(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2015/09 EP B1 (13) (51) T3 Int.Cl. C07K 16/24 ( ) A61K 39/395 ( ) A61P 11/06 ( ) A61P 37/00 ( ) A61P 1/00 ( ) (54) Tytuł wynalazku: Przeciwciała przeciwko IL-25 (30) Pierwszeństwo: GB US P (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2011/29 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2015/10 (73) Uprawniony z patentu: Medical Research Council, Swindon, GB (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 DAVID JOHN MATTHEWS, London, GB JILLIAN BARLOW, Cambridge, GB ANDREW NEIL JAMES MCKENZIE, Cambridge, GB (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Piotr Godlewski JWP RZECZNICY PATENTOWI DOROTA RZĄŻEWSKA SP. J. ul. Żelazna 28/30 Sienna Center Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 Przeciwciała przeciwko IL-25 Opis DZIEDZINA WYNALAZKU [0001] Wynalazek dotyczy przeciwciał, w tym ich fragmentów wiążących, skierowanych przeciwko interleukinie 25 (IL-25). TŁO WYNALAZKU Astma [0002] Astma to powszechne przewlekłe zaburzenie zapalne dróg oddechowych. W ciągu ostatnich kilku dekad liczba osób cierpiących dramatycznie wzrosła i Światowa Organizacja Zdrowia szacuje, że na całym świecie na astmę cierpi około 300 milionów osób. Astma alergiczna cechuje się niekontrolowaną nadreaktywnością oskrzeli (ang. airways hyperresponsiveness, AHR) indukowaną przez szereg bodźców prowokujących i wiąże się z przenikaniem do płuc wydzielin zapalnych typu 2. [0003] Cytokiny typu 2 odgrywają ważną rolę w pośredniczeniu w odporności ochronnej na zakażenia robakami pasożytniczymi regulując funkcje efektorowe, takie jak wzrost komórek B oraz wydzielanie IgE, indukując przerost komórek kubkowych oraz powiązane wytwarzanie śluzu, eozynofilię, mastocytozę oraz zwłóknienie (1). To centralne role odgrywane przez te cytokiny w regulacji tych funkcji efektorowych uczyniły z nich kluczowe cele terapeutyczne w astmie. W istocie, modele mysie, gdzie te cytokiny ulegają nadekspresji, wykazują istotne cechy astmy. Dlatego zaskakujące, że nieskuteczne okazały się wysiłki mające na celu złagodzenie astmy doświadczalnej przez blokowanie swoistych cytokin typu 2, z wyjątkiem inhibicji IL-13. [0004] Inhibicja IL-13 tłumi zarówno AHR, jak również zapalenie dróg oddechowych, chociaż mechanizm tego pozostaje niejasny (2, 3). Jednak biorąc pod uwagę złożoną patofizjologię oraz słabo zrozumianą etiologię astmy, nie jest jasne, czy celowanie pojedynczych szlaków ostatecznie okaże się skuteczne terapeutycznie. [0005] Niedawno wykazano, że nadekspresja IL-25/IL-17E, członka spokrewnionej strukturalnie rodziny cytokin IL-17 (8) indukuje odpowiedzi typu 2 w warunkach in vivo (4-6) i zwiększa reaktywność agonistów dróg oddechowych (7). Myszy Il25 -/- nie były w stanie skutecznie zwalczać robaków; wykazano także, że kluczowy wskaźnik nieskutecznej odpowiedzi IL-25 typu 2 (9, 10) także był regulowany do góry w próbkach od pacjentów z astmą. Nieswoiste zapalenie jelita [0006] Nieswoiste zapalenie jelita (ang. inflammatory bowel disease, IBD) to przewlekłe zapalenie wpływające na warstwę śluzówki jelita grubego lub okrężnicy, co zazwyczaj obejmuje jedno lub więcej schorzeń wybranych z grupy zawierającej wrzodziejące zapalenie jelita grubego (ang. ulcerative colitis, UC) oraz chorobę Leśniowskiego-Crohna (ang. Crohn s disease, CD). Uważa się, że UC jest chorobą wywoływaną za pośrednictwem Th2, gdzie

3 reprezentatywny model mysi wykazuje udział cytokin typu 2 w rozwoju zapalenia jelit (16). Wytwarzanie IL-25 obserwowano w mysim modelu przewlekłego zapalenia okrężnicy w związku z przejściem od odpowiedzi typu Th1 do Th2 (17) oraz wysoką ekspresją mrna IL-25 w całym przewodzie pokarmowym myszy (18). Ponadto gen IL-25 znajduje się w regionie podatności na chorobę Leśniowskiego-Crohna na chromosomie 14, chociaż jego potencjalny związek z chorobą oczekuje na zbadanie (19). Ponadto IBD może obejmować jedno lub więcej schorzeń wybranych z grupy zawierającej kolagenowe zapalenie okrężnicy, limfocytowe zapalenie okrężnicy, niedokrwienne zapalenie okrężnicy, zapalenie okrężnicy z wyłączenia, zespół Behçeta, zakaźne zapalenie okrężnicy oraz nieokreślone zapalenie okrężnicy. [0007] Konwencjonalne terapie dla leczenia IBD obejmują antybiotyki lub leki sterydowe; jednak nie są one obecnie skuteczne w indukowaniu lub utrzymywaniu remisji u pacjentów (20). Dostępna jest także terapia obejmująca czynniki anty-tnf-α, jednak wykazuje słabą skuteczność (21, 22). Pokazuje to, że istnieje wyraźne zapotrzebowanie na nowe i skuteczniejsze terapie w leczeniu zapalnych chorób jelit. Przeciwciała [0008] Podstawowa struktura przeciwciała jest dobrze znana w dziedzinie. Naturalnie występujące przeciwciało zazwyczaj ma cztery łańcuchy polipeptydowe: dwa identyczne łańcuchy ciężkie oraz dwa identyczne łańcuchy lekkie połączone mostkami dwusiarczkowymi. Łańcuchy ciężkie (VH) oraz lekkie (VL) mają regiony (lub domeny) stałe oraz zmienne. Regiony zmienne zasadniczo odpowiadają za wiązanie antygenu. W obrębie każdego regionu zmiennego z antygenem stykają się trzy podregiony znane jako regiony determinujące dopasowanie (ang. complementarity determining regions, CDR). CDR każdej domeny zmiennej są numerowane od końca N do końca C jako CDR1, CDR2 oraz CDR3. Między końcami N oraz C do CDR znajdują się cztery tzw. regiony zrębowe, które wykazują niewielki lub brak kontaktu z antygenem. Więcej szczegółów dotyczących struktur przeciwciał przedstawiono w wielu niżej cytowanych dokumentach, które włączono tu dla odniesienia. [0009] Istnieje szereg sposobów wytworzenia przeciwciał przeciwko antygenowi. Jednym z takich sposobów jest wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych przy użyciu technologii hybrydomy. Przeciwciała są zazwyczaj wytwarzane u myszy lub innych gryzoni. Może być to użyteczny sposób generowania przeciwciał o wysokim powinowactwie. Jednak, aby takie przeciwciała były użyteczne w leczeniu ludzi, zazwyczaj należy przenieść CDR przeciwciał na zręb ludzki. Ma to na celu próbę uniknięcia odpowiedzi u pacjenta ludzkiego przeciwciała przeciwmysiego. [0010] Ogólną zasadę przeszczepienia CDR opisali Jones et al oraz Riechman et al (11, 12). CDR przeciwciała mysiego są przeszczepiane do regionów zrębowych przeciwciała ludzkiego będącego biorcą. W praktyce chociaż uzyskane przeciwciało będzie wiązać ten sam antygen docelowy jak pierwotne mysie przeciwciało będące dawcą, powinowactwo przeszczepionego przeciwciała jest zazwyczaj znacznie ograniczone. [0011] Ponadto termostabilność przeszczepionych przeciwciał może być często pogorszona.

4 [0012] W dziedzinie znane są różne sposoby prób odzyskiwania i optymalizacji właściwości pierwotnego przeciwciała. Na przykład w regionach zrębowych występują pewne reszty struktur kanonicznych Chothia & Lesk (13), które są związane z pewnym CDR linii zarodkowych. Ponadto, Foote & Winter (14) zidentyfikowali reszty strefy Verniera (niektóre z nich są także resztami struktury kanonicznej), które wspierają konformacje pętli wiążącej antygen oraz ich względne skłonności i dlatego sugerowano, że odgrywają ważną rolę w regulacji dopasowania przeciwciała do antygenu. Dodatkowo uważa się, że dalsze reszty zrębowe stabilizują i utrzymują granicę VH/VL. Dlatego znawcy pragnący humanizować ludzkie sekwencje zrębowe, gdzie reszty strefy Verniera, kanoniczne oraz granicy ( VCI ) możliwie najlepiej przypominają pierwotne przeciwciało będące dawcą. [0013] Jednak każde przeciwciało stanowi wyjątkowe wyzwanie dla znawców i nie ma pewności, że w każdym przypadku można bezpośrednio zastosować jakąkolwiek ogólną znaną metodologię przeszczepienia CDR. [0014] Twórcy i ich współpracownicy (Ballantyne et al (15)) donoszą o wytwarzaniu mysiego przeciwciała monoklonalnego, 2C3, które wiąże się z IL-25 oraz może w warunkach in vivo blokować nadreaktywności dróg oddechowych w astmie alergicznej. Jak dotąd sekwencja przeciwciała nie jest dostępna publicznie. [0015] PCT/GB2008/001365, opublikowany 30 października 2008 r. jako WO2008/129263, donosi o sekwencji przeciwciała 2C3 i jego stosowaniu w blokowaniu nadreaktywności dróg oddechowych. UJAWNIENIE WYNALAZKU [0016] Wynalazek dotyczy humanizowanego (z przeszczepionym CDR) przeciwciała, które opiera się na sekwencji 2C3. Podczas wytwarzania tego przeciwciała należało pokonać szereg trudności. [0017] Twórcy najpierw wybrali łańcuch VH ludzkiego przeciwciała będącego biorcą o maksymalnej homologii VCI, czyli 20 spośród 22 reszt VCI. Jednak stwierdzono, że uzyskane przeciwciało ( RHA ) wiąże IL-25 w o wiele mniejszym stopniu niż samo 2C3. Mimo szeregu dalszych modyfikacji przeciwciała, w tym zmian wyznaczonych aminokwasów i reszt VCI, które wydawały się stanowić rzadkie mutacje somatyczne, osiągnięto niewielką poprawę wiązania przeciwciała. [0018] Podczas próby przezwyciężenia niepowodzenia podejścia homologii VCI do humanizacji przeciwciała, wybrano inną ludzką sekwencję zrębową VH o mniejszym dopasowaniu reszt VCI (17/22), ale nieco wyższej homologii ogólnej. Uzyskane przeciwciało zapewniło lepsze wiązanie niż przeciwciało RHA chociaż nadal nie było tak wysokie jak w przypadku macierzystego przeciwciała 2C3. [0019] Dla maksymalizacji wiązania oraz zminimalizowania reszt nieludzkich prowokujących ryzyko odpowiedzi przeciwciała, dokonano dalszych zmian sekwencji zrębowej oraz CDR. Otrzymane przeciwciało okazało się wykazywać znacznie lepsze wiązanie w porównaniu z 2C3, a w teście inhibicji nadreaktywności dróg oddechowych w warunkach in vivo okazało się znacznie silniejsze niż 2C3. Przeciwciało wykazywało także dobrą termostabilność.

5 [0020] Zakres wynalazku jest definiowany przez zastrzeżenia i wszelkie informacje, które nie są zawarte w zastrzeżeniach są podane jedynie w celach informacyjnych. [0021] Wynalazek dotyczy humanizowanego łańcucha VH pochodzącego od 2C3 do przeciwciała zawierającego ten łańcuch. Przeciwciało może zawierać humanizowany łańcuch VL zawierający CDR łańcucha VL 2C3. [0022] Dlatego w jednym aspekcie wynalazek zapewnia domenę VH przeciwciała, która zawiera SEQ ID NO:1: gdzie: Xa1 to Ser lub Thr; Xa2 to Gly, Asp, Ala, Ser, Val, Asn, Lys, Tyr lub Met; Xa3 to Met lub Ile; Xa4 to Val lub Arg; a Xa5 to Asp, Asn lub Gly, połączona z łańcuchem VL zawierającym CDR łańcucha VL 2C3. [0023] W jednym aspekcie reszty Xa1 Xa5 mogą być wybrane spośród następujących kombinacji: Xa1 to Ser lub Thr; Xa2 to Gly lub Asp; Xa3 to Met lub Ile; Xa4 to Val lub Arg; a Xa5 to Asp, Asn lub Gly. [0024] W niektórych przykładach wykonania, Xa2 to Gly, a Xa5 to Asp lub Asn, korzystnie Asp. [0025] W niektórych przykładach wykonania (w tym takich, gdzie Xa2 to Gly, a Xa5 to Asp lub Asn, korzystnie Asp), Xa1 to Ser.

