(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 13/47 EP B1 (13) (51) T3 Int.Cl. A61K 39/395 (06.01) A61K 45/06 (06.01) A61K 31/663 (06.01) C07K 16/18 (06.01) G01N 33/68 (06.01) (54) Tytuł wynalazku: Kompozycje i sposoby zastosowania przeciwciał przeciw sklerostynie (30) Pierwszeństwo: EP EP EP (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr /27 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 14/05 (73) Uprawniony z patentu: Novartis AG, Basel, CH (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 MICHAELA KNEISSEL, Basel, CH CHRISTINE HALLEUX, Dornach, CH SHOU-IH HU, New Providence, US BEATE DIEFENBACH-STREIBER, Windach, DE JOSEF PRASSLER, Germering, DE (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Sebastian Walkiewicz LDS ŁAZEWSKI DEPO I WSPÓLNICY SP.K. ul. Okopowa 58/ Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 1 Z-11635/13 EP B Kompozycje i sposoby zastosowania przeciwciał przeciw sklerostynie Opis Dziedzina techniki wynalazku [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy przeciwciał przeciw sklerostynie oraz kompozycji i sposobów zastosowania takich przeciwciał do leczenia zaburzeń patologicznych, w których pośredniczy sklerostyna lub chorób związanych z zaburzeniami kostnymi, takich jak osteoporoza. Tło wynalazku [0002] Gen SOST koduje białko o nazwie sklerostyna, które jest wydzielaną 213- aminokwasową glikoproteiną. Sklerostyna jest członkiem nadrodziny czynników zawierających węzeł cystynowy. Sklerostyna jest związana z rodziną białek DAN/Cerberus, oddziałujących bezpośrednio na sygnalizację BMP poprzez hamowanie wiązania BMP z receptorami, a zatem kaskady sygnałowej BMP (Avsian-Kretchmer, Mol Endocrinol 04, 18 (1):1-12). [0003] Ekspresję mrna sklerostyny wykrywa się u dorosłych ludzi, głównie w kościach i nerkach. Białko to jest możliwe do wykrycia głównie w kościach. W kościach ekspresja sklerostyny jest ograniczona do dojrzałych i końcowo zróżnicowanych komórek tworzących kości, osteocytów. [0004] Sklerostyna jest silnie negatywnym regulatorem tworzenia kości u ludzi i myszy. Brak ekspresji SOST prowadzi do sklerosteozy (Balemans i wsp. Hum Mol Genet., 01, (5):537-43; Brunkow i wsp. Am J Hum Genet, 01, 68 (3):577-89). Pacjenci cierpią na dożywotni przerost kości powodujący wzrost gęstości mineralnej i wytrzymałości kości. Nie wykazują oni żadnych innych zaburzeń endokrynologicznych - wszystkie powikłania, których doświadczają w okresie całego życia są związane z nieprawidłową akumulacją kości. U heterozygotycznych nosicieli tego recesywnego zaburzenia obserwuje się również zwiększenie masy kostnej (Gardner i wsp. J Clin Endocrinol Metab, 05, 90(12):6392-5). Ten fenotyp może wystąpić u myszy bez SOST, a skutkiem nadekspresji jest osteopenia. Ponadto, choroba Van Buchema [MIM 2390] - fenotypowa kopia sklerosteozy - jest spowodowana nieprawidłową regulacją SOST wywołaną genomową delecją enhancera dystalnego kości (Balemans i wsp. J Med Gene, 02, 39(2):91-7; Loots i wsp., Genome Res, 05, (7):928-35). Ostatecznie, obserwuje

3 się hamowanie SOST przez hormon przytarczyc (potwierdzona klinicznie zasada tworzenia kości) podczas kościotworzenia, co sugeruje, że SOST może pośredniczyć w części anabolicznego działania PTH (Keller i Kneissel Bone, 05, 37(2):148-58). [0005] Sklerostyna wiąże białka BMP (morfogenetyczne białka kości) i może działać jako antagonista BMP in vitro (Winkler i wsp. EMBO J., 03, 22 (23): ). Sklerostyna działa również jako negatywny regulator kanonicznej ścieżki sygnałowej Wnt, albo bezpośrednio przez wiązanie się z LRP5/LRP6 (Li i wsp. J Biol Chem., 05, ;280(); Semenov, J Biol Chem. 06 Oct 19; van Bezooijen i wsp. J Bone Miner Res, 06, Oct ), albo pośrednio (Winkler i wsp. J Biol Chem., 05, 28;280(4): ). [0006] Brak ekspresji sklerostyny powoduje wzrost kościotworzenia przy niezakłóconej resorpcji kości (sklerosteoza, choroba van Buchema) (Balemans i wsp. 01; Brunkow i wsp. Am J Hum Genet, 01, 68(3):577-89, Balemans i wsp. 06; Loots i wsp., Genome Res, 05, (7):928-35). [0007] W kilku z obecnie dostępnych sposobów leczenia chorób kości można zwiększać gęstość kości u dorosłych, a większość obecnie dostępnych terapii polega głównie na hamowaniu dalszej resorpcji raczej niż stymulowaniu tworzenia nowych kości. [0008] Jednym z przykładów leku stosowanego do leczenia utraty masy kostnej jest estrogen. Jednak nie jest jasne, czy estrogen wywiera jakiekolwiek korzystne działanie długoterminowe. Ponadto estrogen może prowadzić do zwiększenia ryzyka wystąpienia różnych typów nowotworów, takich jak rak piersi i rak endometrium. Inne obecne podejścia do leczenia osteoporozy obejmują bisfosfoniany (na przykład Fosamax, Actonel, Bonviva, Zometa, olpadronian, nerydronian, skelid, bonefos), hormon przytarczyc, kalcylityks, kalcymimetyki (na przykład cynakalcet), statyny, sterydy anaboliczne, sole lantanu i strontu oraz fluorek sodu. Takie środki lecznicze są jednak często związane z działaniami niepożądanymi. Streszczenie wynalazku [0009] Wynalazek dostarcza przeciwciało przeciw sklerostynie zawierające sekwencję polipeptydową regionu zmiennego łańcucha ciężkiego zawierającą SEQ ID NO: 70 i sekwencję polipeptydową regionu zmiennego łańcucha lekkiego zawierającą SEQ ID NO: 81. [00] Wariant ujawniony w niniejszym dokumencie dostarcza przeciwciała lub białka funkcjonalnego zawierającego część wiążącą antygen tego przeciwciała, skierowanych przeciwko polipeptydowi sklerostyny (SEQ ID NO: 5), i charakteryzuje się tym, że przeciwciało lub jego białko funkcjonalne swoiście wiążą się z polipeptydem sklerostyny oraz zwiększają co najmniej jeden spośród następujących czynników:

4 tworzenie kości, gęstość mineralną kości, zawartość minerałów w kościach, masę kostną, jakość kości i wytrzymałość kości u ssaka. [0011] W jednym wariancie, ujawnione przeciwciała wykazują zdolność do odwracalnego hamowania sklerostyny w procesie mineralizacji kości in vitro. W powiązanym wariancie, mają one zdolność do odwracalnego hamowania sklerostyny w szlaku sygnałowym, w którym pośredniczy Wnt-1. W innym powiązanym wariancie, zakłócają one wiązanie sklerostyny z LRP-6 i mogą blokować działanie hamujące, które sklerostyna wywiera w wysokich dawkach na fosforylację Smad1 indukowaną przez BMP. W innym wariancie, ujawnione przeciwciała wiążą się z regionem sklerostyny pomiędzy aminokwasami 112 i 126 włącznie (tj. wymieniony region składa się z aminokwasów 112 do 126 o sekwencji SEQ ID NO: 5) o sekwencji SEQ ID NO: 5 i/lub regionem pomiędzy aminokwasami włącznie (tj. wymieniony region składa się z aminokwasów 160 do 174 o sekwencji SEQ ID NO: 5) o sekwencji SEQ ID NO: 5, oraz bardziej konkretnie, wiążą się z regionem obejmującym zarówno ARLLPNAIGRGKWWR (SEQ ID NO: 6), jak i RLVASCKCKRLTRFH (SEQ ID NO: 7). [0012] Sklerostyna hamuje aktywację wnt1, w której pośredniczy STF (Supertopftash, reporter odczytu dla kanonicznej sygnalizacji wnt) w komórkach HEK 293. W niektórych wykonaniach, ujawnione w niniejszym dokumencie przeciwciała przywracają odczyt reportera sygnalizacji wnt w bardzo powtarzalny sposób. [0013] Wykazano, że zaobserwowany wpływ hamujący ujawnionych przeciwciał na działanie sklerostyny w teście z reporterem sygnalizacji Wnt w komórkach nieosteoblastycznych przekłada się na wywoływanie odpowiedzi kościotworzenia, z powodu hamowania sklerostyny in vivo. Rzeczywiście, badania in vivo na gryzoniach w starszym wieku pokazują, że przeciwciała według wynalazku wspomagają silny anabolizm kości. Wzrost masy kości osiąga poziom efektów dziennych przerywanego leczenia bardzo wysokimi dawkami anabolicznymi hormonu przytarczyc (który stosowano jako kontrolę pozytywną). [0014] Zatem, według innego korzystnego wariantu, ujawnione w niniejszym dokumencie przeciwciała wykazują powinowactwo do sklerostyny w zakresie niskich pm i hamują oddziaływanie sklerostyny na szlak sygnałowy wnt z wartościami IC 50 około nm. [00] Korzystnie, w innym korzystnym wariancie, ujawnione przeciwciała wiążą się z regionem sklerostyny pomiędzy aminokwasami 112 i 126 włącznie (na przykład wymieniony region składa się z aminokwasów od 112 do 126 o sekwencji SEQ ID NO:

5 ) i pomiędzy aminokwasami 160 i 174 włącznie (na przykład wymieniony region składa się z aminokwasów od 160 do 174 o sekwencji SEQ ID NO: 5) o sekwencji SEQ ID NO: 5, a w szczególności regionem, który pokrywa co najmniej następujące peptydy, odpowiednio, ARLLPNAIGRGKWWR (SEQ ID NO: 6) i RLVASCKCKRLTRFH (SEQ ID NO: 7), i wykazują powinowactwo do sklerostyny w zakresie niskich pm oraz hamują oddziaływanie sklerostyny na szlak sygnałowy wnt z wartością IC 50 około nm. Omawiane przeciwciała wykazują zdolność do zwiększania masy kostnej szkieletu osiowego i obwodowego w mysim modelu zwierzęcym na poziomie efektu, który daje codzienne podskórne podawanie bardzo wysokich dawek anabolicznych hormonu przytarczyc (kontrola pozytywna) i są zatem użyteczne w leczeniu chorób związanych z nieprawidłowościami kości, takimi jak osteoporoza, [0016] Dalsze warianty wynalazku obejmują kompozycje zawierające przeciwciała według wynalazku w kombinacji z alternatywnymi terapiami do leczenia osteoporozy, takimi jak bisfosfoniany, hormon przytarczyc, środki uwalniające hormon przytarczyc (kalcylityki), przeciwciała neutralizujące LRP4 i przeciwciała neutralizujące DKK-1. Krótki opis figur [0017] Figura 1: Wpływ MOR05613_IgG2Iambda w teście wnt 1 Figura 2. MOR05813_IgG2Iambda w mineralizacji indukowanej przez BMP-2 w komórkach MC3T3-1b Figura 3: Wpływ MOR05813_IgG2Iambda w teście MOR05813_IgG2Iambda Figura 4: Wpływ MOR05813_IgG2Iambda w teście z fosfo-smad1 Figura 5: A - Wpływ wyciszania LRP4 (sirna) na działanie hamujące SOST w teście wnt-1 w komórkach HEK293 (czarne cyfry: odnoszą się do aktywności STF w nieobecności SOST; czarne cyfry zaznaczone czcionka pogrubioną: stosunek aktywności STF w obecności/nieobecności SOST); B - swoistość wpływu nadekspresji LRP4 na IC 50 dla SOST i IC 50 dla Dkk1 w teście wnt-1 w komórkach Hek293; C - swoistość wpływu nadekspresji LRP4 na hamujące działanie SOST i Dkk1 w teście wnt-1 w komórkach C28a2, D - swoistość wpływu wyciszania LRP4 (sirna) na działanie hamujące SOST i Dkk1 w teście wnt-1 w komórkach Hek293, E - modulacja aktywności MOR05813 przez LRP4 Figura 6: Badanie myszy, pqct in vivo 2,5-tygodniowe leczenie MOR05813 zwiększa całkowitą zawartość minerałów w kościach w proksymalnej przynasadzie kości piszczelowej

6 Figura 7: Badanie myszy, pqct in vivo 2,5-tygodniowe leczenie MOR05813 zwiększa całkowitą gęstość mineralną kości w proksymalnej przynasadzie kości piszczelowej Figura 8: Badanie myszy, pqct in vivo 2,5-tygodniowe leczenie MOR05813 zwiększa grubość warstwy korowej w proksymalnej przynasadzie kości piszczelowej Figura 8: Badanie myszy, pqct in vivo 2,5-tygodniowe leczenie MOR05813 zwiększa grubość warstwy gąbczastej w proksymalnej przynasadzie kości piszczelowej Figura 9: Badanie myszy, pqct in vivo 2,5-tygodniowe leczenie MOR05813 zwiększa objętość kości gąbczastej w proksymalnej przynasadzie kości piszczelowej Figura : Badanie myszy, pqct in vivo 2,5-tygodniowe leczenie MOR05813 zwiększa objętość kości beleczkowej w proksymalnej przynasadzie kości piszczelowej Figura 11: Badanie myszy, pqct in vivo 5-tygodniowe leczenie MOR05813 zwiększa dodatkowo całkowitą gęstość mineralną kości w proksymalnej przynasadzie kości piszczelowej Figura 12: Badanie myszy, DEXA ex vivo - 5-tygodniowe leczenie MOR05813 zwiększa dodatkowo gęstość mineralną kości piszczelowej. Figura 13: Badanie myszy, DEXA ex vivo - 5-tygodniowe leczenie MOR05813 zwiększa dodatkowo gęstość mineralną kości udowej. Figura 14: Badanie myszy, DEXA ex vivo - 5-tygodniowe leczenie MOR05813 zwiększa dodatkowo gęstość mineralną kości kręgosłupa. Figura : Badanie myszy, histomorfometria ex vivo - 2,5-tygodniowe leczenie MOR05813 zwiększa szybkość tworzenia kości w szkielecie obwodowym (proksymalna przynasada kości udowej) Figura 16: Badanie myszy, histomorfometria ex vivo - 2,5-tygodniowe leczenie MOR05813 zwiększa szybkość odkładania minerałów w szkielecie obwodowym (proksymalna przynasada kości udowej) Figura 17: Badanie myszy, histomorfometria ex vivo - 2,5-tygodniowe leczenie MOR05813 zwiększa powierzchnię mineralizacji w szkielecie obwodowym (proksymalna przynasada kości udowej) Figura 18: Badanie myszy, histomorfometria ex vivo - 2,5-tygodniowe leczenie MOR05813 zwiększa szybkość tworzenia kości w szkielecie osiowym (kręgosłup lędźwiowy) Figura 19: Badanie myszy, histomorfometria ex vivo - 2,5-tygodniowe leczenie MOR05813 nie wpływa na resorpcję kości w szkielecie obwodowym (proksymalna przynasada kości udowej), w pomiarze powierzchni osteoklastów

7 Figura : Test ELISA przedstawiający wpływ MOR05813_IgG2Iambda na wiązanie SOST z LRP-6. W każdym przypadku stosowano 0,9 nm SOST Figura 21: Badanie myszy, pqct in vivo po leczeniu skojarzonym MOR05813 i kwasem zoledronowym, (A) całkowita gęstość mineralna kości, (B) całkowita zawartość minerałów w kościach, (C) grubość warstwy korowej i (D) gęstość mineralna kości gąbczastej Figura 22: Badanie myszy pqct in vivo: podawanie MOR05813 pod wstępnym leczeniu alendronianem (alen), (A) całkowita gęstość mineralna kości, (B) całkowita zawartość minerałów w kościach, (C) grubość warstwy korowej i (D) gęstość mineralna kości gąbczastej Figura 23: Badanie myszy, pqct in vivo po leczeniu skojarzonym MOR05813 i (i) anty-dkk1 lub (ii) PTH, (A) całkowita gęstość mineralna kości, (B) całkowita zawartość minerałów w kościach, (C) grubość warstwy korowej i (D) gęstość mineralna kości gąbczastej Szczegółowy opis wynalazku [0018] Niniejszy wynalazek dotyczy izolowanych przeciwciał, w szczególności ludzkich przeciwciał, które wiążą się swoiście ze sklerostyną i hamują właściwości funkcjonalne sklerostyny. W niektórych wykonaniach, ujawnione w niniejszym dokumencie przeciwciała pochodzą od szczególnych sekwencji łańcucha ciężkiego i lekkiego i/lub mogą mieć specyficzne cechy strukturalne, takie jak regiony CDR, o określonych sekwencjach aminokwasowych. Wynalazek dostarcza przeciwciał przeciw sklerostynie zawierających sekwencję polipeptydową regionu zmiennego łańcucha ciężkiego zawierającą SEQ ID NO: 70 i sekwencję polipeptydową regionu zmiennego łańcucha lekkiego zawierającą SEQ ID NO: 81. Ujawniono także izolowane przeciwciała, sposoby wytwarzania takich przeciwciał, immunokoniugaty i wielowartościowe lub wieloswoiste cząsteczki zawierające takie przeciwciała i kompozycje farmaceutyczne zawierające te przeciwciała, immunokoniugaty i cząsteczki o podwójnej swoistości według wynalazku. Wynalazek dotyczy także sposobów stosowania tych przeciwciał do hamowania zaburzenia lub stanu związanego z obecnością ekspresji sklerostyny, na przykład w leczeniu zaburzenia patologicznego, w którym pośredniczy sklerostyna lub które jest związane ze zwiększonym poziomem sklerostyny; na przykład choroby kości, takiej jak osteoporoza. [0019] W celu ułatwienia zrozumienia niniejszego wynalazku, zdefiniowano najpierw pewne terminy. Dodatkowe definicje zamieszczono w szczegółowym opisie.

8 [00] Termin zawierający obejmuje obejmujący jak również składający się z, na przykład kompozycja zawierająca X może składać się wyłącznie z X lub może obejmować pewne dodatkowe elementy, na przykład X + Y. [0021] Termin około w odniesieniu do wartości liczbowej x oznacza, na przykład, x±%. [0022] Słowo zasadniczo nie wyklucza całkowicie, na przykład kompozycja, która jest zasadniczo wolna od Y może być całkowicie wolna od Y. Jeżeli jest to konieczne, słowo zasadniczo może być pominięte w definicji według wynalazku. [0023] Termin odpowiedź immunologiczna odnosi się do działania, na przykład, limfocytów, komórek prezentujących antygen, komórek fagocytarnych, granulocytów i rozpuszczalnych makrocząsteczek wytwarzanych przez powyższe komórki lub wątrobę (włączając przeciwciała, cytokiny i dopełniacze), które powoduje selektywne uszkodzenie, zniszczenie lub eliminację z organizmu ludzkiego inwazyjnych patogenów, komórek lub tkanek zakażonych patogenami, komórek rakowych lub, w przypadku autoimmunizacji lub patologicznego procesu zapalnego, prawidłowych ludzkich komórek lub tkanek. [0024] Termin sklerostyna odnosi się do ludzkiej sklerostyny określonej w SEQ ID NO: 5. Rekombinowaną ludzką sklerostynę można uzyskać z R&D Systems (Minneapolis, MN, Stany Zjednoczone; 06, nr kat ST-025). Dodatkowo, rekombinowana mysia sklerostyna/sost jest dostępna na rynku z R&D Systems (Minneapolis, MN, Stany Zjednoczone; 06, nr kat. 89-ST-025). Dokumenty patentowe Stanów Zjednoczonych nr i , oraz publikacje patentowe Stanów Zjednoczonych nr US i odnoszą się ogólnie do przeciwciał przeciw sklerostynie. [0025] Termin przeciwciało stosowany w niniejszym dokumencie obejmuje całe przeciwciała oraz ich dowolny fragment wiążący antygen (na przykład część wiążącą antygen ) lub ich pojedyncze łańcuchy. Występujące naturalnie przeciwciało jest glikoproteiną zawierającą co najmniej dwa ciężkie (H) i dwa lekkie łańcuchy (L), połączone ze sobą wiązaniami disiarczkowymi. Każdy łańcuch ciężki składa się z regionu zmiennego łańcucha ciężkiego (oznaczonego w niniejszym dokumencie jako VH) i regionu stałego łańcucha ciężkiego. Region stały łańcucha ciężkiego obejmuje trzy domeny, CH1, CH2 i CH3. Każdy łańcuch lekki składa się z regionu zmiennego łańcucha lekkiego (oznaczonego w niniejszym dokumencie jako VL) oraz regionu stałego łańcucha lekkiego. Region stały łańcucha lekkiego składa się z jednej domeny, CL. Regiony VH i VL można dalej podzielić na regiony hiperzmienności, określane jako regiony

9 determinujące komplementarność (CDR), przedzielone regionami, które są bardziej konserwatywne, nazywanymi regionami zrębowymi (FR). Każdy łańcuch VH i VL składa się z trzech CDR i czterech FR uporządkowanych od końca aminowego do końca karboksylowego w następującej kolejności: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Regiony zmienne łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego zawierają domenę wiążącą, która oddziałuje z antygenem. Stałe regiony przeciwciał mogą pośredniczyć w wiązaniu immunoglobuliny z tkankami lub czynnikami gospodarza, w tym różnymi komórkami układu odpornościowego (na przykład komórkami efektorowymi) i pierwszym składnikiem (C1q) klasycznego układu dopełniacza. [0026] Termin część wiążąca antygen przeciwciała (lub po prostu część antygenowa ), w znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie, odnosi się do przeciwciała o pełnej długości lub jednego lub większej liczby fragmentów przeciwciała, które zachowują zdolność do swoistego wiązania się z antygenem (na przykład sklerostyną). Wykazano, że funkcja wiązania antygenu przeciwciała może być pełniona przez fragmenty przeciwciała o pełnej długości. Przykłady fragmentów wiążących objętych terminem część wiążąca antygen przeciwciała obejmują fragment Fab, jednowartościowy fragment składający się z domen VL, VH, CL i CH1; fragment F(ab)2, dwuwartościowy fragment zawierający dwa fragmenty Fab połączone mostkiem dwusiarczkowym w regionie zawiasowym; fragment Fd składający się z domen V H i CH1; fragment Fv składający się z domen VL i VH pojedynczego ramienia przeciwciała;. fragment dab (Ward i wsp., 1989 Nature 341: ), składający się z domeny VH; oraz izolowany region determinujący komplementarność (CDR). [0027] Ponadto, chociaż dwie domeny fragmentu Fv, VL i VH, są kodowane przez dwa odrębne geny, można je połączyć stosując metody rekombinacji, przez syntetyczny łącznik, który umożliwia wytworzenie z nich pojedynczego łańcucha białkowego, w którym regiony VL i VH dopasowują się tworząc cząsteczki jednowartościowe (znaną jako jednołańcuchowy Fv (scfv); patrz na przykład Bird i wsp., 1988 Science 242: ; oraz Huston i wsp., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85: ). Takie przeciwciała jednołańcuchowe również mieszczą się w zakresie terminu region wiążący antygen przeciwciała. Omawiane fragmenty przeciwciał otrzymuje się konwencjonalnymi metodami znanymi osobom biegłym w dziedzinie, a fragmenty są poddawane skriningowi pod kątem użyteczności w taki sam sposób, jak nienaruszone przeciwciała. [0028] Przeciwciało izolowane, w znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie, odnosi się do przeciwciała, które jest zasadniczo wolne od innych przeciwciał

10 mających odmienną swoistość antygenową (na przykład izolowane przeciwciało, które swoiście wiąże się ze sklerostyną jest zasadniczo wolne od przeciwciał, które swoiście wiążą się z antygenami innymi niż sklerostyna). Izolowane przeciwciało, które swoiście wiąże się ze sklerostyną może jednakże wykazywać krzyżową reaktywność z innymi antygenami, takimi jak cząsteczki sklerostyny pochodzące od innych gatunków. Ponadto, izolowane przeciwciało może być zasadniczo wolne od innych materiałów komórkowych i/lub związków chemicznych. [0029] Terminy przeciwciało monoklonalne lub kompozycja przeciwciała monoklonalnego w znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie odnoszą się do preparatu cząsteczek przeciwciała o pojedynczym składzie cząsteczkowym. Kompozycja przeciwciała monoklonalnego wykazuje pojedynczą swoistość wiązania i powinowactwo wobec określonego epitopu. [0030] Termin ludzkie przeciwciało, w znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie, w zamierzeniu obejmuje przeciwciała zawierające regiony zmienne, w których zarówno regiony zrębowe, jak i regiony CDR pochodzą z ludzkich sekwencji. Ponadto, jeśli przeciwciało zawiera region stały, region ten również pochodzi od takich sekwencji ludzkich, na przykład ludzkich sekwencji linii zarodkowej lub zmutowanych wersji sekwencji ludzkiej linii zarodkowej lub przeciwciał zawierających konsensusowe sekwencje zrębowe pochodzące z analiz ludzkich sekwencji zrębowych, jak opisali Knappik i wsp. (00. J Mol Biol 296, 57-86). [0031] Ujawnione ludzkie przeciwciała mogą obejmować reszty aminokwasowe niekodowane przez ludzkie sekwencje (na przykład mutacje wprowadzone przez losową lub ukierunkowaną mutagenezę in vitro lub przez mutację somatyczną in vivo). Jednakże, termin przeciwciało ludzkie, w znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie, w zamierzeniu nie obejmuje przeciwciał, w których sekwencje CDR pochodzące z linii zarodkowej innych gatunków ssaków, takich jak myszy, zostały przeszczepione na ludzkie sekwencje zrębowe. [0032] Termin ludzkie przeciwciało monoklonalne dotyczy przeciwciał wykazujących pojedynczą swoistość wiązania, zawierających zmienne regiony, w których zarówno regiony zrębowe, jak i regiony CDR pochodzą od ludzkich sekwencji. W jednej postaci ludzkie przeciwciała monoklonalne są wytwarzane przez komórkę hybrydoma, którą stanowi komórka B uzyskana z transgenicznego zwierzęcia niebędącego człowiekiem, na przykład myszy transgenicznej, o genomie zawierającym transgen ludzkiego łańcucha ciężkiego oraz transgen łańcucha lekkiego, połączone z unieśmiertelnioną komórką.

11 [0033] Termin rekombinowane ludzkie przeciwciało, w znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, obejmuje wszystkie ludzkie przeciwciała, które otrzymuje się, poddaje ekspresji, tworzy lub izoluje metodami rekombinacyjnymi, takie jak przeciwciała izolowane ze zwierzęcia (na przykład myszy), które są transgeniczne lub transchromosomalne pod względem ludzkich genów immunoglobulin, lub hydromy z nich wytworzone, przeciwciała izolowane z komórki gospodarza transformowanej w celu ekspresji ludzkiego przeciwciała, na przykład z transfectoma, przeciwciała izolowane z rekombinowanej, kombinatorycznej biblioteki ludzkich przeciwciał, przeciwciała, które otrzymuje się, poddaje ekspresji, tworzy lub izoluje dowolnymi innymi środkami obejmującymi splicing całego lub części ludzkiego genu immunoglobuliny, sekwencji z innymi sekwencjami DNA. Takie rekombinowane ludzkie przeciwciała zawierają regiony zmienne, w których regiony zrębowe i CDR pochodzą od ludzkich sekwencji zarodkowych immunoglobulin. W pewnych wykonaniach jednakże, takie rekombinowane ludzkie przeciwciała można poddać mutagenezie in vitro (lub, gdy stosuje się zwierzę transgeniczne dla ludzkich sekwencji immunoglobulin, mutagenezie somatycznej in vivo) i w ten sposób sekwencje aminokwasowe regionów VH i VL rekombinowanych przeciwciał są sekwencjami, chociaż pochodzą od i są spokrewnione z ludzkimi sekwencjami zarodkowymi VH i VL, mogą nie występować naturalnie w repertuarze linii zarodkowej ludzkiego przeciwciała in vivo. [0034] W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, termin izotyp odnosi się do klasy przeciwciał (na przykład IgM, IgG, takich jak lgg1 i lgg2), zapewnianej przez geny regionu stałego łańcucha ciężkiego. [0035] Terminy przeciwciało rozpoznające antygen i przeciwciało swoiste dla antygenu są stosowane zamiennie w niniejszym dokumencie z terminem przeciwciało, które wiąże się swoiście z antygenem. [0036] W znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie termin przeciwciało, które swoiście wiąże się z polipeptydem sklerostyny w zamierzeniu dotyczy przeciwciała, które wiąże się z polipeptydem sklerostyny ze stałą K D wynoszącą 1 x -8 M lub mniejszą, 1 x -9 M lub mniejszą, lub 1 x - M lub mniejszą. Przeciwciało, które reaguje krzyżowo z antygenem innym niż sklerostyna w zamierzeniu dotyczy przeciwciała, które wiąże się z antygenem ze stałą K D 0,5 x -8 M lub mniejszą, 5 x -9 M lub mniejszą lub 2 x -9 M lub mniejszą. Przeciwciało, które nie reaguje krzyżowo z konkretnym antygenem, w zamierzeniu dotyczy przeciwciała, które wiąże się z tym antygenem ze stałą K D 1,5 x -8 M lub większą albo stałą K D w zakresie od 5 x -8 M do x -8 M lub 1 x -7 M lub większą. W pewnych wykonaniach, takie przeciwciała,

12 które nie reagują krzyżowo z antygenem, wykazują zasadniczo niewykrywalne wiązanie z tymi białkami w standardowych testach wiązania. [0037] W znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie termin przeciwciało, które blokuje działanie hamujące sklerostyny w komórkowym teście sygnalizacji wnt, w zamierzeniu dotyczy przeciwciała, które przywraca sygnalizację wnt w obecności sklerostyny w teście komórkowym STF z wartością IC 50 mniejszą niż 1 mm, 0 nm, nm, nm lub mniejszą. Taki test STF opisano bardziej szczegółowo w zamieszczonych poniżej przykładach. [0038] W znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie termin przeciwciało, które blokuje działanie hamujące sklerostyny w komórkowym teście mineralizacji w zamierzeniu dotyczy przeciwciała, które przywraca indukowaną przez BMP2 mineralizację w obecności sklerostyny w teście komórkowym ze stałą IC 50 mniejszą niż 1 mm, 500 nm, 0 nm, nm, 1 nm lub mniejszą. Taki test opisano bardziej szczegółowo w zamieszczonych poniżej przykładach. [0039] W znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie termin przeciwciało, które blokuje działanie hamujące sklerostyny w teście fosforylacji Smad1, w zamierzeniu dotyczy przeciwciała, które przywraca indukowaną przez BMP6 fosforylację Smad1 w obecności sklerostyny w teście komórkowym z wartością IC 50 mniejszą niż 1 mm, 500 nm, 0 nm, nm, 1 nm lub mniejszą. Taki test opisano bardziej szczegółowo w zamieszczonych poniżej przykładach. [0040] W znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie termin przeciwciało, które hamuje wiązanie sklerostyny z LRP-6 odnosi się do przeciwciała, które hamuje wiązanie się sklerostyny z LPR-6, z wartością IC50 wynoszącą 1 mm, 500 nm, 0 nm, nm, 5 nm, 3 nm, 1 nm lub mniej. Taki test opisano bardziej szczegółowo w zamieszczonych poniżej przykładach. [0041] W znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie termin przeciwciało, które zwiększa kościotworzenie oraz masę i gęstość kości odnosi się do przeciwciała, które jest zdolne osiągnięcia kościotworzenia, masy i gęstości kości na poziomie uzyskiwanym dla codziennego przerywanego leczenia dużą anaboliczna dawką PTH, jak pokazano w przykładzie. [0042] Terminy K asoc lub K a, w znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie, w zamierzeniu dotyczą szybkości asocjacji konkretnego oddziaływania przeciwciało-antygen, podczas gdy terminy K dys lub K d w znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie w zamierzeniu odnoszą się do szybkości dysocjacji konkretnego oddziaływania przeciwciało-antygen. Termin K D w znaczeniu stosowanym w niniejszym

13 dokumencie odnosi się do stałej dysocjacji, którą otrzymuje się ze stosunku K d do K a (tj. K d /K a ) i wyrażonej jako stężenie molowe (M). Wartości K D dla przeciwciał można określić za pomocą metod dobrze znanych w dziedzinie. K D przeciwciała określa się techniką powierzchniowego rezonansu plazmonowego lub przy użyciu systemu bioczujnika, takiego jak system Biacore. [0043] W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, termin powinowactwo odnosi się do siły wzajemnego oddziaływania pomiędzy przeciwciałem a antygenem w pojedynczych miejscach antygenowych. W obrębie każdego miejsca antygenowego, region zmienny ramienia przeciwciała oddziałuje poprzez słabe siły niekowalencyjne z antygenem w wielu miejscach; im więcej odziaływań, tym silniejsze powinowactwo. [0044] W znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie termin zachłanność odnosi się do informacyjnej miary ogólnej stabilności i mocy kompleksu przeciwciałoantygen. Zachłanność jest regulowana przez trzy główne czynniki: powinowactwo epitopu przeciwciała; wartościowość zarówno antygenu, jak i przeciwciała; oraz układ strukturalny oddziałujących ze sobą części. Ostatecznie te czynniki określają swoistość przeciwciała, to znaczy prawdopodobieństwo, wiązania danego przeciwciała z dokładnym epitopem antygenu. [0045] W celu uzyskania sondy o wyższej zachłanności, można skonstruować dimeryczny koniugat, a tym samym ułatwić wykrywane przez FACS odziaływań o niskim powinowactwie (na przykład z przeciwciałem linii zarodkowej). Ponadto, inny sposób zwiększenia zachłanności wiązania antygenu obejmuje wytwarzanie dimerów, trimerów lub multimerów któregokolwiek z konstruktów opisanych w niniejszym dokumencie z przeciwciałami przeciw sklerostynie. Takie multimery mogą być wytwarzane przez wiązanie kowalencyjne między poszczególnymi modułami, na przykład, przez naśladowanie naturalnego wiązania końców C z końcami N lub poprzez naśladowanie dimerów przeciwciał, które są utrzymywane razem przez ich stałe regiony. Wiązania skonstruowane w międzyfazę Fc/Fc może być kowalencyjne lub niekowalencyjne. Ponadto składniki dimeryzacji lub multimery inne niż Fc mogą być stosowane w hybrydach sklerostyny w celu otrzymania takich struktur wyższego rzędu. Na przykład, możliwe jest użycie domen multimeryzacyjnych, takich jak domena trimeryzacyjna opisana w Borean (W ) i domena pentameryzacyjna opisana w opublikowanym zgłoszeniu patentowym WO98/ [0046] W znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie, termin reaktywność krzyżowa odnosi się do przeciwciała lub populacji przeciwciał wiążących się z epitopami na innych antygenach. Może to być spowodowane niską zachłannością lub swoistością

14 przeciwciała lub wieloma różnymi antygenami, mającymi identyczne lub bardzo zbliżone epitopy. Reaktywność krzyżowa jest czasem pożądana, gdy korzystne jest ogólne wiązanie z powiązaną grupą antygenów lub przy próbie miedzygatunkowego znakowania, gdy sekwencja epitopu antygenu nie jest ewolucyjnie silnie konserwatywna. [0047] W znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie, termin wysokie powinowactwo wobec przeciwciała IgG odnosi się do przeciwciała o stałej K D -8 M lub mniejszej, -9 M lub mniejszej lub - M lub mniejszej wobec antygenu docelowego. Jednakże wysokie powinowactwo wiązania może zmieniać się dla innych izotypów przeciwciała. Na przykład, wysokie powinowactwo wiązania dla izotypu IgM dotyczy przeciwciała o stałej K D -7 M lub mniejszej albo -8 M lub mniejszej. [0048] W znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie, termin pacjent obejmuje każdego człowieka lub zwierzę niebędące człowiekiem. Termin zwierzę niebędące człowiekiem obejmuje wszystkie kręgowce, na przykład ssaki i zwierzęta niebędące ssakami, takie jak niebędące ludźmi, naczelne, owce, psy, koty, konie, krowy, kurczaki, płazy, gady itp. [0049] W znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie, termin zoptymalizowana oznacza, że sekwencja nukleotydowa została zmieniona, aby kodować sekwencję aminokwasową z użyciem kodonów, które są korzystne w komórce produkcyjnej lub organizmie, zasadniczo komórce eukariotycznej, na przykład, komórce Pichia lub Trichoderma, komórce jajnika chomika chińskiego (CHO) lub komórce ludzkiej. Zoptymalizowana sekwencja nukleotydowa w niniejszym wynalazku została skonstruowana tak, aby utrzymać całkowicie lub w możliwie największym stopniu pierwotną sekwencję aminokwasową kodowaną przez wyjściową sekwencję nukleotydową, która jest znana także jako macierzysta sekwencja. Zoptymalizowane sekwencje w niniejszym dokumencie zostały zmodyfikowane tak, aby zawierać kodony, które są korzystne w komórkach ssaczych, jednakże w niniejszym dokumencie przewiduje się optymalizację ekspresji tych sekwencji w innych komórkach eukariotycznych. Sekwencje aminokwasowe kodowane przez sekwencje nukleotydowe zoptymalizowane są również określane jako zoptymalizowane. [0050] Różne aspekty wynalazku opisano bardziej szczegółowo w kolejnych podrozdziałach. [0051] Standardowe testy służące do oceny zdolności powinowactwa wiązania przeciwciał ze sklerostyną różnych gatunków są znane w tej dziedzinie, w tym na przykład test ELISA, western blot oraz RIA. Odpowiednie testy szczegółowo opisano w przykładach. Kinetyka wiązania (na przykład powinowactwo wiązania) przeciwciał

15 również może być oceniane za pomocą standardowych testów znanych w dziedzinie, na przykład poprzez analizę Biacore. Testy służące do oceny wpływu przeciwciał na właściwości funkcjonalne sklerostyny (na przykład, wiązanie z receptorem, zapobieganie lub łagodzenie osteolizy) opisano bardziej szczegółowo w zamieszczonych poniżej przykładach. [0052] Odpowiednio, przeciwciało, które hamuje jedną lub większą liczbę tych właściwości funkcjonalnych sklerostyny (na przykład, aktywności biochemicznych, immunochemicznych, komórkowych, fizjologicznych lub innych aktywności biologicznych lub podobnych), co określa się metodami znanymi w dziedzinie i opisanymi w niniejszym dokumencie, należy rozumieć jako odnoszące się do statystycznie istotnego zmniejszenia konkretnej aktywności w stosunku do tej obserwowanej w przypadku braku przeciwciała (lub gdy obecne jest kontrolne przeciwciało o nieistotnej swoistości). Przeciwciało, które hamuje aktywność sklerostyny, powoduje takie statystycznie istotne zmniejszenie o co najmniej % mierzonego parametru, o co najmniej 50%, 80% lub 90%, w niektórych wykonaniach przeciwciało według wynalazku może hamować aktywność funkcjonalną sklerostyny o ponad 95%, 98% lub 99%. [0053] Terminy blokowanie krzyżowe, blokowany krzyżowo lub blokujące krzyżowo stosowane są zamiennie w niniejszym opisie i oznaczają zdolność przeciwciała lub innego środka wiążącego do zakłócania wiązania innych przeciwciał lub środków wiążących się z sklerostyną w standardowym teście wiązania kompetycyjnego. [0054] Zdolność i zakres, w jakim przeciwciało lub inny środek wiążący mogą zakłócać wiązanie innego przeciwciała lub cząsteczki wiążącej ze sklerostyną, a zatem blokować krzyżowo zgodnie z niniejszym ujawnieniem, można określić stosując standardowe testy wiązania kompetycyjnego. Jeden odpowiedni test obejmuje zastosowanie technologii Biacore (na przykład przy użyciu urządzenia Biacore 3000 (Biacore, Uppsala, Szwecja)), która umożliwia pomiar stopnia oddziaływań wykorzystując technikę plazmonowego rezonansu powierzchniowego. Inny test do pomiaru blokowania krzyżowego opiera się na metodzie ELISA. [0055] Dalsze szczegóły dotyczące obu sposobów podano w przykładach. [0056] Według ujawnienia, blokujące krzyżowo przeciwciało lub inny środek wiążący wiążą się ze sklerostyną w opisanym teście Biacore blokowania krzyżowego tak, że rejestrowane wiązanie kombinacji (mieszaniny) przeciwciał lub środków wiążących mieści się w zakresie do 80% do 0,1% (na przykład 80% do 4%), teoretycznego maksymalnego wiązania, w szczególności w zakresie od 75% do 0,1% (na przykład 75% do 4%), teoretycznego maksymalnego wiązania, szczególniej w zakresie od 70% do 0,1%

