(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2012/25 EP B1 (13) (51) T3 Int.Cl. C07K 16/24 ( ) A61K 39/395 ( ) C12N 5/18 ( ) C07K 14/52 ( ) A61P 37/06 ( ) A61P 31/04 ( ) A61P 31/12 ( ) (54) Tytuł wynalazku: IP-10 przeciwciała i ich zastosowanie (30) Pierwszeństwo: US P (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2006/34 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2012/11 (73) Uprawniony z patentu: Medarex, Inc., Princeton, US (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 SHRIKANT DESHPANDE, Fremont, US HAICHUN HUANG, Fremont, US MOHAN SRINIVASAN, Cupertino, US JOSEPHINE M. CARDARELLI, San Carlos, US CHANGYU WANG, Fremont, US DAVID PASSMORE, Mountain View, US VANGIPURAM S. RANGAN, Pleasant Hill, US THOMAS E. LANE, Irvine, US HANS S. KEIRSTEAD, Irvine, US MICHAEL T. LIU, Irvine, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Helena Danuta Stefani-Iwanow JAN WIERZCHOŃ & PARTNERZY BIURO PATENTÓW I ZNAKÓW TOWAROWYCH SP.J. ul. Żurawia 47/ Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 14105/12/P-RO/DS/KM EP IP-10 PRZECIWCIAŁA I ICH ZASTOSOWANIE Opis: Tło wynalazku [0001] Białko indukujące interferon gamma 10 (IP-10) (znane również jako CXCL10) jest 10kDa chemokiną, którą pierwotnie zidentyfikowano na podstawie ekspresji genu IP-10 w komórkach leczonych interferonem gamma (IFN-gamma) (Luster, A.D. i współpracownicy (1985) Nature 315: ). IP-10 wykazuje homologię z białkami o aktywności chemotaktycznej, takimi jak czynnik płytkowy 4 i beta-tromoboglobulina i z białkami o mitogennej aktywności, takimi jak, peptyd III aktywujący tkanką łączną (Luster, AD i współpracownicy (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: ). IP-10 jest wyrażany przez wiele komórek, w tym komórki śródbłonka, monocyty, fibroblasty i keratynocyty, w odpowiedzi na IFNgamma (Luster, A.D. i Ravetch, JV (1987) J. Exp. Med. 166: ). Wykazano, że IP-10 również występuje w makrofagach skórnych i komórkach śródbłonka w reakcjachi nadwrażliwości typu późnego (DTH) w ludzkiej skórze (Kaplan, G. i współpracownicy (1987) J. Exp. Med. 166: ). Chociaż pierwotnie zidentyfikowany na podstawie jego indukowania przez IFN-gamma, IP-10 może być również indukowany przez IFN-alfa, na przykład w komórkach dendrytycznych (Padovan, E. i współpracownicy (2002) J. Leukoc. Biol. 71: ). Wyrażanie IP-10 może również być indukowane w komórkach centralnego układu nerwowego, takich jak astrocyty i mikrogleju, przez bodźce, takie jak IFN-gamma, wirusy i lipopolisacharydy (Vanguri R. i Farber, J.M. (1994) J. Immunol. 152: ; Ren, L.Q. i współpracownicy (1998) Brain Res. Mol. Brain Res. 59: ). Immunobiologię IP-10 omówiono w Neville, L.F. i współpracownicy (1997) Cytokine Growth Factor Rev. 8: [0002] Receptor dla IP-10 zidentyfikowano jako CXCR3, siedmio-transbłonowy receptor (Loetscher, M. i współpracownicy (1996) J. Exp. Med. 184: ). Wykazano, że CXCR3 jest wyrażany na aktywowanych limfocytach T, ale nie na spoczynkowych limfocytach T, ani na limfocytach B, monocytach i granulocytach (Loetscher, M. i współpracownicy, supra). Wykazano, że ekspresja CXCR3 jest nasilona w komórkach NK poprzez stymulację z TGFbeta 1 (Inngjerdingen, M. i współpracownicy (2001) Blood 97: ). Zidentyfikowano również dwa inne ligandy dla CXCR3: MIG (Loetscher, M. i współpracownicy, jak wyżej.) i ITAC (Cole, K.E. i współpracownicy (1998) J. Exp. Med. 187: ). [0003] Wykazano, że wiązanie IP-10 z CXCR3 pośredniczy w mobilizacji wapnia i chemotaksji w aktywowanych komórkach T (Loetscher, M. i współpracownicy, supra). Chemotaksja i wewnątrzkomórkowa mobilizacja wapnia są również indukowane przez wiązanie IP-10 CXCR3 na zaktywowanych komórkach NK (Maghazachi, A.A. i współpracownicy (1997) FASEBJ. 11: ). Wykazano, że w grasicy IP-10 jest chemoatraktantem dla TCRαβ + CD8 + komórek T, TCRyB + komórek T i komórek typu NK (Romagnani, P. i współpracownicy (2001) Blood 97: ). [0004] IP-10 lub jego receptor CXCR3 zidentyfikowano w różnych chorobach zapalnych i autoimmunologicznych, w tym stwardnieniu rozsianym (patrz np: Sorensen, T.L. i współpra-

3 - 2 - cownicy (1999) J. Clin. Invest. 103: ), reumatoidalnym zapaleniu stawów (patrz np: Patel, D.D. i współpracownicy (2001) Clin. Immunol. 98:39-45), wrzodziejącym zapaleniu jelita grubego (patrz np: Uguccioni, M. i współpracownicy (1999) Am. J. Pathol. 155: ), zapaleniu wątroby (patrz np. Narumi, S. i współpracownicy (1997) J. Immunol. 158: ), urazach rdzenia kręgowego (patrz np: McTigue, D.M. i współpracownicy (1998) J. Neurosci. Res. 53: ; Gonzalez i współpracownicy Exp. Neurol. 184: ), toczniu rumieniowatym układowym (patrz np: Narumi, S. i współpracownicy (2000) Cytokine 12: ), odrzuceniu przeszczepu (patrz np: Zhang, Z. i współpracownicy (2002) J. Immunol, 168: ), zespole Sjögrena (patrz np: Ogawa, N. i współpracownicy (2002) Arthritis Rheum. 46: ). W związku z tym są pożądane środki lecznicze, które hamują aktywność, w szczególności środki, które są odpowiednie do stosowania u ludzi. Istota wynalazku [0005] Niniejszy wynalazek dostarcza izolowane przeciwciała monoklonalne, w szczególności ludzkie przeciwciała monoklonalne, które wiążą się z IP-10 i które wykazują wiele korzystnych właściwości. Właściwości te obejmują wysokie powinowactwo wiążące z ludzkim IP-10, jak również reaktywność krzyżową z IP-10 małpy rezus, ale nie obejmują znacznej reaktywności krzyżowej z albo MIG człowieka, ITAC człowieka lub IP-10 myszy. Ponadto, przeciwciała hamują wiązanie IP-10 z jego receptorem, CXCR3, hamują wypływ jonów wapnia indukowany przez IP-10 w komórkach wyrażających receptor i hamują migrację komórek wywołaną przez IP-10 (chemotaksję). Co więcej, wykazano, że przeciwciała według wynalazku wiążą się z IP-10 w części mózgu człowieka, chorego na stwardnienie rozsiane. [0006] W szczególności, wynalazek dostarcza izolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne, lub jego część wiążącą antygen, przy czym przeciwciało obejmuje: (a) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 43 i region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 92; (b) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 35 i region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 84, lub (c) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 39 i region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 88. [0007] W korzystnych przykładach wykonania wynalazku, ludzki IP-10 obejmuje polipeptyd mający sekwencję aminokwasową jak przedstawiono w SEQ ID NO: 121 [Genbank Acc. No. NP_001556]; CXCR3 obejmuje polipeptyd mający sekwencję aminokwasową jak określono w SEQ ID NO: 122 [Genbank Acc. No. NP_001495]; IP-10 małpy rezus obejmuje polipeptyd mający sekwencję aminokwasową jak przedstawiono w SEQ ID NO: 123 [Genbank Acc. No. AAK95955]; mysi IP-10 obejmuje polipeptyd mający sekwencję aminokwasową jak przedstawiono w SEQ ID NO: 124 [Genbank Acc. No. NP_067249]; ludzki MIG obejmuje polipeptyd mający sekwencję aminokwasową jak przedstawiono w SEQ ID NO: 125 [Genbank

4 - 3 - Acc. No. NP_002407] i/lub ludzki ITAC obejmuje polipeptyd mający sekwencję aminokwasową jak określono w SEQ ID NO: 126 [Genbank Acc. No. NP_005400]. [0008] Przeciwciała według wynalazku mogą być, na przykład, przeciwciałami o pełnej długości, na przykład izotypu IgG1 lub IgG4. Alternatywnie, przeciwciała mogą być fragmentami przeciwciał, takimi jak fragmenty Fab lub Fab'2 lub przeciwciałami o pojedynczych łańcuchach. [0009] Wynalazek dostarcza również immunokoniugat zawierający przeciwciało wynalazku lub jego część wiążącą antygen, związane ze środkiem terapeutycznym, takim jak cytotoksyna lub izotop promieniotwórczy. Wynalazek dostarcza również bispecyficzną cząsteczkę zawierającą przeciwciało lub jego część wiążącą antygen, według wynalazku, połączoną z drugim ugrupowaniem funkcjonalnym mającym inną specyficzność wiązania niż przeciwciało lub jego część wiążącą antygen. [0010] Kompozycje zawierające przeciwciało lub jego część wiążącą antygen, lub immunokoniugat lub bispecyficzną cząsteczkę według wynalazku i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik są również przewidziane. [0011] Cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące przeciwciała lub ich części wiążące antygen, według wynalazku, są również objęte wynalazkiem, jak również wektory ekspresyjne zawierające takie kwasy nukleinowe i komórki gospodarza zawierające takie wektory ekspresyjne. Ponadto, wynalazek dostarcza transgeniczną mysz zawierającą ludzkie transgeny ciężkich i lekkich łańcuchów immunoglobuliny, gdzie mysz wyraża przeciwciało według wynalazku, jak również hybrydomy otrzymane z takiej myszy, w których hybrydoma wytwarza przeciwciało według wynalazku. Krótki opis rysunków [0012] Figura 1A przedstawia sekwencję nukleotydową (SEQ ID NO: 99) i sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 35) regionu zmiennego łańcucha ciężkiego w 1D4 ludzkiego przeciwciała monoklonalnego. Regiony CDR1 (SEQ ID NO: 1), CDR2 (SEQ ID NO: 13) i CDR3 (SEQ ID NO: 24) są dokładnie określone i są wskazane wyprowadzenia linii germinalnej V, D i J. Figura 1B przedstawia sekwencję nukleotydową (SEQ ID NO: 110) i sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 84) regionu zmiennego łańcucha lekkiego z 1 D4 ludzkiego przeciwciała monoklonalnego. Regiony CDR1 (SEQ ID NO: 51), CDR2 (SEQ ID NO: 62) i CDR3 (SEQ ID NO: 73) są dokładnie określone i są wskazane wyprowadzenia linii germinalnej V i J. Figura 2A przedstawia sekwencję nukleotydową (SEQ ID NO: 100) i sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 36) regionu zmiennego łańcucha ciężkiego z 1E 1 ludzkiego przeciwciała monoklonalnego. Regiony CDR1 (SEQ ID NO: 2), CDR2 (SEQ ID NO: 14) i CDR3 (SEQ ID NO: 25) są dokładnie określone i są wskazane wyprowadzenia linii germinalnej V i J. Figura 2B przedstawia sekwencję nukleotydową (SEQ ID NO: 111) i sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 85) z regionu zmiennego łańcucha lekkiego w 1E1 ludzkiego przeciwciała monoklonalnego. Regiony CDR1 (SEQ ID NO: 52), CDR2 (SEQ ID NO: 63) i CDR3

5 - 4 - (SEQ ID NO: 74) są dokładnie określone i są wskazane wyprowadzenia linii germinalnej V i J. Figura 3A przedstawia sekwencję nukleotydową (SEQ ID NO: 101) i sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 37) regionu zmiennego łańcucha ciężkiego ludzkiego przeciwciała monoklonalnego 2G1. Regiony CDR1 (SEQ ID NO: 3), CDR2 (SEQ ID NO: 15) i CDR3 (SEQ ID NO: 26) są dokładnie określone i są wskazane wyprowadzenia linii germinalnej V i J. Figura 3B przedstawia sekwencję nukleotydową (SEQ ID NO: 112) i sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 86) regionu zmiennego łańcucha lekkiego ludzkiego przeciwciała monoklonalnego 2G1. Regiony CDR1 (SEQ ID NO: 53), CDR2 (SEQ ID NO: 64) i CDR3 (SEQ ID NO: 75) są dokładnie określone i są wskazane wyprowadzenia linii germinalnej V i J. Figura 4a przedstawia sekwencję nukleotydową (SEQ ID NO: 102) i sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 38) regionu zmiennego łańcucha ciężkiego 3C4 ludzkiego przeciwciała monoklonalnego. Regiony CDR1 (SEQ ID NO: 4), CDR2 (SEQ ID NO: 16) i CDR3 (SEQ ID NO: 27) są dokładnie określone i są wskazane wyprowadzenia linii germinalnej V, D i J. Figura 4B przedstawia sekwencję nukleotydową (SEQ ID NO: 113) i sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 87) regionu zmiennego łańcucha lekkiego 3C4 ludzkiego przeciwciała monoklonalnego. Regiony CDR1 (SEQ ID NO: 54), CDR2 (SEQ ID NO: 65) i CDR3 (SEQ ID NO: 76) są dokładnie określone i są wskazane wyprowadzenia linii germinalnej V i J. Figura 5A przedstawia sekwencję nukleotydową (SEQ ID NO: 103) i sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 39) regionu zmiennego łańcucha ciężkiego ludzkiego przeciwciała monoklonalnego 6A5. Regiony CDR1 (SEQ ID NO: 5), CDR2 (SEQ ID NO: 17) i CDR3 (SEQ ID NO: 28) są dokładnie określone i są wskazane wyprowadzenia linii germinalnej V, D i J. Figura 5B przedstawia sekwencję nukleotydową (SEQ ID NO: 114) i sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 88) regionu zmiennego łańcucha lekkiego ludzkiego przeciwciała monoklonalnego 6A5. Regiony CDR1 (SEQ ID NO: 55), CDR2 (SEQ ID NO: 66) i CDR3 (SEQ ID NO: 77) są dokładnie określone i są wskazane wyprowadzenia linii germinalnej V i J. Figura 6A przedstawia sekwencję nukleotydową (SEQ ID NO: 104) i sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 40) regionu zmiennego łańcucha ciężkiego ludzkiego przeciwciała monoklonalnego 6A8. Regiony CDR1 (SEQ ID NO: 6), CDR2 (SEQ ID NO: 18) i CDR3 (SEQ ID NO: 29) są dokładnie określone i są wskazane wyprowadzenia linii germinalnej V i J. Figura 6B przedstawia sekwencję nukleotydową (SEQ ID NO: 115) i sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 89) z regionu zmiennego łańcucha lekkiego ludzkiego przeciwciała monoklonalnego 6A8. Regiony CDR1 (SEQ ID NO: 56), CDR2 (SEQ ID NO: 67) i CDR3 (SEQ ID NO: 78) są dokładnie określone i są wskazane wyprowadzenia linii germinalnej V i J. Figura 7A przedstawia sekwencję nukleotydową (SEQ ID NO: 105) i sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 41) regionu zmiennego łańcucha ciężkiego ludzkiego przeciwciała monoklonalnego 6B10. Regiony CDR1 (SEQ ID NO: 7), CDR2 (SEQ ID NO: 19) i CDR3 (SEQ ID NO: 30) są dokładnie określone i są wskazane wyprowadzenia linii germinalnej V, D i J. Figura 7B przedstawia sekwencję nukleotydową (SEQ ID NO: 116) i sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 90) regionu zmiennego łańcucha lekkiego ludzkiego przeciwciała mono-

6 - 5 - klonalnego 6B10. Regiony CDR1 (SEQ ID NO: 57), CDR2 (SEQ ID NO: 68) i CDR3 (SEQ ID NO: 79) są dokładnie określone i są wskazane wyprowadzenia linii germinalnej V i J. Figura 8A przedstawia sekwencję nukleotydową (SEQ ID NO: 106) i sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 42) regionu zmiennego łańcucha ciężkiego ludzkiego przeciwciała monoklonalnego 7C10. Regiony CDR1 (SEQ ID NO: 8), CDR2 (SEQ ID NO: 20) i CDR3 (SEQ ID NO: 31) są dokładnie określone i są wskazane wyprowadzenia linii germinalnej V, D i J. Figura 8B przedstawia sekwencję nukleotydową (SEQ ID NO: 117) i sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 91) z regionu zmiennego łańcucha lekkiego ludzkiego przeciwciała monoklonalnego 7C10. Regiony CDR1 (SEQ ID NO: 58), CDR2 (SEQ ID NO: 69) i CDR3 (SEQ ID NO: 80) są dokładnie określone i są wskazane wyprowadzenia linii germinalnej V i J. Figura 9A przedstawia sekwencję nukleotydową (SEQ ID NO: 107) i sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 43) regionu zmiennego łańcucha ciężkiego ludzkiego przeciwciała monoklonalnego 8F6. Regiony CDR1 (SEQ ID NO: 9), CDR2 (SEQ ID NO: 21) i CDR3 (SEQ ID NO: 32) są dokładnie określone i są wskazane wyprowadzenia linii germinalnej V, D i J. Figura 9B przedstawia sekwencję nukleotydową (SEQ ID NO: 118) i sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 92) regionu zmiennego łańcucha lekkiego ludzkiego przeciwciała monoklonalnego 8F6. Regiony CDR1 (SEQ ID NO: 59), CDR2 (SEQ ID NO: 70) i CDR3 (SEQ ID NO: 81) są dokładnie określone i są wskazane wyprowadzenia linii germinalnej V i J. Figura 10A przedstawia sekwencję nukleotydową (SEQ ID NO: 108) i sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 44) regionu zmiennego łańcucha ciężkiego ludzkiego przeciwciała monoklonalnego 10A12. Regiony CDR1 (SEQ ID NO: 10), CDR2 (SEQ ID NO: 22) i CDR3 (SEQ ID NO: 33) są dokładnie określone i są wskazane wyprowadzenia linii germinalnej V i J. Alternatywnie, reszta aminokwasowa 32 w CDR1 może być zmutowana z cysteiny do seryny (SEQ ID NO: 11), co prowadzi do VH sekwencji SEQ ID NO: 45. Figura 10B przedstawia sekwencję nukleotydową (SEQ ID NO: 119) i sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 93) regionu zmiennego łańcucha lekkiego ludzkiego przeciwciała monoklonalnego 10A12. Regiony CDR1 (SEQ ID NO: 60), CDR2 (SEQ ID NO: 71) i CDR3 (SEQ ID NO: 82) są dokładnie określone i są wskazane wyprowadzenia linii germinalnej V i J. Figura 11A przedstawia sekwencję nukleotydową (SEQ ID NO: 109) i sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 46) regionu zmiennego łańcucha ciężkiego ludzkiego przeciwciała monoklonalnego 13C4. Regiony CDR1 (SEQ ID NO: 12), CDR2 (SEQ ID NO: 23) i CDR3 (SEQ ID NO: 34) są dokładnie określone i są wskazane wyprowadzenia linii germinalnej V, D i J. Figura 11B przedstawia sekwencję nukleotydową (SEQ ID NO: 120) i sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 94) regionu zmiennego łańcucha lekkiego ludzkiego przeciwciała monoklonalnego 13C4. Regiony CDR1 (SEQ ID NO: 61), CDR2 (SEQ ID NO: 72) i CDR3 (SEQ ID NO: 83) są dokładnie określone i są wskazane wyprowadzenia linii germinalnej V i J. Figura 12 przedstawia wyrównywanie (nakładanie) sekwencji aminokwasowej regionu zmiennego łańcucha ciężkiego 1D4 i 1E1 i 2G1, 6A5, 6A8, 7C10 i 10A12 z sekwencją aminokwasową (SEQ ID NO: 47) ludzkiej linii germinalnej V H 3-33.

7 - 6 - Figura 13 przedstawia wyrównywanie (nakładanie) sekwencji aminokwasowej regionu zmiennego łańcucha ciężkiego 6B10 i 8F6 z z sekwencją aminokwasową (SEQ ID NO: 48) ludzkiej linii germinalnej V H Figura 14 przedstawia wyrównywanie (nakładanie) sekwencji aminokwasowej regionu zmiennego łańcucha ciężkiego 3C4 z sekwencją aminokwasową (SEQ ID NO: 49) ludzkiej linii germinalnej V H Figura 15 przedstawia wyrównywanie (nakładanie) sekwencji aminokwasowej regionu zmiennego łańcucha ciężkiego 13C4 z sekwencją aminokwasową (SEQ ID NO: 50) ludzkiej linii germinalnej V H Figura 16 przedstawia wyrównywanie (nakładanie) sekwencji aminokwasowej regionu zmiennego łańcucha lekkiego 1D4, 2G1, 6A5, 6A8, 10A12 i 13C4 z sekwencją aminokwasową (SEQ ID NO: 95) ludzkiej linii germinalnej V K A-27. Figura 17 przedstawia wyrównywanie (nakładanie) sekwencji aminokwasowej regionu zmiennego łańcucha lekkiego 1E1, 6B10 i 8F6 z sekwencją aminokwasową (SEQ ID NO: 96) ludzkiej linii germinalnej V K L-6. Figura 18 przedstawia wyrównywanie (nakładanie) sekwencji aminokwasowej regionu zmiennego łańcucha lekkiego 3C4 z sekwencją aminokwasową (SEQ ID NO: 97) ludzkiej linii germinalnej V K L-18. Figura 19 przedstawia wyrównywanie (nakładanie) sekwencji aminokwasowej regionu zmiennego łańcucha lekkiego 7C10 z sekwencją aminokwasową (SEQ ID NO: 98) ludzkiej linii germinalnej V K L-15. Szczegółowy opis wynalazku [0013] Wynalazek dotyczy izolowanych ludzkich przeciwciał monoklonalnych, które wiążą się specyficznie z IP-10 i które hamują właściwości funkcjonalne IP-10. Wynalazek dostarcza izolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne, lub jego część wiążącą antygen, w którym przeciwciało obejmuje: (a) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 43 i region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 92; (b) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 35 i region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 84, lub (c) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 39 i region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 88. [0014] Wynalazek dostarcza również immunokoniugaty i bispecyficzne cząsteczki zawierające takie przeciwciała i kompozycje farmaceutyczne zawierające przeciwciała, immunokoniugaty lub bispecyficzne cząsteczki według wynalazku.

8 - 7 - [0015] Celem lepszego zrozumienia wynalazku, należy najpierw zdefiniować pewne terminy. Dodatkowe definicje są określone w całym szczegółowym opisie. [0016] Terminy "białko indukujące interferon gamma 10" "IP-10" i "CXCL10" są używane zamiennie i obejmują warianty, izoformy i gatunki homologiczne ludzkiego IP-10. Zgodnie z tym, ludzkie przeciwciała według wynalazku mogą, w niektórych przypadkach, ulegać reakcji krzyżowej z IP-10 z gatunków innych niż ludzki. W innych przypadkach, przeciwciała mogą być całkowicie specyficzne dla ludzkiego IP-10 i nie mogą wykazywać reakcji krzyżowej gatunków lub innych rodzajów. Pełną sekwencję aminokwasową ludzkiego IP-10 ma Genbank numer dostępu NP_ (SEQ ID NO: 121). Pełną sekwencję aminokwasową IP-10 małpy rezus ma Genbank numer dostępu AAK95955 (SEQ ID NO: 123). Pełną sekwencję aminokwasową IP-10 myszy ma Genbank numer dostępu NP_ (SEQ ID NO: 124). [0017] Termin "CXCR3" dotyczy receptora dla IP-10 (CXCL10). Pełną sekwencję aminokwasową ludzkiego CXCR3 ma Genbank numer dostępu NP_ (SEQ ID NO: 122). [0018] Termin "MIG" dotyczy liganda dla CXCR3, znanego również jako monokina indukowana przez interferon gamma, który różni się od IP-10. Pełną sekwencję aminokwasową ludzkiego MIG ma Genbank numer dostępu NP_ (SEQ ID NO: 125). [0019] Termin "ITAC" dotyczy liganda dla CXCR3, znanego również jako indukowany interferonem alfa chemoatraktant dla komórek T, który różni się od IP-10. Pełną sekwencję aminokwasową ludzkiego ITAC ma Genbank numer dostępu NP_ (SEQ ID NO: 126). [0020] Termin "odpowiedź immunologiczna" dotyczy działania, na przykład, limfocytów, komórek prezentujących antygen, komórek fagocytarnych, granulocytów i rozpuszczalnych makrocząsteczek wytworzonych przez powyższe komórki lub wątrobę (w tym przeciwciał, cytokin i dopełniacza), które prowadzi do selektywnego uszkodzenia, zniszczenia lub wyeliminowania z ludzkiego ciała inwazji patogenów, komórek lub tkanek zakażonych patogenami, komórek nowotworowych, lub, w przypadkach autoimmunizacji lub patologicznego procesu zapalnego, normalnych ludzkich komórek lub tkanek. [0021] "Szlak transdukcji sygnału" dotyczy biochemicznej zależności pomiędzy różnymi cząsteczkami transdukcji sygnału, które odgrywają rolę w przekazywaniu sygnału od jednej części komórki do innej części komórki. Stosowane tu wyrażenie "receptor powierzchni komórki" obejmuje, na przykład cząsteczki i kompleksy cząsteczek zdolnych do odbierania sygnału i przekazywanie takiego sygnału całej błonie komórkowej. Przykładem "receptora powierzchni komórki" wynalazku jest receptor CXCR3, z którym wiąże się cząsteczka. IP-10. [0022] Termin "przeciwciało", tu stosowany obejmuje glikoproteinę, zawierającą co najmniej dwa ciężkie (H) łańcuchy i dwa lekkie (L) łańcuchy wzajemnie połączone wiązaniami dwusiarczkowymi lub ich części wiążące antygen. Każdy ciężki łańcuch składa się z regionu zmiennego łańcucha ciężkiego (w skrócie tu jako V H ) i stałego regionu ciężkiego łańcucha. Region stały łańcucha ciężkiego składa się z trzech domen, C H1, C H2 i C H3. Każdy lekki łańcuch składa się z regionu zmiennego łańcucha lekkiego (w skrócie tu jako V L ) i stałego regionu łańcucha lekkiego. Region stały łańcucha lekkiego składa się z jednej domeny, C L. Regiony V H i V L mogą być podzielone dalej na regiony hiperzmienności, zwane regionami określającymi komplementarność (CDR), przemieszane z regionami, które są bardziej zachowawcze,

