(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 14/12 EP B1 (13) (1) T3 Int.Cl. C07K 16/28 (06.01) A61K 39/39 (06.01) A61P 3/00 (06.01) (4) Tytuł wynalazku: Przeciwciało monoklonalne przeciw CD44 do stosowania do leczenia raka płaskonabłonkowego głowy i szyi () Pierwszeństwo: US 1449 P (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 12/0 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 14/08 (73) Uprawniony z patentu: F.HOFFMANN-LA ROCHE AG, Basel, CH University of Miami, Miami, US (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 LUIS A.G. DA CRUZ, Toronto, CA ELIZABETH JANE FRANZMANN, Miami, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Agnieszka Marszałek SULIMA-GRABOWSKA-SIERZPUTOWSKA BIURO PATENTÓW I ZNAKÓW TOWAROWYCH SP.J. Skr. poczt Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 SGS-4824/VAL EP B1 Opis [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy sposobów profilaktyki, leczenia lub diagnozowania raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (HNSCC) z użyciem jednego lub większej liczby przeciwciał modyfikujących chorobę nowotworową (CDMAB). W pewnych aspektach, CDMAB stanowi przeciwciało swoiste dla CD44. Ujawniono także sposoby prowadzenia terapii skojarzonej, obejmujące zastosowanie CDMAB według wynalazku, ewentualnie w połączeniu z jednym lub większą liczbą innych CDMAB i/lub środków chemioterapeutycznych, jako środków do profilaktyki lub leczenia nowotworu. [0002] Rak płaskonabłonkowy głowy i szyi (HNSCC) jest wyniszczającą i śmiertelną chorobą, która zazwyczaj ujawnia się w późnym stadium i każdego roku dotyka 0000 osób w Stanach Zjednoczonych i osobników na świecie. HNSCC jest chorobą, która powoduje znaczną chorobowość, zwłaszcza w odniesieniu do czynności mowy i połykania. Jako opcje leczenia na ogół dostępna jest operacja chirurgiczna, terapia radiacyjna, chemioterapia lub ich połączenia. [0003] Pomimo rygorystycznych połączeń operacji chirurgicznej, chemioterapii i promieniowania, wskaźniki wyleczenia sięgają jedynie % w przypadku choroby w późnym stadium, a nawroty pozostają najpowszechniejszą przyczyną niepowodzenia po standardowych terapiach (u %-0% pacjentów). Terapia ratunkowa opiera się na tych samych opcjach leczenia co terapia pierwszego rzutu. Jednakże paliatywna operacja chirurgiczna jest często trudna i oszpecająca. Ponadto, terapia radiacyjna rzadko jest możliwa do przeprowadzenia lub korzystna, a chemioterapia nie poprawia zasadniczo przeżywalności u pacjentów z HNSCC. Rokowanie dla tych pacjentów pozostaje słabe, tak że mediana czasu przeżycia po nawrocie wynosi jedynie około sześć miesięcy. [0004] Słabe rezultaty mogą być spowodowane nieskutecznym niszczeniem komórek inicjujących guz czy komórek macierzystych nowotworu (CSC). CSC są zdolne do samoodnawiania, a także wytwarzają komórki potomne o zróżnicowanym fenotypie i ograniczonym samoodnawianiu. CSC, tak jak normalne komórki macierzyste, są oporne na chemioterapię i terapię radiacyjną ze względu na przewagę związaną z przeżyciem, taką jak zwiększona zdolność naprawy DNA. W rzeczywistości, standardowa chemioterapia, np. schematy z użyciem cisplatyny i terapii radiacyjnej rzeczywiście zwiększają populację komórek macierzystych. [000] CD44 odgrywa istotną rolę w onkogenezie. Transbłonowa glikoproteina CD44 wiąże kwas hialuronowy (HA) w substancji międzykomórkowej i białka cytoszkieletu. Oddziaływania pomiędzy CD44, HA, składnikami cytoszkieletu i cząsteczkami sygnałowymi, takimi jak cyklina D1, EGFR, Rho i Ras pobudzają wzrost i migrację. Dodatkowo, CD44 jest uwalniany z błony w postaci rozpuszczalnej (solcd44) przez metaloproteinazy substancji zewnątrzkomórkowej (MMP), a to zdarzenie jest istotne dla migracji komórek. Stwierdzono również, że CD44 jest ważnym markerem CSC, występującym w raku sutka, rakach jelita grubego i HNSCC. Wykazano również, że aktywność CD44 jest wykazywana jako aktywność w tworzeniu guzów w modelach heteroprzeszczepów; Komórki nowotworowe CD44+ HNSCC są onkogenne u myszy z upośledzoną odpornością, podczas gdy kontrolne komórki nowotworowe CD44-HNSCC nie wytworzyły guzów w tych samych modelach. [0006] VFF-18, oznaczany również jako BIWA 1, jest przeciwciałem o wysokim powinowactwie do wariantu v6 CD44, swoistym dla regionu polipeptydu. Różne wersje i pochodne BIWA 1 poddano badaniom klinicznym w celu leczenia nowotworu. W szczególności, zastosowano BIWA 1 w postaci znakowanego 99m technetem koniugatu w próbie klinicznej 1. fazy dla zbadania bezpieczeństwa i potencjału celowania u 12 pacjentów z rakiem płaskonabłonkowym głowy i szyi. Czterdzieści godzin po wstrzyknięciu, 14

3 procent wstrzykniętej dawki zostało pobrane przez guz z minimalną akumulacją w innych narządach, takich jak nerka, śledziona i szpik kostny. Chociaż wysoce selektywne wiązanie z guzem sugeruje rolę BIWA 1 w radioimmunoterapii, wyjątkowo wysokie powinowactwo tego przeciwciała uniemożliwiało wnikanie do głębszych warstw guza. Ponadto stwierdzono, że BIWA 1 jest w znacznym stopniu immunogenny. Jedenastu z dwunastu badanych pacjentów wytworzyło ludzkie przeciwciała anty-mysie (HAMA), które wykazywały niejednorodną akumulację w całym guzie i doprowadziły do powstania kompleksów przeciwciało-rozpuszczalny CD44. [0007] W WO 02/ ujawniono humanizowane wersje VFF-18 zaprojektowane w celu przezwyciężenia odpowiedzi HAMA, oznaczone BIWA 4 i BIWA 8. Stwierdzono, że BIWA 4 ma istotnie niższe powinowactwo wiązania antygenu w porównaniu z macierzystym przeciwciałem VFF 18. Jednak przeciwciało BIWA 4 o niższym powinowactwie wykazywało lepsze właściwości pobierania przez guz niż BIWA 8 o wyższym powinowactwie. Przeciwciała BIWA 4 zarówno znakowane 99m technetem, jak i znakowane 186 renem oceniono w próbie klinicznej 1. fazy na 33 pacjentach w celu określenia bezpieczeństwa, tolerancji, akumulacji w guzie i, w przypadku BIWA 4 znakowanego 186 Re, maksymalnej tolerowanej dawki. Okazało się, że występowało zależne od guza pobieranie BIWA 4 znakowanego 99m Tc. Nie stwierdzono odpowiedzi guza dla wszystkich dawek BIWA 4 znakowanego 186 Re. Chociaż w trakcie badania u wielu pacjentów choroba była stabilna; toksyczność ograniczająca dawkę wystąpiła przy 60 mci/m 2. Ponadto częstość występowania zdarzeń niepożądanych wynosiła 0-6 procent, przy czym u 12 na 33 pacjentów stwierdzono wystąpienie poważnych zdarzeń niepożądanych (małopłytkowość, leukopenia i gorączka). Dodatkowo 6 spośród tych 12 pacjentów, wszyscy leczeni BIWA 4 znakowanym 186 Re, zmarło w trakcie leczenia lub katamnezy z powodu postępu choroby. Dwóch pacjentów wytworzyło także ludzkie przeciwciała anty-ludzkie (HAHA). Zatem znakowane radioaktywnie VFF-18 nie wykazało żadnych efektów klinicznych. [0008] Próbę I fazy z eskalacją dawki BIWA 4 znakowanego 186 Re przeprowadzono na pacjentach. Zaobserwowano zapalenie błony śluzowej jamy ustnej i ograniczającą dawkę małopłytkowość i leukopenię; u jednego pacjenta wystąpiła odpowiedź HAHA. Stabilną chorobę zaobserwowano u pacjentów leczonych najwyższą dawką 60 mci/m 2. Chociaż uważa się to za dopuszczalne zarówno pod kątem bezpieczeństwa, jak i tolerancji w tym zakresie dawek, w badaniach osiągnięto jedynie stabilizację choroby. Dodatkowo w tych badaniach częstość występowania zdarzeń niepożądanych jest wyższa w porównaniu z innymi niesprzężonymi z radioizotopami terapiami biologicznymi w badaniach klinicznych. [0009] W amerykańskim zgłoszeniu patentowym US 03/0398 ujawniono humanizowaną wersję VFF-18 (BIWA 4) sprzężoną z majtanzynoidem do stosowania w terapii przeciwnowotworowej, oznaczoną BIWI 1. Stwierdzono, że BIWI 1 wykazuje znaczące działanie przeciwnowotworowe w mysich modelach ludzkiego naskórkowego raka sromu, raka płaskonabłonkowego gardła lub raka sutka. Wersja niesprzężona, tj. BIWA 4, nie wykazywała działania przeciwnowotworowego. Nie ma dowodów na bezpieczeństwo lub skuteczność koniugatu BIWI 1 u ludzi. [00] Mab U36 jest mysim przeciwciałem monoklonalnym IgG1 wytwarzanym przez immunizację ludzkimi komórkami raka gardła dolnego UM-SCC-22B i selekcję pod kątem swoistości dla nowotworu i tkanki. Charakterystyka antygenów drogą klonowania cdna i analizy sekwencji pozwoliła zidentyfikować, że epitop Mab U36 znajduje się w domenie v6 swoistego dla keratynocytów wariantu splicingowego CD44, epicanu. Badania immunohistochemiczne pokazują, że ten rozpoznany epitop jest ograniczony do błony komórkowej. Mab U36 silnie znakowało 94 procent raków płaskonabłonkowych głowy i szyi (HNSCC), a w tych guzach obserwowano jednorodność wybarwienia komórek. W Da Cruz, (08), European J. of Cancer, Suplement, 6, strona 170 wspomniano o ekspresji CD44 na komórkach nowotworowych i że humanizowane przeciwciało anty-cd44,

4 ARH jest opracowywane do leczenia. W US 09/0043 ujawniono, że chimeryczne ARH anty-cd44 hamuje wzrost guza z ludzkich komórek raka sutka lub raka gruczołu krokowego w modelach heteroprzeszczepu. [0011] Badanie Mab U36 znakowanego 99m Tc u pacjentów wykazało selektywną akumulację przeciwciała w nowotworach HNSCC (,4 +/- 12,4 procent wstrzykniętej dawki/kg po 2 dniach); żadne działania niepożądane nie zostały zgłoszone, ale dwóch pacjentów wytworzyło HAMA. W badaniu związanego z radioaktywnym jodem mysiego Mab U36 wystąpiły 3 przypadki HAMA wśród 18 pacjentów i jednorodny selektywny wychwyt przez HNSCC. W celu zmniejszenia antygenowości Mab U36 i zmniejszenia częstości występowania HAMA skonstruowano przeciwciało chimeryczne, przy czym ani chimeryczne ani oryginalne mysie Mab U36 nie wykazuje aktywności ADCC. Jednak w badaniu nie stwierdzono dowodów na aktywność przeciwnowotworową nieznakowanego Mab U36. [0012] Chimeryczne Mab U36 znakowane 186 Re zastosowano do określenia przydatności Mab U36 jako środka terapeutycznego. W tej próbie I fazy z eskalacją dawki 13 pacjentów otrzymało dawkę rozpoznawczą chimerycznego Mab U36 znakowanego 99m Tc, a następnie chimeryczne Mab U36 znakowane 186 Re. Nie zgłoszono żadnych ostrych zdarzeń niepożądanych. Jednak po leczeniu zaobserwowano ograniczającą dawkę mielotoksyczność (1, GBq/m 2 ) u 2 z 3 pacjentów i małopłytkowość u jednego pacjenta leczonego maksymalną tolerowaną dawką (1,0 GBq/m 2 ). Chociaż obserwowano pewien wpływ na wielkość guza, te efekty nie spełniały kryteriów dla obiektywnych odpowiedzi na leczenie. W dalszych badaniach chimerycznego Mab U36 znakowanego 186 Re wykorzystano strategię stosowania reinfuzji pełnej krwi stymulowanej czynnikiem stymulującym tworzenie kolonii granulocytów, aby podwoić maksymalną tolerowaną aktywność do 2,8 Gy. W tym badaniu spośród dziewięciu pacjentów z różnymi nowotworami głowy i szyi, 3 wymagało transfuzji z powodu niedokrwistości związanej z lekiem. Inne działania toksyczne obejmują mielotoksyczność 3. stopnia i zapalenie błony śluzowej 2. stopnia. Nie odnotowano żadnych obiektywnych odpowiedzi guza, choć osiągnięto stabilizację choroby na 3- miesięcy u pacjentów. [0013] Ze względu na słabe rokowanie dla pacjentów z HNSCC, wpływ choroby na jakość życia i ograniczone możliwości leczenia, istnieje znaczne zainteresowanie i nieodłączna potrzeba opracowania nowych terapii skierowanych przeciw HNSCC. Do tej pory nie było doniesień o tak zwanym nagim (tj. niesprzężonym) przeciwciele anty-cd44 wykazującym skuteczność w przypadku HNSCC. Tak więc chociaż CD44 okazuje się potencjalnym celem przeciwnowotworowym do immunoterapii, przeciwciała anty-cd44 wymagają radio-immuno-konigatu dla osiągnięcia działania przeciwnowotworowego. Jednak, badania ze znakowanym radioaktywnie anty-cd44 wykazały niedopuszczalne działanie toksyczne związane z terapią w odniesieniu do osiąganych efektów klinicznych. Zgodnie z tym, istnieje potrzeba opracowania nowych terapii swoistych dla HNSCC. [0014] Technicznym problemem leżącym u podstaw niniejszego wynalazku jest zapewnienie sposobów i środków do zapobiegania, leczenia lub diagnozy HNSCC z użyciem przeciwciał anty-cd44 i, szczególnie w niektórych aspektach, nieznakowanych przeciwciał anty-cd44. [001] Ten techniczny problem rozwiązuje się przez dostarczenie postaci scharakteryzowanych w zastrzeżeniach. [0016] W opisie opisano nowe sposoby zapobiegania, leczenia lub diagnozowania raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (HNSCC) obejmujące zastosowanie przeciwciał anty- CD44. Wynalazek obejmuje zastosowanie przeciwciał anty-cd44, które wiążą domenę końca aminowego domeny zewnątrzkomórkowej CD44 i/lub które immunospecyficznie wiążą jeden lub większą liczbę, korzystnie wiele ludzkich wariantów CD44 eksprymowanych u ludzi, do leczenia HNSCC. W opisie opisano zastosowanie przeciwciała anty-cd44 wytwarzanego przez hybrydomę zdeponowaną w ATCC pod numerem dostępu PTA-4621

