(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 11/33 EP B1 (13) (1) T3 Int.Cl. C07K 16/28 (06.01) A61K 39/39 (06.01) A61P 37/06 (06.01) A61P 19/02 (06.01) (4) Tytuł wynalazku: Humanizowane przeciwciało anty-cd4 o właściwościach immunosupresyjnych (30) Pierwszeństwo: EP EP (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 09/2 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 12/03 (73) Uprawniony z patentu: Biotest AG, Dreieich, DE (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 JOHN WIJDENES, Larnod, FR HELMUT JONULEIT, Ginsheim-Gustavsburg, DE (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Marta Kawczyńska POLSERVICE KANCELARIA RZECZNIKÓW PATENTOWYCH SP. Z O.O. ul. Bluszczańska Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 2 17/P28697PL00 EP B Opis [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy humanizowanego przeciwciała anty-cd4 i jego zastosowania do immunomodulacji. [0002] Choroby autoimmunologiczne, jak również odrzucenie przeszczepu, są skutkiem niewłaściwej odpowiedzi immunologicznej na antygeny tkankowe: w pierwszym przypadku - na antygeny własne, a w drugim - na antygeny przeszczepu allogenicznego. [0003] Do chorób autoimmunologicznych należą na przykład reumatoidalne zapalenie stawów, cukrzyca typu I, stwardnienie rozsiane, choroba Crohna, wrzodziejące zapalenie jelita grubego, atopowe zapalenie skóry itd. [0004] Konwencjonalne sposoby leczenia tych zaburzeń immunologicznych obejmują stosowanie leków immunosupresyjnych. Leki te jednak wywołują uogólnioną immunosupresję, powodując hamowanie nie tylko szkodliwych funkcji układu immunologicznego, lecz również funkcji użytecznych. Skutkiem tego wywołują one skutki uboczne niepożądane, takie jak zakażenia oportunistyczne. [000] Jako alternatywne podejście proponuje się zastosowanie immunosupresyjnych przeciwciał monoklonalnych (mab) przeciwko cząsteczkom powierzchniowym komórki w celu usunięcia pewnych subpopulacji limfocytów (przeciwciała powodujące eliminację) lub zahamowania czynności docelowej cząsteczki powierzchniowej bez zabijania komórki, na której ta cząsteczka się znajduje (przeciwciała

3 niepowodujące eliminacji). [0006] Istnieje ogólna zgoda co do tego, że komórki T CD4 + odgrywają główną rolę w zapoczątkowywaniu i podtrzymywaniu funkcji autoimmunologicznych. Zgodnie z tym proponowano zastosowanie mab przeciwko cząsteczkom powierzchniowym komórek T CD4 +, zwłaszcza mab anty-cd4, jako środków immunosupresyjnych. Mimo, że wiele badań klinicznych potwierdziło potencjalne zainteresowanie tym podejściem, uwidoczniły one także kilka problemów, którymi należy się zająć, żeby zaadaptować mab anty-cd4 do zastosowania w rutynowej praktyce klinicznej. [0007] Przykładowo przeciwciało B-F (mysie IgG1 skierowane przeciwko ludzkiej CD4) badano w różnych chorobach autoimmunologicznych: - u pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów kilka badań otwartych sugerowało dodatni efekt kliniczny B-F w dawce dziennej co najmniej mg (Racadot i wsp. Clin Exp Rheumatol (4):36-74; 1992; Wendling i wsp., Clin Rheumatol, 11 (4):42-7, 1992). Jednak wyniki obserwowane w badaniu kontrolowanym placebo z dawką dzienną mg przez dni nie wykazały jednak istotnej poprawy (Wendling i wsp. J Rheumatol; 2(8):147-61, 1998). - w łuszczycy obserwowano poprawę zmian łuszczycowych po leczeniu w dawce od 0,2 mg/kg/dzień do 0,8 mg/kg/dzień przez 7 lub 8 dni (Morel i wsp. J Autoimmun., (4):46-77, 1992); - u chorych ze stwardnieniem rozsianym (MS) obserwowano pewne dodatnie efekty po -dniowej terapii pacjentów z postaciami nawrotowo-remisyjnymi: u niektórych z nich remisja utrzymywała się w 6 miesiącu po terapii