16 (na przykład 70% do 4%), a szczególnie od 65% do 0,1% (na przykład 65% do 4%) teoretycznego maksymalnego wiązania (jak określono powyżej) dwóch przeciwciał lub środków wiążących w kombinacji. [0057] Przeciwciało definiuje się jako blokujące krzyżowo w teście ELISA, jak to opisano w przykładach, jeśli przeciwciało przeciw sklerostynie w fazie roztworu może spowodować obniżenie od 60% do 0%, w szczególności od 70% do 0%, a zwłaszcza od 80% do 0%, sygnału detekcji sklerostyny (tj. ilości sklerostyny związanej przez powleczone przeciwciało), w porównaniu z sygnałem detekcji sklerostyny otrzymanym w nieobecności w fazie roztworu przeciwciała przeciw sklerostynie (na przykład dołki stanowiące kontrolę pozytywną). Monoklonalne przeciwciała [0058] Przeciwciała ujawnione w niniejszym wynalazku obejmują ludzkie przeciwciała, przeciwciała izolowane, jak opisano w przykładach. Sekwencje aminokwasowe VH ujawnionych izolowanych przeciwciał przedstawiono w SEQ ID NO: Sekwencje aminokwasowe VL ujawnionych izolowanych przeciwciał przedstawiono, odpowiednio, w SEQ ID NO: Odpowiednie korzystne sekwencje aminokwasowe pełnej długości łańcucha ciężkiego ujawnionych przeciwciał przedstawiono w SEQ ID NO: Odpowiednie korzystne sekwencje aminokwasowe łańcucha lekkiego o pełnej długości ujawnionych przeciwciał przedstawiono, odpowiednio, w SEQ ID NO: Inne przeciwciała obejmują aminokwasy, które zostały zmutowane, ale wykazują co najmniej 60, 70, 80, 90 lub 95 procent lub większy stopień identyczności w regionach CDR z regionami CDR przedstawionymi w sekwencjach opisanych wyżej. W niektórych wykonaniach, ujawnienie obejmuje zmutowane sekwencje aminokwasowe, gdzie zmutowano nie więcej niż 1, 2, 3, 4 lub 5 aminokwasów w regionach CDR w porównaniu z regionami CDR wskazanymi w sekwencji opisanej powyżej. [0059] Ponadto, sekwencje nukleotydowe macierzystego regionu zmiennego łańcucha ciężkiego przedstawiono w sekwencjach SEQ ID NO: Sekwencje nukleotydowe macierzystego regionu zmiennego łańcucha ciężkiego przedstawiono w sekwencjach SEQ ID NO: 0-1. Sekwencje nukleotydowe łańcucha lekkiego o pełnej długości, zoptymalizowane do ekspresji w ssaczej komórce przedstawiono w sekwencjach SEQ ID NO: Sekwencje nukleotydowe łańcucha ciężkiego o pełnej długości zoptymalizowane do ekspresji w komórkach ssaczych przedstawiono w SEQ ID NO: Sekwencje aminokwasowe łańcucha lekkiego o pełnej długości kodowane przez zoptymalizowane sekwencje nukleotydowe łańcucha lekkiego przedstawiono w

17 sekwencjach SEQ ID NO: Sekwencje aminokwasowe łańcucha ciężkiego o pełnej długości kodowane przez zoptymalizowane sekwencje nukleotydowe łańcucha ciężkiego przedstawiono w sekwencjach SEQ ID NO: Inne przeciwciała obejmują aminokwasy i kwasy nukleinowe, które nie zostały zmutowane, ale wykazują co najmniej 60, 70, 80, 90 lub 95 procent lub większą identyczność sekwencji z sekwencjami opisanymi powyżej. W niektórych wykonaniach, wynalazek obejmuje zmutowane sekwencje aminokwasowe, gdzie nie więcej niż 1, 2, 3, 4 lub 5 aminokwasów zostało zmutowanych w regionach zmiennych, w porównaniu z regionami zmiennymi przedstawionymi w sekwencji opisanej powyżej, przy zasadniczym zachowaniu takiej samej aktywności terapeutycznej. [0060] Ponieważ każde z tych przeciwciał może wiązać się ze sklerostyną, sekwencje (sekwencje nukleotydowe i sekwencje aminokwasowe) pełnej długości łańcucha lekkiego i łańcucha pełnej długości ciężkiego: VH, VL, można mieszać i dopasowywać w celu wytworzenia innych cząsteczek wiążących skierowanych przeciw sklerostynie według wynalazku. Wiązanie ze sklerostyną tego typu mieszanych i dopasowanych przeciwciał można testować stosując testy wiązania opisane powyżej w przykładach (na przykład ELISA). Gdy łańcuchy te miesza się i dopasowuje, sekwencję VH z określonego sparowania VH/VL zastępuje się strukturalnie podobną sekwencją VH. Podobnie, sekwencję pełnej długości łańcucha ciężkiego z określonego sparowana pełnej długości łańcucha ciężkiego/pełnej długości łańcucha lekkiego zastępuje się strukturalnie podobną sekwencją pełnej długości łańcucha ciężkiego. Podobnie, sekwencję VL z określonego sparowania VH/VL zastępuje się strukturalnie podobną sekwencją VL. Podobnie, sekwencję pełnej długości łańcucha lekkiego z określonego sparowania pełnej długości łańcucha ciężkiego/pełnej długości łańcucha lekkiego zastępuje się strukturalnie podobną sekwencją pełnej długości łańcucha lekkiego. W związku z powyższym, w jednym aspekcie, ujawnienie dostarcza izolowanego przeciwciała monoklonalnego lub jego regionu wiążącego antygen mających: region zmienny łańcucha ciężkiego, zawierający sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NO: 69-77, oraz region zmienny łańcucha lekkiego zawierający sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NO: 80-88; gdzie przeciwciało wiąże się swoiście ze sklerostyną. [0061] W innym aspekcie, wynalazek dostarcza (i) izolowanego przeciwciała monoklonalnego mającego: pełnej długości łańcuch ciężki zawierający sekwencję aminokwasową, która została zoptymalizowana do ekspresji w komórce ssaka, wybraną z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NO: , oraz

18 pełnej długości łańcuch lekki zawierający sekwencję aminokwasową, która została zoptymalizowana do ekspresji w komórce ssaka, wybraną z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NO: ; lub (ii) białka funkcjonalnego zawierającego jego część wiążącą antygen. [0062] W innym aspekcie, wynalazek dostarcza (i) izolowanego przeciwciała monoklonalnego mającego: pełnej długości łańcuch ciężki, zawierający sekwencję nukleotydową, która została zoptymalizowana do ekspresji w komórce ssaka, wybraną z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NO: oraz pełnej długości łańcuch lekki zawierający sekwencję nukleotydową, która została zoptymalizowana do ekspresji w komórce ssaka, wybraną z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NO:146-4: lub (ii) białka funkcjonalnego zawierającego jego część wiążącą antygen. [0063] W jeszcze innym aspekcie, wynalazek dostarcza przeciwciał, zawierających regiony CDR1 CDR2 i CDR3 łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego przeciwciał, lub ich kombinacje. Sekwencje aminokwasowe regionów CDR1 łańcucha VH przeciwciał przedstawiono w SEQ ID NO: Sekwencje aminokwasowe regionów CDR2 łańcucha VH przeciwciał przedstawiono w SEQ ID NO: Sekwencje aminokwasowe regionów CDR3 łańcucha VH przeciwciał przedstawiono w SEQ ID NO: Sekwencje aminokwasowe regionów CDR1 łańcucha VL przeciwciał przedstawiono w SEQ ID NO: Sekwencje aminokwasowe regionów CDR2 łańcucha VL przeciwciał przedstawiono w SEQ ID NO: Sekwencje aminokwasowe regionów CDR3 łańcucha VL przeciwciał przedstawiono w SEQ ID NO: Regiony CDR są dokładnie określone za pomocą systemu Kabata (Kabat, E. A., i wsp., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, wyd. 5, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication nr ). [0064] Biorąc pod uwagę, że każde z tych przeciwciał może wiązać się ze sklerostyną i swoistość wiązania antygenu jest głównie determinowana przez regiony CDR1, 2, i 3, sekwencje regionów CDR1, 2, i 3 łańcucha VH oraz sekwencje regionów CDR1, 2, i 3 łańcucha VL można mieszać i dopasowywać (tj. regiony CDR z różnych przeciwciał można mieszać i dopasowywać), przy czym każde przeciwciało może zawierać regiony CDR1, 2 i 3 łańcucha VH i regiony CDR1, 2 i 3 łańcucha VL, z otrzymaniem innych cząsteczek wiążących przeciw sklerostynie według wynalazku. Wiązanie tego typu mieszanych i dopasowanych przeciwciał przeciw sklerostynie można testować stosując testy wiązania opisane powyżej w przykładach (na przykład test ELISA). Gdy sekwencje regionów CDR łańcucha VH miesza się i dopasowuje, sekwencję

19 CDR1, CDR2 i/lub CDR3 z określonej sekwencji VH należy wymienić na strukturalnie podobną(e) sekwencję(e) CDR. Podobnie, gdy sekwencje regionów CDR łańcucha VH miesza się i dopasowuje, sekwencję CDR1, CDR2 i/lub CDR3 z określonej sekwencji VL należy wymienić na strukturalnie podobną(e) sekwencję(e) CDR. Dla osoby biegłej w dziedzinie powinno być oczywiste, że nowe sekwencje VH i VL można otrzymać przez zastąpienie jednej lub większej liczby sekwencji regionu CDR łańcucha VH i/lub VL strukturalnie podobnymi sekwencjami wybranymi spośród sekwencji CDR przedstawionych w niniejszym opisie dla przeciwciał monoklonalnych według niniejszego wynalazku. [0065] Izolowane przeciwciało monoklonalne lub antygen zawierają: region zmienny łańcucha ciężkiego CDR1 zawierający sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NO: 1-11, region zmienny łańcucha ciężkiego CDR2 zawierający sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NO: 12-22, region zmienny łańcucha ciężkiego CDR3 zawierający sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NO: 23-33; region zmienny łańcucha lekkiego CDR1 zawierający sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NO: 34-44; region zmienny łańcucha lekkiego CDR2 zawierający sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NO: 45-55, region zmienny łańcucha lekkiego CDR3 zawierający sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NO: 56-66, gdzie przeciwciało wiąże się swoiście ze sklerostyną. [0066] W pewnym wariancie, przeciwciało zawiera: region zmienny łańcucha ciężkiego CDR1 o sekwencji SEQ ID NO: 3; region zmienny łańcucha ciężkiego CDR2 o sekwencji SEQ ID NO: 14; region zmienny łańcucha ciężkiego CDR3 o sekwencji SEQ ID NO: 25; region zmienny łańcucha lekkiego CDR1 o sekwencji SEQ ID NO: 36; region zmienny łańcucha lekkiego CDR2 o sekwencji SEQ ID NO: 47; i region zmienny łańcucha lekkiego CDR3 o sekwencji SEQ ID NO: 58. [0067] W pewnym wariancie, przeciwciało zawiera: region zmienny łańcucha ciężkiego CDR1 o sekwencji SEQ ID NO: 4; region zmienny łańcucha ciężkiego CDR2 o sekwencji SEQ ID NO: ; region zmienny łańcucha ciężkiego CDR3 o sekwencji SEQ ID NO: 26; region zmienny łańcucha lekkiego CDR1 o sekwencji SEQ ID NO: 37; region zmienny łańcucha lekkiego CDR2 o sekwencji SEQ ID NO: 48; i region zmienny łańcucha lekkiego CDR3 o sekwencji SEQ ID NO: 59. [0068] W pewnym wariancie, przeciwciało zawiera: region zmienny łańcucha ciężkiego CDR1 o sekwencji SEQ ID NO: 5; region zmienny łańcucha ciężkiego CDR2 o

20 sekwencji SEQ ID NO: 16; region zmienny łańcucha ciężkiego CDR3 o sekwencji SEQ ID NO: 27; region zmienny łańcucha lekkiego CDR1 o sekwencji SEQ ID NO: 38; region zmienny łańcucha lekkiego CDR2 o sekwencji SEQ ID NO: 49; i region zmienny łańcucha lekkiego CDR3 o sekwencji SEQ ID NO: 60. [0069] W pewnym wariancie, przeciwciało zawiera: region zmienny łańcucha ciężkiego CDR1 o sekwencji SEQ ID NO: 6; region zmienny łańcucha ciężkiego CDR2 o sekwencji SEQ ID NO: 17; region zmienny łańcucha ciężkiego CDR3 o sekwencji SEQ ID NO: 28; region zmienny łańcucha lekkiego CDR1 o sekwencji SEQ ID NO: 39; region zmienny łańcucha lekkiego CDR2 o sekwencji SEQ ID NO: 50; i region zmienny łańcucha lekkiego CDR3 o sekwencji SEQ ID NO: 61. [0070] W pewnym wariancie, przeciwciało zawiera: region zmienny łańcucha ciężkiego CDR1 o sekwencji SEQ ID NO: 7; region zmienny łańcucha ciężkiego CDR2 o sekwencji SEQ ID NO: 18; region zmienny łańcucha ciężkiego CDR3 o sekwencji SEQ ID NO: 29; region zmienny łańcucha lekkiego CDR1 o sekwencji SEQ ID NO: 40; region zmienny łańcucha lekkiego CDR2 o sekwencji SEQ ID NO: 51; i region zmienny łańcucha lekkiego CDR3 o sekwencji SEQ ID NO: 62. [0071] W pewnym wariancie, przeciwciało zawiera: region zmienny łańcucha ciężkiego CDR1 o sekwencji SEQ ID NO: 8; region zmienny łańcucha ciężkiego CDR2 o sekwencji SEQ ID NO: 19; region zmienny łańcucha ciężkiego CDR3 o sekwencji SEQ ID NO: 30; region zmienny łańcucha lekkiego CDR1 o sekwencji SEQ ID NO: 41; region zmienny łańcucha lekkiego CDR2 o sekwencji SEQ ID NO: 52; i region zmienny łańcucha lekkiego CDR3 o sekwencji SEQ ID NO: 63. [0072] W pewnym wariancie, przeciwciało zawiera: region zmienny łańcucha ciężkiego CDR1 o sekwencji SEQ ID NO: 9; region zmienny łańcucha ciężkiego CDR2 o sekwencji SEQ ID NO: ; region zmienny łańcucha ciężkiego CDR3 o sekwencji SEQ ID NO: 31; region zmienny łańcucha lekkiego CDR1 o sekwencji SEQ ID NO: 42; region zmienny łańcucha lekkiego CDR2 o sekwencji SEQ ID NO: 53; i region zmienny łańcucha lekkiego CDR3 o sekwencji SEQ ID NO: 64. [0073] W pewnym wariancie, przeciwciało zawiera: region zmienny łańcucha ciężkiego CDR1 o sekwencji SEQ ID NO: ; region zmienny łańcucha ciężkiego CDR2 o sekwencji SEQ ID NO: 21; region zmienny łańcucha ciężkiego CDR3 o sekwencji SEQ ID NO: 32; region zmienny łańcucha lekkiego CDR1 o sekwencji SEQ ID NO: 43; region zmienny łańcucha lekkiego CDR2 o sekwencji SEQ ID NO: 54; i region zmienny łańcucha lekkiego CDR3 o sekwencji SEQ ID NO: 65.

21 [0074] W pewnym wariancie, przeciwciało zawiera: region zmienny łańcucha ciężkiego CDR1 o sekwencji SEQ ID NO: 11; region zmienny łańcucha ciężkiego CDR2 o sekwencji SEQ ID NO: 22; region zmienny łańcucha ciężkiego CDR3 o sekwencji SEQ ID NO: 33; region zmienny łańcucha lekkiego CDR1 o sekwencji SEQ ID NO: 44; region zmienny łańcucha lekkiego CDR2 o sekwencji SEQ ID NO: 55; i region zmienny łańcucha lekkiego CDR3 o sekwencji SEQ ID NO: 66. [0075] W znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie, ludzkie przeciwciało zawiera regiony zmienne ciężkiego lub lekkiego łańcucha lub pełnej długości łańcuchy ciężkie lub łańcuchy lekkie, które są produktem lub pochodzą od określonej sekwencji linii zarodkowej, jeżeli regiony zmienne lub pełnej długości łańcuchy przeciwciała uzyskuje się z systemu, w którym wykorzystuje się geny immunoglobulin ludzkiej linii zarodkowej. Takie systemy obejmują immunizację transgenicznej myszy mającej geny ludzkich immunoglobulin, antygenem będącym przedmiotem zainteresowania lub skrining (przesiewanie) bibliotek genów ludzkich immunoglobulin fagach z użyciem antygenu będącego przedmiotem zainteresowania. Ludzkie przeciwciało, które jest produktem lub pochodzi od sekwencji immunoglobuliny ludzkiej linii zarodkowej można zidentyfikować jako takie poprzez porównanie sekwencji aminokwasowej ludzkiego przeciwciała z sekwencjami aminokwasowymi ludzkich immunoglobulin linii zarodkowej i wybór sekwencji ludzkiej immunoglobuliny linii zarodkowej, która jest najbliższa pod względem sekwencji (tj. największy % identyczności) sekwencji przeciwciała ludzkiego. Ludzkie przeciwciało, które jest produktem lub pochodzi od określonej sekwencji immunoglobuliny ludzkiej linii zarodkowej może różnić się aminokwasami w porównaniu do sekwencji linii zarodkowej, z powodu, na przykład, naturalnie występujących mutacji somatycznych, czy też w wyniku celowego wprowadzenia mutacji ukierunkowanej. Jednak, wybrane ludzkie przeciwciało typowo jest w co najmniej 90% identyczne pod względem sekwencji aminokwasów z sekwencją aminokwasową kodowaną przez gen immunoglobuliny ludzkiej linii zarodkowej i zawiera reszty aminokwasowe, które identyfikują ludzkie przeciwciało jako ludzkie w porównaniu z sekwencją aminokwasową immunoglobuliny linii zarodkowej innych gatunków (na przykład sekwencji mysiej linii zarodkowej). W niektórych przypadkach, ludzkie przeciwciało może być w co najmniej 60%, 70%, 80%, 90% lub w co najmniej 95% lub nawet w co najmniej 96%, 97%, 98% lub 99% identyczne pod względem sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową kodowaną przez gen immunoglobuliny linii zarodkowej. Zazwyczaj, ludzkie przeciwciało pochodzące od określonej sekwencji ludzkiej linii zarodkowej będzie wykazywało nie więcej niż różnic w aminokwasach w stosunku do sekwencji

22 aminokwasowej kodowanej przez gen immunoglobuliny ludzkiej linii zarodkowej. W niektórych przypadkach, ludzkie przeciwciało może wykazywać nie więcej niż 5, lub nawet nie więcej niż 4, 3, 2 lub 1 różnic aminokwasów w porównaniu z sekwencją aminokwasową kodowaną przez gen immunoglobuliny linii zarodkowej. W niektórych wykonaniach sekwencję aminokwasową immunoglobulin linii zarodkowej wybiera się z tych zawierających sekwencje regionu zmiennego łańcucha ciężkiego składające się z, odpowiednio, SEQ ID NO:67-68, i sekwencje regionu zmiennego łańcucha lekkiego składające się z, odpowiednio, SEQ ID NO: Przeciwciała homologiczne [0076] W jeszcze innym wykonaniu, ujawnione przeciwciało ma sekwencje aminokwasowe pełnej długości łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego; sekwencje nukleotydowe pełnej długości łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego, lub sekwencje aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego, które są homologiczne z sekwencjami aminokwasowymi i nukleotydowymi przeciwciał opisanych w niniejszym dokumencie, oraz gdzie przeciwciała zachowują pożądane właściwości funkcjonalne przeciwciał przeciw sklerostynie według wynalazku. [0077] Na przykład, ujawnienie dostarcza izolowanego przeciwciała monoklonalnego (lub jego białka funkcjonalnego zawierającego jego część wiążącą antygen) zawierającego region zmienny łańcucha ciężkiego i region zmienny łańcucha lekkiego, przy czym: region zmienny łańcucha ciężkiego zawiera sekwencję aminokwasową, która jest w co najmniej 80% identyczna z sekwencją aminokwasową wybraną z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NO: 67-77; region zmienny łańcucha lekkiego zawiera sekwencję aminokwasową, która jest w co najmniej 80% identyczna z sekwencją aminokwasową wybraną z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NO: 78-88; przeciwciało swoiście wiąże się ze sklerostyną i przeciwciało wykazuje co najmniej jedną z następujących właściwości funkcjonalnych: przeciwciało blokuje działanie hamujące sklerostyny w teście komórkowym sygnalizacji Wnt, przeciwciało blokuje działanie hamujące sklerostyny w teście komórkowym mineralizacji lub blokuje działanie hamujące sklerostyny w teście fosforylacji Smad1 lub przeciwciało hamuje wiązanie sklerostyny z LPR- 6 lub przeciwciało zwiększa kościotworzenie, masę i gęstość kości. [0078] W kolejnym przykładzie, ujawnienie dostarcza izolowanego przeciwciała monoklonalnego (lub jego białka funkcjonalnego zawierającego jego część wiążącą antygen) zawierającego pełnej długości łańcuch ciężki i pełnej długości łańcuch lekki, gdzie: pełnej długości łańcuch ciężki zawiera sekwencję aminokwasową, która jest w co najmniej 80% identyczna z sekwencją aminokwasową wybraną z grupy składającej się z

23 sekwencji SEQ ID NO: ; pełnej długości łańcuch lekki zawiera sekwencję aminokwasową, która jest w co najmniej 80% identyczna z sekwencją aminokwasową wybraną z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NO: ; przeciwciało wiąże się swoiście ze sklerostyną i przeciwciało wykazuje co najmniej jedną z następujących właściwości funkcjonalnych: przeciwciało blokuje działanie hamujące sklerostyny w teście komórkowym sygnalizacji Wnt, przeciwciało blokuje hamujące działanie sklerostyny w teście komórkowym mineralizacji lub blokuje działanie hamujące sklerostyny w teście fosforylacji Smad1 lub przeciwciało hamuje wiązanie sklerostyny z LPR-6 lub przeciwciało zwiększa kościotworzenie, masę i gęstość kości. [0079] W innym przykładzie, ujawnienie dostarcza izolowanego przeciwciała monoklonalnego (lub jego białka funkcjonalnego zawierającego jego część wiążącą antygen) zawierającego pełnej długości łańcuch ciężki i pełnej długości łańcuch lekki, gdzie: pełnej długości łańcuch ciężki jest kodowany przez sekwencję nukleotydową, która jest w co najmniej 80% identyczna z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NO: ; pełnej długości łańcuch lekki zawiera sekwencję nukleotydową, która jest w co najmniej 80% identyczna z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NO: 144-4; przeciwciało wiąże się swoiście ze sklerostyną i przeciwciało wykazuje co najmniej jedną z następujących właściwości funkcjonalnych: przeciwciało blokuje działanie hamujące sklerostyny w teście komórkowym sygnalizacji Wnt, przeciwciało blokuje hamujące działanie sklerostyny w teście komórkowym mineralizacji lub blokuje działanie hamujące sklerostyny w teście fosforylacji Smad1 lub przeciwciało hamuje wiązanie sklerostyny z LPR-6 lub przeciwciało zwiększa kościotworzenie, masę i gęstość kości. [0080] W różnych wariantach, przeciwciało może wykazywać jedną lub większą liczbę, co najmniej dwie lub trzy z właściwości funkcjonalnych omówionych powyżej. Przeciwciało może być na przykład przeciwciałem ludzkim, przeciwciałem humanizowanym lub przeciwciałem chimerycznym. [0081] W innych wariantach, sekwencje aminokwasowe VH i/lub VL mogą być w 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% identyczne z sekwencjami przedstawionymi powyżej. W innych wykonaniach, sekwencje aminokwasowe VH i/lub VL mogą być takie same za wyjątkiem substytucji aminokwasów w nie więcej niż 1,2,3,4 lub 5 pozycjach aminokwasów. Przeciwciało zawierające regiony VH i VL o wysokiej (tj. 80% lub większej) identyczności z regionami VH i VL sekwencji, odpowiednio, SEQ ID NO: oraz SEQ ID NO: 78-88, można otrzymać na drodze mutagenezy (na przykład mutagenezy ukierunkowanej lub mutagenezy za pośrednictwem PCR) cząsteczek kwasu

24 nukleinowego kodujących, odpowiednio, sekwencje SEQ ID NO: i 0-1, a następnie przez badanie kodowanego zmodyfikowanego przeciwciała pod kątem zachowania funkcji (tj. funkcji określonych powyżej) przy użyciu testów funkcjonalnych opisanych w niniejszym opisie. [0082] W innych wariantach, sekwencje aminokwasowe pełnej długości łańcucha ciężkiego i/lub pełnej długości łańcucha lekkiego mogą być w 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% identyczne z sekwencjami przedstawionymi powyżej. Przeciwciało zawierające pełnej długości łańcuch ciężki i pełnej długości łańcuch lekki wykazujące wysoką (tj. 80% lub większą) identyczność z, odpowiednio, pełnej długości łańcuchami ciężkimi o dowolnej spośród sekwencji SEQ ID NO i pełnej długości łańcuchami lekkimi o dowolnej spośród sekwencji SEQ ID NO , można otrzymać na drodze mutagenezy (na przykład mutagenezy ukierunkowanej lub mutagenezy za pośrednictwem PCR) cząsteczek kwasów nukleinowych kodujących, odpowiednio, SEQ ID NO i SEQ ID NO 144-4, a następnie przez badanie kodowanego zmodyfikowanego przeciwciała pod kątem zachowania funkcji (tj. funkcji określonych powyżej) przy użyciu testów funkcjonalnych opisanych w niniejszym opisie. [0083] W innych wariantach, sekwencje nukleotydowe pełnej długości łańcucha ciężkiego i/lub pełnej długości łańcucha lekkiego mogą być w 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% identyczne z sekwencjami przedstawionymi powyżej. [0084] W innych wariantach, regiony zmienne sekwencji nukleotydowych łańcucha ciężkiego i/lub łańcucha lekkiego mogą być w 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% identyczne z sekwencjami przedstawionymi powyżej. [0085] W znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie, procent identyczności pomiędzy dwiema sekwencjami jest funkcją liczby identycznych pozycji wspólnych dla sekwencji (tj. % identyczności = liczba identycznych pozycji/całkowita liczba pozycji x 0), biorąc pod uwagę liczbę przerw i długość każdej przerwy, które należy wprowadzić w celu optymalnego dopasowania dwóch sekwencji. Porównanie sekwencji i określanie procentu identyczności między dwiema sekwencjami można zrealizować stosując algorytm matematyczny, jak opisano w nieograniczających przykładach poniżej. [0086] Procent identyczności między dwiema sekwencjami aminokwasowymi można określić za pomocą algorytmu E. Meyersa i W. Millera (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988), który włączono do programu ALIGN (wersja 2.0), stosując tabelę reszt ważonych PAM1, karę za długość przerwy 12 i karę za przerwę 4. Ponadto, procent identyczności pomiędzy dwiema sekwencjami aminokwasowymi można określić za

25 pomocą algorytmu Needlemana i Wunscha (J. Mol, Biol. 48: , 1970), który został włączony do programu GAP w pakiecie oprogramowania GCG (dostępnym na stronie używając matrycy Blossom 62 lub matrycy PAM250 i wagi przerw 16, 14, 12,, 8, 6 albo 4 i wagi długości wynoszącej 1, 2, 3, 4, 5 lub 6. [0087] Dodatkowo lub alternatywnie, sekwencje białka według wynalazku mogą być również wykorzystywane jako sekwencja zapytania do przeszukiwania publicznych baz danych, w celu, na przykład, identyfikacji spokrewnionych sekwencji. Takie przeszukiwania można przeprowadzać przy użyciu programu XBLAST (wersja 2.0) z Altschul, i wsp., 1990 J.Mol. Biol. 2:403-. Przeszukiwanie białek BLAST można prowadzić za pomocą programu XBLAST, punktacja = 50, długość słowa = 3, aby uzyskać sekwencje aminokwasowe homologiczne do cząsteczek przeciwciał według wynalazku. W celu otrzymania dopasowań z przerwami dla celów porównawczych, można stosować program Gapped BLAST, jak opisano w Altschul i wsp Nucleic Acids Res. 25 (17): W przypadku stosowania programów BLAST i Gapped BLAST, można wykorzystać parametry domyślne odpowiednich programów (na przykład XBLAST i NBLAST), zob. Przeciwciała z konserwatywnymi modyfikacjami [0088] W pewnych wariantach, ujawnione przeciwciało ma region zmienny łańcucha ciężkiego zawierający sekwencje CDR1, CDR2 i CDR3 i region zmiennego łańcucha lekkiego, zawierający sekwencje CDR1, CDR2 i CDR3, przy czym jedna lub większa liczba tych sekwencji CDR ma określone sekwencje aminokwasowe bazujące na przeciwciałach opisanych w niniejszym dokumencie lub ich konserwatywnych modyfikacjach, przy czym przeciwciała zachowują pożądane właściwości funkcjonalne przeciwciał przeciw sklerostynie według wynalazku. Zgodnie z tym, ujawnienie dostarcza izolowanego przeciwciała monoklonalnego lub białka funkcjonalnego zawierających część wiążącą antygen, składającą się z regionu zmiennego łańcucha ciężkiego, zawierającego sekwencje CDR1, CDR2 i CDR3, i regionu zmiennego łańcucha lekkiego, zawierającego sekwencje CDR1, CDR2 i CDR3, przy czym: sekwencję aminokwasową regionu zmiennego łańcucha ciężkiego CDR1 wybiera się z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NO: 1-11 oraz ich konserwatywnych modyfikacji; sekwencje aminokwasowe regionu zmiennego CDR2 łańcucha ciężkiego wybiera się z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NO: 12-2 oraz ich konserwatywnych modyfikacji; sekwencje aminokwasowe regionu zmiennego CDR3 łańcucha ciężkiego wybiera się z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NO: oraz ich konserwatywnych modyfikacji; sekwencje aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha lekkiego CDR1 wybiera się z grupy składającej się z sekwencji SEQ

26 ID NO: oraz ich konserwatywnych modyfikacji; sekwencje aminokwasowe regionów zmiennych CDR2 łańcucha lekkiego wybiera się z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NO: oraz ich konserwatywnych modyfikacji; sekwencje aminokwasowe regionów zmiennych CDR3 łańcucha lekkiego wybiera się z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NO: oraz ich konserwatywnych modyfikacji; przeciwciało wiąże się swoiście ze sklerostyną i przeciwciało wykazuje co najmniej jedną z następujących właściwości funkcjonalnych: przeciwciało blokuje działanie hamujące sklerostyny w teście komórkowym sygnalizacji Wnt, przeciwciało blokuje hamujące działanie sklerostyny w teście komórkowym mineralizacji lub blokuje działanie hamujące sklerostyny w teście fosforylacji Smad1 lub przeciwciało hamuje wiązanie sklerostyny z LPR-6 lub przeciwciało zwiększa kościotworzenie, masę i gęstość kości. [0089] W różnych wariantach, przeciwciało może wykazywać jedną lub większą liczbę, dwa lub większą liczbę, albo trzy lub większą liczbę z wymienionych właściwości funkcjonalnych omówionych powyżej. Takie przeciwciała mogą być, na przykład, ludzkimi przeciwciałami, humanizowanymi przeciwciałami lub chimerycznymi przeciwciałami. [0090] W innych wariantach, ujawnione przeciwciało zoptymalizowane do ekspresji w ssaczej komórce zawiera sekwencję pełnej długości łańcucha ciężkiego i sekwencję pełnej długości łańcucha lekkiego, przy czym jedna lub większa liczba z tych sekwencji ma określone sekwencje aminokwasowe oparte na opisanych w niniejszym dokumencie przeciwciałach lub ich konserwatywnych modyfikacjach i przy czym przeciwciała zachowują pożądane właściwości funkcjonalne przeciwciał przeciw sklerostynie według wynalazku. Zgodnie z tym, wynalazek dostarcza izolowanego przeciwciała monoklonalnego zoptymalizowanego do ekspresji w komórkach ssaków, składającego się z pełnej długości łańcucha ciężkiego i pełnej długości łańcucha lekkiego, przy czym: pełnej długości łańcuch ciężki zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy sekwencji SEQ ID NO: i ich konserwatywnych modyfikacji, oraz pełnej długości łańcuch lekki zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy SEQ ID NO: , i ich konserwatywnych modyfikacji; przeciwciało wiąże się swoiście ze sklerostyną; i przeciwciało wykazuje co najmniej jedną z następujących właściwości funkcjonalnych: przeciwciało blokuje działanie hamujące sklerostyny w teście komórkowym sygnalizacji Wnt, przeciwciało blokuje hamujące działanie sklerostyny w teście komórkowym mineralizacji lub blokuje działanie hamujące sklerostyny w teście fosforylacji Smad1 lub przeciwciało hamuje wiązanie sklerostyny z LPR-6 lub przeciwciało zwiększa kościotworzenie, masę i gęstość kości.

27 [0091] W różnych wariantach, przeciwciało może wykazywać jedną lub większą liczbę, dwa lub większą liczbę, albo trzy lub większą liczbę z wymienionych właściwości funkcjonalnych omówionych powyżej. Takie przeciwciała mogą być, na przykład, ludzkimi przeciwciałami, humanizowanymi przeciwciałami lub chimerycznymi przeciwciałami. [0092] W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, określenie konserwatywne modyfikacje sekwencji w zamierzeniu odnosi się do modyfikacji aminokwasów, które nie mają znaczącego wpływu ani nie zmieniają właściwości wiązania przeciwciała zawierającego sekwencję aminokwasową. Takie konserwatywne modyfikacje obejmują substytucje, addycje i delecje aminokwasów. Modyfikacje mogą być wprowadzane do przeciwciała według niniejszego wynalazku z zastosowaniem standardowych technik znanych w dziedzinie, takich jak ukierunkowana mutageneza oraz mutageneza z zastosowaniem reakcji PCR. [0093] Konserwatywne substytucje aminokwasowe to te, w których reszta aminokwasowa jest zastąpiona resztą aminokwasową zawierającą podobny łańcuch boczny. Rodziny reszt aminokwasowych mających podobne łańcuchy boczne określono w dziedzinie. Rodziny te obejmują aminokwasy z zasadowymi łańcuchami bocznymi (na przykład lizyna, arginina, histydyna), kwasowymi łańcuchami bocznymi (na przykład kwas asparaginowy, kwas glutaminowy), nienaładowanymi polarnymi łańcuchami bocznymi (na przykład glicyna, asparagina, glutamina, seryna, treonina, tyrozyna, cysteina, tryptofan), niepolarnymi łańcuchami bocznymi (na przykład alanina, walina, leucyna, izoleucyna, prolina, fenyloalanina, metionina), beta-rozgałęzionymi łańcuchami bocznymi (na przykład treonina, walina, izoleucyna) i aromatycznymi łańcuchami bocznymi (na przykład tyrozyna, fenyloalanina, tryptofan, histydyna). Tak więc, jedną lub większą liczbę reszt aminokwasowych w obrębie regionów CDR przeciwciała według wynalazku można zastąpić innymi resztami aminokwasowymi z tej samej rodziny łańcuchów bocznych i zmodyfikowane przeciwciała można przebadać pod kątem zachowanych funkcji przy użyciu testów funkcjonalnych opisanych w niniejszym dokumencie. Przeciwciała, które wiążą się z tym samym epitopem, co przeciwciała przeciw sklerostynie według wynalazku [0094] W innym wariancie, ujawnienie dostarcza przeciwciał, które wiążą się z tym samym epitopem co różne swoiste przeciwciała przeciw sklerostynie opisane w niniejszym dokumencie. W rzeczywistości nieoczekiwanie okazało się, że wszystkie przeciwciała opisane w przykładach, które zdolne do:

28 (i) blokowania hamującego działania sklerostyny w teście komórkowym sygnalizacji Wnt; (ii) blokowania hamującego działania w komórkowym teście mineralizacji; (iii) hamowania wiązania sklerostyny z LRP-6; oraz (iv) zwiększanie kościotworzenia, masy i gęstości kości, wiążą się z tym samym epitopem w sklerostynie z wysokim powinowactwem, przy czym wymieniony epitop jest epitopem konformacyjnym obejmującym aminokwasy z obu sekwencji SEQ ID NO: 6 i SEQ ID NO: 7. Nie uciekając się do żadnego konkretnego modelu, proponuje się w niniejszym dokumencie, że sekwencje aminokwasowe SEQ ID NO: 6 i SEQ ID NO: 7 wyznaczają jeden region konformacyjnego epitopu w polipeptydzie sklerostyny, który jest rozpoznawany przez ujawnione przeciwciała. [0095] Dodatkowe przeciwciała mogą być zatem identyfikowane na podstawie ich zdolności do konkurowania krzyżowego (na przykład do konkurencyjnego hamowania wiązania, w sposób statystycznie istotny) z innymi przeciwciałami według wynalazku w standardowych testach wiązania sklerostyny. Zdolność testowanego przeciwciała do hamowania wiązania przeciwciała według wynalazku z ludzką sklerostyną wskazuje, że badane przeciwciało może konkurować z tym przeciwciałem o wiązanie z ludzką sklerostyną; takie przeciwciało może, według nieograniczającej teorii, wiązać się z takim samym lub pokrewnym (na przykład strukturalnie podobnym lub przestrzennie bliższym) epitopem ludzkiej sklerostyny jak przeciwciała, z którymi konkuruje. W pewnym wariancie, przeciwciało, które wiąże się z tym samym epitopem na ludzkiej sklerostynie co przeciwciała według niniejszego wynalazku, jest ludzkim przeciwciałem monoklonalnym. Takie ludzkie przeciwciała monoklonalne mogą być wytwarzane i izolowane sposobem opisanym w przykładach. Konstrukcja przeciwciał i przeciwciała zmodyfikowane [0096] Przeciwciało według wynalazku można ponadto wytworzyć stosując przeciwciało zawierające jedną lub większą liczbę sekwencji VH i/lub VL przedstawionych w niniejszym dokumencie jako materiał wyjściowy do konstrukcji zmodyfikowanego przeciwciała, które może mieć zmienione właściwości w stosunku do przeciwciała wyjściowego. Przeciwciało może być skonstruowane poprzez modyfikację jednej lub większą liczbę reszt w obrębie jednego lub obu regionów zmiennych (na przykład VH i/lub VL), na przykład w obrębie jednego lub większej liczby regionów CDR i/lub w obrębie jednego lub większej liczby regionów zrębowych. Dodatkowo, albo alternatywnie, przeciwciała mogą być konstruowane poprzez modyfikację reszt w

