(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (1) T3 Int.Cl. G01N 33/68 (06.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 13/3 EP B1 (4) Tytuł wynalazku: Sposób określania skuteczności adalimumabu u pacjentów cierpiących na zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa z zastosowaniem CTX-II i MMP-3 jako markerów biologicznych () Pierwszeństwo: US P (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 08/31 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 14/01 (73) Uprawniony z patentu: AbbVie Biotechnology Ltd, Hamilton, BM (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 WALTER P. MAKSYMOWYCH, Edmonton, CA ROBERT L. WONG, Basking Ridge, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Magdalena Tagowska PATPOL KANCELARIA PATENTOWA SP. Z O.O. ul. Nowoursynowska 162 J Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 Opis TŁO WYNALAZKU [0001] Podwyższony poziom TNF odgrywa ważną rolę w patologicznych procesach zapalnych. TNF, nazywany również TNFα, jest związany z procesami patofizjologicznymi zachodzącymi w czasie wielu różnych chorób i zaburzeń u ludzi, w tym w czasie sepsy, infekcji, chorób autoimmunologicznych, w czasie procesu odrzucania przeszczepu oraz reakcji przeszczep przeciwko gospodarzowi (patrz np. Moeller i wsp., (1990) Cytokine 2:162; patent USA Nr , Moeller i wsp.; Nr Publikacji Patentu Europejskiego B1, Moeller, A. i wsp.; Vasilli (1992) Annu. Rev. Immunol. :411; Tracey i Cerami (1994) Annu. Rev. Med. 4:491). [0002] Zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa (AS, ang. ankylosing spondylitis), które powiązano z podniesionym poziomem TNF (Lange i wsp. (00), Eur J Med Res. (12):07), jest powszechną chorobą reumatyczną o podłożu zapalnym, powodującą stopniowe zesztywnienie kręgosłupa i ograniczenie możliwości poruszania się. AS jest jedną z form przewlekłego stanu zapalnego kręgosłupa oraz stawów krzyżowo-biodrowych, która może być przyczyną bólu i sztywności w okolicach kręgosłupa. Z czasem, przewlekłe zapalenie kręgosłupa (zapalenie stawów kręgosłupa) może spowodować całkowite zespolenie ze sobą kręgów (fuzja) w procesie zwanym zesztywnieniem stawów, a to z kolei może prowadzić do utraty sprawności ruchowej kręgosłupa. [0003] AS jest często diagnozowane kombinacją kilku metod, w tym badaniem objawów występujących u pacjenta, badaniem fizykalnym i analizą rentgenowską. Do objawów AS odczuwanych przez pacjenta należą ból i sztywność kręgosłupa oraz okolic kości krzyżowej z towarzyszącym stanem zapalnym w innych stawach, ścięgnach i narządach lub przy nie występującym w innych okolicach stanie zapalnym. Wczesne objawy AS mogą wprowadzać w błąd ze względu na to, że obserwowane objawy tj. sztywność i bóle kręgosłupa występują w wielu innych stanach chorobowych, co często powoduje opóźnienie w postawieniu trafnej dla AS diagnozy. Ponadto, badanie fizykalne pacjenta może wykazać oznaki stanu zapalnego i zmniejszony zakres ruchu stawów, często szczególnie widoczne w obrębie kręgosłupa (elastyczność dolnej części pleców i/lub szyi może być zmniejszona). Dalszymi wskazówki do postawienia prawidłowej diagnozy mogą być widoczne w prześwietleniu rentgenowskim anomalie w kręgosłupie albo wykazana w teście przeprowadzonym na próbce krwi obecność markera genetycznego - genu HLA-B27. [0004] AS jest związane z uszkodzeniem strukturalnym, czego skutkiem jest degradacja i resorpcja w chrząstce i kości stawu, powodująca zniszczenie stawu. Z punktu widzenia terapeutycznego istotne jest zarówno leczenie objawów występujących u pacjenta z AS, jak również związanych z chorobą uszkodzeń strukturalnych spowodowanych zniszczeniem stawów. [000] Klasyczne leczenie AS obejmuje podawanie pacjentowi niesteroidowych leków przeciwzapalnych (NLPZ) celem zmniejszenia bólu i sztywności kręgosłupa oraz innych stawów. Powszechnie stosowane leki NLPZ obejmują indomethacin (Indocin), tolmetin (Tolectin), sulindac (Clinoril), naproxen (Naprosyn) i diklofenak (Voltaren). W ostatnim czasie wykazano, że czynniki biologiczne zwalczające TNF, takie jak etanercept, infliximab i adalimumab, skuteczne zmniejszają objawy towarzyszących AS. [0006] Przykładowo: WALTER P. i wsp.: Infliximab in ankylosing spondylitis: A prospective Observational inception cohort analysis of efficacy and safety J RHEUMATOL, Tom 29, 02, str , XP ujawnia sposób określania skuteczności terapii zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa za pomocą infliximabu. 1

3 MAKSYMOWYCH WALTER P. i wsp.: Etanercept exerts beneficial effects on articular cartilage biomarkers of degradation and turnover in patients with ankylosing spondylitis JOURNAL OF RHEUMATOLOGY, TORONTO, CA, Tom 32, Nr, 1 października 0 (0--01), str , XP ISSN: X ujawnia zastosowanie etanerceptu do zwalczania zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa oraz jego potencjalną skuteczność. BERNARD VANDOOREN i wsp.: Involvement of Matrix Metalloproteinases and Their Inhibitors in Peripheral Synovitis and Down-Regulation by Tumor Necrosis Factor alpha Blockade in Spondylarhtropathy, ARTHRITIS & RHEUMATISM, Tom 0, Nr 9 Września 04 (04-09), str , ujawnia, że infliksymab podawany pacjentom ze spondyloartropatią (zapaleniem stawów z zajęciem stawów kręgosłupa) wywołuje zmniejszenie ekspresji metaloproteinaz macierzy zewnątrzkomórkowej STRESZCZENIE WYNALAZKU [0007] Mimo postępów w leczeniu AS biologicznymi czynnikami zwalczającymi TNF, istnieje potrzeba opracowania testów diagnostycznych i prognostycznych, wspomagających lekarzy w diagnozowaniu objawów i rekomendowaniu odpowiedniego sposobu leczenia. Ponadto, testy diagnostyczne i prognostyczne, poprzez trafniejszą ocenę postępów leczenia, mogą zapewnić pacjentom lepszą opiekę medyczną i redukcję kosztów leczenia. [0008] Zgodnie z pierwszym wykonaniem, niniejszy wynalazek dostarcza sposobu określania skuteczności adalimumabu w leczeniu zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa (AS) u pacjenta cierpiącego na AS, przy czym sposób obejmuje oznaczanie poziomu C-końcowego telopeptydu kolagenu typu II (CTX-II, ang. type II collagen C-telopeptide) po zakończeniu leczenia oraz oznaczanie poziomu metaloproteinazy 3 macierzy zewnątrzkomórkowej (MMP-3, ang. matrix metalloproteinase 3) po zakończeniu leczenia w próbce/próbkach otrzymanych od pacjenta cierpiącego na AS, w których niższy poziom CTX-II po leczeniu w odniesieniu do znanego standardowego poziomu CTX-II ustalonego w oparciu o próbkę/próbki od pacjentów z AS oraz niższy poziom MMP-3 po leczeniu w odniesieniu do znanego standardowego poziomu MMP-3 ustalonego w oparciu o próbkę/próbki od pacjenta/pacjentów z AS wskazuje na to, że terapia adalimumabem w przypadku danego pacjenta jest skuteczna. Korzystnie we wspomnianym pierwszym wykonaniu po leczeniu poziom CTX-II w próbce lub próbkach otrzymanych od leczonego pacjenta jest obniżony o co najmniej 9% w stosunku do znanego standardowego poziomu CTX-II ustalonego w oparciu o dane od pacjenta/pacjentów cierpiących na AS. [0009] Korzystnie we wspomnianym pierwszym wykonaniu po leczeniu poziom MMP-3 w próbce lub próbkach otrzymanych od leczonego pacjenta jest obniżony o co najmniej o 8% w stosunku do znanego standardowego poziomu MMP-3 ustalonego w oparciu o dane od pacjenta/pacjentów cierpiących na AS. [00] Zgodnie z drugim wykonaniem, niniejszy wynalazek dostarcza sposobu określania skuteczności adalimumabu w leczeniu zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa (AS) u pacjenta cierpiącego na AS, przy czym sposób obejmuje oznaczenie poziomu C-końcowego telopeptydu kolagenu typu II (CTX-II) przed rozpoczęciem leczenia oraz oznaczanie poziomu metaloproteinazy 3 macierzy zewnątrzkomórkowej (MMP-3) przed rozpoczęciem leczenia w próbce/próbkach otrzymanych od pacjenta cierpiącego na AS, u których niższy poziom CTX-II po leczeniu w odniesieniu do poziomu CTX-II przed leczeniem oraz niższy poziom MMP-3 po leczeniu w odniesieniu do poziomu MMP-3 przed leczeniem wskazuje na to, że terapia adalimumabem dla danego pacjenta z AS jest skuteczna. 2

4 1 2 3 [0011] Zgodnie z trzecim wykonaniem niniejszy wynalazek dostarcza sposobu określania skuteczności adalimumabu w leczeniu zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa (AS) u pacjenta cierpiącego na AS, przy czym sposób obejmuje oznaczanie poziomu C-końcowego telopeptydu kolagenu typu II (CTX-II) po zakończeniu leczenia oraz oznaczanie poziomu metaloproteinazy 3 macierzy zewnątrzkomórkowej (MMP-3) po zakończeniu leczenia w próbce/próbkach otrzymanych od pacjenta cierpiącego na AS, w których niższy poziom CTX-II po leczeniu w odniesieniu do poziomu CTX-II przed leczeniem oraz niższy poziom MMP-3 po leczeniu w odniesieniu do poziomu MMP-3 przed leczeniem wskazuje na to, że terapia adalimumabem dla danego pacjenta z AS jest skuteczna. [0012] W powyższych wykonaniach, korzystne jest oznaczanie poziomu MMP-3 przy użyciu metody ELISA. [0013] Zgodnie z czwartym wykonaniem niniejszy wynalazek dostarcza sposobu określania skuteczności adalimumabu w leczeniu zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa (AS) u pacjenta cierpiącego na AS, przy czym sposób obejmuje oznaczanie poziomu C-końcowego telopeptydu kolagenu typu II (CTX-II) po leczeniu w próbce/próbkach otrzymanych od pacjenta cierpiącego na AS, w których poziom CTX-II jest niższy o co najmniej 9% w odniesieniu do znanego standardowego poziomu CTX-II w oparciu o próbkę/próbki od pacjenta z AS wskazuje na to, że terapia adalimumabem dla danego pacjenta z AS jest skuteczna. [0014] W powyższych wykonaniach, korzystne jest oznaczanie poziomu CTX-II przy użyciu metody ELISA. [001] Zgodnie z korzystnymi wykonaniami niniejszego wynalazku, wspomniany CTX-II jest CTX-II z moczu. [0016] Zgodnie z preferowanymi wykonaniami niniejszego wynalazku, wspomniana MMP-3 jest MMP-3 z surowicy. [0017] W powyższych wykonaniach, korzystnie sposób będący przedmiotem wynalazku obejmuje ponadto porównanie poziomu białka C-reaktywnego (CRP, ang. C-reactive protein) pacjentów ze znanym standardowym poziomem CRP związanym z występowaniem AS oraz ustalenie, czy poziom CRP pacjenta jest wyższy niż znany standardowy poziom CRP, gdzie niższy poziom CRP w odniesieniu do znanego standardowego poziomu CRP wskazuje na skuteczność leczenia. [0018] Niniejszym ujawnione są markery biologiczne, które można użyć do określania poprawy stanu pacjenta cierpiącego na AS, w szczególności w odniesieniu do strukturalnych uszkodzeń związanych z AS. Niniejsze ujawnienie dotyczy sposobu określania skuteczności inhibitora TNF służącego do hamowania związanej z AS degradacji chrząstki i/lub zapalenia błony maziowej stawu. Niniejsze ujawnienie obejmuje również sposób identyfikacji pacjentów z AS, którzy są kandydatami do leczenia inhibitorami TNF, np. adalimumabem, w oparciu o poziom markerów biologicznych degradacji chrząstki i/lub zapalenia błony maziowej stawu. KRÓTKI OPIS FIGUR [0019] Fig. 1 przedstawia projekt badań opisany w Przykładzie 1. Fig. 2 przedstawia wykres pokazujący, że w 12 tygodniu i w 24 tygodniu u chorych poddanych leczeniu alimumabem następuje znaczące obniżenie poziomu CTX-II w moczu w stosunku do placebo. Fig. 3 przedstawia wykres pokazujący, że w 12 tygodniu i w 24 tygodniu u chorych poddanych leczeniu adalimumabem następuje znaczące obniżenie poziomu MMP-3 w stosunku do placebo. Fig. 4 przedstawia wykres, który pokazuje, że w 12 i 24 tygodniu u pacjentów poddanych leczeniu adalimumabem poziomy CRP zostały znacząco zredukowane w porównaniu do pacjentów traktowanych placebo. 3

5 1 2 3 SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU I. Definicje [00] W celu lepszego objaśnienia wynalazku w pierwszej kolejności podano definicje szeregu stosowanych określeń. [0021] Określenie marker biologiczny stosowane w niniejszym dokumencie odnosi się do cząsteczki, np. genu (kwas nukleinowy kodujący wspomniany gen), białka, struktury cukrowej lub glikolipidu, której ekspresję w próbce lub na próbce z tkanki ssaczej lub komórki można wykryć standardowymi metodami znanymi w stanie techniki (jak również ujawnionymi w niniejszym dokumencie). Cząsteczka ta jest również czynnikiem prognostycznym lub wskazuje na stan zdrowia pacjenta (czynnik diagnostyczny), od którego próbka pochodzi. Gdy wspomnianym markerem biologicznym jest białko, modulacja lub zmiana ekspresji obejmuje modulację poprzez różnego typu modyfikacje post-translacyjne. W oparciu o poziom markera biologicznego można określić zaawansowanie choroby, w tym ocenić poprawę lub pogorszenie stanu chorobowego. W związku z powyższym, w jednym wykonaniu marker biologiczny przydatny w niniejszym wynalazku jest dowolną cząsteczką, której ekspresja jest regulowana (ulega obniżeniu lub podwyższeniu) w zależności od postępu choroby np. spondyloartropatii, w porównaniu do prawidłowej kontroli, np. od osobnika zdrowego. W jednym wykonaniu wybrany zestaw jednego, dwóch, trzech lub więcej markerów biologicznych według niniejszego wynalazku można użyć jako punkty odniesienia do szybkiej diagnostyki lub prognozy określającej odpowiedź pacjenta na leczenie skierowane przeciwko TNF [0022] Określenie marker biologiczny degradacji kolagenu odnosi się do cząsteczki np. do genu (lub kwasu nukleinowego kodującego ten gen), białka, struktury cukrowej lub glikolipidu, który jest związany z niszczeniem kolagenu. Marker biologiczny degradacji kolagenu jest wykorzystany do określenia aktywności choroby, tj. zniszczenia kolagenu u pacjenta, od którego otrzymano próbkę lub tkankę. W jednym wykonaniu marker biologiczny degradacji kolagenu jest fragmentem kolagenu np. fragmentem kolagenu typu II. Markerem biologicznym degradacji kolagenu wykorzystanym w niniejszym wynalazku jest C-końcowy telopeptyd kolagenu typu II (CTX-II). [0023] Określenie marker biologiczny zapalenie błony maziowej stawu odnosi się do cząsteczki np. do genu (lub kwasu nukleinowego kodującego wspomniany gen), białka, struktury cukrowej lub glikolipidu, która jest związana z zapaleniem błony maziowej stawu lub stanem zapalnym błony maziowej stawu. Marker biologiczny zapalenia błony maziowej stawu można wykorzystać do oznaczania wzmożonej przebudowy, proliferacji, degradacji, zapalenia, uszkodzenia, rozpadu, patologicznej zmiany lub degradacji błony maziowej lub kolagenu błony maziowej pacjenta. W jednym wykonaniu, marker biologiczny zapalenia błony maziowej stawu jest endopeptydazą związaną z degradacją macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) np. metaloproteinazą macierzy zewnątrzkomórkowej. Markerem biologicznym zapalenia błony maziowej stawu używanym w niniejszym wynalazku jest MMP-3. [0024] Określenie znany poziom standardowy lub poziom kontroli odnosi się do przyjętego lub wstępnie określonego poziomu markera biologicznego wykorzystywanego do porównania z poziomem markera biologicznego pochodzącego z próbki pacjenta. W jednym wykonaniu wspomniany znany poziom standardowy markera biologicznego degradacji kolagenu i/lub markera biologicznego zapalenia błony maziowej stawu jest określany w oparciu o pacjenta lub pacjentów z AS reprezentujących dany stan chorobowy. W innym wykonaniu, wspomniany znany poziom standardowy markera biologicznego wskazuje na niezmieniony, niezwiązany z chorobą stan fizyczny osobnika, który nie choruje na AS. 4

6 1 2 3 [002] Odchylenie od znanego poziomu standardowego markera biologicznego oznacza w ogólności polepszenie lub pogorszenie stanu chorobowego. Alternatywnie, kiedy poziom markera biologicznego jest taki sam jak standardowy poziom markera biologicznego na ogół oznacza to potwierdzenie aktywności choroby, potwierdzenie stanu prawidłowego pacjenta lub w przypadku, gdy badany jest marker biologiczny po leczeniu, niepowodzenie leczenia w poprawie stanu pacjenta. [0026] Stosowane tu określenie ekspresja używane razem z określeniem wykrywanie ekspresji markera biologicznego według niniejszego wynalazku, może odnosić się do wykrywania transkrypcji genu kodującego białko markera biologicznego, do wykrywania translacji białka markera biologicznego i/lub do wykrywania białka markera biologicznego powstałego w wyniku procesów metabolicznych większej cząsteczki białka np. w wyniku degradacji kolagenu typu II, w czasie której powstaje fragment CTX-II. Określenie wykrywanie markera biologicznego odnosi się do czynności aktywnego określania czy zachodzi ekspresja markera biologicznego czy też nie. Ilościowe oznaczanie ekspresji odnosi się do określania poziomu danego markera biologicznego np. w ng/ml. Wykrywania i/lub oznaczanie ilościowe może obejmować ustalanie, czy ekspresja danego markera biologicznego ulega podwyższeniu w porównaniu do znanego poziomu standardowego, ulega obniżeniu w porównaniu do znanego poziomu standardowego lub w zasadzie nie ulega zmianom w porównaniu do znanego poziomu standardowego. Dlatego też szacowanie ilościowe i/lub wykrywanie ekspresji nie wymaga podwyższenia lub obniżenia poziomu ekspresji markera biologicznego. Dotyczy raczej detekcji ekspresji markera biologicznego, wykrywania braku zmian w ekspresji markera lub wykrywanie braku różnic (np. wykrywanie braku znaczącej ekspresji markera biologicznego lub braku znaczących zmian ekspresji markera biologicznego w porównaniu do kontroli). [0027] Określenie poziom lub ilość tu stosowane odnosi się do mierzalnej ilości markera biologicznego. Wspomniana ilość może być (a) absolutną ilością mierzoną w cząsteczkach, molach lub masie w odniesieniu do objętości lub komórek albo (b) ilością względną np. wyznaczoną w analizie densytometrycznej. W korzystnym wykonaniu wyznaczono poziomy RNA i/lub białka markera biologicznego. [0028] Określenia pacjent lub osobnik tu stosowane odnosi się do człowieka lub zwierzęcia niebędącego człowiekiem. [0029] Określenie próbka tu stosowane odnosi się do kolekcji podobnych komórek lub tkanek otrzymanych od badanego pacjenta. Źródłem próbek tkanek lub komórek może być stała tkanka świeża, mrożona i/lub zabezpieczona próbka organu lub tkanki lub biopsja lub aspiracja; krew lub dowolne składniki krwi lub płyny fizjologiczne takie jak krew, surowica, mocz, ślina, pot lub maź stawowa. W jednym wykonaniu biologiczny marker zapalenia błony maziowej stawu jest uzyskiwany z próbki surowicy. W jednym wykonaniu, marker biologiczny degradacji chrząstki jest uzyskiwany z próbki moczu. [00] Określenie ludzki TNFα (tu w skrócie htnfα lub po prostu htnf) stosowany w niniejszym dokumencie w zamyśle odnosi się do ludzkiej cytokiny, która występuje jako forma wydzielnicza o masie 17 kd oraz jako forma błonowa o masie 26 kd. Forma aktywna biologicznie jest trimerem niekowalencyjnie połączonych cząsteczek o masie 17 kd. Struktura htnfα jest szerzej opisana na przykład w Pennica, D. i wsp. (1984) Nature 312: ; Davis, J. M. i wsp. (1987) Biochemistry 26: ; I Jones, E. Y.,i wsp. (1989) Nature 338: Określenie ludzki TNFα w zamyśle obejmuje rekombinowany ludzki TNFα (rhtnfα), który można wytworzyć standardowymi metodami ekspresji rekombinacyjnej lub kupić ze źródeł komercyjnych (R&D Systems, Nr kat. 2-TA, Minneapolis, MN). TNFα jest również określany jako TNF. [0031] Określenie inhibitor TNFα obejmuje czynniki, które wpływają na aktywność TNFα.

7 1 2 3 [0032] Określenie obejmuje również każde z przeciwciał skierowanych przeciwko TNFα oraz części przeciwciał tu opisanym oraz opisane w patencie USA nr ; ; , i 03/ A1. Inhibitor TNFα zastosowany w tym ujawnieniu jest przeciwciałem skierowanym przeciwko TNFα lub fragmentem tego przeciwciała, obejmującym infliximab (Remicade, Johnson i Johnson opisanym w patencie USA nr , CDP71 (humanizowane przeciwciało monoklonalne IgG4 skierowane przeciwko TNFα), CDP 870 (fragment humanizowanego przeciwciało monoklonalnego skierowanego przeciwko TNFα), anty-tnf dab (Peptech), CNTO 148 (golimumab. Medarex, Centocor, patrz WO 02/12), adalimumab (Humira Abbott Laboratories, ludzkie mab skierowane przeciwko TNFα, opisane w patencie USA nr jako D2E7). Ponadto przeciwciała TNF, które mogą być użyte w tym ujawnieniu, opisano w patencie USA nr ; ; ; i W innym aspektem tego ujawnienia, inhibitor TNFα jest białkiem fuzyjnym TNF, np. etanercept (Enbrel, Amgen. opisane w WO 91/033 i WO 09/6476. W innym aspekcie tego ujawnienia inhibitor TNFα jest rekombinowanym białkiem wiążącym TNF (r-tbp-1) (Serono). [0033] Określenie przeciwciało stosowane w niniejszym dokumencie w zamyśle odnosi się do cząsteczek immunoglobulin składających się z czterech łańcuchów polipeptydowych: dwóch łańcuchów ciężkich (H) oraz dwóch lekkich (L) połączonych wiązaniami dwusiarczkowymi. Każdy łańcuch ciężki składa się z regionu zmiennego łańcucha ciężkiego (tu w skrócie HCVR lub VH) i regionu stałego łańcucha ciężkiego. Region stały łańcucha ciężkiego składa się z trzech domen: CH1, CH2 i CH3. Każdy łańcuch lekki składa się z regionu zmiennego łańcucha lekkiego (tu w skrócie LCVR lub VL) i regionu stałego łańcucha lekkiego. Region stały łańcucha lekkiego składa się z jednej domeny - CL. W regionach VH i VL można wyróżnić regiony hiperzmienne zwane regionami determinującymi komplementarność (CDR), które są położone naprzemiennie z regionami bardziej konserwatywnymi, zwanymi regionami zrębowymi (FR). Każdy region VH i VL składa się z trzech lub czterech regionów CDR i czterech regionów FR, ułożonych od końca aminowego do końca karboksylowego w następującej kolejności: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Przeciwciała według niniejszego wynalazku opisano szczegółowo w patencie USA nr ; ; i [0034] Określenie cześć wiążąca antygen przeciwciała (lub prosto część przeciwciała ) tu stosowane odnosi się do jednego lub więcej fragmentów przeciwciała, które zachowują zdolność wiązania antygenu w sposób specyficzny (np. htnfa). Wykazano, że fragmenty przeciwciała o pełnej długości mogą pełnić funkcję przeciwciała polegającą na wiązaniu antygenu. Przykłady fragmentów wiążących zawarte w określeniu część wiążąca antygen przeciwciała obejmują (i) fragment Fab, monowalentny fragment zawierający domeny VL, VH, CL oraz CH1; (ii) fragment F(ab'), dwuwalentny fragment obejmujący dwa fragmenty Fab połączone wiązaniem dwusiarczkowym w regionie zawiasowym; (iii) fragment Fd zawierający domeny VH i CH1; (vi) fragment Fv obejmujący domeny VL i VH pojedynczego ramienia przeciwciała, (v) fragment dab (Ward i wsp. (1989) Nature 341:44-46), który składa się z domeny VH oraz (vi) izolowanego regionu determinującego komplementarność (CDR). Ponadto, chociaż obie domeny fragmentu Fv, tj. VL i VH, są kodowane przez oddzielne geny, można je łączyć za pomocą metod rekombinacji syntetycznym łącznikiem, dzięki któremu mogą występować jako pojedynczy łańcuch białkowy, w którym para regionów VL i VH tworzy cząsteczki monowalentne (znane jako pojedynczy łańcuch Fv (scfv); patrz np. Bird i wsp. (1988) Science 242: ; i Huston i wsp. (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 8: ). Takie jednołańcuchowe przeciwciała w zamyśle również mieszczą się pod określeniem część wiążąca antygen przeciwciała. Powyższa definicja obejmuje również inne formy jednołańcuchowych przeciwciał, takich jak 6