5 i jego wariantów i/lub pochodnych, np. chimerycznych i humanizowanych wersji PTA Opisano także zastosowanie przeciwciał i ich fragmentów wiążących antygen, które współzawodniczą o wiązanie z PTA W szczególności niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania przeciwciała monoklonalnego anty-cd44 lub jego fragmentu wiążącego antygen, do wytwarzania leku do leczenia raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (HNSCC) u ssaka, przy czym ten HNSCC charakteryzuje się ekspresją CD44, przy czym to przeciwciało zawiera (a) CDR1 VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:3, CDR2 VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:4, CDR3 VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:, CDR1 VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:6, CDR2 VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:7 oraz CDR3 VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:8; lub (b) domenę VH o sekwencji aminokwasowej, która jest w co najmniej 8% identyczna z domeną VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:9 lub SEQ NO: oraz domenę VL o sekwencji aminokwasowej, która jest w co najmniej 8% identyczna z domeną VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:11; przy czym to przeciwciało współzawodniczy o wiązanie z CD44 z przeciwciałem wytwarzanym przez hybrydomę zdeponowaną w ATCC pod numerem dostępu PTA Wynalazek dotyczy również humanizowanego przeciwciała anty-cd44 lub jego fragmentu wiążącego antygen, do stosowania do leczenia raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (HNSCC) u człowieka, przy czym ten HNSCC charakteryzuje się ekspresją CD44 i przy czym to humanizowane przeciwciało zawiera domenę VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:9 i domenę VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:11 albo zawiera domenę VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: i domenę VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:11. [0017] Przeciwciała i fragmenty stosowane zgodnie ze sposobami są swoiste dla CD44, szczególnie CD44 eksprymowanego na powierzchni komórki, a korzystnie swoistego dla domeny zewnątrzkomórkowej na końcu aminowym jednego lub większej liczby wariantów ludzkiego CD44, np. eksprymowanego na powierzchni komórki nowotworowej HNSCC. W pewnych aspektach przeciwciała do stosowania zgodnie z ujawnionymi tu sposobami są humanizowanymi lub chimerycznymi wersjami przeciwciała wytwarzanego przez hybrydomę zdeponowaną w ATCC pod numerem dostępu PTA Przeciwciała do stosowania zgodnie z ujawnionymi tu sposobami, lub ich fragmenty wiążące antygen, zawierają jeden lub większą liczbę spośród CDR1 domeny zmiennej łańcucha ciężkiego (VH) o sekwencji aminokwasowej RYWMS (SEQ ID NO:3), CDR2 VH o sekwencji aminokwasowej EVNPDSTSINYTPSLKD (SEQ ID NO:4), CDR3 VH o sekwencji aminokwasowej PNYYGSRYHYYAMDY (SEQ ID NO:), CDR1 domeny zmiennej łańcucha lekkiego (VL) o sekwencji aminokwasowej RASQDINNYLN (SEQ ID NO:6), CDR2 VL o sekwencji aminokwasowej YTSRLHS (SEQ ID NO:7); i CDR3 VL o sekwencji aminokwasowej QQGSTLPFT (SEQ ID NO:8). [0018] Stosowane tu przeciwciała mogą również zawierać dwa lub większą liczbę, trzy lub większą liczbę, cztery lub większą liczbę, pięć lub większą liczbę, a w pewnych aspektach wszystkie spośród CDR1 VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:3, CDR2 VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:4, CDR3 VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:, CDR1 VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:6, CDR2 VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:7 oraz CDR3 VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:8. Niniejszy wynalazek dostarcza również przeciwciało monoklonalne anty-cd44 lub jego fragment wiążący antygen, do stosowania do leczenia raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (HNSCC) u ssaka, przy czym ten HNSCC charakteryzuje się ekspresją CD44, przy czym to przeciwciało zawiera

6 (a) CDR1 VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:3, CDR2 VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:4, CDR3 VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:, CDR1 VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:6, CDR2 VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:7 oraz CDR3 VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:8; lub (b) domenę VH o sekwencji aminokwasowej, która jest w co najmniej 8% identyczna z domeną VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:9 lub SEQ NO: oraz domenę VL o sekwencji aminokwasowej, która jest w co najmniej 8% identyczna z domeną VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:11; przy czym to przeciwciało współzawodniczy o wiązanie z CD44 z przeciwciałem wytwarzanym przez hybrydomę zdeponowaną w ATCC pod numerem dostępu PTA [0019] Przeciwciała i fragmenty wiążące antygen do stosowania zgodnie ze sposobami według wynalazku mogą zawierać domenę VH o sekwencji aminokwasowej 1 i/lub domenę VL o sekwencji aminokwasowej [00] W pewnych aspektach wynalazek obejmuje zastosowanie przeciwciała anty-cd44 lub fragmentu wiążącego antygen, zawierającego domenę VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:1 oraz domenę VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:2. [0021] Wynalazek obejmuje ponadto zastosowanie przeciwciała anty-cd44 lub jego fragmentów wiążących antygen, do leczenia, profilaktyki lub diagnozowania HNSCC, przy czym przeciwciało anty-cd44 jest humanizowane. W niektórych aspektach, humanizowane przeciwciało anty-cd44 lub fragment wiążący antygen zawiera domenę VH o sekwencji aminokwasowej lub 2 i/lub domenę VL o sekwencji 3 [0022] W szczególnym aspekcie, wynalazek dostarcza humanizowane przeciwciało anty- CD44 lub jego fragment wiążący antygen, do stosowania do profilaktyki, leczenia lub diagnozy HNSCC u osobnika, przy czym to humanizowane przeciwciało anty-cd44 zawiera domenę VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:9 oraz domenę VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:11 lub przy czym to przeciwciało anty-cd44 zawiera domenę VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: oraz domenę VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:11. W szczególnych aspektach osobnikiem jest człowiek. Wynalazek dostarcza również zastosowanie humanizowanego przeciwciała anty-cd44 lub jego fragmentu wiążącego antygen, do profilaktyki, leczenia lub diagnozowania HNSCC u osobnika, przy czym to humanizowane przeciwciało anty-cd44 zawiera domenę VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:9 oraz domenę VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID

7 NO:11 lub przy czym to przeciwciało anty-cd44 zawiera domenę VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: oraz domenę VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:11. [0023] W pewnych aspektach, przeciwciało lub fragment przeciwciała do stosowania zgodnie ze sposobami według wynalazku rozpoznaje epitop w domenie końca aminowego regionu zewnątrzkomórkowego CD44 o sekwencji aminokwasowej AFDGPITITIV (SEQ ID NO:12). [0024] Przeciwciała anty-cd44 do stosowania zgodnie z wynalazkiem mogą być sprzężone z ugrupowaniami czynnymi, takimi jak ugrupowania terapeutyczne lub reporterowe. Przeciwciała anty-cd44 mogą być również sprzężone z komórkami hematopoetycznymi od osobnika. W pewnych aspektach ugrupowaniami terapeutycznymi są ugrupowania znane w dziedzinie jako korzystne do leczenia, profilaktyki lub diagnozy HNSCC, takie jak, lecz nie wyłącznie, cytotoksyna, enzym, pierwiastek promieniotwórczy, cytokina, antymetabolit lub interferon. [002] Wynalazek obejmuje również przeciwciała anty-cd44 lub ich fragmenty wiążące antygen do stosowania jako monoterapie lub w połączeniu z jednym lub większą liczbą innych środków chemioterapeutycznych lub diagnostycznych i/lub terapii. Zgodnie z tym, wynalazek obejmuje przeciwciała anty-cd44 (np. humanizowane lub chimeryczne przeciwciała) lub ich fragmenty wiążące antygen, do stosowania w połączeniu ze standardowym lub doświadczalnym schematem leczenia HNSCC (np. chemioterapią, radioimmunoterapią lub radioterapią). Przykłady środków terapeutycznych, które są szczególnie użyteczne w połączeniu z przeciwciałem swoistym dla CD44 lub jego fragmentem wiążącym antygen, zgodnie z ujawnionymi tu sposobami do profilaktyki, leczenia lub diagnozy HNSCC, obejmują, lecz nie wyłącznie, chemioterapeutyki znane w dziedzinie, środki alkilujące, antymetabolity, produkty naturalne i hormony. Ujawnione w opisie terapie skojarzone mogą umożliwiać stosowanie niższych dawek przeciwciała anty-cd44 lub jego fragmentu wiążącego antygen i/lub rzadsze podawanie przeciwciała anty-cd44 lub jego fragmentu wiążącego antygen osobnikowi z HNSCC, w celu osiągnięcia efektu terapeutycznego lub profilaktycznego. Zgodnie z ujawnionymi tu sposobami, przeciwciała anty- CD44 lub ich fragmenty wiążące antygen mogą być wspólnie podawane, równocześnie podawane i/lub kolejno podawane z jednym lub większą liczbą innych środków chemioterapeutycznych lub diagnostycznych, lub mogą być podawane łącznie z terapią radiacyjną lub operacją chirurgiczną. Podawanie przeciwciał, fragmentów i/lub dodatkowych środków lub terapii można prowadzić z zastosowaniem dowolnych środków znanych w dziedzinie jako odpowiednie do dostarczania konkretnego środka lub terapii do miejsca guza. Takie podawanie można prowadzić pozajelitowo (np. podawanie IV, domięśniowo lub podskórnie), doustnie lub, w pewnych aspektach, przez bezpośrednie dostarczanie do miejsca guza lub miejsca podejrzanego o występowanie lub nawrót guza. Przeciwciała, fragmenty i/lub kompozycje można również podawać jako preparat o przedłużonym uwalnianiu. [0026] Wynalazek dostarcza ponadto kompozycję farmaceutyczną do profilaktyki, leczenia lub diagnozy HNSCC u osobnika, zawierającą (i) terapeutycznie skuteczną ilość ujawnionego w opisie przeciwciała anty-cd44 (np. przeciwciało chimeryczne lub humanizowane) lub jego fragmentu wiążącego antygen, oraz (ii) farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. [0027] W opisie ujawniono także sposoby diagnozy HNSCC u osobnika, co do którego podejrzewa się, że ma taką chorobę, obejmujące: (i) kontaktowanie próbki biologicznej od tego osobnika ze skuteczną ilością ujawnionego w opisie przeciwciała anty-cd44 lub jego fragmentu wiążącego antygen; i (ii) wykrywanie wiązania tego przeciwciała lub jego fragmentu, przy czym wykrycie tego przeciwciała lub fragmentu powyżej poziomu tła lub wzorca wskazuje na to, że ten osobnik ma HNSCC. Wykrywanie przeciwciała anty-cd44 lub jego fragmentu wiążącego antygen można wspomóc przez zastosowanie markera detekcyjnego znanego w dziedzinie. Ujawnienie obejmuje również zestaw diagnostyczny lub

8 prognostyczny do wykrywania HNSCC, w próbce tkanki od osobnika, co do której wiadomo lub co do której podejrzewa się, że zawiera komórki HNSCC. W pewnych aspektach, zestaw zawiera środki do wykrywania CD44, w szczególności eksprymowanego przez komórki HNSCC i/lub próbkę tkanki od osobnika, co do której wiadomo lub co do której podejrzewa się, że zawiera komórki HNSCC. Zestaw może zawierać (1) przeciwciało monoklonalne wytworzone przez hybrydomę zdeponowaną w ATCC pod numerem dostępu PTA-4621, (2) przeciwciało, które konkuruje o wiązanie z przeciwciałem monoklonalnym wytwarzanym przez hybrydomę zdeponowaną w ATCC pod numerem dostępu PTA-4621; (3) przeciwciało zawierające jeden lub większą liczbę spośród CDR1 VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:3, CDR2 VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:4, CDR3 VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:, CDR1 VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:6, CDR2 VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:7 i CDR3 VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:8; lub (4) fragment wiążący antygen przeciwciała (1), (2) lub (3). Zestaw może również zawierać jeden lub większą liczbę spośród: podłoża lub zbiornika do utrzymywania próbki biologicznej, wzorca(-ów) odniesienia dla biomarkera(-ów) w roztworze lub postaci stałej (np. CD44 lub peptyd swoiście wiązany przez przeciwciało wytworzone przez przeciwciało PTA-4621), jedno lub większą liczbę przeciwciał swoistych dla biomarkerów (np. przeciwciało PTA-4621 i jego fragment wiążący antygen, albo jego wariant lub pochodną) oraz wskazówki do prowadzenia testu(-ów) do wykrywania biomarkerów z użyciem zawartości zestawu. [0028] Celem ujawnienia jest również opisanie sposobu leczenia HNSCC z użyciem przeciwciała PTA-4621 lub jego fragmentów wiążących antygen. Innym celem ujawnienia jest opisanie diagnozy HNSCC z użyciem przeciwciała PTA-4621 lub jego fragmentów wiążących antygen. Kolejnym celem ujawnienia jest opisanie zastosowania PTA-4621 lub jego fragmentów wiążących antygen, do rokowania lub określania stopnia zaawansowania HNSCC. Kolejnym celem ujawnienia jest opisanie zastosowania PTA-4621 lub jego fragmentów wiążących antygen, do selekcji pacjentów do leczenia HNSCC. [0029] W pewnych aspektach, przeciwciała anty-cd44 i ich fragmenty wiążące antygen do stosowania zgodnie z ujawnionymi w opisie sposobami mogą obejmować sekwencję aminokwasową domeny VH i/lub domeny VL, która jest w co najmniej 4%, co najmniej 0%, co najmniej %, co najmniej 60%, co najmniej 6%, co najmniej 70%, co najmniej 7%, co najmniej 80%, co najmniej 8%, co najmniej 90%, co najmniej 9% lub co najmniej 99% identyczna z sekwencją aminokwasową domeny VH i/lub domeny VL mysiego przeciwciała monoklonalnego wytwarzanego przez hybrydomę zdeponowaną w ATCC pod numerem dostępu PTA-4621, pod warunkiem, że przeciwciała anty-cd44 lub fragmenty wykazują swoistość wiązania z CD44 i/lub współzawodniczą o wiązanie z PTA Wynalazek obejmuje ponadto zastosowanie przeciwciał anty-cd44 lub ich fragmentów wiążących antygen, które obejmują sekwencję aminokwasową domeny VH i/lub domeny VL, która jest w co najmniej 4%, co najmniej 0%, co najmniej %, co najmniej 60%, co najmniej 6%, co najmniej 70%, co najmniej 7%, co najmniej 80%, co najmniej 8%, co najmniej 90%, co najmniej 9% lub co najmniej 99% identyczna z domeną VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:1 i/lub domeną VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:2, pod warunkiem, że przeciwciała anty-cd44 lub fragmenty wykazują swoistość wiązania z CD44 i/lub współzawodniczą o wiązanie z PTA W pewnych aspektach, niniejszy wynalazek obejmuje przeciwciała lub ich fragmenty, które swoiście wiążą CD44 i które obejmują sekwencję aminokwasową jednego lub większej liczby CDR, która jest w co najmniej 4%, co najmniej 0%, co najmniej %, co najmniej 60%, co najmniej 6%, co najmniej 70%, co najmniej 7%, co najmniej 80%, co najmniej 8%, co najmniej 90%, co najmniej 9% lub co najmniej 99% identyczna z sekwencją aminokwasową jednego lub większej liczby CDR mysiego przeciwciała monoklonalnego wytwarzanego przez hybrydomę zdeponowaną w ATCC pod numerem dostępu PTA-4621, pod warunkiem, że te przeciwciała lub fragmenty wykazują swoistość wiązania z CD44 i/lub współ-

9 zawodniczą o wiązanie z PTA Wynalazek obejmuje ponadto zastosowanie przeciwciał anty-cd44 lub ich fragmentów wiążących antygen, które obejmują sekwencję aminokwasową jednego lub większej liczby CDR, która jest w co najmniej 4%, co najmniej 0%, co najmniej %, co najmniej 60%, co najmniej 6%, co najmniej 70%, co najmniej 7%, co najmniej 80%, co najmniej 8%, co najmniej 90%, co najmniej 9% lub co najmniej 99% identyczna z jednym lub większą liczbą spośród CDR1 VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:3, CDR2 VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:4, CDR3 VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:, CDR1 VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:6, CDR2 VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:7 oraz CDR3 VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:8, pod warunkiem, że te przeciwciała lub fragmenty wykazują swoistość wiązania z CD44 i/lub współzawodniczą o wiązanie z PTA [00] W opisie zgodnie z tym ujawniono zastosowanie humanizowanych przeciwciał i fragmentów przeciwciała swoistych dla CD44 lub takich, które współzawodniczą o wiązanie z przeciwciałem PTA-4621, w którym jeden lub większa liczba regionów jednego lub większej liczby CDR regionów zmiennych łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego ludzkiego przeciwciała (przeciwciała akceptorowego) zostały zastąpione analogicznymi częściami jednego lub większej liczby CDR donorowego przeciwciała monoklonalnego, które swoiście wiąże CD44, np. mysiego przeciwciała monoklonalnego wytwarzanego przez klon PTA Korzystnie, humanizowane przeciwciało swoiście wiąże się z tym samym epitopem, co mysie przeciwciało donorowe. Specjalista w dziedzinie zauważy, że wynalazek obejmuje ogólnie przeszczepianie CDR przeciwciał. W szczególnych aspektach, niniejszy wynalazek obejmuje zastosowanie humanizowanych przeciwciał lub fragmentów przeciwciała, które swoiście wiążą CD44 i/lub współzawodniczą o wiązanie z PTA-4621, które to humanizowane przeciwciała lub fragmenty przeciwciał obejmują sekwencję aminokwasową domeny VH i/lub domeny VL, która jest w co najmniej 4%, co najmniej 0%, co najmniej %, co najmniej 60%, co najmniej 6%, co najmniej 70%, co najmniej 7%, co najmniej 80%, co najmniej 8%, co najmniej 90%, co najmniej 9% lub co najmniej 99% identyczna z domeną VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:9 lub SEQ ID NO: i/lub domeną VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:11. [0031] Przeciwciała anty-cd44 i ich fragmenty wiążące antygen do stosowania zgodnie z ujawnionymi tu sposobami mogą być kodowane przez sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją nukleotydową kodującą domenę VH, pełny łańcuch ciężki, domenę VL lub pełny łańcuch lekki mysiego przeciwciała monoklonalnego PTA W innych aspektach, wynalazek obejmuje zastosowanie przeciwciała anty- CD44 lub jego fragmentu wiążącego antygen, obejmującego domenę VH, która jest kodowana przez sekwencję kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją kwasu nukleinowego kodującą sekwencję aminokwasową SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:9 lub SEQ ID NO:. W innych aspektach, wynalazek obejmuje zastosowanie przeciwciała anty-cd44 lub jego fragmentu wiążącego antygen, obejmującego domenę VL, która jest kodowana przez sekwencję kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją kwasu nukleinowego kodującą sekwencję aminokwasową SEQ ID NO:2 lub SEQ ID NO:11. Wynalazek obejmuje zastosowanie przeciwciała anty- CD44 lub jego fragmentu wiążącego antygen, obejmującego jeden lub większą liczbę CDR kodowanych przez sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją nukleotydową kodującą jeden lub większą liczbę CDR mysiego przeciwciała monoklonalnego PTA-4621, lub sekwencję kwasu nukleinowego kodującą jeden lub większą liczbę spośród CDR1 VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:3, CDR2 VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:4, CDR3 VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:, CDR1 VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:6, CDR2 VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:7 oraz CDR3 VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:8. Ostre warunki hybrydyzacji obejmują, lecz nie wyłącznie, (i) hybrydyzację ze związanym na filtrze DNA w 6X chlorku sodu/cytrynianie sodu (SSC) w około 4 C, a następnie jed-