29 regionie(ach) stałym(ych), na przykład w celu zmiany funkcji efektorowej(ych) przeciwciała. [0097] Jednym z rodzajów konstrukcji regionów zmiennych, które można realizować, jest przeszczepienie regionów CDR. Przeciwciała oddziałują z docelowymi antygenami głównie poprzez reszty aminokwasowe, które znajdują się w sześciu regionach determinujących komplementarność (CDR) ciężkiego i lekkiego łańcucha. Z tego powodu, sekwencje aminokwasowe w obrębie CDR są bardziej zróżnicowane pomiędzy poszczególnymi przeciwciał niż sekwencjami na zewnątrz CDR. Ponieważ sekwencje CDR są odpowiedzialne za większość oddziaływań przeciwciało-antygen, możliwe jest poddawanie ekspresji rekombinowanych przeciwciał, które naśladują właściwości naturalnie występujących swoistych przeciwciał przez konstruowanie wektorów ekspresyjnych, zawierających sekwencje CDR z naturalnie występującego swoistego przeciwciała szczepionego na sekwencjach zrębowych innego przeciwciała o różniących się właściwościach (patrz na przykład Riechmann, L. i wsp., 1998 Nature 332: ;. Jones, P. i wsp., 1986 Nature 321: ;. Queen, C. i wsp., 1989, Natl. Acad. See. Stany Zjednoczone 86: ; dokument patentowy Stanów Zjednoczonych nr dla Wintera i dokumenty patentowe Stanów Zjednoczonych nr 55301, ; i dla Queena i wsp.) [0098] Odpowiednio, inny wariant wynalazku dotyczy izolowanego przeciwciała monoklonalnego lub białka funkcjonalnego zawierającego jego fragment wiążący antygen, zawierającego region zmienny łańcucha ciężkiego zawierający sekwencje CDR1 o sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NO: 1-11; sekwencje CDR2 o sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NO: 12-22; sekwencje CDR3 o sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NO: 23-33, odpowiednio; i region zmienny łańcucha lekkiego o sekwencji aminokwasowej CDR1 wybranej z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NO: 34-44; sekwencje CDR2 o sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NO: 45-55; oraz sekwencje CDR3 składające się z sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy składającej się, odpowiednio, z sekwencji SEQ ID NO: Tak więc, takie sekwencje przeciwciał zawierają sekwencje CDR łańcucha VH i VL przeciwciał monoklonalnych, lecz mogą zawierać inne sekwencje zrębowe tych przeciwciał. [0099] Takie sekwencje zrębowe można otrzymać z publicznej bazy danych DNA lub opublikowanych źródeł zawierających sekwencje genów przeciwciała linii zarodkowej. Na przykład, sekwencje DNA linii zarodkowej dla ludzkich genów regionu zmiennego

30 łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego można znaleźć w bazie sekwencji ludzkiej linii zarodkowej VBase (dostępna w Internecie pod adresem mrccpe.camac.uk/vbase), jak również w Kabat, E. A., i wsp., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, wyd. 5, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication nr ; Tomlinson, I. M. i wsp., 1992 J. fol. Biol. 227: ; i Cox, J. P. L. i wsp., 1994 Eur. J Immunol. 24: [00] Przykładowe sekwencje zrębowe do zastosowania w ujawnionych przeciwciałach to te, które są strukturalnie podobne do sekwencji zrębowych stosowanych w wybranych przeciwciałach według wynalazku, na przykład, sekwencje konsensusowe i/lub sekwencje zrębowe stosowane w przeciwciałach monoklonalnych według wynalazku. Sekwencje CDR1, 2 i 3 łańcucha VH i sekwencje CDR1, 2 i 3 łańcucha VL mogą być szczepione na regionach zrębowych, które mają identyczną sekwencję jak w genie immunoglobuliny linii zarodkowej, od której pochodzi sekwencja zrębowa, lub sekwencje CDR mogą być szczepione na regionach zrębowych, które zawierają jedną lub większą liczbę mutacji w porównaniu do sekwencji linii zarodkowej. Na przykład, stwierdzono, że w pewnych przypadkach korzystna może być mutacja reszt w regionach zrębowych w celu zachowania lub zwiększenia zdolności wiązania antygenu przez przeciwciało (patrz, na przykład, dokumenty patentowe Stanów Zjednoczonych nr 55301, , i dla Queena i wsp.) [01] Inny typ modyfikacji regionu zmiennego to mutacja reszt aminokwasowych w obrębie regionów CDR1, CDR2 i/lub CDR3 łańcucha VH i/lub VL, z poprawą tym sposobem jednej lub większej liczby właściwości wiązania (na przykład powinowactwa) przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania, co określa się jako dojrzewanie powinowactwa. Ukierunkowaną mutagenezę lub mutagenezę za pośrednictwem PCR można przeprowadzać w celu wprowadzenia mutacji, a wpływ na zdolność przeciwciała do wiązania lub modyfikacji innych właściwości funkcjonalnych przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania można ocenić w testach in vitro lub in vivo, jak opisano w niniejszym dokumencie i przedstawiono w przykładach. Można wprowadzić konserwatywne modyfikacje (jak omówiono powyżej). Mutacje mogą być substytucjami, insercjami lub delecjami aminokwasów. Ponadto zazwyczaj modyfikuje się nie więcej niż jedną, dwie, trzy, cztery albo pięć reszt w regionie CDR. [02] Zatem, w innym wariancie, ujawnienie dostarcza izolowanych przeciwciał monoklonalnych przeciw sklerostynie lub białka funkcjonalnego zawierającego jego część wiążącą antygen, składających się z regionu zmiennego łańcucha ciężkiego mającego: region CDR1 łańcucha VH, składający się z sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy

31 sekwencji SEQ ID NO: 1-11 albo sekwencji aminokwasowej zawierającej jedną, dwie, trzy, cztery lub pięć substytucji, delecji lub addycji aminokwasów w porównaniu z sekwencjami SEQ ID NO: 1-11; region CDR2 łańcucha VH o sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NO: lub sekwencji aminokwasowej zawierającej jedną, dwie, trzy, cztery lub pięć substytucji, delecji lub addycji aminokwasów w porównaniu z sekwencjami SEQ ID NO: 12-22; region CDR3 łańcucha VH o sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NO: 23-33, lub sekwencji aminokwasowej zawierającej jedną, dwie, trzy, cztery lub pięć substytucji, delecji lub addycji aminokwasów w porównaniu z sekwencjami SEQ ID NO: 23-33; region CDR1 łańcucha VL o sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NO: 34-44, lub sekwencji aminokwasowej zawierającej jedną, dwie, trzy, cztery lub pięć substytucji, delecji lub addycji aminokwasów w porównaniu z sekwencjami SEQ ID NO: 34-44; region CDR2 łańcucha VL o sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NO: 45-55, lub sekwencji aminokwasowej zawierającej jedną, dwie, trzy, cztery lub pięć substytucji, delecji lub addycji aminokwasów w porównaniu z sekwencjami SEQ ID NO: 45-55, oraz region CDR3 łańcucha VL o sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NO: 56-66, sekwencji aminokwasowej zawierającej jedną, dwie, trzy, cztery lub pięć substytucji, delecji lub addycji aminokwasów w porównaniu z sekwencjami SEQ ID NO: Konstrukcja regionu zrębowego lub Fc [03] Ujawnione w niniejszym dokumencie konstruowane przeciwciała obejmują te, w których wprowadzono zmiany do reszt zrębowych w obrębie łańcucha VH i/lub VL, na przykład w celu poprawy właściwości przeciwciała. Na ogół takie modyfikacje zrębu przeprowadza się w celu zmniejszenia immunogenności przeciwciała. Na przykład, jednym z podejść jest mutacja wsteczna jednej lub większej liczby reszt zrębowych w odpowiadającej sekwencji linii zarodkowej. Bardziej szczegółowo, przeciwciało, które ulega mutacji somatycznej może zawierać reszty zrębowe, które różnią się od sekwencji zarodkowej, z którego pochodzi przeciwciało. Takie reszty można zidentyfikować poprzez porównanie sekwencji zrębowej przeciwciała z sekwencją linii zarodkowej, z której przeciwciało pochodzi. Aby przywrócić sekwencje regionu zrębowego do ich konfiguracji linii zarodkowej mutacje somatyczne można poddać mutacji wstecznej do sekwencji linii zarodkowej poprzez, na przykład, ukierunkowaną mutagenezę lub mutagenezę z zastosowaniem reakcji PCR.

32 [04] Inny typ modyfikacji zrębu obejmuje mutowanie jednego lub większej liczby reszt w obrębie regionu zrębowego, lub nawet w obrębie jednego lub kilku regionów CDR, w celu usunięcia epitopów limfocytów T, a tym samym zmniejszenia potencjalnej immunogenności przeciwciała. Takie podejście jest także określany jako deimmunizacja i opisane bardziej szczegółowo w publikacji zgłoszenia patentowego Stanów Zjednoczonych nr przez Carra i wsp. [05] Dodatkowo lub alternatywnie do modyfikacji przeprowadzanych w regionach zrębowych lub regionach CDR, przeciwciała ujawnione w niniejszym dokumencie mogą być konstruowane tak, aby obejmowały modyfikacje w obrębie regionu Fc, zazwyczaj w celu zmiany jednej lub większej liczby właściwości funkcjonalnych przeciwciała, takich jak czas półtrwania w surowicy, wiązanie dopełniacza, wiązanie receptora Fc i/lub zależna od antygenu cytotoksyczność komórkowa. Ponadto, ujawnione przeciwciała mogą być modyfikowane chemicznie (na przykład, do przeciwciała można dołączyć jedno lub większą liczbę ugrupowań chemicznych) lub mogą być modyfikowane w celu zmiany jego glikozylacji, ponownie w celu zmiany jednej lub większej liczby właściwości funkcjonalnych przeciwciała. Każde z tych wykonań opisano bardziej szczegółowo poniżej. Numeracja reszt w regionie Fc jest zgodna z indeksem EU Kabata. [06] W jednym wariancie, region zawiasowy CH1 jest zmodyfikowany tak, że liczba reszt cysteiny w regionie zawiasowym zmienia się, na przykład, zwiększa lub zmniejsza. To podejście zostało opisane w dokumencie patentowym Stanów Zjednoczonych nr przez Bodmera i wsp. Liczba reszt cysteiny w regionie zawiasowym domeny CH1 zmienia się w celu, na przykład, ułatwienia składania lekkich i ciężkich łańcuchów lub zwiększenia lub zmniejszenia stabilności przeciwciała. [07] W innym wariancie, region zawiasowy Fc przeciwciała jest zmutowany w celu zmniejszenia biologicznego okresu półtrwania przeciwciała. Bardziej szczegółowo, jedną lub większą liczbę mutacji aminokwasów wprowadza się do regionu styku domen CH2-CH3 fragmentu zawiasowego Fc tak, że przeciwciało wykazuje ograniczone wiązanie białka A bakterii Staphylococcyl (SpA) w stosunku do natywnej domeny regionu zawiasowego Fc wiążącego SpA. To podejście zostało opisane bardziej szczegółowo w dokumencie patentowym Stanów Zjednoczonych nr przez Warda i wsp. [08] W innym wariancie, przeciwciało jest modyfikowane w celu zwiększenia jego biologicznego okresu półtrwania. Możliwe są różne podejścia. Na przykład, można wprowadzić jedną lub większą liczbę następujących mutacji: T252L, T254S, T256F, jak opisano w dokumencie patentowym Stanów Zjednoczonych nr dla Warda. Alternatywnie, w celu zwiększenia okresu biologicznego półtrwania,

33 przeciwciało może być modyfikowane w obrębie regionu CL lub CH1 tak, aby zawierało epitop wiążący receptor ratunkowy z dwóch pętli domeny CH2 regionu Fc przeciwciała IgG, jak zostało opisane w opisach patentowych nr i przez Presta i wsp. [09] W jeszcze innych wariantach, region Fc jest modyfikowany poprzez wymianę co najmniej jednej reszty aminokwasowej na inną resztę aminokwasową w celu zmiany funkcji efektorowych przeciwciała. Na przykład, jedną lub większą liczbę aminokwasów można zastąpić inną resztą aminokwasową tak, że przeciwciało ma zmienione powinowactwo do ligandu efektorowego, ale zachowuje zdolność wiązania antygenu przeciwciała macierzystego. Ligand efektorowy, w stosunku do którego powinowactwo może być zmienione to, na przykład, receptor Fc i składnik dopełniacza C1. To podejście zostało opisane bardziej szczegółowo w dokumentach patentowych Stanów Zjednoczonych nr i , oba dla Wintera i wsp. [01] W innym wariancie, jeden lub większą liczbę aminokwasów wybranych z reszt aminokwasowych można zastąpić inną resztą aminokwasową tak, że przeciwciało wykazuje zmienione powinowactwo do wiązania C1q i/lub zmniejszoną lub zniesioną cytotoksyczność zależną od dopełniacza (CDC). To podejście zostało opisane bardziej szczegółowo w dokumencie patentowym Stanów Zjednoczonych nr przez Idusogie a i wsp. [0111] W innym wariancie, jedną lub większą liczba reszt aminokwasowych zmienia się, aby zmodyfikować zdolność przeciwciała do wiązania dopełniacza. Podejście to zostało opisane w publikacji PCT WO 94/29351 przez Bodmera i wsp. [0112] W jeszcze innym wariancie, region Fc jest modyfikowany w celu zwiększenia zdolności przeciwciał do pośredniczenia w zależnej od przeciwciał cytotoksyczności komórkowej (ADCC) i/lub w celu zwiększenia powinowactwa przeciwciała do receptora Fcy poprzez modyfikację jednego lub większej liczby aminokwasów. Podejście to zostało opisane w publikacji PCT WO 00/ 472 przez Presta. Ponadto, miejsca wiązania na ludzkiej IgG1 dla FcyRI, FcyRII, FcyRIII i FcRn zmapowano i opasano warianty o poprawionym wiązaniu (patrz Shields, R.L. i wsp., 01 J. Biol. Chen. 276: ). W jeszcze innym wariancie, zmodyfikowana jest glikozylacja przeciwciała. Na przykład, można wytworzyć aglikozylowane przeciwciało (na przykład przeciwciało wykazujące brak glikozylacji). Glikozylację można zmieniać w celu, na przykład, zwiększenia powinowactwa przeciwciała do antygenu. Takie modyfikacje węglowodanów, można przeprowadzać, na przykład, poprzez zmianę jednego lub większej liczby miejsc glikozylacji w obrębie sekwencji przeciwciała. Na przykład, można

34 podstawić jeden lub większą liczbę aminokwasów, co powoduje eliminację jednego lub większej liczby miejsc glikozylacji zmiennych regionów zrębowych z eliminacją tym sposobem glikozylacji w tym miejscu. Taka aglikozylacja może zwiększać powinowactwo przeciwciała do antygenu. Takie podejście zostało opisane bardziej szczegółowo w dokumentach patentowych Stanów Zjednoczonych nr i , przez Co i wsp. [0113] Dodatkowo albo alternatywnie, można wytworzyć przeciwciało o zmienionym rodzaju glikozylacji, takie jak hipofukozylowane przeciwciało o zmniejszonej ilości reszt fukozylowych lub przeciwciało o zwiększonej przepoławiającej strukturze GlcNAc. Wykazano, że takie zmienione wzory glikozylacji zwiększają zdolność ADCC przeciwciał. Takie modyfikacje węglowodanów można przeprowadzić, na przykład, poddając ekspresji przeciwciała w komórkach gospodarza, o zmienionych mechanizmach służących do glikozylacji. Komórki o zmienionych mechanizmach służących do glikozylacji opisano w dziedzinie i mogą być wykorzystywane jako komórki gospodarza do ekspresji rekombinowanych przeciwciał z wytworzeniem przeciwciała o zmienionej glikozylacji. Na przykład, w EP dla Hanga i wsp. opisano linię komórkową z funkcjonalnie przerwanym genem FUT8, który koduje transferazę fukozylu tak, że przeciwciała poddawane ekspresji w takiej linii komórkowej wykazują hipofukozylację. W publikacji PCT WO 03/ dla Presta opisano wariant linii komórek CHO, komórki Lecl3, o ograniczonej zdolności do przyłączania fukozy do Asn (297)-związanych węglowodanów, co również powoduje hipofukozylację przeciwciał poddawanych ekspresji w tych komórkach gospodarza (patrz również Shields, R.L. i wsp., 02 J. Biol. Chem. 277: ). W publikacji PCT WO 99/54342 dla Umana i wsp. opisano linię komórkową skonstruowaną do ekspresji transferaz glikozylowych modyfikowanych glikoproteinami (na przykład beta-(1,4)-n-acetyloglukozaminylotransferazy III (GnTIII)) tak, że przeciwciała poddane ekspresji w skonstruowanych liniach komórkowych wykazują zwiększenie liczby przedzielających struktur GlcNAc, co powoduje wzrost aktywności ADCC przeciwciał (patrz również Umana i wsp., 1999 Nat. Biotech. 17: ). [0114] Inna rozważana modyfikacja przeciwciała według niniejszego wynalazku, to pegylacja. Przeciwciało może być pegylowane, na przykład, w celu zwiększenia biologicznego (na przykład w surowicy) okresu półtrwania. W celu przeprowadzenia pegylacji przeciwciała, przeciwciało lub jego fragment typowo poddaje się reakcji z poli(glikolem etylenowym) w postaci reaktywnej pochodnej estrowej lub reaktywnej pochodnej aldehydowej PEG, w warunkach, w których jedna lub większa liczba grup PEG zostaje przyłączonych do przeciwciała lub fragmentu przeciwciała. Pegylację można

35 5 34 przeprowadzać w reakcji acylowania lub reakcji alkilowania z reaktywną cząsteczką PEG (lub analogicznym reaktywnym polimerem rozpuszczalnym w wodzie). W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, termin poli(glikol etylenowy) w zamierzeniu obejmuje dowolną z postaci PEG, które zastosowano do derywatyzacji innych białek, takich jak mono (C1-C) alkoksy- lub aryloksy-poli(glikol etylenowy) lub poli(glikol etylenowy)- maleimid. W niektórych wykonaniach, przeciwciało przeznaczone do pegylacji jest aglikozylowanym przeciwciałem. Sposoby pegylacji białek są znane w dziedzinie i mogą być stosowane do przeciwciał według wynalazku, patrz, na przykład, EP dla Nishimura i wsp. i EP dla Ishikawa i wsp. [01] Inną rozważaną modyfikacją przeciwciała jest koniugat lub białko fuzyjne co najmniej regionu wiążącego antygen przeciwciała według wynalazku z białkiem surowicy, takim jak albumina surowicy ludzkiej, lub jego fragmentem w celu zwiększenia okresu półtrwania uzyskanej cząsteczki. Takie podejście zostało opisane, na przykład, przez Ballance a i wsp. W EP [0116] Inną możliwością jest fuzja co najmniej regionu wiążącego antygen przeciwciała z białkiem zdolnym do wiązania się z białkami osocza, na przykład albuminą surowicy ludzkiej, w celu zwiększenia okresu półtrwania uzyskanej cząsteczki. Takie podejście zostało opisane, na przykład, przez Nygrena i wsp. w EP Metody konstrukcji zmodyfikowanych przeciwciał [0117] Jak opisano powyżej, przeciwciała przeciw sklerostynie mające sekwencje VH i VL lub sekwencje o pełnej długości łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego przedstawione w niniejszym dokumencie, mogą być stosowane do wytwarzania nowych przeciwciał przeciw sklerostynie poprzez modyfikacje sekwencji pełnej długości łańcucha ciężkiego i/lub łańcucha lekkiego, sekwencji VH i/lub VL, lub regionu(ów) stałego(ych) do nich przyłączonego(ych). Tak więc, w innym aspekcie, cechy strukturalne przeciwciała przeciw sklerostynie według wynalazku są stosowane do wytwarzania strukturalnie pokrewnych przeciwciał przeciw sklerostynie, które zachowały co najmniej jedną właściwość funkcjonalną przeciwciała według wynalazku, na przykład wiązania z ludzką sklerostyną oraz hamowania jednej lub większej liczby właściwości funkcjonalnych sklerostyny (na przykład, wiązania z receptorem, zapobiegania lub łagodzenia osteolizy). [0118] Na przykład, jeden lub większą liczbę regionów CDR ujawnionych przeciwciał albo ich mutacji, można łączyć rekombinacyjnie ze znanymi regionami zrębowymi i/lub innymi regionami CDR w celu wytworzenia dodatkowych rekombinacyjnie skonstruowanych przeciwciał przeciw sklerostynie według wynalazku,

36 jak opisano powyżej. Inne rodzaje modyfikacji obejmują te opisane w poprzednim rozdziale. Materiał wyjściowy dla metod konstrukcji to jedna lub większa liczba sekwencji VH i/lub VL, dostarczanych w niniejszym dokumencie, lub jeden lub większa liczba ich regionów CDR. W celu utworzenia przeciwciała technikami inżynierii genetycznej, nie jest konieczne, aby rzeczywiście wytworzyć (tj. poddać ekspresji jako białko) przeciwciało zawierające jedną lub większą liczbę sekwencji VH i/lub VL dostarczanych w niniejszym dokumencie, lub jeden lub większą liczbę regionów CDR. Przeciwnie, informację zawartą w sekwencji(ach) stosuje się jako materiał wyjściowy do wytwarzania sekwencji drugiej generacji pochodzącej(ych) z pierwotnej(ych) sekwencji, a następnie otrzymuje się sekwencję(e) drugiej generacji i poddaje ekspresji jako białko. [0119] Zatem, w innym wariancie, ujawnienie dostarcza sposobu wytwarzania przeciwciała przeciw sklerostynie składającego się z: sekwencji regionu zmiennego łańcucha ciężkiego przeciwciała o sekwencji CDR1 wybranej z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NO: 1-11, sekwencji CDR2 wybranej z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NO: i/lub sekwencji CDR3 wybranej z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NO: 23-33; oraz sekwencji regionu zmiennego łańcucha lekkiego przeciwciała o sekwencji CDR1 wybranej z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NO: 34-44, sekwencji CDR2 wybranej z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NO: i/lub sekwencji CDR3 wybranej z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NO: 56-66; modyfikacji przynajmniej jednej reszty aminokwasowej w sekwencji regionu zmiennego łańcucha ciężkiego przeciwciała i/lub sekwencji regionu zmiennego łańcucha lekkiego przeciwciała, w celu utworzenia co najmniej jednej zmienionej sekwencji przeciwciała; oraz ekspresji zmodyfikowanej sekwencji przeciwciała jako białka. [01] Zatem, w innym wariancie, ujawnienie dostarcza sposobu wytwarzania przeciwciała przeciw sklerostynie zoptymalizowanego do ekspresji w komórkach ssaków, składającego się z: sekwencji pełnej długości łańcucha ciężkiego przeciwciała mającego sekwencję wybraną z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NO: , oraz pełnej długości sekwencję łańcucha lekkiego przeciwciała o sekwencji wybranej z grupy ; zmianę przynajmniej jednej reszty aminokwasowej w sekwencji pełnej długości łańcucha ciężkiego przeciwciała i/lub sekwencji pełnej długości łańcucha lekkiego przeciwciała w celu otrzymania co najmniej jednej zmienionej sekwencji przeciwciała oraz ekspresję zmodyfikowanej sekwencji przeciwciała w białku. [0121] Zmienioną sekwencję przeciwciała można również wytwarzać poprzez skrining bibliotek przeciwciał o ustalonych sekwencjach CDR3 wybranych z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NO:23-33 lub minimalnych istotnych determinant

37 wiążących, jak opisano w US i różnorodności sekwencji CDR1 i CDR2. Skrining można przeprowadzać dowolną techniką odpowiednią do skriningu bibliotek przeciwciał, taką jak technologia fagowa odpowiednia do skriningu przeciwciał z bibliotek przeciwciał, jak techniki prezentacji na fagach. [0122] Do wytwarzania i ekspresji zmodyfikowanej sekwencji przeciwciała można stosować standardowe techniki biologii molekularnej. Przeciwciało kodowane przez zmienioną(e) sekwencję(e) to takie, które zachowuje jedną, niektóre lub wszystkie z właściwości funkcjonalnych przeciwciał przeciw sklerostynie opisanych w niniejszym dokumencie, którego właściwości funkcjonalne obejmują, ale nie są ograniczone do, swoiste wiązanie z ludzką sklerostyną, i przeciwciało wykazuje co najmniej jedną z następujących właściwości funkcjonalnych: przeciwciało blokuje działanie hamujące sklerostyny w teście komórkowym sygnalizacji Wnt, przeciwciało blokuje hamujące działanie sklerostyny w teście komórkowym mineralizacji lub blokuje działanie hamujące sklerostyny w teście fosforylacji Smad1 lub przeciwciało hamuje wiązanie sklerostyny z LPR- 6 lub przeciwciało zwiększa kościotworzenie, masę i gęstość kości. [0123] Zmodyfikowane przeciwciało może wykazywać jedną lub większą liczbę, dwie lub większą liczbę, albo trzy lub większą liczbę właściwości funkcjonalnych omówionych powyżej. [0124] Właściwości funkcjonalne zmodyfikowanych przeciwciał można ocenić stosując standardowe testy dostępne w tej dziedzinie i/lub opisane w niniejszym dokumencie, takie jak te, które przedstawiono w przykładach (na przykład test ELISA). [0125] W pewnych wykonaniach metod konstrukcji przeciwciał, mutacje mogą być wprowadzane losowo lub selektywnie w całej lub części sekwencji kodującej przeciwciała przeciw sklerostynie i otrzymane zmodyfikowane przeciwciała przeciw sklerostynie mogą być poddawane skriningowi pod kątem aktywności wiązania i/lub innych właściwości funkcjonalnych, jak opisano w niniejszym dokumencie. Metody mutacji opisano w stanie techniki. Na przykład, w publikacji PCT WO 02/ opisano w skrócie metody wytwarzania i skriningu mutacji przeciwciał przy użyciu mutagenezy wysycenia, składania syntetycznych cząsteczek drogą ligacji lub ich kombinacji. Alternatywnie, w publikacji PCT WO 03/ Lazar i wsp. opisali sposoby wykorzystania obliczeniowych metod przesiewowych do optymalizacji właściwości fizykochemicznych przeciwciał. Cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące przeciwciała według wynalazku [0126] Inny aspekt wynalazku odnosi się do cząsteczek kwasu nukleinowego, które kodują przeciwciało według wynalazku. Przykłady macierzystych sekwencji

38 nukleotydowych pełnej długości łańcucha lekkiego przedstawiono w sekwencjach SEQ ID NO: Przykłady macierzystych sekwencji nukleotydowych pełnej długości łańcucha ciężkiego przedstawiono w sekwencjach SEQ ID NO: Przykłady sekwencji nukleotydowych pełnej długości łańcucha lekkiego zoptymalizowane do ekspresji w ssaczej komórce przedstawiono w sekwencjach SEQ ID NO: Przykłady sekwencji nukleotydowych pełnej długości łańcucha ciężkiego zoptymalizowane do ekspresji w ssaczej komórce przedstawiono w sekwencjach SEQ ID NO: [0127] Kwasy nukleinowe mogą być obecne w całych komórkach, w lizacie komórkowym lub mogą być kwasami nukleinowymi w postaci częściowo oczyszczonej lub zasadniczo czystej. Kwas nukleinowy jest izolowany lub zasadniczo oczyszczony, gdy jest oczyszczony z innych składników komórkowych lub innych zanieczyszczeń, na przykład innych komórkowych kwasów nukleinowych lub białek, standardowymi technikami obejmującymi traktowanie zasadą/sds, wirowanie w gradiencie CsCl, chromatografię kolumnową, elektroforezę w żelu agarozowym i inne metody dobrze znane w dziedzinie, patrz F. Ausubel, i wsp., wyd Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York. Kwas nukleinowy według wynalazku może być, na przykład DNA lub RNA i może, ale nie musi zawierać sekwencji intronowych. W wykonaniu, kwasem nukleinowym jest cząsteczka cdna. Kwas nukleinowy może znajdować się w wektorze, takim jak wektor ekspresji fagowej lub rekombinowany wektor plazmidowy. [0128] Kwasy nukleinowe według wynalazku można otrzymać za pomocą standardowych technik biologii molekularnej. W przypadku przeciwciał, które są poddawane ekspresji przez hybrydomy (na przykład hybrydomy otrzymane z myszy transgenicznych z genami ludzkich immunoglobulin, jak opisano poniżej), cdna kodujące lekkie i ciężkie łańcuchy przeciwciała, wytwarzane przez hybrydomy można uzyskać za pomocą standardowych technik amplifikacji PCR i klonowania cdna. W przypadku przeciwciał uzyskanych z biblioteki genów immunoglobulin (na przykład przy użyciu techniki prezentacji fagowej), kwas nukleinowy kodujący przeciwciało może być odzyskiwany z różnych klonów fagów, należących do biblioteki. [0129] Po otrzymaniu fragmentów DNA kodujących segmenty VH i VL, te fragmenty DNA mogą być dalej poddawane obróbce za pomocą standardowych technik rekombinacji DNA, na przykład w celu przekształcenia genów regionów zmiennych do genów łańcucha przeciwciała o pełnej długości, genów fragmentów Fab lub genu scfv. Podczas tej obróbki, fragment DNA kodujący VL lub VH jest funkcjonalnie łączony z inną

39 cząsteczką DNA i z fragmentem kodującym inne białko, takim jak region stały przeciwciała lub elastyczny łącznik. Termin funkcjonalnie połączony, w znaczeniu stosowanym w niniejszym kontekście oznacza, że te dwa fragmenty DNA są połączone w sposób funkcjonalny, na przykład tak, że sekwencje aminokwasowe, kodowane przez dwa fragmenty DNA pozostają w ramce lub tak, że białko ulega ekspresji pod kontrolą żądanego promotora. [0130] Izolowane DNA kodujące region VH można przekształcić do genu pełnej długości łańcucha ciężkiego, przez funkcjonalne połączenie DNA kodującego VH z inną cząsteczką DNA kodującą regiony stałe łańcucha ciężkiego (CH1, CH2 i CH3). Sekwencje genów ludzkiego regionu stałego łańcucha ciężkiego są znane w dziedzinie (patrz na przykład Kabat, EA, el al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, wyd. 5, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication nr ) i fragmenty DNA obejmujące te regiony można otrzymać za pomocą standardowej reakcji PCR. Region stały łańcucha ciężkiego może być regionem stałym IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM lub IgD. Korzystnie, region stały łańcucha ciężkiego wybiera się spośród izotypów lgg2. W przypadku genu fragmentu Fab łańcucha ciężkiego, DNA kodujące VH może być funkcjonalnie połączone z inną cząsteczką DNA kodującą tylko region stały ciężkiego łańcucha CH1. [0131] Izolowane DNA kodujące region VL można przekształcić do genu łańcucha lekkiego pełnej długości (jak również do genu fragmentu Fab łańcucha lekkiego) poprzez funkcjonalne połączenie DNA kodującego VL z inną cząsteczką DNA kodującą region stały łańcucha lekkiego, CL. Sekwencje genów ludzkiego regionu stałego łańcucha lekkiego są znane w dziedzinie (patrz na przykład Kabat, E. A., i wsp., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, wyd. 5, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication nr ), a fragmenty DNA obejmujące te regiony można uzyskać za pomocą standardowej amplifikacji PCR. Region stały łańcucha lekkiego może być regionem stałym kappa lub lambda. [0132] W celu utworzenia genu scfv, fragmenty DNA kodujące VH i VL, są funkcjonalnie łączone z innym fragmentem kodującym elastyczny łącznik, na przykład kodującym sekwencję aminokwasową (Gly4 -Ser) 3 tak, że sekwencje VH i VL mogą być mogą być poddawane ekspresji jako ciągłe jednołańcuchowe białko, z regionami VL i VH połączonymi przez elastyczny łącznik (patrz na przykład Bird i wsp., 1988 Science 242: ; Huston i wsp., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: ; McCafferty i wsp., 1990 Nature 348: ). Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych według wynalazku

40 [0133] Przeciwciała monoklonalne (mab) można wytwarzać różnymi technikami, włączając konwencjonalną technikę przeciwciał monoklonalnych, na przykład standardową technikę hybrydyzacji komórek somatycznych według Kohlera i Milsteina, 1975 Nature 256: 495. Można zastosować wiele technik wytwarzania przeciwciał monoklonalnych, na przykład wirusową lub onkogenną transformację limfocytów B. [0134] System zwierzęcy do otrzymywania hybrydom jest systemem mysim. Wytwarzanie hybridom u myszy jest procedurą dobrze ustaloną. Protokoły immunizacji i techniki izolacji immunizowanych splenocytów do fuzji są znane w stanie techniki. Partnerzy fuzji (na przykład mysie komórki szpiczaka) i procedury fuzji również są znane. [0135] Chimeryczne i humanizowane przeciwciała można wytwarzać w oparciu o sekwencję mysiego przeciwciała monoklonalnego wytworzonego jak opisano powyżej. DNA kodujące immunoglobuliny, z łańcuchem ciężkim i lekkim, można otrzymać z mysiej hybrydomy będącej przedmiotem zainteresowania i skonstruować tak, aby zawierało nie-mysie (na przykład ludzkie) sekwencje immunoglobulin za pomocą standardowych technik biologii molekularnej. Na przykład, w celu wytworzenia chimerycznego przeciwciała, mysie regiony zmienne można połączyć z ludzkimi regionami stałymi stosując metody znane w dziedzinie (patrz, na przykład, dokument patentowy Stanów Zjednoczonych nr dla Cabilly ego i wsp.). Aby otrzymać humanizowane przeciwciało, mysie regiony CDR można wstawić do ludzkiego regionu zrębowego, stosując metody znane w tej dziedzinie, patrz na przykład dokument patentowy Stanów Zjednoczonych nr dla Wintera i dokumenty patentowe Stanów Zjednoczonych nr 55301; ; i dla Queena i wsp. [0136] W pewnym wykonaniu, przeciwciała według wynalazku są ludzkimi przeciwciałami monoklonalnymi. Takie ludzkie przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko sklerostynie można wytworzyć stosując myszy transgeniczne lub transchromosomowe z częściami ludzkiego układu immunologicznego raczej niż mysiego. Te myszy transgeniczne i transchromosomowe obejmują myszy, o których mowa w niniejszym dokumencie, jako, odpowiednio, myszy HuMAb i myszy KM, i są wspólnie określane dalej jako myszy z ludzką Ig [0137] Mysz HuMAb (Medarex, Inc) zawiera miniloci genu ludzkiej immunoglobuliny kodujące nieuporządkowane sekwencje ciężkiego (μ i γ) i lekkiego к łańcucha ludzkich immunoglobulin, wraz z ukierunkowanymi mutacjami, które inaktywują endogenne loci łańcucha μ i к (patrz na przykład Lonberg, i wsp., 1994 Nature 368(6474): ). Odpowiednio, myszy wykazują zredukowaną ekspresję mysich IgM lub к oraz w odpowiedzi na immunizację, wprowadzone transgeny ludzkiego łańcucha ciężkiego i

41 lekkiego są poddawane przełączeniu klas i mutacji somatycznej z wytworzeniem ludzkiego monoklonalnego IgGк o wysokim powinowactwie (Lonberg, N. i wsp., 1994 supra; przegląd w Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-1; Lonberg, N. i Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol.13: 65-93, i Harding, F. i Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764: ). Wytwarzanie i zastosowanie mysiego HuMAb i modyfikacje genomowe, które zawierają te myszy, opisano dalej w Taylor, L. i wsp., 1992 Nucleic Acids Research : ; Chen, J. i wsp., 1993 International Immunology 5: ; Tuaillon i wsp., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: ; Choi i wsp., 1993 Nature Genetics 4: ; Chen, J. i wsp., 1993 EMBO J. 12: ; Tuaillon i wsp., 1994 J. Immunol. 2: ; Taylor, L. i wsp., 1994 International Immunology ; i Fishwild, D. i wsp., 1996 Nature Biotechnology 14: Patrz ponadto dokumenty patentowe Stanów Zjednoczonych nr , , , , , , 56616, , oraz ; wszystkie dla Lonberga i Kay a, dokumenty patentowe Stanów Zjednoczonych nr dla Surani a i wsp.,. publikacje PCT nr WO 92/3918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/113852, WO 98/24884 i WO 99/45962, wszystkie dla Lonberga i Kay a, oraz publikacja PCT nr WO 01/ dla Kormana i wsp. [0138] W innym wykonaniu, ludzkie przeciwciała według wynalazku można otrzymać stosując myszy z sekwencjami ludzkich immunoglobulin na transgenach i transchromosomach, takie jak myszy z transchromosomem ludzkiego łańcucha ciężkiego i ludzkiego łańcucha lekkiego. Myszy te, określane w niniejszym dokumencie jako myszy KM opisano szczegółowo w publikacji PCT WO 02/ dla Ishida a i wsp. [0139] Ponadto, alternatywne systemy zwierząt transgenicznych wykazujące ekspresję genów ludzkich immunoglobulin są dostępne w tej dziedzinie i mogą być wykorzystywane do otrzymywania przeciwciał przeciw sklerostynie według wynalazku. Na przykład, może być stosowany alternatywny transgeniczny systemem określany dalej jako Xenomouse (Abgenix, Inc.) Takie myszy opisano, na przykład, w dokumentach patentowych Stanów Zjednoczonych nr , , , i dla Kucherlapati ego i wsp. [0140] Ponadto, alternatywne transchromosomowe systemy zwierzęce wykazujące ekspresję genów ludzkich immunoglobulin są dostępne w dziedzinie i mogą być wykorzystywane do otrzymywania przeciwciał przeciw sklerostynie według wynalazku. Na przykład, mogą być stosowane myszy z obydwoma, transchromosomem ludzkiego łańcucha ciężkiego, jak i z transchromosomem ludzkiego łańcucha lekkiego, określane jako myszy TC ; takie myszy zostały opisane w Tomizuka i wsp., 00 Proc.