8 1 2 3 przeciwciała dwuspecyficzne (ang. diabodies). Przeciwciała typu diabodies są dwuwartościowe i dwuspecyficzne. Domeny VH i VL tego typu przeciwciał są wyrażane jako jeden łańcuch polipeptydowy, przy czym linker jest zbyt krótki i nie pozwala na parowanie między dwoma domenami tego samego łańcucha, zmuszając do parowania z komplementarną domeną innego łańcucha i w ten sposób tworząc dwa miejsca wiązania antygenu (patrz np. Holliger i wsp. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90: ; Poljak i wsp. (1994) Structure 2: ). Części przeciwciała według niniejszego wynalazku opisano bardziej szczegółowo w patencie USA nr 6,090,382, 6,28,62, 6,09,01. Inhibitorem TNFα stosowanym w wynalazku jest adalimumab. [003] Fragmenty wiążące są wytwarzane metodami rekombinowanego DNA lub poprzez trawienie enzymatyczne albo cięcie chemiczne całych cząsteczek immunoglobuliny. Fragment wiążące obejmują Fab, Fab', F(ab') 2, Fabc, Fv, pojedyncze łańcuchy oraz przeciwciała jednołańcuchowe. Zrozumiałym jest, że przeciwciała lub immunoglobuliny inne niż określane mianem dwuspecyficzne lub dwufunkcjonalne posiadają dwa identyczne miejsca wiązania. Przeciwciało dwuspecyficzne lub dwufunkcjonalne jest sztuczną hybrydą posiadającą dwie różne pary ciężkich/lekkich łańcuchów oraz dwa różne miejsca wiązania. Dwuspecyficzne przeciwciała mogą być wytwarzane przy wykorzystaniu różnych metod, w tym fuzji komórek hybrydoma lub poprzez łączenie fragmentów Fab'. Patrz, np. Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: (1990); Kostelny i wsp., J. Immunol. 148, (1992). [0036] Konserwatywne podstawienie aminokwasu, jak stosuje się w niniejszym dokumencie, to zamiana aminokwasu, gdzie jedna reszta aminokwasowa jest zastępowana inną resztą aminokwasową o podobnym łańcuchu bocznym. Rodziny reszt aminokwasowych o podobnych łańcuchach bocznych zostały zdefiniowane w stanie techniki. Obejmują zasadowe łańcuchy boczne (np. lizyna, arginina, histydyna), kwaśne łańcuchy boczne (np. kwas asparaginowy, kwas glutaminowy), nienaładowane polarne łańcuchy boczne (np. glicyna, asparagina, glutaminy, seryna, treonina, tyrozyna, cysteina), niepolarne łańcuchy boczne (np. alanina, walina, leucyna, izoleucyna, proliny, fenyloalanina, metionina, tryptofan), betarozgałęzione łańcuchy boczne (np. treonina, walina, izoleucyna) oraz aromatyczne łańcuchy boczne (np. tyrozyna, fenyloalanina, histydyna, tryptofan). [0037] Określenie przeciwciała chimeryczne odnosi się do przeciwciała, w którym jedna cześć każdej z sekwencji aminokwasowych ciężkiego lub lekkiego łańcucha jest homologiczna do odpowiadającej sekwencji w przeciwciałach pochodzących z określonego gatunku lub należących do określonych klas, natomiast pozostały segment łańcuchów jest homologiczny do odpowiadających sekwencji z innych gatunków. W jednym z aspektów, ujawnienie opisuje przeciwciało chimeryczne lub fragment wiążący antygen, w którym regiony zmienne zarówno łańcucha lekkiego jak i ciężkiego naśladują regiony zmienne przeciwciał pochodzących z jednego gatunku ssaków, natomiast części stałe są homologiczne do sekwencji w przeciwciałach pochodzących z innych gatunków. W korzystnym aspekcie ujawnienia, przeciwciała chimeryczne otrzymuje się przez przeszczep regionów CDR myszy do regionów zrębowych przeciwciała ludzkiego. [0038] Określenie humanizowane przeciwciała odnosi się do przeciwciał, które zawierają co najmniej jeden łańcuch zawierający reszty zrębowe regionu zmiennego, zwłaszcza z łańcucha przeciwciała ludzkiego (zwanego immunoglobuliną lub przeciwciałem akceptorowym) oraz co najmniej jeden region odpowiedzialny za komplementarność (CDR) zwłaszcza z przeciwciała nie pochodzącego od człowieka (np. pochodzącego z myszy). Ponadto, oprócz przeszczepu regionów CDR, humanizowane przeciwciała zazwyczaj poddawane są dalszym modyfikacjom w celu polepszenia ich powinowactwa i/lub immunogenności. 7

9 1 2 3 [0039] Określenie przeciwciało wielowartościowe odnosi się do przeciwciała zawierającego więcej niż jedno miejsce rozpoznające antygen. Przykładowo przeciwciało dwuwalentne posiada dwa miejsca rozpoznające antygen, a przeciwciało czterowalentne posiada cztery miejsca rozpoznające antygen. Wyrażenia monospecyficzne, dwuspecyficzne, trójspecyficzne, czterospecyficzne, itd. odnosi się do specyficzności różnych miejsc rozpoznających antygen (w przeciwieństwie do liczby miejsc rozpoznających antygen) obecnych w obrębie przeciwciała wielowartościowego. Przykładowo, miejsca rozpoznające antygen w obrębie przeciwciała monospecyficznego wiążą ten sam epitop. Dwuspecyficzne (ang. bispecific lub dualspecific ) przeciwciała posiadają co najmniej jedno miejsce rozpoznające antygen, które wiąże pierwszy epitop oraz co najmniej jedno miejsce wiążące drugi epitop, który jest różny od pierwszego epitopu. Wielowartościowe monospecyficzne przeciwciała posiadają wiele miejsc wiążących antygen, przy czym wszystkie te miejsca wiążą ten sam epitop. Wielowartościowe dwuspecyficzne przeciwciało posiada wiele miejsc rozpoznających antygen, przy czym pewna ich liczba wiąże pierwszy epitop, a pozostałe wiążą drugi epitop, który jest różny od pierwszego epitopu. [00] Określenie ludzkie przeciwciało tu stosowane w zamyśle obejmuje przeciwciała posiadające regiony zmienne i stałe otrzymane w oparciu o sekwencje immunoglobulin ludzkich linii zarodkowych. Ludzkie przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą obejmować reszty aminokwasowe nie kodowane przez sekwencje immunoglobulin ludzkiej linii zarodkowej (np. mutacje indukowane przez losową lub miejscowospecyficzną mutagenezę in vitro lub poprzez mutację somatyczną in vivo, np. w regionach CDR, a w szczególności w CDR3). Tym niemniej określenie przeciwciało ludzkie stosowane w niniejszym dokumencie, w zamyśle nie obejmuje przeciwciał, w których sekwencje CDR otrzymano z linii zarodkowej innych gatunków ssaków, takich jak mysz, i przeszczepiono w zrąb sekwencji ludzkich. [0041] Określenie ludzkie przeciwciało rekombinowane stosowane w niniejszym dokumencie obejmuje ludzkie przeciwciała przygotowywane, wyrażane, tworzone i izolowane za pomocą techniki rekombinacji jak np. przeciwciała wyrażane z wykorzystaniem komórek gospodarza transfekowanych wektorem ekspresyjnym (opisanym poniżej), przeciwciała izolowane z rekombinowanych, kombinatorycznych bibliotek ludzkich przeciwciał (opisane poniżej), przeciwciała izolowane ze zwierząt (np. z myszy), które są transgeniczne dla genów ludzkich immunoglobulin (patrz Taylor i wsp. (1992) Nucl. Acids Res. :6287) lub przeciwciała przygotowane, wyrażane, tworzone i izolowane w jakikolwiek inny sposób, który obejmuje alternatywne składanie sekwencji genów ludzkich immunoglobulin z innymi sekwencjami DNA. Takie ludzkie rekombinowane przeciwciała posiadają regiony zmienne i stałe otrzymane w oparciu o sekwencje immunoglobulin ludzkiej linii zarodkowej. Jednakże, w określonych wykonaniach takie ludzkie przeciwciała rekombinowane są poddane mutagenezie in vitro (lub w przypadku wykorzystania zwierząt transgenicznych dla sekwencji ludzkich Ig poddane somatycznej mutagenezy in vivo). Stąd sekwencje aminokwasowe regionów VH i VL przeciwciał rekombinowanych pochodzą z ludzkiej linii i są spokrewnione z ludzkimi sekwencjami VH i VL, ale mogą naturalnie nie występować w repertuarze genów ludzkiej linii zarodkowej in vivo. [0042] Takie chimeryczne, humanizowane i dwuspecyficzne przeciwciała mogą być produkowane znanymi w stanie techniki metodami rekombinowanego DNA np. wykorzystując metody opisane w patencie USA Nr ; EP ; EP ; EP ; publikacja PCT nr WO 86/0133; patent USA Nr ; EP 0123; Better i wsp. (1988) Science 2:41-43; Liu i wsp. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: ; Liu i wsp. (1987) J. Immunol. 139: ; Sun i wsp. (1987) Proc. Natl. Acad Sci. USA 84: ; Nishimura i wsp. (1987) Cancer Res. 47:999-0; Wood i wsp. (198) Nature 314: ; 8

10 1 2 3 Shaw i wsp. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:13-19); Morrison (198) Science 229:12-17; Oi i wsp. (1986) BioTechniques 4:214; Patent USA Nr,22,39; Jones i wsp. (1986) Nature 321:2-2; Verhoeyan i wsp. (1988) Science 239:134; i Beidler i wsp. (1988) J. Immunol. 141:443-60, Queen i wso., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: (1989), US,,1, US,8,089, US,693,761, US,693,762, Selick i wsp., WO 90/07861, and Winter, US,22,39. [0043] Określenie izolowane przeciwciało stosowane w tym dokumencie w zamyśle odnosi się do przeciwciała, które jest zasadniczo wolne od innych przeciwciał posiadających inne specyficzności antygenowe (np. izolowane przeciwciało, które specyficznie wiąże htnfα jest zasadniczo wolne od przeciwciał, które specyficznie wiążą antygen inny niż htnfα). Izolowane przeciwciało, które specyficznie wiąże htnfα może jednakże wykazywać reaktywność krzyżową wobec innych antygenów, takich jak cząsteczka TNFα pochodząca z innych gatunków (omówione szerzej w dalszej części). Ponadto, izolowane przeciwciało może być zasadniczo wolne od innych składników komórki i/lub odczynników chemicznych. [0044] Określenie przeciwciało neutralizujące stosowane w niniejszym dokumencie (lub przeciwciało, które neutralizuje aktywność htnfα ) w zamyśle odnosi się do przeciwciała, którego wiązanie do htnfα powoduje zahamowanie biologicznej aktywności htnfα. Wspomniane zahamowanie aktywności biologicznej htnfα można ocenić mierząc jeden lub większą liczbę wskaźników aktywności biologicznej htnf, takich jak indukowana przez htnfα cytotoksyczność (in vitro lub in vivo), aktywacja komórkowa indukowana przez htnfα oraz wiązanie htnfα do receptorów htnfα. Opisane wskaźniki aktywności biologicznej htnfα można ocenić za pomocą jednego lub wielu standardowych testów in vivo lub in vitro znanych w stanie techniki (patrz patent USA ). Korzystnie, zdolność przeciwciała do neutralizowania aktywności htnfα jest oceniana przez hamowane indukowanej przez htnfα cytotoksyczności dla komórek L929. Jako dodatkowy lub alternatywny parametr zdolności przeciwciała do zahamowania aktywności htnfα można wykorzystać parametr zdolności hamowania przez przeciwciało indukowanej przez TNFα ekspresji ELAM-1 na komórkach HUVEC. [004] Określenie rezonans plazmonu powierzchniowego stosowane w niniejszym dokumencie odnosi się do zjawiska optycznego, które pozwala analizować w czasie rzeczywistym biospecyficzne interakcje przez detekcję lub zmiany w stężeniu białka w macierzy biosensora, na przykład wykorzystując system BIAcore (Pharmacia AB, Uppsala, Szwecja i Piscataway, NJ). Aby uzyskać dodatkowe informacje, patrz: Przykład 1 patent USA i Jönsson i wsp. (1993) Ann. Biol. Clin. 1:19; Jönsson i wsp. (1991) Biotechniques 11:6-627; Johnsson i wsp. (199) J. Mol. Recognit. 8:12; i Johnnson i wsp. (1991) Anal.Biochem.198:268. [0046] Określenie K off, stosowane w niniejszym dokumencie odnosi się do stałej dysocjacji dla przeciwciała oddysocjowującego od kompleksu przeciwciało/antygen. [0047] Określenie K d, stosowane w niniejszym dokumencie odnosi się do stałej dysocjacji dla określonych oddziaływań przeciwciało - antygen. [0048] Określenie IC 0 stosowane w niniejszym dokumencie w zamyśle odnosi się do stężenia inhibitora potrzebnego do zahamowania punktu końcowego właściwości biologicznej (ang. endpoint) będącego przedmiotem zainteresowania np. do zneutralizowania cytotoksyczności. [0049] Określenie cząsteczka kwasu nukleinowego stosowane w niniejszym dokumencie obejmuje cząsteczki DNA i RNA. Cząsteczka kwasu nukleinowego może być jednoniciowa lub dwuniciowa, lecz korzystnie jest dwuniciowym DNA. 9

11 1 2 3 [000] Określenie izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego stosowane w niniejszym dokumencie w odniesieniu do kwasów nukleinowych kodujących przeciwciała lub części przeciwciał (np. VH, VL, CDR3), które wiążą htnfα, odnosi się do cząsteczki kwasu nukleinowego, w którym sekwencje nukleotydów kodujące przeciwciało lub cześć przeciwciała są wolne od innych sekwencji nukleotydowych kodujących przeciwciała lub części przeciwciał wiążących antygeny inne niż htnfα, a inne sekwencje mogą oskrzydlać kwas nukleinowy w ludzkim genomowym DNA. Tak więc, przykładowo, izolowany kwas nukleinowy według niniejszego wynalazku kodujący region VH przeciwciała skierowanego przeciwko htnfα nie zawiera innych sekwencji kodujących inne regiony VH, które wiążą antygeny inne niż htnfα. [001] Określenie wektor stosowane w niniejszym dokumencie odnosi się do cząsteczki kwasu nukleinowego zdolnej do transportu innej cząsteczki kwasu nukleinowego, do której została ta cząsteczka została przyłączona. Jeden typ wektora jest określany plazmidem, które to określenie odnosi się do kolistej dwuniciowej pętli DNA, do której wligowano dodatkowe segmenty DNA. Inny typ wektora to wektor wirusowy, w którym dodatkowe segmenty DNA mogą być wligowane do genomu wirusowego. Pewne wektory są zdolne do autonomicznej replikacji w komórce gospodarza, do której zostały wprowadzone (np. wektory bakteryjne posiadające bakteryjne miejsce inicjacji replikacji lub episomalne wektory ssacze). Pozostałe wektory (np. nie episomalne wektory ssacze) mogą się integrować z genomem komórki gospodarza po wprowadzeniu do komórki gospodarza i ulegają replikacji razem z genomem gospodarza. Co więcej, niektóre wektory są zdolne do kierowania ekspresją genów, z którymi są funkcjonalnie połączone. Takie wektory nazwano tu rekombinacyjnymi wektorami ekspresyjnymi (lub prosto wektorami ekspresyjnymi ). Generalnie, wektory ekspresyjne wykorzystywane w technikach rekombinacji DNA są często w formie plazmidu. W niniejszym opisie, określenie plazmid i wektor mogą być używane wymiennie, ponieważ plazmid jest najczęściej używaną formą wektora. Jednak wynalazek w zamyśle obejmuje inne formy wektorów ekspresyjnych, takie jak wektory wirusowe (np. retrowirusy pozbawione zdolności replikacji, adenowirusy, wirusy związane z adenowirusami), które spełniają równoważne funkcje. [002] Określenie transformowana komórka gospodarza (lub komórka gospodarza ), stosowane w niniejszym dokumencie odnosi się do komórki, do której wprowadzono wektor ekspresyjny. Należy przez to rozumieć, że takie określenia odnoszą się nie tylko do konkretnej komórki, ale do całej populacji tych komórek. Ze względu na to, że w pokoleniach potomnych mogą zachodzić pewne modyfikacje związane z mutacją lub wpływem środowiska zewnętrznego, taka populacja może w rzeczywistości różnić się od komórki rodzicielskiej, ale wciąż mieścić się pod pojęciem komórka gospodarza. [003] Określenie dawka stosowane w niniejszym dokumencie odnosi się do ilości inhibitora TNFα podawanego badanemu osobnikowi. [004] Określenie zmienna dawka wielokrotna obejmuje różne dawki inhibitora TNFα, który jest podawany badanemu osobnikowi w celach terapeutycznych. Zmienny schemat wielokrotnego podawania lub wielodawkowa terapia zmienną dawką opisana w harmonogramie leczenia oparta jest na podawaniu różnych ilości inhibitora TNFα w różnych momentach czasowych w czasie procesu leczenia. Wielodawkowe sposoby leczenia opisano w WO 0/142. [00] Określenie dawkowanie stosowane w niniejszym dokumencie odnosi się do podawania substancji (np. przeciwciała skierowanego przeciwko TNFα) w celu osiągnięcia celu terapeutycznego (np. leczenie reumatoidalnego zapalenia stawów). [006] Określenie schemat dawkowania dwa razy w tygodniu, dawkowanie dwa razy w tygodniu oraz podawanie dwa razy w tygodniu stosowane w niniejszym dokumencie odnosi się to okresu podawania

12 1 2 3 substancji (np. przeciwciała skierowanego przeciwko TNFα) badanemu osobnikowi w celu osiągnięcia celu terapeutycznego. Schemat podawania leku dwa razy w tygodniu w zamyśle nie obejmuje schematu dawkowania raz w tygodniu. Korzystnie, dana substancja jest podawana co 9-19 dni, korzystniej, co dni, jeszcze korzystniej co 13-1 dni, a najkorzystniej co 14 dni. [007] Określenie kombinacja w zdaniu pierwszy czynnik w kombinacji z drugim czynnikiem obejmuje łączne podawanie pierwszego czynnika i drugiego czynnika, który przykładowo może być rozpuszczony lub zmieszany z tym samym farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem lub podawanie pierwszego czynnika, a następnie drugiego czynnika lub podawanie drugiego czynnika, a następnie pierwszego czynnika. Niniejsze ujawnianie zawiera kombinację metod leczenia farmaceutycznego i kombinację kompozycji farmaceutycznych. [008] Określenie towarzyszący w zdaniu leczenie towarzyszące zawiera podawanie czynnika w obecności drugiego czynnika. Towarzyszące leczenie terapeutyczne obejmuje metody, w których pierwszy, drugi, trzeci lub dodatkowe czynniki są podawane łącznie. Towarzyszące leczenie terapeutyczne obejmuje również sposoby, w których pierwszy lub dodatkowy czynnik są podawane w obecności drugiego lub dodatkowego czynnika, przy czym drugi lub dodatkowy czynnik przykładowo mogą być podane wcześniej. Leczenie towarzyszące można przeprowadzić stopniowo przez różne osoby zaangażowane w leczenie. Przykładowo, jedna osoba zaangażowana w leczenie może podawać pacjentowi pierwszy czynnik, a druga osoba zaangażowana w leczenie może podawać pacjentowi drugi czynnik. Podawanie tych dwóch czynników może mieć miejsce w tym samym czasie, prawie w tym samym czasie lub może być rozdzielone w czasie tak długo, jak pierwszy czynnik (i dodatkowe czynniki) jest po podaniu w obecności drugiego czynnika (i dodatkowych czynników). Osoba zaangażowana w leczenie i pacjent mogą być jedną i tą sama osobą (np. człowiekiem). [009] Określenie terapia skojarzona stosowany w niniejszym dokumencie odnosi się do podawania dwóch lub większej liczby substancji leczniczych np. przeciwciała skierowanego przeciwko TNFα oraz innego leku. Inny lek (leki) mogą być podawane jako towarzyszące przed lub po podaniu przeciwciała skierowanego przeciwko TNFα. [0060] Określenie zestaw stosowane w niniejszym dokumencie odnosi się do opakowanego produktu zawierającego elementy składowe, za pomocą których podaje się przeciwciało TNFα według niniejszego wynalazku do leczenia zaburzeń związanych z TNFα. Wspomniany zestaw obejmuje pudełko lub pojemnik zawierający elementy składowe zestawu. Opakowanie to posiada naklejkę lub protokół zaakceptowany przez Agencję Żywności i Leków. Opakowanie lub pojemnik zawiera elementy składowe wynalazku, które są korzystnie zapakowane w naczynia plastikowe, polietylenowe, polipropylenowe, etylenowe lub propylenowe. Naczynia te mogą być zamykanymi probówkami lub butelkami. Zestaw może zawierać również instrukcje dotyczące podawania przeciwciała TNFα według niniejszego ujawnienia. W jednym wykonaniu zestaw według niniejszego ujawnienia zawiera ludzkie przeciwciało D2E7, jak opisano w patencie USA 8,216,83 i patencie USA 04/ A1. [0061] Różne aspekty wynalazku są opisane w dalszej części niniejszego dokumentu. II. Degradacja chrząstki oraz markery biologiczne zapalenia stawów kręgosłupa. [0062] Istnieje potrzeba stworzenia miarodajnego narzędzia do oceny zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa (AS). Takie narzędzie potrzebne jest do oceny poprawy stanu pacjent, w szczególności do oceny poprawy stanu pacjentów z AS poddanych leczeniu inhibitorem TNF. Obecnie, szeroko stosowanymi metodami oceny aktywności AS jest wskaźnik opadania erytrocytów (ESR) i poziom białka C-reaktywnego 11

13 1 2 3 (CRP), jednak są one narzędziem niewystarczającym. (Ruof i Stucki (1999) J Rheumatol 26:966). Wynalazek jak określono w załączonych zastrzeżeniach, dostarcza markery, biologiczne które zidentyfikowano jako pomocne w ocenie skuteczności terapii anty-tnf do zapobiegania uszkodzeniom strukturalnym związanym z AS u pacjentów. Ponadto, wynalazek, jak określono w załączonych zastrzeżeniach, dostarcza sposób określania odpowiedzi pacjenta w przypadku zahamowania uszkodzeń strukturalnych stawów związanego z AS. Sposoby tu opisane identyfikują takie zmiany w progresji uszkodzeń strukturalnych u pacjentów, które przy użyciu bardziej tradycyjnych metod, takich jak radioterapia, trudniej jednoznacznie zdiagnozować. Sposoby według niniejszego wynalazku są korzystne, gdyż umożliwiają lekarzowi określenie skuteczności leczenia hamującego działania TNF u pacjenta bez konieczności dłuższego oczekiwania na wyniki badań klinicznych. [0063] Generalnie niniejsze ujawnienie obejmuje porównanie poziomu markerów biologicznych pacjentów cierpiących na AS, z podejrzeniem AS, ze standardowym poziomem tych markerów związanym z chorobą w celu ustalenia, czy poziom markerów u pacjenta ulega podwyższeniu, obniża się lub utrzymuje się na tym samym poziomie w stosunku do kontroli. Przy określaniu skuteczności inhibitorów TNF w leczeniu AS u pacjenta, w szczególności w odniesieniu do poprawy w postępie uszkodzeń strukturalnych, poziomy markerów biologicznych można ocenić wcześniej lub alternatywnie można do procedury włączyć pobranie próbki od pacjenta i porównać poziom markera biologicznego z próbki w teście porównawczym według niniejszego ujawnienia. [0064] Niniejsze ujawnienie identyfikuje określone markery związane z procesem uszkodzeń strukturalnych, w tym markery degradacji chrząstki oraz markery zapalenia błony maziowej, które można wykorzystać do określania czy wybrana terapia z użyciem TNF jest odpowiednia do leczenia lub czy powinno się rozważyć zastosowanie innej inna terapia przeciwko TNF. Takie narzędzia prognostyczne działają na korzyść ogólnego zdrowia pacjenta, ponieważ umożliwiają szybsze dobranie odpowiedniego sposobu leczenia. Sposoby tu opisane powodują również obniżenie ogólnych kosztów leczenia poprzez szybsze odrzucenie terapii nie przynoszących pożądanych skutków terapeutycznych. [006] Niniejsze ujawnienie dostarcza sposób określania skuteczności inhibitora TNF w leczeniu spondyloartropatii np. zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa, obejmujący pomiar markerów biologicznych uszkodzenia chrząstki i błony maziowej stawu. Skuteczność terapii jest ustalana w zależności od zdolności inhibitora TNF do obniżania poziomu markerów biologicznych charakterystycznych dla degradacji chrząstki i/lub błony maziowej u pacjenta. [0066] W jednym aspekcie, niniejsze ujawnienie obejmuje sposób określania skuteczności inhibitora TNF np. przeciwciała skierowanego przeciwko TNFα, lub części tego przeciwciała wiążącej antygen do leczenia zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa (AS), w którym wcześniej określony poziom markera biologicznego degradacji kolagenu i/lub błony maziowej u pacjentów z AS poddanych leczeniu inhibitorem TNFα (poziom markera biologicznego po leczeniu) jest porównywany ze znanym poziomem standardowym markera biologicznego degradacji kolagenu i/lub błony maziowej związanych ze stanem rozwoju choroby. Porównując te dwa poziomy ustala się czy poziom markera biologicznego degradacji kolagenu po leczeniu i/lub poziom markera biologicznego zapalenia błony maziowej po leczeniu jest niższy niż znany poziom standardowy, gdzie niższy poziom markera biologicznego degradacji kolagenu pacjentów poddanych leczeniu inhibitorem TNF w odniesieniu do znanego poziomu standardowego wskazuje na skuteczność inhibitora w leczeniu AS. 12