10 no lub większą liczbę przemyć w 0,2X SSC/0,1% SDS w około 0-6 C; (ii) wysoce ostre warunki, takie jak hybrydyzacja ze związanym na filtrze DNA w 6X SSC w około 4 C, a następnie jedno lub większa liczba przemyć w 0,1X SSC/0,2% SDS w około 60 C, lub (iii) jakiekolwiek inne ostre warunki hybrydyzacji znane specjalistom w dziedzinie. [0032] W opisie ujawniono również zastosowanie wektora obejmującego ujawnione w opisie kwasy nukleinowe (tj. kwasy nukleinowe kodujące domeny VH, domeny VL i/lub jeden lub większą liczbę CDR przeciwciała anty-cd44 lub fragmenty wiążące antygen). Ten wektor może być wektorem ekspresyjnym, a sekwencje kwasu nukleinowego kodujące opisane w opisie sekwencje aminokwasowe są funkcjonalnie połączone z regulującymi sekwencjami kwasu nukleinowego lub sekwencjami kodującymi regulujące sekwencje aminokwasowe (np. sygnały transkrypcji, translacji, translokacji) niezbędne do prawidłowej ekspresji kodowanych sekwencji aminokwasowych. Ujawniono tu również komórki gospodarzy zawierające wektory lub sekwencje nukleotydowe kodujące ujawnione w opisie przeciwciała lub fragmenty przeciwciał. [0033] Wynalazek zilustrowano także przez załączone przykłady. DEFINICJE [0034] Na ogół poniższe słowa lub wyrażenia, gdy są stosowane w streszczeniu, opisie, przykładach i zastrzeżeniach, mają wskazaną definicję. [003] Określenie przeciwciało stosuje się w najszerszym znaczeniu i obejmuje w szczególności, przykładowo, pojedyncze przeciwciała monoklonalne (w tym przeciwciała agonistyczne, antagonistyczne i neutralizujące, przeciwciała deimmunizowane, mysie, chimeryczne, humanizowane lub ludzkie), kompozycje przeciwciał o swoistości poliepitopowej, przeciwciała jednołańcuchowe, diaciała, triaciała, immunokoniugaty, przeciwciała syntetyczne, przeciwciała kamelizowane, jednołańcuchowe Fv (scfv), przeciwciała jednołańcuchowe, fragmenty Fab, fragmenty F(ab'), związane mostkami disiarczkowymi Fv (sdfv), intraciała i przeciwciała antyidiotypowe (anty-id) (w tym, np. przeciwciała anty-id i anty-anty-id przeciw przeciwciałom według wynalazku), oraz fragmenty wiążące epitop któregokolwiek z powyższych. W szczególności, przeciwciała obejmują cząsteczki immunoglobuliny i immunologicznie czynne fragmenty cząsteczek immunoglobuliny, tj. cząsteczki, które zawierają miejsce wiążące antygen. Wynalazek obejmuje zastosowanie cząsteczek immunoglobuliny dowolnego typu (np. IgG, IgE, IgM, IgD, IgA i IgY), klasy (np. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2) lub podklasy. [0036] Fragment przeciwciała lub fragment wiążący antygen obejmuje część nienaruszonego przeciwciała, korzystnie zawierającą jego region wiążący antygen lub epitop albo region zmienny. Przykłady fragmentów przeciwciała obejmują przeciwciała krótsze niż pełnej długości, np. Fab, Fab', F(ab')2, jak również konstrukty domen zmiennych przeciwciała, np. fragmenty Fv; diaciała; liniowe przeciwciała; jednołańcuchowe cząsteczki przeciwciał; jednołańcuchowe przeciwciała, jednodomenowe cząsteczki przeciwciał, białka fuzyjne, białka rekombinowane i wieloswoiste przeciwciała utworzone z fragmentu(-ów) przeciwciała. [0037] Humanizowane i/lub chimeryczne postacie przeciwciał/immunoglobulin innych niż ludzkie (np. mysie) dotyczą przeciwciał, obejmujących swoiste chimeryczne immunoglobuliny, łańcuchy immunoglobulin lub ich fragmenty (takie jak Fv, Fab, Fab', F(ab')2 lub inne wiążące antygen podsekwencje przeciwciał), które powodują zmniejszenie odpowiedzi ludzkich przeciwciał anty-mysich (HAMA), ludzkich przeciwciał antychimerycznych (HACA) lub ludzkich przeciwciał anty-ludzkich (HAHA) w porównaniu z oryginalnym przeciwciałem i zawierają wymagane części (np. CDR(-y), region(-y) wiążący(-e) antygen, domenę(-y) zmienną(-e) itp.) pochodzące z tej immunoglobuliny innej niż ludzka, niezbędne do odtworzenia pożądanego efektu, jednocześnie zachowując charakterystykę wiązania porównywalną z tą immunoglobuliny innej niż ludzka. W większości przypadków, humanizowane przeciwciała są ludzkimi immunoglobulinami (przeciwciało akceptorowe), w których reszty z regionów determinujących komplementarność (CDR)

11 przeciwciała akceptorowego są zastąpione resztami z CDR z gatunku innego niż człowiek (przeciwciało donorowe), takiego jak mysz, szczur lub królik, posiadającego pożądaną swoistość, powinowactwo i kompetencję (np. swoistość dla CD44). W niektórych przypadkach, reszty regionu zrębowego Fv (FR) ludzkiej immunoglobuliny są zastąpione odpowiednimi resztami FR nie pochodzącymi od człowieka. Ponadto, humanizowane przeciwciało może zawierać reszty, które nie występują ani w przeciwciele akceptorowym, ani w importowanych sekwencjach CDR lub FR. Modyfikacje te wprowadza się w celu dalszego udoskonalania i optymalizacji działania przeciwciała. Na ogół, humanizowane przeciwciało będzie zawierać zasadniczo wszystkie z co najmniej jednej, a typowo dwóch domen zmiennych, w których wszystkie lub zasadniczo wszystkie regiony CDR odpowiadają tym z immunoglobuliny innej niż ludzka i wszystkie lub zasadniczo wszystkie reszty FR są tymi z sekwencji konsensusowej ludzkiej immunoglobuliny. Humanizowane przeciwciało optymalnie będzie również zawierać co najmniej część regionu stałego immunoglobuliny (Fc), typowo ludzkiej immunoglobuliny. [0038] Stosowane tu określenie region hiperzmienny dotyczy reszt aminokwasowych przeciwciała, które są odpowiedzialne za wiązanie antygenu. Region hiperzmienny zawiera reszty aminokwasowe z regionu determinującego komplementarność lub CDR (np. reszty (L1), 0-6 (L2) i (L3) w domenie zmiennej łańcucha lekkiego i 31-3 (H1), 0-6 (H2) i 9-2 (H3) w domenie zmiennej łańcucha ciężkiego według Kabat i in., Sequences of Proteins of Immunological Interest,. wyd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) i/lub te reszty z pętli hiperzmiennej (tj. reszty (L1), 0-2 (L2) i (L3) w domenie zmiennej łańcucha lekkiego i (H1), 3- (H2) i 96-1 (H3) w domenie zmiennej łańcucha ciężkiego; Chothia i Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: ). Reszty regionu zrębowego lub FR są tymi resztami domeny zmiennej, które są inne niż zdefiniowane w opisie reszty regionu hiperzmiennego. Stosowane tu określenia domena zmienna łańcucha ciężkiego, domena VH i/lub VH są stosowane zamienne i odnoszą się do regionu hiperzmiennego (obejmującego zarówno CDR, jak i domeny zrębowe) łańcucha ciężkiego przeciwciała; określenia domena zmienna łańcucha lekkiego, domena VL i/lub VL są stosowane zamienne i odnoszą się do regionu hiperzmiennego (obejmującego zarówno CDR, jak i domeny zrębowe) łańcucha ciężkiego przeciwciała. [0039] W niniejszym opisie, linie komórkowe hybrydoma, jak również przeciwciała monoklonalne, które są z nich wytwarzane, są oznaczane przez numer dostępu ATCC PTA Wewnętrzne oznaczenie tego przeciwciała to ARH Zatem, odniesienie do PTA-4621 może odnosić się do klonu komórek hybrydoma zdeponowanego w ATCC, który wytwarza przeciwciało anty-cd44, lub może odnosić się do samego anty-cd44 wytwarzanego przez tę hybrydomę. Odniesienie do PTA-4621 dotyczy także przeciwciała o wewnętrznym oznaczeniu ARH Zgodnie z tym, w stosowanym tu znaczeniu, chimeryczne wersje PTA-4621 mogą być określone jako chpta-4621 lub charh , a humanizowane wersje PTA-4621 mogą być określone jako hupta-4621 lub huarh Specjalista w dziedzinie natychmiast rozpozna z kontekstu czy odniesienie dotyczy przeciwciała czy klonu hybrydomy. Mysie przeciwciało monoklonalne anty-cd44 PTA-4621 odkryto stosując metodologię wytwarzania swoistych dla pacjenta przeciwciał przeciwnowotworowych podaną w opisie patentowym US Stosując ten sposób, myszy immunizowano komórkami zarówno z biopsji guza płuca pacjenta oraz linii komórek raka płuca NCI-H460. Przeciwciało jest ujawnione w opisie patentowym US , a linię komórek hybrydoma eksprymujących to przeciwciało zdeponowano w American Type Culture Collection, 801 University Blvd., Manassas, VA września 02 r., pod numerem dostępu PTA Wykazano, że to przeciwciało wykazuje znaczne działanie przeciwnowotworowe w wielu przedklinicznych modelach heteroprzeszczepu, w tym zarówno w prewencyjnych jak i ustalonych modelach in vivo ludzkiego raka sutka (jak ujawniono w opisie patentowym US ), raka wątroby (jak ujaw-

12 niono w opisie patentowym US ) i raka gruczołu krokowego (jak ujawniono w opisie patentowym US 70737). Dodatkowo, leczenie PTA-4621 w połączeniu z lekami chemioterapeutycznymi (Cisplatyną) wykazało aktywność przeciwnowotworową w ustalonym modelu in vivo raka gruczołu krokowego (ibid). Chimeryczne i humanizowane wersje mysiego przeciwciała PTA-4621/ARH ujawniono w opisie patentowym US [00] Określenie przeciwciało monoklonalne w stosowanym w opisie znaczeniu dotyczy przeciwciała otrzymanego z populacji zasadniczo jednorodnych przeciwciał, tj. poszczególne przeciwciała tworzące populację są identyczne, z wyjątkiem możliwych naturalnie występujących mutacji, które mogą występować w niewielkich ilościach. Przeciwciała monoklonalne są wysoce swoiste, skierowane przeciw pojedynczemu miejscu antygenowemu. Ponadto, w przeciwieństwie do preparatów przeciwciał poliklonalnych, które obejmują różne przeciwciała skierowane przeciwko różnym determinantom (epitopom), każde przeciwciało monoklonalne jest skierowane przeciwko pojedynczej determinancie na antygenie. Oprócz ich swoistości, przeciwciała monoklonalne są korzystne pod tym względem, że mogą być syntetyzowane jako nie zanieczyszczone innymi przeciwciałami. Wyrażenie modyfikujące monoklonalne wskazuje na charakter przeciwciała, jako uzyskanego z zasadniczo jednorodnej populacji przeciwciał i nie należy go interpretować jako wymóg wytwarzania przeciwciała jakimkolwiek określonym sposobem. Przykładowo, przeciwciała monoklonalne stosowane zgodnie z niniejszym wynalazkiem można wytworzyć metodą hybrydoma (mysie lub ludzkie), po raz pierwszy opisaną przez Kohler i in., Nature, 26:49 (197), lub można wytworzyć metodami rekombinacji DNA (patrz np. opis patentowy US nr ). Przeciwciała monoklonalne można również wyizolować z fagowych bibliotek przeciwciał stosując techniki opisane w Clackson i in., Nature, 32: (1991) oraz Marks i in., J. Mol. Biol., 222:81-97 (1991). [0041] Przeciwciało modyfikujące chorobę nowotworową (CDMAB) dotyczy przeciwciała monoklonalnego, które modyfikuje przebieg choroby nowotworowej, w sposób, który jest korzystny dla pacjenta, przykładowo przez zmniejszenie całkowitej masy guza lub przedłużenie czasu przeżycia osób z nowotworem i ich przeciwciał-ligandów. [0042] Przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała, które wiąże lub swoiście wiąże interesujący antygen, np. CD44, jest cząsteczka, która jest zdolna do wiązania antygenu z wystarczającym powinowactwem, tak że przeciwciało jest użyteczne jako środek terapeutyczny lub diagnostyczny w celowaniu w komórki eksprymujące antygen. Gdy przeciwciałem jest przeciwciało, które wiąże CD44, będzie ono zazwyczaj preferencyjnie wiązać CD44 w przeciwieństwie do innych receptorów i nie obejmuje to przypadkowego wiązania, takiego jak nieswoisty kontakt Fc lub wiązanie z modyfikacjami potranslacyjnymi wspólnymi dla innych antygenów, i może być przeciwciałem, które nie reaguje krzyżowo w znacznym stopniu z innymi białkami. Sposoby wykrywania przeciwciał, które wiążą interesujący antygen są dobrze znane w dziedzinie i mogą obejmować, lecz nie wyłącznie oznaczenia, takie jak FACS, komórkowy test ELISA i Western blot. [0043] W korzystnych postaciach, przeciwciała lub fragmenty przeciwciał do stosowania zgodnie ze sposobami według wynalazku swoiście wiążą CD44, w szczególności eksprymowany na HNSCC, i/lub współzawodniczą z mysim przeciwciałem monoklonalnym PTA-4621 o wiązanie CD44, gdy stosuje się standardowe metody znane w dziedzinie. CD44 pośredniczy w bezpośrednim połączeniu między substancją międzykomórkową i cytoszkieletem poprzez swoje konserwatywne zewnątrzkomórkowe regiony wiążące HA i wewnątrzkomórkowe regiony wiążące ankirynę. Białka CD44 są również uwalniane w postaci rozpuszczalnej (solcd44) przez proteazy i są wykrywalne w normalnym krążeniu i ślinie. Receptor CD44 obejmuje rodzinę izoform eksprymowanych w wielu rodzajach komórek. Te izoformy powstają w wyniku alternatywnego splicingu regionu zmiennych egzonów (egzony -14) obecnego w mrna CD44, tworząc różne łodygi łączące domenę końca aminowego regionu zewnątrzkomórkowego domeny transbłonowej. Izoformy wy-