9 - 8 - zwane regionami ramkowymi (FR). Każdy z V H i V L składa się z trzech CDR i czterech FR, ułożonych od końca amino do końca karboksy w następującej kolejności: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Zmienne regiony łańcuchów ciężkich i lekkich zawierają domenę wiążącą, która oddziałuje z antygenem. Stałe regiony przeciwciał mogą pośredniczyć w wiązaniu immunoglobuliny do tkanek gospodarza lub czynników, obejmujących różne komórki układu immunologicznego (np. komórki efektorowe) i pierwszy komponent (Clq) klasycznego układu dopełniacza. [0023] Termin "część wiążąca antygen" przeciwciała (lub po prostu "część przeciwciała"), jak tu stosowane, dotyczy jednego lub więcej fragmentów przeciwciała, które zachowują zdolność wiązania się specyficznie z antygenem (np. IP-10). Wykazano, że funkcja wiązania antygenu przeciwciała może być dokonywane przez fragmenty przeciwciała o pełnej długości. Przykłady fragmentów wiążących objęte terminem "część wiążąca antygen" przeciwciała obejmują (i) fragment Fab, jednowartościowy fragment składający się z domen V L, V H, C L i C H1, (ii) fragment F(ab') 2, dwuwartościowy fragment składający się z dwóch fragmentów Fab połączonych mostem dwusiarczkowym w regionie zawiasowym, (iii) fragment Fd składający się z domen V H i C H1, (iv) fragment Fv składający się z domen V L i V H pojedynczego ramienia przeciwciała, (v) fragment dab (Ward i współpracownicy (1989) Nature 341: ), który składa się z domeny V h i (vi) izolowany region określający komplementarność (CDR). Ponadto, mimo że obydwie domeny fragmentu Fv, V L i V H są kodowane przez odrębne geny, to mogą być połączone za pomocą metod rekombinacji, przez syntetyczny łącznik umożliwiający im powstanie jako pojedynczego łańcucha białkowego, w którym regiony V L i V H parują się tworząc jednowartościowe cząsteczki (znane jako pojedynczy łańcuch Fv (scfv), patrz np: Bird i współpracownicy (1988) Science 242: i Huston i współpracownicy (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: ). Takie przeciwciała o pojedynczym łańcuchu w zamierzeniu są również objęte terminem "część wiążąca antygen" przeciwciała. Te fragmenty przeciwciała uzyskuje się stosując konwencjonalne techniki, znane specjalistom w tej dziedzinie, i fragmenty są badane przesiewowo pod kątem użyteczności w taki sam sposób jak nienaruszone przeciwciała. [0024] "Izolowane przeciwciało", jak tu stosowane, w zamierzeniu oznacza przeciwciało, które jest zasadniczo wolne od innych przeciwciał, mających różne specyfiki antygenowe (np. izolowane przeciwciało, które specyficznie wiąże IP-10 jest zasadniczo wolne od przeciwciał, które specyficznie wiążą antygeny inne niż IP-10). Izolowane przeciwciało, które specyficznie wiąże IP-10 może jednak mieć reaktywność krzyżową z innymi antygenami, takimi jak cząsteczki IP-10 z innych gatunków. Ponadto, izolowane przeciwciało może być zasadniczo wolne od innego materiału komórkowego i/lub chemikaliów. [0025] Terminy "przeciwciało monoklonalne" lub "kompozycja przeciwciała monoklonalnego" jak tu stosowane dotyczą preparatu cząsteczek przeciwciał w pojedynczej molekularnej kompozycji. Kompozycja przeciwciała monoklonalnego wykazuje pojedynczą specyficzność wiązania i powinowactwa do konkretnego epitopu. [0026] Termin "ludzkie przeciwciało", jak tu stosowane, obejmuje przeciwciała o zmiennych regionach, w których zarówno regiony ramkowe jak i CDR, pochodzą z ludzkich sekwencji germinalnych immunoglobulin. Ponadto, jeśli przeciwciało zawiera stały region, stały region

10 - 9 - również wywodzi się z ludzkich sekwencji germinalnych immunoglobulin. Ludzkie przeciwciała według wynalazku mogą zawierać reszty aminokwasowe niekodowane przez ludzkie sekwencje germinalne immunoglobulin (np. mutacje wprowadzone przez losową lub specyficzną dla miejsca mutagenezę in vitro lub mutację somatyczną in vivo). Jednakże, termin "ludzkie przeciwciało", jak tu stosowany w zamierzeniu nie obejmuje przeciwciał, w których sekwencje CDR pochodzące z linii germinalnej innych gatunków ssaków, takich jak mysz, zaszczepiono na ludzkich sekwencjach ramkowych. [0027] Termin "ludzkie przeciwciało monoklonalne" dotyczy przeciwciał wykazujących specyficzność pojedynczą wiązania, które mają zmienne regiony, w których zarówno regiony ramkowe i CDR pochodzą z ludzkich sekwencji germinalnych immunoglobulin. W jednym przykładzie wykonania ludzkie przeciwciała monoklonalne są wytwarzane przez hybrydomę, która zawiera limfocyty Typu B, otrzymane ze zwierzęcia transgenicznego nie człowieka, np. myszy transgenicznej, z genomem, obejmującym ludzki transgen łańcucha ciężkiego i transgen łańcucha lekkiego skondensowane z komórką immortalizowaną. [0028] Termin "rekombinowane ludzkie przeciwciało", tu stosowany, obejmuje wszystkie ludzkie przeciwciała, które otrzymano, wyrażano, wytworzono lub izolowano z zastosowaniem środków rekombinacyjnych, takich jak (a) przeciwciała izolowane ze zwierzęcia (np. myszy), które jest transgeniczne lub transchromosomalne dla ludzkich genów immunoglobuliny lub hybrydoma otrzymana z niego (opisane poniżej), (b) przeciwciała izolowane z komórki gospodarza przekształcone do wyrażania ludzkiego przeciwciała, np. z transfektoma, (c) przeciwciała izolowane z rekombinacyjnej kombinatorycznej biblioteki ludzkich przeciwciał i (d) przeciwciała, które otrzymano, wyrażano, wytworzono lub izolowano z zastosowaniem środków rekombinacyjnych w inny sposób, które obejmują składanie ludzkich sekwencji genowych immunoglobulin do sekwencji innych DNA. Takie rekombinowane ludzkie przeciwciała mają zmienne regiony, w których regiony ramkowe i CDR pochodzą z ludzkich sekwencji germinalnych immunoglobulin. W pewnych przykładach wykonania jednak, takie rekombinowane ludzkie przeciwciała mogą być poddane mutagenezie in vitro (lub, jeśli jest używane zwierzę transgeniczne dla sekwencji Ig człowieka, mutagenezy somatycznej in vivo), i w ten sposób sekwencje aminokwasowe regionów V H i V L rekombinowanych przeciwciał są sekwencjami, które, jeśli otrzymane z i związane z ludzkimi sekwencjami linii germinalnej V H i V L, mogą nie występować naturalnie w repertuarze in vivo germinalnego ludzkiego przeciwciała. [0029] Stosowany tu termin "izotyp" dotyczy klasy przeciwciał (np. IgM lub IgG1), która jest kodowana przez geny regionu stałego łańcucha ciężkiego. [0030] Wyrażenia "przeciwciało rozpoznające antygen" i "przeciwciało specyficzne dla antygenu" są tu stosowane wymiennie z terminem "przeciwciało, które wiąże się specyficznie z antygenem". [0031] Stosowany tu termin przeciwciało, które "specyficznie wiąże się z ludzkim IP-10" w zamierzeniu dotyczy przeciwciała, które wiąże się z ludzkim IP-10 z K D 5 x 10-9 M lub mniej, bardziej korzystnie 2 x 10-9 M lub mniej, i jeszcze bardziej korzystnie 1 x M lub mniej. Przeciwciało, które "reaguje krzyżowo z IP-10 małpy rezus" w zamierzeniu dotyczy przeciwciała, które wiąże się z IP-10 małpy rezus z K D 0,5 x 10-8 M lub mniej, bardziej korzystnie 5 x

11 M lub mniej, i jeszcze bardziej korzystnie 2 x 10-9 M lub mniej. Przeciwciało, które "nie reaguje krzyżowo z mysim IP-10" lub "nie reaguje krzyżowo z ludzkim MIG" lub "nie reaguje krzyżowo z ludzkim ITAC" w zamierzeniu dotyczy przeciwciała, które wiąże się z mysim IP-10, ludzkim MIG lub ludzkim ITAC z K D 1,5 x 10 8 M lub więcej, bardziej korzystnie K D 5-10 x 10-8 M lub więcej i jeszcze bardziej korzystnie 1 x 10-7 M lub więcej. W pewnych przykładach wykonania, takie przeciwciała, które nie reagują krzyżowo z mysim IP-10, MIG człowieka i/lub ludzkim ITAC wykazują zasadniczo niewykrywalne wiązanie wobec tych białek w standardowych testach. [0032] Stosowany tu termin przeciwciało, które "hamuje wiązanie IP-10 z CXCR3" w zamierzeniu dotyczy przeciwciała, które hamuje wiązanie IP-10 z CXCR3 z K i 1 nm lub mniej, bardziej korzystnie 0,75 nm lub mniej, nawet bardziej korzystnie 0,5 nm lub mniej, i jeszcze bardziej korzystnie 0,25 nm lub mniej. [0033] Stosowany tu termin przeciwciało, które "hamuje wywołany przez IP-10 wypływ wapnia" w zamierzeniu dotyczy przeciwciała, które hamuje wywołany przez IP-10 wypływ wapnia z IC nm lub mniej, korzystniej 7,5 nm lub mniej, jeszcze bardziej korzystnie 5 nm lub mniej, i jeszcze bardziej korzystnie 2,5 nm lub mniej. [0034] Stosowany tu termin przeciwciało, które "hamuje wywołaną przez IP-10 migrację komórkową" w zamierzeniu dotyczy przeciwciała, które hamuje migrację komórek wywołaną przez ludzki IP-10 z IC 50 2 μg/ml lub mniej, korzystniej 1 μg/ml lub mniej, jeszcze bardziej korzystnie 0,5 μg/ml lub mniej, i jeszcze bardziej korzystnie 0,25 μg/ml lub mniej. [0035] Termin "K asoc" lub "IC a ", jak tu stosowane, w zamierzeniu dotyczy szybkości asocjacji konkretnego oddziaływania przeciwciało antygen, natomiast termin "K dys " lub "K d " jak tu stosowane, w zamierzeniu dotyczy szybkości dysocjacji konkretnego oddziaływania przeciwciało antygen. Termin "k D " jak tu stosowane, w zamierzeniu dotyczy stałej dysocjacji, która jest uzyskana ze stosunku K d do K a (tzn. K d /K a ) i jest wyrażona jako stężenie molowe (M). Wartości K D dla przeciwciał można określić za pomocą metod dobrze znanych w tej dziedzinie. Preferowaną metodą określania K d przeciwciała jest zastosowanie metody powierzchniowego rezonansu plazmonowego, korzystnie za pomocą systemu biosensorowego, takiego jak system Biacore. [0036] Stosowany tu termin "duże powinowactwo" dla przeciwciała IgG dotyczy przeciwciała mającego K d 10-8 M lub mniej, bardziej korzystnie 10-9 M lub mniej, i jeszcze bardziej korzystnie M lub mniej dla antygenu docelowego. Jednakże "duże powinowactwo" wiązania może być różne dla innych izotypów przeciwciał. Na przykład, "duże powinowactwo" wiązania dla izotypu IgM dotyczy przeciwciała mającego K d 10-7 M lub mniej, bardziej korzystnie 10-8 M lub mniej. [0037] Stosowany tu termin "osobnik" obejmuje człowieka lub zwierzę nie będące człowiekiem). Termin "zwierzę nie będące człowiekiem obejmuje wszystkie kręgowce, np. ssaki i nie-ssaki, takie jak ssaki naczelne inne niż człowiek, owce, psy, koty, konie, krowy, kurczęta, płazy, gady, itp. [0038] Różne aspekty wynalazku opisano bardziej szczegółowo w kolejnych rozdziałach. Przeciwciała Anty-IP-10

12 [0039] Przeciwciała według wynalazku są scharakteryzowane za pomocą poszczególnych cech funkcjonalnych lub właściwości przeciwciał. Na przykład, przeciwciała wiążą się specyficznie z ludzkim IP-10. Przeciwciała mogą reagować krzyżowo z IP-10 z jednego lub więcej ssaków naczelnych innych niż człowiek, takich jak małpa rezus. Przeciwciała nie wchodzą w reakcje krzyżowe z mysim IP-10. Ponadto, chociaż MIG i ITAC są również ligandami dla receptora CXCR3, przeciwciała według wynalazku nie wchodzą w reakcje krzyżowe z MIG człowieka lub ITAC człowieka. [0040] Korzystnie, przeciwciało według wynalazku wiąże się z IP-10 z dużym powinowactwem, na przykład z K D 10-8 M lub mniej lub 10-9 M lub mniej, lub nawet M lub mniej. [0041] Ponadto, przeciwciała według wynalazku są zdolne do hamowania jednego lub więcej działań funkcjonalnych IP-10. Na przykład, w jednym przykładzie wykonania, przeciwciała hamują wiązanie IP-10 do CXCR3. W innym przykładzie wykonania, przeciwciała hamują wywołany przez IP-10 wypływ wapnia. W jeszcze innym przykładzie wykonania, przeciwciała hamują wywołaną przez IP-10 migrację komórek (chemotaksję). [0042] Standardowe testy oceniające zdolność wiązania przeciwciał z IP-10 różnych gatunków i/lub MIG lub ITAC są znane w tej dziedzinie, w tym np. ELISA, Western blots i RIAs. Odpowiednie testy zostały szczegółowo opisane w przykładach. Kinetyka wiązania (np. powinowactwo wiązania) przeciwciał również może być oceniana za pomocą standardowych testów znanych w tej dziedzinie, takich jak analiza Biacore. Testy do oceny wpływu przeciwciał na właściwości funkcjonalne IP-10 (np. wiązanie receptora, wypływ jonów wapnia, chemotaksja) opisano bardziej szczegółowo w przykładach. [0043] Zgodnie z tym przeciwciało, które "hamuje" jedną lub więcej z tych właściwości funkcjonalnych IP-10 (np. biochemiczne, immunochemiczne, komórkowe, fizjologiczne lub inne działania biologiczne, lub podobne), jak określono zgodnie z metodologią znaną w dziedzinie i tu opisaną, w zamierzeniu dotyczy statystycznie znaczącego spadku w konkretnej aktywności względem obserwowanej w przypadku braku przeciwciała (np. lub jeśli jest obecne kontrolne przeciwciało o nieistotnej specyficzności). Korzystnie przeciwciało, które hamuje efekty aktywności IP-10, takie jak statystycznie znaczący spadek o co najmniej 10% mierzonego parametru, bardziej korzystnie co najmniej o 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% lub 90%, i w pewnych korzystnych przykładach wykonania przeciwciało według wynalazku może hamować więcej niż 92%, 94%, 95%, 97%, 98% lub 99% aktywności funkcjonalnej IP-10. Przeciwciała monoklonalne 1D4. 6A5 i 8F6 [0044] Korzystne przeciwciała według wynalazku stanowią ludzkie przeciwciała monoklonalne 1D4, 6A5 i 8F6, izolowane i strukturalnie scharakteryzowane jak opisano w przykładach 1 i 2. Sekwencje aminokwasowe V L 1D4, 6A5 i 8F6 są przedstawione w SEQ ID NO: 35, 39 i 43, odpowiednio. Sekwencje aminokwasowe V L 1D4 i 6A5 i 8F6 są przedstawione w SEQ ID NO: 84, 88 i 92, odpowiednio. [0045] Zgodnie z tym, w jednym aspekcie, wynalazek dostarcza izolowane przeciwciało monoklonalne lub jego część wiążącą antygen obejmujące:

13 (a) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 43, i (b) region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 92, lub (a) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 35, i (b) region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 84, lub (a) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 39 i (b) region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 88. [0046] Sekwencje aminokwasowe V H CDR1s z ID4, 1E1, 2G1, 3C4, 6A5 i 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12, 10A12S i 13C4 są przedstawione w SEQ ID NOs: Sekwencje aminokwasowe z V H CDR2s z 1D4, 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12 i 13C4 są przedstawione w SEQ ID NOs: Sekwencje aminokwasowe z V H CDR3s z 1D4, 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12 i 13C4 są przedstawione w SEQ ID NOs: Sekwencje aminokwasowe z V k CDR1s z 1D4, 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12 i 13C4 są przedstawione w SEQ ID NOS: Sekwencje aminokwasowe z V k CDR2s z 1D4, 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12 i 13C4 są przedstawione w SEQ ID NOS: Sekwencje aminokwasowe z V k CDR1s z 1D4, 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12 i 13C4 są przedstawione w SEQ ID NOS: Regiony CDR zostały określone przy użyciu systemu Kabat (Kabat, E.A., i współpracownicy (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, piąte wydanie, U.S. Department of Health i Human Services, NIH Publication No ). Przeciwciała mające sekwencje konkretnej linii germinalnej [0047] W pewnych przykładach wykonania, przeciwciało według wynalazku zawiera region zmienny ciężkiego łańcucha z konkretnego genu linii germinalnej łańcucha ciężkiego immunoglobuliny i/lub regionu zmiennego łańcucha lekkiego z konkretnego genu linii germinalnej łańcucha lekkiego immunoglobuliny. [0048] Jak tu wykazano, otrzymano ludzkie przeciwciała specyficzne dla IP-10, które obejmują region zmienny łańcucha ciężkiego, który jest produktem lub pochodzi z ludzkiego genu linii germinalnej VH 3-33, genu VH , genu VH 5-51 lub genu VH [0049] Przeciwciała wynalazku obejmują region zmienny łańcucha ciężkiego, który jest produktem lub pochodzi z ludzkiego genu linii germinalnej VH wybranego z VH 3-33 lub VH [0050] Ponadto, jak tu wykazano, otrzymano ludzkie przeciwciała specyficzne dla IP-10, które obejmują region zmienny łańcucha lekkiego, który jest produktem lub pochodzi z ludzkiego genu linii germinalnej V K A27, genu V K L15, genu V K L6 lub genu V K L18. Przeciwciała wynalazku obejmują region zmienny łańcucha lekkiego, który jest produktem lub pochodzi z ludzkiego genu linii germinalnej V K wybranego z V K A27 lub V K L6. Przeciwciała są specyficzne dla polipeptydu ludzkiego IP-10 (np. zawierającego sekwencję Genbank Acc. No. NP_001556). Przykłady przeciwciał mających V H i V K z V H 3-33 i V K

14 A27, odpowiednio, obejmują 1D4, 2G1, 6A5, 6A8, 10A12 i 10A12S. Przykładem przeciwciała mającego V H i V K z VH 3-33 i V K L15, odpowiednio, jest 7C10. Przykładem przeciwciała mającego V H i V K z VH 3-33 i V K L6, odpowiednio, jest 1E1. Przykłady przeciwciał mających V H i V K z VH i V K L6, odpowiednio, obejmują 6B10 i 8F6. Przykładem przeciwciała mającego V H i V K z VH 5-51 i V K L18, odpowiednio, jest 3C4. Przykładem przeciwciała mającego V H i V K z VH 4-61 i VK A27, odpowiednio, jest 13C4. [0051] Stosowany tu termin ludzkie przeciwciało obejmuje zmienne regiony ciężkiego lub lekkiego łańcucha, które jest "produktem" lub "pochodzi od" określonej sekwencji linii germinalnej, jeśli zmienne regiony przeciwciała są otrzymywane z systemu, który wykorzystuje ludzkie geny linii germinalnych immunoglobulin. Takie systemy obejmują zaszczepienie transgenicznej myszy, mającej geny ludzkie immunoglobuliny z antygenem, będącym przedmiotem zainteresowania lub badaniem przesiewowym biblioteki genów ludzkich immunoglobuliny, prezentowanym na fagu (ang. phage display) z antygenem będącym przedmiotem zainteresowania. Ludzkie przeciwciało, które jest "produktem" lub "pochodzi od" sekwencji genowej linii germinalnej ludzkiej immunoglobuliny może być zidentyfikowane przez porównanie sekwencji aminokwasowej ludzkiego przeciwciała z sekwencją aminokwasową ludzkich immunoglobulin linii germinalnych i wybierając sekwencję ludzkich immunoglobulin linii germinalnych, która jest najbliższa w sekwencji (tzn. największy % tożsamości) do sekwencji ludzkiego przeciwciała. Ludzkie przeciwciało, które jest "produktem" lub "pochodzi od" konkretnej sekwencji linii germinalnej ludzkiej immunoglobuliny może zawierać różnice aminokwasowe w porównaniu z sekwencją linii germinalnej, z powodu, na przykład, naturalnie występujących mutacji somatycznych lub celowego wprowadzenia mutacji ukierunkowanej. Jednak wybrane ludzkie przeciwciało zazwyczaj ma sekwencję aminokwasową co najmniej w 90% identyczną z sekwencją aminokwasową kodowaną przez gen ludzki immunoglobuliny linii germinalnej i zawiera reszty aminokwasowe, które identyfikują ludzkie przeciwciało jako ludzkie w porównaniu z sekwencją aminokwasową immunoglobuliny linii germinalnej innych gatunków (np. mysie sekwencje linii germinalnej). W niektórych przypadkach, ludzkie przeciwciało może mieć sekwencję aminokwasową co najmniej w 95%, lub nawet co najmniej 96%, 97%, 98% lub 99% identyczną z sekwencją aminokwasową kodowaną przez gen immunoglobuliny linii germinalnej. Zazwyczaj, ludzkie przeciwciało pochodzące od określonej sekwencji ludzkiej linii germinalnej prezentuje nie więcej niż 10 różnic aminokwasowych z sekwencji aminokwasowej kodowanej przez ludzki gen immunoglobuliny linii germinalnej. W niektórych przypadkach, ludzkie przeciwciało może prezentować nie więcej niż 5, lub nawet nie więcej niż 4, 3, 2, lub 1 różnic aminokwasowych z sekwencji aminokwasowej kodowanej przez gen immunoglobuliny linii germinalnej. Przeciwciała, które wiążą się z tym samym epitopem jak przeciwciała anty-ip-10 według wynalazku [0052] Ujawniono również przeciwciała, które wiążą się z tym samym epitopem, tak jak to czynią tu dostarczone różne przeciwciała anty-ip-10 według wynalazku, takie jak inne ludzkie przeciwciała, które wiążą się z tym samym epitopem jak tu opisane przeciwciała 1D4, 6A5 lub 8F6. Takie dodatkowe przeciwciała mogą być identyfikowane na podstawie ich zdolności do konkurowania krzyżowego (np. do konkurencyjnego hamowania wiązania, w sposób istotny statystycznie) z przeciwciałami 1D4, 6A5 lub 8F6 w standardowych testach

15 wiążących IP-10. Zdolność przeciwciała testowego do hamowania wiązania, np., 1D4, 6A5 lub 8F6 z ludzkim IP-10 pokazuje, że przeciwciało testowe może konkurować z tym przeciwciałem w wiązaniu z ludzkim IP-10; takie przeciwciało może, według nie ograniczającej teorii, wiązać się z takim samym lub pokrewnym (np. strukturalnie podobnym lub przestrzennie proksymalnym) epitopem na ludzkim IP-10, jak przeciwciało, z którym konkuruje. W korzystnym przykładzie wykonania, przeciwciało, które wiąże się z tym samym epitopem na ludzkim IP-10, jak 1D4, 6A5 lub 8F6 jest ludzkim przeciwciałem monoklonalnym. Takie ludzkie przeciwciała monoklonalne mogą być otrzymane i izolowane, jak opisano w przykładach. Cząsteczki kwasu nukleinowego kodującego przeciwciała według wynalazku [0053] Inny aspekt wynalazku dotyczy cząsteczek kwasów nukleinowych kodujących przeciwciała według wynalazku. Kwasy nukleinowe mogą być obecne w całych komórkach, w lizacie komórkowym lub w postaci częściowo oczyszczonej lub zasadniczo czystej. Kwas nukleinowy jest "izolowany" lub "zasadniczo czysty", jeśli jest oczyszczony od innych składników komórkowych lub innych zanieczyszczeń, np. innych komórkowych kwasów nukleinowych lub białek, standardowymi technikami, obejmującymi traktowanie zasadą/sds, wirowanie w gradiencie CsCl, chromatografię kolumnową, elektroforezę w żelu agarozowym i innymi technikami dobrze znanymi w tej dziedzinie. Zobacz, F. Ausubel, i współpracownicy, Wyd. (1987) Currant Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing i Wiley Interscience, Nowy Jork. Kwasem nukleinowym według wynalazku może być, na przykład DNA lub RNA i może lub nie może zawierać sekwencji intronowych. W korzystnym przykładzie wykonania, kwas nukleinowy jest cząsteczką cdna. [0054] Kwasy nukleinowe wynalazku można uzyskać przy użyciu standardowych metod biologii molekularnej. Dla przeciwciał wyrażanych przez hybrydomy (np., hybrydomy otrzymane z myszy transgenicznych posiadających ludzkie geny immunoglobulin jak opisano poniżej), cdna kodujące lekkie i ciężkie łańcuchy przeciwciała uzyskanego przez hybrydomy można otrzymać za pomocą standardowej amplifikacji PCR lub technik klonowania cdna. Dla przeciwciał uzyskanych z biblioteki genowej immunoglobulin (np. przy użyciu metody prezentacji fagów), kwas nukleinowy kodujący przeciwciało może być odzyskany z biblioteki. [0055] Szczególne cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku stanowią te kodujące sekwencje VH i VL przeciwciał monoklonalnych 6A5, 8F6 i 1D4. Inne ujawnione kwasy nukleinowe stanowią te kodujące sekwencje VH i VL przeciwciał monoklonalnych 1E1, 2G1, 3C4, 6A8, 6B10, 7C10, 10A12 lub 13C4. Sekwencje DNA kodujące VH sekwencje 1D4, 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12 i 13C4 przedstawiono w SEQ ID NOS: , odpowiednio. Sekwencje DNA kodujące VL sekwencje 1D4, 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12 i 13C4 są przedstawione w SEQ ID NOS: , odpowiednio. [0056] Po uzyskaniu fragmentów DNA kodujących segmenty VH i VL, te fragmenty DNA mogą być dalej przetwarzane za pomocą standardowych technik rekombinacji DNA, na przykład konwertując geny zmiennego regionu do genów przeciwciał o pełnych łańcuchach, do genów fragmentu Fab lub genu scfv. W tych działaniach, fragment DNA VL- lub VH- kodu-

16 jący jest funkcjonalnie połączony z innym fragmentem DNA kodującym inne białko, takie jak region stały przeciwciała lub łącznik elastyczny. Termin "funkcjonalnie połączone", użyte w tym kontekście, w zamierzeniu oznacza, że te dwa fragmenty DNA są połączone tak, że sekwencje aminokwasowe kodowane przez dwa fragmenty DNA pozostają w ramce. [0057] Izolowany DNA kodujący region VH może być konwertowany do genu pełnej długości ciężkiego łańcucha przez operacyjnie połączenie DNA VH-kodującego do innej cząsteczki DNA kodującej regiony stałe łańcucha ciężkiego (CH1, CH2 i CH3). Sekwencje ludzkich genów stałych regionów łańcuchów ciężkich są znane (patrz np: Kabat, E.A., i współpracownicy (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, piąte wydanie, U.S. Department of Health i Human Services, NIH Publication No ) i fragmenty DNA obejmujące te regiony mogą być uzyskane przez zastosowanie standardowych metod wzmocnienia PCR. Stałym regionem łańcucha ciężkiego może być stały region IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM lub IgD, ale najkorzystniej jest to stały region IgGI lub IgG4. Dla genu fragmentu Fab łańcucha ciężkiego, VH-kodowanie DNA może być funkcjonalnie połączone z inną cząsteczką DNA kodującą tylko stały region ciężkiego łańcucha CH1. [0058] Izolowany DNA kodujący VL region może być konwertowany do genu pełnej długości łańcucha lekkiego (jak również genu łańcucha lekkiego Fab) przez operacyjnie związanie VL-kodującego DNA do innej cząsteczki DNA kodującego region stały lekkiego łańcucha, CL. Sekwencje stałych regionów lekkich łańcuchów genów ludzkich są znane w dziedzinie (patrz np: Kabat, EA, i współpracownicy (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, piąte wydanie, U.S. Department of Health i Human Services, NIH Publication No ) i fragmenty DNA obejmujące te regiony mogą być uzyskane przez standardowe metody PCR. Stały region lekkiego łańcucha może być kappa lub lambda stałym regionem, ale najkorzystniej jest kappa stały region. [0059] W celu utworzenia genu scfv, VH- i VL-kodujące fragmenty DNA są operatywnie związane z innym fragmentem kodującym elastyczny łącznik, np. kodującym sekwencję aminokwasową (Gly 4 -Ser) 3, tak, że sekwencje VH i VL mogą ulegać ekspresji jako ciągły pojedynczy łańcuch białkowy, z regionami VL i VH połączonymi przez elastyczny łącznik (patrz np. Bird i współpracownicy (1988) Science 242: ; Houston i współpracownicy (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: ; McCafferty i współpracownicy, (1990) Nature 348: ). Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych wynalazku [0060] Przeciwciała monoklonalne (MABS) według wynalazku mogą być wytwarzane z zastosowaniem różnych technik, w tym np. konwencjonalnej metodologii monoklonalnego przeciwciała, np. standardowej techniki hybrydyzacji komórek somatycznych, Kohler i Milstein (1975) Nature 256: 495. Chociaż procedury hybrydyzacji komórek somatycznych są korzystne, w zasadzie można wykorzystać inne techniki wytwarzania przeciwciał monoklonalnych, np., wirusowe lub onkogenne transformacje limfocytów B. [0061] Korzystnym systemem zwierzęcym dla otrzymywania hybrydomy jest system mysi. Wytwarzanie hybrydomy u myszy jest bardzo dobrze znaną procedurą. Protokoły immunizacji i techniki izolacji uodpornionych splenocytów dla fuzji są znane w tej dziedzinie. Partnerzy fuzji (np. mysie komórki szpiczaka) i procedury syntezy są również znane.