14 1 2 3 Bardziej szczegółowo, według pierwszego wykonania niniejszy wynalazek dostarcza sposób określania skuteczności adalimumabu w leczeniu zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa (AS) u pacjentów cierpiących na AS. Wspomniany sposób obejmuje oznaczanie poziomu C-końcowego telopeptydu kolagenu typu II (CTX-II) po zakończeniu leczenia oraz oznaczanie poziomu metaloproteinazy 3 macierzy zewnątrzkomórkowej (MMP-3) po zakończeniu leczenia w próbce/próbkach otrzymanych od pacjentów cierpiących na AS, w których niższy poziom CTX-II po leczeniu w odniesieniu do znanego standardowego poziomu CTX-II ustalonego w oparciu o próbkę/próbki od pacjenta lub pacjentów z AS oraz niższy poziom MMP-3 po leczeniu w próbce/próbkach w odniesieniu do znanego standardowego poziomu MMP-3 ustalonego w oparciu próbkę/próbki pacjenta lub pacjentów AS wskazuje na to, że terapia adalimumabem w przypadku danego pacjenta jest skuteczna. [0067] W innym aspekcie, niniejsze ujawnienie dostarcza sposób określania skuteczności inhibitora TNF np. przeciwciała skierowanego przeciwko ludzkiemu TNFα lub części tego przeciwciała wiążącej antygen, do leczenia zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa (AS), obejmujący porównanie poziomu markera biologicznego degradacji kolagenu przed leczeniem i/lub markera biologicznego zapalenia błony maziowej w materiale od pacjentów z AS z poziomem markera biologicznego degradacji kolagenu po leczeniu i/lub markera biologicznego zapalenia błony maziowej w materiale od wcześniej wspomnianych pacjentów, gdzie niższy poziom markera biologicznego po leczeniu wskazuje na skuteczność działania inhibitora TNF w leczeniu AS. [0068] Przez obniżenie poziomu markera biologicznego związanego z degradacją chrząstki i/lub zapaleniem błony maziowej stawu, inhibitor TNF może być używany do zapobiegania lub zmniejszania strukturalnego uszkodzenia związanego z AS. Bardziej szczegółowo zgodnie z drugim wykonaniem niniejszy wynalazek dostarcza sposób określania skuteczności adalimumabu w leczeniu zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa (AS) u pacjentów z AS. Wspomniany sposób obejmuje oznaczanie poziomu C-końcowego telopeptydu kolagenu typu II (CTX-II) przed leczeniem oraz oznaczanie poziomu metaloproteinazy 3 macierzy zewnątrzkomórkowej (MMP-3) przed leczeniem w próbce/próbkach otrzymanych od pacjenta z AS, w których niższy poziom CTX-II po leczeniu w odniesieniu do poziomu CTX-II przed leczeniem oraz niższy poziom MMP-3 po leczeniu w odniesieniu do poziomu MMP-3 przed leczeniem wskazuje na to, że terapia adalimumabem dla danego pacjenta jest skuteczna. W jednym aspekcie, niniejsze ujawnienie obejmuje sposób określania skuteczności inhibitora TNF np. przeciwciała skierowanego przeciwko TNFα lub części tego przeciwciała wiążącej antygen, do leczenia zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa (AS), w którym wcześniej określony poziom markera biologicznego degradacji kolagenu i/lub błony maziowej u pacjentów z AS poddanych leczeniu inhibitorem TNFα (poziom markera biologicznego po leczeniu) jest porównywany ze znanym poziomem standardowym markera biologicznego degradacji kolagenu i/lub zapalenia błony maziowej związanych z AS. W tym przypadku, zmniejszenie się poziomu markera biologicznego u pacjenta względem znanego standardowego poziomu oznacza, że inhibitor TNF jest skuteczny w zmniejszaniu tempa progresji uszkodzeń strukturalnych u pacjentów z AS. [0069] W jednym aspekcie, niniejsze ujawnienie obejmuje sposób przewidywania skuteczności inhibitora TNF np. przeciwciała skierowanego przeciwko TNFα, lub części tego przeciwciała wiążącej antygen do leczenia (AS) u pacjentów obejmujący porównanie wcześniej wyznaczonego poziomu markera biologicznego degradacji kolagenu i/lub markera biologicznego zapalenia błony maziowej u pacjenta poddanego leczeniu przeciwciałem skierowanym przeciwko TNFα lub częścią tego przeciwciała wiążącą antygen, ze znanym standardem poziomu markera biologicznego degradacji kolagenu i/lub markera 13

15 1 2 3 biologicznego zapalenia błony maziowej u pacjenta z AS. W oparciu o te dwa poziomy markera biologicznego ocenia się, czy marker biologiczny degradacji kolagenu po leczeniu i/lub poziom markera biologicznego zapalenia błony maziowej po leczeniu jest niższy niż znany standardowy poziom markera biologiczny degradacji kolagenu i/lub poziom markera biologicznego zapalenia błony maziowej. W takim wypadku niższy poziom markera biologicznego degradacji kolagenu po leczeniu i/lub niższy poziom markera biologicznego zapalenia błony maziowej u pacjenta po leczeniu w odniesieniu do standardowego poziomu wskazuje na to, że można przewidzieć skuteczność przeciwciała skierowanego przeciwko TNFα lub jego części wiążącej antygen w leczeniu pacjentów z AS. [0070] W powyższej sytuacji stwierdzono, że inhibitor TNF skutecznie zmniejsza poziom markera biologicznego związanego z niszczeniem chrząstki i/lub zapaleniem błony maziowej. Efektem działania inhibitora jest ograniczenie uszkodzeń strukturalnych np. uszkodzeń stawów. W takim przypadku można rozważać kontynuowanie leczenie tym inhibitorem W jednym aspekcie niniejszego wynalazku, można rozważyć podawanie leku zgodnie z tym samym schematem dawkowania. Alternatywnie można rozważyć zmniejszenie dawki inhibitora TNF, która, jak wykazano, jest skuteczna w leczeniu pacjenta z AS. [0071] Niniejsze ujawnienie dostarcza sposób wykorzystania markera biologicznego degradacji chrząstki samego lub w kombinacji z markerem biologicznym zapalenia błony maziowej, a także sposób użycia markera biologicznego zapalenia błony maziowej samego lub w kombinacji z markerem biologicznym degradacji chrząstki do określania skuteczności inhibitora TNF w leczeniu AS. [0072] Ponadto analizę degradacji kolagenu i/lub zapalenia błony maziowej stawu można przeprowadzić w oparciu o próbkę od pacjenta, który nie był leczony inhibitorem TNF. Analizę markerów biologicznych degradacji kolagenu i zapalenie błony maziowej stawu można przeprowadzić w celu ustalenia, czy istnieje prawdopodobieństwo, że pacjent odpowie na leczenie przeciwciałem skierowanym przeciwko TNFα, np. adalimumabem. Porównywalny poziom markera biologicznego degradacji kolagenu i/lub zapalenie błony maziowej stawu w próbce od pacjenta w odniesieniu do znanego poziomu standardowego opisanego jako poziom wskaźnikowy dla AS, może sugerować, że wspomniany pacjent jest chory na AS i byłby potencjalnym kandydatem do leczenia inhibitorem TNF. W związku z tym, w celu uniknięcia uszkodzeń strukturalnych które mogą wystąpić w progresji choroby, taki pacjent może być wybrany do leczenia przeciwciałem skierowanym przeciwko TNFα, np. adalimumabem. [0073] W jednym aspekcie niniejszego wynalazku poziom kontrolny bazuje na indywidualnym poziomie odniesienia pacjenta dla markera biologicznego degradacji chrząstki i/lub zapalenia błony maziowej, gdzie poziom odniesienia wyznaczono przez leczeniem inhibitorem TNF. W takiej sytuacji, poziom markera biologicznego degradacji chrząstki i/lub zapalenia błony maziowej stawu, który wyznacza się po leczeniu jest zestawiany z poziomem odniesienia pacjenta. Następnie oznaczanie przeprowadza się w celu określenia czy inhibitor TNF jest skuteczny w oparciu o marker biologiczny degradacji chrząstki i/lub zapalenia błony maziowej stawu obniżony u pacjentów po leczeniu. W innym aspekcie niniejszego ujawnienia, poziom odniesienia wykorzystywany w charakterze kontroli oparty jest na indywidualnym poziomie markera biologicznego degradacji chrząstki i/lub zapalenia błony maziowej stawu pacjenta w danym punkcie leczenia inhibitorem TNF, gdzie poziom odniesienia w danym punkcie czasowym jest porównywany do poziomu markera biologicznego w danym momencie, podczas gdy pacjent kontynuuje leczenie. [0074] W jednym aspekcie niniejszego ujawnienia znany poziom standardowy wyznacza się w oparciu o akceptowany poziom markera biologicznego degradacji chrząstki i/lub zapalenia błony maziowej stawu związany ze stanem choroby np. związany z pacjentem/pacjentami chorymi na AS. Znany poziom 14

16 1 2 3 standardowy markera biologicznego degradacji chrząstki i/lub zapalenia błony maziowej stawu można określić w oparciu o dane od pojedynczego pacjenta z AS lub, alternatywnie, na podstawie średniej uzyskanej w oparciu o dane grupy pacjentów z AS, np. znany standardowy poziom MMP-3 z surowicy pacjenta z AS waha się w zakresie od około -0, około 1-180, około -1, około -1, około - 0, około 0-80, około 2-7, czy około ng/ml. W innym aspekcie niniejszego ujawnienia, znany standardowy poziom CTX-II z moczu pacjenta z AS waha się około 0-00, około 0-800, około 0-600, około 31-39, około 3-390, około 32-38, około 3-380, około 32-38, około , około 33-37, około 3-370, około 34-36, czy około ng/ml. [007] Alternatywnie, w innym aspekcie niniejszego wynalazku, znany poziom standardowy można określić w oparciu o poziom markera biologicznego degradacji chrząstki i/lub zapalenia błony maziowej stawu u zdrowych, nie zmienionych chorobowo osobników. Znany poziom standardowy markera biologicznego degradacji chrząstki i/lub zapalenia błony maziowej stawu można ustalić na podstawie danych od pojedynczego, niezmienionego chorobowo, zdrowego osobnika lub alternatywnie na podstawie średniej z danych uzyskanych od grupy pacjentów z AS. Przykłady prawidłowych wartości CTX-II z moczu tzn. wartości od zdrowych, nie chorujących na AS osobników opisano w Haima (0) Osteo Medical Group Clinical and Technical Monograph and Mouritzen i wsp. (03) Annals ofthe Rheumatic Diseases 62:332. Na przykład, w jednym aspekcie niniejszego wynalazku znany poziom standardowy MMP-3 z surowicy u nie chorujących, zdrowych osobników waha się w granicach od 13 do1 ng/ml (patrz: Chen i wsp. (06) Rheumatology 4:414). [0076] Zakresy pośrednie w stosunku do powyżej opisanych poziomów markera biologicznego np. od około 323 do około 329 mg/ml CTX-II z moczu, są również w zamyśle częścią tego ujawnienia. Ponadto należy uwzględnić przedziały wartości przy użyciu kombinacji dowolny z powyższych opisanych wartości jako górne i/lub dolne limity. Dodatkowo, górne granice opisane powyżej nie mają stanowić ograniczenia w kontekście podniesionych poziomów MMP-3 i CTX-II u pacjentów z AS. [0077] Poziom markera biologicznego degradacji chrząstki stawowej i/lub zapalenie błony maziowej stawu uważa się za zmieniony w stosunku do kontroli tzn. charakterystycznego dla danego pacjenta poziomu przed leczeniem lub znanego poziomu standardowego danego pacjenta, w przypadku, kiedy poziom ten jest wyższy/wzrósł lub niższy/obniżył się w stosunku do kontroli. W jednym wykonaniu poziom markera biologicznego degradacji chrząstki stawowej i/lub zapalenie błony maziowej stawu pacjenta z AS uważa się za wyższy/podwyższony w stosunku do poziomu kontrolnego, jeżeli marker biologiczny degradacji chrząstki i/lub zapalenia błony maziowej stawu jest wyższy/wzrósł w stosunku do poziomu kontroli o ilość, która jest większa niż błąd standardowy testu używanego do wyznaczania tego poziomu. W jednym wykonaniu poziom markera biologicznego degradacji chrząstki stawowej i/lub zapalenie błony maziowej stawu pacjenta z AS uważa się za niższy/obniżony w stosunku do poziomu kontrolnego, jeżeli marker biologiczny degradacji chrząstki i/lub zapalenia błony maziowej stawu jest niższy/obniżył się w stosunku do poziomu kontroli o ilość, która jest większa niż błąd standardowy testu używanego do wyznaczania tego poziomu. W innym wykonaniu poziom markera biologicznego degradacji chrząstki stawowej i/lub zapalenie błony maziowej stawu chorych uważa się za wyższy/podwyższony lub niższy/obniżony w stosunku do poziomu kontrolnego jeżeli marker biologiczny degradacji chrząstki i/lub zapalenia błony maziowej stawu, jeżeli marker biologiczny jest co najmniej dwa, trzy, cztery lub pięć razy wyższy lub niższy niż błąd standardowy i pomiary prób. [0078] W jednym wykonaniu, inhibitor TNF uważany jest za skuteczny, jeżeli poziomy CTX-II u osobnika z AS obniżają się o co najmniej 9% w stosunku do poziomu odniesienia lub znanego poziomu standardowego. 1

17 1 2 3 W jednym wykonaniu inhibitor TNF uważa się za skuteczny, jeżeli poziomy MMP-3 obniżają się o co najmniej 8% w stosunku do poziomu odniesienia lub znanego poziomu standardowego dla osobnika z AS. W kolejnym wykonaniu, inhibitor TNF uważa się za skuteczny, jeżeli poziomy MMP-3 obniżają się o co najmniej 12% w stosunku do poziomu odniesienia lub znanego poziomu standardowego u osobnika z AS. [0079] Zakresy pośrednie do powyżej opisanych poziomów markerów biologicznych np. od około 8% do około %, w zamyśle są również częścią tego wynalazku. Dodatkowo, przedziały wartości przy użyciu kombinacji któregokolwiek z wymienionych powyżej wartości jako górne i/lub dolne granice w zamyśle są częścią tego wynalazku. Dodatkowo, górne granice procentowe opisane powyżej nie mają stanowić ograniczenia w kontekście wyrażonych w procentach obniżonych poziomów MMP-3 i CTX-II u pacjentów z AS, tj. większe spadki procentowe są również w zakresie tego wynalazku. Bardziej szczegółowo, zgodnie z trzecim wykonaniem niniejszy wynalazek dostarcza sposób określania skuteczności adalimumabu w leczeniu zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa (AS) u pacjentów cierpiących na AS. Wspomniany sposób obejmuje oznaczanie poziomu C-końcowego telopeptydu kolagenu typu II (CTX-II) po zakończeniu leczenia oraz oznaczanie poziomu metaloproteinazy 3 macierzy zewnątrzkomórkowej (MMP-3) po zakończeniu leczenia w próbce/próbkach otrzymanych od pacjenta z AS, w których niższy poziom CTX-II po leczeniu w odniesieniu do poziomu CTX-II przed leczeniem oraz niższy poziom MMP-3 po leczeniu w odniesieniu do poziomu MMP-3 przed leczeniem wskazuje na to, że terapia adalimumabem dla danego pacjenta jest skuteczna. Bardziej szczegółowo, zgodnie z czwartym wykonaniem niniejszy wynalazek dostarcza sposób określania skuteczności adalimumabu w leczeniu zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa (AS) u pacjenta z AS. Wspomniany sposób obejmuje oznaczanie poziomu C-końcowego telopeptydu kolagenu typu II (CTX-II) po leczeniu w próbce/próbkach otrzymanych od pacjenta z AS, w których obniżenie poziomu CTX-II o co najmniej 9% w odniesieniu do znanego standardowego poziomu CTX-II w oparciu o próbkę/próbki od pacjenta/pacjentów z AS wskazuje na to, że terapia adalimumabem jest skuteczna. Markery biologiczne degradacji chrząstki stawowej. [0080] Chrząstka stawowa składa się głównie z sieci włókien kolagenu typu II w kompleksie z proteoglikanem agrekanem (patrz Poole AR, 03. Rheum Dis Clin North Am 29: i Eyre (1991) Semin Arthritis Rheum. 21(3 Suppl 2):2-11). W czasie choroby stawów, kolagen typu II jest stopniowo cięty przez kolagenazy. Kolagen typu II ulega takiej degradacji, że produkty tego procesu degradacji można podzielić na trzy grupy w zależności od lokalizacji danego epitopu w cząsteczce kolagenu (artykuł przeglądowy patrz Birmingham i wsp. (06) Biomarker Insights 2:61). [0081] Różne typy epitopów, w tym neoepitopy i epitopy telopeptydów, mogą być wykorzystane jako wskaźniki procesu degradacji związanego z kolagenem. [0082] Dojrzała forma kolagenu typu II składa się z potrójnej helisy z krótkimi telopeptydami na obu końcach. Telopeptydy są kowalencyjnie związane z innymi nićmi kolagenu, co służy do łączenia poszczególnych cząsteczek kolagenu w sztywną siec włókien. Fragmenty dojrzałego kolagenu są wytwarzane w degradacji macierzy zewnątrzkomórkowej tkanki chrzęstnej. Takie fragmenty można znaleźć i mierzyć ich stężenie zarówno w surowicy krwi jak i w moczu jako markery katabolizmu tkanki chrzęstnej. Telopeptydy obejmują col2ctx i CTX-II (WO 91/08478; Christgau i wsp. (01) Bone 29:9; Matyas i wsp. (04) Arthritis Rheum 0:43; i Eyre (1989) Peptide fragments containing HP and LP cross-links, USP ). [0083] Proteoliza powoduje ubytek epitopów kolagenu typu II i jego obecność w płynach ustrojowych. Dlatego analizując epitopy kolagenu typu II w płyny ustrojowe, można ustalić stopień degradacji kolagenu 16

18 1 2 3 (patrz Birmingham i wsp. (06) Biomarker Insights 2:61 i Christgau i wsp. (01) Bone 29:9) Możliwości monitorowania, spowalniania lub nawet odwracania procesu degradacji kolagenu jest istotna z klinicznego punktu, ponieważ intensywna degradacja usieciowanych włókien dojrzałego kolagenu typu II jest uważana za krytyczne, a nawet nieodwracalne stadium uszkodzenia stawu (Billinghurst i wsp. (1997)). [0084] Sposób tu opisany wykorzystuje markery biologiczne degradacji chrząstki do określenia skuteczności inhibitora TNF w leczeniu AS, którego jednym z nieodłącznych elementów jest uszkodzenie strukturalne tj. uszkodzenie stawu. Zgodnie z opisanymi tutaj wykonaniami, jako marker biologiczny rozpadu tkanki chrzęstnej w sposobach według wynalazku wykorzystuje się CTX-II, który jest zlokalizowany niemal wyłącznie w chrząstce. CTX-II [008] W korzystnym wykonaniu C-końcowy telopeptyd kolagenu typu II (CTX-II) jest markerem biologicznym degradacji kolagenu. CTX-II jest fragment kolagenu, pochodzącym z C-końca kolagenu typu II. CTX-II jest taki sam jak neoepitop Col2CTx, zlokalizowany na C-końcu ciętego fragmentu o ¼ długości kolagenu typu II (artykuł przeglądowy, patrz Birmingham i wsp. (06)). [0086] CTX-II jest znany jako marker biologiczny degradacji chrząstki stawowej. Po raz pierwszy powiązano ten marker z degradacja chrząstki u chorych z chorobą zwyrodnieniową stawu kolanowego (Garnero i wsp. (01) Annals Rheum Dis 60:619)], w której oznaczono kolejne wzrosty poziomu CTX-II w moczu chorych wraz z postępem ciężkiej choroby zwyrodnieniowej stawów (Jung i wsp. (04) Pathobiol 71:70). Pokazano, że CTX-II koreluje ze stopniem zniszczenia stawów (Christgau i wsp. (01) Bone 29:9; Garnero i Delmas (03) Curr Op Rheumat 2:641). [0087] W jednym aspekcie, niniejsze ujawnienie dostarcza sposób określania skuteczności inhibitora TNFα w leczeniu AS obejmujący porównanie wcześniej wyznaczonego poziom CTX-II u pacjenta po leczeniu inhibitorem TNFα ze znanym poziomem standardowym CTX-II związanym z AS. Następnie dokonuje się oceny zależności pomiędzy tymi dwoma poziomami CTX-II aby określić, czy poziom CTX-II po leczeniu jest niższy niż znany poziom standardowy CTX-II. Obniżony poziom CTX-II w odniesieniu do znanego standardu odpowiadającego stanowi chorobowemu związanego z AS wskazuje na to, że inhibitor TNFα jest skuteczny w leczeniu pacjentów z AS. W takiej sytuacji, znany poziom standardowy odpowiada poziomowi CTX-II u pacjenta z aktywnym AS np. u pacjenta chorego i nie leczonego. [0088] W szczególności, zgodnie z czwartym wykonaniem niniejszy wynalazek dostarcza sposób określania skuteczności adalimumabu w leczeniu zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa (AS) u pacjentów z AS. Wspomniany sposób obejmuje oznaczanie poziomu C-końcowego telopeptydu kolagenu typu II (CTX-II) po leczeniu w próbce/próbkach otrzymanych od pacjentów z AS, w których obniżenie poziomu CTX-II o co najmniej 9% w odniesieniu do znanego standardowego poziomu CTX-II w oparciu o próbkę/próbki od pacjentów z AS wskazuje na to, że terapia adalimumabem dla danego pacjenta jest skuteczna. [0089] W innym aspekcie, niniejsze ujawnienie dostarcza sposób określania skuteczność inhibitora TNFα w ograniczaniu uszkodzenia strukturalnego związanego z zesztywniającym zapaleniem stawów kręgosłupa (AS), obejmujący porównanie wcześniej wyznaczonego poziomu CTX-II u pacjentów z AS po leczeniu inhibitorem TNFα ze znanym poziomem standardowym CTX-II związanym z AS. Następnie dokonuje się oceny tych dwóch poziomów CTX-II aby określić, czy poziom CTX-II u pacjenta po leczeniu jest niższy niż znany poziom standardowy CTX-II. Jeżeli poziom CTX-II u pacjenta jest niższy w odniesieniu do znanego poziomu standardowego, taki wynik wskazuje na to, że inhibitor TNFα skutecznie hamuje uszkodzenia strukturalne związane z AS. 17

19 1 2 3 [0090] W jednym aspekcie, niniejsze ujawnienie opisuje sposób określania skuteczności inhibitora TNFα w leczeniu AS obejmujący porównanie wcześniej wyznaczonego poziom CTX-II u pacjenta po leczeniu z wcześniej wyznaczonym poziomem CTX-II u pacjenta przed leczeniem. Następnie dokonuje się oceny dotyczącej tych dwóch poziomów CTX-II określając, czy po leczeniu poziom CTX-II jest niższy niż poziom CTX-II przed leczeniem, przy czym niższy poziom CTX-II po leczeniu w odniesieniu do poziomu CTX-II przed leczeniem wskazuje na to, że inhibitor TNFα jest skuteczny w leczeniu pacjentów z AS. Markery biologiczne zapalenie błony maziowej stawu. [0091] Obecnie wiadomo, że zapalenie błony maziowej stawu (stan zapalny) pojawia się wcześnie w przebiegu chorób o podłożu zapalnym, takich jak choroba zwyrodnieniowa stawów, i jest związane z progresją choroby widoczną w badaniach radiologicznych. To proces, w którym stan zapalny, w tym bezobjawowy stan zapalny, może zaostrzyć uszkodzenie stawu, najprawdopodobniej zmiany w funkcjonowaniu chondrocytów, wzmożona angiogeneza i/lub przyspieszenie w obrocie kostnym. (Bonnet i Walsh DA. (0) Rheumatology 44:7-16). Niniejsze ujawnienie wykorzystuje markery biologiczne błony maziowej do określania skuteczności inhibitora TNF w leczeniu AS. W jednym aspekcie, MMP-3 z surowicy, która najprawdopodobniej pochodzi ze stawu objętego zapaleniem (Kruithof i wsp. (0) Arthritis Rheum 2:3898), jest wykorzystywana jako marker biologiczny zapalenia błony maziowej stawu do określenia skuteczności inhibitora TNF w leczeniu AS. MMP-3 [0092] W degradacji cząsteczek macierzy tkanki chrzęstnej biorą udział zależne od jonów cynku endopeptydazy zwana metaloproteinazami macierzy zewnątrzkomórkowej. Rodzina zależnych od cynku endopeptydaz (MMP) trawi składowe macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), takie jak kolageny i proteoglikany. Rodzina MMP pośredniczy w różnego rodzaju procesach fizjologicznych trawiąc macierz zewnątrzkomórkową. [0093] MMP-3 jest enzymem, który degraduje fibronektynę, lamininę, kolagen typu III, IV, IX i X oraz proteoglikany tkanki chrzęstnej. Obecnie istnieje co najmniej rodzajów ludzkich MMP, podzielonych na grupy według struktury i specyficzności substratowej: kolagenaza (MMP-1, -8, -13), stromielizyna, żelatynaza (MMP-2, -9) i matrylizyny (patrz, np. Nabeshima K i wsp. 02 Pathol Int 2: 2-64). [0094] W korzystnym aspekcie niniejszego ujawnienia marker biologiczny zapalenia błony maziowej użyty w wynalazku to MMP-3. Pokazano, że stężenie MMP-3 jest podwyższone w chorobach reumatoidalnych o podłożu zapalnym charakteryzującym się zapaleniem błony maziowej stawu takim jak reumatoidalne zapalenie stawów, łuszczycowe zapalenie stawów oraz chondrokalcynoza. Uznaje się, że stężenie MMP-3 w surowicy jest wynikiem zapalenia błony maziowej stawów (patrz Ribbens i wsp. (02) Annals of the Rheumatic Diseases 61:161). Ponadto, w dotychczasowych badaniach skorelowano metaloproteinazę macierzy zewnątrzkomórkowej (MMP), konkretnie MMP-3 (stromielizyna 1) z wartością indeksu BASDAI u pacjentów z AS (patrz Yang, C. i wsp. (04) Arthritis Rheum 1:691-9). [009] Sekwencja aminokwasowa MMP-3 jest znana i można ją odnaleźć na przykład w GenBank pod numerem AAI Sekwencja nukleotydowa MMP-3 jest również znana i można ją odnaleźć na przykład w GenBank pod numerem NM [0096] W dalszej kolejności wynalazek obejmuje zastosowanie markera biologicznego degradacji chrząstki, w szczególności CTX-II oraz markera biologicznego zapalenia błony maziowej stawu, w szczególności MMP-3, tego pierwszego osobno lub w połączeniu z tym drugim do realizacji sposobów według wynalazku. 18