13 stępują w normalnych komórkach jako standardowy CD44 (CD44s), nabłonkowy CD44 (CD44E) lub CD44v8- i CD44v3- w keratynocytach. Inne wariantowe izoformy CD44 (CD44v) są w różnicowany sposób eksprymowane w niektórych nowotworach. W szczególnych aspektach, przeciwciała i ich fragmenty wiążące antygen do stosowania zgodnie ze sposobami według wynalazku immunospecyficznie wiążą domenę końca aminowego regionu zewnątrzkomórkowego CD44, wykazując tym samym swoistość wobec wielu, a korzystnie wszystkich, funkcjonalnych izoform CD44 eksprymowanych u ludzi. W szczególnych aspektach, wynalazek obejmuje zastosowanie przeciwciał i ich fragmentów wiążących antygen, które swoiście wiążą CD44 eksprymowany przez HNSCC. W pewnych aspektach, przeciwciała i fragmenty wiążące antygen do stosowania zgodnie ze sposobami według niniejszego wynalazku wiążą epitop domeny końca aminowego regionu zewnątrzkomórkowego CD44 o sekwencji aminokwasowej AFDGPITITIV (SEQ ID NO:12). Korzystnie, przeciwciała do stosowania zgodnie z ujawnionymi tu sposobami współzawodniczą z PTA-4621 o wiązanie z CD44, co określa się standardowymi sposobami znanymi w dziedzinie. [0044] W stosowanym tu znaczeniu, wyrażenia komórka, linia komórkowa i hodowla komórek są stosowane zamiennie i wszystkie takie określenia obejmują potomstwo. Rozumie się, że całe potomstwo nie musi być dokładnie identyczne pod względem zawartości DNA, wskutek umyślnych lub przypadkowych mutacji. Objęte jest zmutowane potomstwo, które ma taką samą funkcję lub aktywność biologiczną, jak poszukiwano w pierwotnie transformowanej komórce. Z kontekstu w jasny sposób wyniknie gdzie różne określenia są zamierzone. [004] W stosowanym tu znaczeniu, wyrażenie podawanie bezpośrednio do miejsca nowotworu lub guza i analogiczne wyrażenia dotyczą, w tym, bez ograniczeń, pojedynczego lub wielu wstrzyknięć przeciwciał, fragmentów lub kompozycji bezpośrednio do guza lub w okolicy guza, ciągłej lub nieciągłej perfuzji do guza lub w okolicy guza, wprowadzenia zbiornika do guza lub w okolicy guza, wprowadzenia urządzenia o powolnym uwalnianiu do guza lub w okolicy guza, wprowadzenia preparatu o powolnym uwalnianiu do guza lub w okolicy guza, bezpośredniego naniesienia na guz, bezpośredniego wstrzyknięcia w tętnicę, która zasadniczo bezpośrednio zasila obszar guza, bezpośredniego wstrzyknięcia w naczynie limfatyczne, które zasadniczo drenuje obszar guza, bezpośredniego lub zasadniczo bezpośredniego wprowadzenia w zasadniczo zamkniętą jamę (np. jamę opłucnej) lub światło (np. wewnątrz pęcherzyka). W okolicy guza jest określeniem opisującym region w obrębie około cm, korzystnie w obrębie cm, korzystniej w obrębie 1 cm, od tego co uważa się za granicę guza, taką jak, lecz nie wyłącznie, granica wyczuwalnego dotykiem guza. Bezpośrednie podawanie w kontekście zapobiegania pojawieniu lub zapobiegania nawrotowi jest zdefiniowane jako podawanie bezpośrednio w miejsce zagrożone rozwojem lub nawrotem nowotworu. [0046] Stosowane tu określenia kwasy nukleinowe, sekwencja kwasu nukleinowego i sekwencja nukleotydowa obejmują cząsteczki DNA (np. cdna lub genomowy DNA), cząsteczki RNA (np. mrna), połączenia cząsteczek DNA i RNA lub hybrydowe cząsteczki DNA/RNA i analogi cząsteczek DNA lub RNA. Takie analogi można wytworzyć z użyciem przykładowo analogów nukleotydów, które obejmują, lecz nie wyłącznie, inozynę lub tritylowane zasady. Takie analogi mogą również obejmować cząsteczki DNA lub RNA zawierające zmodyfikowane łańcuchy główne, które zapewniają korzystne cechy cząsteczkom, takie jak przykładowo odporność na nukleazy lub zwiększona zdolność do przekraczania błon komórkowych. Kwasy nukleinowe lub sekwencje nukleotydowe mogą być jednoniciowe, dwuniciowe, mogą zawierać zarówno jednoniciowe jak i dwuniciowe części i mogą zawierać trójniciowe części, ale korzystny jest dwuniciowy DNA. [0047] Określenie hybrydyzacja lub hybrydyzuje w stosowanym tu znaczeniu może dotyczyć hybrydyzacji w ostrych lub nieostrych warunkach. Te warunki hybrydyzacji mogą być ustalone zgodnie ze standardowymi protokołami opisanymi np. w Sambrook, Rus-

14 sell; Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (01); Ausubel; Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989) lub Higgins i Hames (red.); Nucleic acid hybridization, a practical approach IRL Press Oxford, Waszyngton DC, (198). Ustawienie warunków całkowicie pozostaje w zakresie umiejętności specjalisty i może być określone według protokołów opisanych w dziedzinie. Zatem wykrywanie wyłącznie swoiście hybrydyzujących sekwencji zwykle wymaga ostrych warunków hybrydyzacji i przemywania, takich jak 0,1 x SSC, 0,1% SDS w 6 C. Nieostre warunki hybrydyzacji do wyrywania homologicznych lub niedokładnie komplementarnych sekwencji można ustawić na 6 x SSC, 1% SDS w 6 C. Jak dobrze wiadomo, długość sondy i skład oznaczanego kwasu nukleinowego stanowią kolejne parametry dla warunków hybrydyzacji. Należy zauważyć, że zmiany w powyższych warunkach można zrealizować zgodnie z rutynowymi metodami z dziedziny, przez włączenie i/lub zastąpienie alternatywnymi odczynnikami blokującymi używanymi do zmniejszenia tła w eksperymentach hybrydyzacyjnych. Typowe odczynniki blokujące obejmują odczynnik Denhardta, BLOTTO, heparynę, zdenaturowany DNA spermy łososia oraz dostępne w handlu opatentowane preparaty. Włączenie określonych odczynników blokujących może wymagać modyfikacji opisanych powyżej warunków hybrydyzacji, że względu na problemy ze zgodnością. Hybrydyzujące cząsteczki kwasu nukleinowego obejmują także fragmenty opisanych powyżej cząsteczek. Takie fragmenty mogą reprezentować sekwencje kwasu nukleinowego, które kodują WAVE1 lub jego funkcjonalny fragment, i które mają długość co najmniej 12 nukleotydów, korzystnie co najmniej 1, korzystniej co najmniej 18, korzystniej co najmniej 21 nukleotydów, korzystniej co najmniej nukleotydów, jeszcze korzystniej co najmniej nukleotydów, a najkorzystniej co najmniej 60 nukleotydów. Ponadto cząsteczki kwasu nukleinowego, które hybrydyzują z dowolną z wyżej wspomnianych cząsteczek kwasu nukleinowego, obejmują również fragmenty komplementarne, pochodne i warianty alleliczne tych cząsteczek. Dodatkowo kompleks hybrydyzacyjny dotyczy kompleksu pomiędzy dwiema sekwencjami kwasu nukleinowego spowodowane tworzeniem się wiązań wodorowych pomiędzy komplementarnymi zasadami G i C oraz pomiędzy komplementarnymi zasadami A i T; te wiązania wodorowe mogą być dalej stabilizowane przez oddziaływania π-π zasad. Dwie komplementarne sekwencje kwasu nukleinowego tworzą wiązania wodorowe w konfiguracji antyrównoległej. Kompleks hybrydyzacyjny może być utworzony w roztworze (np. w analizie Cot lub Rot) lub pomiędzy jedną sekwencją kwasu nukleinowego obecną w roztworze a drugą sekwencją kwasu nukleinowego unieruchomioną na stałym podłożu (np. membranach, filtrach, chipach, szpilkach lub szkiełkach, na których np. utrwalono komórki). Określenia komplementarny lub komplementarność dotyczą naturalnego wiązania się polinukleotydów, w umożliwiających to warunkach obecności soli i temperatury, przez parowanie zasad. Przykładowo sekwencja A-G-T wiąże się z komplementarną sekwencją T- C-A. Komplementarność dwóch jednoniciowych cząsteczek może być częściowa, gdy wiążą się tylko niektóre z kwasów nukleinowych, lub może być pełna, gdy występuje pełna komplementarność cząsteczek jednoniciowych. Stopień komplementarności nici kwasu nukleinowego znacząco wpływa na wydajność i siłę hybrydyzacji pomiędzy nićmi kwasu nukleinowego. Ma to szczególne znaczenie w reakcjach amplifikacji, które zależą od wiązania pomiędzy nićmi kwasu nukleinowego. [0048] Określenie sekwencje hybrydyzujące korzystnie dotyczy sekwencji, które wykazują identyczność sekwencji co najmniej %, korzystnie co najmniej 0%, korzystniej co najmniej 60%, jeszcze korzystniej co najmniej 70%, szczególnie korzystnie co najmniej 80%, bardziej szczególnie korzystnie co najmniej 90%, jeszcze bardziej szczególnie korzystnie co najmniej 9%, a najkorzystniej co najmniej 97% identyczność z opisaną powyżej sekwencją kwasu nukleinowego (tj. SEQ ID NO: 1-11) kodującą domeny VH lub domenę VL przeciwciał anty-cd44 lub ich fragmentów wiążących antygen według wynalazku, i/lub CDR takich przeciwciał anty-cd44 lub fragmentów.

15 [0049] Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, określenie identyczny lub procentowa identyczność w kontekście dwóch lub większej liczby sekwencji kwasu nukleinowego lub aminokwasowych, dotyczy dwóch lub większej liczby sekwencji lub podsekwencji, które są takie same, lub mają określony udział procentowy reszt aminokwasowych lub nukleotydów, które są takie same (np. 60% lub 6% identyczność, korzystnie 70-9% identyczność, korzystniej co najmniej 9% identyczność z sekwencjami aminokwasowymi, np. SEQ ID NO: 1-11 lub sekwencjami kwasu nukleinowego kodującymi sekwencje aminokwasowe SEQ ID NO:1-11), przy porównaniu lub uliniowieniu z maksymalną odpowiedniością w oknie porównania lub w określonym regionie, mierzoną przy użyciu algorytmu porównywania sekwencji znanego w dziedzinie lub drogą manualnego uliniowienia i oceny wzrokowej. Sekwencje wykazujące przykładowo 60% do 9% lub większą identyczność sekwencji uważa się za zasadniczo identyczne. Taka definicja ma również zastosowanie do sekwencji komplementarnej do badanej sekwencji. Specjaliści w dziedzinie będą wiedzieli jak określić procentową identyczność między/wśród sekwencji stosując przykładowo takie algorytmy jak te oparte na programie komputerowym CLUSTALW (Thompson, Nucl. Acids Res. 2(1994), ) lub FASTDB (Brutlag, Comp. App. Biosci. 6(1990), ), znane w dziedzinie. [000] Chociaż algorytm FASTDB typowo nie uwzględnia wewnętrznych niedopasowanych delecji lub addycji w sekwencjach, tj. przerw, w obliczeniach, może być to skorygowane ręcznie w celu uniknięcia przeszacowania % identyczności. Jednakże CLUSTALW bierze pod uwagę przerwy w sekwencji w obliczeniach identyczności. Dla specjalistów w dziedzinie dostępne są również algorytmy BLAST i BLAST 2.0 (Altschul, Nucl. Acids Res. 2(1997) ; Altschul, J. Mol. Evol. 36(1993) 290-0; Altschul, J. Mol. Biol. 21(1990) 3-4). Program BLASTN dla sekwencji kwasu nukleinowego stosuje jako wartości domyślne długość słowa (W) 11, wartość oczekiwaną (E), M=, N=4 oraz porównanie obu nici. Dla sekwencji aminokwasowych, program BLASTP stosuje jako wartości domyślne długość słowa (W) 3 i wartość oczekiwaną (E). Macierz punktująca BLOSUM62 (Henikoff, PNAS 89(1989) 91) stosuje uliniowienia (B) 0, wartość oczekiwaną (E), M=, N=4 oraz porównanie obu nici. [001] Opisano tu także cząsteczki kwasu nukleinowego, których sekwencja jest zdegenerowana w porównaniu z sekwencją opisanej powyżej cząsteczki hybrydyzującej. Stosowane zgodnie z niniejszym wynalazkiem określenie jest zdegenerowana w wyniku kodu genetycznego oznacza, że z powodu nadmiarowości kodu genetycznego różne sekwencje nukleotydowe kodują ten sam aminokwas. [002] Analogiczne techniki komputerowe stosujące BLAST używa się do poszukiwania identycznych lub pokrewnych cząsteczek w bazach danych sekwencji nukleotydowych, takich jak GenBank lub EMBL. Ta analiza jest dużo szybsza niż wielokrotne hybrydyzacje oparte na membranie. Ponadto, czułość przeszukiwania komputerowego może być modyfikowana w celu określenia, czy dane dopasowanie jest zaklasyfikowane jako dokładne lub podobne. Podstawą przeszukiwania jest wynik iloczynowy, który jest zdefiniowany jako: % identyczność sekwencji x % maksymalny wynik BLAST 0 4 i uwzględnia on zarówno stopień podobieństwa dwóch sekwencji, jak i długość dopasowania sekwencji. Przykładowo, przy wyniku iloczynowym, dopasowanie będzie dokładne w granicach 1-2% błędu; a przy 70, dopasowanie będzie dokładne. Podobne cząsteczki są zazwyczaj identyfikowane przez wybranie tych, dla których wyniki iloczynowe wynoszą między 1 i, chociaż niższe wyniki mogą identyfikować cząsteczki pokrewne. Innym przykładem programu zdolnego do generowania uliniowień sekwencji jest program komputerowy CLUSTALW (Thompson, Nucl. Acids Res. 2(1994) ) lub FASTDB (Brutlag, Comp. App. Biosci. 6(1990) ), znane w dziedzinie.

16 [003] Leczenie lub leczyć dotyczy zarówno postępowania terapeutycznego, jak i środków profilaktycznych lub zapobiegawczych, gdzie celem jest zapobieganie, łagodzenie lub spowolnienie (osłabianie) docelowego stanu patologicznego lub zaburzenia (np. HNSCC), albo jednego lub większej liczby związanych z nimi objawów. Określenia te są tu stosowane także w celu opisania opóźniania wystąpienia, hamowania (np. zmniejszenia lub zatrzymania wzrostu), łagodzenia skutków lub przedłużenia życia pacjenta cierpiącego na nowotwór, w szczególności HNSCC. Osobnicy potrzebujący leczenia obejmują tych, u których zdiagnozowano zaburzenie, u których podejrzewa się występowanie zaburzenia, predysponowanych do wystąpienia zaburzenia, jak również tych, u których ma się zapobiegać zaburzeniu. Zatem ssak do leczenia może tu mieć już zdiagnozowane zaburzenie lub może być predysponowany lub podatny na wstąpienie zaburzenia. W niektórych postaciach leczenie dotyczy likwidacji, usunięcia, modyfikacji lub opanowania pierwotnej, obszarowej lub przerzutowej tkanki nowotworowej, które wynika z podawania jednego lub większej liczby środków terapeutycznych zgodnie ze sposobami według wynalazku. W innych postaciach, takie określenia dotyczą zminimalizowania lub opóźnienia szerzenia się nowotworu wynikającego z podawania jednego lub większej liczby środków terapeutycznych osobnikowi z taką chorobą. W innych postaciach, takie określenia dotyczą wyeliminowania komórek powodujących chorobę. [004] Stosowane tu określenia zapobiegać, zapobieganie i profilaktyka dotyczą zapobiegania pojawieniu się i/lub nawrotowi albo wystąpieniu jednego lub większej liczby objawów choroby nowotworowej u osobnika wynikającego(-ych) z podawania środka profilaktycznego lub terapeutycznego. [00] Osobnicy, co do których uważa się że mają ryzyko rozwoju nowotworu, mogą szczególnie skorzystać z wynalazku, przede wszystkim dlatego, że leczenie profilaktyczne można zacząć zanim uzyska się jakiekolwiek dowody zaburzenia (przykładowo zmiany przedrakowe ( przednowotworowe ) lub dysplastyczne, które mogą ale nie muszą być widoczne gołym okiem, ale obejmują histologiczne zmiany przedrakowe). Osobnicy z ryzykiem obejmują, np. osobników eksponowanych na czynniki rakotwórcze, np. przez konsumpcję, np. wziewnie i/lub przez połknięcie, na poziomach, które jak wykazano statystycznie sprzyjają nowotworom u podatnych osobników. Objęci są również osobnicy z ryzykiem spowodowanym ekspozycją na promieniowanie nadfioletowe lub ich środowiskiem, zawodowym i/lub dziedzicznym, jak również ci wykazujący oznaki stanu przednowotworowego, takie jak polipy. Podobnie osobnicy z bardzo wczesnym stadium nowotworu lub rozwoju przerzutów (tj. tylko jedna lub kilka nieprawidłowych komórek jest obecna(-ych) w organizmie osobnika lub w określonym miejscu w tkance osobnika) mogą skorzystać z takiego leczenia profilaktycznego [006] Określenia skuteczna ilość i skuteczna do leczenia, w stosowanym tu znaczeniu, dotyczą ilości lub stężenia przeciwciała stosowanego przez pewien okres czasu (w tym ostrego lub przewlekłego podawania oraz okresowego lub ciągłego podawania), która jest skuteczna w kontekście jego podawania w celu wywołania zamierzonego efektu lub rezultatu fizjologicznego. Skuteczne ilości przeciwciała do stosowania w niniejszym wynalazku obejmują przykładowo ilości, które hamują wzrost nowotworu, np. guzów i/lub komórek nowotworowych, poprawiają rezultat dla pacjenta cierpiącego na lub z ryzykiem nowotworu i poprawiają rezultat innych terapii przeciwnowotworowych. [007] Określenia pacjent i osobnik stosuje się zamiennie i stosuje się je w całym opisie do opisu istoty żywej, człowieka lub nie będącej człowiekiem, której zapewnia się leczenie lub diagnozę zgodnie ze sposobami według niniejszego wynalazku. [008] Określenia rak płaskonabłonkowy głowy i szyi lub HNSCC obejmują, lecz nie wyłącznie, raki jamy ustnej, warg, jamy nosowej, zatok przynosowych, gardła, krtani, części nosowej gardła, gardła i tchawicy. [009] Środek chemioterapeutyczny jest związkiem chemicznym użytecznym do leczenia nowotworu.