6 [0026] W niektórych przykładach wykonania (w tym takich, gdzie Xa2 to Gly, a Xa5 to Asp lub Asn, korzystnie Asp), Xa1 to Thr. [0027] W niektórych przykładach wykonania, w tym wszystkich wyżej opisanych kombinacjach Xa2, Xa5 oraz Xa1, Xa3 to Met. [0028] W niektórych przykładach wykonania, w tym wszystkich wyżej opisanych kombinacjach Xa2, Xa5 oraz Xa1, Xa3 to Ile. [0029] Wszystkie wyżej opisane przykłady wykonania mogą być połączone z wartościami Xa4, tj. Val lub Arg. [0030] Określone kombinacje powyższych reszt podano w tabeli poniżej. Dla wygody znawcy oraz spójności z dołączonymi przykładami, tabela wymienia reszty wg numeracji Kabata. W niektórych przypadkach różni się to od numeracji listy sekwencji. Reszta Kabata: Pozycja w SEQ ID NO:1: Reszta listy sekwencji: Xa1 Xa2 Xa3 Xa4 Xa5 SEQ ID NO:2 Ser Gly Met Val Asp SEQ ID NO:3 Thr Gly Met Arg Asp SEQ ID NO:4 Ser Gly Met Arg Asp SEQ ID NO:5 Thr Gly Met Val Asp SEQ ID NO:6 Ser Asp Met Val Asp SEQ ID NO:7 Thr Asp Met Arg Asp SEQ ID NO:8 Thr Asp Met Val Asp SEQ ID NO:9 Ser Gly Ile Val Asp SEQ ID NO:10 Thr Gly Ile Arg Asp SEQ ID NO:11 Thr Gly Ile Val Asp SEQ ID NO:12 Ser Asp Ile Val Asp SEQ ID NO:13 Thr Asp Ile Arg Asp SEQ ID NO:14 Thr Asp Ile Val Asp [0031] Domena VH może być połączona z domeną zmienną łańcucha lekkiego dla zapewnienia określonego elementu wiążącego, który wiąże IL-25. [0032] Odpowiednia domena łańcucha lekkiego to taka, która zawiera reszty CDR przeciwciała 2C3. Korzystnie łańcuch lekki to humanizowany łańcuch lekki, tj. zawierający ludzkie sekwencje zrębowe oraz regiony CDR 2C3. Domena łańcucha lekkiego 2C3 jest przedstawiona jako SEQ ID NO:15. Regiony CDR 1 3 mogą zawierać reszty 30 34, na

7 przykład mogą zawierać odpowiednio reszty (SEQ ID NO:29); (SEQ ID NO:30) oraz (SEQ ID NO:31). [0033] Reszty CDR mogą znajdować się w łańcuchu lekkim natywnego przeciwciała 2C3 lub mogą być przeniesione do humanizowanej cząsteczki łańcucha lekkiego. [0034] Reszty 35 38, chociaż nie zawierające CDR, są wysoce zakonserwowane między sekwencjami mysiego i ludzkiego łańcucha lekkiego i także mogą być przenoszone. [0035] Przykład humanizowanego łańcucha VL zawiera reszty SEQ ID NO:25. Można jednak zastosować inne ludzkie sekwencje zrębowe, które zawierają trzy regiony CDR o SEQ ID NO: 15. Ponadto, jak wskazano poniżej, można także zastosować sekwencje wiodące przeciwciała inne niż sekwencja wiodąca nienatywnego przeciwciała łańcucha VL. Dlatego w jednym przykładzie wykonania łańcuch VL zawiera SEQ ID NO:25. W innym przykładzie wykonania łańcuch VL może zawierać sekwencję wiodącą przeciwciała taką jak opisana niżej połączoną z resztami o SEQ ID NO:25. [0036] Wynalazek zapewnia także zastosowanie docelowych elementów wiążących, na przykład w postaci kompozycji farmaceutycznej, do stosowania w leczeniu chorób, w tym schorzeń zapalnych, takich jak astma (w tym astma alergiczna), choroba Leśniowskiego- Crohna i wrzodziejące zapalenie okrężnicy. [0037] Te i kolejne aspekty wynalazku opisano dokładniej poniżej i z odniesieniem do dołączonych przykładów. SKRÓCONY OPIS RYSUNKÓW [0038] Figura 1 przedstawia sekwencję nukleotydową (SEQ ID NO:16) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:15) łańcucha lekkiego kappa sekwencji przeciwciała mysiego 2c3. Zacienienie oznacza CDR. Figura 2 przedstawia sekwencje nukleotydową (SEQ ID NO:18) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:17) łańcucha ciężkiego sekwencji przeciwciała mysiego 2c3. Zacienienie oznacza CDR. Figura 3 przedstawia sekwencje DNA (SEQ ID NO:20) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:19) AY Figura 4 przedstawia sekwencje DNA (SEQ ID NO:22) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:21) humanizowanego RHA 2c3. Figura 5 przedstawia sekwencje DNA (SEQ ID NO:24) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:23) AY Figura 6 przedstawia sekwencje DNA (SEQ ID NO:26) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:25) humanizowanego łańcucha lekkiego kappa RKA 2c3. Figury 7A-C przedstawiają porównanie aktywności wiązania RHA/RKA humanizowanego przeciwciała 2c3 oraz wariantów z chimerycznym 2c3.

8 Figura 8 przedstawia sekwencje DNA (SEQ ID NO:28) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:27) sekwencji zrębowej AJ zastosowaną w projekcie humanizowanego 2c3- RH2. Figury 9A i B przedstawiają wpływ określonych mutacji CDR na wiązanie 2c3 RH2bcdef do IL-25. Figura 10 przedstawia wpływ łączenia mutacji D31G i G96D CDR na wiązanie IL-25. Figura 11 przedstawia porównanie wiązania 2c3 RH2.5_S30T oraz 2c3 RH2.5_R71V do IL-25 Figura 12 to protokół dla mysiego modelu in vivo AHR. Figury 13A i B przedstawiają wpływ podawania 2c3 RH2.5_R71V na opór płucny w odpowiedzi na metacholinę. Figury 14A i B przedstawiają długość okrężnicy oraz masę ciała myszy w modelu zapalenia okrężnicy. SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU Docelowy element wiążący [0039] Opisuje to element pary cząsteczek, które wykazują swoistość wiązania się ze sobą. Członkowie pary swoiście wiążącej się mogą występować naturalnie bądź być wytwarzani całkowicie lub częściowo syntetycznie. Jeden element pary cząsteczek ma na powierzchni obszar lub jamę, która swoiście wiąże i dlatego jest komplementarna do określonej organizacji przestrzennej lub polarnej drugiego elementu pary cząsteczek. Dlatego elementy pary mają właściwość swoistego wiązania się ze sobą. Przykłady rodzajów par swoistego wiązania to antygen-przeciwciało, biotyna-awidyna, hormon-receptor hormonu, receptorligand oraz enzym-substrat. [0040] Przedmiot wynalazku dotyczy reakcji typu antygen-przeciwciało. Odpowiednio, docelowy element wiążący według wynalazku zawiera przynajmniej część cząsteczki przeciwciała, szczególniej przynajmniej część domeny wiążącej antygen takiej cząsteczki. [0041] Ogólnie region zmienny łańcucha ciężkiego (domena VH) przeciwciała odgrywa znaczącą rolę w wiązaniu przeciwciała do antygenu. Stąd, docelowe elementy wiążące według wynalazku opierają się na tych, które zawierają domenę VH i obejmują SEQ ID NO: 1. [0042] Podczas przygotowywania domen VH według wynalazku stwierdzono, że regiony CDR przeciwciała 2C3 uległy poprawie dzięki zmianie sekwencji CDR1 oraz CDR3. Dlatego, chociaż opisane korzystne przykłady wykonania wynalazku opisują rozważane domeny VH o SEQ ID NO:1, gdzie Xa2 to Gly, a Xa5 to Asp, wynalazek rozważa także humanizowane domeny VH mające ludzkie regiony zrębowe zawierające regiony CDR1 3 odpowiednio o SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35 oraz SEQ ID NO:36. [0043] Dlatego w kolejnych aspektach wynalazek zapewnia docelowy element wiążący, który wiąże IL-25, przy czym region determinujący dopasowanie (CDR) łańcucha ciężkiego H1 ma

9 sekwencję aminokwasową o SEQ ID NO:34. W innym aspekcie wynalazek zapewnia docelowy element wiążący, który wiąże IL-25, przy czym region determinujący dopasowanie (CDR) łańcucha ciężkiego H2 ma sekwencję aminokwasową o SEQ ID NO:35. W innym aspekcie wynalazek zapewnia docelowy element wiążący, który wiąże IL-25, przy czym region determinujący dopasowanie (CDR) łańcucha ciężkiego H3 ma sekwencję aminokwasową o SEQ ID NO:36. [0044] W kolejnym aspekcie wynalazek zapewnia docelowy element wiążący, który wiąże IL-25, przy czym region determinujący dopasowanie (CDR) łańcucha lekkiego L1 ma sekwencję aminokwasową o SEQ ID NO:29. W innym aspekcie wynalazek zapewnia docelowy element wiążący, który wiąże IL-25, przy czym region determinujący dopasowanie (CDR) łańcucha lekkiego L2 ma sekwencję aminokwasową o SEQ ID NO:30. W innym aspekcie wynalazek zapewnia docelowy element wiążący, który wiąże IL-25, przy czym region determinujący dopasowanie (CDR) łańcucha lekkiego L3 ma sekwencję aminokwasową o SEQ ID NO:31. [0045] W kolejnym aspekcie wynalazek zapewnia docelowy element wiążący, który wiąże IL-25, przy czym region determinujący dopasowanie (CDR) łańcucha ciężkiego H1 ma sekwencję aminokwasową o SEQ ID NO:34, CDR łańcucha ciężkiego H2 ma sekwencję aminokwasową o SEQ ID NO:35, a CDR łańcucha ciężkiego H3 ma sekwencję aminokwasową o SEQ ID NO:36. W jednym przykładzie wykonania taki docelowy element wiążący ma CDR łańcucha lekkiego L1 o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:29, CDR łańcucha lekkiego L2 o SEQ ID NO:30, a CDR łańcucha lekkiego L3 o SEQ ID NO:31. [0046] Zręb takich docelowych elementów wiążących może być wyłącznie ludzki, wyłączenie mysi lub zgodnie z wynalazkiem, głównie ludzki, ale zachowujący jedną lub więcej reszt mysich dla zwiększenia powinowactwa wiązania. [0047] Dlatego docelowe elementy wiążące zawierające CDR tworzą kolejny aspekt wynalazku i mogą być stosowane zgodnie z opisem dla docelowych elementów wiążących z domeną VH zawierającą SEQ ID NO: 1. [0048] Ogólnie, docelowy element wiążący zawiera domenę VH sparowaną z domeną VL dla zapewnienia domeny wiążącej przeciwciało antygen. W jednym przykładzie wykonania domena VH jest sparowana z domeną VL, której CDR i opcjonalnie reszty zrębowe zakonserwowane między człowiekiem i myszą pochodzą z przeciwciała 2C3. [0049] Jednak mieszanie łańcucha lekkiego jest dobrze ustalone w dziedzinie, co omówiono dalej i dlatego VH może być sparowana z domeną VL inną niż pochodząca z 2C3. Taka domena VL może być wybrana tak, jak to omówiono poniżej. [0050] Struktury i lokalizacje domen zmiennych immunoglobulin mogą być określone w odniesieniu do publikacji Kabat, E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4th Edition. US Department of Health and Human Services i jej aktualizacjach. Zapytania do tej bazy danych można zadawać za pomocą szeregu dostępnych źródeł akademickich i komercyjnych. Przykład, patrz Martin, A.C.R. Accessing the Kabat Antibody Sequence Database by Computer PROTEINS: Structure, Function and Genetics, 25 (1996),

10 [0051] Docelowy element wiążący według wynalazku może wiązać IL-25 z powinowactwem zasadniczo podobnym do opisanego niżej powinowactwa RHA2.5 R71V, np. +10%. Docelowy element wiążący będzie ogólnie swoisty wobec IL-25. Dlatego docelowy element wiążący nie będzie wykazywał istotnego wiązania cząsteczek innych niż jego swoisty partner lub partnerzy wiązania. Na przykład stwierdzono, że przeciwciało 2C3, od którego pochodzą przeciwciała według wynalazku, nie reaguje krzyżowo z IL-4, IL-5 oraz IL-13 i dlatego unikanie takiej reaktywności krzyżowej z innymi cytokinami implikowanymi w astmie oraz podobnych procesach jest cechą pożądaną docelowych elementów wiążących według wynalazku. [0052] Zazwyczaj swoistość można określić za pomocą oznaczenia wiązania, takiego jak test ELISA wykorzystujący panel antygenów. Docelowy element wiążący według wynalazku może rozpoznawać IL-25, ale nie innych członków rodziny IL-17, zwłaszcza dowolne spośród IL-17A, IL-17B oraz IL-17C; korzystniej wszystkie trzy spośród IL-17A, IL-17B oraz IL-17C. Wiązanie docelowego elementu wiążącego według wynalazku z IL-25 może być zablokowane przez konkurowanie z rekombinowaną IL-25. [0053] Powinowactwo wiązania oraz siłę zobojętniania różnych docelowych elementów wiążących można porównać w odpowiednich warunkach. Cząsteczka przeciwciała [0054] Opisuje to immunoglobulinę naturalną bądź wytworzoną częściowo lub całkowicie syntetycznie. Wykazano, że fragmenty całego przeciwciała mogą pełnić funkcję wiązania antygenów. Dlatego odniesienie do przeciwciała obejmuje także dowolny polipeptyd lub białko zawierające fragment wiążący przeciwciało. [0055] Przykładami fragmentów wiążących są (i) fragment Fab zawierający domeny VL, VH, CL i CH1; (ii) fragment Fd zawierający domeny VH i CH1; (iii) fragment Fv składający się z domen VL i VH pojedynczego przeciwciała; (iv) fragment dab (Ward, E.S. et al., Nature 341, (1989)), który zawiera domenę VH; (v) fragmenty F(ab )2, dwuwartościowy fragment obejmujący dwa połączone fragmenty Fab (vi) jednołańcuchowe cząsteczki Fv (scfv), przy czym domeny VH i VL są połączone linkerem peptydowym, który umożliwia powiązanie dwóch domen dla utworzenia miejsca wiązania antygenu (Bird et al, Science, 242, , 1988; Huston et al, PNAS USA, 85, , 1988); (vii) dwuswoiste jednołańcuchowe dimery Fv (PCT/US92/09965) i (viii) diciała, wielowartościowe lub wieloswoiste fragmenty skonstruowane przez fuzję genów (WO94/13804; P. Holliger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 1993). Cząsteczki Fv, scfv lub diciał mogą być stabilizowane przez włączenie mostków dwusiarczkowych łączących domeny VH i VL (Y. Reiter et al, Nature Biotech, 14, , 1996). Można także otrzymać miniciała zawierające scfv połączone z domeną CH3 (S. Hu et al, Cancer Res., 56, , 1996). [0056] Jeżeli będą stosowane przeciwciała dwuswoiste, mogą być to konwencjonalne przeciwciała dwuswoiste, które można wytwarzać na szereg sposobów (Holliger, P. and Winter G. Current Opinion Biotechnol. 4, (1993)), np. przygotowywać chemicznie lub z hybryd hybrydom lub mogą być dowolnymi wymienionymi wyżej fragmentami