20 1 2 3 Ponadto wynalazek można stosować w połączeniu z białkiem C-reaktywnym do dokładniejszego określania skuteczności inhibitora TNF w leczeniu AS. [0097] Poziom białka C-reaktywnego (CRP) można wykorzystać w połączeniu z markerem biologicznym degradacji chrząstki np. CTX-II, i markerem zapalenia błony maziowej np. MMP-3, jako wskaźnik stanu choroby i skuteczności terapii przeciwko TNF. CRP należy do rodziny białek pentraksyn nazywanych tak ze względu na to, ze zbudowane są z pięciu identycznych podjednostek, kodowanych przez pojedynczy gen na chromosomie 1. Podjednostki te asocjują tworząc stabilną pentastrukturę podobną do dysku. CRP jest wytwarzane wyłącznie w wątrobie i wydzielane w zwiększonych ilościach w ciągu 6 godzin od rozpoczęcia ostrego zapalenia. Podwyższone stężenie białka CRP służy jako czuły indeks bieżącego stanu zapalnego, zapewniają wartościowe narzędzie pomocnicze do starannej oceny klinicznej. Testy do wyznaczania poziomu markerów biologicznych [0098] Poziom markerów biologicznych degradacji chrząstki stawowej i/lub zapalenie błony maziowej stawu można analizować szeregiem technik znanych w stanie techniki. Wszelkie metody znane w stanie techniki odpowiednie do wykrywania i analizy ilościowej markerów biologicznych degradacji chrząstki oraz zapalenia błony maziowej w próbce od pacjenta można wykorzystać w sposobach według wynalazku (zarówno na poziomie kwasu nukleinowego jak i białka). Takie metody są powszechnie znane w stanie techniki i obejmują, lecz nie są ograniczone do metody Western blot, Northern blot, Southern blot, immunohistochemia, ELISA, np. ELISA o podwyższonej czułości, analiza ilościowa we krwi, np. ELISA testująca surowicę, testy ilościowe w moczu, np. sprawdzanie poziomów ekspresji białek lub degradacji w przypadku CXT-II, immunoprecypitacja, immunofluorescencja, cytometria przepływowa, immunocytochemia, analiza technikami spektrometrii masowej np. MALDI-TOF i SELDI-TOF, techniki hybrydyzacji kwasu nukleinowego, metody odwrotnej transkrypcji, oraz metody namnażania kwasu nukleinowego. Przykłady takich analiz są bardziej szczegółowo opisane poniżej: Testy oparte na białkach. [0099] Do wyznaczenia poziomu danego markera biologicznego sposobem według wynalazku mogą służyć testy przeprowadzane na poziomie białka/w oparciu o białko. Przykłady testów w oparciu o białka obejmują analizy immunohistochemiczne i/lub Western blot, testy ilościowe w oparciu o krew np. analiza surowicy w teście ELISA, oraz ilościowy test moczu np. test ELISA. W jednym wykonaniu do ilościowej oceny danego markera biologicznego służy test immunologiczny. [00] Białka z prób od pacjentów można izolować metodami znanymi specjalistom w dziedzinie. Użyte metody izolacji białka mogą być przykładowo takie, jak opisane w (Harlow and Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). [01] Ilość markera biologicznego degradacji chrząstki stawowej lub zapalenie błony maziowej stawu można ustalić, wykrywając obecność lub oznaczając ilość wyrażanego polipeptydu. Obecność i ilość polipeptydu można ustalić dowolnym narzędziem znanym w stanie techniki specjalistom w dziedzinie. Narzędzia te obejmują metody analizy biochemicznej takie jak elektroforeza, elektroforeza kapilarna, wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC), chromatografia cienkowarstwowa (TLC), chromatografia hiperdyfuzyjna i podobne, oraz rożnego rodzaju metody immunologiczne takie jak reakcja precypitacji w płynie lub żelu, immunodyfuzja (pojedyncza lub podwójna), immunoelektroforeza, radiografia (RIA), test immunoenzymatyczny (ELISA), testy immunofluorescencyjne oraz Western blot. [02] W jednym wykonaniu poziom markera biologicznego degradacji chrząstki lub zapalenia błony maziowej stawu można ustalić przy użyciu testu z wykorzystaniem przeciwciał. Zastosowanie przeciwciał 19

21 1 2 3 skierowanych przeciwko tu opisanym markerom biologicznym można zastosować do przeszukiwania próbek biologicznych pochodzenia ludzkiego, np. płynów, pod kątem poziomu specyficznych antygenów o charakterze markera biologicznego np. kolagenu, markera biologicznego degradacji kolagenu i/lub zapalenia błony maziowej stawu. Dla przykładu, płyny ustrojowe, takie jak surowica krwi lub mocz, można pobrać od pacjenta i testować na obecność specyficznych epitopów, zarówno w postaci uwolnionego antygenu jak i związanego z błoną na powierzchni komórki w płynie ustrojowym, stosując przeciwciała skierowane przeciwko markerom biologicznym np. w testach RIA lub ELISA znanych w stanie techniki. Przeciwciała wykorzystywane w takich metodach to korzystnie przeciwciała monoklonalne. W jednym wykonaniu in vitro immunoserologiczna ocena surowic pobranych od pacjentów pozwala na nieinwazyjną ocenę postępu choroby lub zahamowanie degradacji chrząstki, jak również zaostrzenie się lub zmniejszenie zapalenia błony maziowej w oparciu o poziomy odpowiadających markerów biologicznych w surowicy. W jednym wykonaniu, przeprowadza się test immunologiczny do ilościowej oceny degradacji chrząstki, mierzący poziom CTX-II w ludzkim moczu. W jednym wykonaniu przeprowadza się ilościową ocenę zapalenia błony maziowej mierząc poziomy MMP-3 w ludzkiej surowicy. [03] W teście immunologicznym czynnikiem do wykrywania polipeptydowego markera biologicznego degradacji chrząstki lub zapalenia błony maziowej może być przeciwciało zdolne do wiązania białka markera biologicznego degradacji chrząstki lub zapalenia błony maziowej stawu. Przeciwciała mogą być poliklonalne lub korzystniej monoklonalne. Można użyć zarówno przeciwciało pełne jak i jego fragment (np. Fab lub F(ab') 2 ). [04] W jednym wykonaniu w testach immunologicznych stosuje się przeciwciała skierowane przeciwko CTX-II, w tym przeciwko CTX-II w moczu, np. w teście ELISA, do określenia poziomu CTX-II w próbce od pacjenta. W jednym wykonaniu poziomy CTX-II można mierzyć zarówno w próbce moczu jak i surowicy od pacjenta. W jednym wykonaniu przeciwciałem, które można stosować w metodach i kompozycjach według niniejszego wynalazku do wykrywania i oznaczania ilościowego ludzkiego CTX-II w moczu jest przeciwciało monoklonalne mabf46 (patrz: Christgau i wsp. (01) Bone 29:9) i F4601 (patrz Oestergaard i wsp. (06) Osteoarthritis Cartilage. 14(7):670). [0] W jednym wykonaniu w testach immunologicznych stosuje się przeciwciała skierowane przeciwko MMP-3, w tym przeciwko MMP-3 w surowicy, np. w teście ELISA, do określenia poziomu MMP-3 w próbce od pacjenta z AS. W jednym wykonaniu poziomy MMP-3 można mierzyć w próbce surowicy od pacjenta. W jednym wykonaniu przeciwciało do wykrywania i oceny ilościowej ludzkiego MMP-3 w surowicy jest przeciwciałem monoklonalnym mab1b4 (Murray GI i wsp. Gut 43:791-7 (1998)). [06] Do określania poziomu białka odpowiadającego markerowi biologicznemu degradacji kolagenu i/lub zapaleniu błony maziowej stawu można stosować Test wiązania kompetycyjnego. Jednym z przykładów testu kompetycyjnego wiązania jest test immunoenzymatyczny (ELISA). Test ELISA można stosować do wykrywania obecności markera biologicznego degradacji kolagenu i/lub zapalenia błony maziowej stawu. ELISA jest czułym testem, który wykorzystuje enzym przyłączony do przeciwciała lub antygenu jako marker detekcji specyficznego białka, w szczególności antygenu lub przeciwciała. ELISA jest testem, w którym związany antygen lub przeciwciało jest wykrywane poprzez przyłączony enzym, który generalnie zamienia bezbarwny substrat na barwny produkt lub produkt wykrywalny. Jednym z najbardziej popularnych typów testu ELISA jest ELISA kanapkowa. W jednym wykonaniu poziom markera biologicznego degradacji chrząstki i/lub zapalenia błony maziowej stawu można ustalić przy użyciu testu ELISA.

22 1 2 3 [07] Dodatkowo, specjalista w dziedzinie potrafi bez trudu dostosować metody wykrywania znanego białka/przeciwciała na potrzeby określania ilości markera według niniejszego wynalazku (tzn. CTX-II i/lub MMP-3). [08] Metody testowania CTX-II jako markera biologicznego uszkadzania stawów są znane w sztuce i opisane, na przykład w Oestergaard i wsp. (06) Osteoarthritis Cartilage. 14(7):670 i Mouritzen i wsp. (03) Annals of the Rheumatic Diseases 62:332, włączony niniejszym przez odniesienie. Testy do oznaczania poziomów CTX-II są dostępne komercyjnie. Przykładem takich testów jest np. Urine Cartilaps i Serum Cartilaps (Nordic Bioscience Diagnostics). Test Urine Cartilaps wykorzystano w badaniach klinicznych do ilościowej oceny degradacji chrząstki w reumatoidalnym zapaleniu stawów oraz kości. Przykładowo Urine CartiLaps ELISA jest oparty na wiązaniu kompetycyjnym przeciwciała monoklonalnego do fragmentów kolagenu typu II w moczu tj. do CTX-II lub do biotynylowanych, syntetycznych peptydów związanych z powierzchnią płytki opłaszczonej streptawidyną. Początkowo biotynylowane, syntetyczne peptydy związane są z powierzchnią dołków płytki opłaszczonych streptawidyną. Po przemyciu, do dołków pipetowane są standardy, kontrole i próbki moczu, następnie dodawany jest roztwór przeciwciała monoklonalnego. Po kolejnym przemyciu do dołków dodawany jest roztwór króliczego przeciwciała antymysz skoniugowanego z peroksydazą. Po kolejnym przemyciu do dołków dodawany jest chromogeniczny substrat, a reakcja kolorymetryczna zostaje zatrzymana kwasem siarkowym i następuje pomiar absorbancji. Kolejne przykłady dotyczące sposobu oznaczania CTX-II za pomocą testu ELISA są opisane w Christgau (01), Bone 29:9. [09] W jednym wykonaniu przeprowadza się test immunologiczny do wykrywania poziomu markera biologicznego MMP-3 zapalenia błony maziowej w ludzkiej surowicy. Metody testowania MMP-3 jako markera biologicznego zapalenia błony maziowej stawu są znane w stanie techniki, jak opisano np. w Tamarat i wsp. (03) PNAS 0: 8. Dodatkowo, komercyjnie dostępne zestawy do badania poziomu białka MMP-3 zawierają system Human Matrix Metalloproteinase-3 Biotrak ELISA (Amersham) (patrz również Yang i wsp. (04) Arthritis i Rheumatism 1:691). Kolejne przykłady opisujące sposób oznaczania białka MMP-3 opisano w Chen i wsp. (06) Rheumatology 4:414. [01] W jednym wykonaniu przeciwciała lub fragmenty przeciwciał są wykorzystywane w metodach wykrywania wyrażanego białka, takich jak Western blot, czy immunofluorescencja. Zasadniczo takich przypadkach najkorzystniej przeciwciało lub białko jest unieruchomione na powierzchni podłoża stałego. Odpowiednie do tego celu podstawy lub nośniki fazy stałej obejmują dowolny nośnik (podstawę) zdolny do wiązania antygenu lub przeciwciała. Dobrze znane nośniki obejmują takie materiały jak szkło, polistyren, polipropylen, polietylen, dekstran, nylon, amylazę, naturalną lub modyfikowaną celulozę, poliakrylamidy, gabros i magnetyt. [0111] Specjalista w dziedzinie będzie znał wiele różnych innych nośników odpowiednich do wiązania przeciwciała lub antygenu i będzie w stanie przystosować taki nośnik do zastosowania według niniejszego wynalazku. Przykładowo, białka wyizolowane z komórek można rozdzielić w elektroforezie na żelu poliakrylamidowym i unieruchamiać na nośniku fazy stałej, takim jak nitroceluloza. Nośnik ten można przemywać odpowiednimi buforami, a następnie traktować przeciwciałami znakowanymi wykrywalnym znacznikiem. Aby usunąć niezwiązane przeciwciało, nośnik fazy stałej powtórnie przemywa się buforem. Ilość związanego znacznika na nośniku fazy stałej można wykryć metodami konwencjonalnymi. Narzędzia do wykrywania białek przy użyciu technik elektroforetycznych są dobrze znane specjalistom w dziedzinie 21

23 1 2 3 (patrz generalnie R. Scopes (1982) Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y.; Deutscher, (1990) Methods in Enzymology Tom 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc., N.Y.). [0112] Inne standardowe metody, wykorzystujące przeciwciała do wykrywania i oceny ilościowej degradacji kolagenu i/lub zapalenia błony maziowej stawu, obejmują, ale nie ograniczają się do radiografii (RIA), testów receptorowych, testów immunoenzymatycznych ( EIA ), biotestów cytochemicznych, testów z ligandem, immunoradiograficznych testów oraz testów immunoenzymatycznych ( ELISA ). Kolejna metoda obejmuje, ze względu na łatwość detekcji i charakter ilościowy, test kanapkowy lub istniejący w wielu wariantach test z dwoma przeciwciałami, z których wszystkie testy w zamyśle mieszczą się w zakresie niniejszego wynalazku. Metody te są dobrze znane specjalistom w dziedzinie, którzy rozumieją, że wymagają one odpowiedniej ilości eksperymentów w celu optymalizacji oddziaływań między przeciwciałami a antygenami oraz optymalizacji detekcji antygenów za pomocą przeciwciał. Te i inne techniki immunologiczne można znaleźć w Principles And Practice Of Immunoassay, Wyd. 2, Price and Newman, red., MacMillan (1997) and Antibodies, A Laboratory Manual, Harlow and Lane, red., Cold Spring Harbor Laboratory, roz. 9 (1988). [0113] Przeciwciała, wykorzystywane do wykrywania poziomów markerów biologicznych w testach immunologicznych znanych w stanie techniki i tu opisanych, można znakować wykrywalnym znacznikiem. Określenie wyznakowany w kontekście próbki lub przeciwciała, w zamyśle obejmuje bezpośrednie znakowanie próbki lub przeciwciała przez sprzęganie (tj. fizyczne łączenie) wykrywalnej substancji do próbki lub przeciwciała, jak również pośrednie znakowanie próbki lub przeciwciała w reakcji z innym reagentem, który jest znakowany w sposób bezpośredni. Przykłady znakowania pośredniego obejmują detekcję pierwszorzędowego przeciwciała przy użyciu fluorescencyjnie znakowanego drugorzędowego przeciwciała, oraz znakowanie końców próbki DNA biotyną w taki sposób, że można ją wykryć fluorescencyjnie znakowaną streptawidyną. [0114] W jednym wykonaniu, przeciwciało jest znakowane np. radioaktywnie, chromoforem, fluoroforem lub enzymem. W innym wykonaniu pochodna przeciwciała (np. przeciwciało sprzężone z substratem, z białkiem lub ligandem pary białko ligand np. biotyna-streptawidyna) lub fragmenty przeciwciała (np. przeciwciało jednołańcuchowe, izolowana domena zmienna przeciwciała, itd.), która wiąże specyficznie białko degradacji chrząstki lub białko zapalenia błony maziowej [011] W jednym wykonaniu niniejszego wynalazku do wykrywania i ilościowej analizy markera biologicznego uszkodzenia chrząstki lub zapalenia błony maziowej stawu wykorzystuje się metody proteomiczne, np. spektrometrię mas. Przykładowo, spektrometria masowa typu MALDI-TOF wykorzystująca jonizację-desorpcję przy pomocy lasera z matrycy stałej lub jej wariant (SELDI-TOF MS), w którym miejsce naniesienia próbki jest dodatkowo modyfikowane chemicznie, próbkę biologiczną, taką jak surowica nanosi się na chip wiążący białko (Wright, G. L., Jr., i wsp. Normal 0 21 (02) Expert Rev Mol Diagn 2:49; Li, J., i wsp. (02 R.) Clin Chem 48:1296; Laronga, C., i wsp. (03 ) Dis znaczników 19:229; Petricoin, E. F., i wsp. (02) 39:72; Adam, B. L., i wsp. (02) Cancer Res 62:3609; Tolson, J., i wsp. (04) Laboratorium inwestowania 84:84; Xiao, Z. i wsp. (01) Cancer Res 61:6029) można użyć do detekcji i analizy ilościowej markera biologicznego degradacji chrząstki i zapalenia błony maziowej stawu. Metody spektrometrii masowej są opisane na przykład w patencie USA nr,622,824,,60,798 i,47,83. RNA [0116] W jednym wykonaniu, poziom mrna kodujący wspomniany marker biologiczny można mierzyć wykorzystując metody znane specjalistom w dziedzinie np. analizę Northern. Ekspresję genów markera biologicznego można wykrywać na poziomie RNA. RNA można izolować z komórek wykorzystując techniki 22

24 1 2 3 izolacji RNA obejmujące np. użycie kwasu fenol/izotiocjanian guanidyny (RNAzolB, BIogenesis), zestaw RNease (Qiagen) lub PAXgene (PreAnalytix, Szwajcaria). Typowe formy testów wykorzystujące hybrydyzację kwasu rybonukleinowego obejmują nuclear run-on assay, RT-PCR, RNase protection assays (Melton i wsp., Nuc. Acids Res. 12:703), Northern blot i In Situ hybridization. Ekspresja genów może być również wykrywana analizą na mikromacierzy jak opisano poniżej. [0117] Na potrzeby Norther blott próbki RNA są najpierw elektroforetycznie rozdzielane pod względem wielkości w żelu agarozowym w warunkach denaturujących. RNA jest następnie transferowane na membranę, sieciowane i hybrydyzowane ze znakowaną sondą. Wysokospecyficzne, znakowane izotopowo lub nieizotopowo sondy uzywane do tego celu obejmują sondy DNA znakowane losowo na całej długości metodą random-priming, nick-translating, sondy wygenerowane w reakcji transkrypcji RNA in vitro i oligonukleotydy. Dodatkowo, jako sondy można użyć sekwencje jedynie częściowo homologiczne (np. cdna pochodzące z innych gatunków lub fragmenty genomowego DNA, które mogą zawierać exon). [0118] Test NPA (ang. Nuclease Proteciton Assay) (zarówno test typu ribonuclease protection assay jak i S 1 nuclease assay " jest niezwykle czułą metodą zarówno jakościową (wykrywanie obecności mrna) jak i ilościową (określanie ilości mrna). Podstawą NPA jest hybrydyzacja w roztworze sond antysensownych (znakowanych izotopowo lub nieizotopowo) z próbką RNA. Po hybrydyzacji, jednoniciowe sondy lub cząsteczki RNA, które nie uległy hybrydyzacji są degradowane przez nukleazy. Pozostałe chronione fragmenty są rozdzielane w żelu akrylamidowym. Test NPA pozwala na jednoczesne wykrywanie RNA kilku gatunków. [0119] Hybrydyzacja in situ (ISH) to wydajne i wszechstronne narzędzie do lokalizacji konkretnych cząsteczek mrna w komórkach i tkankach. Hybrydyzacja sondy odbywa się w obrębie danej komórki lub tkanki. Ze względu na to, że integralność struktury komórkowej jest utrzymywana przez cały czas trwania procedury, ISH dostarcza informacji o lokalizacji mrna w próbce tkanki. [01] Wspomniana procedura rozpoczyna się od utrwalenia próbek w buforowanej formalinie o neutralnym ph i zatopienie ich w parafinie. Próbki są następnie cięte na cienkie skrawki i umieszczane na szkiełkach mikroskopowych. Alternatywnie, tkanka może być najpierw zamrażana, następnie cięta na skrawki i utrwalana w parafolmaldehydzie. Po serii przemywań, w celu usunięcia wosku i nawilżenia skrawków, następuje etap trawienia Proteinazą K. Celem trawienia jest zwiększenie dostępności struktur komórkowych dla sondy. Kolejnym krokiem jest hybrydyzacja skrawków ze znakowanymi sondami. Sondy znakowane izotopowo są wizualizowane za pomocą płynnej warstwy schnącej na szkiełku mikroskopowym, podczas gdy sondy znakowane nieizotopowo są konwencjonalnie wykrywane za pomocą odczynników fluorescencyjnych lub odczynników do reakcji kolorymetrycznej. Ta ostatnia metoda jest podstawą techniki hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (ang. Fluorescent In Situ Hybridisation (FISH)). [0121] Metody wykrywania które można tu zastosować, obejmują znaczniki izotopowe, enzymatyczne, chemiluminescencyjne, fluorescencyjne i inne odpowiednie dla tej techniki znaczniki. [0122] Zazwyczaj do namnażania docelowego RNA używana jest technika RT-PCR. W procesie tym, enzym odwrotnej transkryptazy jest używany do przepisania RNA na komplementarną cząsteczkę DNA (cdna), która następnie w celu łatwiejszej detekcji może być namnażana. Względna ilościowa reakcja RT-PCR obejmuje namnożenie wewnętrznej kontroli jednocześnie z genem będącym przedmiotem zainteresowania. Kontrola wewnętrzna jest stosowana do normalizacji próbek, która umożliwia porównanie względnych ilości określonego mrna między poszczególnymi próbkami. Powszechnie stosowane kontrole wewnętrzne obejmują na przykład, GAPDH, HPRT, genu aktyny i cyklofiliny. 23

25 1 2 3 [0123] Znanych jest wiele metod namnażania DNA. Większość z nich opiera się na enzymatycznej reakcji łańcuchowej (takiej jak reakcja łańcuchowa polimerazy, reakcja łańcuchowa ligazy, lub metoda samopodtrzymującej się replikacji sekwencji - 3SR (ang. self-sustained sequence replication) [0124] Wiele metod namnażania sekwencji docelowych i wzmacniania sygnału (TAS) opisano w literaturze np. w artykułach przeglądowych na temat tych metod: Landegren, U. i wsp., Science 242: (1988) i Lewis, R., Genetic Engineering News :1, 4- (1990)). PCR jest techniką namnażania kwasu nukleinowego znaną w stanie techniki i opisaną miedzy innymi w patencie USA Nr. 4,683,19 and 4,683,2. W diagnostyce PCR można użyć do namnażania dowolnego kwasu nukleinowego ((Mok i wsp., 1994, Gynaecologic Oncology 2:247-22). Technika 3SR jest wariantem TAS, i obejmuje namnażanie izotermalne matrycy kwasu nukleinowego poprzez kolejne cykle reakcji odwrotnej transkrypcji (RT), etap aktywności polimerazy i nukleazy, które działają w mieszaninie, oraz odpowiednie startery oligonukleotydowe (Guatelli i wsp., 1990). Natl. Acad. Sci. USA 87:1874). Reakcja namnażania z ligacją lub system namnażania z ligacją wykorzystuje ligazę DNA oraz cztery oligonukleotydy - dwa na każdy koniec docelowej nici. Technika ta jest opisana przez Wu, D. Y. i Wallace, R. B., 1989, Genomics 4:60. W Q.beta. technikę replikacji, replikazę RNA z bakteriofaga Q.beta., która replikuje jednoniciowy RNA, wykorzystuje się do namnażania docelowego DNA, jak opisano w Lizardi i wsp., 1988, Bio/Technology 6:1197. Ilościowa reakcja PCR (Q-PCR) jest techniką, która umożliwia oszacowanie względnych ilości transkryptów w badanej próbce. III. Inhibitory TNF [012] Niniejsze ujawnienie opisuje metodę określania skuteczności inhibitora TNF np. przeciwciała skierowanego przeciwko ludzkiemu TNFα lub części tego przeciwciała wiążącej antygen, w leczeniu zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa (AS). Niniejsze ujawnienie dostarcza również sposób monitorowania skuteczności inhibitora TNFα np. przeciwciała skierowanego przeciwko ludzkiemu TNFα lub części tego przeciwciała wiążącej antygen, w hamowaniu uszkodzenia strukturalnego związanego ze zesztywniającym zapaleniem stawów kręgosłupa (AS) u pacjenta. Niniejsze ujawnienie dalej opisuje metodę prognozowania skuteczności inhibitora TNF np. przeciwciała skierowanego przeciwko ludzkiemu TNFα lub części tego przeciwciała wiążącej antygen, w leczeniu pacjentów z AS. Kompozycje i zestawy związane z ujawnionymi tu sposobami są także traktowane jako cześć tego ujawnienia. [0126] W jednym aspekcie, sposoby te obejmują określenie skuteczności izolowanych ludzkich przeciwciał, lub ich części wiążących antygen, które wiążą z wysokim powinowactwem i niską stałą dysocjacji oraz posiadają dużą zdolności neutralizacji. Korzystnie, ludzkie przeciwciała stosowane w niniejszym ujawnieniu są rekombinowanymi przeciwciałami skierowanymi przeciwko ludzkiemu TNFα i neutralizującymi ludzki TNFα. Rekombinowane przeciwciała neutralizujące według niniejszego wynalazku nazwane są tu D2E7, a także HUMIRA i adalimumab (sekwencję aminokwasową regionu VL przeciwciała D2E7 przedstawiono w SEK ID NR: 1; sekwencję aminokwasową regionu VH przeciwciała D2E7 przedstawiono w SEK ID NR: 2). Właściwości D2E7 (adalimumab / HUMIRA ) zostały opisane w Salfeld i wsp., patent USA nr ; ; i [0127] Sposoby leczenia reumatoidalnego zapalenia stawów według niniejszego wynalazku mogą być również wykonywane z wykorzystaniem chimerycznych lub humanizowanych mysich przeciwciał skierowanych przeciwko htnfα, które przeszły testy kliniczne (patrz Elliott, M. J., i wsp., (1994) Lancet 344: ; Elliot, M.J., i wsp. (1994) Lancet 344:1-11; Rankin, E.C., i wsp. (199) Br. J. Rheumatol. 34: ). 24