17 [0060] Ssak do celów leczenia odnosi się do jakiejkolwiek istoty żywej sklasyfikowanej jako ssak, w tym do człowieka, myszy, myszy lub szczepów myszy SCID lub nagich, zwierząt udomowionych i gospodarskich oraz zwierząt w zoo, sportowych lub domowych, takich jak owce, psy, konie, koty, krowy itp. Korzystnie ssakiem jest tutaj człowiek. [0061] Stosowane w opisie określenie w połączeniu dotyczy zastosowania więcej niż jednego środka profilaktycznego i/lub terapeutycznego, np. środka profilaktycznego lub terapeutycznego w dodatku do przeciwciał anty-cd44 lub ich fragmentów wiążących antygen, jak opisano w opisie. Zastosowanie określenia w połączeniu nie ogranicza kolejności, w jakiej środki profilaktyczne i/lub terapeutyczne są podawane osobnikowi z zaburzeniem, np. HNSCC. Pierwszy środek profilaktyczny lub terapeutyczny może być podawany przed (np. 1 minutę, minut, 1 minut, minut, 4 minut, 1 godzinę, 2 godziny, 4 godziny, 6 godzin, 12 godzin, 24 godziny, 48 godzin, 72 godziny, 96 godzin, 1 tydzień, 2 tygodnie, 3 tygodnie, 4 tygodnie, tygodni, 6 tygodni, 8 tygodni lub 12 tygodni przed), równocześnie z lub po (np. 1 minutę, minut, 1 minut, minut, 4 minut, 1 godzinę, 2 godziny, 4 godziny, 6 godzin, 12 godzin, 24 godziny, 48 godzin, 72 godziny, 96 godzin, 1 tydzień, 2 tygodnie, 3 tygodnie, 4 tygodnie, tygodni, 6 tygodni, 8 tygodni lub 12 tygodni po) podaniu drugiego środka profilaktycznego lub terapeutycznego osobnikowi, który miał, ma lub jest podatny na zaburzenie. Środki profilaktyczne lub terapeutyczne podaje się osobnikowi w takiej kolejności i przedziale czasowym, że środek według wynalazku może działać wraz z innym środkiem, aby zapewnić zwiększoną korzyść, niż gdyby były one podawane w inny sposób. Każdy dodatkowy środek profilaktyczny lub terapeutyczny może być podawany w dowolnej kolejności z innymi dodatkowymi środkami profilaktycznymi lub terapeutycznymi. W połączeniu może również dotyczyć stosowania ujawnionych tu przeciwciał anty-cd44 lub ich fragmentów wiążących antygen łącznie ze standardowymi sposobami leczenia przeciwnowotworowego, np. radioterapią lub operacją chirurgiczną. [0062] Stosowane w opisie określenie immunokoniugat oznacza dowolną cząsteczkę lub CDMAB, takie jak przeciwciało, chemicznie lub biologicznie połączone z cytotoksynami, środkami radioaktywnymi, cytokinami, interferonami, ugrupowaniami docelowymi lub reporterowymi, enzymami, toksynami, lekami przeciwnowotworowymi lub środkami terapeutycznymi. Przeciwciało lub CDMAB może być połączone z cytotoksyną, środkiem radioaktywnym, cytokiną, interferonem, ugrupowaniem docelowym lub reporterowym, enzymem, toksyną, lekiem przeciwnowotworowym lub środkiem terapeutycznym w dowolnym miejscu w cząsteczce, pod warunkiem, że jest zdolne do wiązania się ze swoim celem. Przykłady immunokoniugatów obejmują chemiczne koniugaty przeciwciała z toksyną i białka fuzyjne przeciwciało-toksyna. Immunokoniugaty mogą mieć szczególne zastosowanie jako środki diagnostyczne. [0063] Środki radioaktywne odpowiednie do stosowania jako środki przeciwnowotworowe i/lub w związku ze sposobami diagnostycznymi, jak ujawniono w opisie, są znane specjalistom w dziedzinie. Przykładowo można stosować 131 I lub 211 At. Te izotopy przyłącza się do przeciwciała z zastosowaniem standardowych technik (np. Pedley i in., Br. J. Cancer 68, (1993)). Alternatywnie środek przeciwnowotworowy, który jest przyłączony do przeciwciała jest enzymem, który aktywuje prolek. Może być podawany prolek, który pozostanie w swojej postaci nieaktywnej, aż dotrze do miejsca nowotworu, gdzie jest przekształcany w swoją postać cytotoksyny po podaniu kompleksu przeciwciała. W praktyce koniugat przeciwciało-enzym podaje się pacjentowi i pozwala zlokalizować w obszarze tkanki, która ma być leczona. Następnie pacjentowi podaje się prolek, tak że przekształcanie w cytotoksyczny lek następuje w obszarze tkanki, która ma być leczona. Alternatywnie środek przeciwnowotworowy sprzężony z przeciwciałem jest cytokiną, taką jak interleukina-2 (IL-2), interleukina-4 (IL-4) lub czynnik martwicy nowotworów alfa (TNF-α). Przeciwciało nakierowuje cytokinę do nowotworu, tak że cytokina pośredniczy w uszkadzaniu lub niszczeniu nowotworu bez wpływu na inne tkanki. Cytokinę sprzęga się z przeciwcia-

18 łem na poziomie DNA przy użyciu standardowych technik rekombinacji DNA. Można również stosować interferony. KRÓTKI OPIS FIGUR [0064] Figury przedstawiają: Figura 1 przedstawia reprezentatywne histogramy FACS przeciwciał ARH skierowanych przeciw liniom komórkowym HNSCC T.Tn, SCC-1 i Detroit- 62 (Fig. 1A) oraz CAL 27 (Fig. 1B), pokazujące, że ARH wiąże się z takimi liniami komórkowym. Na Fig. 1A, jako kontrola służyło przeciwciało C22 (anty-egfr); na Fig. 1B, jako kontrola służyło przeciwciało anty-cd RITUXAN. Figura 2 pokazuje wpływ charh na wzrost guza w ustalonym ludzkim modelu HNSCC T.Tn. Pionowe linie przerywane wskazują okres, w którym przeciwciało podawano dootrzewnowo. Punkty danych przedstawiają średnią +/- SEM. Figura 3 pokazuje wpływ chimerycznego PTA-4621 na masę ciała myszy w ustalonym ludzkim modelu HNSCC T.Tn. Punkty danych przedstawiają średnią +/- SEM. Figura 4 pokazuje wpływ humanizowanego PTA-4621 na wzrost guza w ustalonym modelu HNSCC SCC-1. Pionowe linie przerywane wskazują okres, w którym przeciwciało podawano dootrzewnowo. Punkty danych przedstawiają średnią +/- SEM. Figura pokazuje wpływ humanizowanego PTA-4621 na masę ciała myszy w ustalonym modelu HNSCC SCC-1. Punkty danych przedstawiają średnią +/- SEM. Figura 6 pokazuje wpływ humanizowanego PTA-4621 na wzrost guza w ustalonym modelu HNSCC Detroit 62. Pionowe linie przerywane wskazują okres, w którym przeciwciało podawano dootrzewnowo. Punkty danych przedstawiają średnią +/- SEM. Figura 7 pokazuje wpływ humanizowanego PTA-4621 na masę ciała myszy w ustalonym modelu HNSCC Detroit 62. Punkty danych przedstawiają średnią +/- SEM. Figura 8 pokazuje wpływ humanizowanego PTA-4621 na względną objętość guza w ustalonym modelu HNSCC CAL 27. Figura 9 pokazuje wpływ humanizowanego PTA-4621 na wzrost guza w ustalonym modelu heteroprzeszczepu HNSCC CAL 27. Objętość guza przedstawiono jako średnią dla grupy ± minus SEM. Pionowe linie przerywane wskazują pierwszy i ostatni dzień dawkowania. Figura pokazuje wpływ humanizowanego PTA-4621 na masę ciała myszy w ustalonym modelu HNSCC CAL 27. Masę ciała przedstawiono jako średnią dla grupy ± SEM. Figura 11 przedstawia sekwencję aminokwasową domeny VH mysiego przeciwciała monoklonalnego PTA-4621 (SEQ ID NO:1). Reszty w sekwencji są ponumerowane według Kabata. CDR są podkreślone i dodatkowo oznaczone kreskami powyżej sekwencji; CDR1 VH (SEQ ID NO:3) odpowiada resztom 31 do 3, CDR2 VH (SEQ ID NO:4) odpowiada resztom 0 do 6, a CDR3 VH (SEQ ID NO:) odpowiada resztom 9 do 2. Figura 12 przedstawia sekwencję aminokwasową domeny VL mysiego przeciwciała monoklonalnego PTA-4621 (SEQ ID NO:2). Reszty w sekwencji są ponumerowane według Kabata. CDR są podkreślone i dodatkowo oznaczone kreskami powyżej sekwencji; CDR1 VL (SEQ ID NO:6) odpowiada resztom 24 do 34, CDR2 VL (SEQ ID NO:7) odpowiada resztom 0 do 67, a CDR3 VL (SEQ ID NO:8) odpowiada resztom 89 do 97. Figura 13 przedstawia sekwencje aminokwasowe dwóch alternatywnych humanizowanych domen VH opartych na mysim przeciwciele monoklonalnym PTA-4621 (SEQ ID NO:9 i SEQ ID NO:). Reszty w sekwencji są ponumerowane we-

19 dług Kabata. Figura 14 przedstawia sekwencję aminokwasową humanizowanej domeny VL opartej na mysim przeciwciele monoklonalnym PTA-4621 (SEQ ID NO:11). Reszty w sekwencji są ponumerowane według Kabata. SZCZEGÓŁOWY OPIS [006] Niniejszy wynalazek rozwiązuje zidentyfikowany problem techniczny, dzięki temu, że nieoczekiwanie pokazano, że przeciwciało anty-cd44 PTA-4621 jest skuteczne w leczeniu HNSCC w postaci nagiego (tj. niesprzężonego) przeciwciała. W szczególności, w przeciwieństwie do wcześniejszej terapii z użyciem anty-cd44, w ustalonych modelach HNSCC, niesprzężone chimeryczne i humanizowane wersje PTA-4621 znacząco hamowały i/lub zmniejszały wzrost nowotworu w modelach HNSCC obejmujących heteroprzeszczepy komórek T.Tn, SCC-1, Detroit 62 i Cal 27. [0066] Zgodnie z tym, wynalazek dostarcza sposoby profilaktyki, leczenia i/lub łagodzenia stanu klinicznego pacjentów cierpiących na HNSCC, obejmujące zastosowanie przeciwciał anty-cd44, w szczególności, przeciwciał anty-cd44, które współzawodniczą o wiązanie z mysim przeciwciałem monoklonalnym PTA-4621 zgodnie ze sposobami znanymi w dziedzinie, i/lub przeciwciał anty-cd44, które immunospecyficznie wiążą domenę końca aminowego regionu zewnątrzkomórkowego CD44 i rozpoznają jedną lub większą liczbę izoform CD44 eksprymowanych u ludzi. W pewnych aspektach, wynalazek dostarcza sposoby (i) zmniejszania wielkości guza HNSCC, szybkości wzrostu, inwazyjności, stopnia złośliwości i/lub ryzyka nawrotu, (ii) przedłużania okresu wolnego od choroby po leczeniu, i/lub (iii) poprawiania czynności oddychania, połykania i/lub mowy u pacjenta z HNSCC, obejmujące podawanie pacjentowi skutecznej ilości ujawnionego w opisie przeciwciała anty-cd44 lub jego fragmentu wiążącego antygen. Kliniczna poprawa może być określona subiektywnie lub obiektywnie, przykładowo przez ocenę zdolności osobnika do oddychania z mniejsza trudnością, zdolności osobnika do połykania cieczy w porównaniu z substancjami stałymi, stopnia niedrożności, jakości lub głośności mowy i innych wskaźników znanych w dziedzinie klinicznej. [0067] Rezultaty kliniczne leczenia nowotworu z zastosowaniem sposobów według wynalazku są łatwo dostrzegalne przez specjalistę w powiązanej dziedzinie, takiego jak lekarz. Przykładowo, standardowe testy medyczne do mierzenia klinicznych markerów nowotworu mogą być silnymi wskaźnikami skuteczności leczenia. Takie testy mogą obejmować, bez ograniczenia, badanie fizykalne, skale sprawności, merkery chorobowe, EKG z 12 odprowadzeniami, pomiary guza, biopsję tkanki, cytoskopię, cytologię, obliczenia najdłuższego wymiaru średnicy guza, radiografię, obrazowanie cyfrowe guza, objawy czynności życiowych, masę ciała, zapis zdarzeń niepożądanych, ocenę epizodów zakaźnych, ocenę równocześnie przyjmowanych leków, ocenę bólu, analizę chemiczną krwi lub surowicy, analizę moczu, skan TK i analizę farmakokinetyczną. Ponadto efekty synergiczne terapii skojarzonej obejmującej przeciwciało anty-cd44, fragment lub kompozycję, jak ujawniono w opisie, zgodnie ze sposobami według wynalazku i inny przeciwnowotworowy środek terapeutyczny można określić przez badania porównawcze z pacjentami poddawanymi monoterapii. [0068] Szczególnie w przypadku HNSCC, łatwo sprawdzić poprawę oddychania, połykania, mowy i niektórych miar jakości życia. Dodatkowo, remisję HNSCC można oceniać stosując kryteria przyjęte przez specjalistę, np. Therasse i in., New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors. European Organization for Research and Treatment of Cancer, National Cancer Institute of the United States, National Cancer Institute of Canada, J Natl Cancer Inst. 92(00) -16. [0069] W niektórych postaciach, nowotwór jest podatny na leczenie przez bezpośrednie podawanie przeciwciał anty-cd44, fragmentów lub kompozycji, jak ujawniono w opisie. Przykładowo, docelowa masa guza może znajdować się blisko powierzchni skóry. W innym przykładzie, zmieniona chorobowo tkanka może być zamknięta w torbieli lub znajdu-

20 je się w zasadniczo zamkniętej jamie, w tym, bez ograniczeń, świetle. Skuteczna dawka przeciwciała anty-cd44, przeciwciała, fragmentu lub kompozycji, jak ujawniono w opisie, do podawania może się zmieniać w zależności od sposobu podawania. Bezpośrednie podawanie (np. wstrzyknięcie do guza) wymaga znacznie mniejszej dawki, w stosunku do całego ciała, ujawnionych przeciwciał anty-cd44 lub fragmentów, w porównaniu z ogólnoustrojowym, dożylnym podawaniem. Będzie to oczywiste dla specjalisty, że miejscowe podawanie może prowadzić do niższych dawek względem masy ciała, a w tych okolicznościach, wynikający z tego niski poziom w osoczu krążącej immunotoksyny byłby oczekiwany i pożądany. W takich przypadkach, przeciwciało anty-cd44 lub jego fragment wiążący antygen, jak ujawniono w opisie, można podawać do guza w całkowitej dawce na cykl równoważnej lub mniejszej od maksymalnej tolerowanej dawki ustalonej w badaniu bezpieczeństwa, ale dawkowanie normalizuje się w stosunku do objętości guza. W pewnych postaciach, dawka będzie podawana w objętości nie przekraczającej około -0% objętości guza. [0070] Wynalazek dostarcza również sposoby zmniejszania ryzyka powikłań pooperacyjnych, obejmujące podawanie skutecznej ilości przeciwciała anty-cd44, fragmentu lub kompozycji, jak ujawniono w opisie, przed, w trakcie lub po operacji chirurgicznej do leczenia HNSCC. [0071] Wynalazek dostarcza także sposoby zapobiegania wystąpieniu, zapobiegania lub opóźniania nawrotu lub zmniejszenia szybkości nawrotu HNSCC, obejmujące podawanie (np. bezpośrednie podawanie) potrzebującemu tego pacjentowi skutecznej ilości przeciwciała anty-cd44, fragmentu lub kompozycji, jak ujawniono w opisie. Bezpośrednie podawanie przeciwciała anty-cd44, fragmentu lub kompozycji, jak ujawniono w opisie, pacjentowi potrzebującemu takiego leczenia może spowodować, że zmniejszone dawki będą wykazywać istotną klinicznie skuteczność. Taka skuteczność zmniejszonej dawki innego przeciwnowotworowego środka terapeutycznego może nie być stwierdzona bez sposobów według wynalazku. Zgodnie z tym, niniejszy wynalazek dostarcza sposoby leczenia guza lub nowotworu obejmujące podawanie zmniejszonej dawki jednego lub większej liczby innych przeciwnowotworowych środków terapeutycznych. [0072] Wynalazek dostarcza także sposoby uwrażliwiania guza lub nowotworu na jeden lub większą liczbę innych przeciwnowotworowych środków terapeutycznych obejmujące podawanie przeciwciała anty-cd44, fragmentu lub kompozycji, jak ujawniono w opisie. W nieograniczającej postaci, inny przeciwnowotworowy środek terapeutyczny obejmuje znany w dziedzinie chemioterapeutyk o znanej aktywności przeciw HNSCC. W innej nieograniczającej postaci, inny przeciwnowotworowy środek terapeutyczny obejmuje napromienianie. Inny przeciwnowotworowy środek terapeutyczny może być podawany przed, w sposób nakładający się z, równocześnie z i/lub po podaniu przeciwciała anty-cd44, fragmentu lub kompozycji, jak ujawniono w opisie. Przy równoczesnym podawaniu, przeciwciało anty-cd44, fragment lub kompozycję, jak ujawniono w opisie, i inny przeciwnowotworowy środek terapeutyczny można podawać w jednym preparacie lub w oddzielnych preparatach, a w przypadku oddzielnych, to ewentualnie różnymi sposobami podawania. Zgodnie z tym połączenie jednej lub większej liczby immunotoksyn i jednego lub większej liczby innych przeciwnowotworowych środków terapeutycznych może oddziaływać synergicznie w celu zwalczenia guza lub nowotworu. [0073] Przeciwciała anty-cd44 do stosowania w sposobach według wynalazku, lub ich fragmenty wiążące antygen, mogą zawierać domenę VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:9 lub SEQ ID NO:, domenę VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:2 lub SEQ ID NO:11 i/lub jeden lub większą liczbę spośród CDR1 VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:3, CDR2 VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:4, CDR3 VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:, CDR1 VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:6, CDR2 VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:7 i CDR3 VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:8. W szczególnej postaci wynalazek obejmuje za-