4 (Racadot i wsp., J Autoimmun, 6(6):771-86, 1993); podobne efekty obserwowali Rumbach i wsp. (Mult Scler; 1(4):7-12, 1996); - w ciężkiej chorobie Crohna nie obserwowano istotnej poprawy u pacjentów otrzymujących B-F w dawce 0, mg/kg/dzień przez 7 kolejnych dni lub 0, mg/kg/dzień pierwszego dnia (dzień 0) i 1 mg/kg/dzień w dniach 1-6 (Canva-Delcambre i wsp., Aliment Pharmacol Ther ():721-7, 1996); - w profilaktyce odrzucenia przeszczepu allogenicznego opisywano modyfikację parametrów biologicznych, wskazującą na działanie B-F in vivo w dawce 30 mg/dziennie. Opisywano jednak, że biodostępność B-F była niewystarczająca do zastosowania tego środka do profilaktyki odrzucenia przeszczepu allogenicznego (Dantal i wsp. Transplantation, 27;62():2-6, 1996). [0008] Z powyższego wynika, że pierwszym problemem do rozwiązania jest konieczność stosowania dużych dawek mab celem uzyskania poprawy klinicznej. Może to wynikać między innymi ze słabej dostępności limfocytów dla mab w tkance docelowej. Zastosowanie większych dawek może powodować nadmierne działanie na limfocyty krwi, wywołujące niepożądane skutki uboczne. [0009] Inną wadą terapii przeciwciałami monoklonalnymi u ludzi jest to, że te przeciwciała są zwykle uzyskiwane z komórek mysich, i u biorców-ludzi wyzwalają odpowiedź przeciwko antygenom mysim. Powoduje to nie tylko mniejszą skuteczność leczenia aktualnego, i, w jeszcze większym stopniu jakiegokolwiek przyszłego leczenia mysimi przeciwciałami

5 monoklonalnymi, lecz również zwiększenie ryzyka anafilaksji. [00] Wady tej można generalnie uniknąć przez zastosowanie przeciwciał humanizowanych, uzyskanych przez przeszczepienie regionów determinujących komplementarność (CDR) mysiego przeciwciała monoklonalnego, determinujących swoistość wiązania antygenu, do regionów zrębowych (FR) ludzkiej cząsteczki immunoglobuliny. Celem humanizacji jest uzyskanie rekombinowanego przeciwciała o takich samych właściwościach wiązania antygenu jak mysie przeciwciało monoklonalne, z którego pochodzą sekwencje CDR, ale znacznie mniej immunogennego u ludzi. [0011] W niektórych przypadkach zastąpienie ludzkich CDR w ludzkich regionach zrębowych przez CDR z przeciwciała mysiego wystarcza do przeniesienia właściwości wiązania antygenu (w tym nie tylko swoistości, lecz również powinowactwa wobec antygenu). W wielu przeciwciałach niektóre reszty FR mają jednak duże znaczenie dla wiązania antygenu, ponieważ bezpośrednio kontaktują się one z antygenem w kompleksie przeciwciało-antygen, lub dlatego, że wpływają na konformację CDR i poprzez to na ich właściwości wiązania antygenu. [0012] W większości przypadków konieczne jest zatem również zastąpienie jedną lub więcej niż jedną resztą zrębową z przeciwciała mysiego odpowiadających im ludzkich reszt FR. Ze względu na to, że liczba podstawionych reszt musi być jak najmniejsza, żeby zapobiec reakcjom przeciwko antygenom mysim, problemem jest ustalenie, która reszta lub reszty aminokwasowe