26 1 2 3 [0128] W jednym wykonaniu sposób według wynalazku obejmuje określenie skuteczności w leczeniu AS przeciwciał D2E7 i ich fragmentów, przeciwciał podobnych do D2E7 i części tych podobnych przeciwciał oraz innych ludzkich przeciwciał oraz części tych ludzkich przeciwciał o właściwościach odpowiadających przeciwciałom D2E7, takich jak wysokie powinowactwo do htnfα, niska kinetyka dysocjacji i wysoka zdolność neutralizacji. W jednym wykonaniu niniejszy wynalazek dostarcza sposób leczenia za pomocą izolowanych ludzkich przeciwciał lub części tych przeciwciał, które oddysocjowują od TNFα z K d w zakresie 1 x -8 M lub wartością mniejszą i K off stałą o wartości 1 x -3 s -1 lub stałą o wartości mniejszej. Obie stałe wyznaczono za pomocą powierzchniowego rezonansu plazmonowego. Przeciwciała według wynalazku neutralizują cytotoksyczność ludzkiego TNFα w standardowym teście in vitro z komórkami L929 z IC 0 o wartości 1 x -7 M lub mniejszej. Korzystniej izolowane ludzkie przeciwciało lub jego cześć wiążąca antygen oddysocjowuje od ludzkiego TNFα ze stałą K off o wartości x -4 s -1 lub mniejszej, lub nawet korzystniej ze stałą K off o wartości 1 x -4 s -1 lub mniejszej. Korzystniej izolowane ludzkie przeciwciało lub część tego przeciwciała wiążąca antygen neutralizuje cytotoksyczność ludzkiego TNFα w standardowym teście in vitro z komórkami L929 z IC 0 o wartości 1 x -8 M lub mniejszej, lub korzystniej z IC 0 o wartości 1 x -9 M lub mniejszej, i jeszcze bardziej korzystniej z IC 0 o wartości 1 x - M lub mniejszej. W korzystnym wykonaniu przeciwciało jest izolowanym ludzkim rekombinowanym przeciwciałem lub jego częścią wiążącą antygen. [0129] Na podstawie stanu techniki wiadomo, że domeny CDR3 ciężkiego i lekkiego łańcucha przeciwciała odgrywają ważną rolę w specyficzności wiązania/powinowactwie przeciwciała do antygenu. W związku z powyższym, w innym aspekcie, wynalazek odnosi się do sposobów przewidywania odpowiedzi pacjenta na leczenie, gdzie leczenie obejmuje podanie ludzkich przeciwciał, które charakteryzują się wolną kinetyką dysocjacji od htnfα, a struktura domen CDR3 ciężkiego i lekkiego łańcucha jest identyczna lub podobna do przeciwciał D2E7. W pozycji 9 w domenie CDR3 łańcucha VL przeciwciała D2E7 może występować Ala lub Thr bez znaczącej zmiany wartości stałej K off. W związku z tym, sekwencja konsensusowa domeny CDR3 łańcucha VL przeciwciała D2E7 obejmuje sekwencję aminokwasów Q-R-Y-N-R-A-P-Y-T-A) (SEK ID Nr: 3). Ponadto, w pozycji 12 w domenie VH CDR3 przeciwciała D2E7 może występować Tyr lub Asn bez znaczącej zmiany wartości stałej K off. W związku z tym, sekwencja konsensusowa domeny VH CDR3 przeciwciała D2E7 obejmuje sekwencję aminokwasów V-S-Y-L-S-T-A-S-S-L-D-(Y/N) (SEK NR ID: 4). Poza tym, jak wykazano w Przykładzie 2 patentu USA Nr , domenę CDR3 łańcuchów ciężkich i lekkich przeciwciała D2E7 można modyfikować poprzez podstawienie pojedynczą resztą alaniny (w pozycji 1, 4,, 7 lub 8 w obrębie VL CDR3 lub w pozycji 2, 3, 4,, 6, 8, 9, lub 11 w obrębie VH CDR3) bez znaczącego wpływu na K off. Ponadto, specjaliści w dziedzinie wiedzą, że dana modyfikacja domen VL CDR3 i VH CDR3 przeciwciała D2E7 polegająca na podstawieniu alaniną innych aminokwasów, w szczególności aminokwasów konserwatywnych, w obrębie domen CDR3 jest możliwa, kiedy stała dysocjacji przeciwciała po podstawieniu pozostaje niska. Korzystnie w domenach VL CDR3 i VH CDR3 przeciwciała D2E7 podstawiono nie więcej niż od jednego do pięciu aminokwasów konserwatywnych. Korzystniej, w domenach VL CDR3 i VH CDR3 przeciwciała D2E7 podstawiono nie więcej niż 3 aminokwasy konserwatywne. Dodatkowo, podstawienie aminokwasów konserwatywnych nie powinno mieć miejsca, kiedy podstawiana pozycja aminokwasowa jest krytyczna dla wiązania htnfα. Pozycje 2 i domeny VL CDR3 przeciwciała D2E7 oraz pozycje 1 i 7 domeny VH CDR3 przeciwciała D2E7 wydają się kluczowe dla interakcji z htnfα. Dlatego nie dokonuje się podstawienia aminokwasów konserwatywnych w tych pozycjach (przy czym podstawienie alaniną w pozycji domeny VL CDR3 przeciwciała D2E7 jest akceptowalne, jak opisano powyżej (patrz patent USA nr 6,090,382). 2

27 1 2 3 [01] W związku z tym, w kolejnym wykonaniu wynalazek ten dostarcza sposoby określania skuteczności leczenia AS, które obejmują podawanie izolowanego ludzkiego przeciwciała, lub część tego przeciwciała wiążącej antygen. Korzystnie wspomniane przeciwciało lub jego część wiążąca antygen posiada następujące właściwości: a) oddysocjowuje od ludzkiego TNFα ze stałą K off o wartości 1 x -3 s -1 lub mniejszą, jak wykazano w powierzchniowym rezonansie plazmonowym. b) posiada domenę CDR3 łańcucha lekkiego obejmującą sekwencję aminokwasową SEK NR ID: 3, lub sekwencję aminokwasową SEK NR ID: 3 modyfikowaną przez podstawienie pojedynczą alaniną w pozycji 1, 4,, 7 lub 8 lub podstawienie od jednego do pięciu aminokwasów w pozycji 1, 3, 4, 6, 7, 8 i/lub 9. c) posiada domenę CDR3 łańcucha ciężkiego obejmującą sekwencję aminokwasową SEK NR ID: 4, lub sekwencję aminokwasową SEK NR ID: 4 modyfikowaną przez podstawienie pojedynczą alaniną w pozycji 2, 3, 4,, 6, 8, 9, lub 11, lub podstawienie od jednego do pięciu konserwatywnych aminokwasów w pozycji 2, 3, 4,, 6, 8, 9,, 11 i/lub 12. [0131] Korzystniej, izolowane ludzkie przeciwciało lub jego cześć wiążąca antygen oddysocjowuje od ludzkiego TNFα ze stałą Koff o wartości x -4 s -1 lub mniejszą. Korzystniej, izolowane ludzkie przeciwciało lub jego cześć wiążąca antygen oddysocjowuje od ludzkiego TNFα ze stałą K off o wartości 1 x -4 s -1 lub mniejszą. [0132] W jeszcze innym wykonaniu, wynalazek ten dostarcza sposoby określania skuteczności leczenia AS, które obejmują podawanie izolowanego ludzkiego przeciwciała, lub części tego przeciwciała wiążącej antygen. Korzystnie przeciwciało lub jego cześć wiążąca antygen według wynalazku zawiera region zmienny łańcucha lekkiego (LCVR) posiadający domenę CDR3 obejmującą sekwencję aminokwasową SEK NR ID: 3, lub sekwencję aminokwasową SEK NR ID: 3 modyfikowaną przez postawienie pojedynczej alaniny w pozycji 1, 4,, 7 lub 8, oraz zawiera region zmienny łańcucha ciężkiego (HCVR) posiadający domenę CDR3 obejmującą sekwencję aminokwasową SEK NR ID: 4, lub sekwencję SEK NR ID: 4 modyfikowaną przez podstawienie pojedynczej alaniny w pozycji 2, 3, 4,, 6, 8, 9, lub 11. Korzystnie LCVR posiada ponadto domenę CDR2 zawierającą sekwencję aminokwasową SEK NR ID: (tj. VL CDR2 przeciwciała D2E7), a HCVR posiada ponadto domenę CDR2 zawierającą sekwencję aminokwasową SEK NR ID:6 (tj. VH CDR2 przeciwciała D2E7). Jeszcze korzystniej, LCVR posiada ponadto domenę CDR1 zawierającą sekwencję aminokwasową SEK NR ID:7 (tj. VL CDR1 przeciwciała D2E7), a HCVR posiada ponadto domenę CDR1 zawierającą sekwencję aminokwasową SEK NR ID:8 (tj. VH CDR1 przeciwciała D2E7). Regiony zrębowe VL korzystnie pochodzą z V κ I ludzkiej linii zarodkowej, korzystniej z genu V κ ludzkiej linii zarodkowej A, a najkorzystniej z sekwencji VL przeciwciała D2E7 przedstawionej na Fig.1A i 1B w patencie USA Nr Regiony zrębowe VH pochodzą korzystnie z V H 3 ludzkiej linii zarodkowej, korzystniej z genu ludzkiej linii zarodkowej DP-31, a najkorzystniej z sekwencji VH przeciwciała D2E7 przedstawionej na Fig. 2A i 2B w patencie USA Nr [0133] W związku z tym, w kolejnym wykonaniu wynalazek ten dostarcza sposoby określania skuteczności leczenia AS, w których leczenie obejmuje podawanie izolowanego ludzkiego przeciwciała, lub część tego przeciwciała wiążącą antygen. To przeciwciało lub jego cześć wiążąca antygen zawiera region zmienny łańcucha lekkiego (LCVR) obejmujący sekwencję aminokwasową SEK NR ID: (tzn. VL przeciwciała D2E7) i region zmienny łańcucha lekkiego (HCVR) obejmujący sekwencję aminokwasową SEK NR ID: 2 (tzn. VH przeciwciała D2E7). W niektórych wykonaniach, przeciwciało zawiera region stały łańcucha 26

28 1 2 3 ciężkiego, taki jak region stały przeciwciała np. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM lub IgD. Korzystnie, region stały łańcucha ciężkiego jest regionem stałym łańcucha ciężkiego przeciwciała klasy IgG1 lub IgG4. Ponadto wspomniane przeciwciało może zawierać zarówno region stały łańcucha lekkiego kappa jak i region stały łańcucha lekkiego lambda. Korzystnie, przeciwciało zawiera region stały łańcucha lekkiego kappa. Alternatywnie, cześć tego przeciwciała może być przykładowo fragmentem Fab lub fragmentem Fv łańcucha. [0134] W jeszcze innym wykonaniu, niniejszy wynalazek dostarcza sposoby określania skuteczności leczenia AS, w których leczenie obejmuje podawanie izolowanego ludzkiego przeciwciała lub część tego przeciwciała wiążąca antygen, zawierającą domeny V CDR3 i VH CDR3 podobne od odpowiadających im domen przeciwciała D2E7. Przykładowo, przeciwciała lub wiążące antygen części tych przeciwciał z regionem zmiennym łańcucha lekkiego (LCVR) posiadające domenę CDR3 obejmującą sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składające się z sekwencji: SEK NR ID: 3, SEK NR ID: 11, SEK NR ID: 12, SEK NR ID: 13, SEK NR ID: 14, SEK NR ID: 1, SEK NR ID: 16, SEK NR ID: 17, SEK NR ID: 18, SEK NR ID: 19, SEK NR ID:, SEK NR ID: 21, SEK NR ID: 22, SEK NR ID: 23, SEK NR ID: 24, SEK NR ID: 2 i SEK NR ID: 26 lub z regionem zmiennym łańcucha ciężkiego (HCVR) posiadające domenę CDR3 obejmującą sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składające się z sekwencji: SEK ID Nr: 4, SEK NR ID: 27, SEK NR ID: 28, SEK NR ID: 29, SEK NR ID:, SEK NR ID: 31, SEK NR ID: 32, SEK NR ID: 33, SEK NR ID: 34 i SEK NR ID: 3. [013] W innym wykonaniu, sposób według niniejszego ujawnienia obejmuje określenie skuteczności leczenia AS, które obejmuje podawanie inhibitora TNFα nie ograniczając się następującej grupy inhibitorów: przeciwciało skierowane przeciwko TNFα lub jego fragment, w tym infliximab (Remicade, Johnson i Johnson. opisany w patencie USA Nr ), CDP71 (humanizowane przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko TNFα klasy IgG4), CDP 870 (fragment humanizowane przeciwciała monoklonalne skierowanego przeciwko TNFα), anty-tnf-dab (Peptech), CNTO 148 (golimumab, Medarex, Centocor, patrz WO 02/12) oraz adalimumab (Humira Abbott Laboratories, ludzkie przeciwciało skierowane przeciwko TNF opisane w patencie USA Nr jako D2E7 i użyte w niniejszym wynalazku. Inne przykłady obejmują etanercept (opisany w WO 91/033 i WO 09/6476), rozpuszczalny receptor TNF typu I, pegylowany rozpuszczalny receptor TNF typu I (PEGS TNF-R1) lub ptnfr1gg (Lenercept). W innym wykonaniu, inhibitor TNFα jest rekombinowanym białkiem wiążącym TNF (r-tbp-1) (Serono). [0136] Przeciwciało skierowane przeciwko TNFα użyte w sposobach i kompozycjach według niniejszego ujawnienia oraz wynalazku można zmodyfikować w celu ulepszenia procesu leczenia AS. W niektórych wykonaniach, aby uzyskać pożądany efekt, przeciwciało skierowane przeciwko TNFα lub jego fragmenty wiążące antygen są zmodyfikowane chemicznie. Przykładowo, pegylacja przeciwciał lub ich fragmentów według niniejszego ujawnienia oraz niniejszy wynalazek mogą być wykonywane w dowolnej reakcji pegylacji znanej w stanie techniki, jak opisano przykładowo w następujących odnośnikach: Focus on Growth Factors 3:4- (1992); EP ; and EP : 3:4-4 (1992 r.); EP ; i EP [0137] Korzystnie, reakcja pegylacji przeprowadzana jest z reaktywną cząsteczką glikolu polietylenowego poprzez reakcję acylacji a następnie alkilowania. Korzystnym rozpuszczalnym w wodzie polimerem do pegylacji przeciwciał lub ich fragmentów według niniejszego ujawnienia i wynalazku jest glikol polietylenowy (PEG). Stosowane w niniejszym dokumencie określenie glikol polietylenowy w zamyśle obejmuje dowolne formy PEG użyte do derywatyzacji białek, takie jak monomeryczna cząsteczka mono (Cl-ClO), alkoksy- lub aryloksy- glikol polietylenowy. 27

29 1 2 3 [0138] Sposoby przygotowania pegylowanych przeciwciał i ich fragmentów według niniejszego ujawnienia i wynalazku generalnie obejmują następujące etapy (a) reakcja przeciwciała lub jego fragmentu z glikolem polietylenowym, takim jak pochodna glikolu polietylenowego z reaktywną grupą estrową lub aldehydową, w warunkach, w których przeciwciało lub jego fragment zostają przyłączone do jednej lub więcej niż jednej grupy PEG oraz (b) otrzymanie produktów reakcji. Dla specjalistów w dziedzinie będzie oczywiste, że w oparciu znane parametry należy wybrać optymalne warunki reakcji lub reakcji acylacji mając na uwadze oczekiwany rezultat. [0139] Generalnie pegylowane przeciwciała i ich fragmenty można stosować w leczeniu AS, podając tak zmodyfikowane przeciwciała skierowane przeciwko TNFα lub ich fragmenty opisane w niniejszym dokumencie. Generalnie pegylowane przeciwciała i ich fragmenty mają dłuższy czas półtrwania niż nie pegylowane przeciwciała lub ich fragmenty. Pegylowane przeciwciała lub ich fragmenty można stosować osobno, razem lub w kombinacji z innymi kompozycjami farmaceutycznymi. [01] W jeszcze innym wykonaniu niniejszego ujawnienia i wynalazku, przeciwciała skierowane przeciwko TNFα lub ich fragmenty można zmienić, przy czym region stały przeciwciała jest zmodyfikowany w taki sposób, że co najmniej jedna biologiczna funkcja efektorowa regionu stałego ulega ograniczeniu w porównaniu do nie zmodyfikowanego przeciwciała. Aby zmodyfikować przeciwciało według niniejszego ujawnienia i wynalazku w taki sposób, żeby wykazało zmniejszone wiązanie do receptora Fc, segment regionu stałego przeciwciała można poddać mutacji w określonych miejscach niezbędnych do oddziaływania z receptorem Fc (FcR) (patrz np. Canfield, S. M. Ii S.L. Morrison (1991) J. Exp. Med. 173: ; i Lund, J. i wsp. (1991) J. of Immunol. 147: ). Zmniejszenie zdolności wiązania FcR przez przeciwciało może także ograniczyć inne funkcje efektorowe opierające się na oddziaływaniach z FcR, takie jak opsonizacja i fagocytoza oraz zależna od antygenu cytotoksyczność komórkowa. [0141] Przeciwciało lub cześć tego przeciwciała użyte w sposobie według niniejszego ujawnienia i wynalazku można poddawać derywatyzacji lub łączyć z inną cząsteczką funkcjonalną (np. innym peptydem lub białkiem). W związku z tym, przeciwciała i części tych przeciwciał według niniejszego ujawnienia i wynalazku w zamyśle obejmują derywatyzowane oraz w inny sposób modyfikowane opisane tu formy przeciwciała skierowane przeciwko TNFα, w tym cząsteczki immunoadhezyjne. Przykładowo, przeciwciało lub część tego przeciwciała według niniejszego ujawnienia i wynalazku może być funkcjonalnie przyłączona (poprzez chemiczne sprzężenie, fuzję, niekowalencyjne zasocjowanie i inne) do jednej lub więcej niż jednej cząsteczki, takiej jak inne przeciwciało (np. przeciwciało o podwójnej specyficzności lub dwuciało), do wykrywalnego czynnika, do czynnika cytotoksycznego, do czynnika farmaceutycznego i/lub do białka lub peptydu, który pośredniczy w asocjacji przeciwciała lub części tego przeciwciała z inną cząsteczką (taką jak region rdzeniowy streptawidyny lub ogon polihistydynowy). [0142] Jeden rodzaj derywatyzowanych przeciwciał jest uzyskiwany przez sieciowanie dwóch lub więcej niż dwóch przeciwciał (tego samego typu lub różnego typu) np. w celu utworzenia przeciwciała o podwójnej swoistości. Odpowiednie czynniki sieciujące obejmują czynniki heterobifunkcjonalne posiadające znacząco reaktywne grupy oddzielone odpowiednim separatorem (np. estrem m-maleimidobenzoilo-nhydroksysukcynoimidu) lub homobifunkcionalne (np. suberan disukcynimidylu). Takie łączniki są dostępne w firmie Pierce Chemical Company, Rockford, IL. [0143] Przydatne wykrywalne czynniki, którymi, według niniejszego ujawnienia i wynalazku, można derywatyzować przeciwciała lub części tych przeciwciał, obejmują związki fluorescencyjne. Przykładowe wykrywalne czynniki fluorescencyjne obejmują fluoresceinę, izotiocjanian fluoresceiny, rodaminę, chlorek - 28

30 1 2 3 dimetyloamino-1-naftalenosulfonylu, fikoerytrynę i podobne. Przeciwciało można także derywatyzować enzymami, takimi jak alkaliczna fosfataza, peroksydaza chrzanowa, oksydaza glukozowa podobne. Przeciwciało derywatyzowane wykrywalnym enzymem można wizualizować poprzez dodanie czynników, które ten enzym wykorzystuje do produkcji widocznego produktu reakcji. Przykładowo, w obecności wykrywalnego czynnika peroksydazy chrzanowej, dodanie nadtlenku wodoru i diaminobenzydyny prowadzi do wytworzenia barwnego wykrywalnego produktu. Przeciwciało można również derywatyzować biotyną i wykrywać poprzez pośredni pomiar wiązania awidyny lub streptawidyny. [0144] Przeciwciało lub cześć tego przeciwciała wykorzystane w sposobie lub kompozycji według niniejszego ujawnienia i wynalazku można wytworzyć w komórce gospodarza poprzez ekspresję będącą wynikiem rekombinacji genów kodujących lekki i ciężki łańcuch o charakterze immunoglobulinowym. W celu ekspresji przeciwciał po rekombinacji, komórka gospodarza jest transfekowana jednym lub więcej niż jednym rekombinacyjnym wektorem ekspresyjnym z fragmentami DNA kodującymi immunoglobulinowe łańcuchy lekkie i ciężkie. Łańcuchy te są wyrażane w komórce gospodarza i korzystnie wydzielane do podłoża hodowlanego, w którym komórki gospodarza są hodowane. Z tego podłoża wytworzone przeciwciała można następnie pozyskać. W celu uzyskania genów kodujących ciężkie i lekkie łańcuchy przeciwciał, wprowadzenie tych genów do rekombinacyjnych wektorów ekspresyjnych, a następnie wprowadzenie tych wektorów do komórki gospodarza, stosowane są standardowe metody rekombinacji DNA, jak opisano w Sambrook, Fritsch i Maniatis (red.), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F.M. i wsp. (red.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) i w patencie USA Nr 4,816,397 Boss i wsp. [014] W celu ekspresji przeciwciała D2E7 lub przeciwciała podobnego do D2E7 najpierw należy otrzymać fragmenty DNA kodujące regiony zmienne lekkiego i ciężkiego łańcucha. Te fragmenty DNA mogą być uzyskiwane poprzez namnażanie i modyfikację sekwencji zmiennego regionu łańcucha lekkiego i ciężkiego linii zarodkowej w łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR). Sekwencje DNA linii zarodkowej człowieka genów regionów zmiennych lekkiego i ciężkiego łańcucha są znane w stanie techniki (patrz np. baza danych sekwencji z ludzkiej linii zarodkowej Vbase, Kabat, E.A. i wsp. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication Nr ; Tomlinson, I.M., i wsp. (1992) The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops J. Mol. Biol. 227: ; and Cox, J.P.L. i wsp. (1994) A Directory of Human Germ-line V78 Segments Reveals a Strong Bias in their Usage Eur. J. Immunol. 24: ). [0146] Do uzyskania fragmentu DNA kodującego region zmienny łańcucha ciężkiego przeciwciała D2E7 lub przeciwciała podobnego do D2E7, fragment DNA należący do rodziny ludzkich genów VH linii zarodkowej namnażany jest w standardowej reakcji PCR. Najkorzystniej, namnażana jest sekwencja VH linii zarodkowej DP-31. Do uzyskania fragmentu DNA kodującego region zmienny łańcucha lekkiego przeciwciała D2E7 lub przeciwciała podobnego do D2E7, fragment DNA należący do rodziny V κ I ludzkich genów VL linii zarodkowej namnażany jest w standardowej reakcji PCR. Najkorzystniej, namnażana jest sekwencja VL linii zarodkowej A. Startery PCR odpowiednie do przeprowadzenia namnażania sekwencji VH linii zarodkowej DP-31 i VL linii zarodkowej A można zaprojektować w oparciu o sekwencje nukleotydowe przy użyciu standardowych metod ujawnionych w odnośniku cytowanym uprzednio. [0147] Po otrzymaniu fragmentów VH i VL, sekwencje te można poddać mutacji w celu uzyskania sekwencji aminokwasowych przeciwciała D2E7 lub przeciwciała do niego podobnego ujawnionych w niniejszym 29

31 1 2 3 dokumencie. Sekwencje aminokwasowe kodowane przez sekwencje DNA VL i VH linii zarodkowej są najpierw porównywane do sekwencji aminokwasowych VH i VL przeciwciała D2E7 i przeciwciała podobnego do D2E7. Następnie, odpowiednie nukleotydy sekwencji DNA linii zarodkowej są poddawane mutacji w taki sposób, że zmutowana sekwencja linii zarodkowej koduje D2E7 lub podobną do D2E7 sekwencję aminokwasową, wykorzystując kod genetyczny do ustalenia które nukleotydy podlegają wymianie. Mutageneza sekwencji linii zarodkowej jest przeprowadzana standardowymi metodami, takimi jak mutageneza w reakcji łańcuchowej PCR (w której zmutowane nukleotydy są wprowadzane do starterów PCR w taki sposób, że produkt PCR zawiera tę mutację) lub mutageneza ukierunkowana. [0148] Otrzymane fragmenty DNA kodujące segmenty VH i VL przeciwciała D2E7 lub przeciwciała podobnego do D2E7 (przez namnażanie i mutagenezę genów VH i VL linii zarodkowej, jak opisano powyżej) są następnie poddawane dalszemu procesowaniu standardowymi technikami rekombinacji DNA np. w celu konwersji genów regionów zmiennych do genów łańcuchów o pełnej długości, do genów fragmentu Fab lub scfv. Podczas tych procesów fragment DNA kodujący VL lub VH jest funkcjonalnie przyłączony do innego fragmentu DNA kodującego inne białko, takie jak region stały lub elastyczny łącznik. Określenie "funkcjonalnie połączony" stosowany w tym kontekście w zamyśle oznacza połączenie między sobą dwóch fragmentów DNA w taki sposób, że sekwencje aminokwasowe kodowane przez dwa fragmenty DNA pozostają w ramce odczytu. [0149] Izolowane DNA kodujące region VH można przekształcić do genu łańcucha o pełnej długości przez funkcjonalne połączenie DNA kodującego VH z inną cząsteczką DNA kodującą region stały łańcucha ciężkiego (CH1, CH2 i CH3). Sekwencje genów regionu stałego łańcucha ciężkiego są znane w stanie techniki (patrz np. Kabat, E.A., i wsp. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication Nr ). Fragmenty DNA zawierające te regiony można otrzymać standardową techniką namnażania w PCR. Region stały łańcucha ciężkiego może być regionem stałym IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgG lub IgD, ale korzystniej jest regionem stałym przeciwciał IgG1 i IgG4. W przypadku genu fragmentu Fab łańcucha ciężkiego, DNA kodujące VH może być funkcjonalnie połączone z inną cząsteczką DNA kodującą wyłącznie region stały CH1 łańcucha ciężkiego. [0149] Izolowane DNA kodujące region VL może być przekształcone do genu kodującego łańcuch lekki o pełnej długości (a także do genu łańcucha lekkiego kodujący fragment Fab) prze funkcjonalne połączenie DNA kodującego VL z inną cząsteczką DNA kodującą region stały CL łańcucha lekkiego. Sekwencje ludzkich genów regionu stałego łańcucha lekkiego są znane w stanie techniki (patrz np. Kabat, E.A., i wsp. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication Nr ) i fragmenty DNA obejmujące te regiony można otrzymać namnażając je w standardowej reakcji PCR. Region stały łańcucha lekkiego może być typu kappa lub lambda, ale korzystniej gdy region stały jest typu kappa. [011] Aby utworzyć gen scfv, fragmenty DNA kodujące VH i VL są funkcjonalnie łączone z innym fragmentem kodującym elastyczny łącznik np. kodujący sekwencję aminokwasową (Gly 4 -Ser) 3 w taki sposób, że sekwencje VH i VL mogą być wyrażane jako pojedynczy łańcuch białkowy z regionami VL i VH połączonymi elastycznym łącznikiem (patrz np. Bird i wsp. (1988) Science 242 : ; Huston i wsp. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8: ; McCafferty i wsp., Nature (1990) 348:2-4). [012] W celu ekspresji przeciwciał lub części tych przeciwciał użytych według niniejszego ujawnienia i wynalazku, cząsteczki DNA, kodujące fragment lub pełnej długości lekki i ciężki łańcuch otrzymany jak