21 stosowanie przeciwciała anty-cd44 lub jego fragmentu wiążącego antygen, zawierających domenę VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:1 oraz domenę VL obejmującą sekwencję SEQ ID NO:2. W innych postaciach wynalazek obejmuje zastosowanie przeciwciała anty-cd44 lub jego fragmentu wiążącego antygen, zawierających domenę VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:9 i domenę VL obejmującą sekwencję SEQ ID NO:11 albo zawierających domenę VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: i domenę VL obejmującą sekwencję SEQ ID NO:11. W pewnych postaciach wynalazek obejmuje zastosowanie przeciwciała anty-cd44 lub jego fragmentu wiążącego antygen, zawierających każdy z CDR1 VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:3, CDR2 VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:4, CDR3 VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:, CDR1 VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:6, CDR2 VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:7 i CDR3 VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:8. [0074] Przeciwciała anty-cd44 lub ich fragmenty wiążące antygen do stosowania w sposobach według wynalazku można (i) scharakteryzować pod kątem swoistego wiązania z CD44, w szczególności, z domeną końca aminowego regionu zewnątrzkomórkowego CD44; (ii) scharakteryzować pod kątem swoistego wiązania z epitopem domeny końca aminowego regionu zewnątrzkomórkowego CD44 o sekwencji aminokwasowej AFDGPITITIV (SEQ ID NO:12); lub (iii) scharakteryzować pod kątem współzawodnictwa o wiązanie z mysim przeciwciałem monoklonalnym PTA-4621 z zastosowaniem dowolnej metody na zasadzie immunologicznej lub biochemicznej znanej w dziedzinie do takiego charakteryzowania obejmującej oznaczanie ilościowe oddziaływania (swoistego) przeciwciała z CD44 lub jego epitopem. Swoiste lub kompetycyjne wiązanie przeciwciała według wynalazku z CD44 lub jego epitopem można określić przykładowo z zastosowaniem metod na zasadzie immunologicznej lub biochemicznej, w tym, lecz nie wyłącznie, testu ELISA, testów powierzchniowego rezonansu plazmonowego, testu immunoprecypitacji, chromatografii powinowactwa i równowagowej dializy. Testy immunologiczne obejmują, lecz nie wyłącznie, kompetycyjne i niekompetycyjne układy testowe z zastosowaniem takich technik jak western blot, testy radioimmunologiczne, ELISA (test immunoenzymatyczny), kanapkowe testy immunologiczne, testy immunoprecypitacji, reakcje z precypityną, reakcje z precypityną z dyfuzją w żelu, testy immunodyfuzyjne, testy aglutynacji, testy wiązania dopełniacza, testy immunoradiometryczne, fluorescencyjne testy immunologiczne, testy immunologiczne z białkiem A, wymieniając jedynie kilka. Takie testy są rutynowe i dobrze znane w dziedzinie. [007] Humanizowane przeciwciała według wynalazku można również oznaczyć stosując dowolne testy oparte na powierzchniowym rezonansie plazmonowym znane w dziedzinie do charakteryzowania parametrów kinetycznych oddziaływania przeciwciała z antygenem, np. CD44. Dowolny aparat do SPR dostępny w handlu można zastosować w niniejszym wynalazku, co jest znane w dziedzinie. [0076] Wynalazek rozważa ponadto zastosowanie CDMAB, np. przeciwciał anty-cd44 lub ich fragmentów wiążących antygen, z którymi związane są ugrupowania docelowe lub reporterowe. Ugrupowania docelowe są pierwszymi elementami par wiązania. Środki przeciwnowotworowe, przykładowo, sprzęga się z drugimi elementami takich par, a tym samym są one kierowane do miejsca, w którym związane jest białko wiążące antygen. Typowym przykładem takiej pary wiązania jest awidyna i biotyna. W korzystnej postaci, biotyna jest sprzężona z docelowym antygenem CDMAB według niniejszego wynalazku, a tym samym zapewnia cel dla środka przeciwnowotworowego lub innego ugrupowania, które jest sprzężone z awidyną lub streptawidyną. Alternatywnie biotyna lub inne takie ugrupowanie jest związane z docelowym antygenem CDMAB według niniejszego wynalazku i stosowane jako reporter, przykładowo w układzie diagnostycznym, w którym środek wytwarzający wykrywalny sygnał jest sprzężony z awidyną lub streptawidyną. Ponadto CDMAB zgodnie ze sposobami według wynalazku może być sprzężone ze środkiem terapeutycznym lub ugrupowaniem leku, który modyfikuje daną odpowiedź biologiczną.

22 Środków terapeutycznych lub ugrupowań leku nie należy rozumieć jako ograniczone do klasycznych chemicznych środków terapeutycznych. Przykładowo ugrupowanie leku może być białkiem lub polipeptydem wykazującym pożądaną aktywność biologiczną. Takie białka mogą obejmować przykładowo toksynę (np. abrynę, rycynę A, egzotoksynę Pseudomonas, toksynę błoniczą, rycynę, geloninę) i enzym, białko (np. czynnik martwicy nowotworu), interferon (np. α-interferon (IFN-α), β-interferon (IFN-β)), środek apoptotyczny, środek zakrzepowy, środek przeciwangiogenny (np. angiostatynę, endostatynę) lub modyfikator odpowiedzi biologicznej (np. limfokinę, czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów lub czynnik wzrostu), proteazę lub rybonukleazę. CDMAB do stosowania zgodnie ze sposobami według wynalazku może być również sprzężone z ugrupowaniami terapeutycznymi, takimi jak substancje promieniotwórcze lub makrocykliczne chelatory użyteczne do sprzęgania promieniotwórczych jonów metali. Typowym przykładem makrocyklicznego chelatora jest kwas 1,4,7,-tetraazacyklododekano-N,N',N,N - tetraoctowy (DOTA), który może być przyłączony do przeciwciała poprzez cząsteczkę łącznikową. Takie cząsteczki łącznikowe są powszechnie znane i rutynowo stosowane w dziedzinie. [0077] Znakowane przeciwciała, w szczególności ujawnione w opisie przeciwciała anty- CD44 lub ich fragmenty wiążące antygen, mogą być stosowane w sposobach według wynalazku do celów diagnostycznych lub prognostycznych, do wykrywania, diagnozowania lub monitorowania choroby nowotworowej. Opisane w opisie znaczniki są wykrywalnymi sygnałami sprzężonymi z przeciwciałem anty-cd44 lub jego fragmentem wiążącym antygen, do stosowania np. w sposobach diagnostycznych in vivo oraz in vitro według wynalazku. Środek wytwarzający sygnał wytwarza mierzalny sygnał, który jest wykrywalny zewnętrznymi środkami, zazwyczaj przez pomiar promieniowania elektromagnetycznego. W przeważającej części, środkiem wytwarzającym sygnał jest enzym albo chromofor lub radionuklid, albo emituje on światło drogą fluorescencji, fosforescencji lub chemiluminescencji. Chromofory obejmują barwniki, które pochłaniają światło w zakresie nadfioletu lub widzialnym, i mogą być substratami lub produktami rozkładu w reakcjach katalizowanych przez enzym. [0078] Ponadto zakresem niniejszego wynalazku objęte jest zastosowanie CDMAB in vivo oraz in vitro w sposobach badawczych lub diagnostycznych, które są dobrze znane w tej dziedzinie. W celu przeprowadzenia sposobów diagnostycznych rozważanych w opisie, niniejszy wynalazek może ponadto obejmować zestawy, które zawierają CDMAB użyteczne w niniejszym wynalazku. Takie zestawy będą użyteczne do identyfikacji osobników z ryzykiem pewnego typu nowotworów przez wykrywanie nadekspresji docelowego antygenu CDMAB na komórkach takiego osobnika. [0079] Przeciwciała użyteczne w praktykowaniu niniejszego wynalazku można stosować jako kompozycję do zapobiegania, leczenia lub diagnozowania nowotworu. Kompozycje te mają niską toksyczność i mogą być podawane jako takie w postaci preparatów ciekłych albo jako kompozycje farmaceutyczne odpowiednich preparatów, ludziom lub ssakom doustnie lub pozajelitowo (np. dożylnie, dootrzewnowo, podskórnie, itp.). Przeciwciała użyteczne w praktykowaniu niniejszego wynalazku mogą być podawane samodzielnie lub mogą być podawane w postaci odpowiednich kompozycji. Kompozycja stosowana do takiego podawania może zawierać farmakologicznie dopuszczalny nośnik z przeciwciałem lub jego solą, rozcieńczalnik lub zaróbkę. Taka kompozycja jest dostarczana w postaci preparatów farmaceutycznych odpowiednich do podawania doustnego lub pozajelitowego. [0080] Przykładami kompozycji do podawania pozajelitowego są preparaty do wstrzykiwań, czopki itp. Preparaty do wstrzykiwań mogą obejmować takie postacie dawkowane jak do wstrzykiwań dożylnych, podskórnych, śródskórnych i domięśniowych, wlewów kroplowych, wstrzykiwań dostawowych itp. Te preparaty do wstrzykiwań mogą być wytwarzane powszechnie znanymi sposobami. Przykładowo, preparaty do wstrzykiwań mogą być wytwarzane przez rozpuszczanie, przeprowadzanie w zawiesinę lub emulgowanie

23 przeciwciała według niniejszego wynalazku lub jego soli w jałowym wodnym ośrodku lub oleistym ośrodku standardowo stosowanym do wstrzykiwań. Jako wodny ośrodek do wstrzykiwań stosuje się przykładowo sól fizjologiczną, izotoniczny roztwór zawierający glukozę i inne pomocnicze środki, itp., które można stosować w połączeniu z odpowiednim środkiem solubilizującym, takim jak alkohol (np. etanol), polialkohol (np. glikol propylenowy, glikol polietylenowy), niejonowy środek powierzchniowo czynny (np. polisorbat 80, HCO-0 (polioksyetylenowy (0 moli) addukt uwodornionego oleju rycynowego)) itp. Jako ośrodek oleisty stosuje się np. olej sezamowy, olej sojowy itp., które można stosować w połączeniu ze środkiem solubilizującym, takim jak benzoesan benzylu, alkohol benzylowy itp. Wytworzonym w ten sposób preparatem do wstrzyknięć zazwyczaj napełnia się odpowiednią ampułkę. Czopek stosowany do podawania doodbytniczego można wytworzyć przez zmieszanie przeciwciała według niniejszego wynalazku lub jego soli ze standardowymi podłożami do czopków. Kompozycja do podawania doustnego obejmuje stałe i ciekłe preparaty, szczególnie tabletki (w tym drażetki i tabletki powlekane błoną), pigułki, granulaty, preparaty proszkowe, kapsułki (w tym miękkie kapsułki), syrop, emulsje, zawiesiny itp. Taką kompozycję wytwarza się powszechnie znanymi sposobami i może ona zawierać podłoże, rozcieńczalnik lub zaróbkę standardowo stosowane w dziedzinie preparatów farmaceutycznych. Przykładami podłoża lub zaróbki do tabletek są laktoza, skrobia, sacharoza, stearynian magnezu itp. [0081] Korzystnie z opisanych powyżej kompozycji do stosowania doustnego lub pozajelitowego wytwarza się preparaty farmaceutyczne o odpowiedniej dawce jednostkowej aby pasowała do dawki składników czynnych. Takie preparaty dawek jednostkowych obejmują przykładowo tabletki, pigułki, kapsułki, preparaty do wstrzykiwań (ampułki), czopki itp. [0082] Dawka wymienionego powyżej środka profilaktycznego/terapeutycznego, zawierającego przeciwciało zgodnie ze sposobami według niniejszego wynalazku, może zmieniać się zależnie od osobnika, któremu jest on podawany, docelowej choroby, warunków, drogi podawania itp. Przykładowo, gdy stosuje się je w celu leczenia/zapobiegania, np. HNSCC u dorosłego, korzystne jest podawanie przeciwciała według niniejszego wynalazku dożylnie w dawce około 0,0001 mg/kg do 0 mg/kg lub 0,0001 mg/kg do 0 mg/kg masy ciała pacjenta. W innych aspektach podawana pacjentowi dawka wynosi między 0,0001 mg/kg i mg/kg, 0,0001 mg/kg i mg/kg, 0,0001 mg/kg i mg/kg, 0,0001 i 2 mg/kg, 0,0001 i 1 mg/kg, 0,0001 mg/kg i 0,7 mg/kg, 0,0001 mg/kg i 0, mg/kg, 0,0001 mg/kg do 0,2 mg/kg, 0,0001 do 0,1 mg/kg, 0,0001 do 0, mg/kg, 0,001 do 0, mg/kg, 0,01 do 0,2 mg/kg lub 0,01 do 0, mg/kg masy ciała pacjenta. Na ogół ludzkie przeciwciała wykazują dłuższy okres półtrwania w organizmie człowieka niż przeciwciała z innych gatunków, ze względu na odpowiedź immunologiczną na obce polipeptydy. Tak więc, możliwe często jest niższe dawkowanie ludzkich przeciwciał i rzadsze podawanie. Ponadto, dawkowanie i częstotliwość podawania przeciwciał według wynalazku lub ich fragmentów mogą być zmniejszone przez zwiększenie wychwytu przeciwciał i ich przenikania przez tkanki drogą modyfikacji, takich jak przykładowo lipidacja. W innych aspektach przeciwciała według wynalazku stosuje się w połączeniu z innymi kompozycjami terapeutycznymi i dawka podawana osobnikowi jest niższa, niż wtedy gdy takie przeciwciała są stosowane jako terapia pojedynczym środkiem. [0083] Przedstawione tu dawkowane ilości i częstotliwości podawania są objęte określeniami terapeutycznie skuteczne i profilaktycznie skuteczne. Dawkowanie i częstotliwość będą ponadto zazwyczaj różnić się w zależności od czynników swoistych dla każdego pacjenta, zależnie od konkretnych podawanych środków terapeutycznych lub profilaktycznych, nasilenia, drogi podawania, jak również wieku, masy ciała, odpowiedzi i wywiadu medycznego pacjenta. Odpowiednie schematy mogą być wybrane przez specjalistę w dziedzinie z uwzględnieniem takich czynników i przez stosowanie się przykładowo do dawek podanych w literaturze i zalecanych w Physician's Desk Reference (6. wyd., 02). Dawka dobowa przeciwciała, fragmentu lub kompozycji według wynalazku może