17 [0062] Chimeryczne lub humanizowane przeciwciała według wynalazku można otrzymać w oparciu o sekwencję mysiego przeciwciała monoklonalnego otrzymanego jak opisano powyżej. DNA kodujące ciężkie i lekkie łańcuchy immunoglobulin można otrzymać z mysiej hybrydomy, będącej przedmiotem zainteresowania, i stosując inżynierię genetyczną wprowadzić nie-mysie (np. ludzkie) sekwencje immunoglobulin przy użyciu standardowych technik biologii molekularnej. Na przykład, aby otrzymać chimeryczne przeciwciało, mysie regiony zmienne mogą być łączone z ludzkimi regionami stałymi stosując metody znane w tej dziedzinie (patrz np. Patent USA dla Cabilly i współpracowników). Celem utworzenia humanizowanego przeciwciała, mysie regiony CDR można poddać insercji do ludzkiej ramki stosując metody znane w tej dziedzinie (patrz np. Patent USA dla Winter i Patencie amerykańskim numer ; ; i dla Quenn i współpracowników). [0063] W korzystnym przykładzie wykonania, przeciwciała według wynalazku są ludzkimi przeciwciałami monoklonalnymi. Takie ludzkie przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko IP-10 mogą być wygenerowane przy użyciu myszy transgenicznych lub transchromosomowych, niosących części raczej ludzkiego układu odpornościowego, niż systemu myszy. Takie myszy transgeniczne i transchromosomowe obejmują myszy tu określane jako myszy HuMAb i myszy KM, odpowiednio, i są wspólnie określane dalej jako "myszy z ludzkim Ig". [0064] Myszy "HuMAb " (Medarex, Inc.) zawierają miniloci ludzkich genów immunoglobuliny, które kodują sekwencje ludzkich łańcuchów ciężkich (μ i γ) i lekkich κ immunoglobulin przed rearanżacją, wraz z ukierunkowanymi mutacjami, które inaktywują endogenne loci łańcuchów μ i κ (patrz. np. Lonberg, N. i współpracownicy, (1994) Nature 368(6474): ). Odpowiednio, myszy wykazują zredukowaną ekspresję mysich IgM lub κ, i w odpowiedzi na immunizację wprowadzone transgeny ludzkich łańcuchów ciężkich i lekkich podlegają przełączaniu klas i mutacji somatycznej w celu wytworzenia ludzkich przeciwciał monoklonalnych IgGκ o wysokim powinowactwie (Lonberg, N. i współpracownicy, supra; omówione w Lonberg N., (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. i Huszar, D., Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93, 1995, i Harding, F. i Lonberg, N., (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci., 764: ,). Przygotowanie i zastosowanie myszy HuMab i genomowych modyfikacji dokonywanych na takich myszach opisano bardziej szczegółowo w Taylor, L. i współpracownicy, (1992) Nucleic Acids Research, 20: ; Chen, J. i współpracownicy, International Immunology 5: , 1993; Tuaillon i współpracownicy, (1993); Proc. Natl. Acad. Sci., USA 90: , Choi i współpracownicy, Nature Genetics, 4: , 1993; Chen, J. i współpracownicy, (1993) EMBO J.,12: ; Tuaillon i współpracownicy, (1994) J. Immunol., 152: ; Taylor, I. i współpracownicy (1994), International Immunology, 6: ; i Fishwild, D. i współpracownicy, (1996) Nature Biotechnology, 14: Patrz ponadto, Patent USA ; Patent USA Patent USA Patent USA Patent USA Patent USA Patent USA Patent USA Patent USA Patent USA wszystkie autorstwa Lonberga i Kay'a, Patent USA dla Surani i współpracownicy; Publikacja PCT nr WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 i WO 99/45962, wszystkie autorstwa Lonberga i Kay'a; i Publikacja PCT nr WO 01/14424 dla Korman i współpracownicy.

18 [0065] W innym przykładzie wykonania, ludzkie przeciwciała według wynalazku mogą być uniesione za pomocą myszy, która niesie ludzkie sekwencje immunoglobulin na transgeny i transchromosomy, takiej jak mysz, która niesie ludzki transgen ciężkiego łańcucha i ludzki transchromosom lekkiego łańcucha. Takie myszy, zwane tu "myszy KM", szczegółowo opisano w Publikacji PCT WO 02/43478 dla Ishida i współpracownicy. [0066] Jeszcze dalej, alternatywne systemy transgenicznych zwierząt wyrażające ludzkie geny immunoglobulin są dostępne w tej dziedzinie i mogą być wykorzystane do uzyskania przeciwciał anty-ip-10 według wynalazku. Na przykład, może być używany alternatywny system transgeniczny zwany Xenomouse (Abgenix, Inc); takie myszy opisano, na przykład, w Patencie USA ; ; ; 6, i dla Kucherlapati i współpracownicy. [0067] Ponadto alternatywne transchromosomowe systemy zwierzęce wyrażające ludzkie geny immunoglobulin są dostępne w tej dziedzinie i mogą być wykorzystane do uzyskania przeciwciała anty-ip-10 według wynalazku. Na przykład, można zastosować myszy mające zarówno ludzki transchromosom ciężkiego łańcucha i ludzki transchromosom lekkiego łańcucha, określane jako "myszy TC", takie myszy opisano w Tomizuka i współpracownicy (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: Ponadto, krowy posiadające ludzkie transchromosomy ciężkiego i lekkiego łańcucha opisano w tej dziedzinie (Kuroiwa i współpracownicy (2002) Nature Biotechnology 20: ) i mogą być wykorzystywane do uzyskania anty-ip- 10 przeciwciał według wynalazku. [0068] Ludzkie przeciwciała monoklonalne według wynalazku mogą również być otrzymane przy użyciu technik prezentacji na fagu do badań przesiewowych bibliotek ludzkich genów immunoglobulin. Takie techniki prezentacji na fagu do izolowania ludzkich przeciwciał są znane w tej dziedzinie. Patrz na przykład: Patent USA Nr ; ; i dla Ladner i współpracownicy; Patent USA Nr i dla Dower i współpracownicy; Patent USA Nr i dla McCafferty i współpracownicy; i Patent USA Nr 5.885,793; ; ; ; i dla Griffiths i współpracownicy. [0069] Ludzkie przeciwciała monoklonalne według wynalazku można również wytwarzać wykorzystując myszy SCID, w których ludzkie komórki odpornościowe odtworzono tak, że odpowiedź ludzkiego przeciwciała może być wygenerowana po immunizacji. Takie myszy opisano, na przykład, Patent USA Nr i dla Wilson i współpracownicy. Immunizacja myszy z ludzkim Ig [0070] Jeśli myszy z ludzkim Ig są wykorzystywane do uniesienia ludzkich przeciwciał według wynalazku, takie myszy mogą być immunizowane z oczyszczonym lub wzbogaconym preparatem antygenu IP-10 i/lub rekombinowanego IP-10 lub białka fuzyjnego IP-10, w sposób opisany przez Lonberg, N. i współpracownicy (1994) Nature 368 (6474): ; Fishwild, D. i współpracownicy (1996) Nature Biotechnology 14: i Publikacja PCT WO 98/24884 i WO 01/ Korzystnie myszy będą miały 6-16 tygodni po pierwszej infuzji. Na przykład, preparat oczyszczonego lub rekombinowanego (5-50µg) antygenu IP-10 można wykorzystać do immunizacji dootrzewnowej myszy z ludzkim Ig.

19 [0071] Szczegółowe procedury do wygenerowania w pełni ludzkich przeciwciał monoklonalnych do IP-10 opisano w przykładzie 1 poniżej. Zebrane doświadczenia z różnymi antygenami wykazały, że myszy transgeniczne reagują, jeśli początkowo immunizuje się je dootrzewnowo (IP, ang. intraperitoneally) antygenem w kompletnym adiuwancie Freunda, z kolejnymi immunizacjami IP co drugi tydzień (łącznie aż do 6) z antygenem w niekompletnym adiuwancie Freunda. Jednakże, adiuwanty inne niż Freunda również okazały się skuteczne. Dodatkowo, stwierdzono, że całe komórki w przypadku braku adiuwantu są wysoce immunogenne. Odpowiedź immunologiczną można monitorować w trakcie protokołu immunizacji, otrzymując próbki osocza z krwawienia pozagałkowego. Osocze można badać przesiewowo, na przykład za pomocą ELISA (jak opisano poniżej), a do fuzji można stosować myszy z dostatecznym mianem ludzkich immunoglobulin anty-1p-10. Myszy można dożylnie pobudzać antygenem 3 dni przed uśmierceniem i usunięciem śledziony. Oczekuje się, że dla każdego antygenu może być konieczne przeprowadzenie 2-3 fuzji. Pomiędzy 6 i 24 myszy typowo immunizuje się przeciwko każdemu antygenowi. Zazwyczaj są wykorzystywane oba szczepy HCo7 i HCo12. Dodatkowo, transgen zarówno HCo7 i HCol2 może być hodowany razem w jednej myszy, mającej dwa różne ludzkie transgeny łańcuchów ciężkich (HCo7/HCo12). Generowanie hybrydomy wytwarzającej ludzkie przeciwciała monoklonalne według wynalazku [0072] Aby wygenerować hybrydomy wytwarzające ludzkie przeciwciała monoklonalne wynalazku, można izolować splenocyty i/lub komórki węzłów chłonnych z immunizowanych myszy i dokonać fuzji z odpowiednią immortalizową linią komórkową, taką jak mysia linia komórkowa szpiczaka. Powstałe hybrydomy poddaje się badaniu przesiewowemu pod kątem wytworzenia przeciwciał specyficznych wobec antygenu. Na przykład, pojedyncze zawiesiny komórkowe limfocytów śledzionowych od immunizowanych myszy poddaje się fuzji z jedną szóstą liczby P3X63- Ag8.653 mysich komórek szpiczaka niewydzielającego (ATCC, CRL 1580) w 50% PEG. Komórki wysiewa się z gęstością około 2x10 5 na płaskodennej płytce mikrotitracyjnej, następnie inkubuje przez dwa tygodnie na pożywce selekcyjnej zawierającej 20% płodowego osocza do klonowania, 18% "653" kondycjonowanej pożywki, 5% origen (IGEN), 4 mm L-glutaminy, 1 mm L-glutaminy, 1 mm pirogronianu sodu, 5 mm HEPES, 0,055 mm 2-merkaptoetanolu, 50 jednostek/ml penicyliny, 50 mg/ml streptomycyny, 50 mg/ml gentamycyny i 1x HAT (Sigma; HAT dodaje się 24 godziny po fuzji). Po około dwóch tygodniach komórki hoduje się w pożywce, w której HAT zastąpiono HT. Supernatanty z poszczególnych sudzienek poddaje się badaniu przesiewowemu przy pomocy ELISA pod kątem ludzkich przeciwciał monoklonalnych IgM i IgG. Po wystąpieniu rozległego wzrostu hybrydomy, pożywkę można obserwować zwykle po dniach. Hybrydomy wydzielające przeciwciała wysiewa się ponownie, poddaje badaniu przesiewowemu, a jeśli wciąż są dodatnie pod względem ludzkich monoklonalnych przeciwciał IgG, można je subklonować co najmniej dwukrotnie poprzez ograniczenie rozcieńczania. Stabilne subklony hoduje się następnie in vitro w celu wytworzenia małych ilości przeciwciał w pożywce hodowli tkankowej w celu scharakteryzowania. [0073] W celu oczyszczania ludzkich przeciwciał monoklonalnych, wybrane hybrydomy można hodować w dwulitrowych butelkach z mieszadłem do hodowli komórek zawieszonych w płynie (ang. spinner flask) do oczyszczania przeciwciał monoklonalnych. Supernatanty

20 można przefiltrować i zatężyć przed chromatografią powinowactwa za pomocą A-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, N.J.) do białek. Eluowany IgG może być sprawdzany za pomocą elektroforezy żelowej i wysokosprawnej chromatografii cieczowej w celu zapewnienia czystości. Roztwór buforu można wymienić na PBS, i stężenie można wyznaczyć za pomocą OD280 stosując współczynnik ekstynkcji1,43. Przeciwciała monoklonalne można podzielić na równe objętości (alikwoty) i przechowywać w temperaturze -80 C. Generowanie transfektomów wytwarzających przeciwciała monoklonalne wynalazku [0074] Przeciwciała według wynalazku można również wytwarzać w transfektomie komórki gospodarza stosując, na przykład, kombinację technik rekombinacji DNA i sposobów transfekcji genu, jak jest dobrze znane w tej dziedzinie (np. Morrison, S. (1985) Science, 229:1202). [0075] Na przykład, aby uzyskać ekspresję przeciwciał lub fragmentów przeciwciał, DNA kodujące lekkie i ciężkie łańcuchy częściowe lub pełnej długości, można uzyskać za pomocą standardowych technik biologii molekularnej (np. amplifikacja PCR lub cdna klonowanie za pomocą hybrydomy, która wyraża przeciwciała będące przedmiotem zainteresowania) i DNA może być wprowadzony do wektorów ekspresyjnych tak, że geny są operatywnie związane z sekwencjami kontrolnymi transkrypcyjnymi i translacyjnymi. W tym kontekście termin "operatywnie połączone" w zamierzeniu oznacza, że gen przeciwciała jest umieszczony przez ligację w wektorze tak, że sekwencje kontrolne transkrypcyjne i translacyjne w wektorze spełniają ich zamierzoną funkcję regulacji transkrypcji i translacji genu przeciwciała. Wektor ekspresji i sekwencje kontrolne ekspresji wybierane są tak, aby zapewnić kompatybilność z ekspresją stosowanej komórki gospodarza. Gen łańcucha lekkiego przeciwciała i gen łańcucha ciężkiego przeciwciała mogą być wstawione do osobnego wektora lub, bardziej typowo, oba geny są wstawiane do tego samego wektora ekspresyjnego. Geny przeciwciał są wstawiane do wektora ekspresyjnego za pomocą standardowych metod (np. poddanie ligacji komplementarnych miejsc restrykcyjnych na fragmencie genu przeciwciała i wektora, lub poddanie ligacji o tępych końcach, jeśli nie ma miejsc restrykcyjnych). Regiony zmienne łańcuchów lekkich i ciężkich przeciwciał tu opisanych mogą być wykorzystywane do tworzenia genów pełnej długości przeciwciał, dowolnego izotypu przeciwciał, przez insercję ich do wektorów ekspresji, kodujących już stałe regiony łańcuchów ciężkich i łańcuchów lekkich pożądanego izotypu tak, że segment V H jest operatywnie związany z segmentem (segmentami) C H w wektorze i segment V L jest operatywnie związany z segmentem C L w wektorze. Dodatkowo lub alternatywnie, rekombinowany wektor ekspresji może kodować peptyd sygnałowy, który ułatwia sekrecję łańcucha przeciwciała z komórki gospodarza. Gen łańcucha przeciwciała może być klonowany do wektora tak, że peptyd sygnałowy jest połączony w ramce z końcem aminowym genu łańcucha przeciwciała. Peptydem sygnałowym może być peptyd sygnałowy immunoglobuliny lub peptyd sygnałowy heterologiczny (tzn. peptyd sygnałowy z białka nie będącego immunoglobuliną). [0076] Oprócz genów łańcucha przeciwciała, rekombinowane wektory ekspresyjne według wynalazku niosą sekwencje regulatorowe, które kontrolują ekspresję genów łańcucha przeciwciała w komórce gospodarza. Określenie "sekwencja regulatorowa" obejmuje promotory, wzmacniacze i inne elementy kontrolujące ekspresję (np. sygnały poliadenylacji), które kon-

21 trolują transkrypcję lub translację genów łańcucha przeciwciała. Takie sekwencje regulatorowe opisano na przykład w Goeddel (technologia ekspresji genów. Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Specjalista w tej dziedzinie zauważy, że projektowanie wektora ekspresyjnego, w tym wybór sekwencji regulatorowych, może zależeć od takich czynników jak wybór transformowanej komórki gospodarza, poziom ekspresji żądanego białka, itp. Korzystne sekwencje regulatorowe dla komórek gospodarza ssaka, w których zachodzi ekspresja, obejmują elementy wirusowe, które kierują wysokimi poziomami ekspresji białka w komórkach ssaków, takich jak promotory i/lub wzmacniacze pochodzące z wirusa cytomegalii (CMV), wirusa małpiego 40 (SV40), adenowirusa, (np. główny późny promotor adenowirusowy (AdMLP) i polioma. Alternatywnie, mogą być użyte nie wirusowe sekwencje regulatorowe, takie jak promotor ubikwityny lub promotor β-globiny. I jeszcze dalej, elementy regulatorowe składające się z sekwencji z różnych źródeł, takich jak system promotora SRα, który zawiera sekwencje od wczesnego promotora SV40 i długich powtórzeń terminalnych wirusa limfocytów T typu 1 ludzkiej białaczki (Takebe, Y. i współpracownicy (1988) Mol. Cell. Biol. 8: ). [0077] Oprócz genów łańcucha przeciwciał i sekwencji regulatorowych, rekombinowane wektory ekspresyjne według wynalazku mogą nieść dodatkowe sekwencje, takie jak sekwencje regulujące replikację wektora w komórkach gospodarza (np. początki replikacji) i geny markerów selekcyjnych. Gen markera selekcyjnego ułatwia selekcję komórek gospodarza, do których wprowadzono wektor (patrz, np., US Pat , i , wszystkie autorstwa Axel i współpracownicy). Przykładowo, zwykle gen markera selekcyjnego nadaje oporność na leki, takie jak G418, higromycynę albo metotreksat, komórce gospodarza, do której wprowadzono wektor. Korzystne geny markerów selekcyjnych obejmują gen reduktazy dihydrofolianu (DHFR) (do zastosowania w komórkach dhfr- z selekcją/amplifikacją z użyciem metotreksatu) i gen neo (do selekcji z użyciem G418). [0078] Dla ekspresji łańcuchów lekkich i ciężkich, wektorem (wektorami) ekspresyjnym kodującym łańcuchy lekkie i ciężkie transfekuje się komórki gospodarza standardowymi metodami. Różne postacie terminu "transfekcja" w zamierzeniu obejmują wielką różnorodność technik stosowanych powszechnie do wprowadzania egzogennego DNA do komórek gospodarza prokariotycznego lub eukariotycznego, np. transfekcja przez elektroporację, precypitację fosforanem wapnia, dekstran-deae i podobne. Jakkolwiek możliwe jest teoretycznie wyrażanie przeciwciał według wynalazku w innych komórkach gospodarza prokariotycznego lub eukariotycznego, ekspresja przeciwciał w komórkach eukariotycznych, i najbardziej korzystnie w ssaczych komórkach gospodarza jest najkorzystniejsza, ponieważ takie komórki eukariotyczne, a szczególnie komórki sacze, w porównaniu z komórkami prokariotycznymi dają większe prawdopodobieństwo wytworzenia i wydzielenia prawidłowo pofałdowanego i immunologicznie czynnego przeciwciała. Ekspresję prokariotyczną genów przeciwciał opisano jako nieskuteczną do wytwarzania znacznych ilości aktywnego przeciwciała (M.A. Boss i C.R. Wood (1985) Immunology Today 6:12-13). [0079] Korzystne komórki gospodarza ssaczego do wyrażania rekombinowanych przeciwciał według wynalazku obejmują komórki jajnika chomika chińskiego (komórki CHO) (w tym komórki CHO-dhfr, opisane przez Urlaub i Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: , zastosowane z markerem selekcyjnym DHFR, jak np. opisano w R.J. Kaufman

22 i P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159: ), komórki szpiczaka NSO, komórki COS i SP2. W szczególności, do stosowania z komórkami szpiczaka NSO, innym korzystnym systemem wyrażania jest system ekspresji genu GS ujawniony w WO 87/04462, WO 89/01036 i PE Kiedy rekombinowane wektory ekspresyjne kodujące geny przeciwciała wprowadzi się do ssaczych komórek gospodarza, przeciwciała wytwarzane są przez hodowanie komórek gospodarza przez okres czasu wystarczający do ekspresji przeciwciała w komórkach gospodarza lub, bardziej korzystnie, wydzielenie przeciwciał do pożywki hodowlanej, w której hodowana jest komórka gospodarza. Przeciwciała mogą być odzyskane z pożywki hodowlanej przy użyciu standardowych metod oczyszczania białek. Charakterystyka wiązania przeciwciała z antygenem [0080] Przeciwciała według wynalazku mogą być testowane pod kątem wiązania IP-10, za pomocą, na przykład, standardowego testu ELISA. W skrócie, płytki mikrotitracyjne powleka się oczyszczonym IP-10 w stężeniu 0,25 μg/ml w PBS i następnie blokuje z 5% albuminą osocza krowiego w PBS. Do każdego studzienki dodaje się rozcieńczenia przeciwciała (np. rozcieńczenia surowicy od myszy immunizowanych IP-10) i inkubuje przez 1-2 godziny w 37 C. Płytki przemywa się PBS/ Tween 20, a następnie inkubuje z odczynnikiem drugorzędowym (np. dla ludzkich przeciwciał, z kozim poliklonalnym odczynnikiem przeciw ludzkim IgG specyficznym wobec Fc), sprzężonym z fosfatazą alkaliczną przez 1 godzinę w 37 C. Po przemyciu, płytki rozwija się z substratem pnpp (1 mg/ml) i mierzy przy OD równej Do fuzji korzystnie zostaną użyte myszy, które wykształciły najwyższe miano. [0081] Test ELISA, jak opisano powyżej, można również zastosować do badań przesiewowych pod kątem hybrydom, które wytwarzają przeciwciała wykazujące dodatnią reakcję z IP- 10 immunogenem. Hybrydomy, które wiążą się z wysokim powinowactwem z IP-10, można wówczas subklonować i dalej charakteryzować. Jeden klon z każdej hybrydomy, która utrzymuje reaktywność komórek macierzystych (za pomocą ELISA), może być wybrany celem utworzenia banku komórek 5-10 probówek, przechowywanego w -140 C, i oczyszczenia przeciwciała. [0082] W celu oczyszczania ludzkich przeciwciał monoklonalnych, wybrane hybrydomy można hodować w dwulitrowych butelkach z mieszadłem do hodowli komórek zawieszonych w płynie (ang. spinner flask) do oczyszczania przeciwciał monoklonalnych. Supernatanty można przefiltrować i zatężyć przed chromatografią powinowactwa za pomocą A-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, N.J.) do białek. Eluowany IgG może być sprawdzany za pomocą elektroforezy żelowej i wysokosprawnej chromatografii cieczowej w celu zapewnienia czystości. Roztwór buforu można wymienić na PBS, i stężenie można wyznaczyć za pomocą OD 280 stosując współczynnik ekstynkcji1,43. Przeciwciała monoklonalne można dzielić na równe objętości (alikwoty) i przechowywać w temperaturze -80 C. [0083] W celu oznaczenia, czy wybrane przeciwciała monoklonalne anty-ip-10 wiążą się z niepowtarzalnymi epitopami, każde przeciwciało można biotynylować stosując komercyjnie dostępne odczynniki (Pierce, Rockford, IL). Badania kompetycyjne stosujące nieznakowane monoklonalne przeciwciała i biotynylowane monoklonalne przeciwciała można przeprowadzić stosując powlekane IP-10 płytki ELISA, jak opisano powyżej. Wiązanie biotynylowanego mab można wykryć za pomocą próby ze znakowaną streptawidyną-fosfatazą alkaliczną.