32 1 2 3 opisano powyżej, są wprowadzane do wektorów ekspresyjnych w taki sposób, że geny funkcjonalnie łączą się z sekwencją kontrolującą transkrypcję i translację. W tym kontekście określenie "funkcjonalnie połączony" w zamyśle oznacza, że gen przeciwciała jest wligowany do wektora w taki sposób, że sekwencje kontrolujące transkrypcje i translację w obrębie wektora spełniają oczekiwane funkcje regulując transkrypcję i translację genu przeciwciała. Wektor ekspresyjny i sekwencje kontrolujące ekspresję wybrano w taki sposób, aby były kompatybilne z sekwencjami naturalnie związanymi z ekspresją w komórce gospodarza. Gen łańcucha lekkiego przeciwciała i gen łańcucha ciężkiego przeciwciała można wprowadzić do osobnego wektora. Zwykle jednak oba geny są wprowadzone do tego samego wektora ekspresyjnego. Geny przeciwciała są wprowadzone do wektora ekspresyjnego standardowymi technikami (np. przez ligację lub komplementarne miejsca restrykcyjne we fragmencie genu przeciwciała lub przez ligację na tępe końce jeżeli nie ma żadnych miejsc restrykcyjnych). Przed wprowadzeniem sekwencji lekkiego lub ciężkiego łańcucha przeciwciała D2E7 lub przeciwciała podobnego, wektor ekspresyjny może być nośnikiem sekwencji regionu stałego przeciwciała. Przykładowo, jednym ze sposobów przekształcenia sekwencji VH i VL przeciwciała D2E7 lub przeciwciała podobnego do pełnej długości genów przeciwciała jest wprowadzenie ich do wektorów ekspresyjnych już kodujących regiony stałe łańcucha ciężkiego i lekkiego, w taki sposób, że segment VH jest funkcjonalnie przyłączony do segmentu/segmentów CH w obrębie wektora, a segment VL jest funkcjonalnie przyłączony do segmentu CL w obrębie wektora. Dodatkowo lub zamiennie, rekombinowany wektor ekspresyjny może kodować peptyd sygnałowy, który ułatwia sekrecję łańcucha przeciwciała z komórki gospodarza. Gen łańcucha przeciwciała można wklonować do wektora w taki sposób, że peptyd sygnałowy jest połączony w ramce odczytu z końcem aminowym genu łańcucha przeciwciała. Peptydem sygnałowym może być immunoglobulinowym peptydem sygnałowym lub heterologicznym peptydem sygnałowym (tzn. peptydem sygnałowym z białka o charakterze nie immunoglobulinowym). [013] Dodatkowo, oprócz genów łańcuchów przeciwciała, rekombinacyjny wektor ekspresyjny według niniejszego wynalazku jest nośnikiem sekwencji regulatorowych, które kontrolują ekspresję genów łańcuchów przeciwciał w komórce gospodarza. Określenie sekwencje regulatorowe w zamyśle obejmują startery, enhansery i inne elementy kontrolujące ekspresję (np. sygnały poliadenylacji), które kontrolują transkrypcję i translację genów łańcucha przeciwciała. Takie sekwencje regulatorowe opisano na przykład w Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 18, Academic Press, San Diego, CA (1990). Specjaliści w dziedzinie wiedzą, że zaprojektowanie wektora ekspresyjnego, w tym wybór sekwencji regulatorowych, może zależeć od takich czynników jak wybór komórki gospodarza do transformacji, poziom ekspresji pożądanego białka, itd. Korzystne sekwencje regulatorowe dla ssaczych komórek gospodarza obejmują elementy wirusowe, od których zależy wysoki poziom ekspresji białka w komórce gospodarza, takie jak promotory i/lub sekwencje wzmacniające pochodzące z wirusa cytomegalii (CMV) (promotor/sekwencja wzmacniająca CMV), wirusa SV (ang. Simian Wirus) (promotor/sekwencja wzmacniająca SV), z adenowirusa (np. AdMLP, ang. the adenovirus major late promoter) i wirusa polio. Dalszy opis wirusowych elementów regulatorowych i ich sekwencji patrz, np., patent USA , Stinsku, patent USA Nr 4 24, Bell i wsp. i patent USA , Chaffnera i wsp. [014] Ponadto, oprócz genów łańcuchów przeciwciał i sekwencji regulatorowych, rekombinacyjny wektor ekspresyjny stosowany w niniejszym ujawnieniu i wynalazku może być nośnikiem dodatkowych sekwencji, takich jak sekwencje regulujące replikację wektora w komórce gospodarza (miejsca startu replikacji) i geny markerów selekcyjnych. Geny markerów selekcyjnych ułatwiają selekcję komórek gospodarza, do których udało się wprowadzić wektor (patrz np. patent USA 4,399,216, 4,634,66 i,179,017 wszystkie pozycje 31

33 1 2 3 przez Axel i wsp.). Przykładowo, zazwyczaj gen markera selekcyjnego potwierdza oporność na leki takie jak G418, higromycynę lub metatreksat w komórce gospodarza, do której wektor został wprowadzony. Korzystne geny markerów selekcyjnych obejmują gen reduktazy dihydrofolianowej (do zastosowania w komórkach gospodarza dhfr- z selekcją/namnażaniem za pomocą metotreksatu) i gen neo (do selekcji za pomocą G418). [01] Do ekspresji łańcuchów lekkich i ciężkich, kodujący łańcuchy lekkie i ciężkie wektor lub wektory ekspresyjne wprowadza się do komórki gospodarza na drodze standardowej transfekcji. Różne formy określenia transfekcja w zamyśle obejmują szeroki wachlarz technik powszechnie używanych do wprowadzania egzogennego DNA do komórek prokariotycznych lub eukariotycznych gospodarza np. elektroporacja, precypitacja fosforanem wapnia, transfekcja DEAE-dextranem i podobne. Mimo, że teoretycznie możliwa jest ekspresja przeciwciał według niniejszego ujawnienia i wynalazku zarówno w komórkach gospodarza prokariotycznych i eukariotycznych, ekspresja przeciwciał w komórkach eukariotycznych, a korzystniej w ssaczych komórkach gospodarza, jest korzystniejsza, ponieważ w komórkach tych, a w szczególności w komórkach ssaczych, z większym prawdopodobieństwem zachodzi prawidłowe złożenie elementów cząsteczki białkowej i fałdowanie w rezultacie aktywnego przeciwciała. Zgodnie z danymi literaturowymi ekspresja genów przeciwciała w komórkach prokariotycznych zachodzi w sposób niewydajny (Boss, M.A. i Wood, C. R. (198) Immunology Today 6:12-13). [016] Korzystnie ssacze komórki gospodarza do ekspresji rekombinowanych przeciwciał według niniejszego ujawnienia i wynalazku obejmują linie komórek jajnika chomika (komórki CHO) (w tym komórki CHO dhfr-, opisane w Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad Sci. USA 77: , używane z markerem selekcyjnym DHFR np. jak opisano z możliwością wyboru selekcyjnego markera DHFR np. zgodnie z opisem w R.J. Kaufman and P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 19: ), linie komórek NS0 szpiczaka mnogiego, komórek COS i komórek SP2. Po wprowadzeniu kodujących geny przeciwciał rekombinacyjnych wektorów ekspresyjnych do ssaczych komórek gospodarza, przeciwciała te są wytwarzane w hodowlach komórkowych komórek gospodarza przez okres czasu wystarczający do tego, aby ekspresja przeciwciała w komórce gospodarza lub korzystniej, wydzielanie przeciwciała do podłoża hodowlanego, w której komórka gospodarza jest hodowana. Przeciwciała można odzyskać z podłoża hodowlanego przy użyciu standardowych metod oczyszczania białka. [017] Komórki gospodarza można także wykorzystać do wytwarzania cześć pełnego przeciwciała, takich jak cząsteczek Fab lub scfv. Jest rzeczą zrozumiałą, że warianty powyższej procedury mieszczą się w zakresie niniejszego ujawnienia i niniejszego wynalazku. [018] Przykładowo, pożądane jest transfekowanie komórki gospodarza DNA kodującym łańcuch lekki lub ciężki (ale nie kodującym oba łańcuchy) przeciwciała według wynalazku. Technologia rekombinacji DNA może być również używana do usuwania niektórych lub wszystkich fragmentów DNA kodujących łańcuch lekki lub ciężki lub oba łańcuchy, które nie są niezbędne do wiązania htnfα. Cząsteczki wyrazane na matrycy tak skróconej cząsteczki DNA należą również do przeciwciał objętych niniejszym ujawnieniem i wynalazkiem. Ponadto, jeden łańcuch ciężki i jeden łańcuch lekki stanowią przeciwciało według wynalazku, a inny łańcuch ciężki i lekki są specyficzne dla antygenu innego niż htnfα. Dwufunkcjonalne przeciwciała można uzyskać sieciując przeciwciało według niniejszego ujawnienia i wynalazku do drugiego przeciwciała standardowymi metodami chemicznego sieciowania. [019] W korzystnym systemie rekombinacyjnej ekspresji przeciwciała lub jego części wiążącej antygen według niniejszego ujawnienia i wynalazku, rekombinacyjny wektor ekspresyjny kodujący zarówno łańcuch 32

34 1 2 3 ciężki jak i lekki przeciwciała jest wprowadzony do komórek linii CHO dhfr- za pomocą transfekcji z fosforanem wapnia. W rekombinacyjnym wektorze ekspresyjnym, każdy gen łańcucha ciężkiego i lekkiego jest funkcjonalnie połączony z elementami regulatorowymi tj. z wzmacniaczem CMV/promotorem AdMLP służącymi do transkrypcji tych genów z wysoka wydajnością. Rekombinacyjny wektor ekspresyjny jest także nośnikiem genu DHFR, który pozwala na selekcję metotreksatem i namnażanie komórek CHO, które uległy transfekcji. Wyselekcjonowane transformanty hoduje się w kulturach komórkowych aby umożliwić ekspresję ciężkich i lekkich łańcuchów przeciwciała i odzyskanie pełnego przeciwciała z podłoża hodowlanego. Do przygotowania rekombinowanych wektorów ekspresyjnych, transfekcji komórki gospodarza, selekcji transformantów, hodowli komórki gospodarza i odzyskania przeciwciała z podłoża hodowlanego stosuje się standardowe techniki biologii molekularne. [0160] Tak jak przeciwciało D2E7 lub fragment tego przeciwciała wiążący antygen lub przeciwciała podobne do D2E7 według niniejszego ujawnienia, ludzkie przeciwciała rekombinowane według niniejszego ujawnienia i wynalazku można izolować przez przeszukiwanie rekombinacyjnej kombinatorycznej biblioteki przeciwciał, korzystnie fagowej biblioteki scfv przygotowanej przy użyciu fragmentów DNA kodujących VL i VH ludzkiego przeciwciała przygotowanych na matrycy mrna z ludzkich limfocytów. Metodologie przygotowania i przeszukiwania takich bibliotek są znane w stanie techniki. Ponadto, oprócz dostępnych na rynku zestawów do tworzenia bibliotek fagowych (np. the Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, nr kat ; oraz the Stratagene SurfZAP phage display kit, nr kat. 2612), przykłady metod i odczynników szczególnie łatwych w użyciu do wytwarzania przeciwciał i przeszukiwania fagowych bibliotek przeciwciał, można znaleźć np. Ladner i wsp. patent USA 223 9; Lui Kanga i wsp. Publikacja PCT nr WO 92/18619; Dower i wsp. Publikacja PCT nr WO 91/17271; Winter i wsp. Publikacja PCT nr WO 92/791; Markland i wsp. PCT Publikacja nr WO 92/1679; Breitlingi wsp. Publikacja PCT nr WO 93/01288; McCafferty i wsp. Publikacja PCT nr WO 92/047; Garrard i wsp. Publikacja PCT nr WO 92/09690; Fuchs i wsp. (1991) Bio/Technology 9: ; Hay i wsp. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-6; Huse i wsp. (1989) Science 246: ; McCafferty i wsp., Nature (1990) 348:2-4; Griffiths i wsp. (1993) EMBO J 12:72-734; Hawkins i wsp. (1992) J Mol Biol 226: ; Clackson i wsp. (1991) Nature 32: ; Gram i wsp. (1992) PNAS 89: ; Garrard i wsp. (1991) Bio/Technology 9: ; Hoogenboom i wsp. (1991) Nuc Acid Res 19: ; i Barbas i wsp. (1991) PNAS 88: [0161] W korzystnym wykonaniu do izolacji ludzkich przeciwciał z wysokim powinowactwem i niską stałą dysocjacji dla htnfα, wykorzystane jest mysie przeciwciało skierowane przeciwko htnfα o wysokim powinowactwie i niskiej stałej dysocjacji dla htnfα (np. MAK19, hybrydoma o numerze ECACC ). Służy ono do selekcji ludzkich sekwencji łańcucha lekkiego i ciężkiego posiadających podobną aktywność wiązania htnfα metodą mapowania epitopu opisaną w Hoogenboom i wsp., publikacja PCT WO 93/ Biblioteki przeciwciał wykorzystane w tej metodzie to korzystnie biblioteki scfv przygotowane i przeszukiwane jak opisano w McCafferty i wsp., publikacja PCT WO 92/047, McCafferty i wsp., Nature (1990) 348:2-4; oraz Griffiths i wsp., (1993) EMBO J 12: Biblioteki przeciwciał scfv korzystnie są przeszukiwane przy użyciu rekombinowanego ludzkiego TNFα w roli antygenu. [0162] Po wstępnym wyselekcjonowaniu segmentów VL i VH, przeprowadza się pierwsze eksperymenty doboru, w których różne pary wstępnie wyselekcjonowanych segmentów VL i VH przeszukuje się pod kątem wiązania htnfα, w taki sposób, żeby wybrać korzystną kombinację par VL/VH. Dodatkowo, aby poprawić ich powinowactwo i/lub dodatkowo obniżyć stałą dysocjacji dla wiązania htnfα, segmenty VL i VH korzystnych par/pary VL/VH można poddać losowej mutagenezie, korzystnie w obrębie regionu CDR3 VH 33

35 1 2 3 lub/i VL w procesie analogicznym do somatycznej mutacji in vivo odpowiedzialnej za dojrzewanie przeciwciał pod kątem powinowactwa w naturalnej odpowiedzi immunologicznej. Dojrzewanie pod kątem powinowactwa in vitro można osiągnąć przez namnażanie regionów VH i VL wykorzystując startery PCR komplementarne odpowiednio do VL CDR3 lub VL CDR3. Do puli starterów dodano mieszaninę starterów z czterema zasadami nukleotydowymi w losowo wybranej pozycji. W rezultacie produkty PCR kodują segmenty VH i VL, w których do regionów VH CDR3 i VL CDR3 wprowadzono losowe mutacje. Te losowo zmutowanej segmenty VH i VL można ponownie przeszukać pod katem wiązania do htnfα, i wybrać sekwencje, które wykazują wysokie powinowactwo i niska stałą dysocjacji wiązania htnfα. [0163] Po przeszukaniu rekombinacyjnej biblioteki immunoglobulin i izolacji przeciwciał skierowanych przeciwko htnfα według niniejszego ujawnienia i wynalazku kwas nukleinowy kodujący wyselekcjonowane przeciwciało można odzyskać z biblioteki (np. z genomu faga), wklonować do wektorów ekspresyjnych standardowymi technikami rekombinacyjnymi. Jeśli jest to wymagane, wspomniany kwas nukleinowy można następnie obrabiać tak, aby wytworzyć formy przeciwciała według niniejszego ujawnienia i wynalazku (np. połączyć z kwasem nukleinowym kodującym dodatkowe domeny immunoglobulinowe, takie jak regiony stałe). W celu ekspresji rekombinowanego przeciwciała ludzkiego wyizolowanego przez przeszukiwanie biblioteki kombinatorycznej, wspomniane DNA kodujące przeciwciało jest klonowane do rekombinacyjnego wektora ekspresyjnego i wprowadzone do ssaczej komórki gospodarza, jak opisano bardziej szczegółowo powyżej. [0164] Metody izolacji ludzkich przeciwciał o wysokim powinowactwie i niskiej stałej dysocjacji dla htnfα opisano także w patencie USA Nr 6,090,382, Nr 6,28,62, i Nr 6,09,01. IV. Spondyloartropatia. [016] TNFα jest związany z patofizjologią wielu różnych zaburzeń, w tym chorób zapalnych takich jak spondyloartropatie (patrz np. Moeller i wsp. (1990) Cytokine 2:162; patent USA nr,231,024; European Patent Publication nr 260 6). [0166] Stosowane w niniejszym dokumencie określenie spondyloartropatia lub spondyloartropatie odnosi się do jednej lub kilku chorób wpływających na stawy kręgosłupa, przy czym tego typu choroby maja wspólne cechy kliniczne, radiologiczne i histologiczne. Szereg spondyloartropatii ma takie samo podłoże genetyczne tj. związane z allelem HLA-B27. W jednym wykonaniu określenie spondyloartropatia odnosi się do jednej lub kilku chorób wpływających na stawy kręgosłupa, wyłączając zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa, przy czym tego typu choroby maja wspólne cechy kliniczne, radiologiczne i histologiczne. Przykłady spondyloartropatii obejmują zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa, łuszczycę, zapalenie stawów, enteropatyczne zapalenie stawów, reaktywne zapalenie stawów lub syndrom Reitera i nie rozróżniane spondyloartropatie. Przykłady modeli zwierzęcych wykorzystywany do badania spondyloartropatii obejmują transgeniczne myszy ank/ank, trasngeniczne szczury HLA-B27 (patrz: Taurog i wsp. (1998) The Spondylarthritides. Oxford: Oxford University Press). [0167] Sposoby według niniejszego ujawnienia można także zastosować do leczenia pacjentów, którzy są narażenia na ryzyko rozwoju spondyloartropatii. Przykłady pacjentów zagrożonych zachorowaniem na spondyloartropatię są ludzie cierpiący na zapalenie stawów. Spondyloartropatie mogą być związane z innymi formami zapalenia stawów, w tym z reumatoidalnym zapaleniem stawów. W jednym wykonaniu według niniejszego ujawnienia, poziom markerów biologicznych degradacji chrząstki i/lub markerów zapalenia błony maziowej pacjentów chorujących na spondyloartropatię lub narażonych na spondyloartropatię określa się i wykorzystuje do ustalenia czy dany pacjent jest narażony na rozwinięcie 34

36 1 2 3 spondyloartropatii. Przykłady spondyloartropatii, które można leczyć przeciwciałem TNFα i w związku z tym można oceniać metodami tu opisanymi, przedstawiono poniżej. 1. Zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa (AS) [0168] Czynnik martwicy nowotworu jest związany z patofizjologią zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa (AS) (patrz Verjans i wsp. (1991) Arthritis Rheum. 34:486; Verjans i wsp. (1994) Clin Exp Immunol. 97:4; Kaijtzel i wsp. (1999) Hum Immunol. 60:1). AS jest zaburzeniem o podłożu zapalnym obejmującym zapalenie jednego lub więcej kręgów. AS jest przewlekłą choroba o podłożu zapalnym, która wpływa na szkielet osiowy i/lub na stawy peryferyjne oraz stawy miedzy kręgosłupem a miednicą. AS może także powodować łączenie się kręgów ze sobą lub wzrost połączonych ze sobą kręgów. Spondyloartropatie, w tym AS, mogą być związane z łuszczycowym zapaleniem stawów (PsA) i/lub przewlekłym zapaleniem jelit (IBD), w tym także z wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego i chorobą Leśniowskiego-Crohna. [0169] Wczesne objawy AS można określić za pomocą radiografii, w tym skanów TC i MRI. Wczesne objawy AS często obejmują zapalenie stawu krzyżowo-biodrowego i zmiany w stawie krzyżowo-biodrowym, o czym świadczą niewyraźne kontury korowe kości podchrząstkowej, a następnie erozja i stwardnienie. Często odnotowanym objawem AS jest również zmęczenie (Duffy i wsp. (02) ACR 66th Annual Scientific Meeting Abstract). W związku z tym, sposoby według niniejszego ujawnienia i wynalazku można wykorzystać do polepszenia sposobu leczenia AS dostarczając sposób określania skuteczności leczenia obejmujący podawanie inhibitora TNF. [0170] W jednym wykonaniu, sposób według wynalazku jest używany do określania skuteczności podawania inhibitora TNF w leczeniu spondyloartropatii, w tym AS, związanej z IBD. [0171] AS jest często leczone niesterydowymi lekami przeciwzapalnymi (NLPZ) takimi jak aspiryna i indomethacin. W związku z tym, sposoby według wynalazku można użyć do określenia skuteczności leczenia obejmującego podawanie przeciwciała skierowanego przeciwko TNFα w kombinacji z czynnikami zwykle używanymi to redukcji stanu zapalnego i bólu zwykle związanego z zesztywniającym zapaleniem stawów kręgosłupa. 2. Łuszczycowym zapaleniem stawów [0172] Czynnik martwicy nowotworu jest związany z patofizjologią łuszczycowego zapalenia stawów (PsA (Partsch i wsp. (1998) Ann Rheum Dis. 7:691; Ritchlin i wsp. (1998) J Rheumatol. 2:144). Łuszczycowe zapalenie stawów lub łuszczyca skóry, odnosi się do przewlekłego stanu zapalnego stawów co jest związane z łuszczycą, który jest częstą, przewlekłą chorobą skóry powodującą czerwone plamy na ciele. U około 1 na osób z łuszczycą równolegle z objawami skórnymi rozwija się zapalenia stawów, a w 7% przypadkach łuszczyca poprzedza zapalenie stawów. PsA ujawnia się na wiele różnych sposobów - począwszy od łagodnego do ciężkiego zapalenia stawów, co zazwyczaj dotyczy zapalenia palców i kręgosłupa. Kiedy jest zaatakowany kręgosłup, objawy są podobne do zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa, jak opisano powyżej. W związku z tym, skuteczność przeciwciała skierowanego przeciwko TNFα lub fragmentu tego przeciwciała w leczeniu PsA można określić używając sposób i kompozycję według niniejszego wynalazku. [0173] Czasami PsA towarzyszy arthritis mutilans. Arthritis mutilans odnosi się do zaburzenia które charakteryzuje się silną erozja kości czego skutkiem jest generalnie spowodowana ubytkiem kości deformacja, która okalecza stawy. W jednym wykonaniu, skuteczność przeciwciała skierowanego przeciwko TNFα lub jego fragment do leczenia arthritis mutilans można określić używając sposobu i kompozycji według niniejszego ujawnienia. 3

37 Reaktywne zapalenie stawów / syndrom Reitera [0174] Czynnik martwicy nowotworu związany jest z patofizjologią reaktywnego zapalenia stawów nazywanego również syndromem Reitera (Braun i wsp. (1999) Arthritis Rheum. 42():39). Reaktywne zapalenie stawów (ReA) odnosi się do zapalenia stawów, które jest komplikacją powstałą w wyniku infekcji w innej części ciała, często pojawiającej się po infekcji jelita lub układu moczowo-płciowego. ReA często charakteryzują określone objawy kliniczne, w tym stany zapalne stawów (reumatoidalne zapalenie stawów), zapalenie cewki moczowej, zapalenie spojówek, skóry i błon śluzowych. Dodatkowo, ReA może pojawiać się w następstwie zakażenia chorobami przenoszonymi drogą płciową lub czerwonki, w tym w wyniku infekcji chlamydią, campylobacter, salmonellą, yersinią. W jednym wykonaniu, skuteczność przeciwciała skierowanego przeciwko TNFα lub jego fragmentu do leczenia ReA można określić używając sposobu i kompozycji według niniejszego ujawnienia. 4. Niezróżnicowane formy spondyloartropatii. [017] W jednym wykonaniu, przeciwciała otrzymane przy użyciu sposobów według niniejszego ujawnienia są używane do leczenia pacjentów cierpiących na niezróżnicowane formy spondyloartropatii (patrz Zeidler i wsp. (1992) Rheum Dis Clin North Am. 18:187). Inne określenia używane do opisania niezróżnicowanych form spondyloartropatii obejmują seronegatywne oligoarthritis i niezrożnicowaną formę oligoarthritis. Niezróżnicowane formy spondyloartropatii, jak stosuje się w niniejszym dokumencie, odnoszą się do choroby, w czasie której występują u pacjenta tylko niektóre objawy związane ze spondyloartropatią. Ten stan jest zwykle obserwowany u młodych osób dorosłych, które nie chorują na IBD, łuszczycę, lub nie mają klasycznych objawów syndromu Reitera. W niektórych przypadkach niezróżnicowane formy spondyloartropatii mogą być wczesnym wskazaniem dla AS. W jednym wykonaniu, skuteczność przeciwciała skierowanego przeciwko TNFα lub jego fragmentu do leczenia niezróżnicowanych form spondyloartropatii można określić używając sposobu i kompozycji według niniejszego ujawnienia. V. Kompozycje farmaceutyczne i podawanie leku. A. Kompozycje i podawanie [0176] Przeciwciała, cześć przeciwciała i inne inhibitory TNFα do stosowania w sposobach według niniejszego ujawnienia i wynalazku można włączyć do kompozycji farmaceutycznych odpowiednich do podawania pacjentowi. Zazwyczaj, postać farmaceutyczna składa się z przeciwciała, części tego przeciwciał lub innego inhibitora TNFα według niniejszego ujawnienia i wynalazku oraz z farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika. Stosowane w niniejszym dokumencie określenie farmaceutycznie dopuszczalny nośnik obejmuje dowolne rozpuszczalniki, roztwory koloidalne, czynniki przeciwbakteryjne i przeciwgrzybicze, czynniki izotoniczne i opóźniające wchłanianie i podobne czynniki kompatybilne fizjologicznie. Przykłady farmaceutycznie dopuszczalnych nośników obejmują jeden lub więcej niż jeden nośnik: wodę, sól fizjologiczną, bufor fosforanowy, dekstrozę, glicerol, etanol i tym podobne, jak również ich kombinacje. W wielu przypadkach, korzystnie jest włączyć w kompozycję czynniki izotoniczne np. cukry, poliakkohole takie jak mannitol, sorbitol i chlorek sodu. Farmaceutycznie dopuszczalne nośniki mogą jeszcze zawierać niewielkie ilości substancji pomocniczych takich jak substancje nawilżające lub środki emulgujące, środków konserwujące lub bufory, które zwiększają trwałość i skuteczność przeciwciała, części tego przeciwciała lub innego inhibitora TNFα. [0177] Kompozycje do stosowania w sposobach według niniejszego ujawnienia i wynalazku mogą występować w wielu formach. Należą do nich, na przykład formy dozowania płynne, półpłynne i stałe, takie jak płynny roztwór (np. roztwory do wstrzyknięć i infuzji), roztwory koloidalne, tabletki, pigułki, proszki, 36