24 być podawana jako pojedyncza dawka bolusowa lub podzielona na wiele dawek do dostarczenia w okresie 24 godzin. Alternatywnie całkowita dawka dobowa może być podawana przez wydłużony okres czasu, np. drogą wlewu, tak że całkowita dawka jest podawana przez 12 godzin, 6 godzin, 4 godziny, 2 godziny, 1, godziny, 1,0 godzinę, 4 minut, minut, 2 minut, minut, 1 minut, minut, 9 minut, 8 minut, 7 minut, 6 minut, minut, 4 minuty, 3 minuty, 2 minuty lub 1 minutę. Gdy stan jest szczególnie ciężki, dawka może być zwiększona zgodnie ze stanem. [0084] Przeciwciało do stosowania zgodnie ze sposobami według niniejszego wynalazku może być podawane jako takie lub w postaci odpowiedniej kompozycji. Kompozycja stosowana do podawania może zawierać farmakologicznie dopuszczalny nośnik z wspomnianym powyżej przeciwciałem lub jego solami, rozcieńczalnik lub zaróbkę. Taka kompozycja jest dostarczana w postaci preparatów farmaceutycznych odpowiednich do podawania doustnego lub pozajelitowego (np. wstrzyknięcia donaczyniowego, wstrzyknięcia podskórnego itp.). Każda z kompozycji opisanych powyżej może ponadto zawierać inne składniki czynne. Ponadto przeciwciało według niniejszego wynalazku może być stosowane w połączeniu z innymi lekami, przykładowo środkami alkilującymi (np. cyklofosfamid, ifosfamid itp.), antagonistami metabolicznymi (np. metotreksat, -fluorouracyl itp.), antybiotykami przeciwnowotworowymi (np. mitomycyna, adriamycyna itp.), środkami przeciwnowotworowymi pochodzenia roślinnego (np. winkrystyna, windezyna, Taxol, itp.), cisplatyną, karboplatyną, etopozydem, irynotekanem itp. Przeciwciało według niniejszego wynalazku i leki opisane powyżej można podawać jednocześnie lub z przesunięciem w czasie pacjentowi. Sposoby podawania humanizowanego przeciwciała według wynalazku obejmują, lecz nie wyłącznie, podawanie pozajelitowe (np. śródskórne, domięśniowe, dootrzewnowe, dożylne i podskórne), podtwardówkowe i śluzówkowe (np. drogą donosową i doustną). W szczególnej postaci, przeciwciała według wynalazku podaje się domięśniowo, dożylnie lub podskórnie. Kompozycje można podawać dowolną dogodną drogą, przykładowo przez wlew lub wstrzyknięcie bolusa, przez wchłanianie przez wyściółkę nabłonkową lub śluzówkowo-skórną (np. śluzówka jamy ustnej, śluzówka odbytnicy i jelita itp.) i można je podawać wraz z innymi środkami biologicznie czynnymi. Podawanie może być ogólnoustrojowe lub miejscowe. Dodatkowo można zastosować także podawanie dopłucne, np. przy użyciu inhalatora lub nebulizera i preparatu ze środkiem wytwarzającym aerozol. [008] Stosowane schematy środków chemioterapeutycznych/innych przeciwciał obejmują każdy schemat, który uważa się za optymalnie odpowiedni do leczenia stanu pacjenta. Różne stany złośliwe mogą wymagać zastosowania swoistych przeciwciał przeciwnowotworowych i swoistych środków chemioterapeutycznych, które będą określane dla każdego pacjenta. W korzystnej postaci według wynalazku, chemioterapię podaje się równocześnie z lub, korzystniej, po terapii przeciwciałem. Należy podkreślić jednak, że niniejszy wynalazek nie jest ograniczony do jakiegokolwiek konkretnego sposobu lub drogi podawania. [0086] Wszystkie opisy patentowe i publikacje podane w tym opisie wskazują na poziom specjalistów w dziedzinie, do której należy wynalazek. [0087] Specjalista w dziedzinie łatwo zauważy, że niniejszy wynalazek jest dobrze dostosowany do realizacji celów i uzyskania wspomnianych efektów i korzyści, jak również tych, które są tu nieodłączne. Jakiekolwiek opisane tu oligonukleotydy, peptydy, polipeptydy, biologicznie powiązane związki, sposoby, procedury i techniki obecnie reprezentują korzystne postacie, mają być przykładowe i nie mają stanowić ograniczeń zakresu. [0088] Ujawnienie obejmuje także następujące punkty: Punkt 1: Punkt 2: Sposób leczenia raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (HNSCC) u ssaka, obejmujący podawanie temu ssakowi przeciwciała monoklonalnego anty- CD44 lub jego fragmentu wiążącego antygen, w ilości skutecznej do wywoła- nia zmniejszenia całkowitej masy guza u tego ssaka. Sposób według punktu 1, w którym przeciwciałem monoklonalnym anty-

25 Punkt 3: Punkt 4: Punkt : Punkt 6: Punkt 7: Punkt 8: Punkt 9: Punkt : Punkt 11: Punkt 12. Punkt 13: Punkt 14: Punkt 1. Punkt 16: Punkt 17: Punkt 18: 24 CD44 jest ARH Sposób według punktu 2, w którym to przeciwciało monoklonalne jest sprzężone z ugrupowaniem cytotoksycznym. Sposób według punktu 1, w którym to przeciwciało monoklonalne jest humanizowaną wersją przeciwciała monoklonalnego wytwarzanego przez hybrydomę zdeponowaną w ATCC pod numerem dostępu PTA-4621 lub fragmentem wiążącym antygen wytworzonym z tego humanizowanego przeciwciała. Sposób według punktu 1, w którym to przeciwciało monoklonalne jest chimeryczną wersją przeciwciała monoklonalnego wytwarzanego przez hybrydomę zdeponowaną w ATCC pod numerem dostępu PTA-4621 lub fragmentem wiążącym antygen wytworzonym z tego chimerycznego przeciwciała. Zastosowanie przeciwciała monoklonalnego anty-cd44 lub jego fragmentu wiążącego antygen, do leczenia HNSCC u ssaka, obejmujące podawanie temu ssakowi tego przeciwciała monoklonalnego anty-cd44 lub jego fragmentu wiążącego antygen, w ilości skutecznej do wywołania zmniejszenia całkowitej masy guza u tego ssaka. Zastosowanie według punktu 6, w którym przeciwciałem monoklonalnym anty-cd44 jest ARH Zastosowanie według punktu 7, w którym to przeciwciało monoklonalne jest sprzężone z ugrupowaniem cytotoksycznym. Zastosowanie według punktu 6, w którym to przeciwciało monoklonalne jest humanizowaną wersją przeciwciała monoklonalnego wytwarzanego przez hybrydomę zdeponowaną w ATCC pod numerem dostępu PTA Zastosowanie według punktu 6, w którym to przeciwciało monoklonalne jest chimeryczną wersją przeciwciała monoklonalnego wytwarzanego przez hybrydomę zdeponowaną w ATCC pod numerem dostępu PTA Sposób leczenia HNSCC u ssaka obejmujący podawanie temu ssakowi przeciwciała monoklonalnego anty-cd44 lub jego fragmentu wiążącego antygen; łącznie z co najmniej jednym środkiem chemioterapeutycznym w ilości skutecznej do wywołania zmniejszenia całkowitej masy guza u tego ssaka. Sposób według punktu 13, w którym przeciwciałem monoklonalnym anty- CD44 jest ARH Sposób według punktu 14, w którym to przeciwciało monoklonalne lub CDMAB jest sprzężone z tym środkiem chemioterapeutycznym. Sposób według punktu 1, w którym tym środkiem chemioterapeutycznym jest ugrupowanie cytotoksyczne. Sposób według punktu 11, w którym to przeciwciało monoklonalne jest humanizowaną wersją przeciwciała monoklonalnego wytwarzanego przez hybrydomę zdeponowaną w ATCC pod numerem dostępu PTA Sposób według punktu 11, w którym to przeciwciało monoklonalne jest chimeryczną wersją przeciwciała monoklonalnego wytwarzanego przez hybrydomę zdeponowaną w ATCC pod numerem dostępu PTA Kompozycja skuteczna do leczenia HNSCC zawierająca w połączeniu: przeciwciało monoklonalne anty-cd44 wytwarzane przez hybrydomę zdeponowaną w ATCC pod numerem dostępu PTA-4621 lub jego fragment wiążący antygen; i wymaganą ilość farmakologicznie dopuszczalnego nośnika; przy czym ta kompozycja jest skuteczna do leczenia tego HNSCC. Kompozycja według punktu 17, zawierająca ponadto konigat tego przeciwciała monoklonalnego lub jego fragmentu wiążącego antygen, z elementem wybranym z grupy obejmującej ugrupowania cytotoksyczne, enzymy, związki promieniotwórcze, cytokiny, interferony, ugrupowania docelowe lub reporterowe i komórki hematopoetyczne.

26 Punkt 19: Zestaw testowy do wykrywania obecności HNSCC, przy czym ten HNSCC eksprymuje co najmniej jeden epitop antygenu, który swoiście wiąże się z przeciwciałem monoklonalnym wytwarzanym przez hybrydomę zdeponowaną w ATCC pod numerem dostępu PTA-4621 lub jego fragmentem wiążącym antygen, który to zestaw zawiera przeciwciało monoklonalne wytwarzane przez hybrydomę zdeponowaną w ATCC pod numerem dostępu PTA-4621 lub jego fragment wiążący antygen, związane z polipeptydem, którego obecność, na określonym poziomie odcięcia, umożliwia diagnozę tej obecności tego HNSCC. [0089] Aby opisany w opisie wynalazek mógł być pełniej zrozumiany, przedstawiono poniższe nieograniczające przykłady. PRZYKŁADY PRZYKŁAD 1 Wiązanie in vitro z liniami komórkowymi HNSCC [0090] Chimeryczne i humanizowane wersje PTA-4621 opracowano jak ujawniono w opisie. Chimeryczne PTA-4621 ( chpta-4621 ) zawiera domeny VH i VL o sekwencji aminokwasowej odpowiednio SEQ ID NO:1 i SEQ ID NO:2. Opracowano dwie humanizowane wersje PTA-4621 (hupta-4621), mające niewielkie różnice w sekwencji aminokwasowej ich domen zmiennych łańcucha ciężkiego. hupta-4621 zawiera domenę VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:9 lub SEQ ID NO: i domenę VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:11. Powinowactwo wiązania antygenu i awidność obu wersji hupta-4621 były nieodróżnialne przy stosowaniu standardowych testów znanych w dziedzinie. [0091] Wiązanie chpta-4621 i hupta-4621 z liniami komórkowymi HNSCC T.Tn, SCC-1, Detroit-62 i CALL 27, oceniono metodą cytometrii przepływowej (FACS). Komórki przygotowano do FACS przez początkowe przemycie monowarstwy komórek DPBS (bez Ca ++ i Mg ++ ). Następnie zastosowano bufor do rozdzielania komórek (INVITROGEN, Burlington, ON; w przypadku T.Tn, SCC-1 i Detroit-62) lub roztwór do odczepiania komórek ACCUTASE (SIGMA, St. Lois, MO, USA, w przypadku CAL 27) w celu usunięcia komórek z ich płytek do hodowli komórkowych w 37 C. Po odwirowaniu i zebraniu, komórki ponownie przeprowadzono w zawiesinę w DPBS zawierającej MgCl2, CaCl2 i 2 procent (T.Tn, SCC-1 i Detroit-62) lub 3 procent (CAL 27) płodowej surowicy bydlęcej w 4 C (ośrodek do barwienia) i zliczono, podzielono na porcje o odpowiedniej gęstości komórek, odwirowano do uzyskania osadu komórek i ponownie przeprowadzono w zawiesinę w ośrodku do barwienia w 4 C w obecności badanych przeciwciał (chimeryczne lub humanizowane PTA-4621) lub przeciwciał kontrolnych (kontrola izotypowa, anty-egfr (C22; T.Tn, SCC-1 i Detroit-62) lub anty-cd (RITUXAN ; CAL27). Kontrolę izotypową i badane przeciwciała oznaczano w stężeniu µg/ml na lodzie przez minut. W celu wykrycia związanego przeciwciała w przypadku komórek T.Tn, SCC-1 i Detroit-62 zastosowano drugorzędowe przeciwciało sprzężone z Alexa Fluor 46, a w testach z CLA 27 zastosowano drugorzędowe przeciwciało sprzężone z APC. Przed dodaniem drugorzędowego przeciwciała, komórki przemyto raz ośrodkiem do barwienia. Następnie dodano drugorzędowe przeciwciało w ośrodku do barwienia zgodnie ze wskazówkami producenta. Komórki następnie przemyto ostatni raz i ponownie przeprowadzono w zawiesinę w ośrodku utrwalającym (ośrodek do barwienia zawierający 1,% paraformaldehyd). Zbieranie metodą cytometrii przepływowej komórek T.Tn, SCC- 1 i Detroit-62 wykonano przepuszczając próbki w FACScan stosując oprogramowanie CellQuest (BD Biosciences, Oakville, ON), podczas gdy zbieranie komórek CAL 27 zbadano przepuszczając próbki w LSR-II stosując oprogramowanie systemu Diva 6 (BD Biosciences, Rockville, MD USA). Rozproszenie przednie (FSC) i boczne (SSC) dla komórek ustawiono dostosowując przyrosty napięcia i amplitudy w detektorach FSC i SSC. Detektory kanału fluorescencji (FITC lub APC) dostosowano przepuszczając komórki niewy-

27 barwione (CAL 27) lub wybarwione tylko drugorzędowym przeciwciałem sprzężonym z Alexa Fluor 46 (T.Tn, SCC-1 i Detroit-62), tak że komórki miały jednakowy pik z medianą intensywności fluorescencji około 1- jednostek. Dla każdej próbki, zebrano około 000 wybarwionych utrwalonych komórek do analizy, a wyniki przedstawiono na Figurze 1A-B. [0092] Podsumowując, otrzymane dane pokazują, że chimeryczne i humanizowane wersje PTA-4621 wiążą się z liniami komórkowymi T.Tn, SCC-1 i Detroit-62 (Fig. 1A) oraz CAL 27 (Fig. 1B). PRZYKŁAD 2 Eksperyment in vivo z ludzkimi komórkami T.Tn [0093] W celu wykazania skuteczności przeciw linii komórkowej ludzkiego raka HNSCC in vivo, chimeryczne PTA-4621 (chpta-4621) zbadano w ustalonym modelu heteroprzeszczepu HNSCC T.Tn. W odniesieniu do Figur 2 i 3, samicom myszy SCID w wieku 6 do 8 tygodni wszczepiono milionów komórek T.Tn w 0 mikrolitrach roztworu PBS wstrzykniętych podskórnie w prawy bok. Myszy losowo podzielono na 2 grupy leczone po zwierząt. Gdy średnia objętość guza u myszy osiągnęła w przybliżeniu mm 3, mg/kg badanego przeciwciała chpta-4621 lub buforu jako kontroli podano dootrzewnowo każdej kohorcie w objętości 0 mikrolitrów po rozcieńczeniu począwszy od stężenia roztworu podstawowego rozcieńczalnikiem zawierającym 2,7 mm KCl, 1 mm KH2PO4, 137 mm NaCl i mm Na2HPO4. Przeciwciało i próbki kontrolne podawano następnie 3 razy w tygodniu przez okres trwania badania. Wzrost guza mierzono co około 7 dni przy użyciu suwmiarki. Badanie zakończono po dawkach przeciwciała. Masę ciała zwierząt rejestrowano raz na tydzień przez okres trwania badania. Pod koniec badania wszystkie zwierzęta poddano eutanazji zgodnie z wytycznymi CCAC. [0094] chpta-4621 zmniejszyło wzrost guza w ustalonym modelu ludzkiego HNSCC in vivo T.Tn. Leczenie przeciwciałem chpta-4621 zmniejszyło wzrost guzów T.Tn o 4,9 procent (p=0,0068, test t) w porównaniu z grupą traktowaną buforem, co określono w dniu, ostatnim dniu okresu badania (Figura 2). [009] W całym badaniu nie stwierdzono klinicznych oznak toksyczności. Masa ciała mierzona w tygodniowych odstępach stanowiła zmienną zastępczą dobrostanu oraz braku prawidłowego wzrostu i rozwoju (Figura 3). Nie występowała istotna różnica średniej masy ciała między grupami pod koniec okresu leczenia. Nie występowała również istotna różnica średniej masy ciała w każdej z grup od rozpoczęcia do końca badania. [0096] Podsumowując, chpta-4621 było dobrze tolerowane i znacznie zmniejszyło całkowitą masę guza w tym modelu heteroprzeszczepu ludzkiego HNSCC. PRZYKŁAD 3 Eksperyment in vivo z ludzkimi komórkami SCC-1 [0097] W celu wykazania skuteczności przeciw linii komórkowej ludzkiego raka HNSCC in vivo, humanizowane PTA-4621 (hupta-4621) zbadano w modelu heteroprzeszczepu HNSCC SCC-1. W odniesieniu do Figur 4 i, samicom myszy SCID w wieku 6 do 8 tygodni wszczepiono 3 miliony komórek SCC-1 w 0 mikrolitrach roztworu PBS wstrzykniętych podskórnie w prawy bok. Myszy losowo podzielono na 2 grupy leczone po zwierząt. Gdy średnia objętość guza u myszy osiągnęła w przybliżeniu mm 3, mg/kg badanego przeciwciała hupta-4621 lub buforu HNT jako kontroli podano dootrzewnowo każdej kohorcie w objętości 0 mikrolitrów po rozcieńczeniu począwszy od stężenia roztworu podstawowego rozcieńczalnikiem zawierającym mm Histydynę HCl, 10 mm NaCl i 0,01% polisorbat 80, Ph 6,0. Przeciwciało i próbki kontrolne podawano następnie raz na tydzień przez okres trwania badania. Wzrost guza mierzono co około 7 dni przy użyciu suwmiarki. Badanie zakończono po 4 dawkach przeciwciała. Masę ciała zwierząt rejestrowano raz na tydzień przez okres trwania badania. Pod koniec badania wszystkie zwierzęta poddano eutanazji zgodnie z wytycznymi CCAC. [0098] hupta-4621 zmniejszyło wzrost guza w ustalonym modelu ludzkiego HNSCC in

