo pod kątem wiązania z przeciwciałem poliklonalnym. W innym sposobie, peptydy odpowiadające różnym regionom polipeptydu IL-17A/F stosować można w badaniach kompetycyjnych z przeciwciałami testowymi lub z przeciwciałem testowym i przeciwciałem ze scharakteryzowanym lub znanym epitopem. Q. Kompozycje Farmaceutyczne [0343] Aktywne cząsteczki IL-17A/F według wynalazku (np. polipeptydy IL-17A/F, przeciwciała anty-il-17a/f i/lub warianty każdego z nich), jak również inne cząsteczki zidentyfikowane poprzez ujawnione powyżej badania przesiewowe podawać można w postaci kompozycji farmaceutycznych do leczenia chorób o podłożu immunologicznym. Formulacje terapeutyczne aktywnych cząsteczek IL-17A/F, korzystnie polipeptydu lub przeciwciała według wynalazku, przygotowuje się do przechowywania poprzez mieszanie cząsteczki aktywnej o pożądanym stopniu czystości z opcjonalnymi, fizjologicznie dopuszczalnymi nośnikami, rozczynnikami lub stabilizatorami (Remington's Pharmaceutical Sciences, wydanie 16-te, Red. Osol, A. (1980)), w postaci formulacji liofilizowanych lub roztworów wodnych. Dopuszczalne nośniki, rozczynniki lub stabilizatory są nietoksyczne dla odbiorców w stosowanych dawkach i stężeniu, i obejmują bufory takie jak fosforan, cytrynian i inne kwasy organiczne; przeciwutleniacze, włączając kwas askorbinowy i metioninę; konserwanty (takie jak chlorek oktadecylodimetylobenzyloamoniowy; chlorek heksametonium; chlorek benzalkonium; chlorek benzetonium; fenol; alkohol butylowy lub benzylowy; parabeny alkilowe, takie jak metyl- lub propylparaben; katechol; rezorcynol; cykloheksanol; 3-pentanol i m-krezol); polipeptydy o małej masie cząsteczkowej (mniej niż około 10 reszt); białka, takie jak albumina surowicy, żelatyna lub immunoglobuliny; polimery hydrofilowe, takie jak poliwinylopirolidon; aminokwasy, takie jak glicyna, glutamina, asparagina, histydyna, arginina lub lizyna; monosacharydy, disacharydy i inne węglowodany, włączając glukozę, mannozę lub dekstryny; środki chelatujące, takie jak EDTA; cukry, takie jak sacharoza, mannitol, trehaloza lub sorbitol, przeciwjony tworzące sole, takie jak [jon] sodowy; kompleksy metali (np. kompleksy Zn-białko) i/lub niejonowe środki powierzchniowo czynne, takie jak TWEEN, PLURONICS lub glikol polietylenowy (PEG). [0344] Związki zidentyfikowane za pomocą ujawnionych badań przesiewowych formułować można w sposób analogiczny, stosując standardowe techniki, dobrze znane w stanie techniki.

116 115 [0345] Do dostarczania cząsteczki IL-17A/F do komórek stosować można również lipofekcje lub liposomy. Gdy stosuje się fragmenty przeciwciała, korzystny jest najmniejszy fragment hamujący, który wiąże się specyficznie do domeny wiążącej białka docelowego. Przykładowo, opierając się na sekwencjach regionu zmiennego przeciwciała projektować można cząsteczki peptydowe, które zachowują zdolność do wiązania sekwencji białka docelowego. Takie peptydy syntezować można chemicznie i/lub wytwarzać za pomocą technologii rekombinowanego DNA (patrz, np. Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: [1993]). [0346] Formulacje mogą zawierać również więcej niż jeden związek aktywny, jeśli jest to niezbędne dla szczególnych, leczonych objawów, korzystnie te o aktywnościach uzupełniających, które nie wpływają na siebie nawzajem niekorzystnie. Alternatywnie lub dodatkowo, kompozycja może zawierać środek cytotoksyczny, cytokinę lub środek hamujący wzrost. Małe cząsteczki są odpowiednio obecne w kombinacji w ilościach skutecznych do zamierzonego celu. [0347] Aktywne cząsteczki IL-17A/F mogą być również "uwięzione" w przygotowanych mikrokapsułkach, przykładowo, za pomocą technik koacerwacji lub za pomocą polimeryzacji międzyfazowej, przykładowo, mikrokapsułkach hydroksymetylocelulozowych lub żelatynowych i mikrokapsułkach poli-(metylometacylanowych), odpowiednio, w koloidalnym systemie dostarczania leków (przykładowo, liposomach, mikrokulkach albuminowych, mikroemulsjach, nanocząstkach i nanokapsułkach) lub w makroemulsjach. Takie techniki ujawniono w Remington's Pharmaceutical Sciences, wydanie 16-te, red. Osol, A. (1980). [0348] Formulacje do stosowania w podawaniu in vivo muszą być sterylne. Można to łatwo osiągnąć przez filtrowanie przez jałowe membrany filtracyjne. [0349] Otrzymywać można preparaty lub cząsteczki IL-17A/F o przedłużonym uwalnianiu. Odpowiednie przykłady preparatów o przedłużonym uwalnianiu obejmują półprzepuszczalne matryce ze stałych polimerów hydrofobowych zawierających przeciwciało, które to matryce występują w postaci przedmiotów o nadanym kształcie, np. błon lub mikrokapsułek. Przykłady matryc o przedłużonym uwalnianiu obejmują poliestry, hydrożele (przykładowo, poli(2-hydroksyetylometakrylan) lub poli(winyloalkohol)), polilaktydy (patent USA nr 3,773,919), kopolimery kwasu L-glutaminowego i L-glutaminianu γ-etylowego, niedegradowalny octan etylenowinylu, degradowalne kopolimery kwas mlekowy-kwas glikolowy, takie jak LUPRON DEPOT (iniekcyjne mikrokuleczki, składające się z kopolimeru kwas mlekowy-kwas glikolowy i octanu leuprolidu) i kwas poli-d-(-)-3- hydroksymasłowy. Podczas gdy polimery, takie jak octan etylenowinylowy i kwas mlekowykwas glikolowy umożliwiają uwalnianie cząsteczek przez ponad 100 dni, niektóre hydrożele uwalniają białka przez krótsze odcinki czasu. Kiedy zamknięte w kapsułkach przeciwciała pozostają w organizmie przez długi czas, mogą w wyniku ekspozycji na wilgoć w 37 C ulegać denaturacji lub agregacji, co skutkuje utratą aktywności biologicznej i ewentualnymi zmianami immunogenności. Można opracować racjonalne strategie stabilizujące, w zależności od zastosowanego mechanizmu. Przykładowo, jeśli stwierdzono, że mechanizm

117 116 agregacji polega na tworzeniu wewnątrzcząsteczkowych wiązań S-S poprzez wymianę tiodisiarczkową, stabilizację można osiągnąć modyfikując reszty sulfhydrylowe, liofilizując z kwaśnych roztworów, kontrolując zawartość wilgoci, stosując odpowiednie dodatki i opracowując specyficzne kompozycje macierzy polimerowych. R. Sposoby Leczenia [0350] Pod uwagę bierze się, że polipeptydy, przeciwciała i inne związki aktywne według wynalazku można stosować do leczenia różnych chorób i stanów chorobowych o podłożu immunologicznym, takich jak choroby mediowane komórkami T, włączając te charakteryzujące się naciekaniem komórek zapalnych do tkanki, stymulacją proliferacji komórek T, hamowaniem proliferacji komórek T, zwiększaniem lub zmniejszaniem przepuszczalności naczyniowej lub jej hamowaniem. [0351] Przykłady stanów chorobowych lub zaburzeń do leczenia polipeptydami, przeciwciałami i innymi związkami według wynalazku obejmują, ale w sposób nieograniczający, toczeń rumieniowaty układowy, reumatoidalne zapalenie stawów, młodzieńcze, przewlekłe zapalenie stawów, spondyloartropatię, twardzinę układową (sklerodermę), idiopatyczne miopatie zapalne (zapalenie skórno-mięśniowe, zapalenie wielomięśniowe), zespół Sjögrena, układowe zapalenie naczyń, sarkoidozę, anemię autoimmunohemolityczną (pancytopenię immunologiczną, napadową hemoglobinurię nocną); trombocytopenię autoimmunologiczną (idiopatyczną plamicę małopłytkową, trombocytopenię o podłożu immunologicznym), zapalenia tarczycy (chorobę Grave'a, zapalenie tarczycy Hashimoto, młodzieńcze, limfocytowe zapalenie tarczycy, zanikowe zapalenie tarczycy), cukrzycę, chorobę nerek o podłożu immunologicznym (zapalenie kłębuszków nerkowych, cewkowo-śródmiąższowe zapalenie nerek), choroby demielinizacyjne układów nerwowych ośrodkowego i obwodowego, takie jak stwardnienie rozsiane, idiopatyczna, demielinizująca polineuropatia lub zespół Guillaina-Barréa oraz przewlekła, zapalna polineuropatia demielinizująca, choroby wątroby i dróg żółciowych, takie jak zakaźne zapalenie wątroby (zapalenie wątroby A, B, C, D, E i innymi wirusami niehepatotropowymi), autoimmunologiczne, przewlekłe, aktywne zapalenie wątroby, pierwotną marskość wątroby, zapalenie wątroby ziarniniakowe i stwardniające zapalenie dróg żółciowych, nieswoiste zapalenie jelit (wrzodziejące zapalenie okrężnicy: choroba Crohna), enteropatię z nadwrażliwości na gluten i chorobę Whipplea, choroby skóry autoimmunologiczne lub o podłożu immunologicznym, włączając choroby pęcherzowe skóry, rumień wielopostaciowy i kontaktowe zapalenie skóry, łuszczycę, choroby alergiczne, takie jak astma, alergiczny nieżyt nosa, atopowe zapalenie skóry, nadwrażliwość pokarmowa i pokrzywka, choroby immunologiczne płuc, takie jak eozynofilowe zapalenie płuc, idiopatyczne zwłóknienie płuc i zapalenie płuc z nadwrażliwości, choroby związane z przeszczepem, włączając odrzucenie przeszczepu i chorobę przeszczep przeciwko gospodarzowi. [0352] W toczniu rumieniowatym układowym, centralnym mediatorem choroby jest wytwarzanie przeciwciał autoreaktywnych wobec własnych białek/tkanek, a następnie wytwarzanie stanu zapalnego o podłożu immunologicznym. Przeciwciała bezpośrednio lub

118 117 pośrednio pośredniczą w uszkadzaniu tkanek. Choć nie wykazano, że limfocyty T są bezpośrednio zaangażowane w uszkadzanie tkanek, to limfocyty T wymagane są do rozwoju przeciwciał autoreaktywnych. Geneza choroby zależy zatem od limfocytów T. Klinicznie dotkniętych jest wiele organów i układów, włączając nerki, płuca, układ mięśniowoszkieletowy, skórno-śluzówkowy, oczy, centralny układ nerwowy, układ sercowonaczyniowy, przewód pokarmowy, szpik kostny i krew. [0353] Reumatoidalne zapalenie stawów (RA, ang. rheumatoid arthritis) jest przewlekłą, układową, autoimmunologiczną chorobą zapalną, która obejmuje głównie błonę maziówkową wielu stawów, z czego wynika uszkodzenie chrząstki stawowej. Patogeneza zależy od limfocytów T i związana jest z wytwarzaniem czynników reumatoidalnych, auto-przeciwciał skierowanych przeciwko własnym IgG, ze skutkiem w postaci tworzenia kompleksów immunologicznych, które osiągają wysokie poziomy w płynie stawowym i krwi. W stawach kompleksy te mogą wywoływać znaczne naciekanie limfocytów i monocytów do maziówki i dalsze, znaczne zmiany maziówkowe; przestrzeń/płyn stawowy jeśli nacieczony przez podobne komórki z dodatkiem licznych neutrofili. Tkankami zmienionymi są przede wszystkim stawy, często symetrycznie. Jednak choroba występuje także poza stawami, w dwóch głównych postaciach. Jedną postacią jest rozwój zmian pozastawowych z ciągłą, postępującą chorobą stawów i typowymi zmianami w postaci zwłóknienia płuc, zapalenia naczyń i wrzodów skórnych. Drugą postacią choroby pozastawowej jest tak zwany zespół Felty'ego, który pojawia się późno w czasie trwania choroby RA, czasami po tym jak choroba stawów stanie się nieaktywna i obejmuje obecność neutropenii, trombocytopenii i splenomegalii. Może temu towarzyszyć zapalenie naczyń w wielu narządach z tworzeniem obszarów martwicy niedokrwiennej, wrzodów skóry i gangreny. U pacjentów rozwijają się często również guzki reumatyczne w tkance podskórnej otaczającej zaatakowane stawy; późny etap guzków ma centra nekrotyczne otoczone przez mieszany naciek komórek zapalnych. Inne objawy, które mogą pojawiać się w RA obejmują: zapalenie osierdzia, zapalenie opłucnej, wieńcowe zapalenie tętnic, śródmiąższowe zapalenie płuc ze zwłóknieniem płuc, suche zapalenie spojówek i rogówki i guzki reumatyczne. [0354] Młodzieńcze, przewlekłe zapalenie stawów jest przewlekłą, idiopatyczną chorobą zapalną, która zaczyna się często wcześniej niż przed 16 rokiem życia. Jej fenotyp ma pewne podobieństwa do RA; niektórych pacjentów pozytywnych pod względem czynnika reumatoidalnego klasyfikuje się jako [mających] młodzieńcze zapalenie stawów. Chorobę podzielono na trzy główne kategorie: skąpostawowe, wielostawowe i ogólnoustrojowe. Zapalenie stawów może być ciężkie i jest zazwyczaj destruktywne oraz prowadzi do zesztywnienia stawów i spowolnienia wzrostu. Inne objawy mogą obejmować przewlekłe zapalenie błony naczyniowej przedniego odcinka oka i amyloidozę ogólnoustrojową. [0355] Spondyloartropatie są grupą zaburzeń z pewnymi wspólnymi cechami klinicznymi i wspólnym związkiem z ekspresją produktu genu HLA-B27. Zaburzenia [te] obejmują: zapalenie stawów kręgosłupa zesztywniające, zespół Reitera (reaktywne zapalenie stawów), zapalenie stawów związane z chorobą zapalną jelit, zapalenie stawów kręgosłupa związane z łuszczycą, spondyloartropatię o początku w wieku młodzieńczym i spondyloartropatię

119 118 niezróżnicowaną. Cechy różnicujące obejmują stan zapalny stawów krzyżowo-biodrowych (łac. sacroileitis) z lub bez zapalenia stawów kręgosłupa; zapalne, asymetryczne zapalenie stawów; związek z HLA-B27 (serologicznie zdefiniowany allel z locus HLA-B MHC klasy I); zapalenie oka i brak auto-przeciwciał związanych z inną chorobą reumatyczną. Komórką najbardziej związaną, kluczową dla wywoływania choroby, jest limfocyt T CD8 +, komórka która ukierunkowana jest na antygen prezentowany przez cząsteczki MHC klasy I. Komórki T CD8 + mogą reagować przeciwko allelowi HLA-B27 MHC klasy I, tak jakby był on obcym peptydem ekspresjonowanym przez cząsteczki MHC klasy I. Postawiono hipotezę, że epitop HLA-B27 może naśladować antygenowy epitop bakterii lub innego mikroorganizmu i z tego względu wywołuje odpowiedź komórek T CD8 +. [0356] Etiologia twardziny układowej (sklerodermii) nie jest znana. Cechą charakterystyczną choroby jest stwardnienie skóry; prawdopodobnie wywoływane jest to czynnym procesem zapalnym. Sklerodermia może być miejscowa lub ogólnoustrojowa; powszechne są zmiany naczyniowe, a uszkodzenie komórek śródbłonka w mikrokrążeniu jest wczesnym i ważnym zdarzeniem w rozwoju twardziny układowej; uszkodzenie naczyniowe może mieć podłoże immunologiczne. Obecność nacieczeń komórek jednojądrzastych w zmianach skórnych i obecność przeciwciał anty-jądrowych u wielu pacjentów ma podłoże immunologiczne. ICAM-1 jest często regulowany "w górę" na powierzchni komórek fibroblastów w zmianach skórnych, co sugeruje, że oddziaływanie komórek T z tymi komórkami może pełnić rolę w patogenezie choroby. Inne zajęte narządy obejmują: przewód pokarmowy: atrofia mięśni gładkich i zwłóknienie, skutkujące nieprawidłową perystaltyką/motoryką; nerki: koncentryczna, podśródbłonkowa proliferacja błony wewnętrznej naczynia, wpływająca na małe tętnice łukowate i międzypłacikowe z efektem postaci zmniejszonego przepływu krwi w korze nerki, skutkującego proteinurią, azotemią i nadciśnieniem; mięśnie szkieletowe: atrofia, zwłóknienie śródmiąższowe; stan zapalny; płuca: śródmiąższowe zapalenie płuc i zwłóknienie śródmiąższowe; oraz serce: martwica z węzłami skurczu, bliznowacenie/zwłóknienie. [0357] Idiopatyczne miopatie zapalne, włączając zapalenie skórno-mięśniowe, zapalenie wielomięśniowe i inne, są zaburzeniami przewlekłego zapalenia mięśni o nieznanej etiologii, skutkującymi męczliwością mięśni. Uszkodzenie/zapalenie mięśni jest często symetryczne i postępujące. Z większością postaci związane są auto-przeciwciała. Te specyficzne mięśniowo auto-przeciwciała skierowane są przeciwko i hamują funkcję komponentów, białek i RNA, związanych z syntezą białek. [0358] Zespół Sjogrena wynika ze stanu zapalnego o podłożu immunologicznym i w konsekwencji uszkodzenia funkcjonalnego gruczołów łzowych i gruczołów ślinowych. Choroba może być związana z lub mogą jej towarzyszyć zapalne choroby tkanki łącznej. Choroba związana jest z wytwarzaniem auto-przeciwciał przeciwko antygenom Ro i La, przy czym oba z nich są małymi kompleksami RNA-białko. Zmiany skutkują suchym zapaleniem spojówek i rogówki, suchością jamy ustnej, z innymi objawami lub powiązaniami obejmującymi marskość wątroby, neuropatię obwodową lub czuciową i plamicę wyczuwalną palpacyjnie.