6 mają kluczowe znaczenie dla zachowania właściwości wiązania antygenu. Do przewidywania bardziej odpowiednich miejsc do substytucji proponowano zastosowanie rozmaitych metod. Mimo, że dostarczają one pewnych zasad ogólnych, które mogą w pewnym stopniu być pomocne w pierwszych etapach humanizacji, ostateczny rezultat bywa różny w przypadku różnych przeciwciał. W przypadku danego przeciwciała bardzo trudno jest zatem przewidzieć, jakie substytucje zapewnią pożądany rezultat. [0013] Twórcy wynalazku podjęli jednak próbę humanizacji mysiego B-F i udało im się wytworzyć humanizowane B-F (określane w dalszym ciągu niniejszego opisu jako hb-f) o takich samych właściwościach wiązania CD4 jak rodzicielskie mysie B- F. [0014] Twórcy wynalazku stwierdzili także nieoczekiwanie, że hb-f wywiera in vivo optymalny wpływ immunosupresyjny w dawkach znacznie mniejszych od uprzednio stosowanych dawek B-F rodzicielskiego, i od dawek obecnie stosowanych w przypadku innych monoklonalnych przeciwciał anty-cd4. [001] Twórcy wynalazku zaobserwowali w istocie, że hb- F zapewnia skuteczne działanie immunosupresyjne, przejawiające się dodatnim efektem klinicznym u pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów przy zastosowaniu -dniowego kursu leczenia w dawce zaledwie 1 mg/dzień, a korzystnie w dawce mg co drugi dzień. [0016] Zgodnie z tym niniejszy wynalazek dostarcza humanizowanego przeciwciała anty-cd4, zdolnego do

7 7 1 aktywacji regulatorowych komórek T CD4 + CD2 +, przy czym to humanizowane przeciwciało anty-cd4 zawiera sekwencję obejmującą regiony determinujące komplementarność (CDR) mysiego przeciwciała monoklonalnego anty-cd4 B-F, przy czym to mysie przeciwciało monoklonalne anty-cd4 B-F zawiera regiony V h i V kodowane przez sekwencje oznaczone SEQ ID nr i SEQ ID nr 6. Niniejszy wynalazek dostarcza ponadto fragmentu przeciwciała zawierającego domeny V tego humanizowanego przeciwciała anty-cd4, które jest zdolne do aktywacji regulatorowych komórek T CD4 + CD2 +, oraz polinukleotydu zawierającego sekwencję kodującą domenę V tego przeciwciała. Niniejszy wynalazek dostarcza również kompozycji terapeutycznej zawierającej to przeciwciało lub fragment przeciwciała, oraz przeciwciała lub fragmentu przeciwciała do zastosowania jako lek. [0017] Niniejszy wynalazek dostarcza humanizowanego przeciwciała (hb-f) pochodzącego z mysiego mab B-F, przy czym to przeciwciało hb-f posiada domeny V zdefiniowane przez następujące sekwencje polipeptydowe: - domena V łańcucha H: (SEQ ID nr 1) - domena V łańcucha L: 2 (SEQ ID nr 2). [0018] Ogólnie przeciwciało hb-f według wynalazku zawiera ponadto ludzki region stały (Fc). Ten region