23 [0084] W celu oznaczenia izotypu oczyszczanych przeciwciał, izotypy ELISA można wykonać używając odczynniki specyficzne dla przeciwciał konkretnego izotypu. Na przykład, aby określić izotyp ludzkiego przeciwciała monoklonalnego, sudzienki płytek mikrotitracyjnych można powlekać z 1 µg/ml przeciw-ludzkiej immunoglobuliny przez noc w 4 C. Po blokowaniu z 1% BSA, płytki poddaje się reakcji z 1 µg/ml lub mniej badanych przeciwciał monoklonalnych lub oczyszczonych kontroli izotypu, w temperaturze pokojowej przez jedną do dwóch godzin. Zawartość sudzienek można następnie poddać reakcji albo z ludzką IgG1 lub ludzką specyficzną dla IgM alkaliczną fosfatazą sprzężoną z sondą. Płytki są rozwijanie i analizowane w sposób opisany powyżej. [0085] Anty-IP-10 ludzkie IgG może być dalej testowane na reaktywność z IP-10 antygenem poprzez Western blotting. W skrócie, IP-10 mogą być przygotowane i poddane elektroforezie w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu. Po elektroforezie, oddzielone antygeny są przenoszone na membrany nitrocelulozowe, zablokowane z 10% cielęcą surowicą płodową i badane z monoklonalnymi przeciwciałami do przetestowania. Wiązanie ludzkiej IgG można wykryć za pomocą przeciw-ludzkiej IgG fosfatazy alaklicznej i rozwinięte z tabletkami substratu BCIP/NBT (Sigma Chem., St Louis, MO). Immunokoniugaty [0086] W innym aspekcie, wynalazek dostarcza anty-ip-10 przeciwciało lub jego fragment, sprzężone z ugrupowaniem terapeutycznym, takim jak cytotoksyna, lek (np., immunosupresant) lub radiotoksyna. Takie koniugaty są tu określane jako "immunokoniugaty". Immunokoniugaty zawierające jeden lub więcej cytotoksyn określane są jako "immunotoksyny". Cytotoksyna lub środek cytotoksyczny oznacza każdy środek, który jest dla komórek szkodliwy (np. zabija je). Przykłady obejmują taksol, cytochalazynę B, gramicydynę D, bromek etydyny, emetynę, mitomycynę, etopozyd, tenopozyd, winkrystynę, winblastynę, kolchicynę, doksorubicynę, daunorubicynę, dihydroksyantracenedion, mitoksantron, mitramycynę, aktynomycynę D, 1-dehydrotestosteron, glikokortykosteroidy, prokainę, tetrakainę, lidokainę, propranolol, puromycynę i analogi lub homologi tych związków. Środki terapeutyczne również obejmują, na przykład, antymetabolity (np., metotreksat, 6-merkaptopurynę, 6-tioguaninę, cytarabinę, 5- fluorouracyl dekarbazynę), środki alkilujące (np. mechloretaminę, tioepachlorambucyl, melfalan, karmustynę (BSNU) i lomustynę (CCNU), cyklofosfamid, busulfan, dibromomannitol, streptozocynę, mitomycynę C i cis-dichlorodiaminę dichloroplatyny (II) (DDP) cisplatynę), antracykliny (np. daunorubicynę (poprzednio daunomycynę) i doksorubicynę), antybiotyki (np. daktynomycynę (poprzednio aktynomycynę), bleomycynę, mitramycynę i antramycynę (AMC)) i środki anty-mitotyczne (np., winkrystyna i winblastyna). [0087] Inne korzystne przykłady terapeutycznych cytotoksyn, które mogą być sprzężone z przeciwciałem według wynalazku obejmują duokarmycyny, kalicheamycyny, majtanzyny, i aurystatyny, i ich pochodne. Przykładem koniugatu przeciwciała kalicheamycyny jest dostępny na rynku preparat Mylotarg ; Wyeth-Ayerst. [0088] Cytotoksyny mogą być sprzężone z przeciwciałami wynalazku za pomocą technologii łącznika dostępnej w tej dziedzinie. Przykłady typów łącznika, które zostały wykorzystane do sprzęgania cytotoksyny z przeciwciałem obejmują, ale bez ograniczania, hydrazony, tioetery, estry, disiarczki i łączniki zawierające peptydy. Łącznik może być wybrany jako, na przykład,

24 podatny na rozszczepienie przez niskie ph w komorze lizosomalnej lub podatny na rozszczepienie przez proteazy, takie jak proteazy preferencyjnie wyrażone w tkance nowotworowej, takie jak katepsyny (np. katepsyny B, C, D). [0089] Dla dalszej dyskusji typów cytotoksyn, łączników i metody sprzęgania środków terapeutycznych z przeciwciałami, patrz również Saito, G. i współpracownicy (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55: ; Trail, P.A. i współpracownicy (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52: ; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3: ; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2: ; Pastan, I. i Kreitman, R.J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3: ; Senter, P.D. i Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53: [0090] Przeciwciała według wynalazku można również sprzęgać z radioaktywnym izotopem do generowania cytotoksycznych radiofarmaceutyków, również określanych jako radioimmunokoniugaty. Przykłady izotopów promieniotwórczych, które mogą być sprzęgane z przeciwciałami do użytku diagnostycznie albo terapeutycznie obejmują, ale bez ograniczania, iod 131 i ind 111 i itr 90 i lutet 177. Sposoby wytwarzania radioimmunokoniugatów są znane w tej dziedzinie. Przykłady radioimmunokoniugatów są dostępne w handlu, w tym Zevalin (IDEC Pharmaceuticals) i Bexxar (Corixa Pharmaceuticals), i podobne sposoby mogą być wykorzystane do przygotowania radioimmunokoniugatów z zastosowaniem przeciwciał według wynalazku. [0091] Koniugaty przeciwciał według wynalazku można zastosować do modyfikacji danej odpowiedzi biologicznej i ugrupowanie leku nie powinno być interpretowane jako ograniczone do klasycznych chemicznych środków terapeutycznych. Na przykład, ugrupowanie leku może być białkiem lub polipeptydem posiadającym żądaną aktywność biologiczną. Takie białka mogą obejmować na przykład, enzymatycznie aktywne toksyny lub ich aktywne fragmenty, takie jak abryna, rycyna A, egzotoksynę Pseudomonas, lub toksynę błonicy; białko takie jak czynnik martwicy nowotworu lub interferon-γ; lub modyfikatory odpowiedzi biologicznej, takie jak, na przykład, limfokiny, interleukina-1 ("IL-1"), interleukina-2 ("IL-2"), interleukina-6 ("IL-6"), czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów ("GM-CSF "), czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów (" G-CSF "), lub inne czynniki wzrostu. [0092] Techniki sprzęgania takich terapeutycznych ugrupowań z przeciwciałami są dobrze znane, patrz np: Arnon i współpracownicy,"monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", Reisfeld i współpracownicy. (wyd.), str (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom i współpracownicy, "Antibodies For Drug Delivery", w Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson i współpracownicy. (wyd.), str (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antybody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", w Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera i współpracownicy. (wyd.), str (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibodies In Cancer Therapy", w Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin i współpracownicy. (wyd.), str (Academic Press 1985), i Thorpe i współpracownicy, "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: (1982). Cząsteczki bispecyficzne

25 [0093] W innym aspekcie, wynalazek dostarcza bispecyficzne cząsteczki zawierające przeciwciało anty-ip-10 lub jego fragment, według wynalazku. Przeciwciało według wynalazku, lub ich części wiążące antygen, można zderywatyzować lub połączyć z inną funkcjonalną cząsteczką, np. innym peptydem lub białkiem (np. innym przeciwciałem lub ligandem dla receptora) do wygenerowania bispecyficznej cząsteczki, która wiąże się z co najmniej dwoma różnymi miejscami wiążącymi lub cząsteczkami docelowymi. Przeciwciało według wynalazku w rzeczywistości może być derywatyzowane lub związane z więcej niż jedną inną funkcjonalną cząsteczką do wygenerowania cząsteczek multispecyficznych, które wiążą się z więcej niż dwoma różnymi miejscami wiążącymi i/lub cząsteczkami docelowymi; takie cząsteczki multispecyficzne są również objęte terminem "bispecyficzna cząsteczka" jak tu stosowane. Aby utworzyć bispecyficzną cząsteczkę wynalazku, przeciwciało według wynalazku może być powiązane funkcjonalnie (np. przez sprzężenie chemiczne, fuzję genetyczną, nie kowalencyjne wiązanie lub inaczej) z jedną lub więcej innych cząsteczek wiążących, takich jak inne przeciwciała, fragmenty przeciwciał, peptyd lub wiążące mimetyki tak, aby otrzymać cząsteczkę bispecyficzną. [0094] Odpowiednio, wynalazek obejmuje bispecyficzne cząsteczki zawierające co najmniej jedną pierwszą specyficzność wiązania dla IP-10 i drugą specyficzność wiązania dla drugiego docelowego epitopu. W szczególnym przykładzie wykonania wynalazku, drugim epitopem docelowym jest receptor Fc, np. ludzki FcγRI (CD64) lub ludzki receptor Fcα (CD89). Z tego względu wynalazek obejmuje bispecyficzne cząsteczki zdolne do wiązania się zarówno do FcγR i FcαR lub FcεR wyrażając komórki efektorowe (np. monocyty, makrofagi i komórki cechujące się różnokształtnością jąder komórkowych (PMN)) i komórek docelowych wyrażających IP-10. Te bispecyficzne cząsteczki kierują wyrażające IP-10 komórki do komórki efektorowej i za pośrednictwem receptora Fc wyzwalają działania komórek efektorowych, takie jak fagocytoza komórek wyrażających IP-10, zależna od przeciwciała komórkowa cytotoksyczność (ADCC), uwalnianie cytokin lub generacja anionu ponadtlenkowego. [0095] W przykładzie wykonania wynalazku, w którym bispecyficzna cząsteczka jest multispecyficzna, cząsteczka może ponadto zawierać trzecią specyficzność wiązania, oprócz anty- Fc specyficzności wiązania i anty-ip-10 specyficzności wiązania. W jednym z przykładów wykonań, trzecia specyficzność wiązania jest częścią czynnika anty-wzmocnienia (EF), np. cząsteczka, która wiąże się z białkiem powierzchniowym zaangażowanym w cytotoksyczną aktywność, a tym samym zwiększa odpowiedź immunologiczną przeciw komórce docelowej. "Część czynnika anty-wzmocnienia" może stanowić przeciwciało, funkcjonalny fragment przeciwciała lub ligand, który wiąże się z daną cząsteczką, np. antygen lub receptor, i w ten sposób prowadzi do wzmocnienia efektu wiązania determinant dla F c receptora lub antygenu komórki docelowej. "Część czynnika anty-wzmocnienia" może wiązać receptor F c lub antygen komórki docelowej. Alternatywnie, część czynnika anty-wzmocnienia może wiązać się z jednostką, która jest inna niż jednostka, z którą związane są pierwsza i druga specyficzność wiązania. Na przykład, część czynnika anty-wzmocnienia może wiązać cytotoksyczną komórkę T (np. poprzez CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 lub inną komórkę odpornościową, co powoduje zwiększoną odpowiedź immunologiczną wobec komórki docelowej).

26 [0096] W jednym przykładzie wykonania, bispecyficzne cząsteczki wynalazku obejmują jako specyficzność wiązania przynajmniej jedno przeciwciało, lub jego fragment przeciwciała, w tym np. Fab, Fab', F(ab') 2, Fv lub pojedynczy łańcuch Fv. Przeciwciałem może być również dimer łańcucha lekkiego lub łańcucha ciężkiego, lub ich każdy minimalny fragment, taki jak Fv lub konstrukt o pojedynczym łańcuchu, jak opisano w Ladner i współpracownicy, Patent USA [0097] W jednym przykładzie wykonania, specyficzność wiązania dla receptora Fcγ jest zapewniona przez przeciwciało monoklonalne, którego wiązanie nie jest blokowane przez ludzką immunoglobulinę G (IgG). Stosowany tu termin "receptor IgG" dotyczy każdego z ośmiu γ-łańcuchowych genów zlokalizowanych na chromosomie 1. Geny te kodują razem dwanaście izoform transbłonowych lub rozpuszczalnych receptorów, które są pogrupowane w trzy klasy receptorów Fcγ: FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), i FcγRIII (CD16). W jednym korzystnym przykładzie wykonania, receptor Fcγ jest ludzkim, o wysokim powinowactwie FcγRI. Ludzki FcγRI jest 72 kda cząsteczką, która wykazuje duże powinowactwo do monomerycznej IgG ( M -1 ). [0098] Wytwarzanie i charakterystyka niektórych korzystnych anty-fcγ przeciwciał monoklonalnych opisano przez Fanger i współpracownicy, w publikacji PCT WO 88/00052 i w patencie USA nr Przeciwciała te wiążą się z epitopem FcγRI, FcγRII lub FcγRIII w miejscu, które jest odmienne od Fcγ miejsce wiązania receptora, a tym samym ich wiązanie nie jest zablokowane istotnie przez fizjologiczne poziomy IgG. Specyficzne anty-fcγri przeciwciała użyteczne w wynalazku stanowią mab 22, mab 32, mab 44, mab 62 i mab 197. Hybrydoma wytwarzająca mab 32 jest dostępna z the American Type Culture Collection, ATCC Accession No. HB9469. W innych przykładach wykonania, przeciwciało anty-fcγ receptora jest humanizowaną postacią przeciwciała monoklonalnego 22 (H22). Wytwarzanie i charakterystykę H22 przeciwciała opisano w Graziano, RF. i współpracownicy, (1995) J. Immunol 155 (10): i publikacji PCT WO 94/ Przeciwciało H22 wytwarzające linię komórkową zdeponowano w American Type Culture Collection pod nazwą HA022CL1 i ma nr dostępu CRL [0099] W jeszcze innych korzystnych wykonaniach, specyficzność wiązania dla receptora Fc jest zapewniona przez przeciwciało, które wiąże się z ludzkim receptorem IgA, np. Fc-alfa receptorem (FcαRI (CD89)), wiązaniem, które korzystnie nie jest zablokowane przez ludzką immunoglobulinę A (IgA). Termin "receptor IgA" obejmuje produkt genu jednego α-genu (FcαRI) zlokalizowanego na chromosomie 19. Gen ten jest znany z kodowania kilku alternatywnie uformowanych izoform transbłonowych o 55 do 110 kda. FcαRI (CD89) ulega konstytutywnie ekspresji w monocytach/makrofagach, eozynofilowych i neutrofilowych granulocytach, lecz nie na nie-efektorowych populacjach komórek. FcαRI wykazuje umiarkowane powinowactwo ( M -1 ) zarówno dla IGA1 i IgA2, które wzrasta po ekspozycji na cytokiny, takie jak G-CSF lub GM-CSF (Morton, HC i współpracownicy, (1996) Critical Reviews in Immunology 16: ). Cztery FCαRI specyficzne przeciwciała monoklonalne, zidentyfikowane jako A3, A59, A62 i A77, które wiążą FcαRI poza domeną wiążącą liganda IgA, opisano (Monteiro, R.C. i współpracownicy, (1992) J. Immunol 148: 1764).

27 [0100] FcαRI i FcγRI są korzystnymi receptorami wyzwalającymi do stosowania w bispecyficznych cząsteczkach według wynalazku, ponieważ są one (1) wyrażane przede wszystkim na odpornościowych komórkach efektorowych, np. monocytach, PMN, makrofagach i komórkach dendrytycznych, (2) wyrażane na wysokim poziomie (np na komórkę), (3) mediatorami działań cytotoksycznych (np. ADCC, fagocytozy); (4) pośredniczą w zwiększonej prezentacji antygenowej antygenów, obejmujących autoantygeny, skierowane do nich. [0101] Podczas gdy ludzkie przeciwciała monoklonalne są korzystne, innymi przeciwciałami, które można zastosować w bispecyficznych cząsteczkach wynalazku są mysie, chimeryczne i humanizowane przeciwciała monoklonalne. [0102] Bispecyficzne cząsteczki według wynalazku można wytwarzać przez sprzężenie składowych, np. anty-f C R i anty-ip-10 specyficzności wiązania, stosując metody znane w tej dziedzinie. Na przykład, każda specyficzność wiązania bispecyficznej cząsteczki może być generowana oddzielnie, a następnie sprzęgana ze sobą. Jeśli specyficzności wiązania stanowią białka lub peptydy, różnorodne środki sprzęgające lub sieciujące mogą być stosowane do kowalencyjnej koniugacji. Przykłady środków sieciujących obejmują białko A, karbodiimidy, N-sukcynimidylo-S-acetylo-tiooctan (SATA), kwas 5,5'-ditiobis (2-nitrobenzoesowy) (DTNB), o-fenylenodimaleimid (opdm), N-sukcynimidylo-3-(2-pirydyloditio)propionian (SPDP), i sulfosukcynimidyl 4-(N-maleimidometylo) cykloheksano-1-karboksylowego (sulfo-smcc) (patrz np., Karpovsky i współpracownicy, (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA i współpracownicy, (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:648). Inne metody obejmują te opisane w Paulus (1985) Behring Inst. Mitt. Nr 78, ; Brennan i współpracownicy, (1985) Science 229:81-83), i Glennie i współpracownicy, (1987) J. Immunol. 139: ). Korzystnymi środkami sprzęgania są SATA i sulfo-smcc, obydwa dostępne z Pierce Chemical Co (Rockford, IL). [0103] Jeśli specyficzności wiązania stanowią przeciwciała mogą one być sprzęgane przez wiązania tiolowe C-końcowych regionów zawiasowych dwóch łańcuchów ciężkich. W szczególnie korzystnym przykładzie wykonania, region zawiasowy jest zmodyfikowany tak, aby zawierał nieparzystą liczbę reszt tiolowych, korzystnie jedną, przed koniugacją. [0104] Alternatywnie, zarówno specyficzności wiązania mogą być kodowane w tym samym wektorze i wyrażane i montowane w tej samej komórce gospodarza. Metoda ta jest szczególnie użyteczna, jeśli bispecyficzną cząsteczką jest mab x mab, mab x Fab, Fab x F(ab') 2 lub ligand x Fab białka fuzyjnego. Bispecyficzną cząsteczką według wynalazku może być cząsteczka o pojedynczym łańcuchu, zawierająca jedno przeciwciało o pojedynczym łańcuchu i wiążącą determinantę, lub bispecyficzna cząsteczka o pojedynczym łańcuchu, zawierająca dwie wiążące determinanty. Bispecyficzne cząsteczki mogą zawierać co najmniej dwie cząsteczki o pojedynczych łańcuchach. Metody otrzymywania bispecyficznych cząsteczek opisano na przykład w patencie amerykańskim numer patencie amerykańskim numer ; patencie amerykańskim numer ; patencie amerykańskim numer ; patencie amerykańskim numer ; patencie amerykańskim numer ; patencie amerykańskim numer ; patencie amerykańskim numer i patencie amerykańskim numer

28 [0105] Wiązanie bispecyficznych cząsteczek do ich specyficznych celów może zostać potwierdzone przez, na przykład, test immunoenzymatyczny (ELISA), test radioimmunologiczny (RIA), analizę FACS, test biologiczny (np. zahamowanie wzrostu), lub test Western Blotting. Każdy z tych testów zazwyczaj wykrywa obecność kompleksów białko-przeciwciało szczególnego zainteresowania przez zastosowanie odczynnika znakowanego (np. przeciwciała) specyficznego dla kompleksu będącego przedmiotem zainteresowania. Na przykład, kompleksy FCR-przeciwciało można wykryć za pomocą np., przeciwciała lub fragmentu przeciwciała związanego z enzymem, który rozpoznaje i specyficznie wiąże się z kompleksami przeciwciało-fcr. Alternatywnie, kompleksy mogą być wykryte za pomocą jednego z wielu innych testów immunologicznych. Na przykład, przeciwciała mogą być radioaktywnie znakowane i wykorzystywane w teście radioimmunologicznym (RIA) (patrz, na przykład, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986). Izotop promieniotwórczo może być wykryty za pomocą takich środków, jak użycie licznika γ lub licznika scyntylacyjnego lub stosując autoradiografię. Kompozycje farmaceutyczne [0106] W innym aspekcie, wynalazek dostarcza kompozycję, np., kompozycję farmaceutyczną, zawierającą jedno lub kombinację przeciwciał monoklonalnych lub jego część (części) wiążącą antygen, według wynalazku, formułowaną wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. Takie kompozycje mogą obejmować jedno lub kombinację (np. dwóch lub więcej różnych) przeciwciał, lub immunokoniugatów lub bispecyficznych cząsteczek wynalazku. Na przykład, farmaceutyczna kompozycja według wynalazku może zawierać kombinację przeciwciał (lub immunokoniugatów lub bispecyficznych), które wiążą się z różnymi epitopami na docelowym antygenie, lub które mają działanie komplementrarne. [0107] Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku można również podawać w terapii skojarzonej, czyli połączeniu z innymi środkami. Na przykład, terapia skojarzona może obejmować anty-ip-10 przeciwciało według wynalazku, połączone z co najmniej jednym innym środkiem przeciwzapalnym lub immunosupresyjnym. Przykłady środków terapeutycznych, które można wykorzystać w terapii skojarzonej opisano bardziej szczegółowo poniżej w rozdziale dotyczącym wykorzystania przeciwciał według wynalazku. [0108] Stosowane tu określenie "farmaceutycznie dopuszczalny nośnik" obejmuje dowolne i wszystkie rozpuszczalniki, ośrodki dyspersyjne, powłoki, środki przeciwbakteryjne i przeciwgrzybicze, środki izotoniczne i opóźniające wchłanianie, i podobne, które są dopuszczalne fizjologicznie. Korzystnie, nośnik jest odpowiedni do podawania dożylnego, domięśniowego, podskórnego, pozajelitowego, doodbytniczego, do kręgosłupa lub na skórę (np. przez iniekcję lub wlew). W zależności od drogi podania, związek aktywny, tzn. przeciwciało, immunokoniugat lub cząsteczka bispecyficzna, może być powlekana materiałem, aby chronić związek przed działaniem kwasów i innych naturalnych warunków, które mogą inaktywować związek. [0109] Farmaceutyczne związki według wynalazku mogą obejmować jedną lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnych soli: "Farmaceutycznie dopuszczalna sól" dotyczy soli, która zachowuje pożądaną aktywność biologiczną związku macierzystego i nie wywiera żadnych niepożądanych działań toksycznych (patrz np. Berge, S.M. i współpracownicy, (1977) J. Pharm

29 Sci. 66: 1-19). Przykłady takich soli obejmują sole addycyjne z kwasami i sole addycyjne z zasadami. Sole addycyjne z kwasami obejmują te pochodzące od nietoksycznych kwasów nieorganicznych, takich jak kwas solny, azotowy, fosforowy, siarkowy, bromowodorowy, jodowodorowy, fosforowy i podobne, jak również z nietoksycznych kwasów organicznych, takich jak alifatyczne kwasy mono- i dikarboksylowe, fenylo-podstawione kwasy alkanowe, hydroksykwasy alkanowe, kwasy aromatyczne, alifatyczne i aromatyczne kwasy sulfonowe i podobne. Sole addycyjne z zasadami obejmują te pochodzące od metali ziem alkalicznych, takich jak sód, potas, magnez, wapń i podobne, jak również z nietoksycznych amin organicznych, takich jak N,N'-dibenzyloetylenodiamina, N-metyloglukamina, chloroprokaina, cholina, dietanoloamina, etylenodiamina, prokaina i podobne. [0110] Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku może również zawierać farmaceutycznie dopuszczalny antyutleniacz. Przykłady farmaceutycznie dopuszczalnych przeciwutleniaczy obejmują: (1) rozpuszczalne w wodzie przeciwutleniacze, takie jak kwas askorbinowy, chlorowodorek cysteiny, wodorosiarczan sodu, pirosiarczyn sodu, siarczyn sodu i podobne; (2) rozpuszczalne w oleju przeciwutleniacze, takie jak palmitynian askorbylu, butylohydroksyanizol (BHA), butylohydroksytoluen (BHT), lecytyna, galusan propylu, alfa-tokoferol, i podobne, i (3) środki chelatujące metale, takie jak kwas cytrynowy, kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), sorbitol, kwas winowy, kwas fosforowy i podobne. [0111] Przykłady odpowiednich wodnych i niewodnych nośników, które można stosować w kompozycjach farmaceutycznych wynalazku obejmują wodę, etanol, poliole (takie jak gliceryna, glikol propylenowy, glikol polietylenowy i podobne) i odpowiednie ich mieszaniny, oleje roślinne, takie jak oliwa z oliwek, i estry organiczne do iniekcji, takie jak oleinian etylu. Właściwą płynność można utrzymywać, na przykład przez użycie materiałów powłokowych, takich jak lecytyna, przez utrzymanie wymaganej wielkości cząstek w przypadku dyspersji i przez użycie środków powierzchniowo czynnych. [0112] Kompozycje te mogą również zawierać środki pomocnicze, takie jak środki konserwujące, środki zwilżające, środki emulgujące i środki dyspergujące. Zapobieganie obecności mikroorganizmów może być zapewnione zarówno przez procedury sterylizacji, supra, jak i przez włączenie różnych środków antybakteryjnych i przeciwgrzybiczych, np. parabenu, chlorobutanolu, fenolu, kwasu sorbowego i podobne. Może być również pożądane włączenie do kompozycji środków izotonicznych, takich jak cukry, chlorek sodu i podobne. Przedłużone wchłanianie postaci farmaceutycznej do iniekcji można wywołać przez wprowadzenie do kompozycji środka utrudniającego wchłanianie, np. soli monostearynianu i żelatyny. [0113] Farmaceutycznie dopuszczalne nośniki obejmują sterylne wodne roztwory lub dyspersje i jałowe proszki do przygotowania bezpośrednio przed użyciem sterylnych roztworów lub dyspersji. Wykorzystanie takich mediów i środków dla substancji aktywnych farmaceutycznie jest znane w tej dziedzinie. Z wyjątkiem przypadku, gdy dowolny konwencjonalny nośnik lub środek jest nie kompatybilny ze związkiem aktywnym, ich wykorzystanie w kompozycjach farmaceutycznych według wynalazku jest rozważane. Związki aktywne uzupełniające mogą być również włączone do kompozycji. [0114] Kompozycje terapeutyczne zwykle muszą być sterylne i trwałe w warunkach wytwarzania i przechowywania. Kompozycje można wytwarzać jako roztwór, mikroemulsję, lipo-

30 som lub inne uporządkowane struktury odpowiednie do osiągania wysokiego stężenia leku. Nośnikiem może być rozpuszczalnik lub ośrodek dyspersyjny, zawierający, na przykład wodę, etanol, poliol (np. gliceryna, glikol propylenowy i ciekły glikol polietylenowy i podobne), i odpowiednie ich mieszaniny. Właściwą płynność można utrzymywać, na przykład przez użycie materiałów powłokowych, takich jak lecytyna, przez utrzymanie wymaganej wielkości cząstek w przypadku dyspersji i przez użycie środków powierzchniowo czynnych. W wielu przypadkach korzystne jest włączenie do kompozycji środków izotonicznych, takich jak cukry, polialkohole, takie jak mannitol, sorbitol, lub chlorek sodu. Przedłużone wchłanianie kompozycji do iniekcji można wywołać przez wprowadzenie do kompozycji środka utrudniającego wchłanianie, np. soli monostearynianu i żelatyny. [0115] Sterylne roztwory do iniekcji można otrzymać poprzez wprowadzenie związku aktywnego w wymaganej ilości do odpowiedniego rozpuszczalnika razem z jednym lub kombinacją wyliczonych powyżej składników, w sposób wymagany, po którym następuje filtracyjna sterylizacja. Ogólnie, dyspersje przygotowuje się poprzez wprowadzenie związku aktywnego do sterylnego nośnika zawierającego zasadowy ośrodek dyspersyjny i inne wymagane składniki spośród wymienionych powyżej. W przypadku sterylnych proszków do przygotowania sterylnych roztworów do iniekcji, użytecznymi sposobami przygotowania jest suszenie pod próżnią i liofilizacja, która dostarcza sproszkowany składnik aktywny plus wszelkie dodatkowe pożądane składniki z jego przefiltrowanego uprzednio jałowo roztworu. [0116] Ilość składnika aktywnego, który może być połączony z materiałem nośnym do wytworzenia pojedynczej postaci dawki będzie się różnić w zależności od leczonego pacjenta i szczególnego sposobu podawania. Ilość składnika aktywnego, która może być połączona z materiałem nośnym do otrzymania pojedynczej postaci dawkowania będzie ogólnie ilością kompozycji, która wytwarza efekt terapeutyczny. Ogólnie, ze stu procent, ilość ta będzie wahać się w zakresie od około 0,01 procent do około dziewięćdziesiąt dziewięć procent składnika aktywnego, korzystnie od około 0,1 procent do około 70 procent, i najbardziej korzystnie od około 1 procenta do około 30 procent składnika aktywnego w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. [0117] Schematy dawkowania są dostosowane tak, aby zapewnić optymalną pożądaną odpowiedź (np. odpowiedź terapeutyczną). Przykładowo można podawać pojedynczy bolus, podawać kilka podzielonych dawek w czasie lub dawkę można proporcjonalnie zmniejszać lub zwiększać według wskazań wynikających z wymagań sytuacji terapeutycznej. Szczególnie korzystne jest przygotowanie kompozycji pozajelitowych w postaci jednostkowych dawek ze względu na łatwość podawania i jednorodność dawki. Postać jednostkowej dawki, jak tu stosowana, dotyczy fizycznie odrębnych jednostek stosownych jako dawki jednostkowe dla osobników, poddanych leczeniu; każda jednostka zawiera wcześniej określoną ilość aktywnego składnika obliczoną tak, by wywoływał pożądany rezultat w połączeniu z wymaganym nośnikiem farmaceutycznym. Specyfikacja jednostkowych postaci dawkowania według wynalazku jest podyktowana i bezpośrednio zależna od (a) szczególnych cech związku aktywnego i określonego efektu terapeutycznego, który ma zostać osiągnięty, i (b) wewnętrznych ograniczeń techniki przygotowania takiego związku aktywnego do leczenia wrażliwości u osobników.