120 119 [0359] Układowe zapalenie naczyń jest chorobą, w której pierwotną zmianą jest stan zapalny i występujące następnie uszkodzenie naczyń krwionośnych, skutkujące niedokrwieniem/martwicą/degeneracją tkanek zaopatrywanych przez zajęte naczynia i w końcu, w niektórych przypadkach, dysfunkcją organu końcowego. Zapalenia naczyń mogą występować również jako zmiana wtórna lub następstwo innych chorób zapalnych i o podłożu immunologicznym, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów, twardzina układowa itp., szczególnie w chorobach związanych również z tworzeniem kompleksów immunologicznych. Choroby w grupie pierwotnych układowych zapaleń naczyń obejmują: układowe, martwicze zapalenie naczyń: guzkowate zapalenie tętnic, alergiczne zapalenie naczyń krwionośnych i ziarniniakowatość, zapalenie licznych naczyń krwionośnych; ziarniakowatość Wegenera; ziarniakowatość limfoidalną; i olbrzymiokomórkowe zapalenie tętnic. Różne zapalenia naczyń obejmują: zespół śluzówkowo-skórno-węzłowy (MLNS, ang. mucocutaneous lymph node syndrome lub choroba Kawasaki), izolowane zapalenia naczyń CNS, chorobę Beheta, zapalenie zakrzepowo-zarostowe naczyń krwionośnych (choroba Buergera) i skórne, martwicze zapalenie żyłek. Mechanizmy patogenne większości wymienionych typów zapaleń naczyń uważa się za wynikające głównie z odkładania się kompleksów immunoglobulinowych w ścianach naczyń i w konsekwencji wywoływania odpowiedzi zapalnej albo via ADCC, albo aktywację dopełniacza, albo oba. [0360] Sarkoidoza jest stanem chorobowym o nieznanej etiologii, który charakteryzuje się obecnością ziarniniaków epitelioidalnych niemal we wszystkich tkankach ciała; najpowszechniejsze jest zajęcie płuc. Patogeneza obejmuje utrzymywanie się aktywowanych makrofagów i komórek limfoidalnych w miejscach choroby z konsekwencjami w postaci przewlekłych następstw wynikających z uwalniania produktów aktywnych miejscowo i ogólnoustrojowo, uwalnianych przez te typy komórek. [0361] Anemia autoimmunohemolityczna, włączając anemię autoimmunohemolityczną, pancytopenię immunologiczną i napadową hemoglobinurię nocną, wynika z wytwarzania przeciwciał reagujących z antygenami ekspresjonowanymi na powierzchni erytrocytów (i, w niektórych przypadkach, innych komórek krwi, włączając również płytki krwi) i jest odzwierciedleniem usuwania tych pokrytych przeciwciałami komórek via lizę za pośrednictwem dopełniacza i/lub mechanizmy, w których pośredniczy ADCC/receptor Fc. [0362] W trombocytopenii autoimmunologicznej, włączając plamicę małopłytkową i małopłytkowość o podłożu immunologicznym w innych układach klinicznych, niszczenie/usuwanie płytek krwi zachodzi w wyniku przyłączania przeciwciała lub dopełniacza do płytek i następującego w konsekwencji usuwania za pomocą lizy przez dopełniacz, ADCC mechanizmy za pośrednictwem receptora FC. [0363] Zapalenie tarczycy, włączając chorobę Grave'a, zapalenie tarczycy Hashimoto, młodzieńcze limfocytarne zapalenie tarczycy i zanikowe zapalenie tarczycy, są wynikiem odpowiedzi autoimmunologicznej przeciwko antygenowi tarczycy, z wytwarzaniem przeciwciał reagujących z białkami obecnymi w i często specyficznymi dla gruczołu tarczycowego. Istnieją modele doświadczalne, włączając modele spontaniczne: szczury

121 120 (szczury BUF i BB) i kury (odmiana kur otyłych); modele indukowalne: immunizacja zwierząt tyreoglobuliną, tarczycowym antygenem mikrosomalnym (proksydaza tarczycowa). [0364] Cukrzyca typu I lub cukrzyca insulinozależna jest autoimmunologicznym niszczeniem komórek wysp trzustkowych; w niszczeniu tym pośredniczą autoprzeciwciała i autoreaktywne komórki T. Przeciwciała wobec insuliny lub receptora insuliny mogą również powodować fenotyp braku responsywności na insulinę. [0365] Choroby nerek o podłożu immunologicznym, włączając zapalenie kłębuszków nerkowych i cewkowo-śródmiąższowe zapalenie nerek, są wynikiem mediowanego przeciwciałem lub limfocytem T uszkodzenia tkanki nerek, albo bezpośredniego, będącego wynikiem wytwarzania przeciwciał autoreaktywnych lub komórek T przeciwko antygenom nerkowym, albo pośredniego, będącego wynikiem odkładania w nerkach przeciwciał i/lub kompleksów immunologicznych, które są reaktywne względem innych antygenów nienerkowych. Z tego względu inne choroby o podłożu immunologicznym, które skutkują tworzeniem kompleksów immunologicznych, mogą również wywoływać chorobę nerek o podłożu immunologicznym, jako następstwo pośrednie. Zarówno mechanizmy immunologiczne bezpośrednie, jak i pośrednie skutkują odpowiedzią zapalną, która wytwarza/wywołuje rozwój zmian w tkance nerek, z czego wynika zaburzenie funkcji narządu, a w niektórych przypadkach progresja do niewydolności nerek. W patogenezę zmian zaangażowane mogą być zarówno immunologiczne mechanizmy humoralne, jak i komórkowe. [0366] Uważa się, że choroby demielinizacyjne układów nerwowych centralnego i obwodowego, włączając stwardnienie rozsiane; idiopatyczną polineuropatię demielinizacyjną lub zespół Guillaina-Barréa; i przewlekłą, zapalną polineuropatię demielinizacyjną mają podstawy autoimmunologiczne i skutkują demielinizacją nerwów w wyniku zniszczenia wyrządzonego oligodendrocytom lub bezpośrednio mielinie. Dla MS istnieje dowód sugerujący, że wywoływanie i progresja choroby zależy od limfocytów T. Stwardnienie rozsiane jest chorobą demielinizacyjną zależną od limfocytów T i ma przebieg nawracającoustępujący lub przewlekły, postępujący. Etiologia nie jest znana; przyczyniają się do tego jednak wszystkie spośród infekcji wirusowych, predyspozycji genetycznych, środowiska i autoimmunizacji. Zmiany zawierają nacieki, w których pośredniczą głównie limfocyty T, komórki mikrogleju i naciekające makrofagi; głównym typem komórek w zmianach są limfocyty T CD4 +. Mechanizm śmierci komórek oligodendrocytowych i powstającej w konsekwencji tego demielinizacji nie jest znany, ale prawdopodobnie kierowany jest limfocytami T. [0367] Choroba zapalna i zwłóknieniowa płuc, włączając eozynofilowe zapalenie płuc; idiopatyczne zwłóknienie płuc i zapalenie płuc z nadwrażliwości, obejmować może rozregulowaną odpowiedź immunologiczno-zapalną. Zahamowanie tej odpowiedzi byłoby korzystne terapeutycznie.

122 121 [0368] Choroba skóry autoimmunologiczna lub o podłożu immunologicznym, włączając choroby pęcherzowe skóry, rumień wielopostaciowy i kontaktowe zapalenie skóry mediowane są autoprzeciwciałami, których pochodzenie jest zależne od limfocytów T. [0369] Łuszczyca jest chorobą zapalną mediowaną limfocytami T. Zmiany zawierają nacieki limfocytów T, makrofagów i komórek przetwarzających antygen oraz trochę neutrofili. [0370] Choroby alergiczne, włączając astmę; alergiczny nieżyt nosa; atopowe zapalenie skóry; nadwrażliwość pokarmową; i pokrzywkę, zależne są od limfocytów T. Choroby te mediowane są głównie przez stan zapalny wywołany limfocytami T, stan zapalny mediowany IgE lub kombinację obu. [0371] Choroby związane z przeszczepem, włączając odrzucenie przeszczepu i chorobę przeszczep przeciwko gospodarzowi (GVHD, ang. graft-versus-host-disease) są zależne od limfocytów T; hamowanie funkcji limfocytów T ma wpływ łagodzący. [0372] Innymi chorobami, w których interwencja w postaci odpowiedzi immunologicznej i/lub zapalnej jest korzystna, są choroby zakaźne, włączając, ale w sposób nieograniczający, infekcje wirusową (włączając, ale w sposób nieograniczający, AIDS, zapalenie wątroby A, B, C, D, E i opryszczkę), infekcję bakteryjną, infekcje grzybowe i pierwotniakowe oraz infekcje pasożytnicze (cząsteczki (lub pochodne/agoniści), które stymulują MLR, można wykorzystywać terapeutycznie dla wzmacniania odpowiedzi immunologicznej na czynniki zakaźne), choroby niedoboru odporności (cząsteczki (lub pochodne/agoniści), które stymulują MLR, można wykorzystywać terapeutycznie dla wzmacniania odpowiedzi immunologicznej na stany chorobowe niedoborów odporności dziedzicznych, nabytych, wywołanych infekcją (jak w infekcji HIV) lub jatrogennych (tj. takie jak w wyniku chemioterapii) oraz nowotworu. [0373] Pokazano, że u niektórych pacjentów z nowotworem, będących ludźmi, rozwija się przeciwciało i/lub odpowiedź limfocytów T na antygeny na komórkach nowotworowych. W modelach zwierzęcych nowotworzenia pokazano również, że wzmaganie odpowiedzi immunologicznej może skutkować odrzuceniem lub regresją tego szczególnego nowotworu. Cząsteczki wzmagające odpowiedź limfocytów T w MLR są użyteczne vivo w zwiększaniu odpowiedzi immunologicznej przeciwko nowotworowi. Cząsteczki wzmagające odpowiedź proliferacyjną limfocytów T w MLR (lub drobnocząsetczkowi agoniści lub przeciwciała wpływające na ten sam receptor w sposób agonistyczny) stosować można terapeutycznie do leczenia raka. Cząsteczki hamujące odpowiedź limfocytów w MLR działają również in vivo podczas nowotworzenia dla hamowania odpowiedzi immunologicznej na nowotwór; cząsteczki takie mogą być eksprymowane przez same komórki nowotworowe lub ich ekspresja może być indukowana przez nowotwór w innych komórkach. Antagonizm takich cząsteczek inhibitorowych (za pomocą przeciwciała, antagonistów drobnocząsteczkowych lub innych sposobów) wzmaga odrzucenie guza o podłożu immunologicznym. [0374] Dodatkowo, hamowanie cząsteczek o właściwościach prozapalnych może nieść korzyść terapeutyczną w uszkodzeniu reperfuzyjnym; udarze; zawale mięśnia sercowego; miażdżycy; ostrym uszkodzeniu płuc; wstrząsie krwotocznym; poparzeniu; sepsie/wstrząsie

123 122 septycznym; ostrej martwicy cewek nerkowych; endometriozie; chorobie zwyrodnieniowej stawów i zapaleniu trzustki. Związki według wynalazku, np. polipeptydy lub przeciwciała, podaje się ssakowi, korzystnie człowiekowi, zgodnie ze znanymi sposobami, takimi jak podawanie dożylne w postaci bolusa lub poprzez ciągłą infuzję przez pewien odcinek czasu, drogą domięśniową, dootrzewnową, przez podanie do płynu mózgowo-rdzeniowego, podskórnie, dostawowo, wewnątrzmaziówkowo, dooponowo, doustnie, miejscowo lub wziewnie (donosowo, dopłucnie). Korzystne jest podawanie dożylne lub wziewne polipeptydów i przeciwciał. [0375] W terapii immunoadiuwantowej inne schematy terapeutyczne, takie jak podawanie środka przeciwnowotworowego łączyć można z podawaniem białek, przeciwciał lub związków według wynalazku. Przykładowo, pacjent, który ma być leczony immunoadiuwantem według wynalazku może również otrzymywać środek przeciwnowotworowy (środek chemioterapeutyczny) lub radioterapię. Przygotowanie i schematy dawkowania takich środków chemioterapeutycznych można stosować zgodnie z instrukcjami producenta lub jak empirycznie określił znawca. Przygotowanie i schematy dawkowania takich środków chemioterapeutycznych opisano również w Chemotherapy Service, Red., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992). Środek chemioterapeutyczny może poprzedzać lub następować po podawaniu immunowadiuwanta lub może być podawany jednocześnie z nim. Dodatkowo, związek antyestrogenowy, taki jak tamoksyfen lub anty-progesteronowy, taki jak onapriston (patrz EP ) podawać można w dawkach znanych dla takich cząsteczek. [0376] Pożądane może być również podawanie przeciwciał przeciwko innym antygenom związanym z chorobą immunologiczną lub związanym z guzem, takich jak przeciwciała, które wiążą się do CD20, CD11a, CD18, ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4 lub czynnika [wzrostu] śródbłonkowego naczyniowego (VEGF, ang. vascular endothelial [growth] factor). Alternatywnie lub dodatkowo, pacjentowi można podawać jednocześnie dwa lub większą ilość przeciwciał wiążących te same lub dwa lub większą ilość różnych ujawnionych antygenów. Czasami, korzystne może być również jednoczesne podawanie pacjentowi jednej lub większej ilości cytokin. W jednym z przykładów wykonania, polipeptydy IL-17A/F podawane są jednocześnie ze środkiem hamującym wzrost. Przykładowo, środek hamujący wzrost podać można najpierw, a następnie polipeptyd IL-17A/F. Uwzględnia się jednak również podawanie jednoczesne lub podanie w pierwszej kolejności. Odpowiednie dawkowania środka hamującego wzrost są tymi stosowanymi obecnie i mogą być zmniejszane z powodu połączonego działania (synergicznego) środka hamującego wzrost i polipeptydu IL-17A/F. [0377] Dla leczenia lub zmniejszania ciężkości choroby o podłożu immunologicznym, odpowiednie dawkowanie związku według wynalazku zależeć będzie od typu leczonej choroby, jak zdefiniowano powyżej, ciężkości i przebiegu choroby, tego czy środek podaje się w celach zapobiegawczych czy leczniczych, wcześniejszej terapii, klinicznej historii pacjenta i odpowiedzi na związek oraz osądu lekarza prowadzącego. Związek korzystnie podaje się pacjentowi odpowiednio jednorazowo lub podczas terapii seryjnej.