8 stały może być wybrany spośród domen stałych z dowolnej klasy immunoglobulin, w tym IgM, IgG, IgD, IgA i IgE, oraz z dowolnego izotypu, w tym IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. Korzystne regiony stałe wybrane są spośród domen stałych IgG, zwłaszcza IgG 1. [0019] Niniejszy wynalazek obejmuje również dowolny fragment przeciwciała hb-f zawierający jego regiony V. Obejmuje to w szczególności fragmenty Fab, Fab', F(ab)' 2, Fv i scfv. [00] Wynalazek obejmuje również polinukleotyd wybrany spośród: - polinukleotydu kodującego polipeptyd o sekwencji oznaczonej SEQ ID nr 1; - polinukleotydu kodującego polipeptyd o sekwencji oznaczonej SEQ ID nr 2. [0021] Korzystnie polinukleotyd ten wybrany jest spośród: - polinukleotydu o sekwencji oznaczonej SEQ ID nr 3; - polinukleotydu o sekwencji oznaczonej SEQ ID nr 4. [0022] Polinukleotydy według wynalazku można łatwo wytwarzać dobrze znanymi metodami techniki rekombinacji DNA i(lub) chemicznej syntezy DNA. [0023] Polinukleotyd kodujący domenę V łańcucha H lub łańcucha L przeciwciała hb-f można poddawać fuzji z polinukleotydem kodującym region stały ludzkiego łańcucha H lub L, w celu uzyskania ekspresji pełnych łańcuchów H i L uzyskanych w ten sposób; można również dodać sekwencję kodującą peptyd sygnałowy umożliwiający wydzielanie białka. Te rekombinowane polinukleotydy są również częścią wynalazku. [0024] Niniejszy wynalazek dostarcza również kaset

9 ekspresyjnych, w których polinukleotyd według wynalazku jest połączony z odpowiednimi sekwencjami kontrolnymi umożliwiającymi regulację jego transkrypcji i translacji w wybranej komórce gospodarza, oraz rekombinowanych wektorów zawierających polinukleotyd lub kasetę ekspresyjną według wynalazku. [002] Te rekombinowane konstrukty DNA można uzyskać i wprowadzać do komórek gospodarza dobrze znanymi technikami rekombinacji DNA i inżynierii genetycznej. [0026] Niniejszy wynalazek obejmuje również komórkę gospodarza, transformowaną polinukleotydem według wynalazku. [0027] Użytecznymi komórkami gospodarza nadającymi się do zastosowania według niniejszego wynalazku mogą być komórki prokariotyczne lub eukariotyczne. Jako odpowiednie komórki eukariotyczne można wymienić na przykład komórki roślinne, komórki drożdży, takich jak Saccharomyces, komórki owadów, takich jak Drosophila lub Spodoptera, i komórki ssaków, takie jak HeLa, CHO, 3T3, C127, BHK, COS itd. [0028] Konstrukcję wektorów ekspresyjnych według wynalazku i transformację komórek gospodarza można prowadzić standardowymi technikami biologii molekularnej. [0029] Przeciwciało hb-f według wynalazku można wytwarzać przez hodowanie komórki gospodarza zawierającej wektor ekspresyjny zawierający sekwencję kwasu nukleinowego kodującą to przeciwciało, w warunkach odpowiednich do jego ekspresji, i odzyskiwanie tego przeciwciała z hodowli komórek gospodarza.

10 [0030] Niniejszy wynalazek obejmuje również kompozycję terapeutyczną zawierającą przeciwciało hb-f według wynalazku lub jego fragment, jak zdefiniowano powyżej. [0031] Korzystnie, kompozycja ta jest kompozycją do podawania pozajelitowego preparowaną w taki sposób, że pozwala na podawanie dawki od 0,1 do mg, korzystnie od 1 do mg hb-f. [0032] Bardziej szczegółowo, wynalazek obejmuje zastosowanie przeciwciała hb-f według wynalazku lub jego fragmentu, do wytwarzania kompozycji immunosupresyjnej. Taka kompozycja immunosupresyjna jest użyteczna w szczególności do leczenia lub profilaktyki chorób, takich jak odrzucenie przeszczepu, reakcja przeszczep przeciwko gospodarzowi lub reakcja gospodarz przeciwko przeszczepowi, lub chorób autoimmunologicznych obejmujących na przykład zapalenie mięśnia serca, cukrzycę, łuszczycę, tocznia rumieniowatego, chorobę Crohna, stwardnienie rozsiane, reumatoidalne zapalenie stawów itd. [0033] Twórcy wynalazku stwierdzili ponadto, że hb-f jest w stanie aktywować pewną szczególną podgrupę komórek T CD4 +, a mianowicie komórki CD4 + CD2 +. [0034] Regulatorowe komórki T CD2 + CD4 + (komórki Treg) stanowią -% obwodowych komórek T CD4 +. Opisali je po raz pierwszy w roku 199 Sakaguchi i wsp. (J. Immunol., 1: ) jako komórki regulatorowe u myszy. Po aktywacji te komórki są zdolne do hamowania aktywacji i proliferacji komórek T zarówno CD4 +, jak i CD8 +. W późniejszym okresie supresorowe komórki T CD2 + CD4 + wykryto również u ludzi (Jonuleit i wsp., J. Exp. Med. 193, , 01; Levings i wsp., J. Exp. Med. 193,