42 Natl. Acad. Sci. USA 97: Ponadto, krowy mające transchromosomy ludzkich ciężkich i lekkich łańcuchów, zostały opisane w dziedzinie (Kuroiwa i wsp., 02 Nature Biotechnology : ) i mogą być wykorzystywane do otrzymywania przeciwciał przeciw sklerostynie według wynalazku. [0141] Ludzkie monoklonalne przeciwciała według wynalazku można także otrzymywać stosując metody prezentacji na fagu do skriningu bibliotek genów ludzkich immunoglobulin. Takie metody prezentacji fagowej służące do izolowania ludzkich przeciwciał są znane w dziedzinie lub opisano je w zamieszczonych poniżej przykładach. Patrz na przykład:. dokumenty patentowe Stanów Zjednoczonych nr ; i dla Ladnera i wsp.; dokumenty patentowe Stanów Zjednoczonych nr i 5,580,717 dla Dowera i wsp.; dokumenty patentowe Stanów Zjednoczonych nr i dla McCafferty ego i wsp.; i dokumenty patentowe Stanów Zjednoczonych nr , , , , i dla Griffithsa i wsp. [0142] Ludzkie monoklonalne przeciwciała według wynalazku można również wytwarzać z wykorzystaniem myszy SCID, w których rekonstytuowano ludzkie komórki odpornościowe tak, że odpowiedź ludzkich przeciwciał można uzyskać w wyniku immunizacji. Takie myszy opisano, na przykład, w dokumentach patentowych Stanów Zjednoczonych nr i dla Wilsona i wsp. Otrzymywanie komórek hybrydoma wytwarzających ludzkie przeciwciała monoklonalne [0143] W celu otrzymania hybrydom produkujących ludzkie przeciwciała monoklonalne według wynalazku, splenocyty i/lub komórki węzłów chłonnych z immunizowanych myszy można wyizolować i poddać fuzji z odpowiednią unieśmiertelnioną linią komórkową, taką jak linia mysich komórek szpiczaka. Powstałe hybrydomy mogą być poddawane skriningowi pod kątem produkcji przeciwciał swoistych wobec antygenu. Na przykład, pojedyncze zawiesiny komórkowe limfocytów śledzionowych pochodzących od immunizowanych myszy można poddać fuzji z jedną szóstą liczby niewydzielniczych komórek szpiczaka P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL 80) z użyciem 50% PEG. Komórki wysiewa się w ilości w przybliżeniu 2 x 145 na płaskodennych płytkach mikrotitracyjnych z dalszą dwutygodniową inkubacją w pożywce do selekcji zawierającą % surowicę płodową Clone, 18% kondycjonowaną pożywkę 653, 5% origen (IGEN), 4 mm L-glutaminę, 1 mm pirogronian sodu, 5 mm HEPES, 0,055 mm 2-merkaptoetanol, 50 jednostek/ml penicyliny, 50 mg/ml streptomycyny, 50 mg/ml gentamycyny i 1 x HAT (Sigma; HAT dodaje się 24 godziny po fuzji). Po około dwóch tygodniach, komórki mogą być hodowane w pożywce, w której HAT zastąpiono

43 HT. Poszczególne dołki następnie poddaje się skriningowi w teście ELISA dla ludzkich przeciwciał monoklonalnych IgM i IgG. Po wystąpieniu rozległego wzrostu hybrydomy, pożywkę można obserwować zwykle po -14 dniach. Hybrydomy wydzielające przeciwciała można ponownie umieścić na płytkach, ponownie poddać skriningowi, a jeśli wciąż uzyskuje się wynik dodatni dla ludzkiego IgG, przeciwciała monoklonalne można subklonować co najmniej dwukrotnie metodą ograniczonych rozcieńczeń. Stabilne subklony można następnie hodować in vitro w celu wytworzenia małych ilości przeciwciał w pożywce do hodowli tkankowej w celu scharakteryzowania. [0144] W celu oczyszczenia ludzkich przeciwciał monoklonalnych, wybrane hybrydomy można hodować w dwulitrowych kolbach z łopatkowym systemem mieszania do oczyszczania przeciwciał monoklonalnych. Supernatanty można przesączyć i zatężyć przed poddaniem chromatografii powinowactwa z użyciem białka A-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ). Wymyte IgG można sprawdzać za pomocą elektroforezy żelowej i wysokosprawnej chromatografii cieczowej w celu zapewnienia czystości. Roztwór buforu można wymienić na PBS i stężenie można wyznaczyć przy OD 280 stosując współczynnik ekstynkcji 1,43. Monoklonalne przeciwciała można podzielić na porcje i przechowywać w temperaturze -80 C. Otrzymywanie transfektom produkujących monoklonalne przeciwciała [0145] Przeciwciała według wynalazku można również wytwarzać w komórkach gospodarza transfectoma z zastosowaniem, na przykład, kombinacji technik rekombinacji DNA i metod transfekcji genów, co jest dobrze znane w dziedzinie (na przykład, Morrison, S. (1985) Science 229:12). [0146] Na przykład, w celu ekspresji przeciwciała lub fragmentów tych przeciwciał, DNA kodujące częściowe lub pełnej długości łańcuchy lekkie i ciężkie można uzyskać standardowymi technikami biologii molekularnej (na przykład techniką amplifikacji PCR i klonowania cdna z użyciem hybrydomy, która wykazuje ekspresję przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania) i DNA można wprowadzać do wektorów ekspresyjnych w taki sposób, że geny są połączone funkcjonalnie z sekwencjami regulującymi transkrypcję i translację. W tym kontekście, termin funkcjonalnie połączony w zamierzeniu oznacza, że gen przeciwciała jest poddany ligacji do wektora w taki sposób, że sekwencje regulujące translację i transkrypcję w obrębie wektora pełnią swoją funkcję regulowania transkrypcji i translacji genu przeciwciała. Wektor ekspresyjny i sekwencje regulujące ekspresję wybiera się tak, aby uzyskać zgodność z komórkami gospodarza wykorzystywanymi do ekspresji. Gen łańcucha lekkiego przeciwciała i gen łańcucha ciężkiego przeciwciała można wstawić do oddzielnych wektorów lub, bardziej

44 typowo, oba geny wprowadza się do tego samego wektora ekspresyjnego. Geny dla przeciwciała wstawia się do wektora ekspresyjnego standardowymi metodami (na przykład poprzez ligację komplementarnych miejsc restrykcyjnych fragmentu genu przeciwciała i wektora, albo ligację tępych końców, jeżeli brak jest miejsc restrykcyjnych). Regiony zmienne łańcuchów lekkich i ciężkich przeciwciał opisanych w niniejszym dokumencie można stosować do wytwarzania genów dla przeciwciał pełnej długości dowolnego izotypu przeciwciała przez wstawienie ich do wektorów ekspresyjnych już kodujących regiony stałe łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego żądanego izotypu tak, że segment VH jest funkcjonalnie połączony z segmentem(ami) CH w obrębie wektora, a segment VL jest funkcjonalnie połączony z segmentem CL w obrębie wektora. Dodatkowo lub alternatywnie, rekombinowany wektor ekspresyjny może kodować peptyd sygnałowy, który ułatwia wydzielanie łańcucha przeciwciała z komórki gospodarza. Gen łańcucha przeciwciała można wklonować do wektora tak, że peptyd sygnałowy jest połączony w ramce z N-końcem genu łańcucha przeciwciała. Peptydem sygnałowym może być peptyd sygnałowy immunoglobuliny albo heterologiczny peptyd sygnałowy (tj. peptyd sygnałowy z białka innego niż immunoglobulina). [0147] Oprócz genów łańcucha przeciwciała, rekombinowane wektory ekspresyjne według wynalazku zawierają sekwencje regulatorowe, które kontrolują ekspresję genów łańcucha przeciwciała w komórce gospodarza. Termin sekwencja regulatorowa w zamierzeniu obejmuje promotory, wzmacniacze i inne elementy kontroli ekspresji (na przykład sygnały poliadenylacji), które kontrolują transkrypcję lub translację genów łańcucha przeciwciała. Takie sekwencje regulatorowe opisano, na przykład, w Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA 1990). Dla osób biegłych w dziedzinie powinno być oczywiste, że projektowanie wektora ekspresyjnego, włączając wybór sekwencji regulatorowych, może zależeć od takich czynników, jak wybór komórki gospodarza przeznaczonej do transformacji, poziom ekspresji pożądanego białka itd. Sekwencje regulacyjne do ekspresji w ssaczej komórce gospodarza. obejmują elementy wirusowe, które kierują wysokimi poziomami ekspresji białka w komórkach ssaków, takie jak promotory i/lub wzmacniacze pochodzące z cytomegalowirusa (CMV), małpiego wirusa 40 (SV40), adenowirusa (na przykład adenowirusowy późny promotor (AdMLP)) i wirusa polyoma. Alternatywnie, mogą być stosowane niewirusowe sekwencje regulatorowe, takie jak promotor ubikwityny lub promotor p-globiny. Ponadto, mogą być stosowane elementy regulacyjne składające się z sekwencji pochodzących z różnych źródeł, takich jak system promotora SRa, który zawiera sekwencje z wczesnego promotora SV40 i długie końcowe powtórzenia ludzkiego

45 wirusa białaczki z limfocytów T typu 1 (Takebe, Y. i wsp Mol. Cell. Biol. 8: ). [0148] Poza genami łańcucha przeciwciała i sekwencjami regulacyjnymi, rekombinowane wektory ekspresyjne według wynalazku mogą przenosić dodatkowe sekwencje, takie jak sekwencje, które regulują replikację wektora w komórkach gospodarza (na przykład miejsce początku replikacji) i geny markerów selekcyjnych. Gen markera selekcyjnego ułatwia selekcję komórek gospodarza, do których wektor został wprowadzony (patrz na przykład dokumenty patentowe Stanów Zjednoczonych nr , i , wszystkie dla Axela i wsp.). Na przykład, typowo gen markera selekcyjnego nadaje oporność na lek, taki jak G418, higromycyna lub metotreksat, komórce gospodarza, do której wprowadzono wektor. Geny markerów selekcyjnych obejmują gen reduktazy dihydrofolianowej (DHFR) (do zastosowania w komórkach gospodarza ujemnej dla dhfr z selekcją metotreksatem/amplifikacją) i gen neo (do selekcji G418). [0149] W celu ekspresji łańcuchów lekkich i ciężkich, wektor(y) ekspresyjny(e) kodujący(e) ciężkie i lekkie łańcuchy transfekuje się do komórki gospodarza przy zastosowaniu standardowych technik. Różne formy określenia transfekcja w zamierzeniu obejmują szeroki zakres technik powszechnie stosowanych do wprowadzania egzogennego DNA do prokariotycznych lub eukariotycznych komórek gospodarza, na przykład elektroporację, wytrącanie fosforanem wapnia, transfekcję DEAE-dekstranem i podobne. Teoretycznie możliwa jest ekspresja przeciwciał według wynalazku w prokariotycznych lub eukariotycznych komórkach gospodarza. Omówiono ekspresję przeciwciał w komórkach eukariotycznych, w szczególności ssaczych komórkach gospodarza, ponieważ bardziej prawdopodobne jest, że stosując takie komórki eukariotyczne, a w szczególności komórki ssacze, raczej niż komórki prokariotyczne, uzyska się składanie i wydzielanie prawidłowo sfałdowanego i immunologicznie aktywnego przeciwciała. Odnotowano, że prokariotyczna ekspresja genów przeciwciał jest nieskuteczna pod względem wytwarzania aktywnego przeciwciała z wysoką wydajnością (Boss, M. A. i Wood, C. R., 1985 Immunology Today 6:12-13). [00] Ssacze komórki gospodarza do ekspresji rekombinowanych przeciwciał według wynalazku obejmują komórki jajnika chomika chińskiego (komórki CHO) (w tym komórki CHO dhfr-, opisane przez Urlauba i Chasina, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: stosowane z markerem selekcyjnym DHFR, na przykład jak opisano w R.J. Kaufman i P.A. Sharp, 1982 Mol. Biol. 9: , komórki szpiczaka NSO, komórki COS i komórki SP2. W szczególności,, innym systemem ekspresji do zastosowania z

46 komórkami szpiczaka NSO jest system ekspresji genu GS przedstawiony w WO 87/ 04462, WO 89/ 036 i EP Kiedy rekombinowane wektory ekspresyjne kodujące geny przeciwciała wprowadza się do ssaczych komórek gospodarza, przeciwciała wytwarza się poprzez hodowanie komórek gospodarza przez okres wystarczający do umożliwienia ekspresji przeciwciała w komórkach gospodarza lub wydzielanie przeciwciała do pożywki hodowlanej, w której komórki gospodarza są hodowane. Przeciwciała można odzyskać z pożywki hodowlanej przy zastosowaniu standardowych metod oczyszczania białek. Cząsteczki o podwójnej swoistości (dwuswoiste) [01] W innym aspekcie, niniejszy wynalazek zapewnia dwuswoiste lub wieloswoiste cząsteczki zawierające przeciwciała przeciw sklerostynie lub ich fragment według wynalazku. Przeciwciało według wynalazku lub jego regiony wiążące antygen mogą być derywatyzowane lub łączone z inną funkcjonalną cząsteczką, na przykład innym peptydem lub białkiem (na przykład innym przeciwciałem lub ligandem dla receptora) z wytworzeniem dwuswoistej cząsteczki, która wiąże się z co najmniej dwoma różnymi miejscami wiązania lub cząsteczkami docelowymi. Przeciwciało według wynalazku może w rzeczywistości być derywatyzowane lub połączone z więcej niż jedną inną funkcjonalną cząsteczką w celu wytworzenia wieloswoistej cząsteczki, która wiążą się z więcej niż dwoma różnymi miejscami wiązania i/lub cząsteczkami docelowymi; takie wieloswoiste cząsteczki mogą być również objęte terminem dwuswoiste cząsteczki, w znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie. W celu otrzymania cząsteczki dwuswoistej, przeciwciała według wynalazku mogą być funkcjonalnie połączone (na przykład przez sprzęganie chemiczne, fuzję genetyczną, niekowalencyjne połączenie lub w inny sposób) z jedną lub większą liczbę innych cząsteczek wiążących, takich jak inne przeciwciało, fragment przeciwciała, peptyd lub mimetyk wiążący, z wytworzeniem cząsteczki dwuswoistej. [02] Odpowiednio, niniejsze ujawnienie obejmuje dwuswoiste cząsteczki zawierające co najmniej jedną pierwszą swoistość wiązania sklerostyny i drugą swoistość wiązania dla drugiego docelowego epitopu. Na przykład, drugi docelowy epitop jest innym epitopem sklerostyny różniącym się od pierwszego docelowego epitopu. Innym przykładem jest cząsteczka dwuswoista zawierająca co najmniej jedną pierwszą swoistość wiązania sklerostyny i drugą swoistość wiązania z epitopem w obrębie Dkk-1. Innym przykładem jest cząsteczka dwuswoista zawierająca co najmniej jedną pierwszą swoistość wiązania sklerostyny i drugą swoistość wiązania z epitopem w obrębie LRP4.

47 [03] Dodatkowo, w przypadku ujawnienia, w którym cząsteczka dwuswoista jest wieloswoista, cząsteczka może ponadto obejmować trzecią swoistość wiązania, oprócz pierwszego i drugiego docelowego epitopu. [04] W jednym z wykonań, dwuswoiste cząsteczki zawierają jako swoistość wiązania co najmniej jedno przeciwciało, lub jego fragment, w tym na przykład Fab, Fab, F(ab )2, Fv lub jednołańcuchowy Fv. Przeciwciało może być dimerem łańcucha lekkiego lub łańcucha ciężkiego, lub dowolnym ich minimalnym fragmentem, takim jak Fv lub jednołańcuchowy konstrukt opisany przez Ladnera i wsp. w dokumencie patentowym Stanów Zjednoczonych nr [05] Inne przeciwciała, które mogą być stosowane w takich dwuswoistych cząsteczkach to mysie, chimeryczne i humanizowane przeciwciała monoklonalne. [06] Dwuswoiste cząsteczki można wytwarzać przez sprzęganie składowych swoistości wiążących, przy użyciu metod znanych w tej dziedzinie. Na przykład, każdą swoistość wiążącą dwuswoistej cząsteczki można wytwarzać oddzielnie i następnie sprzęgać się ze sobą. Gdy swoistościami wiążącymi są białka lub peptydy, do kowalencyjnego sprzęgania można stosować różne środki sprzęgające lub sieciujące. Przykłady środków sieciujących obejmują białko A, karbodiimid, S-acetylo-tiooctan N- sukcynoimidylu (SATA), kwas 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoesowy) (DTNB), o- fenylenodimaleimid (opdm), 3-(2-pirydyloditio)propionian N-sukcynoimidylu (SPDP) i 4-(N-maleimidometylo)-cykloheksano-1-karboksylan sulfosukcynoimidylu (sulfo-smcc) (patrz na przykład Karpovsky i wsp., 1984 J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA i wsp., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Inne metody obejmują te opisane w Paulus, 1985 Behring Ins, Mitt. nr 78, ; Brennan i wsp., 1985 Science 229:81-83, i Glennie i wsp., 1987 J. Immunol. 139: Środki sprzęgający to SATA i sulfo-smcc, oba dostępne z firmy Pierce Chemical Co (Rockford, IL). [07] Gdy swoistościami wiązania są przeciwciała, mogą one być sprzężone poprzez wiązania tiolowe z regionami zawiasowymi C-końca dwóch łańcuchów ciężkich. W szczególnym wykonaniu, region zawiasowy jest zmodyfikowany tak, że zawiera nieparzystą liczbę reszt tiolowych, na przykład jedną, przed sprzęganiem. [08] Alternatywnie, obie swoistości wiązania mogą być zakodowane w tym samym wektorze i poddawane ekspresji i składane w tej samej komórce gospodarza. Metoda ta jest szczególnie użyteczna tam, gdzie dwuswoistymi cząsteczkami są białka fuzyjne mab x mab, mab x Fab, Fab x F(ab )2 lub ligand x Fab. Cząsteczka dwuswoista może być jednołańcuchową cząsteczką zawierającą jednołańcuchowe przeciwciało i determinantę wiążącą lub jednołańcuchową cząsteczką dwuswoistą zawierającą dwie

48 determinanty wiążące. Cząsteczki dwuswoiste mogą zawierać co najmniej dwie cząsteczki jednołańcuchowe. Sposoby wytwarzania cząsteczek dwuswoistych opisano, na przykład, w dokumencie patentowym Stanów Zjednoczonych nr 52603; dokumencie patentowym Stanów Zjednoczonych nr ; dokumencie patentowym Stanów Zjednoczonych nr ; dokumencie patentowym Stanów Zjednoczonych nr ; dokumencie patentowym Stanów Zjednoczonych nr 50913; dokumencie patentowym Stanów Zjednoczonych nr ; dokumencie patentowym Stanów Zjednoczonych nr ; dokumencie patentowym Stanów Zjednoczonych nr ; i w dokumencie patentowym Stanów Zjednoczonych nr [09] Wiązanie dwuswoistych cząsteczek z ich specyficznymi celami można potwierdzić, na przykład w teście immunoenzymatycznym (ELISA), teście radioimmunologicznym (REA), w analizie FACS, w teście biologicznym (na przykład hamowania wzrostu) lub teście Western Blot. W każdym z tych testów zwykle wykrywa się obecność kompleksów białko-przeciwciało będących przedmiotem szczególnego zainteresowania przez zastosowanie wyznakowanego odczynnika (na przykład przeciwciała) swoistego dla kompleksu będącego przedmiotem zainteresowania. Przeciwciała wielowartościowe [0160] W innym aspekcie, niniejszy wynalazek dostarcza związków wielowartościowych zawierających co najmniej dwa identyczne lub różne fragmenty wiążące antygen tych przeciwciał według wynalazku wiążących się ze sklerostyną. Korzystnie, biorąc pod uwagę charakter trimeryczny sklerostyny, takie związki zapewniają co najmniej trzy lub cztery części wiążące antygen przeciwciała. Części wiążące antygen mogą być połączone ze sobą za pomocą białka fuzyjnego lub wiązania kowalencyjnego lub niekowalencyjnego. Alternatywnie, opisano metody łączenia dla dwuswoistcyh cząsteczek. Czterowartościowe związki można otrzymać, na przykład, poprzez sieciowanie przeciwciał według wynalazku z przeciwciałem, które wiąże się z regionami stałymi przeciwciała według wynalazku, na przykład Fc lub regionem zawiasowym. [0161] Domeny trimeryzacyjne opisano, przykład, w dokumencie patentowym EP B1. Moduły pentameryzacyjne opisano, na przykład, w WO98/18943 (PCT/EP97/05697). Kompozycje farmaceutyczne [0162] W innym aspekcie, niniejszy wynalazek dostarcza kompozycji, na przykład kompozycji farmaceutycznej, zawierającą jedno lub kombinację przeciwciał monoklonalnych lub ich regionu(-ów) wiążącego(ych) antygen, według niniejszego wynalazku, sporządzonych razem z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. Takie

49 kompozycje mogą obejmować jedno lub kombinację (na przykład dwóch lub większą liczbę różnych) przeciwciał lub immunokoniugatów lub dwuswoistych cząsteczek według wynalazku. Na przykład, kompozycja farmaceutyczna według wynalazku może zawierać kombinację przeciwciał, które wiążą się z różnymi epitopami na docelowym antygenie lub wykazują aktywność komplementarną. [0163] Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku można także podawać w terapii skojarzonej, tj. w połączeniu z innymi środkami. Na przykład, leczenie skojarzone może obejmować przeciwciało przeciw sklerostynie według niniejszego wynalazku w połączeniu z co najmniej jednym innym środkiem przeciwzapalnym lub środkiem przeciw osteoporozie. Przykłady środków terapeutycznych, które można wykorzystać w terapii skojarzonej opisano bardziej szczegółowo poniżej, w rozdziale dotyczącym zastosowania przeciwciał według wynalazku. Kompozycje korzystnie sporządza się przy fizjologicznym ph. [0164] Stosowany w niniejszym dokumencie termin farmaceutycznie dopuszczalny nośnik obejmuje dowolne i wszystkie rozpuszczalniki, ośrodki dyspersyjne, powłoki, środki przeciwbakteryjne i przeciwgrzybicze, środki izotoniczne i środki opóźniające wchłanianie i podobne, które są fizjologicznie kompatybilne. Nośnik powinien być odpowiedni do podawania dożylnego, domięśniowego, podskórnego, pozajelitowego, do rdzenia kręgowego lub naskórkowego (na przykład poprzez zastrzyki lub wlewy). W zależności od drogi podawania, substancja czynna, to znaczy przeciwciało, immunokoniugat lub cząsteczki o podwójnej swoistości, mogą być powlekane w materiale, aby chronić związek przed działaniem kwasów i innych naturalnych warunków, które mogą inaktywować związek. [0165] Związki farmaceutyczne według wynalazku mogą obejmować jedną lub większą liczbę farmaceutycznie dopuszczalnych soli. Farmaceutycznie dopuszczalna sól dotyczy soli zachowującej pożądaną aktywność biologiczną związku macierzystego i niewywołującej jakichkolwiek niepożądanych działań toksykologicznych (patrz, na przykład, Berge, S.M. i wsp., 1977 J. Pharm. Sci. 66:1-19). Przykłady takich soli obejmują sole addycyjne z kwasami i sole addycyjne z zasadami. Sole addycyjne z kwasami obejmują te, które otrzymuje się z nietoksycznych kwasów nieorganicznych, takich jak kwas chlorowodorowy, azotowy, fosforowy, siarkowy, bromowodorowy, jodowodorowy, fosforowy i podobne, a także z nietoksycznych kwasów organicznych, takich jak kwasy alifatyczne mono- i di-karboksylowe, podstawione fenylem kwasy alkanowe, kwasy hydroksyalkanowe, kwasy aromatyczne, alifatyczne i aromatyczne kwasy sulfonowe i podobne. Sole addycyjne z zasadami obejmują sole otrzymywane z metali ziem

50 alkalicznych, takie jak sole sodu, potasu, magnezu, wapnia i podobne, a także z nietoksycznymi aminami organicznymi, takimi jak N,N'-dibenzyloetylenodiamina, N- metyloglukamina, chloroprokaina, cholina, dietanoloamina, etylenodiamina i prokaina. [0166] Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku może również zawierać farmaceutycznie dopuszczalny przeciwutleniacz. Przykłady farmaceutycznie dopuszczalnych przeciwutleniaczy obejmują: przeciwutleniacze rozpuszczalne w wodzie, takie jak kwas askorbinowy, chlorowodorek cysteiny, wodorosiarczan sodu, pirosiarczyn sodu, siarczyn sodu i podobne; przeciwutleniacze rozpuszczalne w oleju, takie jak palmitynian askorbylu, butylowany hydroksyanizol (BHA), butylowany hydroksytoluen (BHT), lecytyna, galusan propylu, alfatokoferol i podobne; oraz środki chelatujące metale, takie jak kwas cytrynowy, kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), sorbitol, kwas winowy i kwas fosforowy. [0167] Przykłady odpowiednich wodnych i niewodnych nośników, które mogą być stosowane w kompozycjach farmaceutycznych według wynalazku obejmują wodę, etanol, poliole (takie jak glicerol, glikol propylenowy, poli(glikol etylenowy) i podobne) i ich odpowiednie mieszaniny, oleje roślinne, takie jak oliwa z oliwek, i estry organiczne do iniekcji, takie jak oleinian etylu. Właściwą płynność można utrzymać, na przykład, przez zastosowanie materiałów powlekających, takich jak lecytyna, przez utrzymanie wymaganej wielkości cząstek w przypadku dyspersji i poprzez zastosowanie środków powierzchniowo czynnych. [0168] Omawiane kompozycje mogą także zawierać adiuwanty, takie jak środki konserwujące, środki zwilżające, środki emulgujące i środki dyspergujące. Zapobieganie obecności drobnoustrojów można zapewnić zarówno stosując procedury sterylizacji, jak powyżej, oraz poprzez dodatek różnych środków przeciwbakteryjnych i przeciwgrzybiczych, na przykład parabenu, chlorobutanolu, fenolu, kwasu sorbinowego. Może być również wskazane wprowadzenie do kompozycji środków izotonicznych, takich jak cukry, chlorek sodu i podobne. Ponadto, przedłużone wchłanianie wstrzykiwanej postaci farmaceutycznej można uzyskać dodając środki, które opóźniają wchłanianie, takie jak monostearynian glinu i żelatyna. [0169] Farmaceutycznie dopuszczalne nośniki obejmują sterylne wodne roztwory lub dyspersje i sterylne proszki do doraźnego przygotowywania sterylnych roztworów lub dyspersji do wstrzykiwania. Zastosowanie takich ośrodków i środków dla substancji czynnych farmaceutycznie jest znane w dziedzinie. Rozważa się zastosowanie środków lub ośrodków w kompozycjach farmaceutycznych według wynalazku, za wyjątkiem

51 przypadku ich niekompatybilności ze związkiem czynnym. Do kompozycji można wprowadzić dodatkowe związki czynne. [0170] Kompozycje terapeutyczne typowo muszą być sterylne i trwałe w warunkach wytwarzania i przechowywania. Kompozycję można sporządzać w postaci roztworu, mikroemulsji, liposomu lub innej uporządkowanej struktury odpowiedniej dla wysokiego stężenia leku. Nośnikiem może być rozpuszczalnik lub dyspersja zawierające, na przykład, wodę, etanol, poliol (na przykład gliceryna, glikol propylenowy i płynny poli(glikol etylenowy)) oraz ich odpowiednie mieszaniny. Właściwą płynność można utrzymać, na przykład, przez zastosowanie powłok takich jak lecytyna, przez utrzymanie wymaganej wielkości cząstek w przypadku dyspersji i przez zastosowanie środków powierzchniowo czynnych. W wielu przypadkach do kompozycji można dodać środki izotoniczne, na przykład cukry, alkohole wielowodorotlenowe, takie jak mannitol, sorbitol, lub chlorek sodu. Przedłużone wchłanianie kompozycji do wstrzykiwania można osiągnąć poprzez włączenie do kompozycji środka, który opóźnia wchłanianie, na przykład soli monostearynianu i żelatyny. [0171] Sterylne roztwory do wstrzykiwania można przygotować poprzez wprowadzenie związku czynnego w odpowiedniej ilości do odpowiedniego rozpuszczalnika razem z jednym lub kombinacją składników wymienionych powyżej, według wymagań, po sterylizacji przez mikrofiltrację. Na ogół, dyspersje wytwarzane są poprzez wprowadzanie związku czynnego do sterylnego podłoża, które zawiera podstawowy ośrodek dyspersyjny i inne wymagane składniki spośród tych wymienionych powyżej. W przypadku sterylnych proszków do sporządzania sterylnych roztworów do wstrzykiwań, sposoby ich wytwarzania to suszenie próżniowe i suszenie sublimacyjne (liofilizacja), pozwalające na uzyskanie proszku składnika czynnego z dowolnym dodatkowym pożądanym składnikiem z jego roztworu wcześniej sterylizowanego przez filtrację. [0172] Ilość składnika czynnego, którą można połączyć z materiałem nośnikowym w celu wytworzenia pojedynczej postaci dawkowania będzie się zmieniać zależnie od leczonego pacjenta oraz konkretnego sposobu podawania. Ilość składnika czynnego, który można połączyć z materiałem nośnikowym w celu wytworzenia pojedynczej postaci dawkowania będzie zazwyczaj ilością kompozycji, która wywołuje efekt terapeutyczny. Ogólnie, przy maksymalnej ilości 0%, ilość ta będzie się mieścić się w zakresie od około 0,01 procent do około dziewięćdziesięciu dziewięciu procent składnika czynnego, od około 0,1 procent do około 70 procent, od około 1 procenta do

52 około 30 procent składnika czynnego w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. [0173] Schematy dawkowania dostosowuje się tak, aby zapewnić optymalną pożądaną odpowiedź (na przykład odpowiedź terapeutyczną). Na przykład, można podać pojedynczy bolus, kilka podzielonych dawek można podawać w czasie lub dawkę można proporcjonalnie zmniejszać lub zwiększać zależnie od wskazań w nagłej sytuacji terapeutycznej. Szczególnie korzystne jest sporządzanie kompozycji pozajelitowych w postaci dawek jednostkowych dla łatwości podawania i jednorodności dawkowania. Postać dawki jednostkowej w znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie odnosi się do fizycznie odrębnych jednostek, dobranych jako dawki jednostkowe dla leczonego pacjenta; przy czym każda jednostka zawiera określoną ilość substancji czynnej, obliczoną w celu wywołania pożądanego skutku terapeutycznego w połączeniu z wymaganym nośnikiem farmaceutycznym. Specyfikacja jednostkowych postaci dawkowania według wynalazku jest zdeterminowana przez i bezpośrednio uzależniona od unikatowych właściwości związku czynnego i konkretnego efektu terapeutycznego, który ma zostać osiągnięty oraz ograniczeń właściwych dziedzinie wytwarzania takiego związku czynnego do leczenia pacjentów. [0174] W przypadku podawania przeciwciała, dawkowanie mieści się w zakresie od około 0,0001 do 0 mg/kg, a częściej 0,01 do 5 mg/kg masy ciała gospodarza. Na przykład dawkowanie może wynosić 0,3 mg/kg masy ciała, 1 mg/kg masy ciała, 3 mg/kg masy ciała, 5 mg/kg masy ciała lub mg/kg masy ciała lub może mieścić się w zakresie 1- mg/kg. Przykładowy tryb leczenia obejmuje podawanie raz na tydzień, raz na dwa tygodnie, raz na trzy tygodnie, raz na cztery tygodnie, raz na miesiąc, raz na 3 miesiące lub co trzy do 6 miesięcy. Schematy dawkowania dla przeciwciała przeciw sklerostynie według wynalazku obejmują 1 mg/kg masy ciała lub 3 mg/kg masy ciała dla podawania dożylnego, przy czym przeciwciało podaje według jednego z następujących schematów dawkowania: co cztery tygodnie dla sześciu dawek, a następnie co trzy miesiące; co trzy tygodnie; 3 mg/kg masy ciała raz, a następnie 1 mg/kg masy ciała co trzy tygodnie. [0175] W niektórych sposobach dwa lub większą liczbę przeciwciał monoklonalnych o różnych swoistościach wiązania podaje się jednocześnie lub sekwencyjnie, przy czym dawkowanie każdego z podawanych przeciwciał mieści się w podanych zakresach. Przeciwciało zazwyczaj podaje się wielokrotnie. Odstępy pomiędzy pojedynczymi dawkami mogą wynosić, na przykład, tydzień, miesiąc, trzy miesiące lub rok. Odstępy mogą być również nieregularne, określane na podstawie pomiaru poziomu we krwi przeciwciała dla docelowego antygenu u pacjenta. W niektórych sposobach dawki

53 dostosowuje się do osiągnięcia stężenia przeciwciał w osoczu wynoszącego około 1-00 µg/ml, a w niektórych sposobach około µg/ml. [0176] Alternatywnie, przeciwciało można podawać jako preparat o przedłużonym uwalnianiu, przy czym w tym przypadku wymagane jest rzadsze podawanie. Dawkowanie i częstość różnią się zależnie od okresu półtrwania przeciwciała u pacjenta. Generalnie, przeciwciała ludzkie mają najdłuższy okres półtrwania, kolejno, pod względem malejącego okresu półtrwania, można wymienić humanizowane przeciwciała, chimeryczne przeciwciała i przeciwciała niepochodzące od człowieka. Dawkowanie i częstość podawania mogą się różnić w zależności od tego, czy leczenie ma charakter profilaktyczny czy terapeutyczny. W zastosowaniach profilaktycznych, stosunkowo niskie dawki podaje się w odstępach stosunkowo rzadkich przez długi okres czasu. Niektórzy pacjenci kontynuują leczenie przez całe życie. W zastosowaniach terapeutycznych, stosunkowo wysoka dawka w stosunkowo krótkich odstępach czasu jest czasem konieczna aż do zmniejszenia lub ustania progresji choroby lub aż u pacjenta nastąpi częściowe lub całkowite polepszenie objawów choroby. Następnie u pacjenta można zastosować reżim profilaktyczny. [0177] Rzeczywiste poziomy dawkowania składników czynnych w kompozycjach farmaceutycznych według niniejszego wynalazku można zmieniać, tak, aby uzyskać ilość składnika czynnego skuteczną dla osiągnięcia pożądanej odpowiedzi terapeutycznej dla konkretnego pacjenta, kompozycji i trybu podawania, bez powodowania toksyczności u pacjenta. Wybrany poziom dawkowania będzie zależał od różnych czynników farmakokinetycznych, włączając aktywność konkretnych stosowanych kompozycji według niniejszego wynalazku, soli lub estru lub amidu, drogi podawania, czasu podawania, szybkości wydalania danego zastosowanego związku, czasu trwania leczenia, innych leków, związków i/lub materiałów stosowanych w połączeniu z konkretnymi stosowanymi kompozycjami, wieku, płci, wagi, stanu, ogólnego stanu zdrowia oraz wcześniejszej historii medycznej leczonego pacjenta oraz podobnych czynników dobrze znanych w dziedzinie medycyny. [0178] Terapeutycznie skuteczna dawka przeciwciała przeciw sklerostynie według wynalazku może skutkować zmniejszeniem nasilenia objawów choroby, wzrostem częstości i czasu trwania okresu wolnego od objawów choroby lub zapobieżeniem osłabieniu lub niepełnosprawności właściwym dla dolegliwości choroby. [0179] Kompozycja według niniejszego wynalazku może być podawana jedną lub większą liczbą dróg podawania, z zastosowaniem jednej lub większej liczby spośród wielu różnych metod znanych w dziedzinie. Dla znawcy powinno być oczywiste, że droga i/lub

54 sposób podawania będą się różnić zależnie od pożądanych wyników. Drogi podawania przeciwciał według wynalazku obejmują podawanie dożylne, domięśniowe, śródskórne, dootrzewnowe, podskórne, do rdzenia kręgowego lub inne pozajelitowe drogi podania, na przykład przez iniekcję lub infuzję. Termin podawanie pozajelitowe w znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie oznacza sposoby podawania inne niż podawanie dojelitowe i miejscowe, zwykle przez zastrzyk, i obejmuje, bez ograniczeń, podawanie poprzez iniekcje i infuzje dożylne, domięśniowe, dotętnicze, dooponowe, wewnątrztorebkowe, śródoczne, dosercowe, śródskórne, śródotrzewnowe, przeztchawicze, podskórne, podnaskórkowe, dostawowe, podtorebkowe, podpajęczynówkowe, wewnątrzrdzeniowe, nadtwardówkowe oraz domostkowe. [0180] Alternatywnie, przeciwciało według wynalazku może być podawane drogą pozajelitową, na przykład miejscowo, naskórkowo lub dośluzówkowo, na przykład, donosowo, doustnie, dopochwowo, doodbytniczo, podjęzykowo lub miejscowo. [0181] Związki czynne można sporządzać z nośnikami, które będą chronić związek przed szybkim uwalnianiem, na przykład w postaci preparatu o kontrolowanym uwalnianiu, włączając implanty, plastry przezskórne i mikrokapsułkowane układy dostarczania. Mogą być stosowane biodegradowalne, biokompatybilne polimery, takie jak kopolimer etylenu z octanem winylu, polibezwodniki, poli(kwas glikolowy), kolagen, poliortoestry i poli(kwas mlekowy). Wiele sposobów sporządzania takich preparatów zostało opatentowanych lub są ogólnie znane znawcom, patrz, na przykład, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, [0182] Kompozycje terapeutyczne można podawać za pomocą urządzeń medycznych znanych w dziedzinie. Na przykład, w jednym wykonaniu, kompozycję terapeutyczną według wynalazku można podawać za pomocą bezigłowego urządzenia do iniekcji podskórnych, takiego jak urządzenia przedstawione w dokumencie patentowym Stanów Zjednoczonych nr ; ; ; ; ; lub Przykłady dobrze znanych implantów i modułów przydatnych w niniejszym wynalazku obejmują: dokument patentowy Stanów Zjednoczonych nr , w którym przedstawiono wszczepialną pompę mikro-infuzyjną do dozowania leku z kontrolowaną szybkością; dokument patentowy Stanów Zjednoczonych nr , w którym przedstawiono urządzenie do podawania terapeutycznego leków przez skórę; dokument patentowy Stanów Zjednoczonych nr , w którym przedstawiono pompę infuzyjną leku do dostarczania leku z precyzyjną szybkością infuzji; dokument patentowy Stanów Zjednoczonych nr , w którym przedstawiono zmienny przepływ wszczepialnego

55 urządzenia infuzyjnego do ciągłego dostarczania leku; dokument patentowy Stanów Zjednoczonych nr , w którym przedstawiono osmotyczny system dostarczania leku z wielokomorowymi przedziałami; i dokument patentowy Stanów Zjednoczonych nr , w którym przedstawiono osmotyczny system dostarczania leków. Wiele innych implantów, systemów dostarczania i modułów jest znanych osobom biegłym w dziedzinie. [0183] W niektórych wykonaniach, ludzkie przeciwciała monoklonalne według wynalazku można sporządzać tak, aby zapewnić właściwą dystrybucję in vivo. Na przykład, bariera krew-mózg (BBB) wyklucza użycie wielu związków silnie hydrofilowych. Aby upewnić się, że związki terapeutyczne przekroczą barierę BBB (jeśli jest to pożądane), można je sporządzić, na przykład, w liposomach. Informacje na temat sposobów wytwarzania liposomów można znaleźć w dokumentach patentowych Stanów Zjednoczonych ; ; oraz Liposomy mogą zawierać jedno lub większą liczbę ugrupowań, które są wybiórczo transportowane do określonych komórek lub narządów, a tym samym zwiększają celowane dostarczanie leku (patrz, na przykład, V.V. Ranade, 1989 J. Cline Pharmacol. 29:685). Przykładowe ugrupowania celujące obejmują folian lub biotynę (patrz na przykład dokument patentowy Stanów Zjednoczonych dla Lowa i wsp.); mannozydy (Umezawa i wsp., 1988, Biochem. Biophys. Res. Commun. 3:38); przeciwciała (P.G. Bloeman i wsp., 1995 FEBS Lett. 357:140; M. Owais i wsp., 1995 Antimicrob. Agents Chernother. 39:180); powierzchniowy receptor białka A (Briscoe i wsp., 1995 Am J. Physiol.1233: 134); p1 (Schreier i wsp., 1994 J. Biol Chem 269:9090); patrz również K. Keinanen; M.L. Laukkanen, 1994 FEBSLett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler, 1994 Immunomethods 4:273. Zastosowania i sposoby według wynalazku [0184] Przeciwciała według niniejszego wynalazku mają zastosowania diagnostyczne i terapeutyczne in vitro i in vivo. Na przykład, cząsteczki te mogą być podawane do komórek w hodowli, na przykład w badaniach in vitro lub in vivo, lub pacjentowi, na przykład, w warunkach in vivo, w celu leczenia, zapobiegania lub diagnozowania różnych zaburzeń. Termin pacjent, w znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie w zamierzeniu obejmuje człowieka i zwierzęta niebędące ludźmi. Zwierzęta niebędące ludźmi obejmują wszystkie kręgowce, na przykład ssaki i kręgowce niebędące ssakami, takie jak naczelne niebędące ludźmi, owce, psy, koty, krowy, konie, kury, płazy i gady. [0185] Omawiane sposoby są szczególnie przydatne do leczenia, zapobiegania albo diagnostyki zaburzeń związanych ze sklerostyną i/lub zaburzeń związanych z nieprawidłową gęstością mineralną kości, na przykład osteoporozy.