124 123 [0378] Przykładowo, zależnie od typu i ciężkości choroby, początkową proponowaną dawką do podawania pacjentowi jest około 1 mg/kg do 15 mg/kg (np. 0,1-20 mg/kg) polipeptydu lub przeciwciała, czy to, przykładowo, za pomocą jednego lub większej ilości oddzielnych podań, czy za pomocą ciągłej infuzji. Typowa dzienna dawka może mieścić się w zakresie od około 1mg/kg do 100 mg/kg lub więcej, zależnie od wyżej wymienionych czynników. Dla podawań powtarzanych przez kilka dni lub dłużej, zależenie od stanu, leczenie podtrzymuje się aż do pożądanego stłumienia występowania symptomów choroby. Użyteczne mogą być jednak inne schematy dawkowania. Postęp tego leczenia można łatwo monitorować za pomocą konwencjonalnych technik i badań. S. Wytwarzane Przedmioty [0379] W innym przykładzie wykonania wynalazku, zapewniono wytwarzany produkt zawierający materiały (np. zawierający cząsteczkę IL-17A/F) użyteczne do diagnostyki lub leczenia opisanych powyżej zaburzeń. Wytwarzany przedmiot zawiera pojemnik i instrukcję. Odpowiednie pojemniki obejmują, przykładowo, butelki, fiolki, strzykawki i probówki testowe. Pojemniki można wytwarzać z wielu różnych materiałów, takich jak szkło lub plastik. Pojemnik zawiera kompozycję skuteczną do diagnozowania lub leczenia stanu chorobowego i może mieć sterylny wlot (przykładowo, pojemnik może być torebką z roztworem dożylnym lub fiolką mającą korek do przebicia igłą do zastrzyków podskórnych). Środek aktywny w kompozycji stanowi zazwyczaj polipeptyd lub przeciwciało według wynalazku. Instrukcja lub etykieta na pojemniku lub do niego dołączona wskazuje, że kompozycję stosuje się do diagnozowania lub leczenia danego stanu chorobowego. Wytwarzany produkt może ponadto zawierać drugi pojemnik, zawierający farmaceutycznie dopuszczalny bufor, taki jak sól fizjologiczną buforowaną fosforanami, roztwór Ringera i roztwór dekstrozy. Może on ponadto obejmować inne materiały pożądane z punktu widzenia komercyjnego i użytkownika, włączając inne bufory, rozcieńczalniki, filtry, igły, strzykawki i ulotki dołączone do opakowania z instrukcjami stosowania. T. Diagnozowanie i Przewidywanie Choroby o Podłożu Immunologicznym [0380] Białka z powierzchni komórki, takie jak białka nadekspresjonowane w niektórych chorobach o podłożu immunologicznym, są doskonałymi celami dla kandydatów na leki lub terapii chorób. Te same białka, razem z białkami wydzielanymi, kodowanymi przez geny amplifikowane w stanie chorobowym o podłożu immunologicznym, znajdują dodatkowe zastosowanie w diagnozowaniu i przewidywaniu tych chorób. Przykładowo, przeciwciała skierowane przeciwko produktom białkowym genów amplifikowanych w stwardnieniu rozsianym, reumatoidalnym zapaleniu stawów, chorobie zapalnej jelit lub innej chorobie o podłożu immunologicznym, stosować można jako środki diagnostyczne lub prognostyczne. [0381] Przykładowo, przeciwciała, włączając fragmenty przeciwciał, stosować można do jakościowego lub ilościowego wykrywania ekspresji białek kodowanych przez geny amplifikowane lub nadekspresjonowane ("produkty genów markerowych"). Przeciwciało korzystnie wyposażone jest w wykrywalny, np. znacznik fluorescencyjny, a wiązanie można monitorować za pomocą mikroskopii świetlnej, cytometrii przepływowej, fluorymetrii lub

125 124 innych technik znanych w stanie techniki. Techniki te są szczególnie odpowiednie, jeśli nadekspresjonowany gen koduje powierzchniowe białko komórkowe Takie oznaczenia wiązania przeprowadza się zasadniczo jak opisano powyżej. [0382] Wykrywanie wiązania przeciwciała do produktu genu markerowego in situ przeprowadzać można, przykładowo, za pomocą immunofluorescencji lub mikroskopii immunoelektronowej. W tym celu od pacjenta pobiera się próbkę histologiczną i stosuje na nią wyznakowane przeciwciało, korzystnie pokrywając przeciwciałem próbkę biologiczną. Procedura ta pozwala określać dystrybucję produktu genu markerowego w badanej tkance. Dla znawców będzie oczywiste, że łatwo dostępna jest ogromna różnorodność sposobów histologicznych do wykrywania in situ. [0383] Następujące przykłady podaje się jedynie dla celów ilustracyjnych i nie mają one na celu ograniczania zakresu wynalazku w jakikolwiek sposób. PRZYKŁADY [0384] Handlowo dostępne odczynniki przytaczane w przykładach stosowano zgodnie z instrukcjami producenta, o ile nie zaznaczono inaczej. Źródłem tych komórek zidentyfikowanych w następujących przykładach i w opisie, poprzez numer dostępu ATCC, jest American Type Culture Collection, Manassas, VA. PRZYKŁAD 1 Ekspresja Rekombinacyjna Nowej Cytokiny IL-17, Określonej jako IL-17A/F Transfekcja komórek ludzkiej nerki 293 wektorami ekspresyjnymi cdna kodującymi IL-17 i IL-17F [0385] Komórki ludzkiej nerki 293 transfekowano równymi ilościami plazmidów kodujących geny ludzkich IL-17, IL-17C i IL-17F, stosując procedurę precypitacji fosforanu wapnia. Dla każdej kolby T-150 z konfluencją 50%-80%, 50 µg każdego z plazmidów mieszano dla utworzenia precypitatów do pokrycia komórek. Jeden dzień po transfekcji usuwano 50:50 F12:DMEM, zawierającego 10% FCS, 5 mm L-glutaminy, penicylinę-streptomycynę i zastępowano pożywką PS24 pozbawioną surowicy oraz hodowano przez dodatkowe cztery dni. Po czterech dniach kondycjonowaną pożywkę zbierano, wirowano i sterylnie filtrowano, po czym oczyszczano. Oczyszczanie rekombinowanej IL-17A/F A. Początkowe Frakcjonowanie Etap 1: [0386] Dwa i pół litra kondycjonowanej pożywki z rekombinowaną IL-17A/F z hodowli przejściowych komórek 293 ludzkiej nerki zatężano i dializowano względem 20 mm octanu sodu, ph 5,0, 1 mm azydku sodu (Bufor A), stosując membranę o punkcie odcięcia 10 kilodaltonów, do objętości 480 mililitrów, a następnie nanoszono na kolumnę Pharmacia HiLoad S Sepharose 26/10 przy 6 ml/min. Kolumnę eluowano gradientem liniowym do 100% Buforu B (20 mm octanu sodu, 1 M NaCl, 1 mm azydku sodu, ph 5,0) przy prędkości 1%/minutę z prędkością przepływu wynoszącą 6 ml/min., zbierając frakcje 12 ml. Na

126 125 frakcjach zebranych z tej kolumny przeprowadzono analizę SDS PAGE. Białka wykrywano za pomocą barwienia srebrem. Markery masy cząsteczkowej oznaczono dla żelu zawierającego frakcje (Fig. 2). Frakcje 31 i 32 zawierały białko o pozornej masie cząsteczkowej wynoszącej w przybliżeniu 33 kd, zgodnej z IL-17A/F. D. Oczyszczanie IL-17A/F [0387] Cztery frakcje 32 (Fig. 2) zakwaszano za pomocą 0,1% kwasu trifluorooctowego, następnie nanoszono przy 0,5 ml/min. na kolumnę Vydac C4, zrównoważoną w 0,1% kwasie trifluorooctowym (Bufor C) i wymywano w gradiencie do 100% Buforu D (0,1 % kwas trifluorooctowy w 100% acetonitrylu) z gradientem trzyetapowym (0-35% D przez 10 minut, 35-50% D przez 35 minut, % D przez 10 minut). Fig. 2 przedstawia chromatogram eluowanych białek, mierzonych przy 214 nm i 280 nm. Etap gradientu acetonitrylu rozciąga się przez cały profil. Poprzez analizę aminokwasów stwierdzono, że stężenia białka we frakcji 38 wyniosło 0,536 mg/ml. Na tej frakcji przeprowadzano żele, bloty, badania sekwencji aminokwasowej i aktywności. [0388] Frakcję 31 i pozostałą objętość frakcji 32 z przebiegu HiLoad S Sepharose zlano i dializowano względem Buforu A przez osiem godzin stosując membranę o punkcie odcięcia 10 kd i przepuszczano przez filtr 0,2 mikrona. Materiał ten nanoszono na kolumnę Mono S, zrównoważoną w Buforze A, przy prędkości przepływu wynoszącej 1 ml/min., a następnie eluowano za pomocą trzyetapowego gradientu do 100% Buforu B (0-30% B przez 10 objętości kolumny, 30-75% B przez 45 objętości kolumny, % B przez 10 objętości kolumny), zbierając jednocześnie 1 ml/frakcję. Oznaczano frakcje 26-43, a stężenia białka określano poprzez analizę aminokwasową. Stężenie frakcji 31, 32 i 33 wynosiły, odpowiednio, 0,258, 0,359 i 0,291 mg/ml. Żele, bloty, badania sekwencji aminokwasowej, spektrometrii mas i aktywności przeprowadzano głównie na frakcjach 32 i 33. Frakcję wytworzone za pomocą chromatografii badano pod kątem zawartości IL-17 i IL-17F poprzez zastosowanie Western blotting. Jeden µg/ml przeciwciała monoklonalnego, skierowanego przeciwko IL-17 lub IL-17F stosowano do wykrywania obecności IL-17 lub IL-17F w próbkach. Analiza IL-17A/F przez Spektrometrię Mas [0389] Sekwencję aminokwasową i międzyłańcuchowe wiązania disiarczkowe z dojrzałej IL- 17A/F określano za pomocą analizy przez spektrometrię mas (patrz, Fig. 4A; heterodimeryczny polipeptyd IL-17A/F przedstawiono z międzyłańcuchowymi i wewnątrzłańcuchowymi połączeniami disiarczkowymi). Między łańcuchami polipeptydów IL-17F i IL-17 wykryto dwa międzyłańcuchowe połączenia disiarczkowe [między resztą 47 IL- 17F i resztą 129 IL-17 ; i między resztą 137 IL-17F i resztą 33 IL-17, odpowiednio (pogrubione, czarne linie na Fig. 4A). Dodatkowo, dwa międzyłańcuchowe połączenia disiarczkowe tworzą się w każdym z łańcuchów homodimerycznego polipeptydu IL-17 [między resztami 102 i 152; i między resztami 107 do 154] i IL-17F [między resztami 94 i 144; oraz między resztami 99 i 146](cienkie, czarne linie na Fig. 4A). Aminokwasy ponumerowano względem początkowej metioniny w każdym prekursorowym łańcuchu polipeptydowym (Fig. 4A). Figura 4B

127 126 przedstawia schemat fragmentów peptydu IL-17A/F, zawierających wiązania disiarczkowe między łańcuchem IL-17, a IL-17F, które przewidzianoby jako tworzone poprzez trawienie IL-17A/F trypsyną [fragment #1 wiązania disiarczkowego IL-17A/F nazwano SEKW. o NR ID:7; fragment #2 wiązania disiarczkowego IL-17A/F nazwano SEKW. o NR ID:8, odpowiednio]. Aminokwasy zawarte w obrębie tych fragmentów wskazano i ponumerowano względem początkowej metioniny z każdego łańcucha. [0390] Wyliczoną, przybliżoną masę cząsteczkową tych fragmentów, którą zaobserwowano by za pomocą spektrometrii mas, przedstawiono na Fig. 4B jako 3410,58 Da i 2420,05 Da [fragment wiązania disiarczkowego IL-17A/F #1 i #2, odpowiednio]. Przeprowadzono mapowanie peptydu za pomocą spektrometrii mas z użyciem desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej matrycą z analizatorem czasu przelotu (MALDI-TOF) (Fig. 4C). 55 pmol IL- 17A/F w buforze 400 mm NaCl, 20 mm bufor NaOAC, ph 5, trawiono przez noc w 37 C za pomocą trypsyny o jakości przeznaczonej do sekwencjonowania, Promega. Spektrometrię mas z użyciem desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej matrycą z analizatorem czasu przelotu (MALDI-TOF) przeprowadzano z opóźnioną ekstrakcją w pozytywnym trybie jonów reflektronu, stosując matrycę 2', 4', 6'-trihydoksyacetofenonową. Powstała mapa peptydowa zawierała piki z [M+H]+ = 2420,12 Da dla fragmentu #2 i 3410,60 Da dla fragmentu #1, w zgodzie z peptydami połączonymi disiarczkowo (Fig. 4C). Drugą porcję próbki trawiono w ph 8, po redukcji wiązań disiarczkowych ditiotreitolem i alkilacją grup sulfhydrylowych jodoacetamidem. Widmo MALDI-TOF z tej próbki nie miało omawianych pików, co wspiera ich oznaczenie jako powiązanych z disiarczkami. Próbkę niezredukowaną charakteryzowano ponadto za pomocą spektrometrii mas z jonizacją przez elektrorozpylanie oraz chromatografii cieczowej (LC-ESI-MS) (Fig. 4D). Chromatogramy jonowe przedstawiają (od góry do dołu) całkowity chromatogram jonowy, zrekonstruowany chromatogram jonowy (RIC) fragmentu #2 wiązania disiarczkowego IL-17A/F [M+2H]2+ i fragmentu #1 wiązania disiarczkowego IL-17A/F [M+2H]3+. Zaobserwowano piki zgodne oboma heterodimerami, podczas gdy nie zaobserwowano pików powyżej szumu tła chemicznego przy oczekiwanych masach dla peptydów homodimerycznych, co wskazywało na brak homodimerów IL-17 lub IL-17F. Kompozycję z heterodimerów połączonych disiarczkowo potwierdzano następnie za pomocą tandemowej spektrometrii mas. Dysocjacja wywołana zderzeniem podwójnie naładowanego prekursora przy m/z 1210,9 odpowiadała fragmentowi #2 wiązania disiarczkowego IL-17A/F, a potrójnie naładowany prekursor przy m/z 1138,0 odpowiadał fragmentowi #1 wiązania disiarczkowego IL-17A/F. We właściwym widmie obserwowano przewidziane piki fragmentów serii jonów b- i y. Badania Przesiewowe Bibliotek Fagowych pod Kątem Przeciwciał Wiążących się do IL- 17A/F [0391] Dla zidentyfikowania przeciwciał, które wiążą się do IL-17A/F, przesiewowo badano bibliotekę fagową syntetycznych przeciwciał Fab. Zidentyfikowano trzydzieści cztery (34) niezależnie klony, kodujące odrębne sekwencje przeciwciał Fab. Które zdolne są do mediowania wiązania do IL-17A/F. Bibliotekę fagową ludzkich sekwencji przeciwciałowych otrzymano i badano przesiewowo pod kątem Fab specyficznych wobec antygenu w sposób

128 127 podobny tego opisanego poprzednio (Gerstner, R. B. et al., J. Mol. Biol. 321(5):851-62(2002). W skrócie, humanizowane przeciwciało monoklonalne 4D5, przeciwciało anty- HER2, zastosowano jako rusztowanie [ang. scaffold] do konstrukcji bibliotek Fab do prezentacji fagowej. Te Fab prezentowano na fagach monowalentnie i/lub diwalentnie poprzez fuzję do homodimeryzowalnego zamka leucynowego. Dla wygenerowania różnorodności biblioteki, do randomizowania wybraliśmy eksponowane na powierzchni reszty CDR łańcucha ciężkiego, które stwierdzono jako wysoce różnorodne w bazie danych Kabat sekwencji przeciwciał naturalnych i zwartym obszarze [na powierzchni przeciwciała]. Ponadto stosowaliśmy mutagenezę ukierunkowaną z dopasowywaniem zdegenerowanych kodonów dla wytworzenia różnorodności aminokwasowej, która naśladowała naturalny repertuar immunologiczny w każdym miejscu CDR. W pierwszych dwóch CDR łańcucha ciężkiego, H I i H2, zezwolono na ograniczoną różnorodność tej samej długości co Herceptyny, podczas gdy H3 zaprojektowano tak, aby był wysoce zdegenerowany z długością mieszczącą się w zakresie od 7 do 19. Wszystkie przeciwciała wytworzone z wyjściowej selekcji z biblioteki mają identyczny łańcuch lekki. Pełnej długości IgG lub Fab wytwarzać można za pomocą jednoetapowego klonowania domeny zmiennej łańcucha ciężkiego do wektorów zapewniających sekwencję regionu stałego specyficzną dla pożądanego izotypu. Dla dalszej poprawy powinowactwa cząsteczki wiążącej z biblioteki łańcucha ciężkiego zastosowano drugi etap randomizacji CDR łańcucha lekkiego. Sekwencję aminokwasową z regionu domeny zmiennej łańcuchów ciężkich, która zawiera trzy (3) CDR-y [H1-H3] z Fab wiążącego IL-17A/F przedstawiono na Fig. 6. Przedstawiono przyrównanie regionu z przewidywanej sekwencji aminokwasowej z 34 klonów Fab, która koduje sekwencje łańcuchów ciężkich odrębnych przeciwciał, które zdolne są do wiązania IL-17A/F. Zacieniowano trzy regiony CDR łańcucha ciężkiego, określone jako CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3, odpowiednio. Odpowiednie SEKW. o NR ID. dla każdego klonu są następujące: klon #1 = SEKW. o NR ID.:9; klon #2 = SEKW. o NR ID:10; klon #3 = SEKW. o NR ID:11; klon #4 = SEKW. o NR ID: 12; klon #5 = SEKW. o NR ID:13; klon #6 = SEKW. o NR ID: 14; klon #7 = SEKW. o NR ID:15; klon #8 = SEKW. o NR ID: 16; klon #9 =SEKW. o NR ID:17; klon #10 =SEKW. o NR ID:18; klon #11 = SEKW. o NR ID:19; klon #12 = SEKW. o NR ID:20; klon #13 = SEKW. o NR ID:21; klon #14 = SEKW. o NR ID:22; klon #15 = SEKW. o NR ID:23; klon #16 = SEKW. o NR ID:24; klon #17 = SEKW. o NR ID:25; klon #18 = SEKW. o NR ID:26; klon #19 = SEKW. o NR ID:27; klon #20 =SEKW. o NR ID:28; klon #21 = SEKW. o NR ID:29; klon #22 = SEKW. o NR ID:30; klon #23 = SEKW. o NR ID:31; klon #24 = SEKW. o NR ID:32; klon #25 = SEKW. o NR ID:33; klon #26 = SEKW. o NR ID:34; klon #27 = SEKW. o NR ID:35; klon #28 = SEKW. o NR ID:36; klon #29 = SEKW. o NR ID:37; klon #30 = SEKW. o NR ID:38; klon #31 = SEKW. o NR ID:39; klon #32 = SEKW. o NR ID:40; klon #33 = SEKW. o NR ID:41; klon #34 = SEKW. o NR ID:42, odpowiednio. [0392] Dodatkowo, odpowiednie sekwencje kodujące DNA dla każdego z trzydziestu czterech (34) klonów przedstawiono w Tabeli 7, poniżej (od SEKW. o NR ID.:43 do SEKW. o NR ID.:76, odpowiednio).