28 vivo SCC-1. Leczenie przeciwciałem hupta-4621 zmniejszyło wzrost guzów SCC-1 o 44, procent (p=0,0379, test t) w porównaniu z grupą traktowaną buforem, co określono w dniu 23, ostatnim dniu okresu badania (Figura 4). [0099] W całym badaniu nie stwierdzono klinicznych oznak toksyczności. Masa ciała mierzona w tygodniowych odstępach stanowiła zmienną zastępczą dobrostanu oraz braku prawidłowego wzrostu i rozwoju (Figura ). Nie występowała istotna różnica średniej masy ciała między grupami pod koniec okresu leczenia. Nie występowała również istotna różnica średniej masy ciała w każdej z grup od rozpoczęcia do końca badania. [00] Podsumowując, hupta-4621 było dobrze tolerowane i znacznie zmniejszyło całkowitą masę guza w tym modelu heteroprzeszczepu ludzkiego HNSCC. PRZYKŁAD 4 Eksperyment in vivo z ludzkimi komórkami Detroit 62 [01] W celu wykazania skuteczności przeciw linii komórkowej ludzkiego raka HNSCC in vivo, hupta-4621 zbadano w modelu heteroprzeszczepu HNSCC Detroit 62. W odniesieniu do Figur 6 i 7, samicom myszy SCID w wieku 6 do 8 tygodni wszczepiono 3 miliony komórek Detroit 62 w 0 mikrolitrach roztworu PBS wstrzykniętych podskórnie w prawy bok. Myszy losowo podzielono na 2 grupy leczone po zwierząt. Gdy średnia objętość guza u myszy osiągnęła w przybliżeniu mm 3, mg/kg badanego przeciwciała hupta-4621 lub buforu jako kontroli podano dootrzewnowo każdej kohorcie w objętości 0 mikrolitrów po rozcieńczeniu począwszy od stężenia roztworu podstawowego rozcieńczalnikiem zawierającym mm Histydynę HCl, 10 mm NaCl i 0,01% polisorbat 80, Ph 6,0. Przeciwciało i próbki kontrolne podawano następnie raz na tydzień przez okres trwania badania. Wzrost guza mierzono co około 7 dni przy użyciu suwmiarki. Badanie zakończono po dawkach przeciwciała. Masę ciała zwierząt rejestrowano raz na tydzień przez okres trwania badania. Pod koniec badania wszystkie zwierzęta poddano eutanazji zgodnie z wytycznymi CCAC. [02] hupta-4621 zmniejszyło wzrost guza w ustalonym modelu ludzkiego HNSCC in vivo Detroit 62. Leczenie przeciwciałem hupta-4621 zmniejszyło wzrost guzów T.Tn o 2,1 procent (p=0,029, test t) w porównaniu z grupą traktowaną buforem, co określono w dniu 42, ostatnim dniu okresu badania (Figura 6). [03] W całym badaniu nie stwierdzono klinicznych oznak toksyczności. Masa ciała mierzona w tygodniowych odstępach stanowiła zmienną zastępczą dobrostanu oraz braku prawidłowego wzrostu i rozwoju (Figura 7). Nie występowała istotna różnica średniej masy ciała między grupami pod koniec okresu leczenia. Nie występowała również istotna różnica średniej masy ciała w każdej z grup od rozpoczęcia do końca badania. [04] Podsumowując, hupta-4621 było dobrze tolerowane i znacznie zmniejszyło całkowitą masę guza w tym modelu heteroprzeszczepu ludzkiego HNSCC. PRZYKŁAD Eksperyment in vivo z ludzkimi komórkami CAL 27 [0] W celu wykazania skuteczności przeciw linii komórkowej ludzkiego raka HNSCC in vivo, hupta-4621 zbadano w modelu heteroprzeszczepu HNSCC CAL 27 obejmującym myszy nagie (NU/J, nr inwentarza: 0019, Jackson Laboratories) z wszczepionymi komórkami CAL27 (ATCC CRL-9). Komórki CAL 27 hodowano w DMEM (ATCC, nr katalogowy -02) z dodatkiem % FBS (ATCC nr katalogowy -) w butelkach 7 mm 2 w 37 C w atmosferze powietrza z % CO2 do osiągnięcia przez komórki konfluencji. Ludzkie komórki CAL 27 odklejono z butelek hodowlanych stosując 0,2% (wag./obj.) trypsynę (Invitrogen, nr katalogowy 20), zliczono, rozpuszczono w PBS i wstrzyknięto podskórnie w środkowy obszar grzbietu myszy nagich w wieku 7 tygodni w dawce 3x 6 komórek/zwierzę z Matrigel (BD Biosciences, nr katalogowy 34248) w objętości 0,2 ml (0 µl komórek w PBS + 0 µl Matrigel). Po wstrzyknięciu komórek pozostawiono je przez okres dwóch tygodni, aby umożliwić wytworzenie grudek guza. Objętość guzów (mm 3 ) zmierzono przy użyciu cyfrowej suwmiarki (VWR, nr katalogowy

29 ) i oszacowano z użyciem wzoru dla elipsoidy [π/6]xaxb 2, gdzie a i b oznaczają pierwszy i drugi z największych prostopadłych pomiarów guza w mm. Gdy objętość guza osiągnęła mm 3, zwierzęta zrandomizowano do dwóch grup (n=). Przeciwciało monoklonalne hupta-4621 i ludzką IgG1 (Sigma, 114) podawano w dawce 3 mg/kg przez wstrzyknięcie dootrzewnowe 3 razy w tygodniu w sumie w dawkach. Grudki guza monitorowano trzy razy w tygodniu przy użyciu cyfrowej suwmiarki. Aktywność przeciwnowotworową określono w odniesieniu do hamowania wzrostu guza pierwotnego przez obliczenie względnej objętości guza (RTV) zgodnie z następującym wzorem: RTV=TVn/TV0, gdzie TVn oznacza objętość guza w dniu n, a TV0 oznacza objętość guza w dniu 0. Wielkość guza obserwowano do dnia 27. Po 27 dniach terapii określono T/C% przez obliczenie RTV jako T/C%=0x (średnia RTV w grupie leczonej)/(średnia RTV w grupie kontrolnej). Stwierdzono 60% zahamowanie wzrostu guza w grupie leczonej przeciwciałem (Figura 8), co wskazuje, że leczenie było skuteczne w uwalnianiu od całkowitej masy guza (P<0,0002). [06] Te dane jasno wykazują, że hupta-4621 wykazuje znaczną aktywność terapeutyczną przeciw heteropszeszczepom guzów CAL 27 badanych w tym badaniu. PRZYKŁAD 6 Eksperyment in vivo z ludzkimi komórkami CAL 27 [07] W celu porównania skuteczności terapii przeciwciałem PTA-4621 ze standardowym leczeniem chemioterapeutycznym, układ modelowy opisany w Przykładzie zastosowano do porównania terapii PTA-4621 z leczeniem cisplatyną. Komórki CAL 27 hodowano i zebrano jak opisano w Przykładzie. Model heteropszeszczepu CAL 27 utworzono przez wstrzyknięcie podskórne myszom nagim w wieku 7 tygodni (NU/J, nr inwentarza: 0019, Jackson Laboratories) w środkowy obszar grzbietu X 6 komórek CAL 27 w 0 µl D-PBS z 0 µl Matrigel. 18 dni po zaszczepieniu, myszy oceniono pod kątem utworzenia guzów i zrandomizowano do 3 grup (w każdej kohorcie, n=6): leczenia hup- TA-4621, leczenia cisplatyną lub kontrolnej (traktowanie niezwiązanym kontrolnym przeciwciałem IgG1). Objętość guzów (mm 3 ) zmierzono przy użyciu cyfrowej suwmiarki (VWR, nr katalogowy ) i oszacowano z użyciem wzoru dla elipsoidy: [π/6]xaxb 2, gdzie a i b oznaczają pierwszy i drugi z największych prostopadłych pomiarów guza w mm. Podczas randomizacji średnia objętość guza wynosiła 84 mm 3 (zakres mm 3 ). [08] Podczas randomizacji zwierzętom podano i.p. badane lub kontrolne przeciwciało w dawce 3 mg/kg lub cisplatynę w dawce 0,7 mg/kg. Podawana objętość dla wszystkich podań wynosiła 6,6 ml/kg. Podawanie przeciwciała i kontroli wykonywano następnie 3 razy w tygodniu przez pierwszy i trzeci tydzień i dwa razy w tygodniu przez drugi tydzień, co daje w sumie osiem podań. Tydzień po ostatnim podaniu, zwierzęta poddano eutanazji zgodnie z wytycznymi CCAC; badanie zakończono w dniu 46. Wzrost guza i masę ciała mierzono trzy razy w tygodniu przez cały okres badania. [09] Aktywność przeciwnowotworową określono w odniesieniu do hamowania wzrostu guza pierwotnego przez obliczenie względnej objętości guza (RTV) zgodnie z następującym wzorem: RTV=TVn/TV0, gdzie TVn oznacza objętość guza w dniu n, a TV0 oznacza objętość guza w dniu 0. Wielkość guza obserwowano do dnia 46. Po zakończeniu badania określono T/C% przez obliczenie RTV jako T/C%=0x (średnia RTV w grupie leczonej)/(średnia RTV w grupie kontrolnej). Stwierdzono 86% zahamowanie wzrostu guza w grupie leczonej przeciwciałem (Figura 9), co wskazuje, że leczenie było skuteczne w uwalnianiu od całkowitej masy guza (p=0,024). Nie obserwowano istotnego hamowania wzrostu w grupie leczonej cisplatyną w porównaniu z kontrolą (Figura 9). Zgodnie z tym, hupta-4621 zmniejszyło wzrost guza w ustalonym modelu ludzkiego HNSCC in vivo CAL 27. [01] Nie występowała istotna różnica średniej masy ciała między grupami pod koniec okresu leczenia. Nie występowała również istotna różnica średniej masy ciała w każdej z

30 29 1 grup od rozpoczęcia do końca badania (Figura ). Jedno zwierzę w grupie kontrolnej IgG1 uśmiercono w dniu 26 z powodu osiągnięcia punktów końcowych IACUC dla zakończenia badania. [0111] Podsumowując, hupta-4621 było dobrze tolerowane i znacznie zmniejszyło całkowitą masę guza w stosunku do standardowych chemioterapeutyków (cisplatyna) w tym modelu heteroprzeszczepu ludzkiego HNSCC. WYKAZ SEKWENCJI [0112] <1> F. Hoffmann-La Roche AG The University of Miami - Dept. of Medicine <1> SPOSOBY LECZENIA RAKA PŁASKONABŁONKOWEGO GŁOWY I SZYI <1> 2683 WO <10> US 61/1449 <11> <160> 12 <170> Patent In wersja 3.2 <2> 1 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <0> 1 2 <2> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens

31 <0> 2 <2> 3 <211> <212> PRT <213> Homo sapiens <0> 3 <2> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <0> <2> <211> 1 <212> PRT <213> Homo sapiens <0> <2> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <0> 6 <2> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens

32 31 <0> 7 <2> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <0> 8 <2> 9 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <0> 9 1 <2> <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens

33 32 <0> <2> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <0> 11 <2> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <0> 12

34 33 Zastrzeżenia patentowe Zastosowanie przeciwciała monoklonalnego anty-cd44 lub jego fragmentu wiążącego antygen, do wytwarzania leku do leczenia raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (HNSCC) u ssaka, przy czym ten HNSCC charakteryzuje się ekspresją CD44, przy czym to przeciwciało zawiera (a) CDR1 VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:3, CDR2 VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:4, CDR3 VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:, CDR1 VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:6, CDR2 VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:7 oraz CDR3 VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:8; lub (b) domenę VH o sekwencji aminokwasowej, która jest w co najmniej 8% identyczna z domeną VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:9 lub SEQ NO: oraz domenę VL o sekwencji aminokwasowej, która jest w co najmniej 8% identyczna z domeną VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:11; przy czym to przeciwciało współzawodniczy o wiązanie z CD44 z przeciwciałem wytwarzanym przez hybrydomę zdeponowaną w ATCC pod numerem dostępu PTA Przeciwciało monoklonalne anty-cd44 lub jego fragment wiążący antygen, do stosowania do leczenia raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (HNSCC) u ssaka, przy czym ten HNSCC charakteryzuje się ekspresją CD44, przy czym to przeciwciało zawiera (a) CDR1 VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:3, CDR2 VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:4, CDR3 VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:, CDR1 VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:6, CDR2 VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:7 oraz CDR3 VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:8; lub (b) domenę VH o sekwencji aminokwasowej, która jest w co najmniej 8% identyczna z domeną VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:9 lub SEQ NO: oraz domenę VL o sekwencji aminokwasowej, która jest w co najmniej 8% identyczna z domeną VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: 11; przy czym to przeciwciało współzawodniczy o wiązanie z CD44 z przeciwciałem wytwarzanym przez hybrydomę zdeponowaną w ATCC pod numerem dostępu PTA Zastosowanie według zastrzeżenia 1 albo przeciwciało lub fragment do stosowania według zastrzeżenia 2, przy czym to przeciwciało anty-cd44 jest chimeryczną wersją przeciwciała monoklonalnego wytwarzanego przez hybrydomę zdeponowaną w ATCC pod numerem dostępu PTA Zastosowanie według zastrzeżenia 1 albo przeciwciało lub fragment do stosowania według zastrzeżenia 2, przy czym to przeciwciało anty-cd44 jest humanizowaną wersją przeciwciała monoklonalnego wytwarzanego przez hybrydomę zdeponowaną w ATCC pod numerem dostępu PTA Zastosowanie według zastrzeżenia 1 albo 3, albo przeciwciało lub fragment do stosowania według zastrzeżenia 2 albo 3, przy czym to przeciwciało anty-cd44 zawiera domenę VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:1. 6. Zastosowanie według zastrzeżenia 1, 3 albo, albo przeciwciało lub fragment do stosowania według zastrzeżenia 2, 3 albo, przy czym to przeciwciało anty-cd44 zawiera domenę VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:2. 7. Zastosowanie według zastrzeżenia 1 albo 4, albo przeciwciało lub fragment do stoso-

35 34 1 wania według zastrzeżenia 1 albo 4, przy czym to przeciwciało anty-cd44 zawiera domenę VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:9 lub SEQ ID NO:. 8. Zastosowanie według zastrzeżenia 1, 4 albo 7, albo przeciwciało lub fragment do stosowania według zastrzeżenia 1, 4 albo 7, przy czym to przeciwciało anty-cd44 zawiera domenę VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: Zastosowanie według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 i 3-8, albo przeciwciało lub fragment do stosowania według któregokolwiek z zastrzeżeń 2-8, przy czym to przeciwciało lub fragment jest sprzężone(-y) z ugrupowaniem terapeutycznym lub reporterowym, albo komórkami hematopoetycznymi.. Zastosowanie humanizowanego przeciwciała anty-cd44 lub jego fragmentu wiążącego antygen, do wytwarzania leku do leczenia raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (HNSCC) u człowieka, przy czym ten HNSCC charakteryzuje się ekspresją CD44 i przy czym to humanizowane przeciwciało zawiera domenę VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:9 oraz domenę VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: 11, albo zawiera domenę VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: oraz domenę VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: Humanizowane przeciwciało anty-cd44 lub jego fragment wiążący antygen, do stosowania do leczenia raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (HNSCC) u człowieka, przy czym ten HNSCC charakteryzuje się ekspresją CD44 i przy czym to humanizowane przeciwciało zawiera domenę VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:9 oraz domenę VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: 11 albo zawiera domenę VH o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: oraz domenę VL o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: 11. Uprawnieni: F.Hoffmann-La Roche AG University of Miami Pełnomocnik: mgr inż. Agnieszka Marszałek Rzecznik patentowy

36 3

37 36

38 37

39 38

40 39

41

42 41

43 42

44 43

45 44

46 4

47 46

48 47