11 przeciwciał dwuswoistych. Diciała i scfv można skonstruować bez obszaru Fc stosując jedynie domeny zmienne i potencjalnie redukując wpływy reakcji anty-idiotypowych. [0057] Diciała dwuswoiste, w przeciwieństwie do pełnych przeciwciał dwuswoistych, mogą być także szczególnie użyteczne ze względu na łatwość konstrukcji i ekspresji w E. coli. Diciała (i wiele innych polipeptydów, takich jak fragmenty przeciwciał) o odpowiednich swoistościach wiązania mogą być łatwo wybrane przy użyciu ekspozycji fagowej (WO94/13804) z bibliotek. Jeżeli jedno ramię diciała ma pozostać stałe (na przykład o swoistości skierowanej przeciwko IL-25), wówczas można przygotować bibliotekę, gdzie drugie ramię jest zmienne i wybrane jest przeciwciało o wybranej odpowiedniej swoistości. Dwuswoiste pełne przeciwciała można przygotować za pomocą techniki knobs-into-holes (J. B. B. Ridgeway et al, Protein Eng., 9, , 1996). [0058] Możliwe jest zastosowanie przeciwciał monoklonalnych i innych oraz zastosowanie technik rekombinacji DNA do wytworzenia innych przeciwciał lub cząsteczek chimerycznych, które zachowują swoistość pierwotnego przeciwciała. Takie techniki mogą obejmować wprowadzanie DNA kodującego obszar zmienny immunoglobuliny lub regiony determinujące dopasowanie (CDR) przeciwciała do obszarów stałych lub obszarów stałych i obszarów zrębowych innej immunoglobuliny. Patrz na przykład EP-A , GB A lub EP-A [0059] Korzystnie regiony CDR łańcucha VL 2C3 są przeszczepiane do ludzkiego regionu zrębowego. Ludzki region zrębowy może być wybrany na wiele sposobów, np. przez porównanie sekwencji mysiego regionu zrębowego lub mysiego regionu VL ze znanymi sekwencjami ludzkiego regionu zrębowego lub regionu VL oraz przez wybranie ludzkiego regionu zrębowego, który ma najwyższy lub jeden z najwyższych stopni podobieństwa lub identyczności aminokwasów. Modyfikacji regionów zrębowych natywnych sekwencji ludzkich można dokonać dla dalszej optymalizacji uzyskanych przeciwciał z przeszczepionymi CDR. [0060] Chociaż w korzystnym aspekcie wynalazku korzystne są cząsteczki przeciwciał zawierające parę domen VH i VL, kolejne aspekty wynalazku tworzą pojedyncze domeny wiążące oparte na sekwencjach domen VH lub VL. Wiadomo, że pojedyncze domeny immunoglobulin, zwłaszcza domeny VH, są zdolne do wiązania w określony sposób antygenów docelowych. [0061] W przypadku tych pojedynczych domen wiążących łańcucha mogą być one zastosowane do badań przesiewowych domen komplementarnych zdolnych do utworzenia dwudomenowego elementu wiążącego zdolnego do wiązania IL-25, co omówiono poniżej. [0062] Cząsteczki przeciwciał według wynalazku mogą zawierać także obszary stałe przeciwciała lub ich części. Na przykład domena VL może być przymocowana jej końcem C do domen stałych łańcucha lekkiego przeciwciała, w tym ludzkich łańcuchów Cκ lub Cλ, korzystnie łańcuchów Cκ. Podobnie element wiążący oparty na domenie VH może być przyłączony jego końcem C do wszystkich lub części łańcucha ciężkiego immunoglobuliny pochodzącego od dowolnego izotypu przeciwciała, np. IgG, IgA, IgE i IgM oraz dowolnej

12 podklasy izotypów, a zwłaszcza IgG1 i IgG4. Korzystna jest IgG4. Można zastosować regiony Fc, takie jak Δnab oraz Δnac, co ujawniono w WO99/ [0063] Dlatego obejmuje to cząsteczki chimeryczne zawierające docelową domenę wiążącą lub równoważnik, połączone z innym polipeptydem. Klonowanie i ekspresja przeciwciał chimerycznych są opisane w EP-A oraz EP-A [0064] Regiony zrębowe cząsteczek przeciwciała według wynalazku mogą także zawierać sekwencje glikozylacji, które zawierają jedno lub więcej miejsc glikozylacji. Zależnie od komórki gospodarza, w której następuje ekspresja docelowego elementu wiążącego, wzorzec glikozylacji może się różnić. Dlatego konstrukty kwasu nukleinowego kodujące miejsca glikozylacji mogą być modyfikowane dla usuwania miejsca lub alternatywnie takie miejsca mogą być wprowadzane do białka. Dla przykładu miejsca N-glikozylacji w białkach eukariotycznych cechują się trypletem aminokwasowym Asn-X-Y, gdzie X to dowolny aminokwas z wyjątkiem Pro, a Y to Ser lub Thr. Odpowiednie substytucje, addycje lub delecje sekwencji nukleotydowej kodującej te tryplety uniemożliwią przyłączenie reszt węglowodanowych do łańcucha bocznego Asn. Zmiana pojedynczego nukleotydu wybranego w ten sposób, że Asn zastępuje się na przykład innym aminokwasem jest wystarczająca do inaktywacji miejsca N-glikozylacji. Znane procedury miejsc inaktywacji N-glikozylacji w białkach obejmują te opisane w U.S. Pat. No. 5,071,972 oraz EP 276,846. Domena wiążąca antygen [0065] Opisuje to część cząsteczki przeciwciała, która zawiera obszar swoiście przez siebie wiązany i jest komplementarna z częścią lub wszystkimi antygenami. Jeżeli antygen jest duży, przeciwciało może wiązać tylko część antygenu zwaną epitopem. Domena wiążąca antygen może być zapewniana przez jedną lub więcej domen zmiennych przeciwciała (np. tak zwany fragment przeciwciała Fd zawierający domenę VH). Korzystnie domena wiążąca antygen zawiera przynajmniej znaczną część regionu zmiennego łańcucha lekkiego przeciwciała (VL) oraz przynajmniej znaczną część regionu zmiennego łańcucha ciężkiego przeciwciała (VH). [0066] Zasadnicza część domeny zmiennej immunoglobuliny będzie obejmować przynajmniej trzy regiony CDR wraz z ich leżącymi między nimi regionami zrębowymi. Korzystnie część będzie także obejmować przynajmniej około 50% pierwszego i/lub czwartego obszaru zrębowego, 50% na końcu C, 50% pierwszego obszaru zrębowego i koniec N 50% czwartego obszaru zrębowego. Dodatkowe reszty na końcu N lub C zasadniczej części domeny zmiennej mogą nie być normalnie związane z naturalnie występującymi regionami domeny zmiennej. Na przykład konstrukcja docelowych elementów wiążących według wynalazku dokonana technikami rekombinacji DNA może spowodować wprowadzenie reszt N- lub C-końcowych kodowanych przez linkery wprowadzane dla ułatwienia klonowania lub innych etapów manipulacji. Inne etapy manipulacji obejmują wprowadzenie łączników dla połączenia domen zmiennych według wynalazku do kolejnych sekwencji białkowych obejmujących łańcuchy ciężkie immunoglobuliny, inne domeny zmienne (na przykład podczas wytwarzania diciał) lub znaczników białkowych, które dokładniej omówiono poniżej.

13 Zawiera [0067] Ogólnie określenie stosowane w znaczeniu obejmuje, czyli dopuszcza obecność jednej lub więcej cech bądź składników. Izolowane [0068] Dotyczy to stanu, w którym domeny VH, docelowe elementy wiążące według wynalazku lub kwasy nukleinowe kodujące takie elementy wiążące, będą ogólnie zgodne z wynalazkiem. Elementy oraz kwasy nukleinowe będą wolne lub zasadniczo wolne od materiału, z którym są naturalnie związane, takim jak polipeptydy lub kwasy nukleinowe, z którymi występują w środowisku naturalnym lub środowisku przygotowania (np. hodowla komórkowa) w przypadku przygotowywania technikami rekombinacji DNA w warunkach in vitro lub in vivo. [0069] Docelowe elementy wiążące i kwasy nukleinowe mogą być formułowane z rozcieńczalnikami lub adiuwantami i nadal izolowane do celów praktycznych na przykład elementy będą normalnie mieszane z żelatyną lub innymi nośnikami w przypadku stosowania do powlekania płytek do mikromiareczkowania dla stosowania do oznaczeń immunologicznych lub mieszane z dopuszczalnymi farmaceutycznie nośnikami lub rozcieńczalnikami w przypadku stosowania w diagnostyce lub terapii. Docelowe elementy wiążące mogą być glikozylowane, naturalnie lub przez układy heterologicznych komórek eukariotycznych (np. CHO lub NS0 (ECACC )) lub mogą być nieglikozylowane (na przykład w przypadku wytwarzania przez ekspresję w komórce prokariotycznej). Dodatkowe cechy docelowych elementów wiążących. [0070] Oprócz sekwencji przeciwciała, docelowy element wiążący według wynalazku może zawierać inne aminokwasy, np. tworzące peptyd lub polipeptyd, taki jak zwinięta domena lub dla nadania cząsteczce innych cech funkcjonalnych oprócz zdolności wiązania antygenu. Docelowe elementy wiążące według wynalazku mogą zawierać wykrywalny znacznik lub mogą być sprzężone z toksyną lub enzymem (np. za pośrednictwem wiązania petydylowego lub linkera). [0071] Wykrywalne znaczniki obejmują znaczniki promieniotwórcze, takie jak 131I lub 99Tc, które mogą być przyłączone do przeciwciał według wynalazku przy użyciu konwencjonalnych technik chemicznych znanych w dziedzinie obrazowania przeciwciał. Znaczniki obejmują także znaczniki enzymatyczne, takie jak peroksydaza chrzanowa. Znaczniki obejmują także reszty chemiczne, takie jak biotyna, które mogą być wykrywane przez wiązanie do swoistej spokrewnionej wykrywalnej reszty, np. znakowanej awidyną. [0072] Gdy dodatkowa cecha to domena polipeptydowa lub znacznik, docelowy element wiążący może być wytworzony za pomocą technik rekombinacyjnych, tj. przez ekspresję kwasu nukleinowego kodującego połączenie docelowego elementu wiążącego oraz dodatkowej domeny. Tasowanie łańcucha [0073] Kolejny aspekt wynalazku zapewnia sposób otrzymywania domeny przeciwciała wiążącej antygen dla IL-25, który obejmuje zapewnienie domeny VH docelowego elementu

14 wiążącego według wynalazku z jedną lub więcej domenami VL oraz badanie kombinacji VHNL lub kombinacji dla domeny wiążącej przeciwciało-antygen dla IL-25. [0074] Domena VL może mieć sekwencję aminokwasową, która jest tu zasadniczo opisana. [0075] Można zastosować analogiczny sposób, gdzie jeden lub więcej ujawnionych tu wariantów sekwencji domeny VL jest połączony z jedną lub więcej domenami VH. [0076] Można to osiągnąć technikami badania przesiewowego ekspozycji fagowej stosując tzw. hierarchiczne podwójne podejście kombinatoryczne jak ujawniono w WO92/01047, gdzie pojedyncza kolonia zawierająca klon łańcucha H lub L służy do zakażania kompletnej biblioteki klonów kodujących inny łańcuch (L lub H) i powstały dwułańcuchowy docelowy element wiążący jest wybierany zgodnie z technikami ekspozycji fagowej, takimi jak opisane w źródłach. [0077] Dlatego wynalazek zapewnia sposób wyboru cząsteczki przeciwciała dla IL-25, który obejmuje: (a) zapewnienie domeny VH zawierającej docelowy element wiążący, która wiąże IL-25 i która zawiera domenę VH przeciwciała według wynalazku; (b) połączenie domeny VH z wieloma domenami VL przeciwciała dla zapewnienia cząsteczek przeciwciała; (c) badanie przesiewowe cząsteczek przeciwciał pod kątem wiązania z IL-25; oraz (d) wybranie cząsteczki przeciwciała, która wiąże IL-25. [0078] W takim sposobie domeny VH oraz VL mogą być zapewnione w postaci białek ulegających ekspresji dzięki rekombinowanemu DNA, zwłaszcza DNA faga lub fagemida. [0079] Wieloma domenami VL mogą być dowolne pojedyncze domeny od 104, na przykład domeny od 106 do 108 lub [0080] Cząsteczki przeciwciała oraz kwas nukleinowy kodujący takie cząsteczki może tworzyć kolejną część wynalazku. IL-25 [0081] I1-25, określana także w dziedzinie jako IL-17E, jest dostępna ze źródeł komerycjnych (np. R&D Systems, MN, USA) lub może być klonowana bądź syntetyzowana przez odniesienie do dostępnych w dziedzinie sekwencji IL-25. Mysią IL-25 (Białko NCBI NP_542767) opisali Hurst et al, 2002 (Ref. 7 poniżej). Ludzką IL-25 (Białko NCBI Q9H293) opisali Fort et al (Ref. 4 poniżej). Do wytwarzania przeciwciał lub zastosowania w oznaczeniach immunologicznych można stosować fragmenty rekombinowanej IL-25, zwłaszcza te skrócone na N-końcu. Na przykład dostępna w handlu rekombinowana ludzka IL-25 (IL-17E) zawiera sekwencję dojrzałego białka Tyr 33 - Gly 177 o nr dostępowym Q9H293) oraz dostępną w handlu mysią IL-25 zawierającą reszty Val 17 - Ala 169 mysiej IL- 17E (nr dostępowy NP_542767). Kwasy nukleinowe i wektory

15 [0082] W kolejnych aspektach wynalazek zapewnia wyizolowany kwas nukleinowy, który zawiera sekwencję kodującą docelowy element wiążący, domenę VH lub domenę VL według wynalazku oraz sposoby przygotowywania docelowego elementu wiążącego, domenę VH lub domenę VL według wynalazku, co obejmuje ekspresję kwasu nukleinowego w warunkach zapewniających wytwarzanie docelowego elementu wiążącego, domeny VH lub domeny VL i ich odzyskiwanie. [0083] Kwasy nukleinowe według wynalazku mogą zawierać sekwencje lub ich istotne części (np. regiony kodujące CDR) o SEQ ID NO:40 (w przypadku łańcuchów ciężkich) lub SEQ ID NO:26 (w przypadku łańcuchów lekkich) lub warianty tych sekwencji zmodyfikowane na przykład przez mutagenezę kierunkową, aby kodowały inne domeny VH oraz VL według wynalazku. Ponadto stosowanie kodonu może być zróżnicowane, np. dla optymalizacji ekspresji sekwencji w żądanej komórce gospodarza. [0084] Wynalazek zapewnia także wyizolowany kwas nukleinowy kodujący docelowy element wiążący według wynalazku. Kwasy nukleinowe obejmują DNA oraz RNA. [0085] Kwasem nukleinowym według wynalazku może być DNA lub RNA i może on być całkowicie lub częściowo syntetyczny. Opisane tu odniesienie do sekwencji nukleotydowej obejmuje cząsteczkę DNA o określonej sekwencji oraz cząsteczkę RNA o określonej sekwencji, gdzie jeżeli nie określono inaczej, U jest podstawiony przez T. [0086] Wynalazek zapewnia także wektory, na przykład w postaci plazmidów, wirusów, np. fagów lub fagemidów, kosmidów, kaset transkrypcji lub ekspresji, które zawierają przynajmniej jeden kwas nukleinowy taki jak wyżej. [0087] Odpowiednie wektory można wybrać lub skonstruować, zawierają one odpowiednie sekwencje regulatorowe, w tym sekwencje promotora, sekwencje terminatora, sekwencje poliadenylacji, sekwencje wzmacniające, geny markerowe i inne odpowiednie sekwencje. Więcej szczegółów, patrz na przykład publikacja Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. [0088] Wektory według wynalazku obejmują także wektory wirusowe zdolne do zakażania komórek ludzkich w warunkach in vivo, np. wektory adenowirusowe, retrowirusowe lub wirusów adeno-powiązanych. Takie wektory mogą być użyteczne w ekspresji docelowego elementu wiążącego według wynalazku w komórkach pacjenta będącego człowiekiem lub zwierzęciem, dla zapewnienia wytwarzania i dostarczania pacjentowi docelowego elementu wiążącego. [0089] Sekwencja kwasu nukleinowego kodującego docelowy element wiążący według wynalazku w jednym aspekcie będzie połączona funkcjonalnie z promotorem dla wywoływania ekspresji docelowego elementu wiążącego w komórce gospodarza. Sekwencja może zawierać na swoim końcu 5 sekwencję wiodącą, aby ułatwiać ekspresję i/lub wydzielanie docelowego elementu wiążącego w i/lub z komórki gospodarza. W dziedzinie znane są liczne odpowiednie sekwencje wiodące i mogą być one wybrane przez znawcę z uwzględnieniem komórki gospodarza.