129 128 Tabela 7

130 129

131 130

132 131

133 132

134 133

135 134 Badania oparte na komórkach - IL-17A/F indukuje wytwarzanie IL-8 i IL-6 [0393] Frakcje wyizolowane z opisanego powyżej etapu oczyszczania Vydac C4 (Fig. 3) badano pod kątem zdolności IL-17A/F do indukowania produkcji IL-8. Frakcje testowano poprzez inkubację z komórkami TK-10 przez 24 godziny (0,033 mikrolitry frakcji/ml pożywki hodowlanej). Następnie zbierano pożywkę kondycjonowaną i za pomocą ELISA przeprowadzano pomiary stężenia IL-8 i IL-6 dla każdej frakcji. Stwierdzono, że frakcja 38 ma mocną aktywność. Poprzez analizę aminokwasów stwierdzono, że stężenia białka we frakcji 38 wyniosło 0,536 mg/ml. Na tej frakcji przeprowadzano żele, bloty, badania sekwencji aminokwasowej i aktywności. (Fig. 3). Alternatywnie, frakcję 31 i pozostałą objętość frakcji 32 z przebiegu HiLoad S Sepharose zlano i dializowano względem Buforu A przez osiem godzin stosując membranę o punkcie odcięcia 10 kd i przepuszczano przez filtr 0,2 mikrona. Materiał ten nanoszono na kolumnę Mono S, zrównoważoną w Buforze A, przy prędkości przepływu wynoszącej 1 ml/min. i eluowano za pomocą trzyetapowego gradientu do 100% Buforu B (0-30% B przez 10 objętości kolumny, 30-75% B przez 45 objętości kolumny, % B przez 10 objętości kolumny), zbierając jednocześnie 1 ml/frakcję. Oznaczano frakcje 26-43, a stężenia białka określano poprzez analizę aminokwasową. Czystą IL-17A/F zidentyfikowano we frakcjach jako pojedyncze białko o pozornej masie cząsteczkowej kd. Stężenia frakcji 31, 32 i 33 wynosiły, odpowiednio, 0,258, 0,359 i 0,291 mg/ml. Żele i analizy sekwencji białka wykazały, że materiał ten był identyczny z IL- 17A/F oczyszczonym za pomocą kolumny C4 (powyżej). Krzywe odpowiedzi na dawkę, porównujące indukowanie IL-8 i IL-6 przez IL-17A/F, IL-17 i IL-17F przedstawiono na Fig. 5. IL-17A/F, IL-17 i IL-17F inkubowano z komórkami TK-10 we wskazanych stężeniach przez 24 godziny. Zbierano pożywkę kondycjonowaną przez TK-10 i analizowano za pomocą ELISA dla IL-8 i ELISA dla IL-6. Dyskusja [0394] Koekspresja mrna dla IL-17 i IL-17F prowadzi do wydzielania nowego rodzaju białka, które zdolne jest do wiązania się z pewnymi przeciwciałami, które zdolne są do

136 135 wiązania się do IL-17 i pewnymi przeciwciałami, które zdolne są do wiązania się do IL-17F. Ten nowy rodzaj białka nazwano interleukiną-17a/f(il-17a/f). Tego nowego rodzaju nie obserwuje się, gdy komórki 293 ludzkiej nerki doprowadzano do ekspresji IL-17 lub IL-17F w izolacji. Pożywkę kondycjonowaną z transfekowanych komórek poddawano immunoprecypitacji (IP), stosując przeciwciała zdolne do rozpoznawania IL-17 (ścieżki 1-5) lub IL-17F (ścieżki 6-10), jak okazano na Fig. 1A i Fig. 1B. Immunoprecypitowane białka rozdzielano następnie za pomocą analizy Western blot i wykrywano przeciwciałami wobec IL-17 (Fig. 1A) lub IL-17F (Fig. 1B). Wykrycie IL-17A/F wskazano na ścieżce 8 z Fig. 1A i na ścieżce 3 z Fig. 1B poprzez obecność IL-17 w kompleksie dimerycznym z IL-17F. Masa cząsteczkowa tego rodzaju, określona za pomocą nieredukującego SDS-PAGE, wynosi w przybliżeniu kd, zgodnie z tym, że rodzaj złożony jest z jednej cząsteczki IL-17 i jednej cząsteczki IL-17F, złączonych razem połączeniem kowalencyjnym. Obecność tego nowego rodzaju (IL-17A/F) można również rozpoznać jako białko o ruchliwości elektroforetycznej, która jest odmienna od tej obserwowanej gdy IL-17 lub IL-17F ekspresjonowane są w izolacji. Ten nowy rodzaj można również uwidocznić bez stosowania przeciwciał, poprzez zastosowanie innych sposobów wykrywania białek, takich jak konwencjonalne techniki barwienia białek. [0395] Obecność nowego rodzaju białka, wytwarzanego poprzez koekspresję IL-17 i IL-17F, zaobserwowano również rozdzielając wydzielane białka, obecne w kondycjonowanej pożywce, za pomocą chromatografii odwróconej fazy. Porównanie frakcji białkowych, zaobserwowanych od białek wydzielanych, wytwarzanych przez komórki koekspresjonujące IL-17 i IL-17F, z rodzajami obserwowanymi z komórek wytwarzających albo IL-17, albo IL- 17F, wykazało obecność dodatkowego rodzaju białka. Ten rodzaj białka, IL-17A/F, oczyszczano i izolowano do homogenności za pomocą chromatografii kolumnowej (Fig. 2 i 3). [0396] Oczyszczone białko wędrowało jako pojedynczy prążek o około kd, jak określano za pomocą nieredukującego SDS-PAGE (Fig. 3A). W warunkach redukujących rozdzielały się jednak dwa wyraźnie odrębne prążki o pozornej masie cząsteczkowej wynoszącą w przybliżeniu kd (nie pokazano). Z tego względu IL-17A/F jest kowalentnym dimerem. Niezależny sposób oceniania kompozycji nowego białka, analiza sekwencji peptydu końca N, również wyraźnie wykazała, że wyizolowany IL-17A/F zawiera peptydy zarówno IL-17, jak i IL-17F (Fig. 3B). Odkryte sekwencje peptydowe są identyczne z sekwencjami zawartymi w obrębie końca N IL-17 i IL-17F (Fig. 3C). Analiza Western Blot wykazała, że ten nowy rodzaj białka jest również zdolny do oddziaływania zarówno z przeciwciałem, które zdolne jest do wiązania się do IL-17, jak i z przeciwciałem zdolnym do wiązania się do IL-17F. Każda z tych obserwacji i odrębnych mas cząsteczkowych nowego, wyizolowanego rodzaju białka sugeruje, że wyizolowane białko IL-17A/F jest nowym rodzajem białka, złożonym z kowalentnego połączenia IL-17 i IL-17F. [0397] Obecność i umiejscowienie wiązań disiarczkowych, które łączą łańcuchy IL-17 i IL- 17F z IL-17A/F charakteryzowano dodatkowo poprzez zastosowanie spektrometrii mas. Umiejscowienie połączeń disiarczkowych w obrębie IL-17A/F przedstawiono schematycznie

137 136 na Fig. 4A. Dwa międzyłańcuchowe wiązania disiarczkowe łączą łańcuchy IL-17 i IL-17F w IL-17A/F. Spodziewano by się, że trawienie IL-17A/F trypsyną dawać będzie dwa odrębne fragmenty peptydowe, zawierające międzyłańcuchowe wiązania disiarczkowe (fragment #1 i #2 wiązania disiarczkowego IL-17A/F; SEKW. o NR ID:7 i 8, odpowiednio. Te peptydy przedstawiono schematycznie (Fig. 4B) razem z ich odpowiednimi, przewidywanymi masami cząsteczkowymi. Peptydy te obserwowano za pomocą spektrometrii mas z użyciem desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej matrycą z analizatorem czasu przelotu (MALDI- TOF) (Fig. 4C) i za pomocą spektrometrii mas z jonizacją przez elektrorozpylanie oraz chromatografii cieczowej (LC-ESI-MS) (Fig. 4D). Nie wykryto pików peptydowych odpowiadających homodimerom IL-17 lub IL-17F co wskazuje, że oczyszczona IL-17A/F złożona była z kowalentnych heterodimerów z łańcuchów IL-17 i IL-17F i nie zawierała homodimerów IL-17 ani IL-17F na wykrywalnych poziomach. [0398] Dodatkowo, za pomocą badania przesiewowego biblioteki fagowej syntetycznych przeciwciał Fab, zidentyfikowano przeciwciała wiążące się do IL-17A/F. Zidentyfikowano trzydzieści cztery (34) niezależnie klony, kodujące odrębne sekwencje przeciwciał Fab. Które zdolne są mediowania wiązania do IL-17A/F. Sekwencję aminokwasową z regionu domeny zmiennej łańcuchów ciężkich, która zawiera trzy (3) CDR-y [H1-H3] z Fab wiążącego IL- 17A/F przedstawiono na Fig. 6. Przedstawiono przyrównanie regionu przewidywanej sekwencji aminokwasowej z 34 klonów Fab, która koduje sekwencje łańcuchów ciężkich odrębnych przeciwciał, które zdolne są do wiązania IL-17A/F. Na żółto zaznaczono trzy regiony CDR łańcucha ciężkiego, określone jako CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3, odpowiednio. Sekwencje aminokwasowe odpowiadające każdemu z trzydziestu czterech (34) klonów nazwano jako SEKW. o NR ID.:9-42. Dodatkowo, sekwencje kodujące DNA odpowiadające każdemu ze zidentyfikowanych trzydziestu czterech (34) klonów przedstawiono w Tabeli 7, poniżej (od SEKW. o NR ID.:43 do SEKW. o NR ID.:76, odpowiednio). Zatem, zidentyfikowano specyficzne przeciwciała, które wiążą się selektywnie do nowego, heterodimerycznego kompleksu IL-17A/F, które mogą służyć do modulowania aktywności tej nowej cytokiny. [0399] IL-17A/F analizowano pod kątem zdolności do stymulowania odpowiedzi prozapalnej, stosując linię komórkową TK-10 nerki ludzkiej (Fig. 5). Ta linia komórkowa odpowiada zarówno na IL-17, jak i na IL-17F poprzez wytwarzanie IL-8. IL-17A/F również mocno indukował wytwarzanie IL-8 w tej linii komórkowej (Fig. 5A). Co ciekawe, zaobserwowano, że IL-17A/F miał wyjątkową moc, różniącą się od tej IL-17 czy IL-17F. Różnica w aktywności różni się od IL-17 i IL-17F w przybliżeniu o rząd wielkości w każdym przypadku. Zasadniczo większa aktywność IL-17A/F niż IL-17F w tym badaniu sugeruje, że IL-17A/F może zawierać kluczowy składnik aktywności cytokiny wynikającej z produktu genu IL-17F. Ta unikalna moc może umożliwiać cząsteczce inny zakres działania in vivo. IL-17A/F indukował również wytwarzanie IL-6 z tej linii komórkowej (Fig. 5B). Dodatkowo prawdopodobnym jest, że IL-17A/F może mieć dodatkowe cechy, nieobecne u IL-17 czy IL- 17F, jako wynik jego nowej, heterodimerycznej kompozycji, która może zmieniać kinetykę i zastosowanie podjednostek receptora in vivo, skutkując unikalnymi konsekwencjami biologicznymi.

138 137 PRZYKŁAD 2 Identyfikacja Nowej Cytokiny IL-17, Wytwarzanej w Aktywowanych, Ludzkich Komórkach T [0400] Po raz pierwszy opisano nową, ludzką cytokinę IL-17 (nazwaną ludzką IL-17A/F), jako wytwarzaną naturalnie w aktywowanych, ludzkich komórkach limfocytów T. Przeprowadzono izolację i aktywację komórek ludzkich limfocytów T oraz wykryto wytwarzanie IL-17A/F i zmierzono je w sposób ilościowy za pomocą ELISA IL-17A/F, jak pokazano poniżej: Izolacja i Aktywacja Ludzkich Komórek T [0401] Heparynizowaną (0,5 ml/50 cc), świeżo pobraną krew ludzką od prawidłowego, zdrowego dawcy, rozcieńczano 1:1 solą fizjologiczną, następnie wlewano jako warstwę na LSM Lymphcyte Separation Media (ICN) i wirowano, zgodnie z zaleceniami producenta (ICN). Uzyskane limfocyty jednojądrzaste wysiewano w kolbach do hodowli tkankowej w pełnym RPMI (RPMI, 10%FCS, 2 mm L-glutamina, penicylina/streptomycyna (GIBCO)), przez jedną godzinę w 37 stopniach C dla pozbycia się monocytów. Supernatanty z hodowli zwirowywano dla osadzenia pozostałych komórek. Ludzkie limfocyty T izolowano następnie za pomocą selekcji negatywnej, stosując zestaw do izolacji komórek T CD4+ (MACS). Dla aktywowania wyizolowanych limfocytów T, kolby do hodowli tkankowych pokrywano 5 ug/ml każdego spośród anty-cd3 (BD Bioscience) i anty-cd28 (BD Bioscience) w PBS przez noc w 4 stopniach C. Po usunięciu pożywki pokrywającej, wyizolowane, ludzkie limfocyty T wysiewano w pełnym RPMI przy gęstości w przybliżeniu 2 milionów komórek na mililitr pożywki. Próbki pożywki zbierano w różnych punktach czasowych po wysianiu i badaniu pod kątem IL-17A/F za pomocą ELISA. Nieaktywowane supernatanty kontrolne zbierano z supernatantów komórkowych z kolb niepokrytych anty-cd3 i anty-cd28. Pomiary ELISA pod Kątem Wytwarzania Ludzkiej IL-17A/F w Ludzkich Komórkach T Aktywowanych anty-cd3/anty-cd28 [0402] Poziomy ludzkiej IL-17A/F mierzono za pomocą ELISA. Mysie [przeciwciała] antyludzka IL-17 rozcieńczano w buforze do pokrywania (0,05 M bufor węglanu sodu, ph 9,6) i pokrywano nimi 96-dołkowe płytki do mikromiareczkowania (Nunc), przez godzin w 2-8 C. Wszystkie kolejne etapy przeprowadzano w temperaturze pokojowej. Niespecyficzne wiązanie blokowano opróżniając dołki i dodając bufor blokujący (PBS, 0,5% BSA, 10 ppm prokliny 300). Po 1-godzinne inkubacji, dołki przemywano buforem do przemywania (PBS, 0,05% Tween 20, 10 ppm prokliny 300). Następnie dodawano standardy odniesienia ludzkiej IL-17A/F i próbki, rozcieńczone w buforze do badania (PBS, 0,5% BSA, 0,05% Tween 20, 10 ppm proklina 300). Po 2-godzinnej inkubacji dołki przemywano buforem do przemywania. Dodawano biotynylowane [przeciwciało], mysie, anty-ludzka IL-17F, rozcieńczone w buforze do badania i pozwalano na inkubację przez 1 godzinę. Po przemywaniu płytek buforem do przemywania, dodawano streptawidynę-hrp (peroksydaza chrzanowa) (Amersham), rozcieńczona w buforze do badania i pozwalano na inkubację przez 1 godzinę. Po przemywaniu płytek buforem do przemywania dodawano roztwór substratu, TMB