31 [0118] Do podawania przeciwciała, zakresy dawkowanie wynoszą od około 0,0001 do 100 mg/kg, i częściej 0,01 do 5 mg/kg, masy ciała gospodarza. Na przykład, dawkowanie może wynosić 0,3 mg/kg masy ciała, 1 mg/kg masy ciała, 3 mg/kg masy ciała, 5 mg/kg masy ciała lub 10 mg/kg masy ciała lub w zakresie 1-10 mg/kg. Przykładowy schemat leczenia wymaga podawania raz na tydzień, raz na dwa tygodnie, raz na trzy tygodnie, raz na cztery tygodnie, raz na miesiąc, raz na 3 miesiące lub raz na trzy do sześciu miesięcy. Korzystne schematy dawkowania dla anty-ip-10 przeciwciała wynalazku obejmują 1 mg/kg masy ciała lub 3 mg/kg masy ciała w przypadku podawania dożylnego, przeciwciało jest podawane według jednego z następujących schematów dawkowania: (i) co cztery tygodnie dla sześciu dawek, następnie co trzy miesiące, (ii) co trzy tygodnie, (iii) 3 mg/kg masy ciała raz, a następnie 1 mg/kg masy ciała co trzy tygodnie. [0119] W niektórych sposobach, dwa lub więcej przeciwciał monoklonalnych z różnymi specyficznościami wiązania podaje się jednocześnie, w takim przypadku dawka każdego podawanego przeciwciała mieści się w zakresach wskazanych. Przeciwciało jest zwykle podawane wielokrotnie. Odstępy czasu pomiędzy pojedynczymi dawkami mogą być, na przykład, tygodniowe, miesięczne, co trzy miesiące lub roczne. Odstępy czasowe mogą być nieregularne, jak wskazano, mierząc stężenie we krwi przeciwciała z docelowym antygenem u pacjenta. W niektórych sposobach, dawkowanie jest dostosowana do uzyskania stężenia przeciwciał w osoczu około µg/ml i w niektórych sposobach około µg/ml. [0120] Alternatywnie, przeciwciała mogą być podawane jako preparat o przedłużonym uwalnianiu, w takim przypadku jest wymagane rzadsze podawanie. Dawkowanie i częstość zmienia się zależnie od okresu półtrwania przeciwciała u pacjenta. Ogólnie, najdłuższy okres półtrwania wykazują przeciwciała ludzkie, następnie przeciwciała humanizowane, przeciwciała chimeryczne, i przeciwciała nie ludzkie. Dawkowanie i częstość podawania mogą się różnić w zależności od tego, czy leczenie jest profilaktyczne czy terapeutyczne. W zastosowaniach profilaktycznych, stosunkowo niską dawkę podaje się w stosunkowo rzadkich odstępach czasowych przez długi okres czasu. Niektórzy pacjenci kontynuują leczenie przez resztę ich życia. W zastosowaniach terapeutycznych, stosunkowo wysoka dawka w stosunkowo krótkich odstępach czasowych jest czasem wymagana aż do zmniejszenia postępu lub zakończenia choroby, i korzystnie aż do wykazania u pacjenta częściowego lub całkowitego złagodzenia objawów choroby. Następnie u pacjenta można zastosować schemat profilaktyczny. [0121] Rzeczywiste poziomy dawkowania składników aktywnych w kompozycjach farmaceutycznych według wynalazku mogą być zróżnicowane tak, aby uzyskać ilość składnika aktywnego, która jest skuteczna w celu osiągnięcia pożądanej terapeutycznej odpowiedzi u konkretnego pacjenta, kompozycji i sposobu podawania, bez bycia toksycznym dla pacjenta. Wybrany poziom dawkowanie zależy od różnych czynników farmakokinetycznych, obejmujących aktywność zastosowanych konkretnych kompozycji wynalazku, lub jego estru, soli lub amidu, drogi podawania, czasu podawania, szybkości wydalania zastosowanego konkretnego związku, czasu trwania leczenia, innych leków, związków i/lub materiałów używanych w połączeniu z zastosowanymi konkretnymi kompozycjami, wieku, płci, masy ciała, stanu, ogólnego zdrowia i wywiadu medycznego z leczonym pacjentem, i podobnych czynników, dobrze znanych w dziedzinie w medycynie.

32 [0122] "Terapeutycznie skuteczna dawka" anty-ip-10 przeciwciała według wynalazku korzystnie prowadzi do zmniejszenie objawów choroby, wzrostu częstotliwości i czasu trwania okresów wolnych od objawów choroby, lub zapobiegania zaburzeniu lub niepełnosprawności z powodu dolegliwości chorobowych. W przypadku reumatoidalnego zapalenia stawów (RZS), skuteczna terapeutycznie dawka korzystnie zapobiega dalszemu pogarszaniu fizycznych objawów związanych z RZS, takich jak, na przykład, ból, zmęczenie, sztywność poranna (trwające dłużej niż jedną godzinę), rozproszone bóle mięśniowe, utrata apetytu, osłabienie, bóle stawów spowodowane ciepłem, obrzęk, bolesność i sztywność stawu po bezczynności. Terapeutycznie skuteczna dawka korzystnie również zapobiega lub opóźnia wystąpienie RZS, jak to może być pożądane, gdy występują wczesne lub wstępne oznaki choroby. Podobnie obejmuje to opóźnianie progresji przewlekłej związanej z RZS. Badania laboratoryjne stosowane w diagnostyce RZS obejmują chemiczne (w tym pomiary poziomów IP-10), hematologię, serologię i radiologię. Odpowiednio, każdy kliniczny lub biochemiczny test, który monitoruje każdy z powyższych może być wykorzystany do określenia, czy konkretne leczenie stanowi terapeutycznie skuteczną dawkę w leczeniu RZS. Specjalista w tej dziedzinie będzie w stanie określić takie ilości, w oparciu o czynniki takie jak wielkość osobnika, nasilenie objawów chorobowych u osobnika i wybrana konkretna kompozycja lub droga podawania. [0123] Kompozycje według niniejszego wynalazku mogą być podawane za pośrednictwem jednego lub więcej sposobów podawania przy użyciu jednego lub więcej różnych sposobów znanych w tej dziedzinie. Będzie zrozumiałe dla specjalisty, że droga i/lub sposób podawania i/lub schemat podawania będą się różnić w zależności od pożądanych rezultatów. Korzystne sposoby podawania dla przeciwciał wynalazku obejmują dożylne, domięśniowe, śródskórne, dootrzewnowe, podskórne, dokręgowe lub inne drogi podawania pozajelitowego, na przykład przez iniekcje lub infuzję. Określenie "podawanie pozajelitowe" jak tu stosowane oznacza sposoby podawania inne niż podawanie dojelitowe i miejscowe, zazwyczaj przez iniekcję, i obejmują, w sposób nieograniczający, iniekcje i wlewy dożylne, domięśniowe, dotętnicze, dokanałowe, dotorebkowe, dooczodołowe, dosercowe, śródskórne, śródotrzewnowe, przeztchawicze, podskórne, podnaskórkowe, śródstawowe, podtorebkowe, podpajęczynówkowe, dordzeniowe, nadtwardówkowe i do przestrzeni podpajęczynówkowej. [0124] Alternatywnie, przeciwciało według wynalazku może być podawane drogą niepozajelitową, taką jak droga podawania miejscowa, naskórkowa lub na błony śluzowe, na przykład, donosowo, doustnie, dopochwowo, doodbytniczo, podjęzykowo lub miejscowo. [0125] Związki aktywne mogą być przygotowane z nośnikami, które zapobiegają gwałtownemu uwalnianiu się związku, tak jak w postaci do kontrolowanego uwalniania, w tym wszczepach, plastrach przezskórnych i mikrokapsułkowanych układach dostarczających. Można zastosować ulegające biodegradacji biologicznie kompatybilne polimery, takie jak kopolimer etylenu i octanu winylu, polibezwodniki, poli(kwas glikolowy), kolagen, poliortoestry i poli(kwas mlekowy). Opatentowano oraz znanych jest wiele sposobow wytwarzania takich preparatow. Patrz np. Sustained i Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson (wyd.), Marcel Dekker, Inc., Nowy York, [0126] Kompozycje terapeutyczne można podawać z wyrobami medycznymi znanymi w tej dziedzinie. Na przykład, w korzystnym przykładzie wykonania, kompozycja terapeutyczna

33 według wynalazku może być podawana za pomocą urządzenia do bezigłowych iniekcji podskórnych, takiego jak urządzenia ujawnione w patentach amerykańskich nr ; lub Przykłady dobrze znanych implantów i modułów użytecznych w wynalazku obejmują: patent amerykański nr który ujawnia wszczepialną mikro-infuzyjną pompę do dozowania leków z kontrolowaną szybkością; patent amerykański nr , który ujawnia urządzenie lecznicze do podawania leków przez skórę; patent amerykański amerykański nr który ujawnia pompę infuzyjną leków do dostarczania leków z określoną szybkością wlewu; patent amerykański nr który ujawnia wszczepialny aparat infuzyjny ze zmiennym przepływem do ciągłego podawania leków; patent amerykański nr który ujawnia osmotyczny układ dostarczania leków posiadający multi-komorowe przedziały; i patent amerykański nr , który ujawnia osmotyczny układ dostarczania leków. Wiele innych tego typu implantów, układów dostarczania, i modułów jest znane specjalistom w tej dziedzinie. [0127] W pewnych przykładach wykonania, ludzkie przeciwciała monoklonalne według wynalazku mogą być formułowane w celu zapewnienia właściwej dystrybucji in vivo. Na przykład, bariera krew-mózg (BBB) wyklucza wiele wysoce hydrofilowych związków. Aby zapewnić przekraczanie BBB (w razie potrzeby) przez terapeutyczne związki według wynalazku mogą one być formułowane na przykład w liposomach. Metody wytwarzania liposomów, patrz, np. amerykańskie patenty i Liposomy mogą obejmować jedno lub więcej ugrupowań, które są wybiórczo transportowane do określonych komórek lub narządów, a tym samym wzmacniają ukierunkowane dostarczanie leku (patrz, np., V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Przykładowe reszty kierowania obejmują kwas foliowy lub biotynę (patrz np. patent amerykański dla Low i współpracownicy); mannozydy (Umezawa i współpracownicy, (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); przeciwciała (P.G. Bloeman i współpracownicy (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais i współpracownicy, (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180), białko powierzchniowe A receptora (Briscoe i współpracownicy, (1995). Am. J. Physiol 1233: 134); str.120 (Schreier i współpracownicy, (1994). J. Biol Chem 269:9090), patrz również K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346: 123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273. Zastosowania i sposoby [0128] Przeciwciała (i immunokoniugaty i bispecyficzne cząsteczki) tu ujawnione są użyteczne w in vitro i in vivo diagnostyce i leczeniu. Na przykład, cząsteczki te mogą być podawane do komórek w hodowli, np. in vitro lub ex vivo lub osobnikowi, np. w warunkach in vivo, w celu leczenia, zapobiegania lub diagnozowania różnorodnych zaburzeń. Termin "osobnik" tu stosowany w zamierzeniu obejmuje człowieka i zwierzęta nie będące ludźmi. Termin "zwierzęta nie będące ludźmi" obejmuje wszystkie kręgowce, np. ssaki i nie-ssaki, takie jak naczelne inne niż ludzie, owce, psy, koty, krowy, konie, kurczęta, płazy i gady. Sposoby są szczególnie użyteczne w leczeniu ludzi mających zaburzenia związane z nieprawidłową ekspresją IP-10. Jeśli przeciwciała IP-10 podawane są razem z innym środkiem, to te dwa można podawać albo kolejno albo jednocześnie.

34 [0129] Przeciwciała (i immunokoniugaty i bispecyficzne cząsteczki) wynalazku można stosować do wykrywania poziomów IP-10, lub poziomów komórek zawierających IP-10. Można to osiągnąć na przykład poprzez kontakt próbki (taki jak w próbce in vitro) i próbki kontrolnej z anty-ip-10 przeciwciałem w warunkach, które pozwalają na tworzenie kompleksu pomiędzy przeciwciałem i IP-10. Wszelkie kompleksy utworzone między przeciwciałem i IP-10 są wykrywane i porównywane w próbce i kontroli. Na przykład, standardowe metody wykrywania, dobrze znane w tej dziedzinie, takie jak ELISA i testy cytometrii przepływowej mogą być wykonywane z zastosowaniem kompozycji według wynalazku. [0130] Odpowiednio, ujawnione są sposoby wykrywania obecności IP-10 (np. ludzkiego antygenu IP-10) w próbce lub pomiaru ilości IP-10, obejmujące skontaktowanie próbki, i próbki kontrolnej, z przeciwciałem wynalazku lub jego częścią wiążącą antygen, które specyficznie wiąże się z IP-10, w warunkach, które pozwalają na tworzenie kompleksu pomiędzy przeciwciałem lub jego częścią i IP-10. Powstanie kompleksu jest następnie wykrywane, gdzie różnica w tworzenie kompleksu pomiędzy próbką w porównaniu do próbki kontrolnej wskazuje na obecność IP-10 w próbce. [0131] Również ujawnione są zestawy zawierające kompozycje (np. przeciwciała, ludzkie przeciwciała, immunokoniugaty i bispecyficzne cząsteczki) wynalazku i instrukcje obsługi. Zestaw może ponadto zawierać co najmniej jeden dodatkowy odczynnik lub jedno lub więcej dodatkowych przeciwciał według wynalazku (np. przeciwciała o komplementarnym działaniu, które wiąże się z epitopem na docelowym antygenie różnym od pierwszego przeciwciała). Zestawy zazwyczaj zawierają etykietę wskazującą przeznaczone wykorzystanie zawartości zestawu. Termin etykieta obejmuje dowolny zapisany lub nagrany materiał, umieszczone na pojemniku lub związany z pojemnikiem, lub który w inny sposób towarzyszy zestawowi. [0132] IP-10 ma teraz mieć wpływ chemoatraktanta na aktywowane limfocyty T i komórki NK i rekrutować te komórki do miejsc zapalnych, jak i odpowiedzi autoimmunologicznych. W związku z tym anty-ip-10 przeciwciała (i immunokoniugaty i bispecyficzne cząsteczki) według wynalazku mogą być stosowane do zahamowania odpowiedzi zapalnej lub autoimmunologicznej przy udziale aktywowanych limfocytów T i/lub komórek NK w różnych wskazaniach klinicznych. Ujawniony tu jest sposób zahamowania odpowiedzi zapalnej lub autoimmunologicznej przy udziale aktywowanych limfocytów T i/lub komórek NK obejmujący skontaktowanie limfocytów T lub komórek NK z przeciwciałem lub jego częścią wiążącą antygen, według wynalazku (lub immunokoniugatu lub bispecyficznej cząsteczki według wynalazku) tak, że jest zahamowana odpowiedź zapalna lub autoimmunologiczna. Konkretne przykłady stanów chorobowych zapalnych i autoimmunologicznych, w których przeciwciała mogą być zastosowane obejmują, ale nie są ograniczone do następujących: A. Stwardnienie rozsiane i inne choroby demielinizacyjne [0133] Wykazano, że ekspresja mrna IP-10 zwiększa się w mysim doświadczalnym alergicznym zapaleniu mózgu i rdzenia (EAE), w mysim modelu stwardnienia rozsianego (Godiska, R. i współpracownicy, (1995 ) J. Neuroimmunol. 58: ). Ponadto, podwyższone poziomy IP-10 stwierdzono w płynie mózgowo-rdzeniowym pacjentów z SM podczas ostrych zdarzeń demielinizacyjnych w Sorensen, T.L i współpracownicy, (1999) J. Clin. Invest. 103: ; Franciotta i współpracownicy, (2001) J. Neuroimmunol. 115: ). Wyka-

35 zano również, że IP-10 jest wyrażane przez astrocyty w zmianach MS, ale nie w niezmienionej istocie białej (Balashov, K.E. i współpracownicy, (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: ) i być wyrażone przez makrofagi w blaszkach MS i przez reaktywne astrocyty w otaczającym miąższu (Simpson, J.E. i współpracownicy, (2000) Neuropathol. Appl. Neurobiol. 26: ). PCT Publikacja patentowa WO 02/15932 wykazała, że podawanie anty- IP-10 przeciwciał w modelu MS mysiego wirusa zapalenia wątroby (MHV) spowodowało zmniejszenie limfocytów T i inwazję makrofagów, zahamowało progresję demielinizacji, zwiększyło remielinizację i poprawiło funkcje neurologiczne (patrz również Liu, M.T. i współpracownicy, (2001) J. Immunol. 167: ). Wykazano, że podawanie mysich anty-ip-10 przeciwciał zmniejszyło kliniczną i histologiczną zachorowalność i ciężkość w mysim EAE (Fife, BT i współpracownicy, (2001) J. Immunol. 166: ). [0134] W świetle powyższego, anty-ip-10 przeciwciała według wynalazku mogą być stosowane w leczeniu stwardnienia rozsianego i innych chorób demielinizacyjnych przez podawanie przeciwciała osobnikowi wymagającemu leczenia. Przeciwciało może być stosowane samodzielnie lub w skojarzeniu z innymi środkami anty-ms, takimi jak interferon beta-1a (np. Avonex, Rebif ), interferon beta-1b (np. Betaseron ), octan glatirameru (np. Copaxone ) i/lub mitoksantron (np. Novantrone). B. Reumatoidalne zapalenie stawów [0135] Wykazano, że IP-10 poziomy są znacznie podwyższone w mazi stawowej, błony maziowej tkanek i surowicy chorych z reumatoidalnym zapaleniem stawów (RZS) (Patel, D.D. i współpracownicy, (2001) Clin. Immunol. 98 :39-45; Hanaoka, R. i współpracownicy, (2003) Arthritis Res. And Therapy 5: R74-R81). Wykazano, że IP-10 receptor CXCR3 jest preferencyjnie wyrażany w komórkach tucznych tkanki maziowej u chorych na RZS (Ruschpler, P. i współpracownicy, (2003) Arthritis Res. Ther. 5:, R241-R252). W uzupełniającym modelu szczurzym indukowanego (AA) artretyzmu, zgłoszono wykrywalną odpowiedź autoprzeciwciała przeciwko samemu IP-10 (Salomon, I. i współpracownicy, (2002) J. Immunol. 169: ). Co więcej, podawanie szczepionki IP-10-kodującego DNA rozszerza wytwarzanie neutralizujących przeciwciał anty-ip-10 u szczurów, i te IP-10 autoprzeciwciała mogą adopcyjnie przenieść oporność wobec AA do naiwnych szczurów (Salomon, I. i współpracownicy, supra) [0136] W świetle powyższego, anty-ip-10 przeciwciała według wynalazku mogą być stosowane w leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów przez podawanie przeciwciał pacjentowi wymagającemu leczenia. Przeciwciało może być stosowane samodzielnie lub w skojarzeniu z innymi anty-ra środkami, takimi jak niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ), środki przeciwbólowe, kortykosteroidy (np.prednison, hydrokortyzon), TNF-inhibitory (w tym adilimumab (Humira ), etanercept (Enbrel ) i infliksymab (Remicade )), modyfikujące przebieg choroby leki przeciwreumatyczne (w tym metotreksat, cyklofosfamid, cyklosporyna, auranofin, azatioprine, tiomalat sodu i złota, hydroksychlorochiny siarczan, leflunomid, minocyklina, penicylamina i sulfasalazyna), leki stosowane w fibromialgii, leki stosowane w osteoporozie i leki stosowane w dnie. C. Choroba zapalna jelit

36 [0137] Wykazano, że ekspresja IP-10 była znacznie zwiększona w komórkach naciekających blaszki właściwej w bioptatach okrężnicy, pobranych od pacjentów z wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego (Uguccioni, M. i współpracownicy, (1999) Am. J. Pathol. 155: ). Ponadto wykazano, że neutralizacja IP-10 zabezpiecza myszy przed owrzodzeniami nabłonka w ostrym zapaleniu jelita grubego i zwiększa przeżywalność komórek kryptowych (Sasaki, S. i współpracownicy, (2002) Eur. J. Immunol. 32: ). Również w IL-10 -/-. myszy, które rozwijają chorobę jelita grubego podobne do choroby Crohna u ludzi, leczenie anty-ip- 10 przeciwciałami doprowadziło do poprawy w punktacji stanu zapalnego (Singh, U.P i współpracownicy, (2003) J. Immunol. 171: ). [0138] W świetle powyższego, anty-ip-10 przeciwciała według wynalazku mogą być stosowane w leczeniu chorób zapalnych jelita (IBD), włącznie z wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego i chorobą Leśniowskiego-Crohna, przez podawanie przeciwciał pacjentowi wymagającemu leczenia. Przeciwciało może być stosowane samodzielnie lub w skojarzeniu z innymi środkami anty-ibd, takimi jak leki zawierające mesalaminę ( włączając sulfasalazynę i inne środki zawierające kwas 5-aminosalicylowy (5-ASA), takie jak olsalazyna i balsalazyd) i niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ), leki przeciwbólowe, kortykosteroidy (np. predinison, hydrokortyzon), TNF inhibitory (w tym adilimumab (Humira ), etanercept (Enbrel ) i infliksymab (Remicade )) i środki immunosupresyjne (takie jak 6-merkaptopuryna, azatiopryna i cyklosporyna A) i antybiotyki. D. Toczeń rumieniowaty układowy [0139] Wykazano, że IP-10 poziomy w osoczu są znacznie podwyższone u pacjentów z toczniem rumieniowatym układowym (SLE) i wykazano, że poziomy te korelują z aktywnością choroby (patrz np: Narumi, S. i współpracownicy, (2000) Cytokine 12: 1561/65). Odpowiednio, w innym przykładzie wykonania, anty-ip-10 przeciwciała według wynalazku mogą być stosowane w leczeniu SLE przez podawanie przeciwciał pacjentowi wymagającemu leczenia. Przeciwciało może być stosowane samodzielnie lub w skojarzeniu z innymi anty-sle środkami, takimi jak niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ), środki przeciwbólowe, kortykosteroidy (np. prednison, hydrokortyzon), środki immunosupresyjne (takie jak cyklofosfamid, azatiopryna i metotreksat), leki przeciwmalaryczne (takie jak hydroksychlorochina) i leki biologiczne, które hamują wytwarzanie przeciwciał dsdna (np. LJP 394). E. Cukrzyca Typu I [0140] Wykazano, że IP-10 poziomy w osoczu są znacznie podwyższone u pacjentów z cukrzycą typu I, w szczególności tych ze świeżym wystąpieniem choroby, i wykazano korelację poziomów z ilością GAD-reaktywnych wytwarzających gamma-interferon limfocytów T u pacjentów pozytywnych ze względu na GAD autoprzeciwciała (Shimada, A. i współpracownicy, (2001) Diabetes Care 24: ). W innym badaniu stwierdzono, że IP-10 poziomy w surowicy są podwyższone u pacjentów z nowo rozpoznaną chorobą i u pacjentów z wysokim ryzykiem choroby i IP-10 stężenia korelowały z poziomami IFN-gamma (Nicoletti, F. i współpracownicy, (2002) Diabetologia 45: ). Co więcej, wykazano, że komórki beta wydzielają IP-10, co prowadzi do chemotaktyczności limfocytów T, i wykazano, że myszy z niedoborem CXCR3 wykazują spóźnione wystąpienie cukrzycy typu I (Frigerio, S. i współpracownicy, (2002) Nature Medicine 8: ).