16 [0090] Odpowiednie sekwencje wiodące obejmują dowolną sekwencję wiodącą immunoglobuliny ludzkiej lub innego ssaka, chociaż można zamiast niej zastosować ssaczą sekwencję wiodącą białka innego niż immunoglobulina lub syntetyczną sekwencję wiodącą. Korzystnie dla ekspresji łańcucha VH można użyć ludzkiej sekwencji wiodącej VH. Korzystnie dla ekspresji łańcucha VL używana jest ludzka sekwencja wiodąca VL. [0091] Odpowiednia sekwencja wiodąca do ekspresji domeny VH według wynalazku to: MGSTAILGLLLAVLQGVCA (SEQ ID NO:37). [0092] Odpowiednia sekwencja wiodąca do ekspresji domeny VL według wynalazku to ludzka lub mysia sekwencja wiodąca VK. Taką sekwencją może być sekwencja wiodąca 2C3: MRVPAQLLGLLLLWLPDTRC (SEQ ID NO:38) lub ludzki homolog, taki jak MDMRVPAQLLGLLLLWLPDTRC (SEQ ID NO:39). [0093] W dołączonych przykładach zastosowano konstrukty ekspresji, które zawierają miejsce HindIII oraz uzgodnioną sekwencję Kozaka (AAGCTTGCCGCCACC, SEQ ID NO:41) poprzedzającą sekwencję kodującą, która rozpoczyna się sekwencją wiodącą przeciwciała. Jest to odpowiednie do ekspresji domen przeciwciała w ssaczych komórkach gospodarza. Jednak można zależnie od preferencji eksperymentatora zastosować inne konstrukty i komórki gospodarza, gdzie będą ulegać ekspresji domeny przeciwciała. [0094] W publikacji Current Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992 opisano szczegółowo wiele znanych technik i protokołów manipulacji kwasami nukleinowymi, np. podczas przygotowywania konstruktów kwasów nukleinowych, mutagenezy, sekwencjonowania, wprowadzania DNA do komórek i ekspresji genu oraz analizy białek. Ujawnienia Sambrook et al. oraz Ausubel et al. wymieniono tu w piśmiennictwie. Komórki gospodarza oraz wytwarzanie docelowych elementów wiążących [0095] Kolejny aspekt zapewnia komórkę gospodarza transformowaną kwasem nukleinowym (np. sekwencją kwasu nukleinowego w postaci wektora) według wynalazku. [0096] W jednym przykładzie wykonania kwas nukleinowy według wynalazku jest integrowany do genomu (np. chromosomu) komórki gospodarza. Integracja może być ułatwiana przez włączenie sekwencji, które ułatwiają rekombinację z genomem zgodnie ze standardowymi technikami. [0097] Jeszcze inny aspekt zapewnia sposób wytwarzania docelowego elementu wiążącego według wynalazku, który to sposób powoduje ekspresję z kodującego kwasu nukleinowego. Taki sposób może obejmować hodowanie komórek gospodarza w warunkach powodujących wytwarzanie wymienionego docelowego elementu wiążącego. [0098] Po wytwarzaniu przez ekspresję domena VH lub VL lub docelowy element wiążący mogą być izolowane i/lub oczyszczane za pomocą odpowiednich technik, następnie odpowiednio stosowane. Sposób wytwarzania może obejmować etap izolacji i/lub oczyszczania produktu.

17 [0099] Po oczyszczaniu produktu docelowy element wiążący może być modyfikowany metodami fizycznymi lub chemicznymi, na przykład dla wprowadzenia grup ochronnych, które zmieniają np. zwiększają stabilność lub czas półtrwania biologicznego białka. Na przykład w dziedzinie znana jest PEGylacja białek dla osiągnięcia takich efektów i docelowe elementy wiążące mogą być w postaci PEGylowanej. [0100] Sposób wytwarzania może obejmować formulację produktu do kompozycji obejmującej przynajmniej jeden dodatkowy składnik, taki jak dopuszczalna farmaceutycznie substancja pomocnicza. [0101] Wynalazek zapewnia także rekombinowaną komórkę gospodarza, która zawiera kwasy nukleinowe lub wektory jak wyżej. Kwas nukleinowy kodujący dowolny CDR, domenę VH lub VL bądź docelowy element wiążący stanowi aspekt wynalazku podobnie jak sposób wytwarzania kodowanego produktu, który to sposób obejmuje ekspresję z kodującego go kwasu nukleinowego. [0102] Dobrze znane są układy do klonowania i ekspresji polipeptydu w szeregu różnych komórek gospodarza. Odpowiednie komórki gospodarza obejmują bakterie, komórki ssaków, drożdże i układy bakulowirusa. Dostępne w dziedzinie ssacze linie komórkowe do ekspresji heterologicznego polipeptydu obejmują komórki jajnika chomika chińskiego, komórki HeLa, komórki nerki młodego chomika, komórki czerniaka myszy NS0, komórki szpiczaka szczura YB2/0 i wiele innych. Popularnym, korzystnym gospodarzem bakteryjnym jest E. coli. [0103] Ekspresja przeciwciał i fragmentów przeciwciał w komórkach prokariotycznych, takich jak E. coli jest dobrze znana w dziedzinie. Patrz na przykład Plückthun, A. Bio/Technology 9: (1991). Jako opcja wytwarzania docelowego elementu wiążącego dla znawcy dostępna jest także ekspresja w komórkach eukariotycznych w hodowli, patrz niedawne przeglądy, na przykład Ref, M.E. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4: ; Trill J.J. et al. (1995) Curr. Opinion Biotech 6: Kompozycje [0104] Dlatego kompozycje farmaceutyczne według wynalazku i do zastosowania według wynalazku mogą obejmować, oprócz składnika aktywnego, farmaceutycznie dopuszczalne substancje pomocnicze, nośnik, bufor, stabilizator i inne materiały dobrze znane znawcy. Takie materiały powinny być nietoksyczne i nie powinny zakłócać skuteczności składnika aktywnego. Precyzyjny charakter nośnika lub innego materiału będzie zależał od drogi podania, która może być doustna lub przez iniekcję (np. dożylną). [0105] Formulacje terapeutyczne docelowego elementu wiążącego mogą być przygotowane do przechowywania przez mieszanie docelowego elementu wiążącego mającego żądany stopień czystości z opcjonalnymi fizjologicznie dopuszczalnymi nośnikami, substancjami pomocniczymi lub stabilizatorami (patrz np. Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins.), w postaci liofilizowanego proszku lub roztworów wodnych. Dopuszczalne nośniki, substancje pomocnicze lub stabilizatory są nietoksyczne dla biorców w stosowanych dawkach i stężeniach i obejmują bufory takie jak fosforan, cytrynian i inne kwasy organiczne; antyoksydanty w tym kwas askorbinowy; polipeptydy o niskiej masie cząsteczkowej (poniżej

18 około 10 reszt); białka takie jak albumina surowicy, żelatyna lub immunoglobuliny; polimery hydrofilowe takie jak poliwinylopirolidon; aminokwasy takie jak glicyna, glutamina, asparagina, arginina lub lizyna; monosacharydy, disacharydy i inne węglowodany w tym glukoza, mannoza lub dekstryny; środki chelatujące takie jak EDTA; alkohole cukrowe takie jak mannitol lub sorbitol; przeciwjony tworzące sól takie jak sód; i/lub niejonowe środki powierzchniowo czynne takie jak Tween, Pluronics lub glikol polietylenowy (PEG). [0106] Docelowy element wiążący do podawania w warunkach in vivo musi być jałowy. Jest to łatwe do wykonania za pomocą filtracji przez jałowe membrany filtracyjne przed przeprowadzaną następnie liofilizacją oraz rekonstytucją. Docelowy element wiążący będzie zwykle przechowywany w postaci liofilizowanej lub w roztworze. [0107] Kompozycje farmaceutyczne do podawania doustnego mogą być w postaci tabletek, kapsułek, proszku lub ciekłej. Tabletka może zawierać nośnik stały, taki jak żelatyna lub adiuwant. Ciekłe kompozycje farmaceutyczne ogólnie zawierają nośnik płynny, taki jak woda, ropa naftowa, oleje zwierzęce lub roślinne, olej mineralny lub olej syntetyczny. Może zawierać roztwór soli fizjologicznej, dekstrozę lub inny roztwór sacharydu bądź glikole, takie jak glikol etylenowy, glikol propylenowy lub glikol polietylenowy. [0108] Do iniekcji dożylnych lub w miejscu choroby, składnik aktywny może być w postaci dopuszczalnego jelitowo roztworu wodnego, który jest niepirogenny i ma odpowiednie ph, izotoniczność oraz stabilność. Znawcy będą w stanie przygotować odpowiednie roztwory używając np. nośników izotonicznych, takich jak chlorek sodu do iniekcji, roztwór Ringera lub mleczan Ringera. Może być konieczne dodanie środków konserwujących, stabilizatorów, buforów, przeciwutleniaczy i/lub innych dodatków. Zastosowania terapeutyczne wynalazku [0109] Wynalazek zapewnia po raz pierwszy demonstrację, że przeciwciała przeciwko IL-25 są skuteczne w zapobieganiu lub ograniczaniu nadreaktywności dróg oddechowych w warunkach in vivo, co jest kluczowym objawem astmy. Dlatego ujawniany jest sposób zapobiegania lub ograniczania nadreaktywności dróg oddechowych u pacjenta (np. człowieka) potrzebującego leczenia, co obejmuje podawanie pacjentowi docelowego elementu wiążącego, zwłaszcza cząsteczki przeciwciała, które wiąże IL-25. Ponadto ujawniany jest sposób zapobiegania, ograniczania lub leczenia astmy u pacjenta potrzebującego leczenia, co obejmuje podawanie pacjentowi docelowego elementu wiążącego, zwłaszcza cząsteczki przeciwciała, która wiąże IL-25. Astma obejmuje astmę alergiczną. [0110] Powyższe sposoby można praktykować z docelowymi elementami wiążącymi (w tym ich kompozycjami) według wynalazku, które są użyteczne w wiązaniu i korzystnie antagonizowaniu działania IL 25 z potencjałem terapeutycznym w różnych chorobach oraz zaburzeniach, w których odgrywa rolę IL-25. Oprócz astmy, takie choroby obejmują inne schorzenia związane ze stanem zapalnym, jak choroba Leśniowskiego-Crohna oraz wrzodziejące zapalenie okrężnicy. Sposoby mogą być także praktykowane z innymi docelowymi elementami wiążącymi (w tym ich kompozycjami), które wiążą IL-25 i które można otrzymać zgodnie z opisem poniżej w dołączonych przykładach.

19 [0111] Docelowe elementy wiążące (w tym ich kompozycje) według wynalazku mogą być zastosowane w sposobie leczenia (w tym leczenia profilaktycznego) lub diagnostyce u człowieka bądź zwierzęcia. Takie sposoby leczenia lub diagnostyki (co może obejmować leczenie profilaktyczne) mogą obejmować podawanie pacjentowi skutecznej ilości docelowego elementu wiążącego według wynalazku. Przykładowe schorzenia i zaburzenia są omówione poniżej. [0112] Zapewnione jest także zastosowanie docelowych elementów wiążących (w tym ich kompozycji) według wynalazku w wytwarzaniu leku do podawania człowiekowi lub zwierzęciu. [0113] Wskazania kliniczne, gdzie można stosować docelowy element wiążący anty-il-25 mogą być stosowane dla zapewnienia korzyści terapeutycznej obejmującej dowolne schorzenie, w którym IL-25 ma konsekwencje patologiczne. Dlatego ogólnie docelowy element wiążący według wynalazku może być stosowany w leczeniu dowolnego schorzenia związanego z niepożądaną odpowiedzią Th2 lub odpowiedziami typu 2. Na przykład docelowy element wiążący według wynalazku może być stosowany w leczeniu alergii i astmy, zwłaszcza astmy. [0114] Leczenie anty-il-25 może być podawane przez wstrzyknięcie (np. dożylne) lub sposobami podawania miejscowego. Przeciwciała anty-il-25 mogą być podawane technikami genowymi. Alternatywne strategie formulacji mogą zapewniać preparaty odpowiednie dla podawania doustnego lub doodbytniczego. Droga podania może być określona przez charakterystykę fizykochemiczną leczenia, szczególne uwagi dotyczące choroby dla optymalizacji skuteczności bądź minimalizacji skutków ubocznych. [0115] Zgodnie z wynalazkiem dostarczone kompozycje mogą być podawane indywidualnie. Podanie to korzystnie ilość skuteczna terapeutycznie, czyli wystarczająca do wykazania korzyści dla pacjenta. Taką korzyścią może być przynajmniej poprawa przynajmniej jednego objawu. Rzeczywista podana ilość, szybkość i schemat czasowy podawania będą zależeć od charakteru i ciężkości leczonego schorzenia. Zalecenie leczenia, tj. decyzje dotyczące dawkowania leżą w kompetencjach lekarzy ogólnych i innych. Odpowiednie dawki przeciwciała są dobrze znane w dziedzinie, patrz Ledermann J.A. et al. (1991) Int. J. Cancer 47: ; Bagshawe K.D. et al. (1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: [0116] Dokładna dawka będzie zależała od szeregu czynników, w tym od tego, czy przeciwciało służy do diagnostyki lub leczenia, rozmiaru i położenia leczonego obszaru, dokładnego charakteru przeciwciała (np. pełne przeciwciało, fragment lub diciało) i charakteru wykrywalnego znacznika bądź innej cząsteczki przyłączonej do przeciwciała. Typowa dawka przeciwciała będzie się mieściła w zakresie od 0,5 mg do 1,0 g i może być podawana dożylnie jako bolus lub jako wlew przez kilka godzin odpowiednio dla osiągnięcia żądanej dawki. Inne schematy podawania obejmują wlew dożylny przez kilka godzin dla osiągnięcia podobnej łącznej dawki zbiorczej. Jest to dawka pojedynczego leczenia dorosłego pacjenta, która może zostać proporcjonalnie dostosowana dla dzieci lub niemowląt oraz dostosowana do innych formatów przeciwciał w proporcji do masy cząsteczkowej. Leczenie