139 138 (tetrametylobenzydyna)-peroksydaza (R & D Systems). Rozwijanie się koloru zatrzymywano dodając 2 N kwas siarkowy. Następnie płytki odczytywano na czytniku płytek do mikromiareczkowania (SLT) przy 450 nm, z odejmowaniem próby ślepej przy 540 nm. Dla utworzenia krzywej standardowej zastosowano czteroparametrowy program do dopasowywania [ang. fitting] krzywej, a stężenia próbek uzyskiwano poprzez interpolację z części liniowej krzywej. IL-17A i IL-17F włączono jako kontrole w ELISA dla pokazania specyficzności badania pod kątem IL-17A/F (Fig. 12). Wyniki: [0403] Wyniki pomiarów wytwarzania IL-17A/F, [uzyskanych za pomocą] ELISA, przedstawiono na Fig. 11. Badania te pokazuję wytwarzanie nowej cytokiny IL-17A/F z komórek ludzkich limfocytów T, aktywowanych anty-cd3/anty-cd28, w porównaniu do komórek T nieaktywowanych, w których nie wykryto wytwarzania IL-17A/F. Wyniki te pokazują po raz pierwszy naturalne występowanie nowej cytokiny, która wytwarzana jest i uwalniana w odpowiedzi na aktywację ludzkich limfocytów T. Dodatkowo, specyficzność badania ELISA wykazano dzięki zaobserwowaniu niemal takich samych ilości IL-17A/F w trzech próbkach (#31-#33), gdy badano je równolegle. W tej ELISA specyficznej wobec IL- 17A/F wykryto pomijalne ilości IL-17A czy IL-17F (Fig. 12). [0404] W badaniach opisanych w Przykładzie 1 i 2 stwierdzono, że rekombinowane ludzkie IL-17A/F jest wyraźnie nową cytokiną, odróżnialną od ludzkiej IL-17 i IL-17F zarówno pod kątem struktury białkowej, jak i w opartych na komórkach oznaczeniach aktywności. Poprzez zastosowanie oczyszczonej, ludzkiej IL-17A/F jako standardu, opracowano ELISA specyficzny dla ludzkiej IL-17AF (przedstawiony na Fig. 11). Poprzez zastosowanie tego specyficznego ELISA wykryto indukowaną ekspresję ludzkiej IL-17A/F, co potwierdziło, że IL-17A/F wytwarzana jest naturalnie w hodowli z aktywowanych, ludzkich komórek T. Stąd, IL-17A/F jest odrębną, nową cytokiną, wykrywalną jako naturalny produkt wyizolowanych, aktywowanych, ludzkich komórek T, której postać rekombinowaną scharakteryzowano, zarówno w pod kątem struktury białka, jak i oznaczeniu opartym na komórkach, jako będącą różną i odróżnialną od powiązanych cytokin. [0405] Ta nowa cytokina może działać do modulowania aktywności IL-17 in vivo, działając jako kompetytywny inhibitor miejsc wiążących dla IL-17 lub innych, powiązanych cytokin. IL-17A/F może również modulować aktywność innych powiązanych cytokin, poprzez regulację "w dół" miejsc wiążących dla siebie samego i/lub miejsc wiążących dla innych, powiązanych cytokin. IL-17A/F może wykazywać aktywność poprzez adaptory wewnątrzkomórkowe lub cząsteczki sygnalizacyjne, które działają dla zmieniania swojej własne aktywności sygnalizacyjnej lub innych, powiązanych cytokin. IL-17A/F ma zdolność do wpływania na parowanie receptorów i ko-receptorów znajdowanych na powierzchni komórek lub w obrębie przedziałów wewnątrzkomórkowych. [0406] Z tego względu, badania te zapewniają i identyfikują nowy stymulant immunologiczny (tj. IL-17A/F), który może pobudzać układ immunologiczny do odpowiedzi na specyficzny antygen, który wcześniej mógł nie być aktywny immunologicznie. Nowo zidentyfikowany

140 139 stymulant immunologiczny ma ważne zastosowania kliniczne. Zidentyfikowano inne, znane stymulanty immunologiczne, takie jak IL-12. [patrz Gubler et al. PNAS 88, 4143 (1991)]. W ostatnich badaniach nad szczepionką nowotworową, badacze z University of Chicago i Genetics Institute (Cambridge, MA) leczenie czerniaka oparli na działaniu IL-12 stymulującym układ immunologiczny. [Peterson et al. Journal of Clinical Oncology 21 (12) (2003)]Wyekstrahowali oni krążące białe krwinki, noszące jeden lub większą ilość markerów komórek czerniaka, wyizolowali antygen i zwrócili je pacjentom. Normalnie, pacjenci nie wykazali by odpowiedzi immunologicznej na swoje własne, ludzkie antygeny. Pacjentów leczono następnie różnymi dawkami IL-12 - stymulatora immunologicznego, zdolnego do indukowania proliferacji komórek T, które były ko-stymulowane przez komórki dendrytyczne. Ze względu na stymulujący wpływ IL-12 na układ immunologiczny, leczenie zapewniło lepsze wyniki w porównaniu do wcześniejszych prac, w których własne komórki dendrytyczne pacjentów otrzymywano z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC), traktowano antygenami, następnie hodowano in vitro i zwracano pacjentowi dla stymulowania odpowiedzi przeciwnowotworowej. [Thurner et al. J. Exp. Med. 190 (11), (1999)]W związku z tym należałoby oczekiwać, że ta nowa cytokina IL-17A/F lub jej agoniści podobnie znajdą praktyczne zastosowanie jako stymulatory immunologiczne. Należałoby natomiast oczekiwać, że cząsteczki hamujące aktywność IL-17A/F (antagoniści) znajdą praktyczne zastosowanie w przypadku pożądanego hamowania odpowiedzi immunologicznej, tak jak w chorobach autoimmunologicznych. [0407] Z tego względu, terapeutyczne cechy miałyby przeciwciała względem tej nowej cytokiny, które naśladują (przeciwciała agonistyczne) albo hamują (przeciwciała antagonistyczne) działania immunologiczne IL-17A/F. Potencjalne zastosowania terapeutyczne miałyby również małe cząsteczki, które działają dla hamowania aktywności tej nowej cytokiny. PRZYKŁAD 3 Zastosowanie IL-17A/F jako sondy hybrydyzacyjnej [0408] Następujący sposób opisuje zastosowanie sekwencji nukleotydowej kodującej IL- 17A/F jako sondy hybrydyzacyjnej. [0409] DNA zawierające sekwencję kodującą IL-17A/F pełnej długości lub dojrzałej, jak ujawniono, zastosowano jako sondę do badania przesiewowego dla DNA homologicznych (takich jak te kodujące naturalnie występujące warianty IL-17A/F) w bibliotekach cdna tkanek ludzkich lub bibliotekach genomowych tkanek ludzkich. [0410] Hybrydyzację i odmywanie filtrów zawierających którekolwiek DNA bibliotekowe przeprowadza się w warunkach o następującej, wysokiej surowości. Hybrydyzację wyznakowanych radioaktywnie sond wyprowadzonych z IL-17A/F do filtrów przeprowadza się w roztworze 50% formamidu, 5x SSC, 0,1% SDS, 0,1% pirofosforan sodu, 50 mm fosforan sodu, ph 6,8, 2x roztwór Denhardta i 10% siarczan dekstranu w 42 C przez 20 godzin. Odmywanie filtrów przeprowadza się w roztworze wodnym 0,1x SSC i 0,1% SDS w 42 C.

141 140 [0411] DNA mające pożądaną identyczność sekwencji z DNA kodującym sekwencję IL- 17A/F pełnej długości lub dojrzałą można następnie identyfikować stosując standardowe techniki znane w stanie techniki. PRZYKŁAD 4 Ekspresja IL-17A/F w E. coli [0412] Przykład ten ilustruje otrzymywanie nieglikozylowanej postaci polipeptydów IL- 17A/F za pomocą ekspresji rekombinacyjnej w E. coli. [0413] Sekwencję DNA kodującą polipeptyd IL-17A/F amplifikuje się początkowo z zastosowaniem wybranych starterów PCR. Startery powinny zawierać miejsca restrykcyjne dla enzymów, które odpowiadają miejscom restrykcyjnym dla enzymów w wybranym wektorze ekspresyjnym. Zastosować można wiele różnych wektorów ekspresyjnych. Przykładem odpowiedniego wektora jest pbr322 (pochodzący z E. coli; patrz, Bolivar et al., Gene, 2:95 (1977)), który zawiera geny odporności na ampicylinę i tetracyklinę. Wektor jest trawiony enzymem restrykcyjnym i defosforylowany. Następnie, do wektora liguje się sekwencje zamplifikowane w PCR. Wektor będzie korzystnie zawierał sekwencje kodujące gen oporności antybiotykowej, promotor trp, [sekwencję] liderową polyhis (włączając pierwsze sześć kodonów STII, sekwencję polyhis i miejsce cięcia dla enterokinazy), region kodujący polipeptyd IL-17A/F, terminator transkrypcyjny lambda i gen argu. [0414] Następnie stosuje się mieszaninę ligacyjną do transformacji wybranego szczepu E. coli, stosując sposoby opisane w Sambrook et al., supra. Transformanty identyfikuje się poprzez ich zdolność do wzrostu na płytkach LB, a następnie wybiera się kolonie oporne na antybiotyk. Można wyizolować DNA plazmidowe i zatwierdzić je poprzez analizę restrykcyjną i sekwencjonowanie DNA. [0415] Wybrane klony hodować można przez noc w pożywce do hodowli płynnej, takiej jak bulion LB, suplementowanej antybiotykami. Całonocną hodowlę można następnie stosować do zaszczepiania hodowli na większą skalę. Komórki hoduje się następnie do pożądanej gęstości optycznej, kiedy to włącza się promotor ekspresji. [0416] Po hodowaniu komórek przez kilka dalszych godzin, komórki można zbierać poprzez wirowanie. Osad komórkowy uzyskany przez wirowanie można rozpuszczać stosując różne środki znane w stanie techniki, a rozpuszczone białko IL-17A/F można następnie oczyszczać, stosując kolumnę chelatującą metal w warunkach pozwalających na mocne wiązanie białka. [0417] Polipeptydy IL-17A/F można ekspresjonować w E. coli w postaci wyznakowanej poli- His, stosując następującą procedurę. DNA kodujące polipeptyd IL-17A/F amplifikuje się początkowo z zastosowaniem wybranych starterów PCR. Startery zawierać będą miejsca restrykcyjne dla enzymów, które odpowiadają miejscom restrykcyjnym dla enzymów w wybranym wektorze ekspresyjnym i inne, użyteczne sekwencje, zapewniając skuteczną i pewną inicjację translacji, szybkie oczyszczanie na kolumnie chelatującej metal i proteolityczne usuwanie za pomocą enterokinazy. Sekwencje zamplifikowane w PCR, wyznakowane poli-his, liguje się następnie do wektora ekspresyjnego, który stosuje się do

142 141 transformowania gospodarza E. coli, opartego na szczepie 52 (W3110 fuha(tona) Ion gale rpohts(htprts) clpp(laciq). Transformanty hoduje się najpierw w LB zawierającym 50 mg/ml karbenicyliny w 30 C z wytrząsaniem, do uzyskania OD 600 równego 3-5. Następnie hodowle rozcieńcza się razy w pożywce CRAP (otrzymane poprzez zmieszanie 3,57 g (NH 4 ) 2 SO 4, 0,71 g cytrynianu sodu 2H 2 O, 1,07 g KCI, 5,36 g ekstraktu drożdżowego Difco, 5,36 g Sheffield hikazy SF w 500 ml wody, jak również 110 mm MPOS, ph 7,3, 0,55% (wag./obj.) glukozy i 7 mm MgSO 4 ) i hoduje przez w przybliżeniu godzin w 30 C z wytrząsaniem. Próbki pobiera się dla potwierdzenia ekspresji za pomocą analizy SDS-PAGE, a całą hodowlę zwirowuje się dla osadzenia komórek. Osady komórek zamraża się do czasu oczyszczania i refałdowania. [0418] Pastę E.coli z od 0,5 do 1 l fermentacji (6-10 g osadu) ponownie zawiesza się w 10 objętościach (wag./obj.) w buforze 7 M guanidyny, 20 mm Tris, ph 8. Dodaje się stałego siarczynu sodu i tetrationianu sodu dla utworzenia końcowych stężeń wynoszących 0,1M i 0,02 M, odpowiednio, a roztwór miesza się przez noc w 4 C. Etap ten skutkuje zdenaturowanym białkiem ze wszystkimi resztami cysteinowymi zablokowanymi poprzez siarczynolizę. Roztwór wiruje się przy 40,000 rpm w ultrawirówce Beckman przez 30 min. Supernatant rozcieńcza się 3-5 objętościami buforu dla kolumny chelatującej metal (6 M guanidyna, 20 mm Tris, ph 7,4) i filtruje przez filtry 0,22 mikronowe, do oczyszczenia. Oczyszczony ekstrakt nanosi się na 5 ml kolumnę chelatującą metal Qiagen Ni-NTA, zrównoważoną buforem dla kolumny chelatującej metal. Kolumnę przemywa się dodatkowym buforem, zawierającym 50 mm imidazol (Calbiochem, stopień Utrol), ph 7,4. Białko eluuje się buforem zawierającym 250 mm imidazol. Frakcje zawierające pożądane białko zbiera się i przechowuje w 4 C. Stężenie białka szacuje się poprzez jego absorbancję przy 280 nm, stosując wyliczone współczynniki ekstynkcji, oparte na jego sekwencji aminokwasowej. [0419] Białka refałduje się poprzez powolne rozcieńczanie próbki w świeżo przygotowanym buforze do refałdowania, składającym się z: 20 mm Tris, ph 8,6, 0,3 M NaCl, 2,5 M mocznik, 5 mm cysteina, 20 mm glicyna i 1 mm EDTA. Objętości refałdowania wybiera się tak, że końcowe stężenie białka wynosi między 50 do 100 mikrogram/ml. Roztwór refałdowany miesza się łagodnie w 4 C przez godzin. Reakcję refałdowania wygasza się poprzez dodanie TFA do końcowego stężenia wynoszącego 0,4% (ph w przybliżeniu 3). Przed dalszym oczyszczaniem białka roztwór filtruje się przez filtr 0,22 mikrona i dodaje acetonitryl do końcowego stężenia 2-10%. Refałdowane białko poddaje się chromatografii na kolumnie odwróconej fazy Poros R1/H, stosując bufor [fazy] nośnej z 0,1 % TFA, z elucją za pomocą gradientu acetonitrylu od 10 do 80%. Podwielokrotności frakcji z absorbancją A280 analizuje się na żelach poliakrylamidowych SDS i zbiera frakcje zawierające białko jednorodnie zrefałdowane. Ogólnie, prawidłowo zrefałdowane rodzaje większości białek eluuje się przy najniższych stężeniach acetonitrylu, ponieważ rodzaje te są najbardziej kompaktowe, ze swoimi hydrofobowymi wnętrzami osłoniętymi od oddziaływania z żywicą fazy odwróconej. Zagregowane rodzaje eluuje się zazwyczaj przy wyższych stężeniach acetonitrylu. W dodatku do oddzielenia nieprawidłowo sfałdowanych postaci białek od postaci pożądanych, w etapie odwróconej fazy z próbek usuwa się endotoksyny.