56 [0186] Wynalazek dostarcza również sposobów zwiększania zawartości związków mineralnych i/lub gęstości mineralnej kości. Kompozycje według niniejszego wynalazku mogą być również użyteczne dla poprawy wyników w zabiegach ortopedycznych, zabiegach stomatologicznych, chirurgii implantów, endoportezoplastyce, przeszczepie kości, chirurgii plastycznej i naprawie kości, takiej jak gojenie złamań, brak zrostu, opóźnione gojenie ran i rekonstrukcja twarzy. Jedną lub większą liczbę kompozycji można podawać przed, w trakcie i/lub po zabiegu, wymianie, przeszczepie, operacji lub naprawie. [0187] Stosowany w niniejszym dokumencie termin zaburzenie związane ze sklerostyną obejmuje zaburzenia, w których gęstość mineralna kości (BMD) jest nieprawidłowo i/lub patologicznie niska w porównaniu ze zdrowymi pacjentami. Choroby charakteryzujące się niską BMD i/lub kruchością kości, obejmują, ale nie są ograniczone do, pierwotną i wtórną osteoporozę, osteopenię, osteomalację, wrodzoną łamliwość (Ol), martwicę wywołaną brakiem unaczynienia i gojenie złamań i implantów (implantów dentystycznych i implantów kości biodrowych), utraty kości spowodowanych innymi zaburzeniami (na przykład związanymi z zakażeniem HIV, nowotworami, zapaleniem stawów). Inne zaburzenia związane ze sklerostyną obejmują, lecz nie wyłącznie, reumatoidalne zapalenie stawów, chorobę zwyrodnieniową stawów, zapalenie stawów i tworzenie i/lub obecność zmian osteolitycznych. [0188] W znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie termin zaburzenie związane ze sklerostyną obejmuje stany związane z lub charakteryzujące się nieprawidłowymi poziomami sklerostyny. Stany te obejmują nowotwory i stany osteoporozy (na przykład osteoporozę lub osteopenię), z których niektóre pokrywają się z zaburzeniami związanymi ze sklerostyną, jak określono w niniejszym dokumencie. Nowotwory złośliwe związane ze sklerostyną mogą obejmować szpiczaka (na przykład, szpiczaka mnogiego z uszkodzeniami osteolitycznymi), raka piersi, raka jelita grubego, czerniaka, raka wątrobowokomórkowego, raka nabłonkowego, raka przełyku, raka mózgu, raka płuc, raka prostaty i raka trzustki, jak również wszelkie ich przerzuty. [0189] Zaburzenie związane ze sklerostyną może obejmować także schorzenia nerek i układu sercowo-naczyniowego, co najmniej z powodu ekspresji sklerostyny w nerkach i układzie sercowo-naczyniowym. Te zaburzenia obejmują, ale nie są ograniczone do, schorzenia nerek, takie jak, choroby kłębuszków nerkowych (na przykład, ostre i przewlekłe zapalenie kłębuszków, szybko postępujące kłębuszkowe zapalenie nerek, zespół nerczycowy, ogniskowe rozplemowe zapalenie kłębuszków nerkowych, uszkodzenie kłębuszków nerkowych związane z chorobą układową, taką jak układowy

57 toczeń rumieniowaty, zespół Goodpasture'a, szpiczak mnogi, cukrzyca, torbielowatość nerek, nowotwory, anemia sierpowata i przewlekłe choroby zapalne), choroby kanalików nerkowych (na przykład, ostra martwica kanalików oraz ostra niewydolność nerek, wielotorbielowatość nerek, gąbczastość rdzenia nerki, torbielowatość rdzenia nerki, cukrzyca nerkopochodna i kwasica kanalikowo-nerkowa), choroby kanalikowośródmiąższowe (na przykład, odmiedniczkowe zapalenie nerek, zapalenie nerek wywołane przez leki i toksyny, hiperkalcemiczna nefropatia i hipokalcemiczna nefropatia), ostra i szybko postępująca niewydolność nerek, przewlekła niewydolność nerek, kamica moczowa, dna moczanowa, choroby naczyniowe (na przykład nadciśnienie i stwardnienie nerek, anemia hemolityczna mikroangiopatyczna, miażdżycowo-zatorowe choroby nerek, rozsiana martwica korowa oraz zawał nerek) lub nowotwory (na przykład rak komórek nerkowych i nerczak niedojrzały). [0190] Omawiane zaburzenia obejmują także, ale nie są ograniczone do, choroby sercowo-naczyniowe, takie jak choroba niedokrwienna serca (na przykład dusznica bolesna, zawał mięśnia sercowego, i przewlekła choroba niedokrwienna serca), nadciśnieniowa choroba serca, zespół sercowo-płucny, choroby zastawek serca (na przykład gorączka reumatyczna i reumatyczna choroba serca, zapalenie wsierdzia, wypadanie zastawki mitralnej i zwężenie zastawki aortalnej), wrodzone wady serca (na przykład obturacyjne zmiany zastawek i naczyń, wady przegrody przedsionkowej lub komorowej i przetrwały przewód tętniczy) lub choroby mięśnia sercowego (na przykład zawał mięśnia sercowego, kardiomiopatia zastoinowa i kardiomiopatia przerostowa). [0191] W przypadku gdy przeciwciała przeciwko sklerostynie są podawane łącznie z innym lekiem, środki te mogą być podawane w dowolnej kolejności (to znaczy sekwencyjnie) lub jednocześnie. [0192] Zgodnie z kolejnym wykonaniem wynalazku, przeciwciała według wynalazku mogą być stosowane jako adiuwanty lub środki wspomagające inną terapię, na przykład w leczeniu, w którym stosuje się inhibitor resorpcji kości, na przykład w leczeniu osteoporozy, w szczególności leczeniu z wykorzystaniem wapnia, kalcytoniny lub jej analogu albo pochodnej, na przykład kalcytoniny z łososia, węgorza lub człowieka, kalcylityków, kalcymimetyków (na przykład cinakalcetu), hormonu steroidowego, na przykład estrogenu, lub częściowego agonisty estrogenów, kombinacji estrogen-gestagen, SERM (selektywny modulator receptora estrogenowego) na przykład raloksyfenu, lazofoksyfenu, bazedoksyfenu, arzoksyfenu, FC1271, tibolonu (Livial ), SARM (selektywny modulator receptora androgenowego), przeciwciała RANKL (na przykład denosumabu), inhibitora katepsyny K, witaminy D lub jej analogu, albo PTH, fragmentu

58 PTH, lub pochodnej PTH na przykład PTH (1-84) (takiej jak Preys ), PTH (1-34) (takiej jak Fortes ), PTH (1-36), PTH (1-38), PTH (1-31)NH2 lub PTS 893. Według innego wykonania, przeciwciała według wynalazku mogą być stosowane w połączeniu z innymi obecnymi terapiami osteoporozy, w tym bisfosfonianami (takimi jak Fosamax (alendronian), Actonel (rizedronian sodu), Bonviva (kwas ibandronowy), Zometa (kwas zoledronowy), Aclasta /Reclast (kwas zoledronowy), olpadronian, nerydronian, skelid, bonefos), statynami, sterydami anabolicznymi, solami lantanu i strontu i fluorkiem sodu. [0193] W jednym szczególnym wykonaniu, przeciwciała według wynalazku mogą być podawane w połączeniu ze środkiem modulującym LRP4, tj. środkiem modulującym ekspresję lub aktywność LRP4 na przykład przeciwciałem neutralizującym LRP4. [0194] W innym konkretnym wykonaniu, przeciwciała według wynalazku mogą być podawane w połączeniu ze środkiem modulującym Dkk1, tj. środkiem który zakłóca lub neutralizuje antagonizm, w którym pośredniczy Dkk-1, wobec sygnalizacji Wnt, na przykład, przeciwciałem neutralizującym Dkk1. [0195] Tak więc, wynalazek dostarcza również zastosowania przeciwciała lub białka funkcjonalnego według wynalazku oraz (i) kwasu zoledronowego, (ii) przeciwciała anty-dkk1, (iii) alendronianu (iv), przeciwciała anty-lrp4, (v) hpth i/lub (vi) środków uwalniających hormon przytarczyc (kalcylityki), do wytwarzania leku do leczenia zaburzeń patologicznych, w których pośredniczy sklerostyna lub które są związane ze zwiększonym poziomem sklerostyny. [0196] W innym wariancie, wynalazek dostarcza zastosowania przeciwciała lub funkcjonalnego białka według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia zaburzeń patologicznych, w których pośredniczy sklerostyna lub które są związane ze zwiększonym poziomem sklerostyny, w którym lek stosuje się w połączeniu z (i) kwasem zoledronowym, (ii) przeciwciałem anty-dkk1, (iii) alendronianem, (iv) przeciwciałem anty-lrp4, (v) hpth i/lub (vi) środkami uwalniającymi hormon przytarczyc (kalcylityki). [0197] W innym wariancie, wynalazek dostarcza zastosowania: (i) kwasu zoledronowego, (ii) przeciwciała anty-dkk1, (iii), alendronianu (iv), przeciwciała anty- LRP4, (v) hpth i/lub (vi) środków uwalniających hormon przytarczyc (kalcylityki) do wytwarzania leku do leczenia zaburzeń patologicznych, w których pośredniczy sklerostyna lub które są związane ze zwiększonym poziomem sklerostyny, gdzie lek stosuje się w połączeniu z przeciwciałem lub funkcjonalnym białkiem według wynalazku.

59 [0198] W innym wariancie, wynalazek dostarcza zastosowania przeciwciała lub funkcjonalnego białka według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia zaburzeń patologicznych, w których pośredniczy sklerostyna lub które są związane ze zwiększonym poziomem sklerostyny, przy czym pacjentowi wcześniej podawano (i) kwas zoledronowy, (ii) przeciwciało anty-dkk1, (iii) alendronian, (iv) przeciwciało anty-lrp4, (v) hpth i/lub (vi) środki wydzielające hormon przytarczyc (kalcylityki). [0199] W innym wariancie, wynalazek dostarcza zastosowania: (i) kwasu zoledronowego, (ii) przeciwciała anty-dkk1, (iii) alendronianu (iv), przeciwciała anty- LRP4, (v) hpth i/lub (vi) środków wydzielających hormon przytarczyc (kalcylityki) do wytwarzania leku do leczenia zaburzeń patologicznych, w których pośredniczy sklerostyna lub które są związane ze zwiększonym poziomem sklerostyny, przy czym pacjentowi wcześniej podawano przeciwciało lub funkcjonalne białko według wynalazku. [00] W jednym z wariantów kombinacji wymienionych powyżej, hpth jest hpth (1-34). [01] W jednym wariancie, przeciwciała według wynalazku mogą być stosowane do wykrywania poziomów sklerostyny lub poziomów komórek, które zawierają sklerostynę. Można to osiągnąć, na przykład, poprzez kontaktowanie próbki (na przykład próbki in vitro) oraz próbki kontrolnej z przeciwciałem przeciw sklerostynie w warunkach, które pozwalają na tworzenie kompleksu pomiędzy przeciwciałem i sklerostyną. Wszelkie kompleksy utworzone między przeciwciałem i sklerostyną są wykrywane i porównane z dowolną próbką kontrolną. Na przykład, standardowe metody wykrywania, dobrze znane w dziedzinie, takie jak ELISA i testy z zastosowaniem cytometrii przepływowej, można przeprowadzić stosując kompozycje według wynalazku. [02] Zgodnie z tym, w jednym aspekcie, wynalazek dostarcza sposobów wykrywania obecności sklerostyny (na przykład ludzkiego antygenu sklerostyny) w próbce lub pomiaru ilości sklerostyny, obejmujących kontaktowanie próbki i próbki kontrolnej, przy czym przeciwciało według wynalazku, lub jego region wiążący antygen, swoiście wiąże się ze sklerostyną w warunkach, które pozwalają na tworzenie kompleksu pomiędzy przeciwciałem lub jego częścią a sklerostyną. Następnie wykrywa się tworzenie kompleksu, przy czym różnica w tworzeniu kompleksu pomiędzy próbką a próbką kontrolną wskazuje na obecność w próbce sklerostyny. [03] Również w zakresie wynalazku mieszczą się zestawy, składające się z kompozycji (na przykład przeciwciała, ludzkie przeciwciała i cząsteczki o podwójnej swoistości) według wynalazku oraz instrukcje stosowania. Zestaw może ponadto zawierać co najmniej jeden dodatkowy odczynnik, lub jedno lub większą liczbę dodatkowych

60 przeciwciał według wynalazku (na przykład przeciwciało o komplementarnej aktywności, które wiąże się z epitopem na docelowym antygenie, innym niż pierwsze przeciwciało). Na przykład, takie zestawy mogą zawierać przeciwciało lub białko funkcjonalne wynalazku oraz jeden lub większą liczbę spośród (i) kwasu zoledronowego, (ii) przeciwciała anty-dkk1, (iii) alendronianu, (iv) przeciwciała anty-lrp4, (v) hpth i (vi) środków uwalniających hormon przytarczyc (kalcylityki). Zestawy zazwyczaj zawierają etykietę wskazującą zamierzone wykorzystanie zawartości zestawu. Termin etykieta obejmuje wszelkie pisemne materiały lub te dostarczane w postaci nagrania na lub w zestawie, lub które w inny sposób są dołączone do zestawu. [04] Wynalazek został w pełni opisany i dalej zilustrowany za pomocą następujących przykładów i zastrzeżeń, które mają charakter ilustracyjny i nie mają na celu dalszego ograniczania. Dla osób biegłych w dziedzinie oczywiste będzie lub będą w stanie potwierdzić, stosując jedynie rutynowe eksperymenty, wiele równoważnych rozwiązań dla konkretnych opisanych procedur. Takie równoważne rozwiązania są objęte zakresem niniejszego wynalazku i zastrzeżeń patentowych. Przykłady: Testy funkcjonalne Testy z fosfataza alkaliczną (ALP) Komórki [05] Komórki MC3T3 1 b to klon komórek MC3T3-JP wykazujących ekspresję OSE2-luc. Klon ten został uzyskano po stabilnej transfekcji MC3T3-JP (osteoblasty mysie MC3T3-E1, klon japoński, Jp; otrzymany dzięki uprzejmości dra T. Kokkubo, Novartis, Japonia) przy użyciu 8x-OSE2wt-mOG2luc w pcdna3.1+. Pożywki hodowlane [06] Komórki MC3T3-1b rutynowo hodowano w pożywce MEM alfa (MEMα, lnvitrogen, nr kat ) z % płodową surowicą cielęcą (FCS; Amimed nr kat. 2-01F0-l), 2 mm L-glutaminą (Gibco nr kat ), 50 jedn. międzynar. (IU) penicyliny/50 µg/ml streptomycyny (Amimed nr kat. 4-01F00-H) i mm Hepes (Gibco nr kat ) i 0,75 mg/ml G418 (Gibco, nr kat ) (pożywka hodowlana). Roztwory podstawowe [07] mm kwasu askorbinowego (Wako Pure Chemical nr katalogowy ) w DMEM-LG, 14 nm BMP-2 (R&D nr kat. 355-BM-0), 5 mm kwas octowy i 0,1% albumina surowicy bydlęcej (BSA, Sigma nr kat. a-8806), 1 M β-glicerofosforan (Sigma nr kat. G9891) w roztworze Tyrode; roztwór Tyrode'a: 9,72 g soli Tyrode'a (Sigma, nr kat. T2145) i 1 g NaHCO 3 w 1 l H 2 O, bufor z substratem ALP: 25 mm glicyna i

61 ,5 mm MgCl 2, ph,5; roztwór substratu ALP: 5 mg fosforanu p-nitrofenylu (Sigma, substrat 4, Sigma nr kat TAB) w 3,75 ml buforu substratu ALP, ph,5; 1 mm p-nitrofenol (Sigma nr kat. 4-1) w roztworze substratu ALP. Analiza [08] W testach ALP, komórki MC3T3 1b hodowano w pożywce testowej (co odpowiada pożywce hodowlanej w nieobecności G418). MC3T3 1b wysiewano w 0 µl z gęstością 3x 4 komórek/ml, jeśli indukcję rozpoczynano 72 godziny później lub 2x 4 komórek/ml w przypadku, gdy indukcję rozpoczynano 96 godzin później. Płytki inkubowano przez 72 godziny lub 96 godzin w temperaturze 37 C i przy 5% CO 2, przed rozpoczęciem indukcji z zastosowaniem kompletnej pożywki (poprzez dodanie do podłoża hodowlanego mm b-glicerofosforanu (bgp) i 50 µm kwasu askorbinowego (AA)). Przeciwciała przeznaczone do testów rozcieńczano kompletną pożywką. Przeciwciało wraz z BMP-2 (0,7 nm) i sklerostyną (50 nm) dodawano do dołków (w trzech powtórzeniach) w końcowej objętości 0 µl kompletnej pożywki. Na każdej płytce umieszczano 4 kontrole wewnętrzne w trzech egzemplarzach: rozpuszczalnik jako kontrola (BSA), kontrola BMP-2 (0,7 nm), BMP-2 + sklerostyna (BMP-2 (0,7 nm) i sklerostyna (50 nm)) oraz sklerostyna jako kontrola (50 nm). Płytki inkubowano przez kolejne 72 godziny w temperaturze 37 C i przy 5% CO 2. Pod koniec okresu inkubacji test zakańczano usuwając pożywkę i dodając 0 ml roztworu substratu ALP (świeżo sporządzonego) do każdego dołka. Płytki inkubowano przez 3-30 minut. Dodawano 0 µl 1 M roztworu NaOH w celu zatrzymania reakcji i płytki wytrząsano w wytrząsarce do płytek Plateshaker. Pomiar OD dał barwę czerwoną wobec ślepej próby przy 405 nm i obliczano aktywność ALP w nmol/min. Stosowano 50 nm sklerostynę uzyskując co najmniej 70% zahamowanie wytwarzania ALP indukowanego przez BMP-2 [0,7 nm BMP-2]. Test Wnt [09] Test ten został opracowany do testowania przeciwciał w oparciu o zdolność sklerostyny do hamowania genu reporterowego STF, w którym pośredniczy Wnt1. Transfekcja komórek HEK293 [02] Dnia 1, komórki HEK293 wysiewano w ilości 1,3-1,4 x 5 komórek na dołek (w objętości 0,5 ml) na 24-dołkowej płytce z poli-d-lizyną (BD-BioCoat, nr kat ) w pożywce DMEM (Gibco, nr kat ) zawierającej % cielęcą surowicę płodową (FCS),1% L-glutaminę (Gibco, nr kat ,024), 1% nieistotnych aminokwasów (Gibco, nr kat ) bez antybiotyków. Transfekcję przeprowadzano dnia 2 za pomocą lipofektaminy 00 (Invitrogen, nr kat ). Do każdego

62 transfekowanego dołka, dodano następujące ilości plazmidów do końcowej objętości 50 ml OptiMEM I (Gibco, nr kat ): do dołków kontrolnych (pcdna3+, 480 ng; SuperTopFlash (STF) ng; phrl-cmv, 0,5 ng) i do dołków traktowanych Wnt1 (pcdna-wnt1, ng; pcdna3+, 460 ng; SuperTopFlash (STF) ng; phrl-cmv, 0,5 ng). [0211] W drugiej probówce, 1,6 ml lipofektaminy 00 rozcieńczano w 50 ml OptiMEM I i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Zawartość dwóch probówek następnie mieszano dodając zawartość probówki z lipidem do probówki z DNA i inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej umożliwiając wytworzenie kompleksu DNA-lipid. Kompleks DNA-lipid (0 ml) następnie równomiernie dodawano do dołków i inkubowano w temperaturze 37 C w atmosferze 5% CO 2 przez 5 godzin. Pod koniec 5-godzinnej inkubacji, komórki były gotowe do traktowania odczynnikami testowymi, takimi jak SOST, przeciwciała itp. Oznaczanie hamowania zależnego od dawki SOST [0212] W celu wyznaczenia krzywej zależności hamowania od dawki, sporządzano serie 2-krotnych rozcieńczeń rhsost w pożywce DMEM zawierającej % FCS, 1% L-glutaminę i 1% nieistotnych aminokwasów bez antybiotyków, począwszy od 160 nm. Stężenie roztworu podstawowego rhsost wynosiło 260 mg/ml w pożywce DMEM z 1% FCS. Rutynowo każde warunki testowano w dwóch powtórzeniach. W związku z tym, sporządzano 1 ml pożywki dla wszystkich warunków i 450 ml dodawano na dołek po usunięciu pożywki zawierającej mieszankę transfekcyjną z dołków. Czas traktowania wynosił 18- godzin. Pod koniec inkubacji, przeprowadzano test z zastosowaniem lucyferazy opisany poniżej. Testy z przeciwciałami anty-sost [0213] Przeciwciała wstępnie mieszano z SOST przed dodaniem do komórek. W tym celu, sporządzano pożywkę DMEM (zawierającą % FCS, 1% L-glutaminę i 1% nieistotnych aminokwasów bez antybiotyków) z do 30 nm rhsost. Następnie, różne rozcieńczenia testowanego przeciwciała dodawano do pożywki zawierającej SOST według procedury eksperymentalnej. Mieszanki te sporządzano 40 minut przed traktowaniem. Wszystkie warunki rutynowo testowano w dwóch powtórzeniach. W tym celu, sporządzano 1 ml pożywki dla wszystkich warunków i 450 ml dodawano na dołek po usunięciu pożywki zawierającej mieszankę transfekcyjną z dołków. Czas traktowania wynosił 18- godzin. Pod koniec inkubacji, przeprowadzano test z zastosowaniem lucyferazy opisany poniżej. Test z zastosowaniem lucyferazy

63 [0214] Pod koniec inkubacji, pożywki usuwano i dodawano 300 ml 1X buforu do lizy pasywnej (Promega, nr kat. E194A) w celu przeprowadzenia lizy komórek. Aktywność lucyferazy następnie mierzono przy użyciu systemu Dual-Glo Luciferase System (Promega, nr kat. E2940) z 30 ml lizatów w dwóch powtórzeniach. Test przeprowadzano zgodnie z instrukcją dostarczoną z zestawem. Typowo, stosowano 30 ml lucyferazy Dual-Glo (lucyferaza ze świetlika; dla STF) i 30 ml substratu Dual-Glo Stop i Glo (lucyferaza z renilli; do kontroli wydajności transfekcji). Sygnały luminescencyjne mierzono za pomocą przyrządu Mithras LB940 (Berthold Technologies). Obliczenia [02] Obliczano stosunek lucyferazy ze świetlika do lucyferazy z renilli. Końcowe wyniki wyrażano przyjmując wartość Wnt1 bez SOST jako 1. Test mineralizacji Komórki [0216] Komórki MC3T3 1b to klon komórek MC3T3-JP wykazujących ekspresję OSE2-luc. Klon ten otrzymano po stabilnej transfekcji MC3T3-JP (mysie osteoblasty MC3T3-E1, klon japoński, Jp; otrzymano dzięki uprzejmości dra T. Kokkubo, Novartis, Japonia) przy użyciu 8x-OSE2wt-mOG2luc in pcdna3,1+. Pożywka hodowlana [0217] Komórki MC3T3-1b rutynowo hodowano w pożywce MEM alfa (MEMα; Invitrogen, nr kat ) z dodatkiem % cielęcej surowicy płodowej (FCS; nr kat. Amimed 2-01F0-I), 2 mm L-glutaminy (Gibco nr kat ), 50 jedn. międzynar. (IU) penicyliny/50 µg/ml streptomycyny (nr kat. Amimed 4-01F00-H) i mm Hepes (Gibco nr kat ) i 0,75 mg/ml G418 (Gibco nr kat ) (pożywka hodowlana). Test mineralizacji [0218] Wapń związany z matrycą osadzony w dołkach oznaczano w komórkach MC3T3-1b przy użyciu zestawu Calcium kit (Axon Lab, nr kat. AXON0012). Komórki wysiewano w ilości 6x 3 komórek/dołek lub 2x 3 komórek/dołek w celu poprawy zdolności do odpowiedzi na 96-dołkowych płytkach w 0 ml pożywki testowej (pożywka hodowlana bez G418) i inkubowano przez 3 dni aż do osiągnięcia konfluencji. Pożywkę testową następnie wymieniano i związki przeznaczone do testowania dodawano razem z mm bgliceryno-fosforanem (bgp; Sigma nr kat. G9891) i 50 mm kwasem askorbinowym (AA; Wako Pure Chemical nr kat ). Przed ich dodaniem do komórek, sklerostynę i Fab przeznaczone do testowania preinkubowano na oddzielnej płytce przez 2 godziny w temperaturze pokojowej; w międzyczasie do 96-dolkowych

64 płytek dodawano 2,1 lub 2,8 nm BMP-2 (R&D Systems, nr kat. 355-BM-0), a następnie mieszankę sklerostyna-fab. Komórki inkubowano przez 14 dni i pożywkę testową wymieniano co 3-4 dni. W skrócie, pod koniec inkubacji, komórki przemywano dwukrotnie 0 µl PBS/dołek, do każdego dołka dodawano 50 µl 0,5 M HCl i płytki zamrażano w temperaturze - C przez minimum 24 godziny. W odpowiednim czasie, płytki rozmrażano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny i ml z każdego dołka przenoszono na nową 96-dołkową płytkę. Następnie dodawano roztwór roboczy wapnia (1:5) (0 ml) i 5-30 minut później, płytki odczytywano przy 595 nm na czytniku mikropłytek. [0219] Absorbancję przeliczano na µg wapnia na podstawie krzywej wzorcowej, wartość dla dołka kontrolnego (kwas askorbinowy i beta-glicerynofosforan) odejmowano od wyników dla każdego dołka i końcowe wyniki wyrażano jako mineralizację w % indukowaną przez BMP-2. Fosforylacja Smad1 (test Western blot) Materiały [02] Mysie osteoblasty MC3T3-E1, (klon japoński, otrzymano dzięki uprzejmości dra T. Kokkubo, Novartis, Japonia) Komórki C3HT1/2 (mysie macierzyste komórki mezenchymalne; ATCC, nr kat.: CCL-226) SCL nieglikozylowane, pochodzące z E. coli (Novartis, PSU5257) N SCL nieglikozylowane, pochodzące z E. coli (Novartis, PSU11274) hsost-app, glikozylowane, pochodzące z HEK-EBNA (Novartis, BTP110) rhscl, glikozylowane, pochodzące z mysich komórek szpiczaka (R&D Systems, nr kat.: 1406-ST/CF) Przeciwciało anty-hsost (R&D Systems, nr kat.: AF1406) Odczynnik do ekstrakcji PhosphoSafe Extraction Reagent (Novagen, nr kat.: ) Koktajl inhibitora proteazy, zestaw III (Calbiochem, nr kat.: ) Żel tris-octanowy NuPAGE Novex 7% 1,5 mm, dołków (Invitrogen, nr kat.: EA03585) Bufor tris-octanowy do elektroforezy SDS x (Invitrogen, nr kat.: LA0041) Przecwiutleniacz NuPAGE (Invitrogen, nr kat.: NP0005) Membrana do transferu elektroforetycznego Immobilon-P 45um (Millipore, nr kat.: IPVH000)

65 Bibuła chromatograficzna Wattman (Merck, nr kat.: ) Aparat XCell SureLock Mini-Cell i XCell II Blot Module (Invitrogen) Czytnik do mikropłytek VersaMax (Bucher) Hodowla komórkowa i ekstrakcja [0221] Komórki MC3T3-E1 i C3HT1/2 rutynowo hodowano, odpowiednio, w pożywce MEM alfa (MEMα; Invitrogen, nr kat ) lub w pożywce DMEM o wysokiej zawartości glukozy (Invitrogen, nr kat ). Wszystkie pożywki zawierały % cielęcą surowicę płodową (FCS; BioConcept nr kat. 2-01F-I, lot. Z04459P), 2 mm L-glutaminę (Invitrogen nr kat ), 50 jedn. międzynar. (IU) penicyliny/50 µg/ml streptomycyny (Invitrogen nr kat ) i mm Hepes (Invitrogen nr kat ) (pożywka hodowlana) [0222] Komórki wysiewano w pożywce hodowlanej na 6-dołkowych płytkach (3 ml/dołek) i hodowano aż do osiągnięcia konfluencji (przy 1,4x 5 komórek MC3T3-1b/dołek, konfluencję osiągnięto dnia 3; przy 1,0x 5 C3HT1/2 komórek/dołek, konfluencję osiągnięto dnia 3). Po całonocnej deplecji surowicy w pożywce hodowlanej zawierającej 1% FBS, pożywkę zastąpiono świeżą z dodatkiem 1% FBS, BMP-6 (R&D Systems, nr kat. 507-BP) i substancji przeznaczonej(ych) do testowania. Przed dodaniem do komórek, BMP-6 i substancję(e) przeznaczoną(e) do testowania preinkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, jak opisano dla fosfo-smad 1/3/5 w C3HT1/2 (Winkler, EMBO J., 03, 22(23): ). W przypadku testowania przeciwciał przeciw sklerostynie, preinkubowano je ze sklerostyną przez noc w temperaturze 4 C, po czym inkubowano z 0,2 nm BMP-6 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i na koniec dodawano do komórek konfluentnych. Po odpowiednim czasie traktowania, komórki przemywano 2 ml lodowatego PBS. Następnie do komórek dodawano 0 µl/dołek odczynnika do ekstrakcji PhosphoSafe Extraction Reagent i rozcieńczonego w stosunku 1:0 koktajlu inhibitora proteazy, a następnie inkubowano na lodzie przez 5 minut. Komórki zeskrobywano z dołków i przenoszono do probówki do mikrowirówki. Ekstrakt komórek trzymano na lodzie przez minut, przerywając etapem wirowania co 5 minut. Następnie, ekstrakt komórek wirowano przez 5 minut przy g i w temperaturze 4 C. Na koniec, supernatant przenoszono do świeżej probówki do mikrowirówki w celu oznaczenia białka. [0223] Stężenie białka w lizacie komórkowym oznaczano przy użyciu zestawu do oznaczania białka BCA Protein Assay Kit zgodnie z instrukcją producenta. BSA stosowano jako wzorzec. W celu denaturacji, lizat komórkowy rozcieńczano 1:2 za pomocą buforu Laemmli (Bio-Rad, nr kat , zawierający β-merkaptoetanol (1:,

66 Merck, nr kat. 1,106) świeżo dodany) i ogrzewano do wrzenia przez 5 minut w temperaturze 95 C. Po schłodzeniu, próbki przechowywano w temperaturze - C aż do dalszego użycia. Western blot [0224] Przeciwciało anty-smad (H-465) (Santa Cruz, nr kat.: sc-73) jest króliczym poliklonalnym IgG, skierowanym przeciwko aminokwasom reprezentującym pełnej długości Smad1 pochodzenia ludzkiego. Powinno rozpoznawać Smad1, Smad2, Smad3, Smad5 i Smad8 pochodzenia ludzkiego, szczurzego i mysiego. Przeciwciała Fosfo-Smad1 (Ser463/465)/Smad5 (Ser463/465)/Smad8 (Ser426/428) (Cell Signalling, nr kat. 9511) to królicze poliklonalne IgG, skierowane przeciwko syntetycznemu fosfo-peptydowi odpowiadającemu resztom otaczającym Ser463/465 ludzkiego Smad5. Powinno wykrywać endogenny poziom Smad1 tylko w przypadku podwójnej fosforylacji przy serynie 463 i serynie 465, a także Smad5 i Smad8 jedynie w przypadku fosforylacji przy równoważnych miejscach pochodzenia ludzkiego, mysiego, szczurzego, od norek i płazów xenopous. Przeciwciało nie reaguje krzyżowo z innymi białkami spokrewnionymi ze Smad. [0225] System XCell SureLock Mini Cell System (Invitrogen) przygotowano zgodnie z instrukcją producenta. Próbki białka (2 mg dla Smad, 5 mg fosfo-smad do analizy Western) załadowano w równych końcowych objętościach na żel tris-octanowy 7% NuPAGE Novex w 1x buforze do elektroforezy. Wstępnie wybarwiony wzorzec SeeBlue Plus2 ( µl, 1:; Invitrogen, nr kat. LC5925) i białko wzorcowe MagicMark XP Western ( µl, 1:0;(Invitrogen, nr kat.; LC5602) stosowano jako markery masy cząsteczkowej. Elektroforezę przeprowadzano przez 75 minut przy stałym napięciu (0V). [0226] Gąbki i bibułę filtracyjną namaczano w 700 ml 1x NuPAGE buforze do transferu elektroforetycznego. Membranę PVDF do transferu elektroforetycznego najpierw namaczano przez 30 sekund w metanolu, a następnie przenoszono w 1x buforze do przenoszenia elektroforetycznego NuPAGE (Invitrogen, nr kat. NP0006, bufor do przenoszenia elektroforetycznego: metanol :1 świeżo sporządzony). Płytki kasety do elektroforezy oddzielano za pomocą noża do żelu, jedną wstępnie namoczoną bibułę filtracyjną umieszczano z wierzchu żelu i usuwano ostrożnie wszelkie uwięzione bąbelki powietrza. Płytkę odwracano do góry nogami na cienkiej folii do zawijania i po usunięciu płytki, wstępnie namoczoną membranę do przenoszenia umieszczano na żelu i usuwano wszelkie pęcherzyki powietrza. Drugą wstępnie namoczoną bibułę filtracyjną umieszczano z wierzchu i usuwano wszelkie pęcherzyki powietrza. Dwie namoczone gąbki umieszczano na rdzeniu katody modułu Cell II Blot Module. Warstwę żel/membrana

67 ostrożnie podnoszono i umieszczano na gąbkach (z żelem bliżej rdzenia katody). Na koniec, 3 wstępnie namoczone gąbki umieszczano na układzie membranowym i na górze umieszczano rdzeń anody. Moduł do blottingu przesuwano po prowadnicy do dolnej komory buforowej i kiln blokowano w odpowiedniej pozycji zgodnie z instrukcją producenta. Moduł do blottingu napełniano 1x buforem do przenoszenia NuPAGE aż do przykrycia układu żel/membrana. Zewnętrzną komorę buforową napełniano 650 ml dejonizowanej wody i białka przenoszono na membranę PVDF przy stałym napięciu (30 V) przez 2 godziny. [0227] Po blottingu, membranę najpierw przemywano przez minut w 0,05 % Tween w PBS i następnie blokowano delikatnie wytrząsając przez 1 godzinę w 25 ml buforu do blokowania SuperBlock T w temperaturze pokojowej. Do membrany dodawano pierwszorzędowe przeciwciało (fosfo-smad 1/5/8 lub Smad (H-465)) w rozcieńczeniu 1:00 w buforze do blokowania SuperBlock T (Pierce, nr kat ) i membranę inkubowano przez noc w temperaturze 4 C wytrząsając. Membranę następnie przemywano 3-krotnieprzez minut za pomocą 0,05 % Tween (Fluka, nr kat ) w PBS, po czym inkubowano z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z RP (1:00 w buforze do blokowania SuperBlock T) przez 60 minut w temperaturze pokojowej wytrząsając. Przeprowadzano co najmniej 3 etapy przemywania po minut każdy, po czym membranę inkubowano przez 5 minut z roztworem roboczym substratu SuperSignal West Femto (Pierce, nr kat ). Na koniec, membranę umieszczano w plastikowej kieszeni i obrazowano przy użyciu Fluor-S Multilmager (Bio-Rad) i kamery. Optymalny czas ekspozycji w zakresie 1 do 2 minut wyznaczono poprzez porównanie obrazów wykonanych w czasie 30 sekund do 5 minut. Analiza danych [0228] Aktywność chemiluminescencyjną mierzono przy użyciu aparatu Quantity One (Bio-Rad) i wartości EC 50 obliczano przy użyciu programu XLfit4. Każdy sygnał fosfo-smad normalizowano do jego odpowiedniego całkowitego sygnału Smad. Test ELISA LRP6/sklerostyna [0229] 96-dołkowe nietraktowane płytki mikrotitracyjne pokrywano 0 µl/dołek LRP6/Fc (1 µg/ml, R&D Systems, nr kat. 05-LR) rozcieńczonym w PBS. Jako kontrolę dla nieswoistego wiązania (NSB), kilka dołków napełniano 0 µl/dołek PBS. Płytki przykrywano folią plastikową i inkubowano przez noc w temperaturze pokojowej. Po pokryciu, płytki przemywano 3-krotnie za pomocą 0 ml/dołek 0,05% Tween (Fluka, nr kat ) w PBS i dołki blokowano przez 1 godzinę w temperaturze 37 C dodając 300 ml/dołek buforu do blokowania SuperBlock (Pierce, nr kat ) w TBS. Po

68 inkubacji, roztwór do blokowania usuwano i dodawano 0 ml/dołek sklerostyny (pochodząca z E.coli, Novartis; 1-00 ng/ml,) rozcieńczonej w 1% BSA w PBS. Płytki inkubowano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, po czym przemywano 3-krotnie za pomocą 0 ml/dołek 0,05% Tween w PBS. Następnie, dodawano 0 ml/dołek przeciwciała przeciw sklerostynie (1 mg/ml) rozcieńczonego w 1% BSA w PBS i płytki inkubowano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, po czym przemywano 3-krotnie za pomocą 0 ml/dołek 0,05% Tween w PBS. Na koniec, dodawano 0 ml/dołek sprzężonego z ALP przeciwciała przeciw koziemu IgG (1: 5000; Sigma nr kat. A-7888) rozcieńczonego w 1% BSA (Sigma nr kat.: A-7888) w PBS w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej i płytki następnie przemywano 3-krotnie za pomocą 0 ml/dołek 0,05% Tween w PBS. W celu oznaczenia ALP, do płytek dodawano 0 ml/dołek roztworu substratu ALP (Sigma, nr kat. S0942, 1 tabletka na 5 ml buforu na bazie dietanoloaminy 1x; Pierce, nr kat ) w ciągu 90 minut i gęstość optyczną mierzono przy 405 nm. Nadekspresja LRP4 w komórkach HEK293 [0230] Komórki HEK293 (ATCC nr kat. CRL-73) rutynowo hodowano w pożywce DMEM/F12 (Invitrogen nr kat ) z dodatkiem % FCS (BioConcept nr kat. 2-01F-I, lot. Z04459P), 2 mm L-glutaminy (Invitrogen nr kat ), 0 jedn. międzynar. (IU) penicyliny/0 µg/ml streptomycyny (Invitrogen nr kat ) i mm HEPES (Invitrogen nr kat ). Komórki Hek293 wysiewano w ilości 5x 4 komórek/dołek na 48-dołkowych płytkach z poli-d-lizyną i inkubowano przez 24 godziny, po czym przeprowadzano transfekcję za pomocą lipofektaminy 00 (Invitrogen nr kat ). Do każdego transfekowanego dołka, dodawano następujące ilości plazmidów do końcowej objętości 25 µl OptiMEM I (Gibco, nr kat ) i delikatnie mieszano: do dołków kontrolnych (pmaxgfp, 62,5 ng, pcdna3+, 125 ng; SuperTopFlash (STF) 62,5 ng; plazmid z genem lucyferazy z renilli kierowanym przez promotor SV40, 0,75 ng) i do dołków traktowanych Wnt1 (pmaxgfp, 62,5 ng, pcdnawnt1, 62,5 ng; pcdna3+, 62,5 ng; Super-TopFlash (STF) 62,5 ng; plazmid z genem lucyferazy z renilli kierowanym przez promotor SV40, 0,75 ng) i do dołków traktowanych LRP4-Wnt1 (pcdna3+-lrp4, 62,5 ng, pcdna3+-wnt1, 62,5 ng; pcdna3+, 62,5 ng; SuperTopFlash (STF) 62,5 ng; plazmid z genem lucyferazy z renilli kierowanym przez promotor SV40, 0,75 ng). W drugiej probówce, 0,8 ml lipofektaminy 00 rozcieńczano do końcowej objętości 25 ml OptiMEM I i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Zawartość w dwóch probówkach następnie mieszano dodając zawartość probówki z lipidem do probówki z DNA i inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej

69 umożliwiając wytworzenie kompleksu DNA-lipid. Kompleks DNA-lipid (50 ml) następnie równomiernie dodawano do dołków i inkubowano w temperaturze 37 C w atmosferze 5% CO 2 przez 5 godzin. Pod koniec 5-godzinnej inkubacji, komórki były gotowe do - godzinnego traktowania odczynnikami testowymi, takimi jak SOST, DKK1 (R&D nr kat. 96-DK), przeciwciała itp. Test z zastosowaniem lucyferazy przeprowadzano sposobem opisanym w części dotyczącej testu Wnt, ale z dodatkiem 0 µl buforu do lizy pasywnej. Nadekspresja LRP4 w komórkach C28A2 [0231] Komórki C28a2 (z Mary Goldring, Harvard Institutes of Medicine, Boston, MA, Stany Zjednoczone) hodowano w tej samej pożywce co komórki HEK293 (zob. powyżej) z tym wyjątkiem, że HEPES nie było obecne i dodano suplement nieistotnych aminokwasów (Gibco nr kat ). Komórki C28a2 wysiewano w ilości 1x 5 komórek/dołek na 24-dołkowej płytce w pożywce bez antybiotyków i inkubowano przez noc, po czym przeprowadzano transfekcję za pomocą lipofektaminy 00 (Invitrogen nr kat ). Do każdego transfekowanego dołka, dodawano następujące ilości plazmidów (w sumie 600 ng/dołek) do końcowej objętości 50 µl OptiMEM I (Gibco, nr kat ) i delikatnie mieszano: do dołków kontrolnych (SuperTopFlash (STF) 0 ng; plazmid z genem lucyferazy z renilli kierowanym przez promotor SV40, 2 ng i pcdna3+, 500 ng w celu kompensacji) i do dołków traktowanych Wnt1 (plazmid pcdna-wnt1, 0 ng; plazmid LRP5, 0 ng; SuperTopFlash (STF) 0 ng; plazmid z genem lucyferazy z renilli kierowanym przez promotor SV40, 2 ng i pcdna3+, 300 ng) i do dołków traktowanych LRP4-Wnt1 (plazmid pcdna-wnt1, 0 ng; plazmid LRP5, 0 ng; plazmid LRP4, 0 ng; SuperTopFlash (STF) 0 ng; plazmid z genem lucyferazy z renilli kierowanym przez promotor SV40, 2 ng i pcdna3+, 0 ng). W drugiej probówce, 1,6 ml lipofektaminy 00 rozcieńczano w 48,4 µl OptiMEM I i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Zawartość dwóch probówek następnie mieszano dodając zawartość probówki z lipidem do probówki z DNA i inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej umożliwiając wytworzenie kompleksu DNA-lipid. Kompleks DNA-lipid (0 µl) następnie równomiernie dodawano do dołków i inkubowano w temperaturze 37 C w atmosferze 5% CO 2 przez 2 godziny. Pod koniec 2-godzinnej inkubacji, pożywkę do transfekcji zastępowano 450 µl/dołek pożywki bez antybiotyków i komórki inkubowano przez 24 godziny. Komórki następnie traktowano przez godzin odczynnikami testowymi, takimi jak SOST lub DKK1 (R&D nr kat. 96-DK). Test z zastosowaniem lucyferazy przeprowadzano sposobem opisanym w części dotyczącej testu Wnt. Knockdown (wyciszanie) LRP4 w komórkach HEK293