20 może być powtarzane wedle uznania lekarza raz na dobę, dwa razy w tygodniu, raz w tygodniu lub raz w miesiącu. [0117] Kolejny tryb podawania obejmuje wstępne powlekanie lub inne umieszczanie we wszczepionych urządzeniach, dla których dzięki odpowiednim doświadczeniom zostanie określona optymalna ilość przeciwciała. [0118] Cząsteczka przeciwciała w niektórych korzystnych przykładach wykonania według wynalazku to fragment monomeryczny, taki jak F(ab) lub scfv. Takie fragmenty przeciwciała mogą mieć zaletę w postaci względnie krótkiego czasu półtrwania oraz mniejszego ryzyka aktywacji płytek, która może być spowodowana przez klasteryzację receptora. Klasteryzacja, która daje początek aktywacji płytek, może obejmować zarówno cząsteczki IL-25, jak również IL-25 z FcγRII. [0119] Jeżeli stosowane jest całe przeciwciało, korzystnie jest ono w postaci niezdolnej do aktywacji i/lub zniszczenia płytek. Korzystnymi wyborami są izotyp IgG4 lub alternatywnie izotypy projektanta pochodzące od szkieletu IgG1 (nowe konstrukty genu Fc WO99/58572, Clark, Armour, Williamson). Można stosować mniejsze fragmenty przeciwciała, takie jak F(ab )2. Dodatkowo można stosować całe przeciwciała lub fragmenty (np. F(ab )2 lub diciała) o podwójnej swoistości epitopowej (np. dla epitopów rozpoznawanych przez scfv 2C3). Chociaż takie przykłady wykonania mogą promować klasteryzację receptora, wysoki współczynnik asocjacji poszczególnych receptorów może wykluczać ten problem. [0120] Docelowe elementy wiążące według wynalazku będą zwykle podawane w postaci kompozycji farmaceutycznej, która oprócz docelowego elementu wiążącego może zawierać przynajmniej jeden składnik. [0121] Docelowy element wiążący według wynalazku może być podawany pojedynczo lub w skojarzeniu z innym leczeniem, jednocześnie lub kolejno w zależności od leczonej choroby. Inne terapie mogą obejmować podawanie odpowiednich dawek leków przeciwbólowych, takich jak niesteroidowe leki przeciwzapalne (np. aspiryna, paracetamol, ibuprofen lub ketoprofen) bądź opiatów, takich jak morfina; podawanie leków przeciwwymiotnych lub podawanie przynajmniej jednego innego związku aktywnego przeciwko astmie, ogólnie środka rozszerzającego oskrzela, który powoduje rozluźnienie dróg oddechowych lub poprawę usuwania śluzu, np. beta-agonista (np. salbutamol, salmeterol), kromoglikan disodowy, steroidy lub inhibitor PDEIV. Sposoby oznaczania [0122] Wynalazek zapewnia sposób obejmujący spowodowanie lub umożliwienie wiązania docelowego elementu wiążącego z IL-25. Jak odnotowano, takie wiązanie może mieć miejsce w warunkach in vivo, np. po podaniu docelowego elementu wiążącego lub kwasu nukleinowego kodującego docelowy element wiążący bądź w warunkach in vitro, na przykład przy oznaczeniu ELISA, Western blotting, immunocytochemicznym, immunoprecypitacji lub chromatografii powinowactwa.

21 [0123] Możliwe jest zmierzenie ilości docelowego elementu wiążącego wiązanego z IL-25. Analiza ilościowa może wiązać się z ilością antygenu w próbce badanej, co może mieć znaczenie diagnostyczne. [0124] Reaktywności przeciwciał w próbce mogą być oznaczone na różne odpowiednie sposoby. Jedna z możliwości to test radioimmunologiczny (RIA). Znakowany radioaktywnie antygen jest mieszany z antygenem nieznakowanym (próbka badana) i umożliwia się jego wiązanie do przeciwciała. Związany antygen jest fizycznie oddzielany od niezwiązanego antygenu i oznaczana jest ilość związanego z przeciwciałem antygenu radioaktywnego. Im więcej antygenu w próbce badanej, tym mniej antygenu radioaktywnego zostanie związane z przeciwciałem. Można także zastosować oznaczenie wiązania kompetycyjnego z użyciem antygenu nieradioaktywnego, używając antygenu lub analogu związanego z cząsteczką reporterową. Cząsteczka reporterowa może być flurorochromem, fosforem lub barwnikiem laserowym z charakterystyką absorpcji lub emisji izolowaną widmowo. Odpowiednie fluorochromy obejmują fluoresceinę, rodaminę, fikoerytrynę oraz czerwień teksańską. Odpowiednie barwniki chromogenne obejmują diaminobenzydynę. [0125] Inne cząsteczki reporterowe obejmują makrocząsteczkowe cząstki koloidalne lub materiał stały, taki jak barwione kulki lateksowe, magnetyczne lub paramagnetyczne i czynniki aktywne biologicznie lub chemicznie, które mogą bezpośrednio lub pośrednio powodować wykrywalne sygnały obserwowane optycznie, wykrywane elektronicznie lub rejestrowane w inny sposób. Cząsteczki te mogą być enzymami katalizującymi reakcje, które wywołują bądź zmieniają barwy lub powodują np. zmiany właściwości elektrycznych. Mogą być one możliwe do wzbudzenia molekularnie w ten sposób, że przejścia elektronów między stanami energii powodują charakterystyczne absorpcje lub emisje widmowe. Mogą one obejmować substancje chemiczne stosowane w połączeniu z bioczujnikami. Można zastosować układy detekcji biotyny/awidyny lub biotyny/streptawidyny i fosfatazy alkalicznej. [0126] Sygnały generowane przez poszczególne koniugaty przeciwciało-reporter mogą służyć do uzyskiwania możliwych do oznaczenia ilościowego danych bezwzględnych lub względnych wiązania w próbkach (norma i test) danego przeciwciała. [0127] Wynalazek zapewnia także zastosowanie docelowego elementu wiążącego takiego jak wyżej do pomiaru poziomów antygenu w oznaczeniu kompetycyjnym, tj. sposobu pomiaru poziomu antygenu w próbce z użyciem docelowego elementu wiążącego opisanego w oznaczeniu kompetycyjnym wynalazku. Może to być przypadek, gdzie nie jest wymagana fizyczna separacja antygenu związanego od niezwiązanego. Jedna możliwość to łączenie cząsteczki reporterowej z docelowym elementem wiążącym w ten sposób, że podczas wiązania występuje fizyczna lub optyczna zmiana. Cząsteczka reporterowa może bezpośrednio lub pośrednio generować możliwe do wykrycia i korzystnie mierzalne sygnały. Wiązanie cząsteczek reporterowych może być bezpośrednie lub pośrednie, kowalencyjne (np. wiązanie peptydowe) lub niekowalencyjne. Wiązanie peptydowe może być wynikiem rekombinacyjnej ekspresji fuzji genu kodującego przeciwciało i cząsteczkę reporterową.

22 [0128] Wynalazek umożliwia także bezpośredni pomiar poziomów antygenu, przy zastosowaniu docelowego elementu wiążącego według wynalazku, na przykład układu bioczujnika. [0129] Tryb określania wiązania nie jest cechą wynalazku i specjaliści w dziedzinie mogą wybrać odpowiedni tryb według swych preferencji oraz wiedzy ogólnej. Przykłady Aspekty i przykłady wykonania wynalazku zostaną zilustrowane przykładami odniesień do następujących doświadczeń. [0130] Przykład porównawczy: Sekwencja pierwszorzędowa 2c3 [0131] Sekwencja łańcucha lekkiego kappa bez jego sekwencji wiodącej została przedstawiona na fig. 1 (SEQ ID NO:15), a sekwencja aminokwasowa pętli CDR zdefiniowana przez Kabata to L1 (SEQ ID NO:29), L2 (SEQ ID NO:30) oraz L3 (SEQ ID NO:31). To sekwencje L1, 2 i 3 są sekwencjami donorowymi do humanizacji łańcucha lekkiego 2c3. Sekwencja łańcucha ciężkiego (SEQ ID NO:17) została przedstawiona na Fig.2 i znowu CDR są oznaczone jako H1 (SEQ ID NO:32), H2 (SEQ ID NO:35) oraz H3 (SEQ ID NO:33). Analiza łańcuchów ciężkich i lekkich 2c3 [0132] Baza danych ludzkich sekwencji przeciwciał została przeanalizowana dla zidentyfikowania sekwencji zrębowych akceptora dla 2c3. Baza danych ludzkich sekwencji przeciwciał zawiera 9597 sekwencji łańcucha ciężkiego oraz 2695 sekwencji łańcucha lekkiego. Odpowiednie sekwencje akceptora zostały wstępnie zdefiniowane po pierwsze na podstawie pierwszej najwyższej punktacji VCI, po drugie na podstawie punktacji zrębowej (FR) i po trzecie na podstawie punktacji identyczności. W końcu wszelkie sekwencje, które nie miały zakonserwowanych długości pętli dla H1, H2, L1 i L2 zostały odrzucone. 20 najlepszych ludzkich sekwencji przeciwciał sprawdzono następnie dla wyeliminowania przeciwciał humanizowanych, silnie zmutowanych przeciwciał scfv oraz przeciwciał mysich. Wyeliminowano także sekwencje zawierające reszty cysteiny lub proliny w pozycjach atypowych. Analiza łańcucha ciężkiego akceptora 2c3 [0133] Zidentyfikowano 20 najlepszych sekwencji łańcucha ciężkiego 2c3. Sekwencja AY z górną punktacją VCI (SEQ ID NO:19) zawierająca tylko 2 różne reszty VCI A67V oraz L691 jest przedstawiona na fig. 3. Obie zmiany są konserwatywne. Analiza pozostałych sekwencji zrębowych pokazuje, że 59 spośród 87 reszt jest zakonserwowana. Reszty graniczne występujące w 2c3 oraz AY są zakonserwowane w pokrewnym łańcuchu ciężkim (AY510106) dla naszego proponowanego łańcucha lekkiego AY Łącznie analiza AY (SEQ ID NO:19) czyni z niego dobrego kandydata, który może wymagać kilku mutacji wstecznych VCI.

23 [0134] Chociaż długość pętli H3 AY wynosi 17 zamiast 13 reszt w 2c3, ta różnica długości H3 nie jest niezwykła podczas humanizacji i jest uważana za mniej ważną niż konserwowanie reszt VCI. Humanizowany konstrukt łańcucha ciężkiego 2c3 (RHA). [0135] Humanizowany konstrukt łańcucha ciężkiego przedstawia fig. 4 i nazywa się on RHA (SEQ ID NO:21). Sekwencje wiodąca i zrębowa pochodzą z AY393094, a pętle H1-3 zdefiniowane przez Kabata z 2c3. Na końcu 5 dodano uzgodnioną sekwencję Kozaka oraz miejsce restrykcyjne HindIII, natomiast na końcu 3 dodano miejsce restrykcyjne ApaI. Miejsca restrykcyjne mają pomagać wektorom ekspresji, a uzgodniona sekwencja Kozaka ma maksymalizować ekspresję białka. Miejsca N-glikozylacji mają motyw NX(S/T), żadnego z nich nie stwierdzono w humanizowanym łańcuchu ciężkim. Jakość miejsc rozszczepiania peptydu oceniano stosując program Signal P wobec amino-końcowej sekwencji peptydowej RHA. Wyniki potwierdziły, że sekwencja wiodąca VH5a będzie rozszczepiana między VCA (C-koniec peptydu sygnałowego) oraz EVR (N-koniec FR1). Analiz zrębu łańcucha lekkiego [0136] Zidentyfikowano szereg ludzkich zrębów łańcucha lekkiego z najlepszą punktacją VCI oraz zrębu. Jednak po rozważeniu trzech sekwencji o najwyższej punktacji, wszystkie porzucono. Pierwszą dlatego, że ten łańcuch lekki pochodził z przeciwciała, które jak wykazano, wiąże się z tworzeniem włókienek amyloidu, kolejne dwie, ponieważ sekwencje miały niezakonserwowane reszty w pozycjach 1 oraz 3. Wcześniejsze doświadczenie twórców dotyczące humanizacji skłoniło ich do poglądu, że reszty te powinny być zakonserwowane. [0137] Następne najlepsze sekwencje różniły się tylko dwoma resztami VCI V44P oraz Y71F, chociaż dalsza analiza ujawniła, że najwyższe punktacje zrębowe były podobne, jednak miały niedopasowania L73F lub I83F. Fenyloalanina jest względnie duża i wydaje się być zakonserwowana w tych dwóch rodzajach łańcuchów lekkich. Dalsza analiza zrębów łańcucha lekkiego 2c3 ujawniła znaczną liczbę mającą walinę w pozycji 83 połączoną z leucyną w pozycji 73 i tym samym zapewnia alternatywę dla zrębów z Phe w pozycji 83. Dlatego twórcy wybrali łańcuch lekki AY510106, który jest łańcuchem lekkim V83 o takiej samej długości pętli CDR jak 2c3. Sekwencja AY (SEQ ID NO:23) jest przedstawiona na fig. 5. Humanizowany konstrukt łańcucha lekkiego 2c3 (RKA). [0138] Humanizowany konstrukt łańcucha lekkiego kappa przedstawia fig. 6 i nazywa się on RKA (SEQ ID NO:25). Sekwencje wiodąca i zrębowa pochodzą z AY510106, a L1-3 z 2c3. Na końcu 5 dodano uzgodnioną sekwencję Kozaka oraz miejsce restrykcyjne HindIII, natomiast na końcu 3 dodano miejsce restrykcyjne BamHI oraz miejsce splicingu. Miejsca restrykcyjne oraz splicingu są niezbędne do klonowania oraz ekspresji konstruktu w wektorze ekspresji pkn100, a uzgodniona sekwencja Kozaka ma maksymalizować ekspresję białka. Miejsca N-glikozylacji mają motyw NX(S/T), żadnego z nich nie stwierdzono w humanizowanym łańcuchu lekkim. Jakość miejsc rozszczepiania peptydu oceniano stosując program Signal P wobec amino końcowej sekwencji peptydowej 2c3 RKA. Wyniki