11 , 01; Dieckmann i wsp., J. Exp. Med. 193, ). Opublikowano wiele artykułów, opisujących immunosupresyjną rolę tych komórek w modelach różnych chorób autoimmunologicznych i w układach in vitro (omówienie można znaleźć na przykład w publikacji Shevach, J. Exp. Med., 193, 11, 41-46, 01). Wykazano również, że aktywowane ex vivo komórki Treg CD4 + CD2 + są skuteczne w zapobieganiu chorobie przeszczep przeciwko gospodarzowi (Taylor i wsp., Blood, 99, , 02; Cohen i wsp., J. Exp. Med. 196, , 02; Hoffmann i wsp., J Exp. Med. 196, , 02). Dostarczenie środków do aktywacji komórek Treg CD4 + CD2 + jest zatem bardzo interesujące. [003] Niniejszy wynalazek dotyczy również zastosowania przeciwciała hb-f według wynalazku lub rodzicielskiego przeciwciała B-F do aktywowania regulatorowych komórek T CD2+CD4+ in vitro. [0036] Korzystnie, przeciwciało hb-f według wynalazku dodaje się do regulatorowych komórek T CD2 + CD4 + w stężeniu od 1 g/ml do g/ml. [0037] Niniejszy wynalazek zostanie dokładniej zilustrowany przez następujący dodatkowy opis, w którym odwołano się do przykładów ilustrujących właściwości przeciwciał hb-f według wynalazku. Należy jednak rozumieć, że te przykłady podano jedynie celem ilustracji wynalazku i nie stanowią one w żadnym stopniu jego ograniczenia. PRZYKŁAD 1: KONSTRUKCJA HUMANIZOWANEGO B-F Projekt humanizowanych regionów V H i V K B-F [0038] Sekwencje DNA kodujące mysie regiony V H i V K B- F przedstawiono, odpowiednio, na Fig. 1 i Fig. 2 oraz

12 oznaczono identyfikatorami sekwencji SEQ ID nr i SEQ ID nr 6. Ludzkie V H i V K, na które przeszczepiono mysie CDR, wybrano poprzez przeszukanie baz danych pod kątem ludzkiego V H najbardziej podobnego do oryginalnych mysich V H i V K B-F. Największą homologię z V H B-F wykazuje region V H ludzkiego przeciwciała (M26; numer dostępu A36006). Największą homologię z V K B-F wykazuje region V K innego ludzkiego przeciwciała (FK- 001; NAKATANI i wsp., Biotechnology, 7 (1989), 80-8)). [0039] Skonstruowano dwa typy V K, różniące się między sobą tym, że 4. resztą była leucyna lub metionina, i oznaczono je jako L4L i L4M. Skonstruowano dwa typy V H, różniące się między sobą tym, że 37. resztą aminokwasową była leucyna lub walina, i oznaczono je jako H37L i H37V. Przyrównanie sekwencji polipeptydowych B-F, FK-001, L4L i L4M przedstawiono na Fig. 3. Przyrównanie sekwencji polipeptydowych B-F, M26, H37L, i H37V przedstawiono na Fig. 4. Reszty FR, opisywane uprzednio jako reszty o dużym znaczeniu dla upakowania CDR (Chothia i wsp., Nature, 342(1989), 877; Foote i wsp., J. Mol. Biol., 224(1992), 487), zaznaczono ramką. [0040] Poprzez połączenie tych V H i V K opracowano 4 wersje regionów V. Ekspresja humanizowanego B-F [0041] Następne etapy wytwarzania humanizowanego B-F były takie same jak ujawniono w patencie Stanów Zjednoczonych,886,12 w odniesieniu do humanizowanego B-B. [0042] Pokrótce, skonstruowano oddzielnie plazmidy