70 [0232] Komórki Hek293 Wnt1/STF/Renilla (stabilny klon otrzymany w wyniku stabilnej transfekcji komórek Hek293 (ATCC nr kat. CRL-73)) z plazmidem ekspresyjnym Wnt1, plazmidem reporterowym SuperTopFlash i plazmidem z genem lucyferazy z renilli kierowanym przez promotor SV40) rutynowo hodowano w pożywce DMEM 4500 g/l glukozy (Invitrogen nr kat ) z dodatkiem % FCS (nr kat. Amimed 2-0F0-I), 2 mm L-glutaminy (Invitrogen nr kat ), 0 jedn. międzynar. (IU)/ml penicyliny/0 µg/ml streptomycyny (Gibco nr kat ), 6 µg/ml puromycyny (Invitrogen nr kat. ant-pr-1), 0 µg/ml zeocyny (Invitrogen nr kat ) i 0 µg/ml higromycyny (Invitrogen nr kat ). Antybiotyki do selekcji opuszczano podczas eksperymentów z wyciszaniem. Komórki wysiewano w ilości 0,6x 5 komórek/dołek na 24-dołkowej płytce z poli-d-lizyną i pozostawiano do przyłączenia na noc, po czym przeprowadzano transfekcję sirna LRP4 za pomocą HiPerFect (Qiagen nr kat ). Stosowane sekwencje sensowne i antysensowne sirna LRP4 były następujące: LRP4a: TAAATTATCATAAAGTCCTAA/AGGACTTTATGATAATTTATT; (SEQ ID NO:160/161) LRP4b: ATAGTGGTTAAATAACTCCAG/GGAGTTATTTAACCACTATTT; (SEQ ID NO:162/163) LRP4c: TAAATTCTCGTGATGTGCCAT/GGCACATCACGAGAATTTATT; (SEQ ID NO:164/165) LRP4d: TTTCTTATAGCACAGCTGGTT/CCAGCTGTGCTATAAGAAATT; (SEQ ID NO:166/167) LRP4e: TAGACCTTTCCATCCACGCTG/GCGTGGATGGAAAGGTCTATT; (SEQ ID NO:168/169) Dla każdego transfekowanego dołka, przygotowano dwie probówki eppendorfa: pierwsza zawierała 0,2 µl nm roztworu podstawowego jednego spośród sirna LRP4 lub 0,1 µl nm roztworu podstawowego dwóch różnych sirna LRP4 (końcowe całkowite stężenie w sirna/dołek wynosiło 6,6 nm) i 50 µl Optimem, a druga, 3 µl HiPerFect i 47 µl Optimem. Zawartość drugiej probówki dodawano do pierwszej, krótko wirowano i pozostawiano na minut w temperaturze pokojowej. 0 µl tej mieszaniny następnie dodawano do odpowiedniego dołka i komórki inkubowano w temperaturze 37 C w atmosferze 5% CO 2 przez 30 godzin. Następnie, mieszankę transfekcyjną usuwano i wymieniano na świeżą pożywkę bez antybiotyków (450 µl/dołek) i pozostawiano do inkubacji na kolejne 24 godziny. Przed traktowaniem SOST lub DKK1, pożywki usuwano, wymieniano na świeżą pożywkę bez antybiotyków zawierającą odpowiednie rozcieńczenie SOST lub DKK1 (R&D nr kat. 96-DK) i komórki

71 inkubowano przez godzin w temperaturze 37 C w atmosferze 5% CO 2. Lucyferazę oznaczano sposobem opisanym w części dotyczącej testu Wnt. Modele zwierzęce [0233] Ośmiomiesięcznym samcom myszy OF1/IC (n=16/grupę, Charles River, Francja) podawano dwa razy w tygodniu dożylnie przeciwciało przeciw sklerostynie PRZECIWCIAŁO A (25 mg/kg, h/mlgg2a) (MOR05813) lub przeciwciało kontrolne (anty-pc-h/mlgg2a). Grupy kontrolne otrzymywały codziennie podskórnie 0 mikrog/kg PTH(1-34) lub podłoże PBS. Leczenie trwało 2,5 tygodnia w przypadku wszystkich zwierząt. Połowę zwierząt (n = 8/grupę) uśmiercano w tym punkcie czasowym w celu przeprowadzenia analizy histomorfometrycznej. U pozostałych zwierząt leczenie kontynuowano (n= 8/grupę) przez okres do 5 tygodni. [0234] Masę i geometrię kości piszczelowej zwierząt zmierzono na początku leczenia techniką obwodowej ilościowej tomografii komputerowej (pqct) i mikrotomografii komputerowej (mikroct). Zwierzęta były równomiernie przydzielane do grup pod względem masy ciała i całkowitej gęstości mineralnej kości piszczelowej według pomiaru pqct. Zmiany gęstości mineralnej, masy i geometrii kości oceniano po 2,5 i 5 tygodniach leczenia. Masę ciała monitorowano co tydzień. Zwierzętom, które uśmiercano po 2,5 tygodniach leczenia podawano dwa znaczniki fluorochromowe w celu wyznakowania mineralizacji kości i 3 dni przed nekropsją. Krew pobierano podczas nekropsji. Przeprowadzano pomiary metodą absorpcjometrii promieniowania rentgenowskiego o podwójnej energii (DEXA) podczas nekropsji na wyciętej kości piszczelowej, kości udowej i kręgach lędźwiowych. Kości utrwalano, odwadniano i zatapiano w celu pocięcia na skrawki za pomocą mikrotomu i przeprowadzenia analizy histomorfometrycznej dynamiki tworzenia kości. Protokół leczenia [0235] Przeciwciało kontrolne: anty-pc-h/mlgg2a, Stężenie: 2,5 mg/ml, Stosowana objętość: ml/kg Podłoże: 50 mm cytrynian, 140 mm NaCl 35 mg/ml, Przeciwciało przeciw sklerostynie: anty-sost-mor05813, h/mlgg2a, 2,45 Stosowana objętość: ml/kg Podłoże: 50 mm cytrynian, 140 mm NaCl

72 71 hpth (1-34) (Bachem, Bubendorf, Szwajcaria) 0 µg/kg Podłoże: PBS+BSA 0,1 % Leczone grupy: 1 izotyp jako kontrola iv. = anty-pc-mlgg2a 2 anty-sost-mor05813 iv. 3 podłoże jako kontrola sc. = PBS+BSA 0,1% 4 hpth(1-34) sc. Warunki chowu [0236] Zwierzęta trzymano w grupach po cztery do pięciu zwierząt w temperaturze 25 C w cyklu 12:12 godz. światło-ciemność. Karmiono je standardową karmą laboratoryjną zawierającą 0,8% fosforu oraz 0,75% wapnia (NAFAG 3893,0,25, Kliba, Basel, Szwajcaria). Karma i woda były dostępne bez ograniczeń. Oświadczenie w sprawie dobrostanu zwierząt [0237] Doświadczenia na zwierzętach przeprowadzano zgodnie z przepisami obowiązującymi w kantonie Bazylea-Miasto, Szwajcaria. Metody obwodowej ilościowej tomografii komputerowej (pqct) [0238] Zwierzęta ustawiano w położeniu bocznym pod narkozą przez inhalację (izofluran, 2,5%). Lewą nogę rozciągano i przymocowywano w tej pozycji. [0239] Masę kostną w przekroju poprzecznym, gęstość i geometrię monitorowano w proksymalnej przynasadzie kości piszczelowej na poziomie środka głowy kości strzałkowej i 1,8 mm dystalnie do proksymalnego końca kości piszczelowej w pomiarze w skanie badawczym przy użyciu zaadaptowanego aparatu Stratec-Norland XCT-00 wyposażonego w lampę rentgenowską Oxford 50 AM i kolimator o średnicy 0,5 mm. Do pomiarów wybrano następujące ustawienia: rozmiar wokseli: 0,1 x 0,1 x 0,5 mm; szybkość skanowania: zdjęcie bazowe mm/s; końcowy skan 3 mm/s, 1 blok, tryb konturowy (contour mode) 1, próg rozdzielnia (peel mode) 2; próg korowy (cortical threshold): 6 mg/cm 3, próg wewnętrzny (inner threshold): 6 mg/cm 3. Mikrotomografia komputerowa (mikroct) [0240] Zwierzęta ustawiano w położeniu bocznym pod narkozą przez inhalację (Izofluran, 2,5%). Lewą nogę rozciągano i przymocowywano w tej pozycji. [0241] Oceniano strukturę kości gąbczastej w lewej proksymalnej przynasadzie kości piszczelowej przy użyciu aparatu Scanco vivact (Scanco Medical AG,

73 Szwajcaria). Nieizomeryczne woksekle miały rozmiar,5 x,5 x,5 µm. Na podstawie obrazów w przekroju poprzecznym, przedział kości gąbczastej został wyodrębniony z kości korowej poprzez śledzenie jej konturu. We wszystkich innych przekrojach, granice interpolowano na podstawie śledzenia w celu określenia objętości będącej przedmiotem zainteresowania. Oceniano 143 przekroje w obrębie obszaru wtórnej istoty kości gąbczastej (począwszy od poziomu poniżej dolnych krawędzi bocznych płytki wzrostu). Wartość progową 370 stosowano do 3-wymiarowej oceny parametrów strukturalnych. Absorpcjometria promieniowania rentgenowskiego o podwójnej energii (DEXA) [0242] Pomiary DEXA ex vivo przeprowadzano na lewej kości piszczelowej, lewej kości udowej i kręgach lędźwiowych. Do stymulacji tkanek miękkich używano etanolu (70%). Pomiary przeprowadzano przy użyciu normalnego aparatu Hologic QDR- 00 przystosowanego do pomiaru małych zwierząt. Stosowano kolimator o średnicy 0,9 cm i tryb bardzo wysokiej rozdzielczości (odstęp między liniami 0,0254 cm, rozdzielczość 0,0127 cm). Znakowanie fluorochromami: [0243] Alizarin ( mg/kg, podskórnie, alizarin complexone, Merck, Dietikon, Szwajcaria) - dni przed nekropsją Kalceina (30 mg/kg, podskórnie, Fluka, Buchs, Szwajcaria) -3 dni przed nekropsją Badania histologiczne i histomorfometryczne [0244] Po wycięciu, prawą kość udową i kręgi lędźwiowe 5 i 6 umieszczano na 24 godziny w utrwalaczu Karnovsky'ego, odwodniano w etanolu w temperaturze 4 C i zatapiano w żywicy (metakrylan metylu). Przy użyciu mikrotomu 50 Supercut (Reichert Jung, Arnsberg, Niemcy), wycinano zestaw niesąsiadujących skrawków o grubości 5 µm w płaszczyźnie czołowej przechodzącej przez środek trzonu do oceny tworzenia kości w oparciu o znakowanie fluorochromem. Skrawki badano przy użyciu mikroskopu Leica DM (Leica, Heerbrugg, Szwajcaria) wyposażonego w kamerę (SONY DXC-950P, Tokyo, Japonia) i przystosowanego do oprogramowania Quantimet 600 (Leica, Cambridge, Wielka Brytania). Próbkowano jeden skrawek na zwierzę. Obrazy mikroskopowe próbek digitalizowano i oceniano półautomatycznie na ekranie. Mierzono obwód kości, obwód kości pojedynczo i podwójnie znakowany i odległość między znacznikami (powiększenie X0). Obliczano stopień mineralizacji na obwodzie (w procentach), szybkość odkładania minerałów (mikrometrów/dzień) (z korektą na ukośność skrawków w warstwie gąbczastej) i dzienne wartości szybkości tworzenia kości (dzienna szybkość tworzenia kości/obwód

74 kości [mikrometrów/dzień]). Wszystkie parametry wyznaczano we wtórnej istocie gąbczastej dystalnej przynasady kości udowej i w jednym kręgu lędźwiowym. Kolejny zestaw skrawków był wybarwiany kwaśną fosfatazą oporną na winian (TRAP). Wyznaczano powierzchnię osteoklastów na powierzchnię kości (%) we wtórnej istocie gąbczastej: Analiza statystyczna [0245] Wyniki wyrażano jako średnią +/-SEM. Analizę statystyczną przeprowadzano przy użyciu testu Studenta (dwustronny; dla prób niezależnych). Leczenie (przeciwciało przeciw sklerostynie lub hpth(1-34) badano pod względem różnicy w stosunku do kontroli (kontrolne przeciwciało lub PBS), *, + p< 0,05, **, ++ p < 0,01. Określanie powinowactwa Określanie powinowactwa wybranych Fab przeciw sklerostynie ludzkiej przy użyciu plazmonowego rezonansu powierzchniowego (Biacore) [0246] Stałe kinetyczne k on i k off wyznaczano za pomocą seryjnych rozcieńczeń odpowiedniego Fab wiążącego się z kowalencyjnie unieruchomionym (immobilizowanym) antygenem sklerostyny przy użyciu aparatu BIAcore 3000 (BIAcore, Uppsala, Szwecja). Do kowalencyjnego unieruchamiania antygenu stosowano standardową chemię sprzęgania amin EDC-NHS. Pomiary kinetyczne przeprowadzano w PBS (136 mm NaCl, 2,7 mm KCl, mm Na 2 HPO 4, 1,76 mm KH 2 PO 4 ph 7,4) przy szybkości przepływu µl/minut stosując Fab w stężeniach w zakresie 1,5-500 nm. Czas iniekcji dla każdego stężenia wynosił 1 minut, z dalszą 3-minutową fazą dysocjacji. Do regeneracji stosowano 2 x 5 µl mm glicyny ph 1,5. Wszystkie sensogramy dopasowywano przy użyciu programu oceny BIA 3.1 (BIAcore). Analiza wiązania bazująca na elektrochemiluminescencji (BioVeris) do pomiaru powinowactwa Fab do wiązania ze sklerostyną w lizatach [0247] W celu pomiaru powinowactwa fragmentów przeciwciała wiążących sklerostynę w lizatach E. coli (ekstrakty BEL), wiązanie analizowano za pomocą systemu BioVeris M-384 SERIES Workstation (BioVeris Europe, Witney, Oxfordshire, UK). [0248] Eksperyment przeprowadzano na 96-dołkowych polipropylenowych płytkach mikrotitracyjnych z PBS z dodatkiem 0,5 % BSA i 0,02 % Tween jako buforem testowym. Biotynylowaną ludzką sklerostynę unieruchamiano (immobilizowano) na kulkach paramegnetycznych M-280 ze streptawidyną (Dynal) według instrukcji dostawcy. Dodawano roztwór podstawowy kulek w rozcieńczeniu 1:25 na dołek. 0 µl rozcieńczonego ekstraktu BEL i kulki inkubowano przez noc w temperaturze pokojowej na

75 wytrząsarce. Do detekcji stosowano anty-ludzkie (Fab) 2 (Dianova) znakowane BV-tagTM według instrukcji dostawcy (BioVeris Europe, Witney, Oxfordshire, UK). [0249] Losowo pobrane klony analizowano metodą opisaną powyżej. Klony dające najwyższe wartości wybierano do dalszej analizy poprzez miareczkowanie równowagowe w roztworze. Określanie powinowactwa Fab do sklerostyny metodą miareczkowania roztworu równowagowego (SET) [0250] W celu wyznaczenia KD, stosowano frakcje monomerów Fab (zawartość monomerów co najmniej 90%, analizowano techniką analitycznej SEC; Superdex75, Amersham Pharmacia). Określanie powinowactwa na podstawie pomiarów elektrochemiluminescencyjnych (ECL) w roztworze i ocenę wyników zasadniczo przeprowadzano sposobem opisanym przez Haenela i wsp., 05. Stałą ilość Fab (25 pm) doprowadzano do równowagi z różnymi stężeniami (seryjne 3 n rozcieńczenia) nieznakowanej sklerostyny ludzkiej, sklerostyny mysiej lub sklerostyny makaka jawajskiego (wyjściowe stężenie: 500 pm) w roztworze. Dodano biotynylowaną ludzką sklerostynę (0,5 µg/ml) sprzężoną z kulkami paramagnetycznymi (M-280 ze streptawidyną, Dynal) i znakowane BV-tag (BioVeris Europe, Witney, Oxfordshire, UK) anty-ludzkie przeciwciało (Fab) 2 (Dianova)i inkubowano przez 30 minut. Następnie, stężenie niezwiązanego Fab określano ilościowo poprzez detekcję ECL przy użyciu analizatora M-SERIES 384 (BioVeris Europe). [0251] Klony o poprawionym powinowactwie Fab zidentyfikowano za pomocą zestawu z wysokowydajnego testu skriningu powinowactwa na bazie ECL BioVeris. Po selekcji tych spełniających kryterium skonsolidowano 4 klony tą samą metodą. Test siły hamowania wiązania z receptorem przy użyciu BioVerisTM [0252] W teście BioVerisTM siły hamowania wiązania, rekombinowaną ludzką BMP-2 bezpośrednio sprzęgano (chemia NHS/EDC) z kulkami magnetycznymi z kwasem karboksylowym M-270 (Dynal) według instrukcji dostawcy. Test przeprowadzano na 96- dołkowej polipropylenowej płytce mikrotitracyjnej (Nunc). 50 µl/dołek oczyszczonego Fab w buforze testowym (PBS + 1 % Tween (warunki ostre) lub 0,1 % Tween (warunki mniej ostre) + 1 % BSA) rozcieńczano w etapach rozcieńczania 1:3 (stężenie wyjściowe: 00 nm). Do każdego rozcieńczenia Fab dodawano 50 µl/dołek biotynylowanej ludzkiej sklerostyny (4 nm). Po inkubacji przez 90 minut z wytrząsaniem przy 400 obr./min na termomikserze Eppendorf w temperaturze 22 C, do każdego dołka dodawano 25 µl kulek powleczonych BMP-2 (2,7E07 kulek na ml) i streptawidynę w rozcieńczeniu 1:500 znakowaną BV-tag według instrukcji dostawcy (BioVeris Europe) i

76 inkubowano przez 30 minut (800 obr./min, 22 C). Detekcję przeprowadzano za pomocą systemu BioVeris M-384 SERIES Workstation (BioVeris Europe). W celu wyznaczenia EC 50 stosowano 4-parametrowy logistyczny model dopasowywania (XLfit, IDBS). Wytwarzanie immunoglobulin Konwersja do ludzkiego formatu IgG1 i ludzko-mysiego formatu IgG2a [0253] W celu ekspresji pełnej długości IgG, fragmenty zmiennej domeny łańcucha ciężkiego (VH) i lekkiego (VL) subklonowano z wektorów ekspresyjnych Fab do odpowiednich wektorów pmorph Ig: pmorph _h_ig1 i chimerycznego ludzko-mysiego pmorph 2_h/m_Ig2a. Enzymy restrykcyjne EcoRI, MfeI, BlpI stosowano, odpowiednio, do subklonowania fragmentu domeny VH do wektora pmorph _h_igg1 lub pmorph 2_h/m_IgG2a i EcoRV, BsiWI, HpaI do subklonowania fragmentu domeny VL do wektora pmorph _h_igk, pmorph _h_igλ i pmorph 2_h/m_Igλ. Enzymy restrykcyjne EcoRI, MfeI i BlpI stosowano, odpowiednio, do subklonowania fragmentu domeny VH do pmorph _h_igg1: szkielet wektora wytwarzano poprzez trawienie EcoRI/BlpI i ekstrakcję fragmentu 6400 bp, podczas gdy fragment VH (350 bp) wytwarzano poprzez trawienie MfeI i BlpI i dalsze oczyszczanie. Wektor i insert ligowano poprzez kompatybilne zwisy wytworzone w wyniku trawienia, odpowiednio, EcoRI i MfeI, i poprzez miejsce BlpI. W ten sposób, niszczone są oba miejsca restrykcyjne EcoRI i MfeI. [0254] Enzymy restrykcyjne MfeI i BlpI stosowano do subklonowania fragmentu domeny VH do pmorph 2_h/m_ IgG2a. W tej nowej generacji wektorów IgG, w wyniku innych modyfikacji, miejsce EcoRI (umożliwiające jedynie subklonowanie poprzez kompatybilne zwisy) zastępowano miejscem MfeI umożliwiając w ten sposób trawienie MfeI/BlpI obu, wektora i insertu. [0255] Subklonowanie fragmentu domeny VL do pmorph _h_igк przeprowadzano poprzez miejsca EcoRV i Bs/WI, podczas gdy subklonowanie do pmorph _h_igλ i pmorph 2_h/m_Igλ przeprowadzano przy użyciu EcoRV i HpaI. Przejściowa ekspresja i oczyszczanie ludzkiego IgG [0256] Komórki HEK293 lub HKB11 transfekowano równomolową ilością wektorów ekspresyjnych ciężkiego i lekkiego łańcucha IgG. W dniach 4 lub 5 po transfekcji zbierano nadsącz hodowli komórkowej. Po doprowadzeniu ph supernatantu do 8,0 i sterylnym przesączeniu, roztwór poddawano standardowej chromatografii kolumnowej z białkiem A (Poros A, PE Biosystems). Przykład 1: Wytwarzanie rekombinowanych białek sklerostyny ludzkiej i sklerostyny makaka jawajskiego

77 [0257] Pełnej długości cdna kodujące prekursor ludzkiej sklerostyny (GenBank Acc.No AF326739) z naturalnym peptydem sygnałowym (aa 1-213, NPL ) sklonowano do ssaczego wektora ekspresyjnego prs5a poprzez insercję do miejsc restrykcyjnych Asp718 i Xba1. Znacznik do detekcji i oczyszczania białka (APP = EFRH) dodawano do C-końca genu. [0258] Po weryfikacji ekspresji w małej skali w testach przejściowej transfekcji na 96-dołkowej płytce, wytwarzanie stabilnych puli transfekcyjnych zainicjowano poprzez transfekcję czterech puli (1,03E6 komórek każda) metodą lipofekcji. 48 godzin po transfekcji selekcję transfektantów rozpoczęto dodając antybiotyk Zeocin w stężeniu 0 µg/ml. Po unormowaniu wzrostu wszystkich czterech puli, miana rekombinowanych białek oznaczano analityczną techniką chromatografii powinowactwa na anty-app HPLC i pule o najwyższej wydajności produkcyjnej - Pool2 - selekcjonowano do adaptacji do pożywki bez surowicy i dalej przeskalowywano. Jednocześnie, przeprowadzano również badania przejściowej ekspresji w dużej -l skali przy użyciu polietylenoaminy jako nośnika plazmidowego DNA podczas transfekcji i systemu bioreaktora Wave (CSPS- F, Art.-No , Wave Biotech) jako systemu hodowli. Supernatanty hodowli komórkowych zbierano 7- dni po transfekcji i zatężano przez filtrację z przepływem krzyżowym i diafiltrację przed oczyszczaniem. [0259] Ludzką SOST i SOST makaka jawajskiego oczyszczano metodą chromatografii immunopowinowactwa. W skrócie, serie - l supernatantów hodowli tkankowej zatężano do 1-2 l przez filtrację z przepływem krzyżowym (wartość odcinająca kda) i nakładano z szybkością 2 ml/min na 50-ml kolumnę z sefarozą anty-app otrzymaną poprzez sprzęganie zastrzeżonego monoklonalnego anty-ab1-40/app (6E- A5) z sefarozą 4B aktywowaną CNBr według instrukcji producenta ( mg przeciwciała na ml żywicy). Po podstawowym przemyciu PBS, związany materiał wymywano 0 mm glicyną, ph 2,7 zobojętniano i sterylnie przesączono. Stężenie białka oznaczano przy A280 przy użyciu obliczonych współczynników absorpcji. Oczyszczone białka na koniec scharakteryzowano za pomocą SDSPAGE, poprzez N-terminalne sekwencjonowanie i LC- MS. Alikwot oczyszczonego ludzkiego SOST biotynylowano w PBS przez 1 godzinę w temperaturze 37 C przy użyciu 1 mm sulfo-nhs-ic-biotyny (Uptima; UP54398A). Nadmiar regenta następnie usuwano poprzez ekstensywną dializę wobec PBS. Ludzka SOST pochodząca z E.coli [0260] Znakowaną histydyną His 6 -PreScission streptawidynę SOSTaa (NPL006071, plazmid pxi504) i SOST aa (NPL006690, plazmid pxi5) wytwarzano techniką refoldingu. E.coli Tuner (DE3) transformowano każdym plazmidem.

78 [0261] Serię PSU5257 poddawano fermentacji w skali l (V9405) przy użyciu zmodyfikowanej pożywki TB (wersja lab 112). Komórki indukowano OD600 3,90 za pomocą 1 mm IPTG i indukowano 3 godziny 30 minut w temperaturze 37 C. Zbieranie realizowano przy użyciu wirówki z przepływem ciągłym, otrzymując wilgotny pelet komórkowy o masie 190 g. [0262] Serię PSU11274 poddawano fermentacji w skali l w 16 l pożywki minimalnej M9-1 z dodatkiem chlorku amonu znakowanego N. Komórki indukowano za pomocą 1 mm IPTG aż do uzyskania OD600 1,5 i zbierano przy OD600 3,3 przy użyciu wirówki z przepływem ciągłym, otrzymując wilgotny pelet komórkowy o masie 50 g. [0263] Wilgotne pelety komórkowe z powyższych fermentacji poddawano lizie w 8 objętościach 50 mm Tris ph 8,0 (każda zawierająca 5 mm EDTA, DTT i benzamidyno- HCl) przy użyciu środka emulgującego Avestin C-50 i wirowano przez 30 minut przy obr./min. Supernatant odrzucano i otrzymany pelet zawieszano ponownie w objętościach buforu do lizy i wirowano ponownie. Proces powtarzano jeszcze 3-krotnie, po czym bufor do lizy zastępowano wodą Milli-Q, zawierającą 5 mm DTT. Pelety przemywano jeszcze dwukrotnie stosując opisane warunki. Ciała inkluzyjne rozpuszczano w 8 M chlorowodorku guanidyny (z 0 mm DTT, 50 mm Tris ph 8 i 5 mm EDTA) przez 3-4 godziny w temperaturze otoczenia, następnie wirowano przy 000 obr./min przez 30 minut, przesączano przez filtr 0,45 um. Refolding inicjowano poprzez szybkie rozpuszczanie 88 objętościami (PSU11274) i 92 objętościami (PSU5257) schłodzonego buforu do refoldingu (0,5 M Tris zawierający 0,9 M chlorowodorek argininy, 5 mm GSH i 0,5 mm GSSG ph 8). Roztwór przechowywano w temperaturze 4 C przez 1 tydzień. Na tym etapie, dwa preparaty traktowano nieco odmiennie, ponieważ wymagane było usunięcie znacznika his 6 -tag z PSU5257 przed zakończeniem refoldingu. PSU5257 [0264] Rozcieńczony roztwór stosowany do foldingu poddawano diafiltracji wobec 1,5 objętości 50 mm Tris ph 8, 5 mm GSH, 0,5 mm GSSG zatężając 2-krotnie, następnie rozcieńczając z powrotem do oryginalnej objętości. Operację tę przeprowadzano 3-krotnie, a po tym czasie dodawano proteazę PreScission i roztwór pozostawiano na 48 godzin w temperaturze 4 C. Wszystkie operacje zatężenia/diafiltracji przeprowadzano przy użyciu kasety do ultrafiltracji Pellicon II z membraną o wartości odcinającej KDa. Na koniec roztwór zatężano -krotnie. PSU11274

79 [0265] Rozcieńczony roztwór do refoldingu zatężano -krtonie. LC-MS stosowano do potwierdzenia tworzenia wszystkich 4 mostków disiarczkowych przed zatężaniem. [0266] Oba preparaty następnie poddawano dializie wobec 2 x objętości 50 mm octanu sodu ph 5. Po kolejnym przesączeniu przez watę szklaną i 3,0-mm membranę w celu usunięcia wytrąconego białka, oczyszczanie przeprowadzano przy użyciu wysokosprawnej chromatografii kationowymiennej ze złożem SP-Sepharose. Kolumnę doprowadzano do równowagi za pomocą buforu do dializy i następnie wymywano używając gradientu 0-1 M NaCl w tym samym buforze dla objętości kolumny. Sklerostynę wymywano jako pojedynczy pik z niewielkim ramieniem, które odrzucono. W przypadku PSU5257, zbierano główny pik, zatężano poddając chromatografii wykluczania przy użyciu kolumny Superdex 75, doprowadzano do równowagi za pomocą 50 mm Tris, 0 mm NaCl. W przypadku PSU11274, próbkę dostarczano bezpośrednio po procedurze wymiany jonowej. [0267] cdna SOST makaka jawajskiego (cysost) amplifikowano za pomocą reakcji RT-PCR ze starterami bazującymi na sekwencji SOST afrykańskiej zielonej małpy (nr dostępu GenBank-u AF326742). Starter St5 (ATGCAGCTCCCACTGGCCCTGTGTCTTGT) (SEQ ID NO: 170) odpowiada N- końcowi sekwencji sygnałowej peptydu i nie występuje w końcowym wydzielonym białku; starter 3 (AATCAGGCCGAGCTGGAGAACGCCTACTAG) (SEQ ID NO: 171) odpowiada regionowi, który jest konserwatywny wśród ludzi, zielonych małp afrykańskich i myszy. Amplifikowany fragment subklonowano do miejsc Bam HI/Eco RI pcdna3,1 (+) i sekwencję potwierdzano. Plazmid ten służył dalej jako matryca do amplifikacji PCR cyno-sost w celu dodania C-końcowego znacznika APP i miejsc rekombinacji attb dla końcowego klonowania do pdestrs5a według metody Gateway a [cysostpdestrs5a]. [0268] Ekspresję przeprowadzano poprzez przejściową transfekcję w dużej -l skali w systemie bioreaktora Wave, zbierano po 9 dniach po transfekcji i oczyszczano sposobem opisanym powyżej. Przykład 2: Wytwarzanie ludzkiego swoistego dla sklerostyny przeciwciała z biblioteki HuCAL GOLD [0269] Terapeutyczne przeciwciała przeciwko ludzkiej sklerostynie wytwarzano poprzez selekcję klonów wykazujących wysokie powinowactwo wiązania, przy użyciu jako źródła wariantów białek przeciwciała, komercyjnie dostępnej biblioteki prezentacji fagowej, MorphoSys HuCAL GOLD. Biblioteka HuCAL GOLD jest biblioteką Fab

80 (Knappik i wsp., 00) w której wszystkie 6 regionów CDR są zróżnicowane poprzez odpowiednią mutację i w której stosuje się technikę CysDisplay do łączenia Fab z powierzchnią faga (WO01/05950, Löhning i wsp., 01). Selekcja swoistego dla sklerostyny przeciwciała z biblioteki techniką panningu [0270] Do selekcji przeciwciała rozpoznającego ludzką sklerostynę stosowano wiele strategii panningu. [0271] W skrócie, przeciwciało-fagi HuCAL GOLD podzielano na trzy pule zawierające różne geny wzorcowe master VH. [0272] Te pule pojedynczo poddano albo a) panningowi w fazie stałej, w którym antygeny (ludzką i mysią sklerostynę) bezpośrednio powlekano na 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych Maxisorp (Nunc, Wiesbaden, Niemcy) lub b) panningowi w semi-roztworze z wychwytywaniem, w którym antygen (biotynylowaną sklerostynę), odpowiednio kompleks fag-antygen, wychwytywano na klarownych paskach N/A albo c) panningowi w roztworze z biotynylowaną sklerostyną, w którym kompleks fagantygen wychwytywano za pomocą kulek magnetycznych ze strepatywidyną (Dynabeads M-280; Dynal) dla każdej puli. Panning w fazie stałej na sklerostynie [0273] W przypadku pierwszej rundy panningu na sklerostynie, dołki płytki Maxisorp powlekano przez noc 300 µl (5 µg/ml) ludzkiej sklerostyny (wytworzonej w komórkach HEK) rozcieńczonej w PBS. Po dwóch etapach przemywania 400 µl PBS, dołki inkubowano z buforem do blokowania zawierającym 5% mleka w proszku rozcieńczonego w PBS. [0274] Przed selekcją, fagi HuCAL GOLD wstępnie adsorbowano w buforze do blokowania (5% mleko w proszku/pbs, 0,5% Tween ) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w celu uniknięcia nieswoistej selekcji przeciwciał. [0275] Po przemyciu (2x 400 µl PBS) powleczonej i zablokowanej płytki Maxisorp, 300 µl wstępnie zaadsorbowanych fagów dodawano do powleczonych dołków i inkubowano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej delikatnie wstrząsając. Po tej inkubacji przeprowadzano cykli przemywania PBS i PBS/0,05% Tween w temperaturze pokojowej. Związane fagi wymywano dodając 300 µl mm DTT w mm Tris/HCl ph 8,0 na dołek przez minut w temperaturze pokojowej. Eluat usuwano i dodawano do ml komórek TG1F + E. coli hodowanych do OD 600nm, w zakresie 0,6-0,8. Po zakażeniu fagami E. coli pozostawiano na 45 minut w temperaturze 37 C bez

81 wytrząsania. Po wirowaniu przez 5 minut przy 41xg, pelety bakteryjne zawieszano ponownie w 600 µl 2xYT pożywki każdy, umieszczano na płytkach agarowych LB-CG i inkubowano przez noc w temperaturze 30 C. Kolonie następnie zeskrobywano z płytek i odzyskiwano oraz amplifikowano fagi. [0276] Drugą i trzecią rundę selekcji przeprowadzano w identyczny sposób jak pierwszą rundę selekcji z tą tylko różnicą, że warunki przemywania po związaniu faga były ostrzejsze. W drugiej rundzie selekcji dla niektórych warunków panningu mysią sklerostynę stosowano jako antygen w celu wzbogacenia mysich reagujących krzyżowo przeciwciał. W niektórych warunkach panningu, powlekano inną serię ludzkiej rekombinowanej sklerostyny (wytworzonej w E.coli). Panning w semi-roztworze na sklerostynie [0277] W przypadku tego panningu stosowano dwie różne metody: procedurę panningu w semi-roztworze z wychwytywaniem i standardowy panning w semi-roztworze. [0278] Szczegółowo, w przypadku panningu w semi-roztworze z wychwytywaniem na biotynylowanej sklerostynie, 0 µl antygenu powlekano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej na klarownych paskach z NeutrAvidin (N/A) (z firmy Pierce, poziom aktywacji 0 µl, zdolność wiązania pmol na dołek). Paski N/A blokowano przez noc w temperaturze 4 C za pomocą 0 µl Chemiblock i przemywano dwukrotnie PBS. [0279] Zablokowany roztwór fagów (Chemiblock/0,05% Tween ) dodawano do zablokowanych dołków N/A przez 30 minut i ten etap powtarzano prze kolejne 30 minut w celu usunięcia substancji wiążących NeutrAvidin. Następnie wstępnie sklarowane fagi przenoszono na biotynylowaną sklerostynę unieruchomioną (immobilizowaną) na klarownych paskach N/A, uszczelniano folią i inkubowano przez noc w temperaturze pokojowej wytrząsając. [0280] Następnego dnia roztwór fagów usuwano z dołków powleczonych antygenem i dołki przemywano. [0281] W przypadku standardowego panningu w semi-roztworze zablokowane (Chemiblock/0,05% Tween ), wstępnie sklarowane fagi dodawano do nowej wstępnie zablokowanej probówki na 1,5 ml (Chemiblock/0,05% Tween ) i następnie biotynylowaną ludzką sklerostynę dodawano do końcowego stężenia 0 nm i inkubowano przez noc w temperaturze pokojowej wytrząsając. [0282] Następnego dnia roztwór fag-antygen z 1,5- ml probówki dodawano do nowych zablokowanych dołków z paskami NeutrAvidin i pozostawiano do wiązania na 30 minut w temperaturze pokojowej i następnie przemywano.