24 potwierdziły, że sekwencja wiodąca VK1-A20 była rozszczepiana między resztami TRC (na C-końcu peptydu sygnałowego) oraz DI (na N-końcu FR1). Porównanie RHA oraz RKA z chimerycznym 2c3 [0139] cdna humanizowanego łańcucha ciężkiego RHA oraz lekkiego kappa RKA 2c3 syntetyzowano (GeneArt AG) i klonowano odpowiednio w wektorze ekspresji łańcucha ciężkiego IgG1 pg1d200 oraz w wektorze ekspresji łańcucha lekkiego pkn100. Początkowo konstrukty cdna łańcucha ciężkiego i lekkiego z chimerycznego 2c3 oraz humanizowane przeciwciało połączono i stosowano do przejściowej transfekcji komórek HEK293T. Supernatanty z transfekowanych komórek stosowano w teście ELISA do pomiaru wiązania przeciwciała do IL-25. Wyniki (fig. 7(A)) wskazują, że humanizowane przeciwciało zawierające łańcuch lekki chimerycznego 2c3 z humanizowanym łańcuchem ciężkim, RHA, wiązało się znacznie słabiej do IL-25 niż przeciwciało zawierające łańcuchy lekkie i ciężkie chimerycznego 2c3. Dla odróżnienia równowartościowe wiązanie do IL-25 stwierdzono w przypadku humanizowanego łańcucha lekkiego, RKA lub łańcucha lekkiego chimerycznego 2c3 związanego z łańcuchem ciężkim chimerycznego 2c3. [0140] Podczas próby odzyskania maksymalnego wiązania w przypadku humanizowanego łańcucha ciężkiego, reszty A67V oraz I69L VCI zostały zastąpione metodą mutagenezy. Wiązanie antygenu przez podwójnego mutanta RHA_A67V_I69L oraz RHA_I69L połączonego z łańcuchem lekkim RKA porównano z chimerycznym 2c3. Komórki HEK 293T poddano kotransfekcji różnymi mutagenizowanymi łańcuchami ciężkimi i RKA, a supernatant stosowano w teście ELISA wiązania IL-25. Wyniki przedstawione na fig. 7(B) pokazują, że maksymalne wiązanie przeciwciał do IL-25 było tylko częściowo odzyskiwane przez zastąpienie reszt A67V oraz I69L. [0141] Dalszą mutagenezę prowadzono na RHA. Przeprowadzono zastępowanie aminokwasów R3Q, S82aL, a supernatanty z przejściowo transfekowanych komórek HEK293T stosowano w teście ELISA wiązania IL-25. Wyniki na fig. 7(C) pokazują, że te zastąpienia mają niewielki lub żaden wpływ na poprawę wiązania humanizowanego przeciwciała do IL-25. [0142] Wniosek był taki, że humanizacja łańcucha lekkiego była pomyślna i nie wymagała dalszej modyfikacji, natomiast nawet przy dalszej inżynierii łańcucha ciężkiego, humanizacja oparta na przeniesieniu CDR do łańcucha ciężkiego z wyraźnie dobrze zakonserwowanymi resztami VCI była niepomyślna. Przykład 1 Projekt przeciwciała humanizowanego o wysokim powinowactwie [0143] Zręb AY nie zapewniał zadowalającego przeciwciała humanizowanego mimo zastąpienia reszt Verniera lub kanonicznych dając regiony zrębowe przeciwciała o wysokim priorytecie identyczności sekwencji wobec punktacji VCI. Sposób umożliwił identyfikację odrębnej klasy zrębów ludzkich. Spośród nich wybrano jeden o najwyższej punktacji VCI. Jego sekwencja wiodąca była nieznana, więc do zastąpienia użyto sekwencji wiodącej VH5a. Wybrano sekwencję ludzkiej domeny VH, AJ (SEQ ID NO:27), która jest przedstawiona na fig. 8.

25 [0144] Jej CDR zastąpiono tymi z 2c3 i drugie przeciwciało humanizowane nazwano RH2. Sekwencja jest przedstawiona jako SEQ ID NO:4. RH2 ma pięć niezakonserwowanych reszt VCI: Ser 30; Met 48; Val 67; Arg 71 oraz Thr 73 (numeracja Kabata). Reszty te są określane poniżej jako odpowiednio b, c, d, e oraz f. [0145] Humanizowany łańcuch ciężki zawierający wszystkie zastąpienia VCI został nazwany RH2bcdef i był testowany w powiązaniu z łańcuchem lekkim RKA. Supernatanty z przejściowo transfekowanych komórek HEK293T stosowano w teście ELISA wiązania IL- 25. Porównanie między RHA oraz RH2bcdef wykazało lepsze wiązanie do IL-25 w porównaniu z RHA, ale nie było w stanie ponownie wychwycić 100% wiązania wykazywanego przez chimeryczne 2c3. Dlatego wniosek był taki, że wymagane było alternatywne podejście do prostej humanizacji 2c3. Przykład 2 Modyfikacja CDR RH2bcdef [0146] Dwie reszty CDR okazały się poprawiać siłę humanizowanego przeciwciała. Mutacje D31 G oraz G96D wprowadzono do RH2bcdef i stosowano do przejściowego transfekowania komórek HEK293T. Supernatanty stosowano w teście ELISA wiązania IL-25. Wyniki na fig. 9(A) pokazują, że mutacja D31 G odzyskuje siłę wiązania RH2bcdef do poziomów 2c3. Niemniej mutacja G96D, fig. 9(B), zwiększa wiązanie antygenu zasadniczo poza wartość osiąganą przez 2c3. [0147] Dla przetestowania, czy dwie mutacje były addytywne, obie włączono do RH2bcdef. Supernatanty z przejściowo transfekowanych komórek HEK293T stosowano w teście ELISA wiązania IL-25. Wyniki przedstawione na fig. 10 sugerują, że występuje niewielki, jednak znaczący, wzrost siły humanizacji dzięki włączeniu mutacji CDR. [0148] Nasze dane wskazują także, że dla utrzymania podobnych właściwości wiązania przeciwciała, oprócz Gly lub Asp, pozycję 31 można także wybrać spośród Ala, Ser, Val, Asn, Lys, Tyr lub Met. Przykład 3 Modyfikacje reszty 96 (Kabat) [0149] Dla lepszego zrozumienia, które aminokwasy mogą być tolerowane przy reszcie 96, glicynę zastąpiono dzięki mutagenezie przez reprezentatywne aminokwasy. Wobec RH2bcdef przeprowadzono następujące mutacje: G96Y, G96N, G96S, G96L, G96K oraz G96E. Konstrukty ekspresji poddano kontransfekcji RKA do komórek HEK293T i supernatanty stosowano w teście ELISA wiązania IL-25. Wyniki pokazują, że jedynie substytucja asparaginianu w pozycji 96 przez asparaginę miała równoważną moc, wszystkie inne badane w tej pozycji reszty miały szkodliwy wpływ na wiązanie do IL-25. Zaskakujące, że szkodliwy wpływ na siłę wiązania obejmował także substytucję przez glutaminian, który jest resztą ujemnie naładowaną, podobnie jak asparaginian. Można dojść do wniosku, że ujemny ładunek nie jest głównym udziałem asparaginy w zwiększaniu siły wiązania. [0150] Dlatego reszta 96 (Kabat) w domenie VH według wynalazku może być asparaginianem lub asparaginą. Przykład 4 Określanie minimalnych wymogów mysich reszt VCI dla RH2

26 [0151] Dla zminimalizowania potencjalnego immunogennego wpływu na przeciwciało humanizowane, pożądane jest ograniczenie liczby zastąpień mysich aminokwasów zrębowych. Humanizowany łańcuch ciężki RH2bcdef_G96D nazwano RH2.1 i miał on pięć zastąpień VCI z 2c3. Początkowo cztery usunięto dla zidentyfikowania, które reszty przyczyniały się do siły wiązania. [0152] Mutacje c, d, e oraz f zastąpiono endogenną ludzką resztą zrębową jako pojedynczymi mutacjami. Komórki HEK 293T poddano kotransfekcji mutacjami VCI i RKA, a supernatanty stosowano w teście ELISA wiązania IL-25. Co zaskakujące stwierdzono, że ponowne wprowadzenie reszt ludzkich V67 lub T73 w niewielkim stopniu poprawiało siłę wiązania, co było nieoczekiwane. Zmiana Met przy 48 z powrotem na mysią Ile nie miała żadnego istotnego wpływu. [0153] Jednak obecność ludzkiej reszty argininy w pozycji 71 wydawała się mieć szkodliwy wpływ na wiązanie IL-25. Dlatego stwierdzono, że w przeciwciele humanizowanym bardzo pożądana była tylko mysia reszta VCI Val 71. Inne reszty mogły być mysie lub ludzkie. [0154] Dla zidentyfikowania optymalnego ostatecznego humanizowanego łańcucha ciężkiego, zsyntetyzowano nową wersję łańcucha ciężkiego zwaną RH2.5 (SEQ ID NO:4), która nie zawierała mysich reszt VCI. Ponadto przygotowano dwie zmodyfikowane wersje RH2.5 wykorzystując mutacje VCI S30T (SEQ ID NO:3) lub R71V (SEQ ID NO:2). Wiązanie tych trzech nowych humanizowanych przeciwciał do IL-25 analizowano za pomocą testu ELISA. Wyniki przedstawia fig. 11. Stwierdzono, że w porównaniu do RH2.5, dodanie S30T lub R71 V równo zwiększało wiązanie do ludzkiej IL-25. [0155] Dlatego w niektórych przykładach wykonania wynalazku pozycje 30 i 71 łańcucha ciężkiego mogą być modyfikowane, oddzielnie lub łącznie, odpowiednio z S na T oraz z R na V. Przykład 5 Termostabilność przeciwciała [0156] Określano termostabilność RH2.5_S30T (SEQ ID NO:3) oraz RH2.5_R71V (SEQ ID NO:2). Przeciwciała przechowywano w różnych temperaturach przez 10 minut, a następnie szybko schładzano do temperatury pokojowej i za pomocą testu ELISA mierzono ich zdolność wiązania IL-25. Stwierdzono, że przeciwciało chimeryczne 2c3 (kontrola) zachowuje większą termostabilność i jest aktywne do temperatury 75 C. RH2.5_R71V zachowało aktywność do 65 C, a RH2.5_S30T było aktywne do 60 C. Przykład 6 Oznaczenie biologiczne komórek nie-b/nie-t przeciwciał humanizowanych [0157] Istnieje kilka oznaczeń biologicznych in vitro do pomiaru aktywności IL-25. Jedno z nich to pomiar uwalniania IL-13 przez komórki nie-b/nie-t (NB/NT) izolowane z węzłów chłonnych krezkowych myszy. W tym oznaczeniu komórki inkubowano z IL-25 i różnymi stężeniami przeciwciała, a następnie po trzech dniach stymulacji mierzono IL-13. Wyniki pokazały, że mysie przeciwciało 2c3 tylko częściowo hamowało wytwarzanie IL-13. Dla odróżnienia zarówno RH2.5_R71V, jak i S30T zmniejszały wytwarzanie IL-13, a RH2.5 znacząco zmniejszało wytwarzanie IL-13. Interesujące, że zarówno RH2.5_R71V, jak i RH2.5_S30T nadal wykazywały całkowitą inhibicję wytwarzania IL-13 w stężeniach tak

27 niskich, jak 0,25 µg/ml, jednak przy tym stężeniu RH2.5 można było stwierdzić niewielkie poziomy wytwarzania cytokin. Dane te są zgodne z poglądem, że przeciwciała humanizowane są silniejsze niż przeciwciało chimeryczne 2c3, a mutacje R71V oraz S30T zwiększają siłę wiązania antygenu. Przykład 7 RH2.5-R71V powoduje inhibicję hiperreaktywności dróg oddechowych [0158] W kolejnych doświadczeniach humanizowane przeciwciało RH2.5_R71V badano w mysim modelu ostrej hiperreaktywności dróg oddechowych (AHR). Protokół doświadczalny podsumowano na fig. 12. Myszy były początkowo uczulane na albuminę jaja kurzego, a następnie prowokowane w obecności przeciwciał anty-il-25. Wyniki na fig. 13(A) pokazują, że odpowiedź AHR była blokowana przez dodanie dawki 500 µg na mysz 2c3, ale nie po obniżeniu dawki do 50 µg na mysz. Dla odróżnienia, AHR była blokowana przez dawkę zaledwie 50 µg (2,5 mg/kg) humanizowanego przeciwciałarh2.5_r71v, jak to przedstawia fig. 13(B). Dane te dodatkowo wspierają pogląd, że przeciwciało humanizowane jest znacząco silniejsze od przeciwciała 2c3. Przykład 8 Leczenie zapalenia okrężnicy [0159] Dla wstępnego uczulenia samic myszy BALB/c (10 na grupę), ogolono pole skóry brzusznej i naniesiono 150 µl 3% (mas./obj.) roztworu oksazolonu w 100% etanolu. Myszy kontrolne były wstępnie uczulane przez naniesienie 150 µl 100% etanolu. 7 dni po wstępnym uczulaniu myszy poddano ponownej prowokacji doodbytniczej za pomocą 150 µl 3% oksazolonu w 50% etanolu lub tylko 50% etanolu (kontrola) pod znieczuleniem izofluranem. Dla zapewnienia dystrybucji oksazolonu w całej okrężnicy i jelicie ślepym, 1 minutę po wstrzyknięciu myszy utrzymywano w pozycji pionowej. Przeciwciało będące chimerą mysiej sekwencji 2C3 w ludzkim szkielecie IgG1 (100 mg/dawkę) podawano dootrzewnowo zarówno dzień przed wstępnym uczulaniem jak również dzień przed doodbytniczym podaniem oksazolonu. Myszy kontrolne otrzymały ludzki izotyp kontrolny IgG4 (100 mg/dawkę). Wszystkie opisane doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono za zgodą UK Home Office. [0160] Długość okrężnicy mierzono w grupach myszy trzy dni po podaniu 50% etanolu plus izotypu kontrolnego IgG4 dootrzewnowo (50% EtOH IgG4); 50% etanolu doodbytniczo plus anty-il-25 dootrzewnowo (50% EtOH anty-il-25); 50% etanolu z 3% oksazolonem doodbytniczo plus izotyp kontrolny IgG1 dootrzewnowo (3% oksazolon IgG4) oraz 50% etanolu z 3% oksazolonem doodbytniczo plus anty-il-25 dootrzewnowo (3% oksazolon anty- IL-25). [0161] Zwierzęta ważono codziennie po zabiegu jak wyżej. [0162] Fig. 14A pokazuje, że podawanie oksazolonu indukuje zmniejszenie długości okrężnicy będąc wskaźnikiem zapalenia okrężnicy. Zwierzęta traktowane oksazolonem i pochodzącym od 2C3 przeciwciałem anty-il-25 wykazują trend w kierunku dłuższych okrężnic (poprawione rokowania) względem zwierząt traktowanych oksazolonem oraz izotypem IgG4. Traktowanie oksazolonem indukuje także utratę masy ciała w porównaniu z kontrolą (fig. 14B). Zwierzęta traktowane oksazolonem i anty-il-25 tracą także masę,