38 1 2 3 liposomy i czopki. Preferowana forma zależy od zamierzonego sposobu podawania i aplikacji terapeutycznej. Preferowane są typowe kompozycje w formie roztworów do wstrzyknięć lub infuzji, takie jak kompozycje podobne do tych stosowanych do pasywnej immunizacji ludzi przeciwciałami lub innymi inhibitorami TNFα. Preferowany tryb podawania to podawanie pozajelitowego (np. dożylnie, podskórne, dooponowe, domięśniowe). W preferowanym wykonaniu przeciwciało lub inny inhibitor TNFα jest podawany dożylnie przez infuzję lub przez wstrzyknięcie. W innym wykonaniu, przeciwciało lub inny inhibitor TNFα jest podawany drogą iniekcji domięśniowej lub podskórnie. [0178] W warunkach produkcji i przechowywania kompozycje do terapii muszą być zazwyczaj sterylne i stabilne. Kompozycja może być formułowana jako roztwór, mikroemulsja, roztwór koloidalny, liposom lub inna struktura odpowiednia do stosowania przy wysokim stężeniu leku. Sterylne roztwory do wstrzyknięć można przygotować przez wprowadzenie aktywnego składnika (np. przeciwciał, części przeciwciał lub innych inhibitorów TNFα) w wymaganej ilości do odpowiedniego rozpuszczalnika z jednym lub z kombinacją składników powyżej wymienionych, a następnie rozpuszczalnik ten wysterylizować przez filtrację. Generalnie roztwór koloidalny jest przygotowywany przez wprowadzenie aktywnego składnika do sterylnego nośnika, który zawiera podstawowe podłoże koloidalne i wymaga innych składników spośród tych wymienionych powyżej. W przypadku sterylnych proszków do przygotowania sterylnych roztworów do iniekcji, korzystne sposoby przygotowania to suszenie w próżni i liofilizacja, która pozwala uzyskać proszek aktywnego składnika razem z innymi dodatkowymi pożądanymi składnikami z wcześniej sterylizowanego przez filtrację roztworu. Prawidłową płynność roztworu można zachować na przykład poprzez użycie powłoki takiej jak lecytyna, przez utrzymanie wymaganej wielkości cząstek w przypadku roztworu koloidalnego i przez użycie środków powierzchniowo czynnych. Przedłużone wchłanianie kompozycji do wstrzyknięć można uzyskać włączając czynnik, który opóźnia absorpcję np. sole monostearynowe i żelatynę. [0179] Do kompozycji można również włączyć dodatkowe składniki aktywne. W określonych wykonaniach, przeciwciało lub cześć tego przeciwciała do użytku w sposobach według tego ujawnienia i wynalazku jest formułowane z i/lub podawane razem z jednym lub więcej niż jednym czynnikiem terapeutycznym, obejmującym inhibitor AS lub antagonistę. Przykładowo przeciwciało skierowane przeciwko htnfα lub cześć tego przeciwciała według niniejszego ujawnienia i wynalazku może być w formulacji razem z i/lub przeciwciałem, podawane razem z jednym lub więcej niż jednym dodatkowym przeciwciałem, które wiąże inne struktury docelowe związane z chorobami, w których rolę odgrywa htnfα. (np. przeciwciała, które wiążą inne cytokiny lub wiążą cząsteczki występujące na powierzchni komórki.), jedną lub więcej cytokin, rozpuszczalny receptor TNFα (patrz np. PCT Publication Nr WO 94/06476) i/lub jeden lub więcej niż jeden czynniki chemiczny, który hamuje wytwarzanie lub aktywność htnfα (takie jak pochodne cykloheksyliden jak opisano w PCT Publikacja Nr WO 93/1971) lub dowolną ich kombinacja. Ponadto, jedno lub więcej niż jedno przeciwciało według niniejszego ujawnienia i wynalazku można użyć w kombinacji z dwoma lub więcej powyżej wymienionymi czynnikami terapeutycznymi. Takie połączenie terapii umożliwia korzystnie na stosowanie niższych dawek podawanych czynników terapeutycznych, co pozwala uniknąć ewentualnych skutków ubocznych, powikłań lub słabej odpowiedzi pacjenta na leczenie związanej ze stosowaniem różnych monoterapii. [0180] W jednym aspekcie, niniejsze ujawnienie obejmuje kompozycję farmaceutyczną obejmującą skuteczną ilość inhibitora TNFα oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, gdzie skuteczna ilość inhibitora TNFα może być skuteczna w leczeniu AS. W jednym wykonaniu, wspomniane przeciwciało lub cześć tego przeciwciała do stosowania w sposobach według tego wynalazku jest włączona w formulację 37

39 1 2 3 farmaceutyczną preparatu zgodnie z opisem jak w patencie USA Nr 8,216,83 i patencie USA Nr 04/ A1. Formulacja ta zawiera przeciwciało D2E7 w stężeniu 0 mg/ml, gdzie jedna wypełniona strzykawka zawiera mg przeciwciała do wstrzyknięcie podskórnego. W innym wykonaniu, wspomniana formulacja według niniejszego ujawnienia oraz jak użyto w sposobach według niniejszego wynalazku zawiera D2E7. [0181] Przeciwciała, części przeciwciał i inne inhibitory TNFα według tego ujawnienia i do użytku według sposobów niniejszego wynalazku można podawać różnymi metodami znanymi w stanie techniki, chociaż dla wielu zastosowań terapeutycznych, korzystną drogą podania jest wstrzyknięcie podskórne. W innym wykonaniu, podanie odbywa się poprzez wstrzyknięcie dożylne lub infuzję. Specjalista w dziedzinie będzie wiedział, że droga podania i/lub sposób podania będzie się zmieniał w zależności od oczekiwanych rezultatów. W określonych wykonaniach, aktywny składnik można przygotować z nośnikiem, który będzie zapobiegał szybkiemu uwalnianiu tego składnika, jak w przypadku formulacji o kontrolowanym uwalnianiu, obejmującej implanty, plastry z wchłaniającym się przez skórę lekiem oraz mikrokapsułkowane układy dostarczania leku. Można także zastosować biodegradowalne i biokompatybilne polimery np. etylenowinylooctan, kwas poliglikolowy, polibezwodniki, poliglikolid, kolagen, poliortoestry, polilaktyd. Wiele metod przygotowania takich formulacji zostało opatentowanych lub są one powszechnie znane w stanie techniki. Patrz, np., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, Robinson, red., Dekker, Inc., New York, [0182] Przeciwciała skierowane przeciwko TNFα użyte w niniejszym ujawnieniu i wynalazku można podawać w postaci formulacji zawierającej kryształy białka. Formulacja obejmuje kryształy białka zamknięte wraz z polimerowym nośnikiem polimerowym tworząc powlekane cząstki. Powlekane cząsteczki formulacji zawierającej kryształy białka mogą mieć sferyczną morfologię i stanowić mikrosferą o średnicy do 00 mikrometrów lub mogą wykazywać inną morfologię i występować w postaci mikrocząstek. Zwiększona koncentracja kryształów białka pozwala na dostarczenie przeciwciała według wynalazku drogą podskórną. W jednym wykonaniu, przeciwciała skierowane przeciwko TNFα według niniejszego ujawnienia i wynalazku są dostarczane systemem dostarczania białka, gdzie jedna lub więcej niż jedna formulacja lub kompozycja kryształów białka jest podawana pacjentowi z zaburzeniem związanym z TNFα. Kompozycje i sposoby przygotowania stabilizowanych formulacji całych kryształów przeciwciała lub kryształów części tego przeciwciała są opisane także w WO 02/ [0183] W jednym wykonaniu niniejszego ujawnienia i wynalazku, formulacja obejmuje skrystalizowane fragmenty przeciwciała opisane w patencie USA Nr i patencie USA 04/ A1 i stosowane w leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów. [0184] W określonych wykonaniach przeciwciało, część przeciwciała lub inny inhibitor TNFα według niniejszego ujawnienia oraz do użytku w sposobach według niniejszego wynalazku może być podawane doustnie, przykładowo z obojętnym rozcieńczalnikiem lub przystosowanym jadalnym nośnikiem. Składnik ten (oraz inne składniki, jeżeli są potrzebne) można także zamknąć w twardej lub miękkiej kapsułce żelatynowej, skompresować do postaci tabletek lub włączyć bezpośrednio do diety pacjenta. Do podawania doustnego, składniki można połączyć z substancją pomocniczą i stosować w formie tabletek do spożycia, tabletek do ssania, kołaczyków, kapsułek, eliksirów, zawiesin, syropów, opłatków i tym podobnych. Do podawania składnika według niniejszego ujawnienia oraz do użycia w sposobach według niniejszego wynalazku inną drogą podawania niż pozajelitowa, niezbędne może być powlekanie wspomnianego składnika lub podawanie razem z substancją, która będzie zapobiegać inaktywacji. 38

40 1 2 3 [018] Kompozycje farmaceutyczne według niniejszego ujawnienia mogą zawierać ilość skuteczną terapeutycznie lub ilość skuteczną profilaktycznie przeciwciała lub części przeciwciała. Ilość skuteczna terapeutycznie odnosi się do ilości skutecznej w dawkach i w czasie niezbędnym do osiągnięcia pożądanego efektu terapeutycznego. Ilość przeciwciała lub części przeciwciała skuteczna terapeutycznie lub inny inhibitor TNFα może się wahać w zależności od czynników, takich jak stadium choroby, wiek, pleć i waga pacjenta oraz zdolność wspomnianego przeciwciała, jego części lub innego inhibitora TNFα do uzyskania pożądanej odpowiedzi na leczenie u danego pacjenta. Terapeutycznie skuteczna ilość to ilość przeciwciała, części tego przeciwciała lub innego inhibitora TNFα, której korzystne efekty terapeutyczne przeważają nad efektami toksycznymi lub szkodliwymi. Ilość skuteczna profilaktycznie odnosi się do ilości skutecznej w dawkach i w czasie niezbędnym do osiągnięcia pożądanego efektu profilaktycznego. Ze względu na to, że dawka profilaktyczna przyjmowana jest w przypadku pacjentów przed zachorowaniem lub we wczesnych stadiach rozwoju choroby, ilość skuteczna profilaktycznie będzie mniejsza niż ilość skuteczna terapeutycznie. [0186] Schemat podawania można tak zmodyfikować, żeby uzyskać optymalną pożądaną odpowiedz na leczenie (tj. odpowiedź na leczenie lub profilaktykę). Przykładowo, w danym czasie można podawać pojedynczy bolus, kilka dawek lub pojedyncza dawkę proporcjonalnie zmniejszoną lub zwiększoną w zależności od potrzeby i sytuacji terapeutycznej. Jest to szczególnie korzystne w przypadku kompozycji pozajelitowej, którą można dla ułatwienia podawania i utrzymania stałego dawkowania, formułować w formie porcji odpowiadającej dawce. Forma porcji odpowiadającej dawce stosowana w niniejszym wynalazku, odnosi się do fizycznie oddzielnych porcji do leczenia osobników należących do ssaków; Każda porcja zawierająca wcześniej ustaloną ilość czynnika aktywnego dobrana jest tak, by osiągnąć w połączeniu z wymaganym nośnikiem farmaceutycznym pożądany efekt terapeutyczny. Opis dozowania dla form porcji odpowiadających dawce zależy i jest bezpośrednio zależny od (a) unikalnych cech czynnika aktywnego oraz poszczególnych terapeutycznych i profilaktycznych efektów do osiągnięcia i (b) ograniczeń nieodłącznie związanych ze sztuką tworzenia kompozycji z czynnikiem aktywnym do traktowania podatności u rożnych osobników. [0187] W jednym aspekcie, niniejsze ujawnienie dostarcza sposób leczenia zaburzeń związanych z TNFα za pomocą pojedynczej dawki, obejmujący podawanie potrzebującemu osobnikowi pojedynczej dawki inhibitora TNFα, takiego jak ludzkie przeciwciało. W jednym aspekcie, inhibitor TNFα jest przeciwciałem D2E7 skierowanym przeciwko TNFα. Pojedyncza dawka inhibitora TNFα może stanowi ilość efektywną terapeutycznie lub profilaktycznie. W jednym aspekcie, pacjentowi podaje się pojedynczą dawkę D2E7 w ilości mg, mg lub 80 mg. Pojedynczą dawkę można podać dowolna drogą obejmującą przykładowo drogę podania podskórnego. Schemat podawania dwa razy na tydzień można stosować przy leczeniu chorób, w których aktywność TNFα jest szkodliwy, i jak szerzej opisano w patencie USA Nr 03/02381 A1. Różnorodne sposoby wielokrotnego dawkowania w leczeniu lub prewencji można także zastosować do leczenia zaburzeń, w których aktywność TNFα jest szkodliwa, jak szerzej opisano WO 0/142. [0188] Należy zwrócić uwagę na fakt, że wartości dawek mogą się różnić w zależności od typu i zaawansowania choroby, której skutki maja łagodzić. Należy ponadto rozumieć, że dla każdego konkretnego pacjenta należy zmodyfikować schematy dawkowania w czasie terapii zgodnie z indywidualnymi potrzebami oraz fachową oceną osoby podającej lek lub sprawującej nadzór nad podawaniem kompozycji, oraz że zakresy dozowania przedstawione w niniejszym dokumencie są tylko przykładowe. 39

41 1 2 3 [0189] Niniejsze ujawnienie dotyczy również opakowania farmaceutycznego lub zestawów do podawania przeciwciał skierowanych przeciwko TNFα do leczenia AS. W jednym aspekcie niniejszego ujawnienia, wspomniany zestaw zawiera inhibitor TNFα, taki jak przeciwciało, drugą kompozycję farmaceutyczną zawierającą dodatkowy czynnik terapeutyczny oraz instrukcję podawania leku do leczenia AS. Instrukcje mogą opisywać, w jaki sposób, np. podskórnie, i kiedy np. w tygodniu 0 i 2, należy podawać leczonemu pacjentowi różne dawki inhibitora TNFα i/lub dodatkowy czynnik terapeutyczny. [0190] Inny aspekt niniejszego ujawnienia odnosi się do zastawów zawierających kompozycję farmaceutyczną obejmującą przeciwciało skierowane przeciwko TNFα oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik oraz jedną lub więcej niż jedną kompozycję farmaceutyczną zawierającą lek użyteczny w leczeniu chorób związanych z TNFα i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Alternatywnie, zestaw składa się z pojedynczej kompozycji farmaceutycznej obejmującej przeciwciało skierowane przeciwko TNFα, jeden lub więcej leków do leczenia chorób związanych z TNFα i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Zestawy zawierają instrukcje dotyczące dawkowania kompozycji farmaceutycznych do leczenia zaburzeń związanych z TNFα. W jednym wykonaniu, zestaw zawiera instrukcję dotyczącą sposobu określania skuteczności inhibitora TNFα w leczenia AS. Zestaw może zawierać dowolny z następujących składników do przeprowadzania sposobów według niniejszego wynalazku: wykrywalny czynnik, który specyficznie rozpoznaje CXT-II lub/i CTX-II i MMP-3, instrukcję obsługi, odczynniki do izolacji próbki od pacjenta. [0191] Opakowanie lub alternatywnie zestaw może zawierać inhibitor TNFα i może być zalecany do stosowania w leczeniu zaburzeń tu opisanych zarówno za pośrednictwem opakowania jak i dołączonej informacji. Ponadto opakowanie środków farmaceutycznych lub zestawach mogą zawierać drugi czynnik (jak tu opisano) pakowany lub zalecany do użytku za pomocą instrukcji stosowania drugiego czynnika z pierwszym czynnikiem (jak tu opisano). B. Dodatkowe czynniki terapeutyczne. [0192] Niniejsze ujawnienie odnosi się do określenia skuteczności w leczeniu AS samym inhibitorem TNF lub tym inhibitorem w kombinacji z dodatkowym czynnikiem terapeutycznym. Połączenie tych czynników w sposobach i kompozycje farmaceutyczne opisanych w niniejszym dokumencie może stanowić dodaną wartość terapeutyczną lub wywierać efekt synergistyczny na chorobę (choroby), na jakie leczenie jest ukierunkowane. Połączenie czynników używanych w opisanych tu sposobach i kompozycjach farmaceutycznych może także zredukować szkodliwy efekt związany z co najmniej jednym z czynników, kiedy jest on podawany w monoterapii lub bez drugiego czynnika (innych czynników) w konkretnej kompozycji farmaceutycznej. Na przykład, toksyczność skutków ubocznych jednego czynnika można złagodzić przez inny czynnik w kompozycji, umożliwiając stosowanie wyższych dawek pierwszego czynnika, uzyskując lepszą podatność pacjenta na leczenie pierwszym czynnikiem i poprawę wyników leczenia. Wartość dodana lub efekty synergistyczne, korzyści i zalety stosowanej kompozycji stosują się do klasy czynników terapeutycznych, klas strukturalnych lub funkcjonalnych lub do poszczególnych związków. [0193] Dodatkowe składniki aktywne mogą również zostać włączone do kompozycji. W niektórych wykonaniach, przeciwciało lub cześć tego przeciwciała według niniejszego wynalazku jest formułowana razem z i/lub podawana razem z jednym lub więcej niż jednym dodatkowym czynnikiem terapeutycznym, który jest użyteczny w leczeniu zaburzeń związanych z TNFα. Przykładowo przeciwciało skierowane przeciwko htnfα lub cześć przeciwciała lub inny inhibitor TNFα według niniejszego wynalazku może być w formulacji razem z i/lub podawany razem z jednym lub więcej niż jednym dodatkowym przeciwciałem, które wiąże inne struktury docelowe (np. przeciwciała, które wiążą inne cytokiny lub wiążą cząsteczki występujące

42 1 2 3 na powierzchni komórki), jedną lub więcej cytokin, rozpuszczalny receptor TNFα (patrz np. publikacja PCT nr WO 94/06476) i/lub jeden lub więcej czynników chemicznych, które hamują wytwarzanie lub aktywność htnfα (takie jak pochodne cykloheksyliden, jak opisano w publikacji PCT Nr WO 93/1971). Ponadto, jedno lub więcej przeciwciał lub innych inhibitorów TNFα według niniejszego ujawnienia można użyć w kombinacji z dwoma lub więcej niż dwoma powyżej wymienionymi czynnikami terapeutycznymi. Takie połączenie terapii korzystnie umożliwia stosowanie niższych dawek podawanych czynników terapeutycznych, co pozwala uniknąć ewentualnej toksyczności lub komplikacji związanej ze stosowaniem różnych monoterapii. [0194] Nie ograniczające przykłady czynników terapeutycznych, z którymi można łączyć przeciwciało, cześć przeciwciała lub inny inhibitor TNFα w sposobie leczenia i określić skuteczność leczenia zgodnie ze sposobami według wynalazku obejmują następujące elementy: niesteroidowy lek (leki) przeciwzapalny (NLPZ); przeciwzapalny lek (leki) immunosupresyjny hamujący działanie cytokin (CSAID); CDP-71BAY (humanizowane przeciwciało skierowane przeciwko TNFα Celltech/Bayer); ca2/infliksymab (chimeryczne przeciwciało skierowane przeciwko TNFα, Centocor); 7 kdtnfr-igg/etanercept (7 kd białko fuzyjne TNF receptor-igg; Immunex; patrz np. Arthritis & Rheumatism (1994) Tom 37, S29; J. Invest. Med. (1996) vol. 44, 23A); kdtnf-igg ( kd białko fuzyjne TNF receptor-igg; Hoffmann-LaRoche); IDEC-CE9.1/SB 2396 (nie eliminujące przeciwciała prymatyzowane anty-cd4; IDEC/SmithKline; patrz np. Arthritis & Rheumatism (199) Tom 38, S18); DAB 486-IL-2 i/lub DAB 389-IL-2 (białka fuzyjne IL-2; Seragen; patrz np., Arthritis & Rheumatism (1993) Tom 36, 1223); Anti-Tac (humanizowane przeciwciało anty-il-2rα; Protein Design Labs/Roche); IL-4 (cytokina przeciwzapalna; DNAX/Schering); IL- (SCH 00; rekombinowany IL-, przeciwzapalna cytokina; DNAX/Schering); IL-4; IL- i/lub agonista IL-4 (np. przeciwciała agonistyczne); IL-1RA (IL-1 receptor antagonistyczny; Synergen/Amgen); anakinra (Kineret /Amgen); TNF-bp/s-TNF (rozpuszczalne białko wiążące TNF; patrz np. Arthritis & Rheumatism (1996) Tom 39, Nr 9 (supplement), S284; Amer. J. Physiol. - Heart and Circulatory Physiology (199) Tom 268, str ); R9731 (phosphodiesterase Type IV inhibitor; patrz np., Arthritis & Rheumatism (1996) Tom 39, Nr 9 (supplement), S282); MK-966 (COX-2 Inhibitor; patrz np., Arthritis & Rheumatism (1996) Tom 39, Nr 9 (supplement), S81); Iloprost (patrz np. Arthritis & Rheumatism (1996) Tom 39, Nr 9 (supplement), S82); metotreksat; talidomid (patrz np., Arthritis & Rheumatism (1996) Tom 39, Nr 9 (supplement), S282) i leki podobne do talidomidu (np. Celgen); leflunomide (przeciwzapalny inhibitor cytokin; patrz np. Arthritis & Rheumatism (1996) Tom 39, nr 9 (supplement), S131; Inflammation Research (1996) Tom 4, str. 3-7); kwas traneksamowy (inhibitor aktywacji plazminogenu; patrz np. Arthritis & Rheumatism (1996) Tom 39, nr 9 (supplement), S284); T-614 (inhibitor cytokin; patrz np., Arthritis & Rheumatism (1996) Tom 39, nr 9 (supplement), S282); prostaglandyna E1 (patrz np., Arthritis & Rheumatism (1996) Tom 39, nr 9 (supplement), S282); Tenidap (niesteroidowy lek przeciwzapalny; patrz np.arthritis & Rheumatism (1996) Tom 39, Nr 9 (supplement), S280); Naproxen (niesteroidowy lek przeciwzapalny; patrz np. euro Report (1996) Tom 7, str ; Meloksykam (niesteroidowy lek przeciwzapalny); Ibuprofen (niesteroidowy lek przeciwzapalny); Piroksykam (niesteroidowy lek przeciwzapaly); Diklofenak (niesteroidowy lek przeciwzapalny); Indomethacin (niesteroidowy lek przeciwzapalny); Sulfasalazine (patrz: np. Arthritis & Rheumatism (1996) Tom 39, Nr 9 (supplement), S281); Azathioprine (patrz np. Arthritis & Rheumatism (1996) Tom 39, Nr 9 (supplement), S281); inhibitor ICE (inhibitor enzymu konwertującego interleukinę-1β); zap-70 i/lub inhbitor lck (inhibitor kinazy tyrozynowej zap-70 lub 1ck); inhibitor VEGF i/lubvegf-r (inhibitor czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego lub jego receptora; inhibitory angiogenezy); kortykosteroidowe leki przeciwzapalne (np. SB380); inhibitory konwertazy TNF; przeciwciała anty IL-12; przeciwciała anti-il- 41

43 ; interleukina-11 (patrz np. Arthritis & Rheumatism (1996) Tom 39, Nr 9 (supplement), S296); interleukina- 13 (patrz np. Arthritis & Rheumatism (1996) Tom 39, Nr 9 (supplement), S8);inhibitory interleukiny-17 (patrz np. Arthritis & Rheumatism (1996) Tom 39, Nr 9 (supplement), S1); złoto, penicylamina, chlorochina, hydroksychlorochina, chlorambucyl, cyklosporyna, cyklofosfamid; calkowite naswietlenie limfidalne, globulina antytymocytarna, przeciwciała anty-cd4, toksyny-cd, doustnie podawane peptydy i kolagen; lobenazaryt disodowy; Czynniki Regulujące Cytokiny (CRA) HP228 i HP466 (Houghten Pharmaceuticals, Inc.); ICAM-1 antysensowne oligonukleotydy fosfosiarkowe (ISIS 22; Isis Pharmaceuticals, Inc.); rozpuszczalny receptor komplementu 1 (TP; T Cell Sciences, Inc.); prednizon; dyzmutaza ponadtlenkowa; polisiarczanowy glikozaminoglikan; minocyklina; przeciwciała anty-il2r; morskie i roślinne lipidy (kwasy tłuszczowe ryb i z nasion ; patrz np. DeLuca i wsp. (199) Rheum. Dis. Clin. North Am. 21:79-777); auranofin; fenylobutazon ;kwas meklofenamowy; kwas flufenamowy; immunoglobuliny podawane dożylnie; zyleuton; azarybina; kwas mykofenolowy (RS-61443); takrolimuss (FK-06); sirolimus (rapamycyna); amipryloza (terafektyna); kladrybina (2-chloro-deoksy-adenozyna); metotreksat; czynniki przeciwwirusowe oraz czynniki modulujące odporność. Każdy z wyżej wymienionych czynników może być stosowany w połączeniu z przeciwciałem TNFα według niniejszego ujawnienia do leczenia zaburzeń związanych z TNFα przy zastosowaniu sposobu leczenia podawania wielokrotnych różnych dawek lub pojedynczej dawki. [019] W jednym wykonaniu, niniejsze ujawnienie obejmuje wyrób lub sposób leczenia do określania skuteczności inhibitora TNF w połączeniu z jednym lub następującymi czynnikami do leczenia zaburzeń związanych z TNFα, w których aktywność TNFα jest szkodliwa: przeciwciała anty-il12 (ABT 874); przeciwciała anty-il18 (ABT 32); drobnocząsteczkowy inhibitor LCK, drobnocząsteczkowy inhibitor COT; przeciwciało anty-il1;drobnocząsteczkowy inhibitor MK2; przeciwciało anty-cd19; drobnocząsteczkowy inhibitor CXCR3;drobnocząsteczkowy inhibitora CCR; drobnocząsteczkowy inhibitora CCR11 przeciwciało anty selektyna E/L; drobnocząsteczkowy inhibitor P2X7; drobnocząsteczkowy inhibitora IRAK-4; drobnocząsteczkowy agonista receptora glikokortykosteroidów. przeciwciało anty- receptor Ca; inhibitor drobnocząsteczkowy receptora Ca; przeciwciało anty-cd32 i CD32 jako białko terapeutyczne. [0196] W jeszcze innym wykonaniu, niniejsze ujawnienie obejmuje wyrób lub sposób leczenia do określania skuteczności inhibitora TNF w kombinacji z antybiotykiem lub czynnikiem przeciwinfekcyjnym. Czynniki antyinfekcyjne obejmują te czynniki znane w stanie techniki, którymi leczone są infekcje wirusami, grzybami, pasożytami lub bakteriami. Określenie antybiotyk tu stosowane odnosi się do substancji chemicznej, która hamuje wzrost lub zabija mikroorganizmy. Określenie to obejmuje zarówno antybiotyki produkowane przez mikroorganizmy jak i antybiotyki syntetyczne (np. analogi) znane w stanie techniki. Antybiotyki obejmują, ale nie ograniczają się do klarytromycyny (Biaxin ), cyprofloksacyny (Cipro ) i metronidazolu (Flagyl ). [0197] W jeszcze innym wykonaniu, niniejsze ujawnienie obejmuje wyrób lub sposób leczenia do określania skuteczności inhibitora TNF w kombinacji z lekiem używanym do leczenia choroby Crohna lub zaburzeń związanych z chorobą Crohna. Przykłady czynników terapeutycznych, które można stosować w leczeniu choroby Leśniowskiego-Crohna obejmuje mesalaminę, prednizol, azatioprynę, merkaptopurynę, imfiksymab, budezonid, sulfasalazynę, bursztynian sodowy metyloprednizolonu, difenoksylat/siarczan atropiny, wodorochlorek loperamidu, metotreksat, omeprazol, foliany, ciprofloksacin/roztwór dekstroza-woda, wodorowinian hydrokodonu/apap, hydrochlorek tetracykliny, fluocynonid, metronidazol, timerozal/kwas borny, siarczan hjoscyjaminy, cholestyraminę/sacharoza, hydrochlorek ciprofloksaciny, hydrochlorek meperydyny, hydrochlorek midazolamu, hcl oksykodonu/acetaminofen, hydrochlorek prometazyny, fosforan 42