13 13 ekspresyjne łańcucha H (fuzja humanizowanego regionu V H z regionem stałym ludzkiego łańcucha -1 (TAKAHASHI i wsp., Cell, 29 (1982), )) i łańcucha L (fuzja humanizowanego regionu V K z regionem stałym ludzkiego łańcucha FK-001) humanizowanego B-F. W tych plazmidach ekspresja humanizowanego B-F jest kierowana przez promotor/wzmacniacz genu ludzkiej IgM monoklonalnej, FK-001. Fig. i 6 przedstawiają, odpowiednio, fragmenty plazmidów kodujących regiony V H i V K humanizowanego BF-. Sekwencje kodujące region V podkreślono; odpowiednie sekwencje polipeptydowe zaznaczono powyżej sekwencji nukleotydowej. Zarówno plazmidy jak i psv2neo jednocześnie wprowadzono do mysiej linii komórek szpiczaka Sp2/0 (ATCC CRL-181), stosując Lipofectin. Transfektomy wytwarzające ludzką IgG selekcjonowano za pomocą ELISA, stosując przeciwciało przeciwko ludzkiej IgG (łańcuch ), i przeciwciało przeciwko ludzkiej Ig (łańcuch ). PRZYKŁAD 2: OKREŚLANIE WŁAŚCIWOŚCI RÓŻNYCH WERSJI HUMANIZOWANEGO B-F Ocena aktywności wiązania CD4 [0043] Zebrano nadsącza z hodowli transfektom wytwarzających cztery wersje hb-f i zatężono je. Poszczególne przeciwciała oczyszczano z nadsączy z hodowli za pomocą chromatografii powinowactwa, z użyciem białka A Sepharose, i oceniano ich aktywność wiązania CD4 poprzez oznaczanie, za pomocą kompetytywnej ELISA, ich działania hamującego wiązanie biotynylowanego mb-f z rozpuszczalnym CD4 powleczonym na płytkach do mikromiareczkowania. Inkubację prowadzono przez 2 godziny w temperaturze 37 C i przez

14 14 noc w temperaturze 4 C. [0044] Względne aktywności wiązania poszczególnych hb- F (aktywność wiązania mb-f przyjęto za 0%) przedstawiono w poniższej tabeli I. Tabela I Przeciwciało Temp ( C) Względna aktywność wiązania (% mb-f) H37L/L4L H37L/L4M H37V/L4L 4-37 H37V/L4M [004] Z wyników przedstawionych w tabeli I wynika, że 37. reszta V H leucyna ma kluczowe znaczenie w utrzymywaniu aktywności wiązania CD4 przeciwciała hb- F, ponieważ aktywność wiązania CD4 ulega kilkukrotnemu zmniejszeniu wskutek konwersji 37 Leu w 37 Val. Stwierdzono natomiast, że reszta 4. V K nie jest tak istotna dla aktywności wiązania CD4. Jako że modelowanie molekularne nie uwidoczniło ewidentnej różnicy strukturalnej między 37 Leu a 37 Val V H, przewaga H37L względem H37V w aktywności wiązania CD4 była nieoczekiwana. [0046] Do oceny aktywności biologicznej in vitro wybrano H37L/L4L i H37L/L4M. Badanie aktywności biologicznych in vitro humanizowanego B-F [0047] Oceniano aktywności biologiczne mysiego B-F i humanizowanych B-F (IgG1 H37L/L4M i IgG1 H37L/L4L) in vitro. Testom poddano również humanizowane B-F typu