28 chociaż w dniu 3 wykazują trend szybszego odzyskiwania masy ciała w porównaniu z grupą traktowaną oksazolonem i izotypem IgG4. Materiały i metody Skróty [0163] AHR Nadreaktywność dróg oddechowych C Stopień Celsjusza Bp DMEM DMSO DNA ELISA FCS FR G Para zasad Zmodyfikowane przez Dulbecco podłoże Eaglesa Dimetylosulfotlenek Kwas dezoksyrybonukleinowy; Test immunoenzymatyczny Płodowa surowica cielęca Zręb Gramy HEK 293T Komórki nerki embrionu ludzkiego wykazujące ekspresję dużego antygenu T SV40 (komórki HEK 293T) hr HRP IgG mab min NB/NT NIMR nm OD PBS PCR RH RK RT s Godzina Peroksydaza chrzanowa Immunoglobulina Przeciwciało monoklonalne Minuta Komórki nie-b/nie-t wyizolowane z mysich węzłów chłonnych krezkowych Narodowy Instytut Badań Medycznych (Wielka Brytania) Nanometr Gęstość optyczna Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Reakcja łańcuchowa polimerazy Rekombinowany łańcuch ciężki Rekombinowany łańcuch kappa Temperatura pokojowa Sekunda

29 UV VH VL VK Ultrafiolet Region zmienny łańcucha ciężkiego immunoglobuliny Region zmienny łańcucha lekkiego immunoglobuliny Region zmienny łańcucha lekkiego kappa immunoglobuliny Odczynniki do immunologii i biologii molekularnej [0164] Artykuł Dostawca w Wielkiej Brytanii Numer katalogowy Komórki kompetentne E. coli 10β NEB C3019H Numer serii Agaroza (UltraPure ) Invitrogen Albumina bydlęca (BSA) Sigma A K1230 Ampicylina Sigma A H0992 Fosfataza antarktyczna NEB M0289S 13 Apa I Promega R Bam HI Promega R Bufor węglan-wodorowęglan Sigma C k82206 Odczynnik transfekcyjny FuGENE 6 Zielona polimeraza Go-Taq Kozie przeciwciało przeciwludzkie IgG (swoiste wobec fragmentu Fc) Koniugat peroksydazy chrzanowej koziego przeciwludzkiego łańcucha kappa Roche Promega Stratech Scientific Sigma A K6101 Hind III Promega R Przeciwciało ludzkie IgG1/kappa IL-25 (mysia) IL-25 (ludzka) The Binding Site R&D Systems R&D Systems BP Substrat HRP K-Blue SkyBio Zestaw ekstrakcyjny żelu MiniElute Qiagen

30 Artykuł Dostawca w Wielkiej Brytanii Numer katalogowy Oligonukleotydy Sigma Nd. Numer serii Tabletki PBS Sigma P K8212 Zestaw do mutagenezy kierunkowej Phusion Zestaw QIAGEN Plasmid Maxi (25) NEB (Finnzymes) F-541 S Qiagen Zestaw QIAprep Spin Miniprep Qiagen Zestaw ELISA Quantikine mysiej IL-13 R&D Systems M1300CB Zestaw ligacyjny Quick NEB M2200s QuikChange II XL Site- Stratagene Zestaw do mutagenezy kierunkowej Czerwony roztwór zatrzymujący (dla K Blue) Kulki Dynabeads znakowane streptawidyną SkyBio Ltd Invitrogen Barwnik żelowy SYBR Safe DNA Invitrogen A Zestaw TOPO-TA Cloning Invitrogen X-Gal Promega V394A Klonowanie genów zmiennych przeciwciał chimerycznych i humanizowanych [0165] Syntetyzowano cdna regionu zmiennego łańcucha ciężkiego oraz lekkiego 2c3 oraz cdna regionu zmiennego przeciwciał humanizowanych (GeneArt AG). Regiony V łańcucha ciężkiego klonowano do pg1d200 za pośrednictwem miejsc enzymów restrykcyjnych HindIII oraz ApaI. Podobnie, regiony V łańcucha lekkiego klonowano do pkn100 za pośrednictwem miejsc HindIII oraz BamHI. Wektor pg1d200 przygotowano do ligacji przez trawienie 5 µg DNA za pomocą 20 jednostek HindIII oraz ApaI w buforze do trawienia restrykcyjnego Multicore (Promega) przez 2 godziny w temperaturze 37 C. Następnie do DNA dodano 1 jednostkę fosfatazy zasadowej antarktycznej (NEB) i inkubowano przez 15 do 30 minut zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie preparat wektora oczyszczano na kolumnie Qiaquick (Qiagen) zgodnie z instrukcjami producenta. Wektor wymywano w 50 µl. Podobnie przygotowano wektor pkn100 przez trawienie 5 µg DNA za pomocą 20 jednostek HindIII oraz BamHI w buforze E (Promega) przez 1 godzinę w temperaturze 37 C. DNA traktowano fosfatazą alkaliczną antarktyczną i oczyszczano zgodnie z opisem powyżej.

31 Region V insercji DNA (ok. 4 µg) trawiono zgodnie z opisem powyżej i fragmenty łańcucha ciężkiego oraz lekkiego oczyszczano z wektora za pomocą elektroforezy w żelu. Odpowiedni prążek wycinano z żelu i oczyszczano na kolumnie Qiaquick column (Qiagen), a następnie wymywano w 50 µl zgodnie z instrukcjami producenta. Ligacje przeprowadzano mieszając 1 µl wektora z 1 µl lub 3 µl insercji DNA w 1x buforze ligazy Quick (NEB) oraz 1 µl ligazy NEB Quick i inkubowano przez 10 minut w temperaturze pokojowej (20 C). Reakcja została użyta do transformacji 50 µl 100 komórek kompetentnych (NEB). Konstrukty wektora potwierdzono za pomocą sekwencjonowania DNA i wykonano w firmie GATC Biotech Ltd (Cambridge). Synteza genów zmiennych oraz mutageneza ukierunkowana Geny zmienne były syntetyzowane przez firmę GeneArt AG (Regensburg, Niemcy) [0166] Mutagenezę ukierunkowaną przeprowadzono przy użyciu zestawu do mutagenezy ukierunkowanej QuickChange II XL (Stratagene) zgodnie z instrukcjami producenta. Z wyjątkiem mutacji R3Q oraz L82aS RHA, gdzie stosowano metodę zestawu do mutagenezy ukierunkowanej Phusion (NEB) zgodnie z instrukcjami producenta. ELISA IgG1 [0167] Płytki Maxisorp powlekano za pomocą 0,4 µg/ml koziego przeciwciała przeciwludzkiego IgG i przechowywano w temperaturze 4 C nie dłużej niż 1 miesiąc. Przed użyciem płytki były przemywane trzykrotnie w PBS/0,02% Tween 20 (obj./ obj.), następnie blokowane w PBS/0,02% Tween20 (obj./obj.)/0,2% (mas./obj.) BSA. Płytki były przemywane jak wcześniej i dodawano supernatant próbki w zakresie stężeń wykorzystując podwajanie rozcieńczeń oraz inkubowano w temperaturze 37 C przez 1 godzinę. Płytki były przemywane jak wcześniej i inkubowane z koniugatem peroksydazy lekkiego łańcucha kappa koziego przeciwciała przeciwludzkiego (Sigma) w rozcieńczeniu 1:5000. Płytki były przemywane jak wcześniej, następnie dodawano 150 µl substratu K Blue One-Step (Neogen). Po 10 minutach reakcja była zatrzymywana za pomocą 50 µl czerwonego roztworu zatrzymującego (Neogen) i mierzono gęstość optyczną przy 655 nm. Oznaczenia wiązania cytokin [0168] Płytki Maxisorp powlekano za pomocą 0,25 µg/ml ludzkiego IL-25 (R&D Systems) w buforze węglan-wodorowęglan (Sigma) i przechowywano w temperaturze 4 C nie dłużej niż 1 miesiąc. Przed użyciem płytki były przemywane trzykrotnie w PBS/0,02% Tween 20 (obj./obj.), następnie blokowane w PBS/0,02% Tween20 (obj./obj.)/0,5% (mas./obj.) BSA. Płytki były przemywane jak wcześniej i dodawano supernatant próbki w zakresie stężeń wykorzystując podwajanie rozcieńczeń oraz inkubowano w temperaturze 37 C przez 1 godzinę. Płytki były przemywane jak wcześniej i inkubowane z koniugatem peroksydazy lekkiego łańcucha lekkiego kappa koziego przeciwciała przeciwludzkiego (Sigma) w rozcieńczeniu 1:5000. Płytki były przemywane jak wcześniej, następnie dodawano 150 µl substratu K Blue One-Step (Neogen). Po 10 minutach reakcja była zatrzymywana za pomocą 50 µl czerwonego roztworu zatrzymującego (Neogen) i mierzono gęstość optyczną przy 650 nm.

32 Myszy [0169] Myszy BALB/c otrzymano z firmy Harlan UK (Bicester, Wielka Brytania) i hodowano w firmach Small Animal Barrier Unit oraz Central Biomedical Services LMB Cambridge, ośrodkach o określonym środowisku wolnym od patogenów. Wszystkie opisane w tym raporcie doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono za zgodą UK Home Office. Oznaczenia komórek nie-b/nie-t [0170] Komórki nie-b/nie-t (NBNT) oczyszczano z krezkowego węzła chłonnego i inkubowano przez 72 godziny z lub bez 10 ng/ml rmil-25 oraz z mysim izotypem IgG1 (anty-c-myc) lub anty-mil-25 2c3 przy różnych stężeniach ludzkiego kontrolnego izotypu IgG1 (anty-malaria), anty-hil-25 RH2.5 R71V, anty-hil-25 RH2.5 S30T lub anty-hil-25 RH2.5. Wytwarzanie IL-13 oceniano z supernatantu komórek, który zlewano z dwóch duplikowanych dołków, techniką ELISA. Test ELISA IL-13 przeprowadzono wykorzystując zestaw Quantikine Murine IL-13 (R&D Systems). Projekt doświadczalny ostrego modelu hiperreaktywności dróg oddechowych (AHR) [0171] Myszy BALB/c (6 12 tygodni) uczulano przez dootrzewnowe podawanie albuminy jaja kurzego w PBS (20 µg/wstrzyknięcie) kompleksowanego z ałunem lub tylko PBS i ałunem (kontrole) w dniach 0 i 12. Podawanie aerozolu 1% albuminy jaja kurzego wykonywano w dniach 19, 20 oraz 21 przez 20 minut na dzień. Zwierzęta kontrolne otrzymywały PBS. Dwie godziny przed każdą prowokacją płucną zwierzęta otrzymały także dootrzewnowo 2c3, mysią kontrolę IgGI1 lub ludzki izotyp kontrolny IgGI1 (anty-malaria) lub anty-hil-25 RH2.5 R71V. W dniu 22 zwierzęta analizowano wykorzystując pletyzmografię po unieruchomieniu dla oceny AHR albuminą jaja kurzego, a przeciwciała zbadano pod kątem endotoksyn i stwierdzono, że mają stężenie poniżej 0,1 EU/ml z wyjątkiem RH2.5_R71V, gdzie wynosiło ono 1,2 EU/ml. Pomiar AHR [0172] Zwierzęta znieczulono, poddano tracheostomii i umieszczono pod respiratorem (respirator Minivent 845, EMMS, Wielka Brytania) przy ok. 150 oddechach/min z objętością oddechową 0,15 ml. Myszy były monitorowane za pomocą pletyzmografii całego ciała po unieruchomieniu (EMMS Hants, Wielka Brytania) i za pomocą podłączonego przetwornika oceniono ciśnienie przezpłucne. Po zarejestrowaniu stabilnego bazowego oporu płucnego, podano rosnące stężenia chlorku acetylo-β-metylocholiny (metacholina; Sigma, Dorset, Wielka Brytania) w aerozolu przez 10 sekund z nebulizatorem ultradźwiękowym i opór płucny rejestrowano przez okres 3 minut. Oprogramowanie EDaq (EMMS Hants, Wielka Brytania) zastosowano do analizy oporu, podatności dróg oddechowych oraz standardowych parametrów płucnych. Piśmiennictwo [0173] 1. P. G. Fallon et al., Immunity 17, 7 (Jul, 2002). 2. G. Grunig et al., Science 282, 2261 (1998).