44 1 2 3 sodu, sulfametoksazol/trimetoprim, celekoksyb, polikarbofil, propoxyphene napsylate - tego na razie nie umiem znalezc hydrokortyzon, multiwitaminy, balsalazyd dwusodowy, fosforan kodeiny/apap, hcl kolesewelamu, cjanokobalaminę, kwas foliowy, lewofloksacynę, natalizumab, metyloprednizolon, interferongamma i sargramostim (GM-CSF). W jednym wykonaniu metotreksat jest podawany do leczenia choroby Leśniewskiego-Crohna w dawce od 2, mg do mg na tydzień. [0198] Przeciwciała skierowane przeciwko TNFα mogą być podawane w kombinacji ze stosowanymi miejscowo kortykosteroidami, analogami witaminy D oraz stosowanymi miejscowo lub doustnie retinoidami lub ich kombinacją do leczenia łuszczycy. Ponadto, przeciwciała skierowane przeciwko TNFα można podawać w kombinacji jednym z następujących czynników do leczenia łuszczycy: drobnocząsteczkowy inhibitor KDR (ABT - 123), drobnocząsteczkowy inhibiotor Tie-2, calcipotriene, propionian klobetazolu, acetonid triamcynolonu, propionian halobetazolu, tazaroten, metotreksat, fluocynonid, betametazon dipropionianu powiększony, fluocynolon, acetonid, acytretyna, szampon dziegciowy, betametazon walerianian, mometazol fenetylu, ketokonazol, pramoksyna / fluocynolon, walerianian hydrokortyzonu, flurandrenolid, mocznik, betametazon, klobetazol propionianu / emoll, propionian flutikazonu, azytromycyna, hydrokortyzon, formuła nawilżająca, kwas foliowy, dezonid, smołya węglowa dwuoctan diflorazon, etanercept, kwas foliowy, kwas mlekowy, metoksalen, hc / bizmut subgal / znox / resor, metyloprednizolonu etylu, prednizon, krem z filtrem ochronnym, kwas salicylowy, halcynonid, Anthralin, klokortolon piwalinianu, wyciąg z węgla, smółka węglowa / kwas salicylowy, smoła węglowa/ kwas salicylowy / siarka, dezoksymetazon, diazepam, środki zmiękczające, pimekrolimus zmiękczające, fluocynonid / zmiękczające, olej mineralny / olej rycynowy / na lact, olej mineralny/ olej arachidowy, ropa naftowa / mirystynian izopropylowy, psoralen, kwas salicylowy, mydło / Tribromzalan, tiomersal / kwas borowy, celekoksyb, infliksymab, alefacept, efalizumab, takrolimus, pimekrolimus, PUVA, UVB i inne fototerapia i sulfasalazyna. [0199] W jednym wykonaniu przeciwciało skierowane przeciwko TNFα według niniejszego ujawnienia do użycia w sposobach według niniejszego wynalazku jest podawane sposobem wielokrotnych różnych dawek do leczenia AS w kombinacji z jednym lub większą liczba czynników do leczenia zaburzeń jelitowych. W innym wykonaniu, wspomniane powyżej dodatkowe czynniki są używane w kombinacji z przeciwciałem skierowanym przeciwko TNFα sposobem leczenia polegającym na podawaniu pojedynczej dawki. W jeszcze innym wykonaniu przeciwciało skierowane przeciwko TNFα jest podawane w schemacie leczenie dwa razy na tydzień. [00] Dowolny wyżej wspomniany czynnik terapeutyczny, w monoterapii lub w kombinacji, może być podawany pacjentowi cierpiącemu na zaburzenie związane z TNFα, w których TNFα jest szkodliwy, w kombinacji z przeciwciałem skierowanym przeciwko TNFα, używając schematu leczenia w wielu zmiennych dawkach. W jednym wykonaniu dowolny z wyżej wymienionych czynników terapeutycznych, w monoterapii lub w kombinacji może być podawany pacjentowi cierpiącemu na zaburzenia jelitowe oprócz przeciwciała skierowanego przeciwko TNFα do leczenia zaburzeń związanych z TNFα takich jak reumatoidalne zapalenie stawów. Należy przez to rozumieć, że dodatkowe środki terapeutyczne można wykorzystać w terapii zgodnie z opisem powyżej, ale również można je stosować przy innych wskazaniach tu opisanych, gdzie pożądany jest korzystny efekt. [01] Niniejszy wynalazek jest szerzej ilustrowany przez przykłady, które nie powinny być interpretowane jako w jakikolwiek sposób ograniczające. 43

45 1 2 3 PRZYKŁAD Przykład 1: Adalimumab tłumi markery biologiczne degradacji chrząstki i zapalenie błony maziowej stawu w aktywnej postaci zesztywniającego zapalenia stawów (AS). [02] Głównym celem niniejszego badania była analiza potencjalnych markerów biologicznych niszczenia chrząstki i kości np. markery resorpcji kości, markery degradacji kolagenu oraz markery zapalenia błony maziowej stawu w kontrolowanych testach adalimumabu w leczeniu AS w stopniu zaawansowania od umiarkowanego do ostrego. W badaniu starano się również przeanalizować efekt wpływu inhibitora TNF tzn. adalimumabu, na korelację markera resorpcji kości, markera degradacji kolagenu i marker zapalenie błony maziowej stawu z CRP, znanym jako marker dla AS, w populacji badanej pod kątem AS. Metody [03] Pacjenci z aktywna formą AS, którzy nieadekwatnie odpowiadali na leczenie za pomocą co najmniej NSAID lub DMARD, kwalifikowali się do grupy objętej niniejszymi badaniami. Projekt badań przedstawiono na Fig.1. Chorych dzielono losowo na grupy i podawano podskórnie (sc) placebo bądź adalimubab w ilości mg z częstotliwością co drugi tydzień (eow, ang. every other week) w czasie 24-tygodniowego okresu ślepego, po którym nastąpił 80-tygodniowy okres badań otwartych. Analizie poddano trzy markery biologiczne. Porównywano ich poziom w punkcie odniesienia oraz poziom tych markerów po leczeniu adalimumabem lub placebo po 12 i 24 tygodniu. Bardziej szczegółowo, analizowano marker resorpcji kości, N-końcowy telopeptyd kolagenu typu I (NTX), marker biologiczny degradacji kolagenu, C-końcowy telopeptyd kolagenu typu II z moczu (CTX-II z moczu), marker biologiczny zapalenia błony maziowej stawu i metaloproteinazę 3 macierzy zewnątrzkomórkowej (MMP-3) z surowicy. Tak więc, główne parametry skuteczności obejmowały kryteria robocze ASAS (ang. ASsessment of Spondylo Arthritis), indeks BASDAI (ang. the Bath AS Disease Activity Index) i CRP. Dla każdego pacjenta w teście ELISA zmierzono stężenie C-końcowego telopeptydu kolagenu typu II z moczu (CTX-II z moczu), N-końcowego telopeptydu kolagenu typu I z surowicy (NTX) oraz MMP-3 z surowicy w punkcie bazowym, i po 12 i 24 tygodniach. Wyznaczono różnice w stężeniu dla poziomu odniesienia w każdej grupie, a także korelację miedzy zmianami w stężeniu markerów biologicznych i innych wyników dla AS. [04] Kryteria włączenia pacjenta obejmowały następujące parametry: pacjenci 18 lat, aktywna forma AS zdefiniowana poprzez spełnienie 2 z 3 następujących kryteriów: (1) wynik BASDAI 4, (2) wynik VAS (ang. Visual Analog Scale) dla indeksu TBP (ang. Total Back Pain) 4, oraz (3) obserwowana sztywność poranna 1 godzina; oraz nieadekwatna odpowiedz na co najmniej jeden lek z grupy NLPZ. [0] Kryteria wyłączenia pacjenta obejmowały następujące parametry: wcześniejsze leczenie przeciwko TNF, radiologiczne dowody na całkowite zesztywnienie kręgosłupa (kręgosłup o wyglądzie kija bambusowego) wykorzystania poprzednich DMARD w ciągu 4 tygodni od punktu odniesienia (inne niż metotreksat, sulfasalazyna lub hydroksychlorochina), dostawowe wstrzyknięcie kortykosteroidów w ciągu 4 tygodni od punktu odniesienia, inne terapie o charakterze biologicznym lub eksperymentalnym w ciągu 6 tygodni od punktu odniesienia. Wyniki: [06] W sumie badaniem objęto 82 chorych. 44 pacjentom podano placebo vs. 38 oddano adalimumab. Z pośród 82 uczestników 24 tygodniowe badanie ukończyło 80 (98 %) pacjentów. Dwóch pacjentów, którzy nie ukończyli 24-tygodniowego okresu badania, było z grupy otrzymującej placebo. Podstawowe dane wyjściowe dla obu grup były podobne. Podstawowe dane demograficzne przedstawiono w Tabeli 1. 44

46 Tabela 1 Punkt odniesienia dla danych demograficznych. Placebo (N=44) Adalimumab mg eow (N= 38) Wiek (lata),0 41,9 Rasa (% przedstawicieli rasy kaukaskiej) 42 (9,) 37 (97,4) Płeć (% mężczyźni) 36 (81,8) 29 (76,3) Waga (kg) 78,2 76,1 Czas trwania AS (lata) 12,1 14, CRP (mg/dl) 2,3 1,8 NTX (nm/bce) 9,77, Stężeni CTX-II z moczu (ng/ml) 388,2 324,8 MMP-3 (ng/ml) 7,1 2,3 [07] Wśród wszystkich pacjentów objętych badaniem, poziomy CRP silnie korelowały z występującymi w moczu markerami CTX-II, MMP-3 i NTX na poziomie odniesienia. Korelacja między poziomami CTX i występującym w moczu CTX-II była silniejsza niż korelacja między poziomami CRP i MMP-3 oraz NTX. Korelację markera biologicznego i CRP na poziomie odniesienia pokazano w Tabeli 2 poniżej. Tabela 2. Korelacja markera biologicznego i CRP na poziomie odniesienia. Poziom odniesienia dla wszystkich R=wartość korelacji (N, p-wartość) pacjentów. CTX-II występujący w MMP-3 NTX moczu CRP 0,71 (80,<0.001) 0,4 (81,<0,001) 0,37 (80, 0,001) CTX-II występujący w moczu - 0,27 (79, 0,01) 0,49 (78, <0,001) r = wartość korelacji N = pacjenci [08] Znaczne obniżenie stężenia występującego w moczu CTX-II oraz MMP-3 (pokazano w Tabeli 3 poniżej) widoczne jest przy porównaniu adalimumab vs placebo pts w tygodniu 12 i 24 (p<0.001). Nie obserwowano natomiast znaczących różnic dla NTX. 1 2 Tabela 3. Znaczne obniżenie występującego w moczu CTX-II i MMP-3. Marker biologiczny Wizyta Zmiana - adalimumab ( %) Zmiana - efekt placebo ( %) CTX-II występujący w moczu Tydzień (-9.6) 43,8 (22,2) Tydzień 24-64,7 (3,2) 47,4 (29,8) MMP-3 Tydzień 12-3,9 (-12.3) 12,4 (18,9) Tydzień (- 8,6) 12, (,1) [09] Jak pokazano na Fig.2, w 12 i 24 tygodniu u pacjentów leczonych adalimumabem obserwowano znaczące w porównaniu do efektu placebo, obniżenie poziom CTX-II w moczu. Jak pokazano na Fig. 3, w 12 i 24 tygodniu u pacjentów leczonych adalimumabem następuje statystycznie znaczące w porównaniu do efektu placebo obniżenie poziomów MMP-3. Jak pokazano na Fig.4, w 12 i 24 tygodniu u pacjentów poddanych leczeniu adalimumabem w porównaniu do pacjentów leczonych placebo poziomy CRP były znacząco obniżony. [02] W grupie poddanej leczeniu adalimumabem. zmiany w poziomach CRP, występującego w moczu CTX-II i MMP-3 istotnie statystycznie ze sobą korelowały w stosunku do poziomu odniesienia. Istotne korelacje zaobserwowano między CRP na poziomie poziomu odniesienia i 1) CTX-II występującym w moczu (r=0,71), 2) MMP-3 (r=0,4) i 3) NTX (r=0,37) (p<0,001), oraz między CTX-II występującym w moczu i NTX (r=0,49; P<0,0001). Po 12 tygodniach zmiany poziomu CTX-II w moczu oraz MMP-3 silnie korelowały ze zmianami w poziomie CRP (r=0, i 0,43, odpowiednio) (p<0,00). Co więcej, po 12 tygodniach zmiana w poziomie CTX-II występującym w moczu znacząco korelowała ze zmianą poziomu w MMP-3 (r=0,41, 4

47 p<0,0001). W grupie leczonej adalimumabem, analiza korelacji potwierdza, że pozytywna zmiana w poziomie CRP jest związana z redukcją zarówno poziomu CTX-II w moczu jak i poziomu MMP-3. Korelacja między CRP i zmianą poziomu markera biologicznego w stosunku do poziomu odniesienia w 12 tygodniu pokazano w Tabeli 2. Tabela 4. Korelacja między CRP i zmianą poziomu markera biologicznego w stosunku do poziomu odniesienia w 12 tygodniu* Placebo R=wartość korelacji (N, p-wartość) CTX-II występujący w moczu MMP-3 NTX CRP 0,21 (42, 0,172 ). 0,34 (44, 0,023) 0,08 (43, 0,629). CTX-II występujący w moczu - 0,4 (42, 0,003) 0,27 (41, 0,089) Adalimumab CTX-II występujący w moczu MMP-3 NTX CRP 0,41 (38, 0,0) 0,37 (37, 0,024) 0,08 (37, 0,6) CTX-II występujący w moczu - 0,1 (37, 0,37) 0, (37, 0,) 1 [0211] Podsumowując, u pacjentów z postacią AS od umiarkowanej do ciężkiej, adalimumab znacząco tłumił markery biologiczne, którymi przejawia się zapalenie błony maziowej stawu i degradacja macierzy zewnątrzkomórkowej chrząstki. Adalimumab wywołał supresję markerów biologicznych, którymi przejawia się zapalenie błony maziowej stawu (MMP-3) oraz uszkodzenie macierzy zewnątrzkomórkowej chrząstki (CTX-II występujący w moczu), co sugeruje, że adalimumab spowalnia uszkodzenia strukturalne związane z AS. Co więcej, po 12 tygodniach zmiany w poziomie CTX-II występującego w moczu i MMP-3 znacząco korelowały ze zmianą poziomu CRP. 2 3 LISTA SEKWENCJI [0212] <1> Maksymowych, Walter P. i wsp. <1> Sposób i kompozycja do diagnozowania zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa z zastosowaniem markerów biologicznych <1> BBI-23PC <1> PCT/US06/4264 <141> <> 60/ <11> <160> 37 <170> FastSEQ dla Windows wersja 4.0 <2> 1 <211> 7 <2> <223> Region zmienny łańcucha lekkiego D2E7 <0> 1 <2> 2 <211>

48 <2> <223> Region zmienny łańcucha ciężkiego D2E7 <0> 2 1 <2> 3 <211> 9 <2> <223> Domena CDR3 regionu zmiennego łańcucha lekkiego D2E7 <221> wariant <222> 9 <223> Xaa = Thr lub Ala <0> <2> 4 <211> 12 <2> <223> Domena CDR3 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego D2E7 <221> wariant <222> 12 <223> Xaa = Tyr lub Asn <0> 4 <2> <211> 7 <2> <223> Domena CDR2 regionu zmiennego łańcucha lekkiego, <0> 4 <2> 6 <211> 17 <2> <223> Domena CDR2 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego, <0> 6 <2> 7 <211> 11 47

49 <2> <223> Domena CDR1 regionu zmiennego łańcucha lekkiego <0> 7 <2> 8 <211> <2> <223> Domena CDR1 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego <0> 8 1 <2> 9 <211> 7, <2> <223> Domena 2SD regionu zmiennego łańcucha lekkiego, <0> 9 2 <2> <211> 121 <2> <223> Domena 2SD4 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego <0> 3 <2> 11 <211> 9 <2> <223> Domena CDR3 2SD regionu zmiennego łańcucha lekkiego <0> 11 48

50 <2> 12 <211> 9 <2> <223> Domena EP B12 CDR3 regionu zmiennego łańcucha lekkiego <0> 12 1 <2> 13 <211> 9 <2> <223> domena EP B12 VLE4 CDR3 regionu zmiennego łańcucha lekkiego, <0> 13 <2> 14 <211> 9 <2> <223> Domena VL0A9 CDR3 regionu zmiennego lańcucha lekkiego, <0> 14 2 <2> 1 <211> 9 <2> <223> Domena CDR3 VLL0D2 regionu zmiennego łańcucha lekkiego <0> <2> 16 <211> 9 <2> <223> Domena VLLOF4 CDR3 regionu zmiennego łańcucha lekkiego <0> 16 <2> 17 <211> 9 <2> <223> Domena CDR3 LOE regionu zmiennego łańcucha lekkiego <0> 17 0 <2> 18 <211> 9 <2> <223> Domena CDR3 VLLOG7 regionu zmiennego łańcucha lekkiego <0> 18 <2> 19 <211> 9 49

51 <2> <223> Domena CDR3 VLLOG9 regionu zmiennego łańcucha lekkiego <0> 19 <2> <211> 9 <2> <223> Domena CDR3 VLLOH1 regionu zmiennego łańcucha lekkiego <0> 1 <2> 21 <211> 9 <2> <223> Domena CDR3 VLLOH regionu zmiennego łańcucha lekkiego <0> <2> 22 <211> 9 <2> <223> Domena CDR3 VL1B7 regionu zmiennego łańcucha lekkiego <0> 22 <2> 23 <211> 9 <2> <223> Domena CDR3 VL1C1 regionu zmiennego łańcucha lekkiego <0> 23 4 <2> 24 <211> 9 <2> <223> Domena CDR3 VL0.1F4 regionu zmiennego łańcucha lekkiego <0> 24 0 <2> 2 <211> 9 <2> <223> Domena CDR3 VL0.1H8 regionu zmiennego łańcucha lekkiego <0> 2 <2> 26 <211> 9 0

52 <2> <223> Domena CDR3 LOE7 A regionu zmiennego łańcucha lekkiego <0> 26 <2> 27 <211> 12 <2> <223> Domena CDR32SD4 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego <0> <2> 28 <211> 12 <2> <223> Domena CDR3 VH1B11 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego <0> 28 <2> 29 <211> 12 <2> <223> Domena CDR3 VH1D8 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego <0> 29 3 <2> <211> 12 <2> <223> Domena CDR3 VH1A11 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego <0> <2> 31 <211> 12 <2> <223> Domena CDR3 VH1B12 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego <0> <2> 32 <211> 12 <2> <223> Domena CDR3 VH1E4 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego <0> 32 <2> 33 <211> 12 <2> <223> Domena CDR3 VH1F6 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego 1

53 <0> 33 1 <2> 34 <211> 12 <2> <223> Domena CDR3 3C-H2 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego <0> 34 <2> 3 <211> 12 <2> <223> Domena CDR3 VH1-D2.N regionu zmiennego łańcucha ciężkiego <0> 3 2 <2> 36 <211> 321 <212> DNA <2> <223> Region zmienny łańcucha lekkiego D2E7 <0> 36 3 <2> 37 <211> 363 <212> DNA <2> <223> Region zmienny łańcucha ciężkiego D2E7 <0> 37 4 Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób określania skuteczności adalimumabu w leczeniu zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa (AS) u pacjenta z AS, który to sposób obejmuje oznaczenie poziomu C-końcowego telopeptydu kolagenu typu II (CTX-II) po leczeniu i poziomu metaloproteinazy macierzy zewnątrzkomórkowej 3 (MMP-3) po leczeniu w próbce/próbkach uzyskanych do pacjenta z AS, przy czym niższy poziom CTX-II w próbce/próbkach po leczeniu w stosunku do znanego standardowego poziomu CTX-II ustalonego w oparciu o dane od pacjenta/pacjentów z AS oraz niższy poziom MMP-3 w próbce/próbkach w stosunku do znanego standardowego poziomu MMP-3 ustalonego w oparciu o dane od pacjenta/pacjentów z AS wskazuje na to, że adalimumab jest skuteczny w leczeniu AS u pacjenta. 2

54 Sposób określania skuteczności adalimumabu w leczeniu zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa (AS) u pacjenta z AS, który to sposób obejmuje oznaczanie poziomu C-końcowego telopeptydu kolagenu typu II (CTX-II) przed leczeniem i poziomu metaloproteinazy 3 macierzy zewnątrzkomórkowej (MMP-3) przed leczeniem w próbce/próbkach otrzymanych od pacjenta z AS, przy czym niższy poziom CTX-II po leczeniu w odniesieniu do poziomu CTX-II przed leczeniem oraz niższy poziom MMP-3 po leczeniu w odniesieniu do poziomu MMP-3 przed leczeniem wskazuje na to, że adalimumab jest skuteczny w leczeniu AS u pacjenta. 3. Sposób określania skuteczności adalimumabu w leczeniu zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa (AS) u pacjenta z AS, który to sposób obejmuje oznaczenie poziomu C-końcowego telopeptydu kolagenu typu II (CTX-II) po leczeniu i poziomu metaloproteinazy macierzy zewnątrzkomórkowej 3 (MMP-3) po leczeniu w próbce/próbkach uzyskanych do pacjentów z AS, przy czym niższy poziom CTX-II po leczeniu w odniesieniu do poziomu CTX-II przed leczeniem oraz niższy poziom MMP-3 po leczeniu w odniesieniu do poziomu MMP-3 przed leczeniem wskazuje na to, adalimumab jest skuteczny w leczeniu AS u pacjenta. 4. Sposób określania skuteczności adalimumabu w leczeniu zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa (AS) u pacjenta z AS, który to sposób obejmuje oznaczanie poziomu C-końcowego telopeptydu kolagenu typu II (CTX-II) po leczeniu w próbce/próbkach otrzymanych od pacjenta z AS, przy czym obniżenie poziomu CTX-II o co najmniej 9% w odniesieniu do znanego poziomu standardowego CTX-II ustalonego w oparciu o dane od pacjenta/pacjentów z AS wskazuje na to, że adalimumab jest skuteczny w leczeniu AS u pacjenta.. Sposób według dowolnego zastrzeżenia od 1 do 4, przy czym CTX-II jest CTX-II z moczu. 6. Sposób według zastrz. 1, przy czym poziom CTX-II po leczeniu w próbce/próbkach otrzymanych od pacjenta, jest obniżony co najmniej o około 9% w odniesieniu do znanego standardowego poziomu CTX-II ustalonego w oparciu o dane pacjenta/pacjentów z AS. 7. Sposób według zastrz. 1, przy czym poziom MMP-3 po leczeniu w próbce/próbkach otrzymanych od pacjenta, jest obniżony co najmniej o około 8% w odniesieniu do znanego standardowego poziomu MMP-3 ustalonego w oparciu o dane pacjenta/pacjentów z AS. 8. Sposób według dowolnego zastrzeżenia od 1 do 3, przy czym MMP-3 jest MMP-3 z surowicy. 9. Sposób według dowolnego zastrzeżenia od 1 do 8 obejmujący porównanie poziomu białka C-reaktywnego (CRP) pacjenta ze znanym standardowym poziomem CRP związanym z AS; ocenę, czy poziom CRP pacjenta jest wyższy niż znany standardowy poziom CRP, przy czym niższy poziom CRP w stosunku do standardowego poziomu CRP wskazuje na skuteczność leczenia.. Sposób według dowolnego zastrzeżenia od 1 do 3, przy czym poziom MMP-3 jest oznaczany testem ELISA. 11. Sposób według dowolnego zastrzeżenia od 1 do 4, przy czym poziom CTX-II jest oznaczany testem ELISA. 3

55 Analiza statystyczna EP FIG. 1 Badania przesiewowe Podwójne wiązanie placebo-kontrola Badania otwarte Do 2 tygodni 24 tygodnie 80 tygodni Analiza pierwotna Tydzień Możliwość przerwania badania w tygodniu 12, 16, 4

56 Średnia zmiana w stosunku do linii bazowej EP FIG. 2 Zmiany w stężeniu CTX-II w 12 i 24 OLCF - skorygowana wartość średnia Tydzień 12 Tydzień 24 *** istotna statystycznie na poziomie p=0,001, adalimumab vs placebo

57 Średnia zmiana w stosunku do linii bazowej EP FIG. 3 Zmiany w stężeniu MMP-3 w 12 i 24 tygodniu OLCF - skorygowana wartość średnia Tydzień 12 Tydzień 24 *** istotna statystycznie na poziomie p=0,001, adalimumab vs placebo 6

58 Średnia zmiana w stosunku do linii bazowej mg/dl EP FIG. 4 Zmiany w CRP w 12 i 24 tygodniu Tydzień 12 Tydzień 24 OLCF ***skorygowana wartość średnia istotna statystycznie na poziomie p=0,001, graniczny poziom istotności dla różnić miedzy terapiami określony w analizie ANCOVA 7

59 Odnośniki cytowane w opisie Poniższa lista odnośników cytowanych przez zgłaszającego ma na celu wyłącznie pomoc dla czytającego i nie stanowi części dokumentu patentu europejskiego. Pomimo, że dołożono największej staranności przy jej tworzeniu, nie można wykluczyć błędów lub przeoczeń i EUP nie ponosi żadnej odpowiedzialności w tym względzie. Dokumenty patentowe cytowane w opisie Literatura niepatentowa cytowana w opisie 8

60 9

61 60