82 [0283] W przypadku obu procedur panningu, związane fagi wymywano po przemyciu dodając 300 µl mm DTT w mm Tris/HCl ph 8,0 na dołek przez minut w temperaturze pokojowej. Eluat usuwano i dodawano do ml komórek TG1E. coli hodowanych do OD 600nm 0,6-0,8. Po zakażeniu fagami E. coli pozostawiano na 45 minut w temperaturze 37 C bez wytrząsania. Po wirowaniu przez 5 minut przy 41xg, pelety bakteryjne zawieszano ponownie w 600 µl 2xYT pożywki każdy, umieszczano na płytkach agarowych LB-CG i inkubowano przez noc w temperaturze 30 C. Kolonie następnie zeskrobywano z płytek i odzyskiwano oraz amplifikowano fagi. [0284] Drugą i trzecią rundę selekcji przeprowadzano w identyczny sposób jak pierwszą rundę selekcji z tą tylko różnicą, że warunki przemywania po związaniu faga były ostrzejsze. Panning w roztworze na sklerostynie [0285] W przypadku tego typu panningu 0 µl kulek magnetycznych ze streptawidyną (Dynabeads M-280; Dynal) przemywano jednokrotnie PBS i blokowano odczynnikiem Chemiblock przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. 500 µl fagów blokowano odczynnikiem Chemiblock przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z wirowaniem. Zablokowane fagi dwukrotnie pre-adsorbowano na 50 µl zablokowanych kulek magnetycznych ze strepatwidyną przez 30 minut. Supernatant fagów przenoszono do nowych zablokowanych 2-ml probówek i dodawano różne stężenia ludzkiej biotynylowanej sklerostyny (zob. tabele 5, 6 i 7) i inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z wirowaniem. 0 µl zablokowanych kulek magnetycznych ze strepatwidyną dodawano do każdej puli panningu i inkubowano przez minut na wirówce. Kulki zbierano za pomocą separatora cząstek (Dynal MPC-E) w ciągu około 2,5 minuty i roztwór ostrożnie usuwano. [0286] Po cyklach przemywania (tabela 2), związane fagi wymywano dodając 300 µl mm DTT w mm Tris/HCl ph 8,0 na dołek przez minut w temperaturze pokojowej. Eluat usuwano i dodawano do ml komórek TG1 F + E. coli hodowanych do OD 600nm 0,6-0,8. Po zakażeniu fagami E. coli pozostawiano na 45 minut w temperaturze 37 C bez wytrząsania. Po wirowaniu przez 5 minut przy 41xg, pelety bakteryjne zawieszano ponownie w 600 µl 2xYT pożywki każdy, umieszczano na płytkach agarowych LB-CG i inkubowano przez noc w temperaturze 30 C. Kolonie następnie zeskrobywano z płytek i odzyskiwano oraz amplifikowano fagi. [0287] Drugą i trzecią rundę selekcji przeprowadzano w identyczny sposób jak pierwszą rundę selekcji z tą tylko różnicą, że warunki przemywania po związaniu faga

83 były ostrzejsze. W drugiej i trzeciej rundzie selekcji dla niektórych warunków panningu stężenie antygenu było zmniejszone. Subklonowanie i ekspresja wybranych fragmentów Fab Mikroekspresja wyselekcjonowanych fragmentów Fab [0288] W celu ułatwienia szybkiej ekspresji rozpuszczalnych Fab, inserty kodujące Fab wyselekcjonowanych fagów HuCAL GOLD subklonowano poprzez Xbal i EcoRI z odpowiedniego wektora do prezentacji do wektora ekspresyjnego E. coli pmorph X9_MH (Rauchenberger i wsp., 03). Po transformacji plazmidów ekspresyjnych do komórek TG1 F - E. coli pojedyncze klony oporne na chloramfenikol pobierano do dołków sterylnej 96-dołkowej płytki mikrotitracyjnej wstępnie napełnionej 0 µl 2xYT-CG pożywki i hodowano przez noc w temperaturze 37 C. 5 µl każdej hodowli TG-1 E. coli przenoszono do świeżej, sterylnej 96-dołkowej płytki mikrotitracyjnej wstępnie napełnionej 0 µl 2xYT pożywki z dodatkiem 34 µg/ml chloramfenikolu i 0,1 % glukozy na dołek. Płytki mikrotitracyjne inkubowano w temperaturze 30 C z wytrząsaniem przy 400 obr./min na wytrząsarce do mikropłytek aż do niewielkiego zmętnienia hodowli (~2-4 godz.) z OD 600nm ~0,5. Do tych płytek ekspresyjnych, dodawano µl 2xYT pożywki z dodatkiem 34 µg/ml chloramfenikolu i 3 mm IPTG (izopropylo-β-d-tiogalaktopiranozyd) na dołek (końcowe stężenie: 0,5 mm IPTG), płytki mikrotitracyjne uszczelniano taśmą przenikalną dla gazów i inkubowano przez noc w temperaturze 30 C z wytrząsaniem przy 400 obr./min. [0289] Wytwarzanie lizatu całych komórek (ekstrakty BEL): Do każdego dołka płytek do ekspresji, dodawano 40 µl buforu BEL i inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 22 C na wytrząsarce do mikropłytek (400 obr./min). Ekspresja i oczyszczanie przeciwciał HuCAL -Fab w E. coli [0290] Ekspresję fragmentów Fab kodowanych przez pmorph X9_Fab_MH w komórkach TG1 F w E. coli w większej skali przeprowadzano w hodowlach z wytrząsanymi kolbami przy użyciu 750 ml 2x pożywki YT z dodatkiem 34 µg/ml chloramfenikolu. Hodowle wytrząsano w temperaturze 30 C aż wartość OD 600nm osiągnęła 0,5. Ekspresję Fab indukowano dodając 0,75 mm IPTG (izopropylo-ß-dtiogalaktopiranozyd) i hodując przez kolejne godzin w temperaturze 30 C. Komórki zbierano i rozrywano przy użyciu lizozymu i fragmenty Fab izolowano metodą chromatografii Ni-NTA. Pozorne masy cząsteczkowe wyznaczano metodą chromatografii wykluczania (SEC) z wzorcami kalibracyjnymi. Stężenia wyznaczano metodą spektrofotometrii UV (Krebs i wsp., 01). Przykład 2: Identyfikacja przeciwciał HuCAL swoistych dla sklerostyny

84 Test immunoenzymatyczny (ELISA) do detekcji Fab wiążących się ze sklerostyną na bezpośrednio powleczonej sklerostynie [0291] 384-dołkowe płytki Maxisorp (Nunc, Rochester, NY, USA) pokrywano µl 2,5 µg/ml antygenu (ludzka sklerostyna - wytworzona w komórkach HEK, ludzka sklerostyna -wytworzona w komórkach E.coli i mysia sklerostyna) w PBS, ph 7,4 przez noc w temperaturze 4 C. [0292] Płytki blokowano za pomocą PBS/0,05% Tween (PBST) z 5% mlekiem w proszku przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po przemyciu dołków za pomocą PBST, do dołków dodawano ekstrakt BEL, oczyszczone HuCAL GOLD lub kontrolne Fab rozcieńczone w PBS i inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Do detekcji pierwszorzędowego przeciwciała, stosowano następujące przeciwciała drugorzędowe: fragment AffiniPure F(ab )2 sprzężony z fosfatazą alkaliczną (AP), kozie anty-ludzkie, anty-mysie IgG (Jackson ImmunoResearch). Do detekcji koniugatów AP stosowano fluorogeniczne substraty AttoPhos (Roche) zgodnie z instrukcją producenta. Pomiędzy wszystkimi etapami inkubacji, dołki płytki mikrotitracyjnej przemywano PBST trzykrotnie i pięciokrotnie po końcowej inkubacji z drugorzędowym przeciwciałem. Fluorescencję mierzono za pomocą czytnika płytek TECAN Spectrafluor. Skrining z wychwytem z użyciem biotynylowanej sklerostyny [0293] Ten rodzaj testu ELISA stosowano do skriningu Fab HuCAL GOLD po przeprowadzeniu panningu w roztworze. [0294] 384-dołkowe płytki Maxisorp (Nunc, Rochester, NY, USA) pokrywano µl 5 µg/ml owczej anty-ludzkiej IgG, swoistej dla fragmentu Fd (The Binding Site, Birmingham, UK), rozcieńczonej w PBS, ph 7,4. [0295] Po blokowaniu za pomocą 3% BSA w TBS, 0,05% Tween przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, dodawano periplazmatyczne ekstrakty lub oczyszczone Fab HuCAL GOLD i inkubowano 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po 5-krotnym przemyciu płytek za pomocą PBST, do dołków dodawano µl biotynylowanej sklerostyny do swoistego wiązania lub biotynylowanej transferyny do nieswoistego wiązania. [0296] Następnie biotynylowany antygen sklerostynę pozostawiano do wiązania z wychwyconymi fragmentami HuCAL -Fab i po przemyciu inkubowano ze streptawidyną (Zymex) sprzężoną z fosfatazą alkaliczną. Do detekcji koniugatu AP-streptawidyna stosowano fluorogeniczne substraty, takie jak AttoPhos (Roche), zgodnie z instrukcją producenta (Roche Diagnostics, Mannheim, Niemcy). Emisję fluorescencyjną przy 535 nm rejestrowano ze wzbudzeniem przy 430 nm.

85 Wyniki: [0297] Po panningach wzbogacone pule fagów subklonowano z wektora z biblioteki pmorph 23 (umożliwiając skuteczną prezentacje na powierzchni faga) do wektora ekspresyjnego pmorph X9_Fab_MH, który pośredniczy w periplazmatycznej ekspresji rozpuszczalnych Fab. Zbierano pojedyncze klony i rozpuszczalne Fab poddawano ekspresji z tych pojedynczych klonów. W sumie, ~4600 klonów analizowano w pierwotnym skriningu, który przeprowadzano poprzez wiązanie Fab bezpośrednio z lizatów bakteryjnych z ludzką i mysią sklerostyną unieruchomioną (immobilizowaną) na płytkach mikrotitracyjnych Maxisorp lub poprzez wychwytywanie Fab poprzez przeciwciało anty-fd na płytkach mikrotitracyjnych maxisorp z dalszym wiązaniem biotynylowanej ludzkiej sklerostyny. Detekcję przeprowadzano w teście ELISA po znakowaniu za pomocą znakowanego fosfatazą alkaliczną przeciwciała przeciw ludzkiemu (Fab) 2 lub przy użyciu koniugatu streptawidyny z fosfatazą alkaliczną. [0298] Cząsteczki spełniające kryterium uzyskane z pierwotnego skriningu na rekombinowanej sklerostynie z sygnałami >5-krtonie większymi od tła analizowano dalej pod kątem wiązania z ludzką HEK i sklerostyną z E. coli i z mysią sklerostyną bezpośrednio powleczoną lub w roztworze przy użyciu biotynylowanej sklerostyny. Cząsteczki spełniające kryterium rozpoznające wszystkie pochodne sklerostyny wyselekcjonowano i sekwencjonowano. Charakterystyka Fab HuCAL GOLD Określanie powinowactwa przy użyciu testu Biacore [0299] W celu dalszego scharakteryzowania przeciwciał przeciw sklerostynie, wyznaczano powinowactwo do sklerostyny ludzkiej, sklerostyny mysiej i sklerostyny makaka jawajskiego. Rekombinowane białko sklerostyny unieruchamiano (immobilizowano) na chipie CM5 Biacore i fragmenty Fab dodawano do fazy ruchomej w różnych stężeniach. W celu rzetelnego wyznaczenia jednowartościowego powinowactwa jedynie te serie Fab stosowano w pomiarach Biacore, dla których uzyskiwano 90% frakcji monomerycznej w pomiarach techniką jakościowej chromatografii wykluczania. [0300] W teście Biacore wyznaczano powinowactwa do rekombinowanej sklerostyny ludzkiej, sklerostyny mysiej i sklerostyny makaka jawajskiego. Powinowactwo mieściło się w zakresie od subnanomolarnego do ponad 500 nm wobec sklerostyny ludzkiej, do prawie 5000 nm wobec sklerostyny makaka jawajskiego i do 4500 nm wobec mysiej sklerostyny.

86 Przykład 3: Identyfikacja kandydatów Fab przeciw ludzkiej sklerostynie hamujących wiązanie sklerostyny z unieruchomionym (immobilizowanym) białkiem BMP-2 przy użyciu aparatu BioVeris [0301] Wszystkie wytworzone i oczyszczone Fab badano w teście siły hamowania wiązania na bazie BioVeris pod kątem ich zdolności do hamowania wiązania sklerostyny z rekombinowaną ludzką BMP-2. Przebadano dwa różne zestawy warunków o rożnej ostrości (0,1 % vs. 1 % Tween w układzie buforowym). 9 z 27 fragmentów Fab wykazywało zdolność do hamowania wiązania sklerostyny z unieruchomionym (immobilizowanym) białkiem BMP-2 w ostrych warunkach buforowania. Przykład 4: Odwracanie hamowanego przez sklerostynę wytwarzania ALP indukowanego przez BMP-2 w komórkach MC3T3. Konwersja do IgG macierzystych substancji wiążących i charakterystyka IgG [0302] 21 kandydatów przekształcano do ludzkiej IgG1 poprzez subklonowanie, odpowiednio, do wektora ekspresyjnego pmorph _h_igg1 i odpowiednich lekkołańcuchowych konstruktów serii wektorów pmorph _h_ig. Ekspresję przeprowadzano poprzez przejściową transfekcję komórek HEK293 lub HKB11 i pełnej długości immunoglobuliny oczyszczano z supernatantu hodowli komórkowej. Funkcjonalność IgG1po oczyszczeniu badano w teście ELISA wiązania z unieruchomioną (immobilizowaną) sklerostyną ludzką, sklerostyną mysią i sklerostyną makaka jawajskiego. IgG w podstawowym teście biologicznym [0303] Miana wszystkich oczyszczonych higg wyznaczano i cząsteczki te badano w teście ALP. Test był rzetelny w odniesieniu do hamowania BMP-2 przez sklerostynę, ale wyselekcjonowane związki-kandydaci nie powinny hamować sklerostyny we wszystkich eksperymentach (zmienność aktywności między testami, zmienność między płytkami, wysoka zmienność dla trzech powtórzeń dołków). W związku z tym, możliwe było jedynie uszeregowanie aktywności (ranking) IgG. Przykład 5: Dojrzewanie powinowactwa wyselekcjonowanych Fab przeciw sklerostynie poprzez równoległą wymianę kaset LCDR3 i HCDR2 [0304] Wyniki badania IgG w teście ALP pozwoliły jedynie na ranking. Na podstawie tego rankingu, 4 Fab wyselekcjonowano ze względu na wysokie ryzyko dojrzewania powinowactwa. Wszystkie przeciwciała kandydujące wyselekcjonowano do optymalizacji jako pojedynczych wiodących kandydatów w LCDR3 i H-CDR2. [0305] W celu zwiększenia powinowactwa i aktywności biologicznej czterech wyselekcjonowanych fragmentów przeciwciał, regiony LCDR3 i HCDR2 optymalizowano

87 równolegle poprzez mutagenezę kasetową przy użyciu mutagenezy ukierunkowanej (Virnekas i wsp., 1994), przy czym regiony zrębowe pozostawały niezmienione. Przed klonowaniem bibliotek dojrzewania, wszystkie macierzyste fragmenty Fab przenoszono z wektora ekspresyjnego pmorph x9_mh do wektora dojrzewania pmorph 25 CysDisplay poprzez miejsca restrykcyjne XbaI/EcoRI. Wektor ten dostarcza białka fagowego piii połączonego przez N-koniec z resztą cysteiny, a także C-końcowej cysteiny połączonej z łańcuchem przeciwciała Fd, a zatem umożliwia prezentację połączenia wiązaniami disiarczkowymi odpowiednich fragmentów Fab na powierzchni faga. [0306] W celu wytworzenia bibliotek HCDR2, region HCDR2 każdego macierzystego Fab wycinano i zastępowano 590 bp wypełniaczem. Ten wypełniacz DNA ułatwia oddzielnie pojedynczo trawionych od podwójnie trawionych pasm wektora i zmniejsza tło macierzystych Fab o wysokim powinowactwie podczas panningu dojrzewania. W kolejnym etapie, wypełniacz wycinano z plazmidów kodujących Fab każdego macierzystego klonu i zastępowano kasetą dojrzewania HCDR2 o wysokim zróżnicowaniu. [0307] Równolegle, region LCDR3 czterech z pięciu macierzystych klonów zastępowano zróżnicowaną kasetą dojrzewania LCDR3 bez pośredniego wklonowywania wypełniacza. [0308] Biblioteki dojrzewania miały rozmiar w zakresie od 1x 7 do 4x 8 klonów z tłem klonowania poniżej 1%, a kontrola jakości poprzez sekwencjonowanie wykazała dobrą jakość każdej biblioteki. Jedynie biblioteka LCDR3 macierzystego klonu MOR045 miała mały rozmiar (< 6 ) i zawierała wiele nieprawidłowych klonów i w związku z tym nie włączano jej do panningu dojrzewania. [0309] Dla każdej biblioteki dojrzewania LCDR3 i HCDR2, otrzymano fagi prezentujące przeciwciała i miana fagów oznaczano poprzez miareczkowanie punktowe. Strategie panningu dla dojrzewania powinowactwa [03] Fagi prezentujące przeciwciała z następujących bibliotek dojrzewania poddawano oddzielnym procedurom panningu i skriningu: Wiodące 1: MOR04518 (dojrzewanie L-CDR3) Wiodące 1: MOR04518 (dojrzewanie H-CDR2) Wiodące 2: MOR045 (dojrzewanie H-CDR2) Wiodące 3: MOR04532 (dojrzewanie L-CDR3) Wiodące 3: MOR04532 (dojrzewanie H-CDR2) Wiodące 4: MOR04799 (dojrzewanie L-CDR3) Wiodące 4: MOR04799 (dojrzewanie H-CDR2)

88 [0311] Dla każdej wiodącej biblioteki przeprowadzano trzy różne procedury panningu. Dla każdej strategii panningu stosowano warunki o różnym stopniu restrykcyjności (ostrości). W celu zwiększenia ostrości panningu i selekcji pod względem poprawionych szybkości dysocjacji, przeprowadzano intensywne przemywanie i testy kompetycyjne z oczyszczonym macierzystym Fab lub z rozpuszczalną rekombinowaną sklerostyną. Po przeprowadzeniu panningu dojrzewania wzbogacone pule fagemidów subklonowano do wektora ekspresyjnego pmorph x9_mh. Pobierano około 2900 pojedynczych klonów i Fab poddawano ekspresji poprzez indukcję IPTG. Ranking powinowactwa BioVerisTM i skrining pod kątem poprawionego powinowactwa [0312] W celu identyfikacji fragmentów Fab swoistych dla sklerostyny o poprawionym powinowactwie, lizaty bakteryjne ~2900 pojedynczych klonów rozcieńczano i sprawdzano pod kątem wiązania Fab z biotynylowaną ludzką sklerostyną unieruchomioną (immobilizowaną) na kulkach powleczonych streptawidyną. Wiązanie analizowano za pomocą systemu BioVeris Workstation. Klony dające największe sygnały wskazywały na poprawione powinowactwo i wybrano je do dalszej analizy metodą miareczkowania roztworu równowagowego. [0313] W tym celu, wyselekcjonowano176 pojedynczych klonów i wstępne powinowactwo wyznaczano za pomocą 4-punktowego miareczkowania roztworu równowagowego (SET) w systemie BioVeris. Z tych danych, wyselekcjonowano 24 klony wykazujące największe powinowactwo. Fragmenty Fab oczyszczano w skali mg. [0314] Końcowe powinowactwo wyznaczono stosując 8-punktowy pomiar SET i sklerostynę ludzką, sklerostynę mysią lub sklerostynę makaka jawajskiego. Optymalizowane Fab w podstawowych testach biologicznych [03] Optymalizowane Fab badano w teście komórkowym ALPy. Większość z nich była nieaktywnych; dla niektórych Fab zaobserwowano zmienne odwracanie hamowania sklerostyny. W związku z tym selekcję klonów przekształcano na format z ludzko-mysim IgG2a i badano w tym samym teście. Jednak klony badane w formacie ludzko-mysiego IgG2a również nie były w pełni zdolne do odwracania hamowania sklerostyny i nie można było osiągnąć pożądanego kryterium EC 50 (< nm). Dla najlepszego dojrzałego kandydata MOR05177 (VL dojrzewany z macierzystego MOR04518) przy 50 nm Fab lub przy nm ludzko-mysiego IgG2a uzyskano 75-85% przywracanie sygnału ALP. Przykład 6: Identyfikacja przeciwciał przeciw sklerostynie z macierzystych i optymalizowanych Fab i IgG w nowych podstawowych testach biologicznych

89 [0316] Nowe funkcjonalne testy biologiczne opracowano na podstawie nowych publikacji (Wu i wsp. JBC 05, He i wsp. JBC 05, Bezooyen i wsp. ASBMR 05, Winkler i wsp. JBC 05), które wykazują, że sklerostyna wpływa na sygnalizację Wnt bezpośrednio lub pośrednio. [0317] Test ten bazuje na powinowactwie sklerostyny do hamowania aktywacji STF, w której pośredniczy Wnt-1 w komórkach HEK293. [0318] W teście tym wszystkie Fab zidentyfikowano w początkowym skriningu i wszystkie zidentyfikowane Fab badano stosując procedurę dojrzewania powinowactwa. Stało się oczywiste, że zwiększone powinowactwo dojrzałych Fab miało swoje odzwierciedlenie w zwiększonej sile działania i skuteczności w teście wnt-1. [0319] Po przebadaniu wszystkich macierzystych Fab, zidentyfikowano dwa kolejne przeciwciała jako obiecujące macierze do dodatkowego dojrzewania powinowactwa. Figura 1 przedstawia aktywność MOR05813_IgG2lambda, jednego z najsilniejszych przeciwciał zidentyfikowanych w teście wnt-1. Przykład 7: Charakterystyka macierzystych Fab i Fab poddanych procedurze dojrzewania powinowactwa w innych testach biologicznych Aktywność macierzystych Fab i Fab poddanych procedurze dojrzewania powinowactwa w teście mineralizacji [03] Test mineralizacji opiera się na zdolności komórek MC3T3 do tworzenia zmineralizowanej matrycy, wskazującej na ich zdolność do różnicowania osteogenicznego. Silną mineralizację (> 1 mg wapnia osadzonego na dołek (format 96-dołkowy)) zmierzono po 14 dniach przy wszystkich badanych stężeniach BMP-2. Dodatek wzrastających stężeń sklerostyny wywołał zależne od dawki hamowanie mineralizacji indukowanej przez BMP- 2 (2,1 nm) (IC 50 : 1 nm) (danych nie pokazano). [0321] Figura 2 przedstawia przykład mineralizacji w obecności MOR05813_Fab. Przeciwciało może przywracać mineralizację indukowaną przez BMP do maksimum 80% początkowej odpowiedzi, podczas gdy Fab przeciw lizozymowi stosowane jako kontrola negatywna nie miało wpływu. 30 Aktywność macierzystych Fab i Fab poddanych procedurze dojrzewania powinowactwa w teście ELISA z LPR6 i sklerostyną [0322] Test ELISA z LPR6 i sklerostyną bazuje na zdolności sklerostyny do wiązania się z LRP6. W celu dalszej charakterystyki otrzymanych Fab, w teście tym przeprowadzano selekcję Fab i IgG. W obecności przeciwciała przeciw sklerostynie z

90 R&D (00 ng/ml =~7 nm), wiązanie sklerostyny (0,9 nm) z LRP6 było hamowane o 68% w porównaniu z kontrolą (danych nie pokazano). [0323] MOR05813_IgG2 lambda hamowało wiązanie sklerostyny z LRP6 do 90% przy 90 nm, podczas gdy IgG przeciw lizozymowi stosowane jako kontrola negatywna nie miało wpływu na wiązanie sklerostyny z LRP6 (figura 3). Aktywność macierzystych Fab i Fab poddanych procedurze dojrzewania powinowactwa w teście z fosfo-smad 1 [0324] Test z fosfo-smad1 (Western) bazuje na zdolności BMP-6 do indukcji fosforylacji Smad1 w ciągu minut w komórkach MC3T3-E1. MOR05318_IgG2 lambda hamowało działanie sklerostyny na indukowaną przez BMP-6fosforylację Smad1 z EC 50 1 nm i ponownie powodowało nasycenie fosforylacji Smad1 do maksimum 66% fosforylacji indukowanej przez BMP-6. Kontrola negatywna, IgG przeciw lizozymowi (IgG C), nie miała wpływu (figura 4). Przykład 8: Wpływ LRP4, nowego partnera oddziałującego z SOST, na aktywność przeciwciała anty-sost [0325] Za wyjątkiem sirna LRP4, wyciszanie mrna LRP4 nie wpływało na aktywność STF w nieobecności SOST. Jednakże, nie zmniejszało to zdolności SOST do hamowania aktywności STF, między i 30%. Takie wyniki obserwowano dla wszystkich pięciu sirna badanych pojedynczo (figura 5A) lub w różnych kombinacjach (danych nie pokazano). Nadekspresja LRP4 powodowała zmniejszenie IC 50 SOST, odpowiednio 5 i 16-krotnie w teście HEK i c28a2 supertopflash, (figura 5B i C). Ten efekt był wyjątkowy pod tym względem, że nadekspresja LRP4 nie miała wpływu na IC 50 dla DKK1 - Wyciszenie LRP4 (sirna) powodowało zmniejszenie działania hamującego SOST w STF indukowanym przez Wnt-1, podczas gdy nie powodowało zmniejszenia działania hamującego DKK1 (figura 5D). Z kolei, LRP4 osłabiało działanie przeciwciała anty-sost poprzez zwiększanie EC 50 MOR05813_IgG2a z 17,2 nm do 30 nm (figura 5E). Dane te sugerują, że LRP4 jest środkiem ułatwiającym działanie SOST. Przykład 9: Nowe dojrzewanie [0326] W celu zwiększenia powinowactwa i biologicznej aktywności dwóch nowo wyselekcjonowanych fragmentów przeciwciała na podstawie wyników otrzymanych z testów biologicznych, regiony LCDR3 i HCDR2 optymalizowano równolegle poprzez mutagenezę kasetową przy użyciu mutagenezy ukierunkowanej (Virnekas i wsp., 1994), przy czym regiony zrębowe pozostawały niezmienione. Przed klonowaniem bibliotek dojrzewania, wszystkie macierzyste fragmenty Fab przenoszono z wektora ekspresyjnego pmorph X9_MH do wektora dojrzewania pmorph 25 CysDisplay poprzez

91 miejsca restrykcyjne XbaI/EcoRI. Wektor ten dostarcza białka fagowego piii połączonego poprzez N-koniec z resztą cysteiny, a także C-końcowej cysteiny połączonej z łańcuchem przeciwciała Fd, a zatem umożliwia prezentację połączenia wiązaniami disiarczkowymi odpowiednich fragmentów Fab na powierzchni faga. [0327] W celu wytworzenia bibliotek HCDR2, region HCDR2 każdego macierzystego Fab wycinano i zastępowano 590 bp wypełniaczem. Ten wypełniacz DNA ułatwia oddzielanie pojedynczo trawionych od podwójnie trawionych pasm wektora i zmniejsza tło macierzystych Fab o wysokim powinowactwie podczas panningu dojrzewania. W kolejnym etapie, wypełniacze wycinano z plazmidów kodujących Fab każdego macierzystego klonu i zastępowano kasetą dojrzewania HCDR2 o wysokim zróżnicowaniu. [0328] Równolegle, region LCDR3 czterech z pięciu macierzystych klonów zastępowano zróżnicowaną kaseta dojrzewania LCDR3 bez pośredniego wklonowywania wypełniacza. [0329] Biblioteki dojrzewania miały rozmiar w zakresie od 1x 7 do 4x 8 klonów z tłem klonowania poniżej 1%, a kontrola jakości poprzez sekwencjonowanie wykazała dobrą jakość każdej biblioteki. Dla każdej biblioteki dojrzewania LCDR3 i HCDR2, otrzymano fagi prezentujące przeciwciała i miana fagów oznaczano poprzez miareczkowanie punktowe. Strategie panningu dla dojrzewania powinowactwa [0330] Fagi prezentujące przeciwciała z następujących bibliotek dojrzewania poddawano oddzielnym procedurom panningu i skriningu: Wiodące 1: MOR04525 (dojrzewanie L-CDR3) Wiodące 1: MOR04525 (dojrzewanie H-CDR2) Wiodące 2: MOR04529 (dojrzewanie L-CDR3) Wiodące 2: MOR04529 (dojrzewanie H-CDR2) [0311] Dla każdej wiodącej biblioteki przeprowadzano trzy rożne procedury panningu. Dla każdej strategii panningu stosowano warunki o różnym stopniu restrykcyjności (ostrości). W celu zwiększenia ostrości panningu i sekcji pod względem poprawionych szybkości dysocjacji, przeprowadzano intensywne przemywanie i testy kompetycyjne z oczyszczoną rozpuszczalną rekombinowaną sklerostyną podczas wydłużonych okresów inkubacji i przemywania. [0332] Po przeprowadzeniu panningu wzbogacone pule fagemidów subklonowano do wektora ekspresyjnego pmorph x9_mh. Pobierano około 1600 pojedynczych klonów i Fab poddawano ekspresji poprzez indukcję IPTG.

92 [0333] Kryterium powinowactwa < 0 pm dla ludzkiej sklerostyny było spełnione dla wszystkich pochodnych obu macierzystych Fab. Kryterium dla reaktywności krzyżowej ze sklerostyną makaka jawajskiego i z mysią sklerostyną < 500 pm było spełnione dla wszystkich pochodnych obu macierzystych Fab. MOR04525dało więcej klonów o wyższym powinowactwie do wszystkich trzech gatunków. Przykład : Charakterystyka przeciwciał przeciw sklerostynie w badaniach in vivo [0334] Ośmiomiesięcznym samicom myszy OF1/IC (n=16/grupę, Charles River, Francja) podawano dwa razy w tygodniu dożylnie przeciwciało przeciw sklerostynie MOR05813 (24,5 mg/kg, mlgg2a) lub izotyp przeciwciała kontrolnego (anty-pcmlgg2a). Grupy kontrolne otrzymywały codziennie podskórnie 0 mikrog/kg PTH(1-34) lub podłoże (PBS + 0,1% BSA). Leczenie trwało 2,5 tygodnia w przypadku wszystkich zwierząt. Połowę zwierząt (n = 8/grupę) uśmiercano w tym punkcie czasowym w celu przeprowadzenia analizy histomorfometrycznej. Zwierzętom tym podawano markery fluorochromowe i 3 dni przed nekropsją w celu oceny histomorfometrycznej dynamiki kościotworzenia. U pozostałych zwierząt leczenie kontynuowano (n= 8/grupę) przez okres do 5 tygodni. [0335] Zwierzęta monitorowano pod kątem masy, gęstości i geometrii kości. Obwodowa ilościowa tomografia komputerowa [pqct] wykazała in vivo, że MOR05177 ma silny wpływ anaboliczny na proksymalną kość piszczelową starych myszy zwiększając zawartość minerałów w kościach (figura 6) i gęstość mineralną (figura 7). Wpływ anaboliczny na układ kostny odnotowano zarówno w warstwie korowej (figura 8), jak i gąbczastej (figura 9). Dane te sugerują, że obserwowany efekt hamujący wykazywany przez MOR05813 w stosunku do działania na sklerostynę w teście reporterowym sygnalizacji Wnt w nieosteoblastycznych komórkach przekłada się na indukcję kościotworzenia z powodu hamowania sklerostyny in vivo. Wielkość odpowiedzi anabolicznej kości była porównywalna z anabolizmem kości wywoływanym przed duże dawki hpth(1-34). [0336] Analiza MicroCT wykazała wzrost objętości kości beleczkowej (figura 9), co można powiązać głownie z zagęszczeniem struktury kości beleczkowej zgodnie z anabolizmem kości (figura ). [0337] Gęstość mineralna kości wzrosła ponadto u zwierząt, które leczono do 5 tygodni (figura 11). Gęstość mineralna kości oceniania techniką DEXA ex vivo wzrosła w szkielecie obwodowym (kość piszczelowa, kość udowa) i osiowym (kręgi lędźwiowe)

93 (figury 12-14). Wpływ był porównywalny do mierzonego w grupie stanowiącej kontrolę pozytywną, leczonej dzienną dawką 0 mikrog/kg hpth(1-34). [0338] Analizy na bazie histomorfometrycznego markera fluorochromowego dynamiki kościotworzenia wykazały, że przyrost masy kostnej był spowodowany zasadniczym wzrostem szybkości kościotworzenia w szkielecie obwodowym (figura ) i osiowym (figura 18). Efekty były porównywalne z tymi uzyskiwanymi dla wyższej dawki PTH(1-34). Wzrost szybkości kościotworzenia był spowodowany wzrostem szybkości odkładania minerałów (figura 16) i powierzchni mineralizacji (figura 17). Resorpcja kości nie wzrastała w wyniku leczenia, według wyników pomiarów powierzchni osteoklastów (figura 19). Przykład 11: Skrining przeciwciał, które blokują krzyżowo przeciwciała wiążące sklerostynę według niniejszego wynalazku Test blokowania krzyżowego Biacore [0339] Poniżej opisano ogólnie test Biacore do określania, czy przeciwciało lub inny środek wiążący blokuje krzyżowo lub jest zdolne do blokowania krzyżowego przeciwciała według wynalazku. Powinno być oczywiste, że w teście można stosować dowolne środki wiążące sklerostynę opisane w niniejszym dokumencie. [0340] Aparat Biacore (na przykład BIAcore 3000) można stosować zgodnie z zaleceniami producenta. [0341] Sklerostyna może być sprzęgana, na przykład, z chipem CM5 Biacore drogą rutynowo stosowanej reakcji chemicznej sprzęgania prowadzącej do wiązania amidowego, na przykład reakcji sprzęgania amin EDC-NHS, z otrzymaniem powierzchni powleczonej sklerostyną. W celu uzyskania mierzalnego poziomu wiązania, typowo jednostek rezonansowych sklerostyny można połączyć z chipem (ilość ta daje mierzalne poziomy wiązania i jednocześnie łatwo wysycalne przez stężenia stosowanego odczynnika testowego). [0342] Alternatywnym sposobem przyłączania sklerostyny do chipa BIAcore jest użycie znakowanej wersji sklerostyny, na przykład, na N-końcu lub C-końcu histydyną His. W tym formacie, przeciwciało anty-his można połączyć z chipem Biacore i następnie His-znakowaną sklerostynę można przepuszczać nad powierzchnią chipa i wychwytywać za pomocą przeciwciała anty-his. [0343] Dwa przeciwciała przeznaczone do oceny pod kątem ich zdolności do blokowania krzyżowego miesza się w ilości stechiometrycznej, na przykład w stosunku molowym jeden do jednego miejsc wiążących w odpowiednim buforze w celu wytworzenia mieszaniny testowej. Stosowany bufor to typowo bufor, który typowo stosuje

94 się w chemii białek, taki jak, na przykład, PBS (136 mm NaCl, 2,7 mm KCI, mm Na 2 HPO 4, 1,76 mm KH 2 PO 4, ph 7,4). Podczas obliczania stężenia w oparciu o miejsca wiązania, zakłada się, że masa cząsteczkowa przeciwciała odpowiada masie cząsteczkowej przeciwciała podzielonej przez liczbę docelowych (na przykład dla sklerostyny) miejsc wiążących na tym przeciwciele. [0344] Stężenie każdego przeciwciała w mieszaninie testowej powinno być na tyle wysokie, aby zapewnić wysycenie miejsc wiążących dla tego przeciwciała na cząsteczkach sklerostyny, które są związane na chipie Biacore. Przeciwciała w mieszaninie występują odpowiednio w tym samym stężeniu molowym (na podstawie miejsc wiążących), i to stężenie będzie typowo mieściło się w zakresie od 1,0 mm do1,5 mm (w oparciu o miejsca wiążące) [0345] Sporządza się także oddzielne roztwory zawierające oddzielne przeciwciała. Bufor stosowany do tych oddzielnych roztworów powinien być takim samym buforem i w takim samym stężeniu jak w mieszaninie testowej. [0346] Mieszaninę testową przepuszcza się nad chipem BIAcore powleczonym sklerostyną i rejestruje wiązanie. Związane przeciwciała następnie usuwa się traktując chip, na przykład, kwasem, takim jak 30 mm HCl przez około 1 minutę. Ważne jest, aby cząsteczki sklerostyny związane z chipem nie były uszkodzone. [0347] Roztwór samego pierwszego przeciwciała przepuszcza się nad powierzchnią powleczoną sklerostyną i rejestruje wiązanie. Następnie, chip traktuje się w celu usunięcia wszystkich związanych przeciwciał bez uszkadzania sklerostyny związanej z chipem, na przykład poprzez wymienione powyżej traktowanie kwasem. [0348] Roztwór samego drugiego przeciwciała przepuszcza się nad powierzchnią powleczoną sklerostyną i rejestruje wiązanie. [0349] Maksymalne teoretyczne wiązanie można określić jako sumę wiązania ze sklerostyną każdego przeciwciała oddzielnie. Wyniki można następnie porównać z faktycznym wiązaniem mieszaniny mierzonych przeciwciał. Jeśli faktyczne wiązanie jest słabsze niż wiązanie teoretyczne, dwa przeciwciała blokują się nawzajem krzyżowo Test Elisa blokowania krzyżowego [0350] Wiązanie krzyżowe przeciwciała przeciw sklerostynie lub innego środka wiążącego sklerostynę można również wyznaczać przy użyciu testu ELISA. [0351] Zasada ogólna testu ELISA obejmuje powlekanie przeciwciała przeciw sklerostynie na dołkach płytki ELISA. Następnie dodaje się w nadmiarze drugie, potencjalnie blokujące krzyżowo przeciwciało przeciw sklerostynie w roztworze (tj.

95 niezwiązane z płytką ELISA). Następnie dodaje się do dołków ograniczoną ilość sklerostyny. [0352] Przeciwciało powleczone na dołkach i przeciwciało w roztworze będą współzawodniczyły w wiązaniu ograniczonej liczby cząsteczek sklerostyny. Płytkę następnie przemywa się w celu usunięcia sklerostyny niezwiązanej z powleczonym przeciwciałem, a także w celu usunięcia drugiego przeciwciała w fazie roztworu, jak również wszelkich kompleksów wytworzonych między drugim przeciwciałem w fazie roztworu a sklerostyną. Ilość związanej sklerostyny następnie mierzy się przy użyciu odpowiedniego odczynnika do detekcji sklerostyny. Przeciwciało w roztworze, które jest zdolne do blokowania krzyżowego powleczonego przeciwciała będzie mogło zmniejszać liczbę cząsteczek sklerostyny, z którymi może wiązać się powleczone przeciwciało, w stosunku do liczby sklerostyny, z którymi może wiązać się powleczone przeciwciało w nieobecności drugiego przeciwciała w fazie roztworu. [0353] Ten test opisano bardziej szczegółowo poniżej dla dwóch przeciwciał określanych jako Ab-X i Ab-Y. W przypadku gdy Ab-X wybiera się jako unieruchomione (immobilizowane) przeciwciało, powleka się je na dołki płytki ELISA, po czym płytki blokuje się odpowiednim roztworem blokującym w celu minimalizacji nieswoistego wiązania dodawanych kolejno odczynników. Następnie do płytki ELISA dodaje się Ab-Y w nadmiarze tak, że liczba moli miejsc wiążących sklerostynę przeciwciała Ab-Y na dołek jest co najmniej -krotnie większa niż liczba moli miejsc wiążących sklerostynę przeciwciała Ab-X, na dołek, stosowanego do powlekania płytki ELISA. Następnie dodaje się sklerostynę tak, że liczba moli sklerostyny dodanej na dołek jest co najmniej 25-krtonie mniejsza niż liczba miejsc wiążących sklerostynę przeciwciała Ab-X stosowanego do powlekania każdego dołka. Po odpowiednim okresie inkubacji, płytkę ELISA przemywa się i dodaje odczynnik do detekcji sklerostyny w celu pomiaru ilości sklerostyny swoiście związanej przez powleczone przeciwciało przeciw sklerostynie (w tym przypadku Ab-X). Sygnał tła w teście określa się jako sygnał otrzymany w dołkach z powleczonym przeciwciałem (w tym przypadku Ab-X), drugim przeciwciałem w fazie roztworu (w tym przypadku Ab-Y), samym buforem sklerostyny (tj. bez sklerostyny) i odczynnikami do detekcji sklerostyny. Sygnał kontroli pozytywnej w teście określa się jako sygnał otrzymany w dołkach z powleczonym przeciwciałem (w tym przypadku Ab-X), samym buforem drugiego przeciwciała w fazie roztworu (tj. bez drugiego przeciwciała w fazie roztworu), sklerostyną i odczynnikami do detekcji sklerostyny. Test ELISA należy przeprowadzać w ten sposób, aby sygnał kontroli pozytywnej był co najmniej 6-krotnie większy od sygnału tła.