33 3. M. Wills-Karp et al., Science 282, 2258 (1998). 4. M. M. Fort et al., Immunity 15, 985 (Dec, 2001). 5. M. R. Kim et al., Blood 100, 2330 (Oct 1, 2002). 6. G. Pan et al., J Immunol 167, 6559 (Dec 1, 2001). 7. S. D. Hurst et al., J Immunol 169, 443 (Jul 1, 2002). 8. T. A. Moseley, et al., Cytokine Growth Factor Rev 14,155 (Apr, 2003). 9. P. G. Fallon et al., J Exp Med 203, 1105 (Apr 17, 2006). 10. A. M. Owyang et al., J Exp Med 203, 843 (Apr 17, 2006). 11. Jones, P.T., et al., Nature 331:522 (1986). 12. Riechmann, L., et al., Nature 332:323(1988). 13. Chothia, C. & Lesk, A.M. J. Mol. Biol. 196:901 (1987). 14. Foote J & Winter G. J Mol Biol 224:487 (1992). 15. Ballantyne, S.J., et al J. Allergy Clin. Immunol. 120:1324 (2007). 16. Heller, F., et al., Immunity 17, (2002) 17. Fichtner-Feigl, S., et al., Mucosal Immunol 1 Suppl 1, S24-7 (2008) 18. Fort, M. M., et al., Immunity 15, (2001) 19. Buning, C., et al., Eur J Immunogenet 30, (2003) 20. Hanauer, S. B. Aliment Pharmacol Ther 27 Suppl 1, (2008) 21. Papa, A., et al., Am J Gastroenterol 104, (2009) 22. Yun, L., and Hanauer, S. Expert Rev Gastroenterol Hepatol 3, (2009) [0174] Sekwencje: SEQ ID NO:1 humanizowana domena VH (sztuczna)

34 gdzie: Xa1 to Ser lub Thr; Xa2 to Gly, Asp, Ala, Ser, Val, Asn, Lys, Tyr lub Met; Xa3 to Met lub Ile; Xa4 to Val lub Arg; a Xa5 to Asp, Asn lub Gly. SEQ ID NO:2 humanizowana domena VH RH2.5_S30T (sztuczna) SEQ ID NO:3 humanizowana domena VH RH2.5_R71V (sztuczna) SEQ ID NO:4 humanizowana domena VH RH2 (sztuczna)

35 SEQ ID NO:5 humanizowana domena VH (sztuczna) SEQ ID NO:6 humanizowana domena VH (sztuczna) SEQ ID NO:7 humanizowana domena VH (sztuczna)

36 SEQ ID NO:8 humanizowana domena VH (sztuczna) SEQ ID NO:9 humanizowana domena VH (sztuczna) SEQ ID NO:10 humanizowana domena VH (sztuczna)

37 SEQ ID NO:11 humanizowana domena VH (sztuczna) SEQ ID NO:12 humanizowana domena VH (sztuczna) SEQ ID NO: 13 humanizowana domena VH (sztuczna)

38 SEQ ID NO:14 humanizowana domena VH (sztuczna) SEQ ID NO:15 domena VK 2c3 (mysia) SEQ ID NO:16 kwas nukleinowy kodujący domenę VK 2c3 SEQ ID NO:17 domena VH 2c3 z sekwencją wiodącą (mysia)

39 SEQ ID NO:18 kwas nukleinowy kodujący domenę VH 2c3 SEQ ID NO: 19 domena VH AY (ludzka) SEQ ID NO:20 kwas nukleinowy kodujący domenę VH AY SEQ ID NO:21 domena VH RHA (sztuczna) SEQ ID NO:22 kwas nukleinowy kodujący domenę VH RHA (sztuczna)

40 SEQ ID NO:23 domena VK AY (ludzka) SEQ ID NO:24 kwas nukleinowy kodujący domenę VK AY SEQ ID NO:25 humanizowana domena VK 2c3 RKA (sztuczna) SEQ ID NO:26 kwas nukleinowy kodujący humanizowaną domenę VK 2c3 RKA

41 SEQ ID NO:27 domena VH AJ (ludzka) SEQ ID NO:28 kwas nukleinowy kodujący domenę VH AJ (ludzką) SEQ ID NO:29 CDR1 łańcucha lekkiego (mysi) SASQGISNYLN SEQ ID NO:30 CDR2 łańcucha lekkiego (mysi) YTSSLHS SEQ ID NO:31 CDR3 łańcucha lekkiego (mysi) QQYSKLPYT SEQ ID NO:32 CDR1 łańcucha ciężkiego (mysi) DYTMN

42 SEQ ID NO:33 CDR3 łańcucha ciężkiego (mysi) EGYDGYLYFAMDY SEQ ID NO:34 CDR1 łańcucha ciężkiego (sztuczny) GYTMN SEQ ID NO:35 CDR2 łańcucha ciężkiego (mysi) LINPYNGGTSYNQNFKG SEQ ID NO:36 CDR3 łańcucha ciężkiego (sztuczny) EDYDGYLYFAMDY SEQ ID NO:37 sekwencja wiodąca domeny VH: MGSTAILGLLLAVLQGVCA SEQ ID NO:38 sekwencja wiodąca domeny VK 2C3: MRVPAQLLGLLLLWLPDTRC NR ID SEKW:39 sekwencja wiodąca ludzkiego VL: MDMRVPAQLLGLLLLWLPDTRC SEQ ID NO:40 kwas nukleinowy kodujący RH2.5 R71 V (sztuczny)

43 SEQ ID NO:41 sekwencja uzgodniona Kozaka (sztuczna) AAGCTTGCCGCCACC LISTA SEKWENCJI [0175] <110> Medical Research Council Matthews, David Barlow, Jillian McKenzie, Andrew <120> Przeciwciała przeciwko IL-25 <130> <150> US 61/101,293 <151> <150> GB <151> <160> 41 <170> Wersja 3.3 PatentIn <210> 1 <211> 122 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Sekwencja syntetyczna: humanizowana domena VH <220> <221> WARIANT <222> (30)..(30)

44 <223> Xaa to Ser lub Thr; <220> <221> WARIANT <222> (31)..(31) <223> Xaa to Gly, Asp, Ala, Ser, Val, Asn, Lys, Tyr lub Met; <220> <221> WARIANT <222> (48)..(48) <223> Xaa to Met lub Ile <220> <221> WARIANT <222> (72)..(72) <223> Xaa to Val lub Arg; <220> <221> WARIANT <222> (100)..(100) <223> Xaa to Asp, Asn lub Gly. <400> 1

45 <210> 2 <211> 122 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Sekwencja syntetyczna: humanizowana domena VH RH2.5_S30T <400> 2

46 <210> 3 <211> 120 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Sekwencja syntetyczna: humanizowana domena VH RH2.5_R71V <400> 3

47 <210> 4 <211> 122 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Sekwencja syntetyczna: humanizowana domena VH RH2 <400> 4

48 <210> 5 <211> 122 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Sekwencja syntetyczna: humanizowana domena VH <400> 5

49 <210> 6 <211> 122 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Sekwencja syntetyczna: humanizowana domena VH <400> 6

50 <210> 7 <211> 122 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Sekwencja syntetyczna: humanizowana domena VH <400> 7

51 <210> 8 <211> 122 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Sekwencja syntetyczna: humanizowana domena VH <400> 8

52 <210> 9 <211> 122 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Sekwencja syntetyczna: humanizowana domena VH <400> 9

53 <210> 10 <211> 122 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Sekwencja syntetyczna: humanizowana domena VH <400> 10

54 <210> 11 <211> 122 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Sekwencja syntetyczna: humanizowana domena VH <400> 11

55 <210> 12 <211> 122 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Sekwencja syntetyczna: humanizowana domena VH <400> 12

56 <210> 13 <211> 122 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Sekwencja syntetyczna: humanizowana domena VH <400> 13

57 <210> 14 <211> 122 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Sekwencja syntetyczna: humanizowana domena VH <400> 14

58 <210> 15 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 15

59 <210> 16 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 16 <210> 17 <211> 139 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 17

60 <210> 18 <211> 417 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 18

61 <210> 19 <211> 137 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 <210> 20 <211> 411 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20

62 <210> 21 <211> 141 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Sekwencja syntetyczna: domena VH RHA <400> 21

63 <210> 22 <211> 424 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Sekwencja syntetyczna: kwas nukleinowy kodujący domenę VH RHA <400> 22

64 <210> 23 <211> 127 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 <210> 24 <211> 381

65 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 <210> 25 <211> 127 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Sekwencja syntetyczna: humanizowana domena VK 2c3 RKA <400> 25

66 <210> 26 <211> 381 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Sekwencja syntetyczna: kwas nukleinowy kodujący humanizowaną domenę VK 2c3 RKA <400> 26

67 <210> 27 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 <210> 28 <211> 363 <212> DNA <213> Homo sapiens

68 <400> 28 <210> 29 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 29 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 30 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 31 <210> 32 <211> 5

69 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 32 <210> 33 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 33 <210> 34 <211> 5 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Sekwencja syntetyczna: CDR1 łańcucha ciężkiego <400> 34 <210> 35 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 35

70 <210> 36 <211> 13 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Sekwencja syntetyczna: CDR3 łańcucha ciężkiego <400> 36 <210> 37 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 <210> 38 <211> 20 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 38 <210> 39 <211> 22 <212> PRT

71 <213> Homo sapiens <400> 39 <210> 40 <211> 423 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Sekwencja syntetyczna: kwas nukleinowy kodujący RH2.5 R71V <400> 40 <210> 41 <211> 15 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Sekwencja syntetyczna: sekwencja uzgodniona Kozaka <400> 41

72 aagcttgccg ccacc 15 Piotr Godlewski Rzecznik patentowy

73 Zastrzeżenia patentowe 1. Docelowy element wiążący, który wiąże IL-25, zawierający domenę VL przeciwciała, która zawiera CDR 1 3 Kabata opisane jako reszty (SEQ ID NO:29); (SEQ ID NO:30) oraz (SEQ ID NO:31) odpowiednio o SEQ ID NO:15 i domenę VH przeciwciała, która zawiera SEQ ID NO:1: Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Xa1 Xa2 Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Xa3 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Xa4 Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Xa5 Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser gdzie Xa1 to Ser lub Thr; Xa2 to Gly, Asp, Ala, Ser, Val, Asn, Lys, Tyr lub Met; Xa3 to Met lub Ile; Xa4 to Val lub Arg; a Xa5 to Asp, Asn lub Gly. 2. Docelowy element wiążący według zastrzeżenia 1, gdzie (a) Xa2 to Gly, a Xa5 to Asp lub Asn; (b) Xa2 to Gly, a Xa5 to Asp; (c) Xa1 to Ser; (d) Xa1 to Thr; (e) Xa3 to Met; (f) Xa3 to Ile; (g) Xa4 to Val; lub (h) Xa4 to Arg. 3. Docelowy element wiążący według zastrzeżenia 1, przy czym reszty Xa1 Xa5 są w następujących kombinacjach: Reszta Kabata: Pozycja w SEQ ID NO: Reszta listy sekwencji: Xa1 Xa2 Xa3 Xa4 Xa5 SEQ ID NO:2 Ser Gly Met Val Asp

74 SEQ ID NO:3 Thr Gly Met Arg Asp SEQ ID NO:4 Ser Gly Met Arg Asp SEQ ID NO:5 Thr Gly Met Val Asp SEQ ID NO:6 Ser Asp Met Val Asp SEQ ID NO:7 Thr Asp Met Arg Asp SEQ ID NO:8 Thr Asp Met Val Asp SEQ ID NO:9 Ser Gly Ile Val Asp SEQ ID NO:10 Thr Gly Ile Arg Asp SEQ ID NO:11 Thr Gly Ile Val Asp SEQ ID NO:12 Ser Asp Ile Val Asp SEQ ID NO:13 Thr Asp Ile Arg Asp SEQ ID NO:14 Thr Asp Ile Val Asp 4. Docelowy element wiążący według zastrzeżenia 1: (a) przy czym domena VL zawiera także reszty z SEQ ID NO:15 sąsiadujące z CDR1 (SEQ ID NO:29); (b) która zawiera SEQ ID NO:15; (c) gdzie domena VL jest humanizowana; lub (d) gdzie domena VL jest humanizowana, a sekwencja docelowego elementu wiążącego zawiera aminokwasy z SEQ ID NO: Docelowy element wiążący według zastrzeżenia 1, który jest fragmentem przeciwciała Fab, F(ab ) 2, scfv lub Fv. 6. Docelowy element wiążący według zastrzeżenia 1, który zawiera region stały przeciwciała. 7. Docelowy element wiążący według zastrzeżenia 6, przy czym region stały to region stały ludzkiej IgG1 lub IgG4. 8. Wyizolowany kwas nukleinowy, który zawiera sekwencję nukleotydową kodującą docelowy element wiążący według zastrzeżenia Wektor ekspresji zawierający kwas nukleinowy według zastrzeżenia 8 połączony funkcjonalnie z promotorem. 10. Komórka gospodarza zawierająca wektor ekspresji według zastrzeżenia Sposób wytwarzania docelowego elementu wiążącego, który to sposób obejmuje hodowanie komórek gospodarza według zastrzeżenia 10 w warunkach do wytwarzania docelowego elementu wiążącego, gdzie sposób opcjonalnie obejmuje ponadto izolowanie docelowego elementu wiążącego i opcjonalnie dalej obejmuje formulację docelowego elementu wiążącego do kompozycji zawierającej przynajmniej jeden składnik dodatkowy.

75 12. Kompozycja zawierająca docelowy element wiążący według zastrzeżenia 1 oraz dopuszczalny farmaceutycznie nośnik, gdzie kompozycja jest opcjonalnie w postaci liofilizowanego proszku. 13. Docelowy element wiążący według dowolnego z zastrzeżeń od 1 do 7 do zastosowania w leczeniu lub zapobieganiu: (a) astmie; (b) nieswoistemu zapaleniu jelita; (c) wrzodziejącemu zapaleniu okrężnicy; lub (d) chorobie Leśniowskiego-Crohna. 14. Sposób wytwarzania przeciwciała przeciwko IL-25, który to sposób obejmuje: (a) zapewnienie domeny VH przeciwciała, która zawiera SEQ ID NO:1: Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Xa1 Xa2 Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Xa3 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Xa4 Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Xa5 Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser gdzie: Xa1 to Ser lub Thr; Xa2 to Gly, Asp, Ala, Ser, Val, Asn, Lys, Tyr lub Met; Xa3 to Met lub Ile; Xa4 to Val lub Arg; a Xa5 to Asp, Asn lub Gly. (b) połączenie domeny VH z wieloma domenami VL przeciwciała dla zapewnienia cząsteczek przeciwciała; (c) badanie przesiewowe cząsteczek przeciwciał pod kątem wiązania IL-25; oraz (d) wybranie cząsteczki przeciwciała, która wiąże IL Docelowy element wiążący według zastrzeżenia 1, który zawiera całe przeciwciała. Piotr Godlewski Rzecznik patentowy

76 Figura 1 Sekwencja łańcucha lekkiego kappa mysiego przeciwciała 2c3. CDR są oznaczone.

77 Figura 2 Sekwencja łańcucha ciężkiego mysiego przeciwciała 2c3. CDR są oznaczone.

78 Figura 3 Sekwencje DNA i aminokwasowa AY393094

79 Figura 4 Sekwencje DNA i aminokwasowa humanizowanego RHA 2c3