37 [0141] Odpowiednio, w innym przykładzie wykonania, anty-ip-10 przeciwciała według wynalazku mogą być stosowane w leczeniu cukrzycy Typu I przez podawanie przeciwciał pacjentowi wymagającemu leczenia. Przeciwciało może być stosowane samodzielnie lub w skojarzeniu z innymi lekami przeciw cukrzycowymi, takimi jak insulina. F. Choroby zapalne skóry [0142] Wykazano, że ekspresja IP-10 jest związana z różnymi chorobami zapalnymi skóry. Na przykład, IP-10 wykryto w keratynocytach i nacieku skóry z aktywnych blaszek łuszczycowych (Gottlieb, AB i współpracownicy, (1988) J. Exp. Med. 168: ). Ponadto, CXCR3 jest wyrażane przez skórne limfocyty CD3+, sugerując, że CXCR3 jest zaangażowany w ruchu limfocytów T do skóry łuszczycowej (Rottman, J.B. i współpracownicy, (2001) Lab. Invest. 81: ). Odpowiednio, w innym przykładzie wykonania, anty-ip-10 przeciwciała według wynalazku mogą być stosowane w leczeniu łuszczycy przez podawanie przeciwciała pacjentowi wymagającemu leczenia. Przeciwciało może być stosowane samodzielnie lub w skojarzeniu z innymi środkami lub terapiami, takiemi jak leczenie miejscowe (np. sterydy, smoła węglowa, kalcipotrien, tazaroten, antralin, kwas salicylowy), fototerapia, leki układowe (np. metotreksat, doustne retinoidy, cyklosporyna, estry kwasu fumarowowego) i/lub leki biologiczne (np. alefacept, efalizumab). [0143] Wykazano, że liszaj płaski, przewlekła zapalna choroba skóry i błon śluzowych jamy ustnej jest związany z naciekiem CD4+ i CD8+ limfocytów T, które wyrażają CXCR3, i wykazano ponadto, że CD8+ naciekające cytolityczny limfocyty T mają IP-10 w swoich cytolitycznych granulkach i wykazano, że keratynocyty wykwitowe nadmiernie wyrażają IP-10 (Iijima, W. i współpracownicy, (2003) Am. J. Pathol. 163: ). Odpowiednio, w innym przykładzie wykonania, anty-ip-10 przeciwciała wynalazku mogą być stosowane w leczeniu liszaja płaskiego przez podawanie przeciwciała pacjentowi wymagającemu leczenia. Przeciwciało może być stosowane samodzielnie lub w skojarzeniu z innymi lekami lub terapiami, takimi jak środki przeciwzapalne, przeciw histaminowe, kortykosteroidy i terapia światłem. [0144] Wykazano, że ekspresja IP-10 jest zwiększona w innych stanach zapalnych skóry, takich jak toczeń rumieniowaty przewlekły i limfatyczne nacieki skóry Jessnera (Flier, J. i współpracownicy, (2001) J. Pathol. 194: ). Odpowiednio, anty-ip-10 przeciwciała według wynalazku mogą być stosowane w leczeniu tych chorób zapalnych skóry by podawanie przeciwciał pacjentowi wymagającemu leczenia. Przeciwciało może być stosowane samodzielnie lub w skojarzeniu z innymi środkami lub terapiami, jak opisano powyżej. G. Autoimmunologiczne choroby tarczycy [0145] Wykazano, że zarówno IP-10 jak i CXCR3 są wyrażane w tarczycy pacjentów z chorobą Gravesa (GD), ale nie są wyrażane (lub słabo wyrażane) w normalnej tkance gruczołu tarczowego, i ekspresja była najwyższa u pacjentów ze świeżym wystąpieniem choroby GD (Romagnani, P. i współpracownicy, (Am. J. Pathol. 161: ). Wykazano, że IP-10 również jest wyrażane w tkance tarczycy pacjentów z chorobą Hashimoto (Kemp, EH i współpracownicy, (2003) Clin. Endocrinol. 59 : ). Odpowiednio, w innym przykładzie wykonania, anty-ip-10 przeciwciała według wynalazku mogą być stosowane w leczeniu chorób autoimmunologicznych tarczycy, w tym choroby tarczycy Gravesa-Basedowa i Hashimoto, przez podawanie przeciwciała pacjentowi wymagającemu leczenia. Przeciwciało może być

38 stosowane samodzielnie lub w skojarzeniu z innymi lekami lub terapiami, takimi jak leki przeciw chorobom tarczycy, radioaktywny jod i częściowego usunięcia tarczycy. H. Zespół Sjögrena [0146] Wykazano, że ekspresja mrna IP-10 jest znacznie nasilona w gruczołach ślinowych pacjentów z zespołem z Sjögrena (SS), z najbardziej widoczną ekspresją w przewodowym nabłonku przyległym do limfoidalnych nacieków (patrz np. Ogawa, N. i współpracownicy, (2002) Arthritis Rheum. 46: ). Odpowiednio, w innym przykładzie wykonania, anty-ip-10 przeciwciała według wynalazku mogą być stosowane w leczeniu zespołu Sjögrena przez podawanie przeciwciała pacjentowi wymagającemu leczenia. Przeciwciało może być stosowane samodzielnie lub w skojarzeniu z innymi środkami anty-ss, takimi jak sztuczne środki nawilżające (np. pozbawione środków konserwujących sztuczne łzy, sztuczna ślina i bezzapachowe lotiony do skóry, solankowe spraye do nosa i środki nawilżające do pochwy), Lacriserts do leczenia suchego oka, chlorowodorek pilokarpiny (Salagen ) i ceyimelina (Eyoxac ) do leczenia suchości w ustach, niesteroidowych leków przeciwzapalnych (NL- PZ), steroidów i leków immunosupresyjnych. Zapalenie płuc [0147] Badano IP-10 ekspresję w mysim modelu astmy alergicznej, z wynikami wskazującymi, że IP-10 jest podwyższone w płucach po prowokacji alergenem i że nadekspresja IP-10 wiązała się ze zwiększoną nadpobudliwością dróg oddechowych, eozynofilią, zwiększonymi poziomami IL-4 i rekrutacją limfocytów CD8+ (Medoff, B.D. i współpracownicy, (2002) J. Immunol. 168: ). Ponadto wykazano, że u palaczy, u których rozwija się przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP) wyrażane jest IP-10 w ich nabłonku oskrzelików (Saetta, M. i współpracownicy, (2002) Am J. Respir. Crit. Care Med. 165: ). Ponadto, wysokie poziomy IP-10 wykazano w popłuczynach płynu oskrzelowego u pacjentów z sarkoidozą płuc i limfocytarnym zapaleniu pęcherzyków płucnych (Agostini, C. i współpracownicy, (1998) J. Immunol. 161: ). [0148] Odpowiednio, w innym przykładzie wykonania, anty-ip-10 przeciwciała według wynalazku mogą być stosowane w leczeniu choroby charakteryzującej się zapaleniem płuc, takich jak astma, POChP, sarkoidozy płuc lub zapalenie pęcherzyków płucnych limfatyczne, przez podawanie przeciwciała osobnikowi wymagającemu leczenia. Przeciwciało może być stosowane samodzielnie lub w skojarzeniu z innymi środkami zmierzającymi do zmniejszenia zapalenia płuc, takimi jak kromoglikan dwusodowy i nedokromil sodu, kortykosteroidy wziewne, układowe (np. doustne) kortykosteroidy, krótko działający antagoniści beta, krótko działające leki rozszerzające oskrzela, długo działające beta antagoniści lub agoniści (doustne lub wziewne), modyfikatory leukotrienów, teofilina i terapia tlenowa. J. Odrzucenia przeszczepu [0149] Wykazano, że IP-10 odgrywa rolę w odrzuceniu przeszczepionej tkanki. Na przykład, leczenie myszy z neutralizującymi przeciwciałami anty-ip-10 zwiększyło przetrwanie małych przeszczepów jelitowych i zmniejszyło akumulację limfocytów T gospodarza i komórek NK w blaszce właściwej (Zhang, Z. i współpracownicy, (2002) J. Immunol. 168 : ). Ponadto, u myszy otrzymującej alloprzeszczepy wysp trzustkowych, leczenie przeciwciałem

39 anty-1p-10 również spowodowało zwiększenie przeżywalności przeszczepu i zmniejszyło limfocytowy naciek przeszczepu (Baker, MS i współpracownicy, (2003) Surgery 134: ). Dodatkowo wykazano, że alloprzeszczepy serca, lecz nie normalne serca, wyrażają IP- 10 i CXCR3 i podwyższone poziomy IP-10 były związane z sercową waskulopatią alloprzeszczepu (Zhao, D.X. i współpracownicy, (2002) J. Immunol 169: ). Wykazano również, że CXCR3 i IP-10 są wyrażane przez komórki zapalne naciekające alloprzeszczepów płuc (Agostini, C. i współpracownicy, (2001) Am. J. Pathol. 158: ). Wykazano, że neutralizacja z CXCR3 lub IP-10 in vivo łagodzi zespół zarostowego zapalenie oskrzelików (BOS), główne ograniczenie dla przeżycia dla pacjentów po przeszczepieniu płuc, w mysim modelu przeszczepu płuc (Belperio, J. A. i współpracownicy, (2002) J. Immunol. 169: ). [0150] W świetle powyższego, wynalazek dostarcza także sposobu hamowania odrzucenia przeszczepu przez podawanie anty-ip-10 przeciwciała wynalazku biorcy potrzebującemu leczenia. Przykłady przeszczepów tkankowych, które można leczyć obejmują, ale bez ograniczania, wątrobę, płuca (np. leczenie BOS), nerki, serce, jelito cienkie i komórki wysp trzustkowych. Przeciwciało może być stosowane samodzielnie lub w skojarzeniu z innymi lekami w hamowaniu odrzucania przeszczepów, takimi jak leki immunosupresyjne (np. cyklosporyna, azatiopryna, metyloprednizolon, prednizolon, prednizon, mykofenolan mofetylu, sirilimus, rapamycyna, takrolimus), środków przeciwzakaźnych (np. acyklowir, klotrimazol, gancyklowir, nystatyna, trimetoprim sulfametoksyoksazol), leki moczopędne (np. bumetanid, furosemid, metolazon) i leki przeciwwrzodowe (np. cymetydyna, famotydyna, lanzoprazol, omeprazol, ranitydyna, sukralfat). K. Uszkodzenie rdzenia kręgowego [0151] Urazowe uszkodzenie rdzenia kręgowego prowadzi do naciekania komórek zapalnych. Wykazano, że IP-10 odgrywa centralną rolę we wtórnej degeneracji po urazie rdzenia kręgowego (Gonzalez i współpracownicy, (2003) Exp. Neurol. 184: ; patrz również PCT publikacja patentowa WO 03/06045). Wykazano, że IP-10 jest znacznie podwyższone w stłuczonych rdzeniach kręgowych szczurów 6 i 12 godzin po urazie (McTigue, D.M. i współpracownicy, (1998) J. Neurosci. Res. 53: ) i uszkodzonym rdzeniu kręgowym myszy 6 godzin po urazie (Gonzalez i współpracownicy, (2003) supra). Odpowiednio, wykazano, że hamowanie aktywności IP-10 po urazie rdzenia kręgowego jest użyteczne w zmniejszaniu nacieku komórek zapalnych, a tym samym zmniejszaniu wtórnego uszkodzenia tkanki przez stan zapalny. Hamowanie może również zmniejszyć naciek komórek zapalnych, zmniejszyć wtórne zwyrodnienie i polepszyć powracanie do zdrowia po urazie mózgu i udarze. Tak więc, wynalazek dotyczy również sposobu leczenia urazu rdzenia kręgowego i uszkodzenia mózgu (np. udaru) u pacjenta wymagającego leczenia, obejmujący podawanie pacjentowi anty-ip-10 przeciwciała według wynalazku. Przeciwciało może być stosowane samodzielnie lub w skojarzeniu z innymi środkami, takimi jak inne środki przeciwzapalne. L. Choroby neurodegeneracyjne [0152] Stwierdzono, że ekspresja IP-10 i CXCR3 w ośrodkowym układzie nerwowym nasila się w połączeniu ze zmianami patologicznymi związanymi z chorobą Alzheimera (AD) (Xia, M.Q. i Hyman, D.T. (1999) J. Neurovirol. 5 :32-41). Wykazano, że w obrębie mózgu AD,

40 CXCR3 jest wyrażany konstytutywnie na neuronach i procesach neuronalnych w różnych regionach korowych i podkorowych i wykazano, że IP-10 był wyrażony w astrocytach, i jego poziom był znacznie podwyższony w porównaniu z mózgami zdrowymi (Xia, M.Q. i współpracownicy, (2000) J. Neuroimmunol. 108: ). W związku z tym przeciwciała wynalazku mogą być stosowane w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera i choroba Parkinsona, przez podawanie pacjentowi wymagającemu leczenia anty- IP-10 przeciwciał samodzielnie lub w skojarzeniu z innymi terapeutycznymi środkami. Przykłady środków, z którymi anty-ip-10 przeciwciała mogą być łączone w leczeniu choroby Alzheimera obejmują inhibitory cholinesterazy (donepezil, rywastygmina, galantamina, takryna) i witamina E. Przykładem środka, z którym anty-ip-10 przeciwciało może być łączone do leczenia choroby Parkinsona jest lewodopa. M. Zapalenie dziąseł [0153] Brzeżne zapalenie ozębnej jest związane z procesem zapalnym tkanki dziąsłowej. Stwierdzono, że komórki wytwarzające IP-10 występują w ludzkiej tkance dziąseł dotkniętej stanem zapalnym, jak również komórki wyrażające receptor CXCR3 (Kabashima, H. i współpracownicy, (2002) Cytokine 20 :70-77). Odpowiednio, w innym przykładzie wykonania, anty-ip-10 przeciwciała według wynalazku mogą być stosowane w leczeniu zapalenia dziąseł przez podawanie przeciwciał pacjentowi wymagającemu leczenia. Przeciwciało może być stosowane samodzielnie lub w skojarzeniu z innymi środkami lub terapiami, takimi jak płyny do płukania ( przeciw zapaleniu dziąseł (np. antybiotykowe płyny do płukania ust), w skalingu przyzębia i polerowaniu powierzchni korzenia i chirurgii przyzębia. N. Zapalenie związane z terapią genową [0154] Adenowirusy z deficytem replikacji, stosowane jako wektory adenowirusowe stosowane w terapii genowej, mogą powodować ostre urazy i zapalenie w tkankach zainfekowanych przez wektory wirusowe. Wykazano, że takie wektory adenowirusowe indukują ekspresję IP-10 przez aktywację zależną od kapsydu NFκB (Borgland, S.L. i współpracownicy, (2000) J. Virol. 74: ). Odpowiednio, anty-ip-10 przeciwciała według wynalazku mogą być stosowane do hamowania urazu wywołanego przez IP-10 i/lub zapalenia podczas terapii genowej, która wykorzystuje wektor wirusowy, taki jak adenowirus, który stymuluje niepożądane wytwarzanie IP- 10. O. Choroby angiogenezy [0155] Wykazano, że IP-10 hamuje angiogenezę in vitro i in vivo (Strieter i współpracownicy, (1995) Biochem Biophys Res Commun 210:51-57; Angiolillo i współpracownicy, (1995) J. Exp Med 182: ; Luster i współpracownicy, (1995) J. Exp Med 182: ). Angiogeneza odgrywa kluczową rolę w wielu procesach chorobowych, takich jak odpowiedź uzdrawiająca na uraz. Na przykład, układ krwionośny w uszkodzonym rdzeniu kręgowym pozostaje w stanie aktywnej przebudowy, aż do co najmniej 28 dni po uszkodzeniu (Popovich i współpracownicy, (1997) J. Comp. Neurol. 377: ). [0156] Uważa się, że IP-10 wywiera działanie angiostatyczne poprzez hamowanie wzrostu komórek śródbłonka i chemotaksji. Dokonuje tego poprzez motyw wiążący heparynę, jak również poprzez receptoro-zależny mechanizm. Poprzez swój motyw wiążący heparynę za-

41 pobiega wiązaniu czynników angiogennych FGF-2 i VEFG165 do ich receptorów. Również wywiera działanie przez receptoro-zależny proces. Receptor dla IP-10, CXCR3 jest alternatywnie uformowany do wytworzenia dwóch znanych odmian CXCR3A i CXCR3B. Wiązanie IP-10 z receptorem CXCR3A prowadzi do proliferacji i chemotaksji komórki docelowej, natomiast wiązanie IP-10 z receptorem CXCR3B ma odwrotny skutek zahamowania wzrostu i chemotaksji. To dzięki receptorowi CXCR3B, IP-10 działa jako czynnik angiostatyczny (Lasagni i współpracownicy, (2003) J. Exp. Med. 197: ). [0157] W świetle powyższego, anty-ip-10 przeciwciała według wynalazku mogą być stosowane w leczeniu chorób wymagających angiogenezy, np. gdy angiostatyczne zachowanie IP- 10 opóźnia lub uniemożliwia gojenie i zaostrza proces chorobowy. Takie choroby obejmują: 1) anomalię fizjologicznej neowaskularyzacji, która może mieć wpływ na gojenie ran, cykl kobiety, ciążę, przerost wywołany ćwiczeniami i podobne; 2) wskazania, które mogą wymagać stymulacji neowaskularyzacji, w tym indukcja tworzenia się naczyń zabezpieczających (obejmujące niedokrwienny zawał serca, niedokrwienie obwodowe, niedokrwienie mózgu), choroba wieńcowa, choroba naczyń obwodowych, udar mózgu, gojenie ran, wszczepienie po przeszczepieniu narządów, takich jak przeszczep wysepek trzustkowych, złamanie i naprawa ścięgna, rekonstrukcyjne operacje chirurgiczne, inżynieria tkankowa, restenoza, wypadanie włosów, odleżyny i wrzody stazy, wrzody przewodu pokarmowego, niewydolność łożyska, martwica aseptyczna, płucne i układowe nadciśnienie, otępienie naczyniopochodne, choroba Alzheimera, mózgowa autosomalna dominująca arteriopatia z podkorowymi zawałami i leukoencefalopatią (CADASIL); psuedocysty tarczycy i obrzęk limfatyczny i 3) wskazania, które mogą wymagać przebudowy naczyniowej, obejmujące malformacje naczyniowe, łuszczyca, i stan przedrzucawkowy. Przeciwciała według wynalazku mogą być stosowane samodzielnie lub w skojarzeniu z innymi środkami indukującymi angiogenezę. P. Choroby zapalne nerek [0158] Odnotowano, że receptor CXCR3 jest wyrażany przez komórki mezangium pacjentów z nefropatią IgA, membrano-proliferacyjnym zapaleniem kłębuszków nerkowych lub szybko postępującym kłębuszkowym zapaleniu nerek (Romagnani, P. i współpracownicy, (1999) J. Am. Soc. Nephrol. 10: ). Ponadto, w mysim modelu nefrotoksycznego zapalenia nerek, poziomy mrna IP-10 były podwyższone sześciokrotnie w korze nerkowej nerek 7 dni po indukcji zapalenia nerek (Schadde, E. i współpracownicy, (2000) Nephrol. Dial. Transplant. 15 : ). Jeszcze dalej, wysoki poziom ekspresji IP-10 zaobserwowano w bioptatach nerek z pacjentów ludzi z kłębuszkowym zapaleniem nerek w porównaniu do zdrowych nerek (Romagnani, P. i współpracownicy, (2002) J. Am. Soc. Nephrol. 13 :53-64 ). W związku z tym anty-ip-10 przeciwciała według wynalazku mogą być stosowane w leczeniu chorób zapalnych nerek, w tym nefropatii IgA, memrano-proliferacyjnego kłębuszkowego zapalenia nerek i szybko postępującego kłębuszkowego zapalenia nerek. Przeciwciała według wynalazku mogą być stosowane samodzielnie lub w skojarzeniu z innymi lekami lub terapiami stosowanymi w leczeniu kłębuszkowego zapalenia nerek, takich jak antybiotyki, leki moczopędne, leki obniżające wysokie ciśnienie krwi i dializa. Q. Miażdżyca

42 [0159] Wykazano, że IP-10 jest mitogennym i chemotaktycznym czynnikiem dla naczyń krwionośnych mięśni gładkich, które są ważnymi cechami komórek mięśni gładkich ze względu na ich wkład w patogenezę miażdżycy (Wang, X. i współpracownicy, ( 1996) J. Biol. Chem. 271: ). Wykazano również, że IP-10 jest indukowany w komórkach mięśni gładkich po leczeniu z LPS lub gamma interferonem, i również był indukowany w tętnicy szyjnej szczura po angioplastyce balonikowej (Wang, X. i współpracownicy, (1996) supra). Ponadto wykazano, że IP-10 jest wyrażany w powiązanych z kaszakiem komórkach śródbłonka, gładkich komórkach mięśni i makrofagów, co wskazuje na rolę IP-10 w rekrutacji i retencji aktywowanych limfocytów T, które zaobserwowano w zmianach ściany naczyniowej w miażdżycy (Mach, F:. i współpracownicy, (1999) J. Clin Invest 104: ). Odpowiednio, anty-ip-10 przeciwciała według wynalazku mogą być stosowane w leczeniu lub zapobieganiu miażdżycy. Przeciwciała mogą być stosowane samodzielnie lub w skojarzeniu z innymi lekami lub terapiami stosowanymi w leczeniu miażdżycy, jak leki obniżające wysokie ciśnienie krwi i obniżające poziom cholesterolu. R. Zakażenia wirusowe [0160] W różnych infekcjach wirusowych IP-10 może wzrastać i może odgrywać korzystną rolę w rekrutacji aktywowanych limfocytów T, aby zwalczyć infekcję wirusową. W niektórych przypadkach jednak, wytwarzanie IP-10 w trakcie infekcji wirusowej może prowadzić do szkodliwych działań, a tym samym aktywność IP-10 może być niepożądana i może być pożądane hamowania aktywności IP-10 w takich wirusowych infekcjach, dzięki użyciu anty- IP-10 przeciwciała według wynalazku. [0161] Na przykład, wykazano, że IP-10 stymuluje replikację ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) w makrofagach pochodzących z monocytów i limfocytach krwi obwodowej (Lane, B.R. i współpracownicy, (2003) Virology 307: ). Ponadto poziom IP-10 jest podwyższony w płynie mózgowo-rdzeniowym i mózgu u pacjentów zakażonych HIV i w ośrodkowym układzie nerwowym HIV gp120-transgenicznych myszy (Asensio, V.C. i współpracownicy, (2001) J. Virol. 75: ). [0162] Wykazano również, że poziomy IP-10 są podwyższone u pacjentów z przewlekłym wirusowym zapaleniem wątroby typu C (HCV) i u pacjentów z przewlekłym aktywnym zapaleniem wątroby (Narumi, S. i współpracownicy, (1997) J. Immunol 158: ). W wątrobach osobników zakażonych HCV, wykazano, że IP-10 jest wyrażany przez hepatocyty, ale nie przez inne typy komórek w obrębie wątroby i znacznie wyższą proporcję z CXCR3 pozytywnych limfocytów T stwierdzono w wątrobie w porównaniu do krwi (Harvey, C.E. i współpracownicy, (2003) J. Leukoc. Biol. 74: ). [0163] Wykazano, że zwiększone wydzielanie IP-10 jest związane z odpowiedzią zapalną na ostrą oczną infekcję spowodowaną opryszczkowym wirusem typu I (HSV-1) u myszy, i wykazano, że leczenie myszy zakażonych HSV-1 z anty-ip-10 przeciwciałami zmniejszyło naciek komórek jednojądrzastych do rogówki, zmniejszyło patologię rogówki i zahamowało progresję wirusa z rogówki do siatkówki podczas ostrej infekcji (Carr, D.J. i współpracownicy, (2003) J. Virol 77: ). [0164] Wykazano również, że IP-10 jest wyrażane w wirusowym zapaleniu opon mózgowych. Wykazano, że IP-10 występuje w płynie mózgowo-rdzeniowym pacjentów z wiruso-

43 wym zapaleniem opon mózgowych i jest odpowiedzialny za chemotaktyczną aktywność neutrofili, komórek jednojądrzastych krwi obwodowej i aktywowanych limfocytów T (Lahrtz, F. i współpracownicy, (1997) Eur. J. Immunol. 27: ;. Lahrtz, F. i współpracownicy, (1998) J. Neuroimmunol 85:33-43). [0165] W świetle powyższego, anty-ip-10 przeciwciała według wynalazku mogą być stosowane w leczeniu infekcji wirusowych obejmujących niepożądaną aktywność IP-10 poprzez podawanie przeciwciał pacjentowi wymagającemu leczenia. Nieograniczające przykłady infekcji wirusowych, które można leczyć obejmują HIV (np., zapalenie mózgu wywołane HIV), HCV, HSV-1, wirusowe zapalenie opon mózgowych i ciężki ostry zespół oddechowy (SARS). Przeciwciało może być stosowane samodzielnie lub w skojarzeniu z innymi środkami przeciwwirusowymi, takimi jak stosowane w zakażeniu HIV, nukleozydowe/nukleotydowe inhibitory odwrotnej transkryptazy, nie nukleozydowe inhibitory odwrotnej transkryptazy i/lub inhibitory proteazy (i ich kombinacje), jak stosowane w zakażeniu HCV, interferon alfa 2a, pegylowany interferon 2a alfa i/lub rybawiryna, i jak stosowane w zakażeniu HSV-1, acyklowir, walacyklowir i/lub famcyklowir. S. Zakażenia bakteryjne. [0166] Zakażenia bakteryjne indukują wytwarzanie IP-10 w dotkniętych komórkach (patrz Gasper, N.A. i współpracownicy, (2002) Infect Immun. 70: ( ) Bakteryjne zapalenie opon mózgowych jest również szczególnie znane jako wywołujące wyrażanie IP-10 (Lapinet, J.A. i współpracownicy, (2000) Infect Immun. 68: ). IP-10 jest również wytwarzane przez jądrowe komórki somatyczne kanalików nasiennych, w modelu bakteryjnego zakażenia, silnie wskazując na prawdopodobną rolę tych chemokin w akumulacji neutrofili i limfocytów T podczas zapalenia jader, które jest klasycznie obserwowane w patogenezie zakażeń bakteryjnych (Aubry, F. i współpracownicy, (2000) Eur Cytokine Net 11:690-8). [0167] W świetle powyższego, anty-ip-10 przeciwciała według wynalazku mogą być stosowane w leczeniu zakażeń bakteryjnych obejmujących niepożądaną aktywność IP-10 przez podawanie przeciwciała pacjentowi wymagającemu leczenia. Przykłady zakażeń bakteryjnych to, ale bez ograniczania, bakteryjne zapalenie opon mózgowych i bakteryjne zapalenie płuc. Przeciwciało może być stosowane samodzielnie lub w skojarzeniu z innymi środkami przeciwbakteryjnymi, takimi jak antybiotyki. [0168] Wynalazek jest dalej zilustrowany przez następujące przykłady, które nie powinny być interpretowane jako dalsze ograniczenie. Przykład 1: Generowanie ludzkich przeciwciał monoklonalnych przeciwko IP-10 Antygen [0169] Oczyszczony rekombinowany ludzki IP-10 pochodzący z E.coli (PeproTech, Inc, numer kat: ), lub oczyszczone rekombinowane ludzkie IP-10 sprzężone z hemocyjaniną ang. hemocyanin keyhole limpet (KLH), użyto jako antygen. Transgeniczne Myszy HuMab i KM [0170] W pełni ludzkie przeciwciała monoklonalne do IP-10 wytworzono stosując szczepy HCo7, HCo12 i HCo17 transgenicznych myszy HuMab i szczep KM transgenicznych myszy

44 transchromosomowych, z których każdy wyraża ludzkie geny przeciwciał. W każdy z tych szczepów myszy, endogenny mysi gen kappa łańcucha lekkiego został homozygotycznie zakłócony, jak opisano w Chen i współpracownicy, (1993) EMBO J. 12: i endogenny mysi gen ciężkiego łańcucha został homozygotycznie zakłócony jak opisano w przykładzie 1 publikacji PCT WO 01/ Każdy z tych szczepów myszy niesie ludzki transgen kappa lekkiego łańcucha KCo5, jak opisano w Fishwild i współpracownicy, (1996) Nature Biotechnology 14: HCo7 szczep niesie transgen HCo7 ludzkiego łańcucha ciężkiego jak opisano w patencie USA o numerach 5,545,806, 5,625,825; i Szczep HCo12 niesie transgen HCo12 ludzkiego łańcucha ciężkiego w sposób opisany w przykładzie 2 PCT Publication WO 01/ HCo17 szczep niesie transgen HCo17 ludzkiego łańcucha ciężkiego w sposób opisany w przykładzie 8 poniżej. Szczep KM zawiera SC20 transchromosom jak opisano w publikacji PCT WO 02/ Immunizacje HuMab i KM: [0171] W celu wygenerowania w pełni ludzkich przeciwciał monoklonalnych do IP-10, Hu- Mab myszy i KM myszy immunizowano z oczyszczonym rekombinowanym IP-10 pochodzącym z E. coli lub TP10-KT.H_ koniugatem jako antygenem. Ogólne schematy immunizacji dlahumab myszy opisano w Lonberg, N. i współpracownicy, (1994) Nature 368 (6474): ; Fishwild, D. i współpracownicy, (1996) Nature Biotechnology 14: i publikacja PCT WO 98/ Myszy miały 6-16 tygodni po pierwszej infuzji antygenu. Oczyszczony rekombinowany preparat (5-50 µg) z IP-10 antygenem (np. oczyszczony z transfekowanych komórek E. coli wyrażających IP-10) został wykorzystany do immunizowania HuMab myszy i KM myszy dootrzewnowo, podskórnie (Sc) lub za pośrednictwem iniekcji w poduszkę łapy. [0172] Myszy transgeniczne immunizowano dwukrotnie z antygenem w kompletnym adiuwancie Freunda lub adiuwancie Ribi albo dootrzewnowo (IP), podskórnie (Sc) lub za pośrednictwem iniekcji w poduszkę łapy (FP), następnie przez 3-21 dni, immunizacja IP, Sc lub FP (do 11 immunizacji łącznie) z antygenem w niekompletnym adiuwancie Freunda lub adiuwancie Ribi. Odpowiedź immunologiczna była monitorowana za pomocą metody krwawienia pozagałkowego (ang. retro-orbital bleeding). Osocze badano przesiewowo za pomocą testu ELISA (jak opisano poniżej), i myszy z wystarczającym mianem anty-ip-10 ludzkiej immunogolobuliny były wykorzystywane do fuzji. Myszy wzmocniono dożylnie z antygenem 3 i 2 dni przed uśmierceniem i usunięciem śledziony. Zazwyczaj przeprowadzono fuzji dla każdego antygenu. Kilka tuzinów myszy immunizowano dla każdego antygenu. Łącznie 82 myszy ze szczepów myszy HCo7, HCo12, HCo17 i KM immunizowano z IP-10. Wybór HuMab lub KM myszy wytwarzających anty-ip-10 przeciwciała: [0173] W celu wyselekcjonowania HuMab lub KM myszy wytwarzających przeciwciała, które wiążą IP-10, surowice od immunizowanych myszy zbadano za pomocą testu ELISA, jak opisane przez Fishwild, D. i współpracownicy, (1996). Krótko, płytki mikrotitracyjne pokryto oczyszczonym rekombinowanym IP-10 z E. coli w stężeniu 1-2 µg/ml w PBS, 50 µl/studzienkę inkubowano w 4 C przez noc, następnie zablokowano z 200 µl/studzienkę 5% osocza kurzego w PBS/Tween (0,05%). Rozcieńczenia osocza z IP-10-immunizowanych myszy dodano do każdej studzienki i inkubowano przez 1-2 godziny w temperaturze otoczenia. Płytki przemywano PBS/Tween, a następnie inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze

45 pokojowej z poliklonalnym kozim przeciwciałem przeciw-ludzkiej IgG Fc sprzęganym z peroksydazą chrzanową (HRP). Po przemyciu, płytki rozwinięto z substratem ABTS (Sigma, A- 1888, 0,22 mg/ml) i analizowano za pomocą spektrofotometru przy OD Myszy, których surowica wykazywała najwyższe miana przeciwciał anty-ip-10 były wykorzystywane do fuzji. Fuzje przeprowadzono w sposób opisany poniżej, a supernatanty hybrydom zostały przetestowane pod względem anty-ip-10 aktywności w teście ELISA. Generowanie hybrydom wytwarzających ludzkie przeciwciała monoklonalne do IP-10: [0174] Splenocyty myszy, izolowane z HuMab myszy i KM myszy, poddano fuzji z PEG do linii komórkowej mysiego szpiczaka w oparciu o standardowe protokoły. Otrzymane hybrydomy następnie przesiewano pod kątem wytwarzania przeciwciał specyficznych wobec antygenu. Zawiesiny pojedynczych komórek limfocytów śledziony z immunizowanych myszy, poddano fuzji z jedną czwartą liczby Sp2/0 nie wyrażających mysich komórek szpiczaka (ATCC, CRL 1581) z 50% PEG (Sigma). Komórki wysiewano w przybliżeniu 1x10 5 /studzienkę na płytce mikrotitracyjnej o płaskim dnie, a następnie około dwóch tygodni inkubowano w podłożu selekcyjnym zawierającym 10% płodową surowicę bydlęcą, 10% P388D1 (ATCC, CRL TIB-63) kondycjonowanej pożywki, 3-5% origen (IGEN) w DMEM (Mediatech, CRL 10013, o wysokiej zawartości glukozy, L-glutaminą i pirogronianem sodu) plus 5 mm HEPES, 0,055 mm 2 merkaptoetanolu, 50 mg/ml gentamycyny i 1x HAT (Sigma, CRL P-7185). Po 1-2 tygodniach, komórki hodowano w pożywce, w której HAT zastąpiono przez HT. Indywidualne studzienki następnie sprawdzano przesiewowo za pomocą testu ELISA (opisane powyżej) pod kątem ludzkiego anty-ip-10 przeciwciał monoklonalnych przeciwciał IgG. Po wystąpieniu rozległego wzrostu hybrydomy, pożywkę monitorowano zwykle po dniach. Przeciwciało wydzielające hybrydomy wysiano ponownie, zbadano przesiewano ponownie, a jeśli nadal pozytywne dla ludzkiego IgG, anty-ip-10 przeciwciała monoklonalne subklonowano co najmniej dwukrotnie ograniczając rozcieńczenie. Stabilne subklony następnie hodowano in vitro do wygenerowania niewielkich ilości przeciwciał w pożywce tkankowej do dalszej charakterystyki. [0175] Klony hybrydomy 1D4, 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12 i 13C4 wybrano do dalszej analizy. Przykład 2: Charakterystyka strukturalna ludzkich przeciwciał monoklonalnych przeciwko IP-10 [0176] Sekwencje cdna kodujące regiony zmienne łańcucha ciężkiego i lekkiego 1D4, 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 6B10, 7C10, 8F6, 10A12 i 13C4 przeciwciał monoklonalnych uzyskano z odpowiednich hybrydom stosując standardowe techniki PCR i sekwencjonowano przy użyciu standardowych technik sekwencjonowania DNA. W przypadkach, gdy sekwencjonowanie DNA samego nie było wystarczające do jednoznacznego określenia struktury przeciwciała, przeprowadzono również analizę białek (np. analiza N-terminalnych aminokwasów i spektroskopia masowa) i wyniki porównano z analizą sekwencji DNA, aby tym samym ustalić poprawną strukturę przeciwciał. Wyniki analizy strukturalnej są następujące: Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha ciężkiego 1D4 przedstawiono na Figurze 1A i w SEQ ID NOs: 99 i 35, odpowiednio. Sekwencje nukleoty-

46 dowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha lekkiego 1D4 przedstawiono na Figurze 1B i w SEQ ID NOs: 110 i 84, odpowiednio. [0177] Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha ciężkiego 1E1 przedstawiono na Figurze 2A i w SEQ ID NOs: 100 i 36, odpowiednio. Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha lekkiego 1E1 przedstawiono na Figurze2B i SEQ ID NOs: 111 i 85, odpowiednio. [0178] Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha ciężkiego 2G1 przedstawiono na Figurze 3A i w SEQ ID NOs: 101 i 37, odpowiednio. Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha lekkiego 2G1 przedstawiono na Figurze 3B i w SEQ ID NOs: 112 i 86, odpowiednio. [0179] Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha ciężkiego 3C4 przedstawiono na Figurze 4A i w SEQ ID NOs: 102 i 38, odpowiednio. Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha lekkiego 3C4 przedstawiono na Figurze 4B i w SEQ ID NOs: 113 i 87, odpowiednio. [0180] Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha ciężkiego 6A5 przedstawiono na Figurze 5A i w SEQ ID NOs: 103 i 39, odpowiednio. Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha lekkiego 6A5 przedstawiono na Figurze 5B i w SEQ ID NOs: 114 i 88, odpowiednio. [0181] Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha ciężkiego 6A8 przedstawiono na Figurze 6A i w SEQ ID NOs: 104 i 40, odpowiednio. Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha lekkiego 6A8 przedstawiono na Figurze 6B i w SEQ ID NOs: 115 i 89, odpowiednio. [0182] Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha ciężkiego 6B10 przedstawiono na Figurze 7A i w SEQ m NOs: 105 i 41, odpowiednio. Sekwencje nukleotydowego i aminokwasowego regionu zmiennego łańcucha lekkiego 6B 10 przedstawiono na Figurze 7B i w SEQ ID NOs: 116 i 90, odpowiednio. [0183] Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha ciężkiego 7C10 przedstawiono na Figurze 8A i w SEQ ID NOs: 106 i 42, odpowiednio. Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha lekkiego 7C10 przedstawiono na Figurze 8B i w SEQ ID NOs: 117 i 91, odpowiednio. [0184] Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha ciężkiego 8F6 przedstawiono na Figurze 9A i w SEQ ID NOs: 107 i 43, odpowiednio. Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha lekkiego 8F6 przedstawiono na Figurze 9B i w SEQ ID NOs: 118 i 92, odpowiednio. [0185] Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha ciężkiego 10A12 przedstawiono na Figurze 10A i w SEQ ID NOs: 108 i 44, odpowiednio. Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha lekkiego 10A12 przedstawiono na Figurze l0b i w SEQ ID NOs: 119 i 93, odpowiednio. [0186] Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha ciężkiego 13C4 przedstawiono na Figurze 11A i w SEQ ID NOs: 109 i 46, odpowiednio. Sekwencje

47 nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha lekkiego 13C4 przedstawiono na Figurze 11B i w SEQ ID NOs: 120 i 94, odpowiednio. [0187] Porównanie 1D4, 1E1, 2G1, 6A5, 6A8, 7C10 i 10A12 sekwencji ciężkiego łańcucha immunoglobuliny do znanych sekwencji ciężkiego łańcucha ludzkiej immunoglobuliny linii germinalnych wykazało, że te ciężkie łańcuchy przeciwciała wykorzystują segment V H z ludzkiej linii germinalnej V H Nakładanie (wyrównywanie) 1D4, 1E1, 2G1, 6A5, 6A8, 7C10 i 10A12 sekwencji VH do VH germinalnej 3-33 sekwencji (SEQ ID NO: 47) przedstawiono na Figurze 12. Dalsza analiza sekwencji 1D4, 1E1, 2G1, 6A5, 6A8, 7C10 i 10A12 VH z wykorzystaniem systemu Kabata określania CDR regionu doprowadziła do wytyczenia regionów ciężkiego łańcucha CDR1, CDR2 i CD3, jak przedstawiono na Figurze1A, 2A, 3A, 5A, 6A, 8A i 10A, odpowiednio. [0188] Porównanie sekwencji 6B10 i 8F6 ciężkich łańcuchów immunoglobulin do znanych sekwencji ciężkiego łańcucha ludzkiej immunoglobuliny linii germinalnych wykazało, że te ciężkie łańcuchy przeciwciała wykorzystują segment V H z ludzkiej linii germinalnej V H Nakładanie (wyrównywanie) sekwencji 6B10 i 8F6 V H do germinalnej sekwencji V H 3-33 (SEQ ID NO: 48) przedstawiono na Figurze 13. Dalsza analiza sekwencji 6B10 i 8F6 VH z wykorzystaniem systemu Kabata określania CDR regionu doprowadziła do wytyczenia regionów ciężkiego łańcucha CDR1, CDR2 i CD3 regionach, jak przedstawiono na Figurach 7A i 9A, odpowiednio. [0189] Porównanie 3C4 sekwencji ciężkiego łańcucha immunoglobuliny do znanych sekwencji ciężkiego łańcucha ludzkiej immunoglobuliny linii germinalnych wykazało, że te ciężkie łańcuchy przeciwciała wykorzystują segment V H z ludzkiej linii germinalnej V H Nakładanie (wyrównywanie) sekwencji 3C4 V H do sekwencji linii germinalnej V H 5-51 (SEQ ID NO: 49) przedstawiono na Figurze 14. Dalsza analiza 3C4 VH sekwencji z wykorzystaniem systemu Kabata określania CDR regionu doprowadziła do wytyczenia regionów ciężkiego łańcucha CDR1, CDR2 i CD3 jak przedstawiono na Figurze 4A. [0190] Porównanie 13C4 sekwencji ciężkiego łańcucha immunoglobuliny do znanych sekwencji ciężkiego łańcucha ludzkiej immunoglobuliny linii germinalnych wykazało, że te ciężkie łańcuchy przeciwciała wykorzystują segment V H z ludzkiej linii germinalnej V H Nakładanie (wyrównywanie) sekwencji 13C4 V H do sekwencji linii germinalnej V H 4-61 sekwencji (SEQ ID NO: 50) przedstawiono na Figurze 15. Dalsza analiza 13C4 VH sekwencji z wykorzystaniem systemu Kabata określania CDR regionu doprowadziła do wytyczenia regionów ciężkiego łańcucha CDR1, CDR2 i CD3 jak przedstawiono na Figurze 11A. [0191] Porównanie 1D4, 2G1, 6A5, 6A8, 10A12 i 13C4 sekwencji lekkiego łańcucha immunoglobuliny do znanych sekwencji lekkiego łańcucha ludzkiej immunoglobuliny linii germinalnych wykazało, że te lekkie łańcuchy przeciwciała wykorzystują segment V L segment z ludzkiej linii germinalnej V k A27. Nakładanie (wyrównywanie) 1D4, 2G1, 6A5, 6A8, 10A12 i 13C4 V L sekwencji do linii germinalnej V K A27 sekwencji (SEQ ID NO: 95) przedstawiono na Figurze 16. Dalsza analiza 1D4, 2G1, 6A5, 6A8, 10A12 i 13C4 V L sekwencji z wykorzystaniem systemu Kabata określania CDR regionu doprowadziła do wytyczenia regionów lekkiego łańcucha CDR1, CDR2 i CD3 jak przedstawiono na Figurach 1B, 3B, 5B, 6B, 10B i 11B, odpowiednio.

48 [0192] Porównanie 1E1, 6B10 i 8F6 sekwencji lekkiego łańcucha immunoglobuliny do znanych sekwencji lekkiego łańcucha ludzkiej immunoglobuliny linii germinalnych wykazało, że te lekkie łańcuchy przeciwciała wykorzystują segment V L z ludzkiej linii germinalnej V k L6. Nakładanie (wyrównywanie) 1E1, 6B10 i 8F6 V L sekwencji do linii germinalnej V K L6 sekwencji (SEQ ID NO: 96) przedstawiono na Figurze 17. Dalsza analiza 1E1, 6B10 i 8F6 V L sekwencji z wykorzystaniem systemu Kabata określania CDR regionu doprowadziła do wytyczenia regionów lekkiego łańcucha CDR1, CDR2 i CD3 jak przedstawiono na Figurach 2B, 7B i 9B, odpowiednio. [0193] Porównanie 3C4 sekwencji lekkiego łańcucha immunoglobuliny do znanych sekwencji lekkiego łańcucha ludzkiej immunoglobuliny linii germinalnych wykazało, że 3C4 lekki łańcuch wykorzystuje V L segment z ludzkiej linii germinalnej V k L18. Nakładanie (wyrównywanie) 3C4 V L sekwencji do linii germinalnej V k L18 sekwencji (SEQ ID NO: 97) przedstawiono na Figurze 18. Dalsza analiza 3C4 V L sekwencji z wykorzystaniem systemu Kabata określania CDR regionu doprowadziła do wytyczenia regionów lekkiego łańcucha CDR1, CDR2 i CD3 jak przedstawiono na Figurze 4B. [0194] Porównanie 7C10 sekwencji lekkiego łańcucha immunoglobuliny do znanych sekwencji lekkiego łańcucha ludzkiej immunoglobuliny linii germinalnych wykazało, że 7C10 lekki łańcuch wykorzystuje V L segment z ludzkiej linii germinalnej V k L15. Nakładanie (wyrównywanie) 7C10 V L sekwencji do linii germinalnej V k L15 sekwencji (SEQ ID NO: 98) przedstawiono na Figurze 19. Dalsza analiza 7C10 V L sekwencji z wykorzystaniem systemu Kabata określania CDR regionu doprowadziła do wytyczenia regionów lekkiego łańcucha CDR1, CDR2 i CD3 jak przedstawiono na Figurze 8B. Przykład 3: Charakterystyka specyficzności wiązania i kinetyki wiązania Anty-IP-10 ludzkich przeciwciał monoklonalnych [0195] W tym przykładzie, badano powinowactwo wiązania, kinetyka wiązania i specyficzność wiązania przeciwciał anty-ip-10 stosując analizę Biacore. Również specyficzność wiązania i konkurencję krzyżową badano metodą ELISA. Analiza Biacore [0196] Anty-IP-10 przeciwciała scharakteryzowano pod kątem powinowactwa i kinetyki wiązania stosując analizę Biacore (Biacore AB, Uppsala, Szwecja). Wyrażone w E. coli, oczyszczone rekombinowane ludzkie IP-10 (R& D Systems) sprzęgano z CM5 sensor 97 RU stosując EDC/NHS protokół sprzęgania dostarczony przez Biacore AB. Wiązanie zmierzono przepuszczając przeciwciało w HBS EP buforze (dostarczone przez Biacore AB) w stężeniach od nm z szybkością przepływu 40 µl/min. Kinetykę asocjacji antygen-przeciwciało obserwowano przez 5 minut i kinetykę dysocjacji obserwowano przez 8 minut. Krzywe asocjacji i dysocjacji dopasowano do modelu wiązania 1:1 Langmuira, wykorzystując oprogramowania BIAevaluation (Biacore AB). Dane odnoszące się do pierwszych kilkudziesięciu sekund tylko dla faz asocjacji i dysocjacji brano pod uwagę do dopasowania krzywej, aby zminimalizować wpływ awidności. Eksperymenty prowadzono w temperaturze zarówno 25 C i 37 C. Wartości K D, k on i k off, które zostały oznaczone przedstawiono w tabeli 1 dla wiązania w temperaturze 25 C i w tabeli 2 dla wiązania w temperaturze 37 C:

49 Tabela 1: Charakterystyka wiązania w 25 C z ludzkim IP-10 Klon ID Powinowactwo K D x 10-9 (M) Szybkość łączenia K on x 10 4 (1/Ms) Szybkość oddzielania K off x 10-5 (1/s) 7C10 0,02 1,70 0,04 10A12 0,53 3,83 2,02 8F6 0,81 23,3 19,0 10A12S 0,88 3,68 3,24 6A5 1,20 3,11 3,64 6A5 partia 2* 0,96 3,20 3,10 1D4 1,20 8,40 10,20 6B10 1,78 9,50 17,2 2G1 1,90 3,78 0,75 * 6A5 partia 2 jest niezależną próbkę oczyszczonego przeciwciała z supernatantem 6A5 hybrydomy w porównaniu do próbki 6A5. Tabela 2: Charakterystyka wiązania w 37 C z ludzkim IP-10 Klon ID Powinowactwo K D x 10-9 (M) Szybkość łączenia K on x 10 4 (1/Ms) Szybkość oddzielania K off x10-5 (1/s) 7C10 0,016 5,27 0,08 10A12 0,34 11,1 3,81 8F6 0,78 34,7 27,0 10A12S 0,49 9,10 4,43 6A5 0,70 10,2 7,15 6A5 Partia 2 0,74 8,41 6,26 1D4 1,15 16,6 19,2 6B10 2,54 19,9 50,4 2G1 0,34 14,8 4,97 [0197] Czas półtrwania przeciwciał (w godzinach), określony jako czas potrzebny do dysocjacji połowy kompleksu przeciwciało antygen w fazie dysocjacji, zmierzono w 25 C i 37 C. Wartości zostały określone przez rozszerzenie krzywych dysocjacji, aby uzyskać czas niezbędny do 50% redukcji osi Y w sensogramie dysocjacji. Wyniki przedstawiono poniżej w tabeli 3: Tabela 3: Czas półtrwania przeciwciał w 25 C i 37 C Klon ID Czas półtrwania (w godz.) w 25 C Czas półtrwania (w godz.) w 37 C 2G1 25,67 3,87 10A12 9,53 5,05 10A12S 5,94 4,34 6A5 5,29 2,69 6A5 Partia 2 6,21 3,87 1D4 1,88 1,00 6B10 1,12 0,38

50 - 49-8F6 1,01 0,71 [0198] Reaktywność krzyżową przeciwciał, w 25 C, z IP-10 małpy rezus, ludzkim MIG, ludzkim ITAC i mysim IP-10 określono na podstawie analizy Biacore przy użyciu tych samych metod, jak opisano powyżej dla ludzkiego IP-10. Ludzkie MIG, ludzkie IP-10 i mysie IP-10 uzyskano na zasadach komercyjnych (PeproTech, Rocky Hill, New Jersey), natomiast IP-10 małpy rezus uzyskano metodą rekombinowanej ekspresji i oczyszczono za pomocą standardowych metod. Antygeny poddano sprzęganiu z CM5 sensor 140 RUs (IP-10 małpy rezus), 457 RU (ludzki MIG), 206 RUs (ludzki ITAC) i 150 RUs (mysie IP-10). Sensogramy asocjacji uzyskano przepuszczając przeciwciało w HBS EP buforze w stężeniu 133 nm przez 5 minut. Następnie zatrzymano przepływ i monitorowano dysocjację przez 5 minut. Krzywe asocjacji i dysocjacji dopasowano do modelu wiązania 1:1 Langmuira, wykorzystując oprogramowania BIAevaluation (Biacore AB). Wyniki eksperymentów reaktywności krzyżowej podsumowano w tabeli 4: Tabela 4: Reaktywność krzyżowa anty-ip-10 z różnymi ligandami CXCR3 Klon ID IP-10 Małpy rezus K DX 10-9 (M) Ludzkie MIG K D x 10-9 (M) Ludzkie ITAC K D x 10-9 (M) IP-10 Myszy K D x 10-9 (M) 7C10 4,4 105,0 Brak wiązania 464,0 10A12 0,71 161,0 Brak wiązania Brak wiązania 8F6 0,81 Brak wiązania Brak wiązania Brak wiązania 10A12S 1,21 722,0 Brak wiązania Brak wiązania 6A5 1,06 Brak wiązania Brak wiązania Brak wiązania 6A5 Partia 2 1,23 Brak wiązania Brak wiązania Brak wiązania 1D4 0,94 Brak wiązania Brak wiązania Brak wiązania 6B10 2,01 15,4 51,5 105,0 2G1 0,26 70,1 Brak wiązania Brak wiązania Analiza ELISA [0199] Dodatkowe eksperymenty przeprowadzono za pomocą testu ELISA do zbadania antygenowej reaktywności krzyżowej przeciwciał anty-ip-10 dla ludzkiego MIG, IP-10 małpy rezus lub IP-10 myszy. Procedury stosowane w teście ELISA opisano powyżej w przykładzie 1, z wyjątkiem tego, że płytki mikrotitracyjne pokryto z 1 μg/ml albo rekombinowanego ludzkiego IP-10, ludzkiego MIG (PeproTech, kat. # ), IP-10 myszy (PeproTech, kat. # ) lub rekombinowanego IP-10 małpy rezus. Wyniki wyrażono jako wartości EC 50 (w ng/ml) są przedstawione poniżej w tabeli 5: Tabela 5: Reaktywność krzyżowa anty-ip-10 za pomocą testu ELISA z różnymi ligandami CXCR3 Klon ID Ludzkie IP-10 IP-10 małpy Ludzkie MIG IP-10 myszy (EC 50 ng/ml) (EC 50 ng/ml) (EC 50 ng/ml) 10A Brak wiązania 10A12S 4,9 15,6 380 Brak wiązania 2G Brak wiązania

51 - 50-6A Brak wiązania Brak wiązania 6A5 Partia Brak wiązania Brak wiązania 6B Brak wiązania 8F Brak wiązania Brak wiązania 1D Brak wiązania Brak wiązania Badania konkurencji krzyżowej pomiędzy różnymi przeciwciałami anty-ip-10 również przeprowadzono za pomocą ELISA przy użyciu biotynylowanych postaci 6A5 i 2G1, celem ustalenia, czy przeciwciała rozpoznają różne epitopy na IP-10. Procedura testów konkurencji ELISA była podobna do testu ELISA, opisanego powyżej w przykładzie 1. Krótko, płytki mikrotitracyjne pokryto oczyszczonym rekombinowanym IP-10 z E. coli w stężeniu 0,2 μg/ml w PBS, 50 μl/studzienkę i inkubowano w 4 C przez noc. Studzienki następnie zablokowano z 200 μl/studzienkę 5% surowicy kurzej w PBS/Tween (0,05%). Rozcieńczenia oczyszczonych ludzkich anty-ludzkich IP-10 przeciwciał (z 2 μg/ml do 3,91 ng/ml) dodano do każdej studzienki i inkubowano przez 30 minut w temperaturze otoczenia. Płytki przemywano PBS/Tween, a następnie inkubowano z 0,1 μg/ml biotyna-6a5 lub biotyna-2g1 przez 30 minut. Płytki następnie przemywano trzykrotnie PBS/Tween. Po przemyciu dodano streptawidyną znakowaną fosfatazą (KPL, Kat #: ) w rozcieńczeniu 1:2000 w 5% surowicy kurzej i inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po przemywaniu, płytki rozwinięto z p-npp substratem (Moss, Inc, lot ) i analizowano stosując spektrofotometr przy OD 405. Zgodnie z oczekiwaniami, nieznakowane 2G1 mogły konkurować z biotyną-2g1 w wiązaniu z IP-10, a ponadto każde z nieznakowanych 6A5, 7C10, 10A12, 10A12S, 6B10, 8F6 i 1D4 było w stanie konkurować w wiązaniu biotyny-2g1 do ludzkiego IP-10. Podobnie, nieznakowane 6A5 może konkurować z biotyną-6a5 w wiązaniu IP-10. Wyniki te wskazują, że każde z tych przeciwciał ma specyficzność wiązania dla tego samego epitopu (lub grupy epitopu) ludzkiego IP-10. Przykład 4: Hamowanie wiązania IP-10 z CXCR3 [0200] W tym przykładzie, zbadano zdolność przeciwciał anty-ip-10 do hamowania wiązania ludzkiego IP-10 z jego receptorem, CXCR3, na komórkach wyrażających receptor. Najpierw przeprowadzono analizę Scatcharda dla 125 I-IP-10 wiązania do komórek transfekowanych do wyrażania CXCR3. Komórki hodowano w pożywce RPMI zawierającej 10% FCS i selekcję G418. Przed użyciem, komórki przemywano dwukrotnie Hank s Balanced Salt Solution (HBSS) w temperaturze 4 C i przystosowanym do 4 x 10 7 komórek/ml. Płytki z włókna szklanego (Millipore MultiScreen, Kat. # MAFBNOB50) zablokowano z 200 μl 0,1% polietylenoiminy jeden dzień przed eksperymentem. W dniu badania bufor blokujący aspirowano za pomocą kolektora Millipore. Płytki przemywano trzykrotnie z 200 μl buforu wiążącego (50 mm HEPES, ph 7,2, 1 mm CaCl 2, 5 mm MgCl 2, 0,5% BSA). Dwadzieścia pięć mikrolitrów buforu wiążącego dodano do każdej studzienki, następnie albo 25 μl 1000 krotnego nadmiaru nieznakowanego IP-10 lub bufora wiążącego. Dodano dwadzieścia pięć mikrolitrów 125 I-IP-10 (Amersham, Kat. # IM332-25μCi) przy wzrastających stężeniach, a następnie 25 μl komórek przy gęstości 1 x 10 6 komórek na studzienkę. Płytki inkubowano na wytrząsarce płytkowej przez 60 minut w temperaturze pokojowej i przemyto trzy razy z buforem do przemywania (10 mm HEPES, ph 7,2, 0,5 M NaCl, 0,5% BSA) przy objętości 200 μl na przemywanie. Płytki wysuszono, dodano 25 μl scyntylanta i płytki zliczono stosując licznik