143 142 [0420] Frakcje zawierające pożądany, sfałdowany polipeptyd IL-17A/F zbiera się, a acetonitryl usuwa z zastosowaniem łagodnego strumienia azotu, skierowanego na roztwór. Białka formułuje się w 20 mm Hepes, ph 6,8 z 0,14 M chlorku sodu i 4% mannitolu poprzez dializę lub filtrację żelową, stosując żywice G25 Superfine (Pharmacia), zrównoważone w buforze formulacji i sterylnie filtruje. PRZYKŁAD 5 Ekspresja IL-17A/F w komórkach ssaczych [0421] Przykład ten ilustruje otrzymywanie potencjalnie nieglikozylowanej postaci polipeptydów IL-17A/F za pomocą ekspresji rekombinacyjnej w komórkach ssaczych. [0422] Wektor, prk5 (patrz EP 307,247, opublikowany 15 marca, 1989), stosuje się jako wektor ekspresyjny. Opcjonalnie, DNA IL-17A/F liguje się do prk5 za pomocą wybranych enzymów restrykcyjnych dla umożliwienia insercji DNA IL-17A/F z zastosowaniem sposobów ligacji, takich jak opisane w et al., supra. Powstały wektor nazywany jest prk5- IL-17A/F. [0423] W jednym z przykładów wykonania, wybranymi komórkami gospodarza mogą być komórki 293. Ludzkie komórki 293 (ATCC CCL 1573) hoduje się do konfluentności na płytkach do hodowli tkankowych w pożywce takiej jak DMEM suplementowane płodową surowicą cielęcą i, opcjonalnie, składnikami odżywczymi i/lub antybiotykami. Około 10 µg prk5-il-17a/f DNA miesza się z około 1 µg DNA kodującego gen VA RNA [Thimmappaya et al., Cell, 31:543 (1982)] i rozpuszcza w 500 µl 1 mm Tris-HCl, 0,1 mm EDTA, 0,227 M CaCl 2. Do mieszaniny dodaje się kroplami 500 µl z 50 mm HEPES (ph 7,35), 280 mm NaCl, 1,5 mm NaPO 4 i pozwala na utworzenie precypitatu przez 10 minut w 25 C. Precypitat zawiesza się i dodaje do komórek 293 oraz pozwala na osadzanie się przez około cztery godziny w 37 C. Pożywkę hodowlaną odbiera się i dodaje 2 ml 20% glicerolu w PBS przez 30 sekund. Następnie komórki 293 przemywa się pożywką pozbawioną serum, dodaje się pożywkę świeżą, a komórki inkubuje się przez około 5 dni. [0424] W przybliżeniu 24 godziny po transfekcjach usuwa się pożywkę hodowlaną i zastępuje ją pożywką hodowlaną (samą) lub pożywką hodowlaną zawierającą 200 µci/ml 35 S-cysteiny i 200 µci/ml s5s-metioniny. Po 12 godzinach inkubacji pożywkę kondycjonowaną zbiera się, zatęża na filtrze obrotowym i nanosi na żel z 15% SDS. Przetworzony żel można osuszać i eksponować na kliszę przez wybrany odcinek czasu do ujawnienia obecności polipeptydu IL-17A/F. Hodowle zawierające transfekowane komórki mogą przechodzić dalszą inkubację (w pożywce bez surowicy), a pożywkę testuje się w wybranych testach biologicznych. [0425] W technice alternatywnej, IL-17A/F można wprowadzać do komórek 293 przejściowo, stosując sposób z siarczanem dekstranu, opisany przez Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981). Komórki 293 hoduje się do maksymalnej gęstości w kolbie z łopatkowym systemem mieszania [ang. spinner flask] i dodaje 700 µg DNA prk5-il- 17A/F. Komórki najpierw zatęża się z kolby z łopatkowym systemem mieszania poprzez wirowanie i przemywanie PBS. Precypitat DNA-dekstran inkubuje się na osadzie

144 143 komórkowym przez cztery godziny. Komórki traktuje się 20% glicerolem przez 90 sekund, przemywa pożywką do hodowli tkankowej i ponownie wprowadza do kolby z łopatkowym systemem mieszania, zawierającej pożywkę do hodowli tkankowej, 5 µg/ml insuliny bydlęcej i 0,1 µg/ml transferyny bydlęcej. Po około czterech dniach kondycjonowaną pożywkę wiruje się i filtruje dla usunięcia komórek i szczątek. Próbkę zawierającą wyekspresjonowany polipeptyd IL-17A/F można następnie zatężać i oczyszczać za pomocą dowolnego, wybranego sposobu, takiego jak dializa i/lub chromatografia kolumnowa. [0426] W innym przykładzie wykonania, polipeptydy IL-17A/F można ekspresjonować w komórkach CHO. prk5-il-17a/f można transfekować do komórek CHO stosując znane odczynniki, takie jak CaPO 4 lub DEAE-dekstran. Jak opisano powyżej, hodowle komórkowe można inkubować, a pożywkę zastępować pożywką hodowlaną (sama) lub pożywką zawierającą znacznik radioaktywny, takie jak 35 S-metionina. Po ustaleniu obecności polipeptydu IL-17A/F, pożywkę hodowlaną można zastępować pożywką bez surowicy. Korzystnie, hodowle inkubuje się przez około 6 dni, a następnie zbiera się pożywkę kondycjonowaną. Pożywkę zawierającą wyekspresjonowany polipeptyd IL-17A/F można następnie zatężać i oczyszczać za pomocą dowolnego, wybranego sposobu. [0427] IL-17A/F wyznakowaną epitopem również można ekspresjonować w komórkach gospodarza CHO. IL-17A/F można subklonować z wektora prk5. Wstawkę subklonu można poddawać PCR dla połączenia w ramce [odczytu] z wybranym znacznikiem epitopowym, takim jak znacznik poli-his w bakulowirusowym wektorze ekspresyjnym. Wstawkę IL-17A/F wyznakowaną poli-his można następnie subklonować do wektora kontrolowanego SV40, zawierającego marker selekcyjny, taki jak DHFR dla selekcji stabilnych klonów. Na koniec, komórki CHO można transfekować (jak opisano powyżej) za pomocą wektora kontrolowanego SV40. Przeprowadzać można znakowanie, jak opisano powyżej, dla potwierdzenia ekspresji. Pożywką hodowlaną, zawierającą wyekspresjonowany polipeptyd IL-17A/F wyznakowany poli-his można następnie zatężać i oczyszczać za pomocą dowolnego, wybranego sposobu, takiego jak za pomocą chromatografii powinowactwa chelatującej Ni 2+. [0428] Polipeptydy IL-17A/F można również ekspresjonować w komórkach CHO i/lub COS za pomocą procedury ekspresji przejściowej lub w komórkach CHO za pomocą innej procedury ekspresji stabilnej. [0429] Stabilną ekspresję w komórkach CHO przeprowadza się stosując następującą procedurę. Białka ekspresjonuje się jako konstrukt IgG (immunoadhezynę), w którym sekwencje kodujące dla postaci rozpuszczalnych (np. domen zewnątrzkomórkowych) odpowiednich białek przyłącza się do sekwencji regionu stałego IgG 1, zawierającej domeny łącznikową, CH2 i CH2 i/lub jako postać wyznakowaną poli-his. [0430] Po amplifikacji za pomocą PCR, odpowiednie DNA są subklonowane w wektor ekspresyjny dla CHO, z zastosowaniem standardowych technik, jak opisano w Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Część 3.16, John Wiley and Sons (1997). Wektory ekspresyjne dla CHO konstruuje się tak, aby miały kompatybilne miejsca restrykcyjne na 5' i

145 144 3' DNA będącego przedmiotem zainteresowania, dla umożliwienia wygodnego transportowania cdna. Wektor stosowany w ekspresji w komórkach CHO jest taki, jak opisano w Lucas et al., Nucl. Acids Res., 24:9 ( (1996) i wykorzystuje wczesny promotor/wzmacniacz SV40 do kierowania ekspresją cdna będącego przedmiotem zainteresowania i reduktazy dihydrofolanu (DHFR). Ekspresja DHFR umożliwia selekcję dla stabilnego utrzymywania plazmidu po transfekcji. [0431] Dwanaście mikrogramów pożądanego DNA plazmidowego wprowadza się do w przybliżeniu 10 milionów komórek CHO, z zastosowaniem handlowo dostępnych odczynników do transfekcji Superfect (Qiagen), Dosper lub Fugene (Boehringer Mannheim). Komórki hoduje się jak opisano w Lucas et al., supra. W przybliżeniu 3 x 10 7 komórek mrozi się w ampułce do wzrostu i wytwarzania w przyszłości, jak opisano poniżej. [0432] Ampułki zawierające DNA plazmidowe rozmraża się umieszczając w łaźni wodnej i miesza przez worteksowanie. Zawartość przenosi się za pomocą pipety do probówki wirówkowej, zawierającej 10 ml pożywki i wiruje się przy 1000 rpm przez 5 minut. Odsysa się supernatant, a komórki ponownie zawiesza w 10 ml pożywki selektywnej (PS20 filtrowana przez 0,2 µm z 5%, diafiltrowaną przez 0,2 µm, płodową surowicą bydlęcą). Następnie komórki porcjuje się do 100 ml [kolby] z łopatkowym systemem mieszania, zawierającej 90 ml pożywki selekcyjnej. Po 1-2 dniach komórki przenosi się do 250 ml [kolby] z łopatkowym systemem mieszania, wypełnionej 150 ml selektywnej pożywki wzrostowej i inkubuje w 37 C. Po kolejnych 2-3 dniach, 250 ml, 500 ml i 2000 ml [kolby] z łopatkowym systemem mieszania zaszczepia się 3 x 10 5 komórek/ml. Pożywka komórkowa wymieniana jest na pożywkę świeżą poprzez wirowanie i ponowne zawieszanie w pożywce produkcyjnej. Choć stosować można dowolną, odpowiednią pożywkę dla CHO, w faktycznie zastosować można pożywkę produkcyjną, opisaną w patencie USA nr 5,122,469, wydanym 16 czerwca, l [kolbę] produkcyjną z łopatkowym systemem mieszania zaszczepia się przy 1,2 x 10 6 komórek/ml. W dniu 0, określa się liczbę komórek i ph. W dniu 1, z [kolby] z łopatkowym systemem mieszania pobiera się próbkę i rozpoczyna się przepłukiwanie filtrowanym powietrzem. W dniu 2, z [kolby] z łopatkowym systemem mieszania pobiera się próbkę, temperaturę przesuwa się do 33 C i pobiera się 30 ml z 500 g/l glukozy oraz 0,6 ml z 10% środka przeciwspieniającego (np. 35% emulsji polidimetylosiloksanu, Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion). W trakcie produkcji, w miarę potrzeby, ph doprowadza się dla utrzymania go w okolicach 7,2. Po 10 dniach lub dopóki żywotność nie spadnie poniżej 70%, hodowlę komórkową zbiera się poprzez wirowanie i filtruje przez filtr 0,22 µm. Przesącz przechowywano w 4 C lub natychmiast nanoszono na kolumny do oczyszczania. [0433] Dla konstruktów wyznakowanych poli-his, białka oczyszcza się stosując kolumnę Ni- NTA (Qiagen). Przed oczyszczaniem do pożywki kondycjonowanej dodaje się imidazol do stężenia 5 mm. Pożywkę kondycjonowaną pompuje się na kolumnę 6 ml Ni-NTA, zrównoważoną w buforze 20 mm Hepes, ph 7,4, zawierającym 0,3 M NaCl i 5 mm imidazol, przy prędkości przepływu wynoszącej 4-5 ml/min., w 4 C. Po naniesieniu, kolumnę przemywa się dodatkowym buforem równoważącym, a białko eluuje buforem równoważącym, zawierającym 0,25 M imidazol. Wysoce oczyszczone białko jest następnie

146 145 odsalane do buforu do przechowywania, zawierającego 10 mm Hepes, 0,14 M NaCl i 4% mannitol, ph 6,8, za pomocą 25 ml kolumny G25 Superfine (Pharmacia) i przechowywane w -80 C. [0434] Konstrukty immunoadhezynowe (zawierające Fc) oczyszcza się z pożywki kondycjonowanej jak następuje. Pożywkę kondycjonowaną pompuje się na kolumnę z 5 ml białka A (Pharmacia), którą zrównoważono w 20 mm buforze fosforanu Na, ph 6,8. Po naniesieniu, przed elucją za pomocą 100 mm kwasu cytrynowego, ph 3,5, kolumnę przemywa się intensywnie buforem równoważącym. Wymyte białko jest natychmiast neutralizowane poprzez zbieranie frakcji 1 ml do probówek zawierających 275 µl 1 M buforu Tris, ph 9. Wysoce oczyszczone białko jest następnie odsalane do buforu do przechowywania, jak opisano powyżej dla białek wyznakowanych poli-his. Jednorodność ocenia się za pomocą żeli poliakrylamidowych SDS i poprzez sekwencjonowanie aminokwasów od końca N przez degradację Edmana. PRZYKŁAD 6 Ekspresja IL-17A/F w Drożdżach [0435] Następujący sposób opisuje ekspresję rekombinacyjną polipeptydów IL-17A/F w drożdżach. [0436] Najpierw konstruuje się drożdżowe wektory ekspresyjne do wewnątrzkomórkowego wytwarzania lub wydzielania IL-17A/F z promotora ADH2/GAPDH. DNA kodujące polipeptyd IL-17A/F i promotor wprowadza się do odpowiednich miejsc restrykcyjnych dla enzymów w wybranym plazmidzie dla kontrolowania wewnątrzkomórkowej ekspresji polipeptydu IL-17A/F. Dla wydzielania, DNA kodujące IL-17A/F można klonować do wybranego plazmidu, razem z DNA kodującym promotor ADH2/GAPDH, naturalny peptyd sygnalny IL-17A/F lub inny, ssaczy peptyd sygnalny, przykładowo, drożdżowy czynnik alfa lub sekwencję liderową/sygnału wydzielania inwertazy oraz sekwencje łącznikowe (jeśli wymagane) do ekspresji IL-17A/F. [0437] Komórki drożdżowe, takie jak drożdżowy szczep AB 110, można następnie transformować za pomocą opisanych powyżej plazmidów ekspresyjnych i hodować w wybranych pożywkach fermentacyjnych. Supernatanty z transformowanych drożdży można analizować poprzez wytrącanie 10% kwasem trichlorooctowym i rozdział poprzez SDS- PAGE, po czym wybarwiać żele barwnikiem Coomassie Blue. [0438] Rekombinowane polipeptydy IL-17A/F można następnie izolować i oczyszczać poprzez usuwanie komórek drożdżowych z pożywki fermentacyjnej za pomocą wirowania, a następnie zatężać pożywkę z zastosowaniem wybranych filtrów w postaci wkładów. Koncentrat zawierający polipeptyd IL-17A/F można dodatkowo oczyszczać stosując wybrane złoża do chromatografii kolumnowej. PRZYKŁAD 7 Ekspresja IL-17A/F w Komórkach Owadzich Zakażonych Bakulowirusem

147 146 [0439] Następujący sposób opisuje ekspresję rekombinacyjną polipeptydów IL-17A/F w komórkach owadzich zakażonych bakulowirusem. [0440] Sekwencję kodującą IL-17A/F przyłącza się powyżej znacznika epitopowego, zawartego w obrębie bakulowirusowego wektora ekspresyjnego. Takie znaczniki epitopowe obejmują znaczniki poli-his i znaczniki immunoglobulinowe (jak regiony Fc z IgG). Zastosować można wiele różnych plazmidów, włączając plazmidy wyprowadzone z handlowo dostępnych plazmidów, takich jak pvl1393 (Novagen). W skrócie, sekwencję kodującą IL-17A/F lub pożądaną część sekwencji kodującej IL-17A/F, taką jak sekwencja kodująca domenę zewnątrzkomórkową białka transbłonowego lub sekwencja kodująca dojrzałe białko, jeśli białko jest zewnątrzkomórkowe, amplifikuje się za pomocą PCR ze starterami komplementarnymi do regionów 5' i 3'. Starter 5' może zawierać w sobie flankujące (wybrane) miejsca restrykcyjne dla enzymów. Produkt jest następnie trawiony tymi wybranymi enzymami restrykcyjnymi i subklonowany do wektora ekspresyjnego. [0441] Recombinowanego bakulowirusa wytwarza się poprzez ko-transfekowanie powyższego plazmidu i DNA BaculoG (Pharmingen) do komórek Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) z zastosowaniem lipofekcji (dostępny handlowo od GIBCO- BRL). Po 4-5 dniach inkubacji w 28C, uwolnione wirusy zbiera się i stosuje do dalszych amplifikacji. Infekcję wirusową i ekspresję białek przeprowadza się jak opisano przez O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994). [0442] Wyekspresjonowaną, wyznakowaną poli-his IL-17A/F można następnie oczyszczać, przykładowo za pomocą chromatografia powinowactwa chelatującej Ni 2+, jak następuje. Ekstrakty z zainfekowanych rekombinowanym wirusem komórek Sf9 otrzymuje się, jak opisano przez Rupert et al., Nature, 362: (1993). W skrócie, komórki Sf9 przemywa się, ponownie zawiesza w buforze do sonikacji (25 ml Hepes, ph 7,9; 12,5 mm MgCl 2 ; 0,1 mm EDTA; 10% glicerol; 0,1% NP-40; 0,4 M KCl) i sonikuje dwukrotnie przez 20 sekund na lodzie. Sonikaty klaruje się poprzez wirowanie, a supernatant rozcieńcza się 50-krotnie w buforze do nanoszenia (50 mm fosforan, 300 mm NaCl, 10% glicerol, ph 7,8) i filtruje przez filtr 0,45 µm. Przygotowuje się kolumnę z agarozą Ni 2+ -NTA (dostępna handlowo od Qiagen) o objętości złoża wynoszącej 5 ml, przemywa się ją 25 ml wody i równoważy 25 ml buforu do nanoszenia. Filtrowany ekstrakt komórkowy nanosi się na kolumnę przy 0,5 ml na minutę. Kolumnę przemywa się do linii podstawowej A 280 za pomocą buforu do nanoszenia, kiedy to rozpoczyna się zbieranie frakcji. Następnie, kolumnę przemywa się drugim buforem do przemywania (50 mm fosforan; 300 mm NaCl, 10% glicerol, ph 6,0), który eluuje białko związane niespecyficznie. Po ponownym osiągnięciu linii podstawowej A 280, kolumnę "rozwija się" [ang. developed] za pomocą gradientu imidazolu od 0 do 500 mm w drugim buforze do przemywania Zbiera się frakcje jednego ml analizuje za pomocą SDS-PAGE i barwienia srebrem lub Western blot z Ni 2+ -NTA w sprzężeniu z fosfatazą alkaliczną (Qiagen). Frakcje zawierające wyeluowaną, wyznakowaną His 10 IL-17A/F zbiera się i dializuje względem buforu do nanoszenia.