96 [0354] W celu uniknięcia artefaktów (na przykład istotnie różniącego się powinowactwa między Ab-X i Ab-Y wobec sklerostyny) wynikających z wyboru przeciwciała do zastosowania w charakterze przeciwciała powlekającego i przeciwciała do zastosowania jako drugie (kompetycyjne) przeciwciało, test blokowania krzyżowego powinien być przeprowadzany w dwóch formatach: 1) formacie 1, gdy Ab-X jest przeciwciałem powlekanym na płytkę ELISA i Ab-Y jest przeciwciałem kompetycyjnym znajdującym się w roztworze i 2) formacie 2, gdy Ab-Y jest przeciwciałem powlekanym na płytkę ELISA i Ab-X jest przeciwciałem kompetycyjnym znajdującym się w roztworze. Przykład 12: Test ELISA do wykrywania wpływu MOR05813_IgG2lambda na wiązanie SOST z LRP6 Test ELISA LRP6/sklerostyna [0355] 96-dołkowe nietraktowane płytki mikrotitracyjne pokrywano 0 µl/dołek LRP6/Fc (1 µg/ml, R&D Systems, nr kat. 05-LR) rozcieńczonym w PBS. Jako kontrolę dla nieswoistego wiązania (NSB), kilka dołków napełniano 0 µl/dołek PBS. Płytki przykrywano folią plastikową i inkubowano przez noc w temperaturze pokojowej. Po pokryciu, płytki przemywano 3-krotnie za pomocą 0 ml/dołek 0,05% Tween (Fluka, nr kat ) w PBS i dołki blokowano przez 1 godzinę w temperaturze 37 C dodając 300 ml/dołek buforu do blokowania SuperBlock (Pierce, nr kat ) w TBS. Po inkubacji, roztwór do blokowania usuwano i dodawano 0 ml/dołek sklerostyny (pochodzącej z E.coli, Novartis; 1-00 ng/ml) rozcieńczonej w 1% BSA w PBS. Płytki inkubowano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, po czym przemywano 3-krotnie za pomocą 0 ml/dołek 0,05% Tween w PBS. Następnie, dodawano 0 ml/dołek przeciwciała przeciw sklerostynie (1 mg/ml) rozcieńczonego w 1% BSA w PBS i płytki inkubowano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, po czym przemywano 3-krotnie za pomocą 0 ml/dołek 0,05% Tween w PBS. Na koniec, dodawano 0 ml/dołek przeciwciała Ab sprzężonego z ALP przeciw koziemu IgG (1: 5000; Sigma nr kat. A- 7888) rozcieńczonego w 1% BSA (Sigma nr kat.:a-7888) w PBS w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej i płytki następnie przemywano 3-krotnie za pomocą 0 ml/dołek 0,05% Tween w PBS. W celu oznaczenia ALP, do płytki dodawano 0 ml/dołek roztworu substratu ALP (Sigma, nr kat. S0942, 1 tabletka na 5 ml buforu na bazie dietanoloaminy 1x; Pierce, nr kat ) w ciągu 90 minut i gęstość optyczną mierzono przy 405 nm. Aktywność macierzystych Fab i Fab poddanych procedurze dojrzewania powinowactwa w teście ELISA z LPR6 i sklerostyną

97 [0356] Test ELISA LRP6/sklerostyna bazuje na zdolności sklerostyny do wiązania się z LRP6. W celu dalszej charakterystyki otrzymanych Fab, w teście tym przeprowadzano selekcję Fab i IgG. W obecności przeciwciała przeciw sklerostynie z R&D (00 ng/ml =~7 nm), wiązanie sklerostyny (0,9 nm) z LRP6 było hamowane o 68% w porównaniu z kontrolą (danych nie pokazano). MOR05813_IgG2 lambda hamowało wiązanie sklerostyny z LRP6 do 90% przy 90 nm, podczas gdy IgG przeciw lizozymowi stosowane jako kontrola negatywna nie miało wpływu na wiązanie sklerostyny z LRP6 (figura ). Przykład 13: Leczenie skojarzone przy użyciu MOR05813 MOR05813 i kwasu zoledronowego [0357] Ośmiomiesięcznym samicom myszy OF1/IC (n=/grupę, Charles River, Francja) wycinano jajniki w celu wywołania utraty masy kostnej poprzez pozbawienie estrogenu lub pozostawiano nienaruszone. Zwierzętom podawano dwa razy w tygodniu dożylnie przeciwciało przeciw sklerostynie MOR05813 (24 mg/kg, h/mlg G2a) lub przeciwciało kontrolne (anty-pc-h/mlgg2a, nienaruszone i grupy kontrolne OVX). Dodatkowe grupy otrzymywały albo pojedyncze podanie samego kwasu zoledronowego (0 µg/kg) lub w kombinacji z przeciwciałem przeciw sklerostynie MOR Leczenie przeciwciałem trwało 3,5 tygodnia (7 podań). [0358] Masę i geometrię kości piszczelowej zwierząt zmierzono przed wycięciem jajników techniką obwodowej ilościowej tomografii komputerowej (pqct). Zwierzęta były równomiernie przydzielone do grup pod względem masy ciała i całkowitej gęstości mineralnej kości piszczelowej. Zmiany gęstości mineralnej, masy i geometrii kości oceniano pod koniec okresu leczenia. [0359] Wyniki wyrażano jako średnią +/-SEM. Analizę statystyczną przeprowadzano przy użyciu RS1 (seria 1999 dla Windows, Domain Manufacturing Corp., Stany Zjednoczone). Dane poddawano jednokierunkowej analizie wariancji (ANOVA). Równość wariancji badano za pomocą testu F Levene a i różnice między grupami oceniano za pomocą testu Dunnetta z poprawką Bonferroniego. Leczone grupy badano pod kątem istotności różnic w stosunku do grupy OVX leczonej przeciwciałem kontrolnym (p<,05*, p<,01**). [0360] Utratę masy kostnej u starszych myszy spowodowaną wycięciem jajników można zablokować poprzez leczenie przeciwciałem (figura 21). Gdy przeciwciało stosuje się w kombinacji z pojedynczą iniekcją dożylną bisfosfonianu - kwasu zoledronowego, utrata masy kostnej jest zablokowana i przyrost masy kostnej jest indukowany na co wskazuje wzrost całkowitej zawartości minerałów w kościach (figura 21 A) i gęstości

98 mineralnej kości (figura 21 B), a także wzrost grubości warstwy korowej (figura 21 C) i gęstości mineralnej kości gąbczastej (figura 21 D). Wstępne leczenie MOR05813 i alendronianem [0361] 4,5-miesięcznym samicom myszy OF1/IC (n=/grupę, Charles River, Francja) podawano dwa razy w tygodniu dożylnie przeciwciało przeciw sklerostynie MOR05813 ( mg/kg, h/mlgg2a) lub przeciwciało kontrolne (anty-pc-mlgg2a, grupa zwierząt nietraktowanych i grupa kontrolna OVX). Dodatkowym grupom podawano 7 tygodni alendronian jako leczenie wstępne (4 µg/kg/dzień; 5 dni/tydzień), a następnie przeciwciało kontrolne lub przeciwciało przeciw sklerostynie MOR Leczenie przeciwciałem trwało 3,5 tygodnia (7 podań). [0362] Masę i geometrię kości piszczelowej zwierząt zmierzono przed rozpoczęciem leczenia przeciwciałem techniką obwodowej ilościowej tomografii komputerowej (pqct). Zwierzęta były równomiernie przydzielone do grup pod względem masy ciała i całkowitej gęstości mineralnej kości piszczelowej. Zmiany gęstości mineralnej, masy i geometrii kości oceniano pod koniec okresu leczenia. [0363] Wyniki wyrażano jako średnią +/-SEM. Analizę statystyczną przeprowadzano przy użyciu RS1 (seria 1999 dla Windows, Domain Manufacturing Corp., Stany Zjednoczone). Dane poddawano jednokierunkowej analizie wariancji (ANOVA). Równość wariancji badano za pomocą testu F Levene a i różnice między grupami oceniano za pomocą testu Dunnetta z poprawką Bonferroniego. Grupy wstępnie leczone alendronianem badano pod kątem istotności różnic w stosunku do grup niepoddawanych leczeniu wstępnemu (p<,05*, p<,01**). [0364] Długoterminowe leczenie wstępne bisfosfonianem alendronianu nie ma negatywnego wpływu na działanie anaboliczne przeciwciała przeciw sklerostynie MOR05813 na co wskazuje wzrost całkowitej zawartości minerałów w kościach (figura 22 A) i gęstości mineralnej kości (figura 22 B), a także wzrost grubości warstwy korowej (figura 22 C) i gęstości mineralnej kości gąbczastej (figura 22 D). Z powodu utrzymujących się właściwości anty-resorpcyjnych bisfosfonianu poza okresem podawania, obserwuje się wzrost całkowitej zawartości minerałów w kościach (figura 22 A) i grubości warstwy korowej (figura 22 C). MOR DKK1 lub hpth [0365] Sześciomiesięcznym samicom nagich myszy (n=8/grupę) podawano dożylnie dwa razy w tygodniu podłoże, przeciwciało przeciw sklerostynie MOR05813 (, i 40 mg/kg, IgG2), przeciwciało anty-dkk1 ( mg/kg, IgGl), hpth(1-34) (0 mikrog/kg) lub ich kombinacje. Leczenie przeciwciałem trwało 4 tygodni (8 podań).

99 [0366] Masę i geometrię kości piszczelowej zwierząt zmierzono przed leczeniem techniką obwodowej ilościowej tomografii komputerowej (pqct). Zwierzęta były równomiernie przydzielone do grup pod względem masy ciała i całkowitej gęstości mineralnej kości piszczelowej. Zmiany gęstości mineralnej, masy i geometrii kości oceniano pod koniec okresu leczenia. [0367] Wyniki wyrażano jako średnią +/-SEM. Analizę statystyczną przeprowadzano przy użyciu RS1 (seria 1999 dla Windows, Domain Manufacturing Corp., Stany Zjednoczone). Dane poddawano jednokierunkowej analizie wariancji (ANOVA). Równość wariancji badano za pomocą testu F Levene a i różnice między grupami oceniano za pomocą testu Dunnetta z poprawką Bonferroniego. Grupy badano pod kątem istotności różnic w stosunku do grupy, której podawano podłoże (p<,05*, p<,01**). [0368] Wzrost działania anabolicznego na kości z dawką przeciwciała przeciw sklerostynie MOR05813 (figura 23). Leczenie skojarzone przeciwciałem anty-dkk1 powoduje poprawę wzrostu całkowitej zawartości minerałów w kościach (figura 23 A) i gęstości mineralnej kości (figura 23 B) oraz grubości warstwy korowej (figura 23 C) i synergistyczny wzrost gęstości mineralnej kości gąbczastej (figura 23 D). Leczenie skojarzone hpth(1-34) powoduje synergistyczny wzrost wszystkich mierzonych parametrów (figura 23 A -D). Odnośniki [0369] Avsian-Kretchmer O, Hsueh AJ (04) Comparative genomic analysis of the eight-membered ring cystine knotcontaining bone morphogenetic protein antagonists. Mol Endocrinol 18(1):1-12. Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K., (1998) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York, USA Balemans W, Ebeling M, Patel N, Van Hul E, Olson P, Dioszegi M, Lacza C, Wuyts W, Van Den Ende J, Willems P, Paes-Alves AF, Hill S, Bueno M, Ramos FJ, Tacconi P, Dikkers FG, Stratakis C, Lindpaintner K, Vickery B, Foernzler D, Van Hul W. (01) Increased bone density in sclerosteosis is due to the deficiency of a novel secreted protein (SOST). Hum Mol Genet. (5): Balemans W, Patel N, Ebeling M, Van Hul E, Wuyts W, Lacza C, Dioszegi M, Dikkers FG, Hildering P, Willems PJ, Verheij JB, Lindpaintner K, Vickery B, Foernzler D, Van Hul W. (02) Identification of a 52 kb deletion downstream of the SOST gene in patients with van Buchem disease. J Med Gene 39(2):91-7.

100 Brunkow ME, Gardner JC, Van Ness J, Paeper BW, Kovacevich BR, Proll S, Skonier JE, Zhao L, Sabo PJ, Fu Y, Alisch RS, Gillett L, Colbert T, Tacconi P, Galas D, Hamersma H, Beighton P, Mulligan J (01) Bone dysplasia sclerosteosis results from loss of the SOST gene product, a novel cystine knot-containing protein. Am J Hum Genet 68(3): Chen, B.P., Hai, T. Expression vectors for affinity purification and radiolabeling of proteins using Escherichia coli as host. Gene 139, Chen, Y., Wiesmann, C., Fuh, G., Li, B., Christinger, H. W., McKay, P., de Vos, A. M., Lowman, H. B. (1999). Selection and analysis of an optimized anti-vegf antibody: crystal structure of an affinity-matured Fab in complex with antigen. J. Mol. Biol. 293, Gardner JC, van Bezooijen RL, Mervis B, Hamdy NA, Lowik CW, Hamersma H, Beighton P, Papapoulos SE. (05) Bone mineral density in sclerosteosis; affected individuals and gene carriers. J Clin Endocrinol Metab 90(12): Haenel C, Satzger M, Della Ducata D, Ostendorp R and Brocks B (05) Chraterization of High Affinity Antibodies by Electrochemiluminescence-Based Equilibrium Titration. Anal Biochem 339(1):182-4 Keller H, Kneissel M. (05) SOST is a target gene for PTH in bone. Bone 37(2): Knappik,A., Ge,L., Honegger,A., Pack,P., Fischer,M., Wellnhofer,G., Hoess,A., Wolle,J., Pluckthun,A. i Virnekas, B. (00). Fully synthetic human combinatorial antibody libraries (HuCAL ) based on modular consensus frameworks and CDRs randomized with trinucleotides. J Mol Biol 296, Krebs,B., Rauchenberger,R., Reiffert,S., Rothe,C., Tesar,M., Thomassen,E., Cao,M., Dreier,T., Fischer,D., Hoss, A., Inge,L., Knappik,A., Marget,M., Pack,P., Meng,X.Q., Schier,R., Sohlemann,P., Winter,J., Wolle,J. i Kretzschmar,T. (01). Highthroughput generation and engineering of recombinant human antibodies. J Immunol Methods 254, Li X, Zhang Y, Kang H, Liu W, Liu P, Zhang J, Harris SE, Wu D (05) Sclerostin binds to LRP5/6 and antagonizes canonical Wnt signaling. J Biol Chem. ;280(): Löhning, C. (01). Novel methods for displaying (poly)peptides/proteins on bacteriophage particles via disulfide bonds. WO 01/05950.

101 Loots GG, Kneissel M, Keller H, Baptist M, Chang J, Collette NM, Ovcharenko D, Plajzer-Frick I, Rubin EM. (05) Genomic deletion of a long-range bone enhancer misregulates sclerostin in Van Buchem disease. Genome Res (7): Low, N. M., Holliger, P., Winter, G. (1996). Mimicking somatic hypermutation: affinity maturation of antibodies displayed on bacteriophage using a bacterial mutator strain. J. Mol. Biol. 260, Rauchenberger,R., Borges,E., Thomassen-Wolf, E., Rom,E., Adar,R., Yaniv,Y., Malka,M., Chumakov,I., Kotzer,S., Resnitzky,D., Knappik,A., Reiffert,S., Prassler,J., Jury,K., Waldherr,D., Bauer,S., Kretzschmar,T., Yayon,A. i Rothe,C. (03). Human combinatorial Fab Library yielding specific and functional antibodies against the human fibroblast growth factor receptor 3. J Biol Chem. 278(40): Semenov MV, He X. LRP5 mutations linked to high bone mass diseases cause reduced LRP5 binding and inhibition by SOST.J Biol Chem. 06 Oct 19; van Bezooijen RL, Svensson JP, Eefting D, Visser A, van der Horst G, Karperien M, Quax PH, Vrieling H, Papapoulos SE, Ten Dijke P, Lowik CW (06) Wnt but not BMP Signaling is Involved in the Inhibitory Action of Sclerostin on BMP-Stimulated Bone Formation. Virnekas B, Ge L, Pluckthun A, Schneider KC, Wellnhofer G, Moroney SE (1994) Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Res. 22(25): J Bone Miner Res 06 Oct Winkler DG, Sutherland MK, Geoghegan JC, Yu C, Hayes T, Skonier JE, Shpektor D, Jonas M, Kovacevich BR, Staehling-Hampton K, Appleby M, Brunkow ME, Latham JA. (03) Osteocyte control of bone formation via sclerostin, a novel BMP antagonist. EMBO J 22(23): Winkler DG, Sutherland MS, Ojala E, Turcott E, Geoghegan JC, Shpektor D, Skonier JE, Yu C, Latham JA (05) Sclerostin inhibition of Wnt-3a-induced C3HT1/2 cell differentiation is indirect and mediated by bone morphogenetic proteins. J Biol Chem. 28;280(4): Wykaz sekwencji [0370] <1> Novartis AG <1> Kompozycje i sposoby zastosowania przeciwciał przeciw sklerostynie <130> <160> 171

102 <170> PatentIn version 3.2 <2> 1 <211> <212> PRT 5 <213> Homo sapiens 1 <400> 1 <2> 2 <211> <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 <2> 3 <211> <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 <2> 4 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 30 <2> 5

103 <211> <212> PRT <213> Homo sapiens 2 5 <400> 5 <2> 6 <211> <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 <2> 7 <211> <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 25 <2> 8 <211> <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 <2> 9 <211> 30 <212> PRT

104 <213> Homo sapiens 3 <400> 9 5 <2> <211> <212> PRT <213> Homo sapiens <400> <2> 11 <211> <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 <2> 12 <211> <212> PRT <213> Homo sapiens <400> <2> 13 <211> <212> PRT

105 <213> Homo sapiens 4 <400> 13 5 <2> 14 <211> <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 <2> <211> <212> PRT <213> Homo sapiens <400> <2> 16 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16

106 5 <2> 17 <211> 19 <212> PRT 5 <213> Homo sapiens <400> 17 <2> 18 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 <2> 19 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 <2> <211>

107 <212> PRT <213> Homo sapiens 6 <400> 5 <2> 21 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 <2> 22 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 <2> 23 <211> <212> PRT <213> Homo sapiens 25 <400> 23

108 5 <2> 24 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 7 <2> 25 <211> <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 <2> 26 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 <2> 27 <211> 8 <212> PRT 25 <213> Homo sapiens <400> 27 <2> <211> 8 <212> PRT

109 <213> Homo sapiens 8 <400> 28 5 <2> 29 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 <2> 30 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 <2> 31 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> <2> 32 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32

110 9 <2> 33 <211> 8 <212> PRT 5 <213> Homo sapiens <400> 33 <2> 34 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 <2> 35 <211> <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 <2> 36 <211> <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36

111 1 <2> 37 <211> 14 <212> PRT 5 <213> Homo sapiens <400> 37 <2> 38 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 <2> 39 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 <2> 40 <211> <212> PRT <213> Homo sapiens <400> <2> 41 <211> 14

112 <212> PRT <213> Homo sapiens 111 <400> 41 5 <2> 42 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 <2> 43 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 <2> 44 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens 25 <400> 44 <2> 45 <211> 11 <212> PRT 30 <213> Homo sapiens

113 <400> <2> 46 <211> 11 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 <2> 47 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 <2> 48 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 <2> <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> <2> 50

114 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 <2> 51 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 <2> 52 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> <2> 53 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 <2> 54 <211> <212> PRT <213> Homo sapiens

115 114 <400> 54 <2> 55 5 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 <2> 56 <211> <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 <2> 57 <211> <212> PRT <213> Homo sapiens <400> <2> 58 <211> <212> PRT <213> Homo sapiens 30 <400> 58

116 5 <2> 59 <211> <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 1 <2> 60 <211> <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 <2> 61 <211> <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 <2> 62 <211> <212> PRT 25 <213> Homo sapiens <400> 62 <2> <211> <212> PRT <213> Homo sapiens

117 116 <400> 63 <2> 64 5 <211> <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 <2> 65 <211> <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 <2> 66 <211> <212> PRT <213> Homo sapiens <400> <2> 67 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens 30 <400> 67

118 117 <2> 68 <211> 117 <212> PRT 5 <213> Homo sapiens <400> 68

119 118 <2> 69 <211> 124 <212> PRT 5 <213> Homo sapiens <400> 69

120 119 <2> 70 <211> 117 <212> PRT 5 <213> Homo sapiens <400> 70

121 1 <2> 71 <211> 116 <212> PRT 5 <213> Homo sapiens <400> 71

122 121 <2> 72 <211> <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72

123 122 <2> 73 <211> 116 <212> PRT 5 <213> Homo sapiens <400> 73

124 123 <2> 74 <211> 116 <212> PRT 5 <213> Homo sapiens <400> 74

125 124 <2> 75 <211> 117 <212> PRT 5 <213> Homo sapiens <400> 75

126 125 <2> 76 <211> 116 <212> PRT 5 <213> Homo sapiens <400> 76

127 126 <2> 77 <211> 116 <212> PRT 5 <213> Homo sapiens <400> 77 <2> 78 <211> 1

128 <212> PRT <213> Homo sapiens 127 <400> 78 5 <2> 79 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79

129 128 <2> 80 <211> 1 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80

130 129 <2> 81 <211> 113 <212> PRT 5 <213> Homo sapiens <400> 81

131 130 <2> 82 <211> 113 <212> PRT 5 <213> Homo sapiens <400> 82 <2> 83

132 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83 <2> 84 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84

133 132 <2> 85 <211> <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 85

134 133 <2> 86 <211> 113 <212> PRT 5 <213> Homo sapiens <400> 86

135 134 <2> 87 <211> 113 <212> PRT 5 <213> Homo sapiens <400> 87

136 135 <2> 88 <211> <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 88

137 136 <2> 89 <211> 372 <212> DNA 5 <213> Homo sapiens <400> 89 <2> 90 <211> 351 <212> DNA

138 <213> Homo sapiens 137 <400> 90 5 <2> 91 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 91 <2> 92 <211> 351 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 92

139 138 <2> 93 <211> 348 <212> DNA 5 <213> Homo sapiens <400> 93 <2> 94 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 94 <2> 95 <211> 348

140 <212> DNA <213> Homo sapiens 139 <400> 95 5 <2> 96 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 96 <2> 97 <211> 351 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 97

141 140 <2> 98 <211> 348 <212> DNA 5 <213> Homo sapiens <400> 98 <2> 99 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 99 <2> 0 <211> 330 <212> DNA

142 <213> Homo sapiens 141 <400> 0 5 <2> 1 <211> 339 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 <2> 2 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2

143 142 <2> 3 <211> 339 <212> DNA 5 <213> Homo sapiens <400> 3 <2> 4 <211> 339 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 <2> 5 <211> 339 <212> DNA

144 <213> Homo sapiens 143 <400> 5 5 <2> 6 <211> 339 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 <2> 7 <211> 339 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7

145 144 <2> 8 <211> 339 <212> DNA 5 <213> Homo sapiens <400> 8 <2> 9 <211> 339 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 <2> 1 <211> 339 <212> DNA

146 <213> Homo sapiens 145 <400> 1 5 <2> 111 <211> 469 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 111

147 146

148 147 <2> 112 <211> 462 <212> PRT 5 <213> Homo sapiens <400> 112

149 148

150 149 <2> 113 <211> 469 <212> PRT

151 <213> Homo sapiens 0 <400> 113

152 1

153 2 <2> 114 <211> 462

154 <212> PRT <213> Homo sapiens 3 <400>114

155 4

156 5 <2> 1 <211> 461

157 <212> PRT <213> Homo sapiens 6 <400> 1

158 7

159 8 <2> 116 <211> 461 <212> PRT

160 <213> Homo sapiens 9 <400> 116

161 160

162 161

163 5 <2> 117 <211> 461 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>

164 163

165 164

166 5 <2> 118 <211> 465 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>

167 166

168 167

169 168 <2> 119 <211> 462 <212> PRT 5 <213> Homo sapiens <400> 119

170 169

171 170

172 171 <2> 1 <211> 461 <212> PRT 5 <213> Homo sapiens <400> 1

173 172

174 173

175 174 <2> 121 <211> 461 <212> PRT 5 <213> Homo sapiens <400> 121

176 175

177 176

178 177 <2> 122 <211> 130 <212> PRT 5 <213> Homo sapiens <400> 122 <2> 123 <211> 237 <212> PRT <213> Homo sapiens

179 <400>

180 179 <2> 124 <211> 234

181 <212> PRT <213> Homo sapiens 180 <400> 124

182 181

183 182 5 <2> 125 <211> 237 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 125

184 183

185 184 <2> 126 <211> 237 <212> PRT 5 <213> Homo sapiens <400> 126

186 185

187 5 <2> 127 <211> 237 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>

188 187 <2> 128 <211> 237 <212> PRT 5 <213> Homo sapiens <400> 128

189 188

190 5 <2> 129 <211> 237 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>

191 190 <2> 130 <211> 237 <212> PRT 5 <213> Homo sapiens <400> 130

192 191

193 5 <2> 131 <211> 237 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>

194 193 <2> 132 <211> 237 <212> PRT 5 <213> Homo sapiens <400> 132

195 194

196 5 <2> 133 <211> 14 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> <2> 134 <211> 1389

197 <212> DNA <213> Homo sapiens 196 <400> <2> 135 <211> 14 <212> DNA <213> Homo sapiens

198 <400> <2> 136 <211> <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 136

199 198 <2> 137 <211> 1386 <212> DNA 5 <213> Homo sapiens <400> 137

200 199 <2> 138 <211> 1386 <212> DNA 5 <213> Homo sapiens <400> 138

201 0 <2> 139 <211> 1386 <212> DNA 5 <213> Homo sapiens <400> 139

202 1 <2> 140 <211> 1386 <212> DNA 5 <213> Homo sapiens <400> 140

203 2 <2> 141 <211> 1389 <212> DNA 5 <213> Homo sapiens <400> 141

204 3 <2> 142 <211> 1386 <212> DNA 5 <213> Homo sapiens <400> 142

205 4 <2> 143 <211> 1386 <212> DNA 5 <213> Homo sapiens <400> 143

206 5 <2> 144 <211> 393 <212> DNA 5 <213> Homo sapiens <400> 144

207 6 <2> 145 <211> 714 <212> DNA 5 <213> Homo sapiens <400> 145 <2> 146 <211> 705 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 146

208 7 <2> 147 <211> 714 <212> DNA 5 <213> Homo sapiens <400> 147 <2> 148 <211> 714

209 <212> DNA <213> Homo sapiens 8 <400> <2> 149 <211> 714 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 149

210 9 <2> 0 <211> 714 <212> DNA 5 <213> Homo sapiens <400> 0 <2> 1 <211> 714

211 <212> DNA <213> Homo sapiens 2 <400> 1 5 <2> 2 <211> 714 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2

212 211 <2> 3 <211> 714 <212> DNA 5 <213> Homo sapiens <400> 3 <2> 4 <211> 714 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4

213 212 <2> 5 <211> 213 <212> PRT 5 <213> homo sapiens <400> 5

214 <2> 6 213

215 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 <2> 7 <211> <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 <2> 8 <211> 13 <212> PRT <213> Sztuczna <2> <223> Sekwencja łącznika białkowego <400> 8 25 <2> 9 <211> 19 <212> PRT <213> Sztuczna 30 <2> <223> Sekwencja łącznika białkowego <400> 9

216 2 5 <2> 160 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna <2> <223> sirna <400> 160 taaattatca taaagtccta a 21 <2> 161 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna <2> <223> sirna 25 <400> 161 aggactttat gataatttat t 21 <2> 162 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna <2> <223> sirna 30 <400> 162 atagtggtta aataactcca g 21 <2> 163

217 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna <2> <223> sirna <400> 163 ggagttattt aaccactatt t 21 <2> 164 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna <2> <223> sirna <400> 164 taaattctcg tgatgtgcca t 21 <2> 165 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna 25 <2> <223> sirna 30 <400> 165 ggcacatcac gagaatttat t 21 <2> 166 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna 35 <2>

218 <223> sirna <400> 166 tttcttatag cacagctggt t 21 <2> 167 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna <2> <223> sirna <400> 167 ccagctgtgc tataagaaat t 21 <2> 168 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna <2> <223> sirna 25 <400> 168 tagacctttc catccacgct g 21 <2> 169 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna 30 <2> <223> sirna 35 <400> 169 gcgtggatgg aaaggtctat t 21 <2> 170

219 <211> 29 <212> DNA <213> Sztuczna <2> <223> Starter RT-PCT <400> 170 atgcagctcc cactggccct gtgtcttgt 29 <2> 171 <211> 30 <212> DNA <213> Sztuczna <2> <223> Starter RT-PCT <400> 171 aatcaggccg agctggagaa cgcctactag 30 Novartis AG, Szwajcaria Pełnomocnik:

220 219 Z-11635/13 EP B Zastrzeżenia patentowe 1. Przeciwciało przeciw sklerostynie zawierające sekwencję polipeptydową regionu zmiennego łańcucha ciężkiego zawierającą SEQ ID NO: 70 i sekwencję polipeptydową regionu zmiennego łańcucha lekkiego zawierającą SEQ ID NO: Przeciwciało według zastrzeżenia 1, zawierające sekwencję aminokwasową pełnej długości łańcucha ciężkiego zawierającą SEQ ID NO: Przeciwciało według zastrzeżeń 1-2, zawierające sekwencję aminokwasową pełnej długości łańcucha lekkiego zawierającą SEQ ID NO: Przeciwciało zawierające sekwencję łańcucha ciężkiego zawierającą sekwencję SEQ ID NO:114 i sekwencję łańcucha lekkiego zawierającą sekwencję SEQ ID NO: Przeciwciało według dowolnego z zastrzeżeń od 1 do 4, do zastosowania jako lek. 6. Zastosowanie przeciwciała określonego w dowolnym z zastrzeżeń od 1 do 4, do wytwarzania leku do leczenia zaburzenia patologicznego, w którym pośredniczy sklerostyna lub które jest związane ze zwiększonym poziomem sklerostyny, gdzie zaburzeniem patologicznym jest co najmniej jedno spośród pierwotnej i wtórnej osteoporozy, osteopenii, osteomalacji, wrodzonej łamliwości kości, martwicy wywołanej brakiem unaczynienia znanej także jako osteonekroza, gojenia złamań i implantów włączając implanty dentystyczne i implanty kości biodrowych, utraty masy kostnej spowodowanej innymi zaburzeniami, takimi jak utrata masy kostnej związana z zakażeniem HIV, rakiem lub zapaleniem stawów. 7. Przeciwciało według dowolnego z zastrzeżeń od 1 do 4, do zastosowania w leczeniu zaburzenia patologicznego, w którym pośredniczy sklerostyna lub które jest związane ze zwiększonym poziomem sklerostyny, gdzie zaburzeniem patologicznym jest co najmniej jedno spośród pierwotnej i wtórnej osteoporozy, osteopenii, osteomalacji, wrodzonej łamliwości kości, martwicy wywołanej brakiem unaczynienia znanej także jako osteonekroza, gojenia złamań i implantów włączając implanty dentystyczne i implanty kości biodrowych, utraty masy kostnej spowodowanej innymi zaburzeniami, takimi jak utrata masy kostnej związana z zakażeniem HIV, rakiem lub zapaleniem stawów. 8. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca przeciwciało określone w dowolnym z zastrzeżeń od 1 do 4.

221 Kompozycja farmaceutyczna według zastrzeżenia 8, w kombinacji z jedną lub większą liczbą farmaceutycznie dopuszczalnych zaróbek, rozcieńczalników lub nośników.. Kompozycja farmaceutyczna według zastrzeżenia 8 lub 9, dodatkowo zawierająca inne składniki czynne. 11. Kompozycja farmaceutyczna według zastrzeżenia 8 lub 9, dodatkowo zawierająca co najmniej jeden inny środek przeciwzapalny lub środek przeciw osteoporozie. 12. Izolowana sekwencja polinukleotydowa kodująca przeciwciało określone w dowolnym z zastrzeżeń od 1 do Wektor klonujący lub ekspresyjny zawierający jedną lub większą liczbę sekwencji polinukleotydowych określonych w zastrzeżeniu Wektor według zastrzeżenia 13, zawierający co najmniej jedną sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z sekwencji SEQ ID NO:136 i Komórka gospodarza zawierająca jeden lub większą liczbę wektorów klonujących lub ekspresyjnych określonych w zastrzeżeniach Sposób wytwarzania przeciwciała określonego w dowolnym z zastrzeżeń od 1 do 4, obejmujący hodowanie komórki gospodarza określonej w zastrzeżeniu i izolowanie wymienionego przeciwciała. 17. Przeciwciało według dowolnego z zastrzeżeń od 1 do 4 lub kompozycja farmaceutyczna według dowolnego z zastrzeżeń od 8-11, do zastosowania w leczeniu lub profilaktyce zaburzenia patologicznego, w którym pośredniczy sklerostyna lub które jest związane ze zwiększonym poziomem sklerostyny, gdzie zaburzeniem patologicznym jest co najmniej jedno spośród pierwotnej i wtórnej osteoporozy, osteopenii, osteomalacji, wrodzonej łamliwości kości, martwicy wywołanej brakiem unaczynienia znanej także jako osteonekroza, gojenia złamań i implantów włączając implanty dentystyczne i implanty kości biodrowych, utraty masy kostnej spowodowanej innymi zaburzeniami, takimi jak utrata masy kostnej związana z zakażeniem HIV, rakiem lub zapaleniem stawów. 18. Zestaw diagnostyczny zawierający przeciwciało określone w dowolnym z zastrzeżeń od 1 do Sposób in vitro identyfikacji komórki lub tkanki wykazujących ekspresję sklerostyny, obejmujący kontaktowanie wymienionej komórki lub tkanki z przeciwciałem wybranym spośród dowolnego określonego w zastrzeżeniach od 1 do 4, gdzie wymienione przeciwciało zawiera ponadto wykrywalny znacznik, taki jak znacznik izotopowy, fluorescencyjny, magnetyczny, paramagnetyczny lub chemiluminescencyjny.

222 Zastosowanie przeciwciała określonego w dowolnym z zastrzeżeń od 1 do 4 i (i) kwasu zoledronowego, (ii) przeciwciała anty-dkk1, (iii) alendronianu, (iv) przeciwciała anty-lrp4, (v) hpth i/lub (vi) środków uwalniających hormon przytarczyc, takich jak kalcylityki, do wytwarzania leku do leczenia zaburzenia patologicznego, w którym pośredniczy sklerostyna lub które jest związane ze zwiększonym poziomem sklerostyny, i gdzie zaburzeniem patologicznym jest co najmniej jedno spośród pierwotnej i wtórnej osteoporozy, osteopenii, osteomalacji, wrodzonej łamliwości kości, martwicy wywołanej brakiem unaczynienia znanej także jako osteonekroza, gojenia złamań i implantów włączając implanty dentystyczne i implanty kości biodrowych, utraty masy kostnej spowodowanej innymi zaburzeniami, takimi jak utrata masy kostnej związana z zakażeniem HIV, rakiem lub zapaleniem stawów. 21. Zastosowanie przeciwciała określonego w dowolnym z zastrzeżeń od 1 do 4 do wytwarzania leku do leczenia zaburzenia patologicznego, w którym pośredniczy sklerostyna lub które jest związane ze zwiększonym poziomem sklerostyny, gdzie lek stosuje się w połączeniu z (i) kwasem zoledronowym, (ii) przeciwciałem anty-dkk1, (iii) alendronianem, (iv) przeciwciałem anty-lrp4, (v) hpth i/lub (vi) środkami uwalniającymi hormon przytarczyc, takimi jak kalcylityki i gdzie zaburzeniem patologicznym jest co najmniej jedno spośród pierwotnej i wtórnej osteoporozy, osteopenii, osteomalacji, wrodzonej łamliwości kości, martwicy wywołanej brakiem unaczynienia znanej także jako osteonekroza, gojenia złamań i implantów włączając implanty dentystyczne i implanty kości biodrowych, utraty masy kostnej spowodowanej innymi zaburzeniami, takimi jak utrata masy kostnej związana z zakażeniem HIV, rakiem lub zapaleniem stawów. 22. Zastosowanie (i) kwasu zoledronowego, (ii) przeciwciała anty-dkk1, (iii) alendronianu, (iv) przeciwciała anty-lrp4, (v) hpth i/lub (vi) środków uwalniających hormon przytarczyc, takich jak kalcylityki do wytwarzania leku do leczenia zaburzenia patologicznego, w którym pośredniczy sklerostyna lub które jest związane ze zwiększonym poziomem sklerostyny, gdzie lek stosuje się w połączeniu z przeciwciałem określonym w dowolnym z zastrzeżeń od 1 do 4, i gdzie zaburzeniem patologicznym jest co najmniej jedno spośród pierwotnej i wtórnej osteoporozy, osteopenii, osteomalacji, wrodzonej łamliwości kości, martwicy wywołanej brakiem unaczynienia znanej także jako osteonekroza, gojenia złamań i implantów włączając implanty dentystyczne i implanty kości biodrowych, utraty masy kostnej spowodowanej innymi zaburzeniami, takimi jak utrata masy kostnej związana z zakażeniem HIV, rakiem lub zapaleniem stawów.

223 Zastosowanie przeciwciała określonego w dowolnym z zastrzeżeń od 1 do 4 do wytwarzania leku do leczenia zaburzenia patologicznego, w którym pośredniczy sklerostyna lub które jest związane ze zwiększonym poziomem sklerostyny, gdzie pacjentowi wstępnie podawano (i) kwas zoledronowy, (ii) przeciwciało anty-dkk1, (iii) alendronian, (iv) przeciwciało anty-lrp4, (v) hpth i/lub (vi) środki uwalniające hormon przytarczyc, takie jak kalcylityki, i gdzie zaburzeniem patologicznym jest co najmniej jedno spośród pierwotnej i wtórnej osteoporozy, osteopenii, osteomalacji, wrodzonej łamliwości kości, martwicy wywołanej brakiem unaczynienia znanej także jako osteonekroza, gojenia złamań i implantów włączając implanty dentystyczne i implanty kości biodrowych, utraty masy kostnej spowodowanej innymi zaburzeniami, takimi jak utrata masy kostnej związana z zakażeniem HIV, rakiem lub zapaleniem stawów. 24. Zastosowanie (i) kwasu zoledronowego, (ii) przeciwciała anty-dkk1, (iii) alendronianu, (iv) przeciwciała anty-lrp4, (v) hpth i/lub (vi) środków uwalniających hormon przytarczyc, takich jak kalcylityki, do wytwarzania leku do leczenia zaburzenia patologicznego, w którym pośredniczy sklerostyna lub które jest związane ze zwiększonym poziomem sklerostyny, gdzie pacjentowi wstępnie podawano przeciwciało określone w dowolnym z zastrzeżeń od 1 do 4, i gdzie zaburzeniem patologicznym jest co najmniej jedno spośród pierwotnej i wtórnej osteoporozy, osteopenii, osteomalacji, wrodzonej łamliwości kości, martwicy wywołanej brakiem unaczynienia znanej także jako osteonekroza, gojenia złamań i implantów włączając implanty dentystyczne i implanty kości biodrowych, utraty masy kostnej spowodowanej innymi zaburzeniami, takimi jak utrata masy kostnej związana z zakażeniem HIV, rakiem lub zapaleniem stawów. 25. Przeciwciało według dowolnego z zastrzeżeń od 1 do 4 i (i) kwas zoledronowy, (ii) przeciwciało anty-dkk1, (iii) alendronian, (iv) przeciwciało anty-lrp4, (v) hpth i/lub (vi) środki uwalniające hormon przytarczyc, takie jak kalcylityki, do zastosowania w leczeniu zaburzenia patologicznego, w którym pośredniczy sklerostyna lub które jest związane ze zwiększonym poziomem sklerostyny, gdzie zaburzeniem patologicznym jest co najmniej jedno spośród pierwotnej i wtórnej osteoporozy, osteopenii, osteomalacji, wrodzonej łamliwości kości, martwicy wywołanej brakiem unaczynienia znanej także jako osteonekroza, gojenia złamań i implantów włączając implanty dentystyczne i implanty kości biodrowych, utraty masy kostnej spowodowanej innymi zaburzeniami, takimi jak utrata masy kostnej związana z zakażeniem HIV, rakiem lub zapaleniem stawów. 26. Przeciwciało według dowolnego z zastrzeżeń od 1 do 4 stosowane w połączeniu z (i) kwasem zoledronowym, (ii) przeciwciałem anty-dkk1, (iii)

224 alendronianem, (iv) przeciwciałem anty-lrp4, (v) hpth i/lub (vi) środkami uwalniającymi hormon przytarczyc, takimi jak kalcylityki, do zastosowania w leczeniu zaburzenia patologicznego, w którym pośredniczy sklerostyna lub które jest związane ze zwiększonym poziomem sklerostyny, gdzie zaburzeniem patologicznym jest co najmniej jedno spośród pierwotnej i wtórnej osteoporozy, osteopenii, osteomalacji, wrodzonej łamliwości kości, martwicy wywołanej brakiem unaczynienia znanej także jako osteonekroza, gojenia złamań i implantów włączając implanty dentystyczne i implanty kości biodrowych, utraty masy kostnej spowodowanej innymi zaburzeniami, takimi jak utrata masy kostnej związana z zakażeniem HIV, rakiem lub zapaleniem stawów. 27. Przeciwciało według dowolnego z zastrzeżeń od 1 do 4 do zastosowania w leczeniu zaburzenia patologicznego, w którym pośredniczy sklerostyna lub które jest związane ze zwiększonym poziomem sklerostyny, gdzie pacjentowi wstępnie podawano (i) kwas zoledronowy, (ii) przeciwciało anty-dkk1, (iii) alendronian, (iv) przeciwciało anty- LRP4, (v) hpth i/lub (vi) środki uwalniające hormon przytarczyc, takie jak kalcylityki, i gdzie zaburzeniem patologicznym jest co najmniej jedno spośród pierwotnej i wtórnej osteoporozy, osteopenii, osteomalacji, wrodzonej łamliwości kości, martwicy wywołanej brakiem unaczynienia znanej także jako osteonekroza, gojenia złamań i implantów włączając implanty dentystyczne i implanty kości biodrowych, utraty masy kostnej spowodowanej innymi zaburzeniami, takimi jak utrata masy kostnej związana z zakażeniem HIV, rakiem lub zapaleniem stawów. 28. (i) Kwas zoledronowy, (ii) przeciwciało anty-dkk1, (iii) alendronian, (iv) przeciwciało anty-lrp4, (v) hpth i/lub (vi) środki uwalniające hormon przytarczyc, takie jak kalcylityki do zastosowania w leczeniu zaburzenia patologicznego, w którym pośredniczy sklerostyna lub które jest związane ze zwiększonym poziomem sklerostyny, gdzie pacjentowi wstępnie podawano przeciwciało określone w dowolnym z zastrzeżeń od 1 do 4, i gdzie zaburzeniem patologicznym jest co najmniej jedno spośród pierwotnej i wtórnej osteoporozy, osteopenii, osteomalacji, wrodzonej łamliwości kości, martwicy wywołanej brakiem unaczynienia znanej także jako osteonekroza, gojenia złamań i implantów włączając implanty dentystyczne i implanty kości biodrowych, utraty masy kostnej spowodowanej innymi zaburzeniami, takimi jak utrata masy kostnej związana z zakażeniem HIV, rakiem lub zapaleniem stawów. 29. Zastosowanie według dowolnego z zastrzeżeń od do 28, gdzie hpth jest hpth(1-34). Novartis AG, Szwajcaria Pełnomocnik:

225 224 Z-11635/13 EP B1

226 225 Z-11635/13 EP B1

227 226 Z-11635/13 EP B1

228 227 Z-11635/13 EP B1

229 228 Z-11635/13 EP B1

230 229 Z-11635/13 EP B1

231 230 Z-11635/13 EP B1 5

232 231 Z-11635/13 EP B1 5

233 232 Z-11635/13 EP B1 5