52 Wallac Microbeta Counter. Dane analizowano przy użyciu oprogramowania Prism i obliczono K D. Oznaczono średnie K D 0,231 nm dla wiązania receptora. [0201] Następnie zbadano zdolność przeciwciał anty-ip-10 do hamowania wiązania 100 pm I-hIP-10 do komórek wyrażających CXCR3. Testy konkurencji prowadzono w sposób podobny do eksperymentu opisanego powyżej. Krótko, 25 μl buforu wiązania dodano do płytek filtrów z włókien szklanych, a następnie 25 μl wzrastających stężeń przeciwciał anty-ip-10. Dwadzieścia pięć mikrolitrów 125 I-IP-10 dodano do stężenia końcowego 0,100 nm. Wreszcie dodano 25 μl komórek o gęstości 1 x 10 6 komórek na studzienkę i płytki inkubowano na wytrząsarce do płytek przez 60 minut w temperaturze pokojowej, przemyto i zliczone jak opisano powyżej. Wartości EC 50 obliczono stosując oprogramowanie Prism. Wartości K i (w nm) ustalono na podstawie wzoru: Wyniki przedstawiono poniżej w tabeli 6: Tabela 6: Hamowanie wiązania IP-10 z CXCR3 Klon ID Ki (nm) 10A12 0,09 10A12S 0,06 2G1 0,09 8F6 0,16 1E1 0,29 6B10 0,30 7C10 0,41 6A5 0,67 6A5 Partia 2 0,35 1D4 0,86 Przykład 5: Hamowanie wywołanego przez IP-10 wypływu wapnia [0202] W tym przykładzie, zbadano zdolność przeciwciał anty-ip-10 do hamowania wywołanego przez IP-10 wypływu wapnia, przy użyciu albo komórek transfekowanych do wyrażania CXCR3 lub anty-cd3 aktywowanych ludzkich limfocytów krwi obwodowej (PBLs), które wyrażają CXCR3. W celu otrzymania PBLs, normalną ludzką krew oczyszczono stosując standardową separację Ficoll. Oczyszczone ludzkie PBLs stymulowano poprzez dodanie komórek do płytek pokrytych 3μg/ml przeciwciała anty-cd3 i hodowanego w RPMI z 10% FBS. Po trzech dniach inkubacji, komórki były utrzymywane w pożywce wzrostowej, zawierającej 500 U/ml IL-2. W dniu badania, komórki przemyto i ponownie zawieszono w pożywce przy gęstości 2,5 x 10 7 komórek/ml. Komórki transfekowane do wyrażania CXCR3 hodowano w RPMI zawierającym 10% FBS. Komórki zawieszano w pożywce wzrostowej dla 2 x 10 6 komórek/ml. [0203] Celem wykonania testu, 100 μl zawiesiny komórek wysiano na płytki 96- studzienkowe o czarnych bokach i przezroczystym dnie, które byłz pokryte poli-d-lizyną (Corning/Costar, kat. # 3667). Dodano do każdej studzienki 100 mikrolitrów Calcium 3 kit

53 loading dye (FlexStation, Molecular Devices, Inc., Sunnyvale, CA), płytki wirowano przy 1100 RPM przez 4 minuty i inkubowano w temperaturze 37 C przez 30 minut. Zastosowano 96-studzienkową płytkę, ludzkie IP-10 (Peprotech, kat. # ) rozcieńczono w Hank s Balanced Salt Solution z 20 mm HEPES i 1% FBS (800 pm do komórek i 1200 PM dla ludzkiego PBLs). Przeciwciała były seryjnie rozcieńczone w płytkach odczynnikowych zawierających IP-10. Kontrolne studzienki zawierające tylko bufor lub tylko IP-10 tylko zostały uwzględnione. Dwadzieścia dwa mikrolitry roztworu IP-10/przeciwciało dodano na studzienkę do płytek zawierających komórki znaczone barwnikiem i strumień wapnia określono przez monitorowanie Calcium 3 fluorescenccji za pomocą aparatu FlexStation, zgodnie z zaleceniami producenta, w okresie czasu 200 sekund. Pole powierzchni pod krzywą (AUC) obliczono poprzez integrację wypływu wapnia pomiędzy sekund zgodnie ze standardowymi protokołami (patrz np., Smart D. i współpracownicy, (1999) Br. J. Pharmacol. 128:1-3). Dane były analizowane przy użyciu oprogramowania Prism (Molecular Devices, Inc.) i ustalono wartości IC 50 (w nm). Wyniki przedstawiono poniżej w tabeli 7: Tabela 7: Hamowanie wywołanego przez IP-10 wypływu wapnia Klon ID IC 50 (nm) dla HPBL IC 50 (nm) dla komórek A12 1,25 0,18 10A12S 2,31 0,08 2G1 2,98 0,50 8F6 6,27 0,30 1E1 3,64 NT 6B10 4,40 0,50 7C10 8,15 0,77 6A5 2,85 0,61 6A5 Partia 2 2,18 0,42 1D4 4,07 0,34 Przykład 6: Hamowanie wywołanej przez IP-10 migracji komórkowej [0204] Zdolność przeciwciał anty-ip-10 do hamowania migracji komórkowej wywołanej przez IP-10 zbadano w teście in vitro chemotaksji. W tych eksperymentach wykorzystano komórki wyrażające CXCR3 i stymulowano albo: (i) 100 ng/ml ludzkiego rekombinowanego IP-10 (rhip-10), (ii) supernatantu z komórek THP-1 stymulowanych z IFN gamma (co wywołuje wydzielanie natywnego IP-10 i MIG), w którym IP-10 pochodzący z komórek THP-1 był w stężeniu 16 ng/ml i aktywność MIG zablokowano przez dodanie anty-mig (R & D Systems) w 2,5 µg/ml lub (iii) 100 ng/ml rekombinowanego IP-10 makaka rezusa (rrmip- 10). Zahamowanie migracji komórkowej oceniano stosując różne stężenia przeciwciał i oznaczono indeks chemotaktyczny. [0205] W szczególności, hamowanie chemotaksji oceniano za pomocą standardowego testu na płytkach 96-studzienkowych (Multiscreen MIC płytki (Millipore)). Filtr 5 µm użyto do transfekowanych linii komórkowych, i filtr 3 µm użyto do komórek pierwotnych. Odpowiadające komórki ( CXCR3+; MBP-specyficzne ludzkie komórki PBMC) zawieszano ponownie w buforze do chemotaksji (RPMI + 1% BSA lub FBS) przy 1x10 6 komórek/ml.

54 Dodano 100 µl zawiesiny komórek do górnej studzienki i pozostawiono do inkubacji przez 30 minut w 37 C. Przed dodaniem do dolnej studzienki zastosowano 5% CO 2. [0206] Ludzkie IP-10 i makaka rezusa IP-10 otrzymano przy 100ng/ml; dla IP-10 pochodzącego z THP-1, komórki THP-1 stymulowano z IFN-γ (0,2 ng/ml) i zebrano supernatant; IP-10 pochodzący z MS CSF użyto bez rozcieńczania. Ligand otrzymano w 150 µl buforu chemotaksji i umieszczono w dolnej komorze. [0207] Dla testów hamowania chemotaksji, ligand wstępnie inkubowano z różnymi stężeniami wskazanego przeciwciała anty-ip-10 (5 µg/ml, 2,5 µg/ml, 1,25 µg/ml, 0,613 µg/ml, 0,3 µg/ml, 0,01 µg/ml) przez 30 minut w temperaturze 37 C w 5% CO 2 przed oznaczeniem. Górną komorę umieszczono nad studzienkami, i studzienki inkubowano przez 2 godziny w temperaturze 37 C w 5% CO 2. Pod koniec inkubacji, komórki odpowiadające były zasysane z górnej komory. Górną komorę ostrożnie usunięto. Komórki zliczano w 4 polach losowych/studzienkę przy 400x powiększeniu. Dane uśredniono w trzech studzienkach i przedstawiono jako indeks chemotaksji (tzn. krotna migracja w odpowiedzi na ligand wobec samej pożywki). [0208] Wyniki wyrażono jako wartości IC 50, są przedstawione poniżej w tabeli 8: Tabela 8: Hamowanie wywołanej przez IP-10 migracji komórkowej Klon ID rhip-10 IC 50 (µg/ml) THP-1 IP-10 IC 50 (µg/ml) rrmip-10 IC 50 (µg/ml) 6A5 (Partia 2) 0,156 0,132 0,119 8F6 0,355 0,173 0,100 6B10 1,1 0,193 0,149 10A12S 0,115 0,211 15,1 1D4 0,156 0,247 0,163 [0209] Zbadano również zdolność przeciwciał anty-ip-10 do hamowania migracji komórek wyrażających CXCR3 w odpowiedzi na płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) pacjenta chorego na stwardnienie rozsiane (SM). Ponownie, przeciwciało anty-mig przy 2,5 µg/ml dodano do próbki CSF w celu zneutralizowania aktywności MIG. Wyniki z dwóch eksperymentów, wyrażono jako wartości IC 50, zestawiono poniżej w tabeli 9: Tabela 9: Hamowanie wywołanej przez SM-CSF migracji komórkowej Klon ID EKSP. 1 IC 50 (µg/ml) EKSP. 2 IC 50 (µg/ml) 6A5 (Partia 2) 0,100 0,236 10A12S 0,562 0,577 [0210] Badania migracji komórkowej były również wykonywane przy użyciu komórek wyrażających CXCR3 i rekombinowanego ludzkiego MIG (R & D Systems), przy 200 ng/ml w celu zbadania zdolności przeciwciał anty-ip-10 do hamowania wywołanej przez MIG migracji komórkowej. Anty-IP-10 przeciwciała 6B10, 8F6, 1D4, 6A5 partia 2, 10A12 i 10A12S indywidualnie przetestowano przy 1 µg/ml i stwierdzono, że nie hamują one wywołanej przez MIG migracji komórkowej. Przykład 7: Wiązanie przeciwciał z wycinkami mózgu pacjentów z SM

55 [0211] W tym przykładzie zbadano zdolność przeciwciał anty-ip-10 do barwienia części mózgu pacjenta chorego na stwardnienia rozsiane (SM). Wycinki mózgu 57 letniej pacjentki chorej na SM uzyskano 19,8 godzin po śmierci i wykazywały one nieregularnie ukształtowana blaszkę (plakę) okołokomorową (1,3 cm x 1,0 cm) z licznymi dodatkowymi mniejszymi blaszkami obecnymi w całej pozostałej materii białej. Barwienie LFB wykazało całkowitą demielinizację. Immunohistochemiczne badanie przeprowadzono na wycinkach, używając 6A5 (partia 2) i 10A12S anty-ip-10 przeciwciał, jak również anty-gfap i anty-cd68, jako kontrole pozytywne i kontrole negatywne przeciwciała. [0212] Zastosowano standardowy protokół immunohistochemiczny do anty-ip-10 barwienia wycinków. Wycinki blokowano za pomocą 2%10% surowicy. Dodano 100 µl/wycinek pierwotnego przeciwciała (np. 6A5) rozcieńczonego w stosunku 1:100 w 2% surowicy, a następnie inkubowano 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Ewentualnie wycinki inkubowano przez noc w temperaturze 4 C i przemywano. Następnie dodano wtórne anty-ludzkie biotynylowane przeciwciało (rozcieńczone w 2% surowicy (100 µl/wycinek)) i inkubowano minut w temperaturze pokojowej. Endogenne peroksydazy usunięto przez dodanie rozcieńczonego H 2 O 2 w MeOH. Następnie dodano ABC Solution (Vector Labs), 100 µl/wycinek i inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Roztwór substratu DAB przygotowano bezpośrednio przed użyciem. Zastosowano 100 µl/wycinek do slajdów przed inkubacją w ciemności przez minut (jest to niezbędne dla rozwoju). Slajdy były następnie barwione kontrastowo z hematoskyliną (Hematoxylin nuclear stain) przez 3 minuty (sprawdzono postęp po 1 minucie). W końcu slajdy inkubowano w 2% wodorowęglanie sodu przez 45 sekund, aby wydobyć kolor. [0213] Wyniki wskazują, że zarówno 6A5 jak i 10A12S może wiązać się z IP-10 in situ w wycinkach mózgu pacjenta MS z 6A5 zabarwieniem bardziej intensywnym niż barwienie 10A12S. Przykład 8: Konstruowanie HCo17 szczepu myszy transgenicznych [0214] Szczep HCo17 transgenicznej myszy wygenerowano przez koiniekcję insertu 80 kb z phc2 (Taylor i współpracownicy, (1994) Int. Immunol., 6: ), 25 Kb insertu z pvx6 i ~ 460 kb fragmentu sztucznego chromosomu drożdżowego z chromosomu yigh24. Sam konstrukt phc2 jest w pełni zdolny do reorganizacji in vivo tworząc funkcjonalne ludzkie loci ciężkiego łańcucha immunoglobuliny; pvx6 i yigh24 dodano celem wniesienie dodatkowej różnorodności linii germinalnej V H. Poszczególne składniki mieszaniny DNA użyte do wytworzenia HCo17 opisano poniżej. [0215] Insert phc2 opisany powyżej zawiera cztery funkcjonalne segmenty genu ludzkich linii germinalnych V H : 1-69 (DP-10), 5-51 (DP-73), 4-34 (DP-63) i (DP -46). Dodatkowo, konstrukt ten zawiera również ludzkie sekwencje genomowe, obejmujące 15 funkcjonalnych segmentów D, wszystkie 6 segmentów J, jak również µ i γ1 segmenty regionu stałego i funkcjonalny µ-γ1 region. [0216] Insert pvx6 zawiera 3 segmenty ludzkiej linii germinalnej VH, VH1-18 (DP-14), VH5-51 (DP-73) i VH3-23 (DP-47). Fragment DNA 8,5 kb Hindlll/Sall, obejmujący ludzki gen linii germinalnej VH1-18 (DP-14), wraz z około 2.5 kb sekwencją genomu 5'otaczającą i 5 kb 3' otaczającą, subklonowano do plazmidowego wektora psp72 (Promega, Madison, WI)

56 w celu wygenerowania plazmidu p kb BamHI/Hindlll fragmentu DNA, obejmujący gen ludzki linii germinalnej VH5-51 (DP-73), wraz z około 5 kb 5' otaczającą i 1 kb 3 otaczającą sekwencją genomową, sklonowano do opartego na pbr322 plazmidowego wektora klonowania pgp1f (Taylor i współpracownicy, (1992) Nucleic Acids Res. 20: ), w celu wygenerowania plazmidu p251f. Nowy wektor klonowania pochodzący od pgplf, pgp1k, trawiono z EcoRV/BamHI, i poddano ligacji do 10 kb EcoRV/BamHI fragmentu DNA, obejmującemu gen ludzkiej linii germinalnej VH3-23 (DP47), wraz z około 4 kb 5'otaczającą i 5 kb 3'otaczającą sekwencję genomu. Powstały plazmid, p112.2rr. 7, trawiono z BamHI/Sall i poddano ligacji z 7 kb oczyszczonego BamHI/Sall insertu p251f. Powstały plazmid, pvx4, trawiono z Xhol i poddano ligacji z 8,5 kb XhoI/Sall insertu p Klon uzyskano z genem VH1-18, w tej samej orientacji co pozostałe dwa geny V. Klon ten, oznaczony pvx6, następnie trawiono z Notl w celu przygotowania insertu. [0217] Sztuczny chromosom drożdżowy (YAC) yigh24 pierwotnie zidentyfikowano dzięki badaniom przesiewowym PCR, stosując VH3 i VH4 rodziny specyficznych starterów i jest mapowany na ludzkim chromosomie 14 przez zawartość VH. Stwierdzono, że yigh24 zawiera segmenty VH, obejmujące członków rodziny VH VH1, VH2, VH3, VH4 i VH5, i w szczególności co najmniej VH1-24, VH-45, VH1-46, VH2-26, VH3-30, V , VH3-30.3, VH3-33, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH4-28, VH4-30, VH4-30.4, VH4-30.3, VH4-31, VH4-34, 4-39 i VH-51. [0218] Oczyszczone inserty z pvx6 (26 KB), phc22 (80 kb) i yigh24 (~ 460 kb) zostały połączone w stosunku molowym 1:1:1, i stosując mikroiniekcję wprowadzone do przedjądrza (ang. pronuclei) półdniowych (C57BL/6J x DBA/2J) F2 zarodków, jak opisano przez Hogan i współpracownicy, (B. Hogan i współpracownicy, Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, 2-gie wyd., 1994, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.). Linia założycielska myszy transgenicznych, obejmująca sekwencje z pvx6 i HC2 i yigh24 została ustanowiona od myszy, które rozwinęły się z wstrzykniętych embrionów. Ta linia została oznaczona (HCo17) [0219] Linia (HCo17) została następnie wyhodowana z myszy obejmujących CMD mutację (opisane w przykładzie 1 PCT publikacji WO 01/09187), mutację JKD (Chen i współpracownicy, (1993) EMBO J. 12: ), i transgen (KCo5) 9272 (Fishwild i współpracownicy, (1996). Nature Biotechnology 14: ). Otrzymane myszy wyrażały ludzkie transgeny ciężkich i kappa lekkich łańcuchów immunoglobuliny w homozygotycznym tle dla przerwania endogenicznych mysich loci ciężkiego i kappa lekkiego łańcucha. Streszczenie listy sekwencji [0220] SEQ ID NO: SEKWENCJA SEQ ID NO: SEKWENCJA 1 VHCDR1 a.a. 1D4 24 VHCDR3a.a. 1D4 2 VHCDR1 a.a. 1E1 25 VHCDR3a.a. 1E1

57 VH CDR1 a.a. 2G1 26 VH CDR3 a.a. 2G1 4 VH CDR1 a.a. 3C4 27 VH CDR3 a.a. 3C4 5 VH CDR1 a.a. 6A5 28 VH CDR3 a.a. 6A5 6 VH CDR1 a.a. 6A8 29 VH CDR3 a.a. 6A8 7 VHCDR1 a.a. 6B10 30 VHCDR3a.a. 6B10 8 VHCDR1 a.a. 7C10 31 VHCDR3a.a. 7C10 9 VH CDR1 a.a. 8F6 32 VH CDR3 a.a. 8F6 10 VHCDR1 a.a. 10A12 33 VHCDR3a.a. 10A12 11 VHCDR1 a.a. 10A12S 34 VHCDR3a.a. 13C4 12 VHCDR1 a.a. 13C4 35 VHa.a. 1D4 13 VHCDR2a.a. 1D4 36 VHa.a. 1E1 14 VHCDR2a.a. 1E1 37 VHa.a2G1 15 VH CDR2 a.a. 2G1 38 VH a.a. 3C4 16 VH CDR2 a.a. 3C4 39 VH a.a. 6A5 17 VH CDR2 a.a. 6A5 40 VH a.a. 6A8 18 VH CDR2 a.a. 6A8 41 VH a.a. 6B10 19 VHCDR2a.a. 6B10 42 VHa.a. 7C10 20 VHCDR2a.a. 7C10 43 VH a.a. 8F6 21 VH CDR2 a.a. 8F6 44 VHa.a. 10A12 22 VHCDR2a.a. 10A12 45 VHa.a. 10A12S 23 VHCDR2a.a. 13C4 46 VHa.a. 13C4 47 VH 3-33 linia germinalna a.a. 49 VH 5-51 linia germinalna a.a. 48 VH linia germinalna a.a. 50 VH 4-61 linia germinalna a.a. 51 VkCDR1 a.a. 1D4 73 VkCDR3a.a. 1D4 52 VkCDR1 a.a. 1E1 74 VkCDR3a.a. 1E1 53 VkCDR1 a.a. 2G1 75 Vk CDR3 a.a. 2G1 54 Vk CDR1 a.a. 3C4 76 Vk CDR3 a.a 3C4 55 Vk CDR1 a.a. 6A5 77 Vk CDR3 a.a. 6A5 56 Vk CDR1 a.a. 6A8 78 Vk CDR3 a.a. 6A8 57 VkCDR1 a.a. 6B10 79 VkCDR3a.a. 6B10 58 VkCDR1 a.a. 7C10 80 VkCDR3a.a. 7C10 59 Vk CDR1 a.a. 8F6 81 Vk CDR3 a.a. 8F6 60 VkCDR1 a.a. 10A12 82 VkCDR3a.a. 10A12 61 VkCDR1 a.a. 13C4 83 VkCDR3a.a. 13C4 62 VkCDR2a.a. 1D4 84 Vka.a. 1D4 63 VkCDR2a.a. 1E1 85 Vka.a. 1E1 64 Vk CDR2 a.a. 2G1 86 Vk a.a. 2G1 65 Vk CDR2 a.a. 3C4 87 Vk a.a. 3C4 66 Vk CDR2 a.a. 6A5 88 Vk a.a. 6A5

58 Vk CDR2 a.a. 6A8 89 Vk a.a. 6A8 68 VkCDR2a.a. 6B10 90 Vka.a. 6B10 69 VkCDR2a.a. 7C10 91 Vka.a. 7C10 70 Vk CDR2 a.a. 8F6 92 Vk a.a. 8F6 71 VkCDR2a.a. 10A12 93 Vka.a. 10A12 72 VkCDR2a.a. 13C4 94 Vka.a. 13C4 95 Vk A27 linia germinalna a.a. 97 Vk L18 linia germinalna a.a. 96 Vk L6 linia germinalna a.a. 98 Vk L15 linia germinalna a.a. 99 VHn.t. 1D4 121 Ludzkie IP-10 a.a. 100 VHn.t. 1E1 122 Ludzkie CXCR3 a.a. 101 VH n.t. 2G1 123 Małpa rezus IP-10 a.a. 102 VH n.t. 3C4 124 Mysie IP-10 a.a. 103 VH n.t. 6A5 125 Ludzkie Mig a.a. 104 VH n.t. 6A8 126 Ludzkie ITAC a.a. 105 VHn.t. 6B VH n.t. 7C VH n.t. 8F6 108 VH n.t. 10A VHn.t. 13C4 110 Vkn.t1D4 111 Vkn.t. 1E1 112 Vk n.t. 2G1 113 Vk n.t. 3C4 114 Vk n.t. 6A5 115 Vk n.t. 6A8 116 Vkn.t. 6B Vkn.t. 7C Vk n.t. 8F6 119 Vkn.t. 10A Vkn.t13C4 Lista sekwencji [0221] <110> Medarex, Inc. i współpracownicy. <120> IP-10 PRZECIWCIAŁA I ICH ZASTOSOWANIE <130>MXI-312PC <150>60/ <151>

59 <160> 126 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211>5 <212> PRT <400> 1 <210>2 <211>5 <400> 2 <210>3 <211>5 <400> 3 <210>4 <211>5 <400> 4 <210>5 <211>5 <400> 5

60 <210>6 <211>5 <400> 6 <210>7 <211>5 <400> 7 <210>8 <211>5 <400> 8 <210>9 <211>5 <400> 9 <210> 10 <211>5 <400> 10

61 <210> 11 <211>5 <400> 11 <210> 12 <211>7 <400> 12 <210> 13 <211>17 <400>13 <210>14 <211> 17 <400> 14 <210> 15 <211> 17 <400> 15

62 <210> 16 <211> 17 <400> 16 10> 17 <211> 17 <400>17 <2 <210>18 <211> 17 <400>18 <210> 19 <211> 17 <400> 19 <210>20 <211> 17

63 <400> 20 <210> 21 <211> 17 <400> 21 <210>22 <211> 17 <400> 22 <210>23 <211> 16 <400> 23 10>24 <211> 15 <400> 24 10>25 <211> 11 <2 <2

64 <400> 25 <210>26 <211> 12 <400> 26 <210>27 <211> 14 <400> 27 <210>28 <211> 15 <400> 28 <210>29 <211> 15 <400> 29 10>30 <211> 13 <2

65 <400> 30 <210> 31 <211> 14 <400> 31 <210>32 <211>11 <400> 32 <210>33 <211> 12 <400> 33 <210>34 <211>20 <400> 34 10>35 <211> 121 <2

66 <400> 35 10>36 <211> 120 <400> 36 <2 10>37 <211> 121 <400> 37 <2

67 <210>38 <211> 123 <400> 38 <210>39 <211> 124 <400> 39

68 <210>40 <211> 124 <400> 40 <210>41 <211>246 <400> 41

69 <210>42 <211> 123 <400> 42

70 <210>43 <211>120 <400> 43 <210>44 <211>121 <400> 44

71 <210>45 <211> 121 <400> 45 <210>46 <211>130 <400> 46

72 <210>47 <211>117 <400> 47 <210>48 <211> 103 <400> 48

73 <210>49 <211>98 <400> 49 <210>50 <211> 99 <400> 50

74 <210> 51 <211> 12 <400> 51 <210>52 <211>11 <400> 52 <210>53 <211> 12 <400> 53 <210>54 <211>11 <400> 54

75 <210>55 <211> 12 <400> 55 <210>56 <211> 12 <400> 56 <210>57 <211>11 <400> 57 <210>58 <211>11 <400> 58 <210>59 <211>11 <400> 59

76 <210>60 <211>12 <400> 60 <210>61 <211>12 <400> 61 <210>62 <211>7 <400> 62 <210>63 <211>7 <400> 63 <210>64 <211>7 <400> 64

77 <210>65 <211>7 <400> 65 <210>66 <211>7 <400> 66 <210>67 <211>7 <400> 67 <210>68 <211>7 <400> 68 <210>69 <211>7 <400> 69

78 <210>70 <211>7 <400> 70 <210> 71 <211>7 <400> 71 <210>72 <211>7 <400> 72 <210>73 <211>9 <400> 73 <210>74 <211> 10 <400> 74

79 <210>75 <211> 10 <400> 75 <210>76 <211>9 <400> 76 <210>77 <211> 10 <400> 77 <210>78 <211>8 <400> 78 <210>79 <211> 10 <400> 79

80 <210>80 <211>9 <400> 80 <210> 81 <211> 10 <400> 81 <210>82 <211> 10 <400> 82 <210>83 <211> 10 <400> 83 <210>84 <211> 108 <400> 84

81 <210>85 <211>108 <400> 85 <210>86 <211>109 <400> 86

82 <210>87 <211>107 <400> 87 <210>88 <211> 109 <400> 88

83 <210>89 <211> 107 <400> 89 <210>90 <211> 108 <400> 90 10> 91 <2

84 <211> 107 <400> 91 <210>92 <211> 108 <400> 92 <210>93 <211>109 <400> 93

85 <210>94 <211> 109 <400> 94 <210>95 <211>96 <400> 95

86 <210>96 <211> 95 <400> 96 <210>97 <211> 95 <210>98 <211> 95

87 <400> 98 <210>99 <211>372 <212>DNA <400> 99 <210> 100 <211>360 <212>DNA <400> 100 <210> 101 <211>363 <212>DNA <400> 101

88 <210> 102 <211>369 <212>DNA <400> 102

89 <210> 103 <211>372 <212>DNA <400> 103 <210> 104 <211>372 <212>DNA <400> 104 <210> 105 <211>366 <212>DNA <400> 105 <210> 106 <211>369 <212>DNA <400> 106

90 <210>107 <211>360 <212>DNA <400> 107 <210>108 <211>363 <212>DNA <400> 108 <210> 109 <211>390 <212>DNA <400> 109 <210> 110 <211>324

91 <212>DNA <400> 110 <210> 111 <211>324 <212>DNA <400> 111 <210> 112 <211>324 <212>DNA <400>112 <210> 113 <211>321 <212>DNA <400>113

92 > 114 <211>327 <212>DNA <400> 114 <2 <210>115 <211>321 <212>DNA <400>115 10> 116 <211>324 <212>DNA <400>116 <2 10> 117 <211> 321 <212>DNA <2

93 <400>117 10> 118 <211>324 <212>DNA <400> 118 <2 <210>119 <211>327 <212>DNA <400> 119 <210> 120 <211>654 <212>DNA <400> 120

94 <210> 121 <211> 98 <400> 121 <210> 122 <211>368 <400> 122