148 147 [0443] Alternatywnie, oczyszczanie IL-17A/F wyznakowanej IgG (lub wyznakowanej Fc) przeprowadzać można z zastosowaniem znanych technik chromatograficznych, włączając, przykładowo, chromatografię kolumnową z białkiem A lub białkiem G. PRZYKŁAD 8 Otrzymywanie Przeciwciał Wiążących IL-17A/F [0444] Przykład ten ilustruje otrzymywanie przeciwciał monoklonalnych, które mogą specyficznie wiązać IL-17A/F. [0445] Techniki do wytwarzania przeciwciał monoklonalnych znane są w stanie techniki i opisano je, przykładowo, w Goding, supra. Immunogeny, które można zastosować obejmują oczyszczone polipeptydy IL-17A/F, białka fuzyjne zawierające polipeptydy IL-17A/F i komórki ekspresjonujące rekombinowane polipeptydy IL-17A/F na powierzchni komórki. Wyboru immunogenu może dokonać znawca, bez niepotrzebnego eksperymentowania. [0446] Myszy, takie jak BALB/c, immunizuje się immunogenem IL-17A/F, tworzącym emulsję z pełnym adiuwantem Freunda i wstrzykniętym podskórnie lub dootrzewnowo w ilości od mikrogramów. Alternatywnie, immunogen wprowadza się w emulsję z adiuwantem MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, Mont.) i wstrzykuje do poduszek na tylnych łapach zwierzęcia. Następnie, immunizowane myszy stymuluje się 10 do 12 dni później za pomocą dodatkowego immunogenu zemulgowanego w wybranym adiuwancie. Od tego czasu, przez kilka tygodni, myszy można również stymulować dodatkowymi zastrzykami immunizującymi. Próbki surowicy można okresowo pobierać od myszy za pomocą skrwawienia pozagałkowego do testowania w badaniu ELISA dla wykrycia przeciwciał anty-il-17a/f/. [0447] Po wykryciu odpowiedniego miana przeciwciał, zwierzętom pozytywnym pod kątem przeciwciał można wstrzyknąć ostatni, dożylny zastrzyk z IL-17A/F. Trzy do czterech dni później, myszy uśmierca się i pobiera komórki śledziony. Komórki śledziony łączy się następnie (stosując 35% glikol polietylenowy) z wybraną linią mysich komórek szpiczaka, taką jak P3X63AgU.1, dostępną od ATCC, Nr CRL Fuzje generują komórki hybrydomy, którymi można następnie wysiewać na 96-dołkowe płytki do hodowli, zawierające pożywkę HAT (hipoksantyna, aminopteryna i tymidyna) do hamowania proliferacji niepołączonych komórek, hybryd szpiczakowych i hybryd komórek śledziony. [0448] Komórki hybrydomy zostaną zbadane przesiewowo w ELISA pod kątem reaktywności przeciw IL-17A/F. Oznaczenie pozytywnych komórek hybrydomy, wydzielających pożądane przeciwciała monoklonalne przeciw IL-17A/F, leży w zakresie umiejętności znawcy. [0449] Pozytywne komórki hybrydomy można wstrzyknąć dootrzewnowo do syngenicznych myszy BALB/c dla wytworzenia puchlin zawierających monoklonalne przeciwciała anty-il- 17A/F. Alternatywnie, komórki hybrydomy można hodować w kolbach do hodowli tkanek lub w obrotowych butelkach. Oczyszczanie przeciwciał monoklonalnych wytwarzanych w puchlinach można uzyskać stosując strącanie siarczanu amonu, po którym przeprowadza się

149 148 żelową chromatografię wykluczenia. Alternatywnie, zastosować można chromatografię powinowactwa w oparciu o wiązanie przeciwciała do białka A lub białka G. PRZYKŁAD 9 Oczyszczanie Polipeptydów IL-17A/F z Zastosowaniem Specyficznych Przeciwciał [0450] Naturalne lub rekombinowane polipeptydy IL-17A/F oczyszczać można za pomocą wielu różnych technik standardowych w dziedzinie oczyszczania białek. Przykładowo, polipeptyd pro-il-17a/f, dojrzały polipeptyd IL-17A/F lub polipeptyd pre-il-17a/f oczyszcza się za pomocą chromatografii immunopowinowactwa, stosując przeciwciała specyficzne dla polipeptydu IL-17A/F będącego przedmiotem zainteresowania. Ogólnie, kolumnę immunopowinowactwa konstruuje się poprzez kowalentne sprzęganie przeciwciała anty-polipeptyd IL-17A/F do aktywowanej żywicy chromatograficznej. [0451] Immunoglobuliny poliklonalne otrzymuje się z surowicy odpornościowej przez wytrącanie siarczanem amonu lub przez oczyszczanie na zimmobilizowanym białku A (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.). Podobnie, przeciwciała monoklonalne otrzymuje się z mysiego płynu puchlinowego za pomocą wytrącania siarczanem amonu lub chromatografii na zimmobilizowanym białku A. Częściowo oczyszczoną immunoglobulinę przyłącza się kowalentnie do żywicy chromatograficznej, takiej jak aktywowana CnBr SEPHAROSE (Pharmacia LKB Biotechnology). Przeciwciało sprzęga się do żywicy, żywicę blokuje się, a żywicę pochodną przemywa się według instrukcji producenta. [0452] Taką kolumnę immunopowinowactwa wykorzystuje się do oczyszczania polipeptydu IL-17A/F poprzez otrzymywanie frakcji z komórek zawierających polipeptyd IL-17A/F w postaci rozpuszczalnej. To otrzymywanie uzyskuje się poprzez rozpuszczanie całej komórki lub frakcji subkomórkowej, uzyskanej via wirowanie różnicujące poprzez dodatek detergentu lub inne sposoby dobrze znane w stanie techniki. Alternatywnie, rozpuszczalny polipeptyd IL-17A/F, zawierający sekwencję sygnalną, może być wydzielany w użytecznej ilości do pożywki, w której komórki są hodowane. [0453] Preparat zawierający rozpuszczalny polipeptyd IL-17A/F przepuszcza się przez kolumnę immunopowinowactwa i kolumnę przemywa się w warunkach umożliwiających preferencyjną absorbancję polipeptydu IL-17A/F (np. bufory o wysokiej sile jonowej w obecności detergentu). Następnie kolumnę eluuje się w warunkach zaburzających wiązanie przeciwciało/polipeptyd IL-17A/F (np. bufor o niskim ph, takim jak w przybliżeniu ph 2-3 lub wysokim stężeniu chaotropu, takiego jak mocznik lub jon tiocyjanianowy) i zbiera się polipeptyd IL-17A/F. PRZYKŁAD 10 Badanie Przesiewowe Leków [0454] Wynalazek ten jest szczególnie użyteczny do badania przesiewowego związków poprzez zastosowanie polipeptydów IL-17A/F lub ich fragmentów wiążących w dowolnej z wielu różnych technik badania przesiewowego leków. Polipeptyd IL-17A/F lub fragment zastosowany w takim teście może być wolny w roztworze, przymocowany do stałej podpory,

150 149 noszony na powierzchni komórki lub umiejscowiony wewnątrzkomórkowo. W jednym ze sposobów badania przesiewowego leku stosuje się komórki gospodarza eukariotycznego lub prokariotycznego, które są stabilnie transformowane rekombinowanymi kwasami nukleinowymi, ekspresjonującymi polipeptyd IL-17A/F lub fragment. Leki bada się przesiewowego względem taki transformowanych komórek w badaniach wiązania kompetycyjnego. Takie komórki, czy to w postaci żywej, czy utrwalonej, stosować można do standardowych badań wiązania. Mierzyć można, przykładowo, tworzenie kompleksów między polipeptydem IL-17A/F lub fragmentem i testowanym środkiem. Alternatywnie, badać można zmniejszanie tworzenia się kompleksów między polipeptydem IL-17A/F a jego komórką docelową lub receptorami docelowym, powodowane testowanym środkiem. [0455] Z tego względu, wynalazek zapewnia sposoby badania przesiewowego pod kątem leków lub jakichkolwiek innych środków, które mogą wpływać na chorobę lub zaburzenie związane z polipeptydem IL-17A/F. Sposoby te obejmują kontaktowanie takiego środka z polipeptydem IL-17A/F lub jego fragmentem i badanie (i) pod kątem obecności kompleksu między środkiem a polipeptydem IL-17A/F lub fragmentem lub (ii) pod kątem obecności kompleksu między polipeptydem IL-17A/F lub fragmentem a komórką, za pomocą sposobów dobrze znanych w stanie techniki. W takich badaniach wiązania kompetycyjnego, polipeptyd IL-17A/F lub jego fragment jest zazwyczaj wyznakowany. Po odpowiedniej inkubacji, wolny polipeptyd IL-17A/F lub fragment oddziela się od tego obecnego w postaci związanej, a ilość wolnego lub niebędącego w kompleksie znacznika jest miarą zdolności danego środka do wiązania się do polipeptydu IL-17A/F lub do zakłócania kompleksu polipeptyd IL- 17A/F/komórka. [0456] Inna technika badania przesiewowego leku zapewnia wysokowydajne badanie przesiewowe pod kątem związków mających odpowiednie powinowactwo wiązania do polipeptydu i jest opisana szczegółowo w WO 84/03564, opublikowanym 13 września, W skrócie, dużą liczbę związków testowych w postaci różnych małych peptydów syntetyzuje się na stałym substracie, takim jak plastikowe szpilki lub niektóre inne powierzchnie. Jak stosuje się dla polipeptydu IL-17A/F, peptydowe związki testowe poddaje się reakcji z polipeptydem IL-17A/F i przemywa. Związany polipeptyd IL-17A/F wykrywa się sposobami dobrze znanymi w stanie techniki. Oczyszczonym polipeptydem IL-17A/F można również bezpośrednio pokrywać płytki do zastosowania w wymienionych wcześniej technikach badania przesiewowego leków. Dodatkowo, przeciwciała nie-neutralizujące stosować można do wychwytywania peptydu i immobilizowania go na stałej podporze. [0457] W wynalazku tym pod uwagę bierze się zastosowanie kompetycyjnego badania przesiewowego leku, w którym przeciwciała neutralizujące, zdolne do wiązania polipeptydu IL-17A/F, swoiście współzawodniczą ze związkiem testowym pod kątem wiązania do polipeptydu IL-17A/F lub jego fragmentów. W ten sposób, przeciwciała stosować można do wykrywania obecności jakiegokolwiek peptydu, który dzieli jedną lub większą liczbę determinant antygenowych z polipeptydem IL-17A/F. PRZYKŁAD 11

151 150 Racjonalne Projektowanie Leku [0458] Celem racjonalnego projektowania leku jest wytworzenie strukturalnych analogów biologicznie aktywnych polipeptydów będących przedmiotem zainteresowania (tj. polipeptydu IL-17A/F) lub małych cząsteczek, z którymi one oddziałują, np. agonistów, antagonistów lub inhibitorów. Którykolwiek z tych przykładów zastosować można do kształtowania leków, które są aktywniejszymi lub stabilniejszymi postaciami polipeptydu IL- 17A/F lub które wzmacniają lub zakłócają funkcję polipeptydu IL-17A/F in vivo (c.f., Hodgson, Bio/Technology, 9: (1991)). [0459] W jednym z podejść określa się trójwymiarową strukturę polipeptydu IL-17A/F lub kompleksu polipeptyd IL-17A/F-inhibitor za pomocą krystalografii rentgenowskiej, poprzez modelowanie komputerowe lub, najbardziej typowo, poprzez kombinację tych dwóch podejść. Dla wyjaśnienia struktury i określenia miejsca (miejsc) aktywnych cząsteczki należy ustalić zarówno kształt, jak i ładunki polipeptydu IL-17A/F. Rzadziej, użyteczne informacje dotyczące struktury polipeptydu IL-17A/F uzyskać można poprzez modelowanie oparte na strukturze białek homologicznych. W obu przypadkach, dla zaprojektowania analogicznych cząsteczek podobnych do polipeptydu IL-17A/F lub do zidentyfikowania skutecznych inhibitorów stosuje się istotne informacje o strukturze. Użyteczne przykłady racjonalnego projektowania leków obejmować mogą cząsteczki, które mają poprawioną aktywność lub stabilność, jak pokazano przez Braxton i Wells, Biochemistry, 31: (1992) lub które działają jako inhibitory, agoniści lub antagoniści peptydów naturalnych, jak przedstawiono przez Athauda et al., J., Biochem., 113: (1993). [0460] Możliwa jest również izolacja przeciwciała specyficznego wobec celu, wybranego poprzez badanie funkcjonalne, jak opisano powyżej, a następnie rozwiązanie jego struktury krystalicznej. Podejście to z zasady daje farmakofor, na którym opierać można dalsze projektowanie leku. Możliwe jest zupełne obejście krystalografii białka poprzez wytwarzanie przeciwciał anty-idiotypowych (anty-id-ów) wobec funkcjonalnego, farmakologicznie aktywnego przeciwciała. Oczekiwano by, że jak odbicie lustrzane odbicia lustrzanego, miejsce wiązania anty-id-ów będzie odpowiednikiem oryginalnego receptora. Anty-id można następnie zastosować do identyfikowania i izolowania peptydów z banków peptydów wytworzonych chemicznie lub biologicznie. Wyizolowane peptydy działaby by wówczas jak farmakofor. [0461] Za pomocą wynalazku dostępnymi uczynić można wystarczające ilości polipeptydu IL-17A/F dla przeprowadzenia takich badań analitycznych, jak krystalografia rentgenowska. Dodatkowo, znajomość zapewnionej sekwencji aminokwasowej polipeptydu IL-17A/F zapewni wytyczne dla stosujących techniki modelowania komputerowego zamiast lub w dodatku do krystalografii rentgenowskiej. Piotr Godlewski Rzecznik patentowy

152 151 Zastrzeżenia patentowe 1. Cząsteczka wyizolowanego kwasu nukleinowego, która albo (i) posiada co najmniej 80% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego z: (a) sekwencją nukleotydową kodującą polipeptyd IL-17A/F składający się z SEKW. o NR ID.:3, jak pokazano na Fig. 3C i SEKW. o NR ID.:4, jak pokazano na Fig. 3C; (b) sekwencją nukleotydową kodującą polipeptyd IL-17A/F składający się z SEKW. o NR ID.:3, jak pokazano na Fig. 3C i SEKW. o NR ID.:4, jak pokazano na Fig. 3C, nie mający swoich powiązanych peptydów sygnalnych; (c) sekwencją nukleotydową składającą się z SEKW. o NR ID.:5, jak pokazano na Fig. 7 i SEKW. o NR ID.:6, jak pokazano na Fig. 9; albo (d) sekwencją nukleotydową składającą się z sekwencji kodującej o pełnej długości z SEKW. o NR ID.:5, jak pokazano na Fig. 7 i SEKW. o NR ID.:6, jak pokazano na Fig. 9; albo (ii) zawiera: (a) sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd IL-17A/F zawierający SEKW. o NR ID.:3, jak pokazano na Fig. 3C i SEKW. o NR ID.:4, jak pokazano na Fig. 3C; (b) sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd IL-17A/F zawierający SEKW. o NR ID.:3, jak pokazano na Fig. 3C i SEKW. o NR ID.:4, jak pokazano na Fig. 3C, nie mający swoich powiązanych peptydów sygnalnych; (c) sekwencję nukleotydową zawierającą SEKW. o NR ID.:5, jak pokazano na Fig. 7 i SEKW. o NR ID.:6, jak pokazano na Fig. 9; albo (d) sekwencję nukleotydową zawierającą sekwencję kodującą o pełnej długości z SEKW. o NR ID.:5, jak pokazano na Fig. 7 i SEKW. o NR ID.:6, jak pokazano na Fig Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 1, w którym polipeptyd IL-I7A/F jest kowalencyjnie związanym kompleksem heterodimerycznym, składającym się z SEKW. o NR ID.:3 i SEKW. o NR ID.:4. 3. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 2, w którym kowalencyjnie związany kompleks heterodimeryczny zawiera dwa międzyłańcuchowe połączenia disiarczkowe między SEKW. o NR ID.:3 i SEKW. o NR ID.:4. 4. Cząsteczka wyizolowanego kwasu nukleinowego według zastrz. 1, mająca co najmniej 85% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego z:

153 152 (a) sekwencją nukleotydową kodującą polipeptyd IL-17A/F składający się z SEKW. o NR ID.:3 i SEKW. o NR ID.:4; (b) sekwencją nukleotydową kodującą polipeptyd IL-17A/F składający się z SEKW. o NR ID.:3 i SEKW. o NR ID.:4, nie mający swoich powiązanych peptydów sygnalnych; (c) sekwencją nukleotydową składającą się z SEKW. o NR ID.:5 i SEKW. o NR ID.:6; albo (d) sekwencją nukleotydową składającą się z sekwencji kodującej o pełnej długości z SEKW. o NR ID.:5 i SEKW. o NR ID.:6. 5. Cząsteczka wyizolowanego kwasu nukleinowego według zastrz. 1, mająca co najmniej 90% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego z: (a) sekwencją nukleotydową kodującą polipeptyd IL-17A/F składający się z SEKW. o NR ID.:3 i SEKW. o NR ID.:4; (b) sekwencją nukleotydową kodującą polipeptyd IL-17A/F składający się z SEKW. o NR ID.:3 i SEKW. o NR ID.:4, nie mający swoich powiązanych peptydów sygnalnych; (c) sekwencją nukleotydową składającą się z SEKW. o NR ID.:5 i SEKW. o NR ID.:6; albo (d) sekwencją nukleotydową składającą się z sekwencji kodującej o pełnej długości z SEKW. o NR ID.:5 i SEKW. o NR ID.:6. 6. Cząsteczka wyizolowanego kwasu nukleinowego według zastrz. 1, mająca co najmniej 95% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego z: (a) sekwencją nukleotydową kodującą polipeptyd IL-17A/F składający się z SEKW. o NR ID.:3 i SEKW. o NR ID.:4; (b) sekwencją nukleotydową kodującą polipeptyd IL-17A/F składający się z SEKW. o NR ID.:3 i SEKW. o NR ID.:4, nie mający swoich powiązanych peptydów sygnalnych; (c) sekwencją nukleotydową składającą się z SEKW. o NR ID.:5 i SEKW. o NR ID.:6; albo (d) sekwencją nukleotydową składającą się z sekwencji kodującej o pełnej długości z SEKW. o NR ID.:5 i SEKW. o NR ID.:6. 7. Cząsteczka wyizolowanego kwasu nukleinowego według zastrz. 1, mająca co najmniej 99% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego z: (a) sekwencją nukleotydową kodującą polipeptyd IL-17A/F składający się z SEKW. o NR ID.:3 i SEKW. o NR ID.:4;

154 153 (b) sekwencją nukleotydową kodującą polipeptyd IL-17A/F składający się z SEKW. o NR ID.:3 i SEKW. o NR ID.:4, nie mający swoich powiązanych peptydów sygnalnych; (c) sekwencją nukleotydową składającą się z SEKW. o NR ID.:5 i SEKW. o NR ID.:6; albo (d) sekwencją nukleotydową składającą się z sekwencji kodującej o pełnej długości z SEKW. o NR ID.:5 i SEKW. o NR ID.:6. 8. Cząsteczka wyizolowanego kwasu nukleinowego według zastrz. 1, zawierająca sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd IL-17A/F, zawierający SEKW. o NR ID.:3 i SEKW. o NR ID.:4. 9. Cząsteczka wyizolowanego kwasu nukleinowego według zastrz. 1, zawierająca sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd IL-17A/F, zawierający SEKW. o NR ID.:3 i SEKW. o NR ID.:4, nie mający swoich powiązanych peptydów sygnalnych. 10. Cząsteczka wyizolowanego kwasu nukleinowego według zastrz. 1, zawierająca SEKW. o NR ID.:5 i SEKW. o NR ID.: Cząsteczka wyizolowanego kwasu nukleinowego według zastrz. 1, zawierająca sekwencję kodującą o pełnej długości z SEKW. o NR ID.:5 i SEKW. o NR ID.: Wektor zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego według Zastrz Wektor według zastrz. 12, operacyjnie przyłączony do sekwencji kontrolnych, rozpoznawanych przez komórkę gospodarza transformowaną wektorem. 14. Komórka gospodarza zawierająca wektor według Zastrz Komórka gospodarza według zastrz. 14, przy czym komórka jest komórką CHO, komórką E. coli, komórką drożdżową lub komórką owadzią zainfekowaną bakulowirusem. 16. Sposób wytwarzania polipeptydu IL-17A/F, obejmujący (i) hodowanie komórki gospodarza według Zastrz. 14 w warunkach odpowiednich do ekspresji polipeptydu IL-17 A/F i odzyskiwanie polipeptydu IL-17A/F z hodowli komórkowej; albo (ii) (a) kotransfekowanie komórek gospodarza równymi ilościami wektorów ekspresyjnych cdna, kodujących ludzki polipeptyd IL-17, przedstawiony jako SEKW. o NR ID.:3 na Fig. 3C i ludzki polipeptyd IL-17F, przedstawiony jako SEKW. o NR ID.:4 na Fig. 3C oraz (i) hodowanie komórek gospodarza w warunkach odpowiednich do ekspresji kompleksu polipeptydowego IL-17 A/F i odzyskiwanie kompleksu polipeptydowego IL-17A/F z hodowli komórkowej.

155 Wyizolowany polipeptyd albo kompleks, mający co najmniej 80% identyczności sekwencji aminokwasowej z kompleksem heterodimerycznym IL-17A/F, składającym się z SEKW. o NR ID.:3, jak przedstawiono na Fig. 3C i SEKW. o NR ID.:4, jak przedstawiono na Fig. 3C, z albo bez ich powiązanych peptydów sygnalnych. 18. Wyizolowany polipeptyd albo kompleks według zastrz. 17, w którym kompleks heterodimeryczny zawiera dwa międzyłańcuchowe połączenia disiarczkowe między SEKW. o NR ID.:3 i SEKW. o NR ID.: Wyizolowany polipeptyd albo kompleks według zastrz. 17, w którym poziom identyczności sekwencji aminokwasowej wynosi co najmniej 85%. 20. Wyizolowany polipeptyd albo kompleks według zastrz. 17, w którym poziom identyczności sekwencji aminokwasowej wynosi co najmniej 90%. 21. Wyizolowany polipeptyd albo kompleks według zastrz. 17, w którym poziom identyczności sekwencji aminokwasowej wynosi co najmniej 95%. 22. Wyizolowany polipeptyd albo kompleks według zastrz. 17, w którym poziom identyczności sekwencji aminokwasowej wynosi co najmniej 99%. 23. Wyizolowany kompleks według zastrz. 17, który jest heterodimerycznym kompleksem IL-17A/F, zawierający SEKW. o NR ID.:3 i SEKW. o NR ID.:4, bez ich powiązanych peptydów sygnalnych. 24. Wyizolowany, heterodimeryczny kompleks IL-17A/F według zastrz. 23, który zawiera dwa międzyłańcuchowe połączenia disiarczkowe między SEKW. o NR ID.:3 i SEKW. o NR ID.: Kompleks chimeryczny, zawierający heterodimeryczny kompleks IL-17A/F według zastrz. 23, w fuzji z heterologiczną sekwencją aminokwasową. 26. Kompleks chimeryczny według zastrz. 25, w którym heterologiczna sekwencja aminokwasowa jest sekwencją znacznika epitopowego albo regionu Fc immunoglobuliny. 27. Wyizolowane przeciwciało specyficznie wiążące się do heterodimerycznego kompleksu IL-17A/F według zastrz. 23 albo 24 i hamujące aktywność heterodimerycznego kompleksu IL-17A/F dla indukowania wytwarzania IL-8 i IL Wyizolowane przeciwciało według zastrz. 27, przy czym przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym, przeciwciałem humanizowanym albo przeciwciałem jednołańcuchowym 29. Wyizolowane przeciwciało według zastrz. 27, przy czym przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym, które korzystnie ma reszty regionu determinującego dopasowanie (CDR) innego niż ludzki i reszty ludzkiego regionu zrębowego (FR). 30. Wyizolowane przeciwciało według zastrz. 27, które jest wyznakowane i jest immobilizowane na stałej podporze.

156 Wyizolowane przeciwciało według zastrz. 27, przy czym przeciwciało jest fragmentem przeciwciała, przeciwciałem monoklonalnym, przeciwciałem jednołańcuchowym albo przeciwciałem anty-idiotypowym. 32. Kompozycja przedmiotowa zawierająca (a) polipeptyd IL-17A/F albo kompleks, jak zdefiniowano w którymkolwiek z zastrz. od 17 do 24; albo (b) antagonistyczne przeciwciało anty-il-17a/f, jak zdefiniowano w którymkolwiek z zastrz. od 27 do 31; w kombinacji z nośnikiem. 33. Kompozycja przedmiotowa według zastrz. 32., w której nośnikiem jest nośnik dopuszczalny farmaceutycznie. 34. Kompozycja przedmiotowa według zastrz. 32, która jest użyteczna do leczenia choroby o podłożu immunologicznym u ssaka. 35. Kompozycja przedmiotowa według zastrz. 32, w której (a) zdolny jest do (i) zwiększania proliferacji limfocytów T u ssaka, albo (ii) zwiększania infiltracji komórek zapalnych do tkanki ssaka. 36. Kompozycja przedmiotowa według zastrz. 32, w której (b) zdolny jest do (i) hamowania proliferacji limfocytów T u ssaka, albo (ii) zmniejszania infiltracji komórek zapalnych do tkanki ssaka. 37. Kompozycja przedmiotowa według zastrz. 32, zawierająca terapeutycznie skuteczną ilość (a) albo (b). 38. Zestaw, zawierający: pojemnik; etykietę na pojemniku; i kompozycję według zastrz. 32, zawartą w pojemniku, przy czym etykieta na pojemniku wskazuje, że kompozycję przedmiotową stosować można do leczenia choroby o podłożu immunologicznym. 39. Zastosowanie polipeptydu albo kompleksu IL-17A/F, jak zdefiniowano w którymkolwiek z zastrz. od 17 do 24, do otrzymywania leku do (i) leczenia zaburzenia o podłożu immunologicznym; (ii) stymulowania proliferacji limfocytów T; albo (iii) wzmacniania infiltracji komórek zapalnych do tkanki u ssaka, który tego potrzebuje. 40. Zastosowanie antagonistycznego przeciwciała anty-il-17a/f, jak zdefiniowano w zastrz. 27, do otrzymywania leku do

157 156 (i) leczenia zaburzenia o podłożu immunologicznym; (ii) hamowania proliferacji limfocytów T; albo (iii) zmniejszania infiltracji komórek zapalnych do tkanki u ssaka, który tego potrzebuje. 41. Zastosowanie według zastrz. 39 albo 40, w którym zaburzenie o podłożu immunologicznym oznacza toczeń rumieniowaty układowy, reumatoidalne zapalenie stawów, osteoartrozę, młodzieńcze, przewlekłe zapalenie stawów, spondyloartropatię, twardzinę układową, idiopatyczną miopatię zapalną, zespół Sjögrena, układowe zapalenie naczyń, sarkoidozę, anemię autoimmunohemolityczną, trombocytopenię autoimmunologiczną, zapalenie tarczycy, cukrzycę, chorobę nerek o podłożu immunologicznym, chorobę demielinizacyjną układu nerwowego ośrodkowego albo obwodowego, idiopatyczną, demielinizacyjną polineuropatię, zespół Guillaina-Barréa, przewlekłą, zapalną polineuropatię demielinizacyjną, chorobę wątroby i dróg żółciowych, infekcyjne albo autoimmunologiczne, przewlekłe, aktywne zapalenie wątroby, pierwotną marskość wątroby, zapalenie wątroby ziarniniakowe, stwardniające zapalenie dróg żółciowych, nieswoiste zapalenie jelit, enteropatię z nadwrażliwości na gluten, chorobę Whipplea, chorobę skóry autoimmunologiczną albo o podłożu immunologicznym, chorobę pęcherzową skóry, rumień wielopostaciowy, kontaktowe zapalenie skóry, łuszczycę, chorobę alergiczną, astmę, alergiczny nieżyt nosa, atopowe zapalenie skóry, nadwrażliwość pokarmową, pokrzywkę, chorobę immunologiczną płuc, eozynofilowe zapalenie płuc, idiopatyczne zwłóknienie płuc, zapalenie płuc z nadwrażliwości, chorobę związaną z przeszczepem, odrzucenie przeszczepu albo chorobę przeszczep przeciwko gospodarzowi. 42. Zastosowanie według zastrz. 41, w którym nieswoistym zapaleniem jelit jest wrzodziejące zapalenie okrężnicy. 43. Zastosowanie według zastrz. 39 albo 40, w którym komórki zapalne są komórkami jednojądrzastymi, eozynofilami albo neutrofilami wielojądrzastymi (PMN). 44. Sposób określania obecności polipeptydu albo kompleksu IL-17A/F, jak zdefiniowano w którymkolwiek z zastrz. od 17 do 24 w próbce podejrzanej o zawieranie polipeptydu, przy czym sposób obejmuje eksponowanie próbki na przeciwciało anty-il-17a i przeciwciało anty-il-17f i określanie wiązania przeciwciał do składnika próbki. 45. Sposób diagnozowania choroby o podłożu immunologicznym u ssaka, przy czym sposób obejmuje (a) kontaktowanie przeciwciała anty-il-17a i przeciwciała anty-il-17f z próbką testową komórek z tkanki uzyskanych od ssaka; (b) wykrywanie tworzenia się kompleksu między przeciwciałami i polipeptydem albo kompleksem IL-17A/F, jak zdefiniowano w którymkolwiek z Zastrz. od 17 do 24 w próbce testowej; i

158 157 (c) porównywanie ilości tworzenia kompleksu w próbce testowej z ilością tworzenia kompleksu w próbce kontrolnej znanych, prawidłowych komórek z tkanki o tym samym typie komórki; przy czym tworzenie większej ilości kompleksu w próbce testowej wskazuje na obecność choroby o podłożu immunologicznym u ssaka, od którego uzyskano testowe komórki z tkanki. 46. Sposób identyfikowania związku, który hamuje aktywność polipeptydu albo kompleksu IL-17A/F, jak zdefiniowano w którymkolwiek z zastrz. od 17 do 24, przy czym sposób obejmuje kontaktowanie komórek, które normalnie odpowiadają na polipeptyd z (a) polipeptydem i (b) związkiem-kandydatem oraz określanie braku responsywności komórki na (a). 47. Sposób identyfikowania związku hamującego ekspresję polipeptydu albo kompleksu IL-17A/F, jak zdefiniowano w którymkolwiek z zastrz. od 17 do 24 w komórkach, które normalnie ekspresjonują polipeptyd, przy czym sposób obejmuje kontaktowanie komórek ze związkiem testowym i określanie czy ekspresja polipeptydu albo kompleksu IL-17A/F jest zahamowana. 48. Sposób według zastrz. 47, w którym związkiem-kandydatem jest antysensowny kwas nukleinowy. 49. Sposób identyfikowania związku, który naśladuje aktywność polipeptydu albo kompleksu IL-17A/F, jak zdefiniowano w którymkolwiek z zastrz. od 17 do 24, przy czym sposób obejmuje kontaktowanie komórek, które normalnie odpowiadają na polipeptyd, ze związkiem-kandydatem oraz określanie responsywności komórki na związek-kandydata. Piotr Godlewski Rzecznik patentowy

159 158

160 159

161 160

162 161

163 162

164 163

165 164

166 165

167 166

168 167

169 168

170 169

171 170

172 171

173 172