15 IgG2 (IgG2 H37L/L4M i IgG2 H37L/L4L). [0048] Aktywności biologiczne in vitro mb-f i czterech typów hb-f oceniano z wykorzystaniem jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC) od zdrowych dawców. PBMC aktywowano za pomocą ConA (2, μg/ml, 3 dni) lub PPD ( μg/ml, 4 dni) w obecności mysich lub humanizowanych B-F, i monitorowano ich odpowiedzi proliferacyjne na podstawie wbudowywania 3 H-tymidyny. [0049] Wyniki przedstawiono na Fig. 7 i 8. Mysie i humanizowane B-F były w stanie w umiarkowanym stopniu hamować proliferację indukowaną przez ConA, lecz aktywności poszczególnych przeciwciał i(lub) komórek pochodzących od różnych dawców różniła się (Fig. 7). Mysie i humanizowane B-F były także zdolne do hamowania swoistej antygenowo proliferacji PBMC indukowanej przez PPD (Fig. 8). [000] Typ IgG1 hb-f hamował proliferację indukowaną przez PPD skuteczniej (aż 70% hamowania, Fig. 7 i 8) niż mb-f. Typ IgG1 wykazywał, jak się wydaje, większą skuteczność niż typ IgG2, którego aktywność hamująca była niemal taka sama jak mb-f. W przypadku typu IgG1 H37L/L4M było skuteczniejsze niż H37L/L4L. Typy IgG2 H37L/L4M i H37L/L4L wykazywały niemal takie same aktywności hamujące. W skrócie, aktywności hamujące B- F przeciwko indukowanej przez PPD proliferacji PBMC były następujące: H37L/L4M IgG1 > H37L/L4L IgG1 > H37L/L4M IgG2 = H37L/L4L IgG2 = mb-f. [001] Uwzględniwszy skuteczność aktywności biologicznej in vitro i mniejszą liczbę mysich aminokwasów, do dalszych badań wybrano IgG1 H37L/L4M.

16 16 PRZYKŁAD 3: WSTĘPNA OCENA WPŁYWU hb-f NA PACJENTÓW Z REUMATOIDALNYM ZAPALENIEM STAWÓW (RA) [002] Wpływ hb-f (IgG1 H37L/L4M) badano u pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów (RA). [003] Warunki badania były następujące: [004] Każdemu pacjentowi podawano -dniowy kurs leczenia obejmujący wstrzyknięć po mg hb-f (jedno wstrzyknięcie co drugi dzień). [00] Wyniki u 3 różnych pacjentów przedstawiono w tabelach II-IV poniżej: 1 Pacjent 1 (tabela II): [006] Rozpoznanie: Reumatoidalne zapalenie stawów, aktywność 2 Czynnik reumatoidalny: 2; stadium: 2 Płeć: K; wiek: 6; Początek choroby: 196 Dodatkowa terapia: diklofenak mg dziennie 2 30

17 17 Tabela II Badania kliniczne Przed leczeniem W czasie leczenia (dni) Po leczeniu (tyg.) Ocena bólu w stawach 4, 2 2 1, 3 2,2 3, (0-) Sztywność poranna w minutach Nasilenie Lekarz , choroby (1-) Pacjent Liczba stawów z obrzękiem Liczba bolesnych stawów Wskaźnik obrzęków (0-30) Siła ręki Prawa Lewa Ocena zmęczenia (0-) 7,7 4 2,3 2 2,3 3,1 3 Ocena Pacjent efektów leczenia Lekarz OB Białko C-reaktywne 4,0 2 2, Pacjent 2 (tabela III): [007] Rozpoznanie: reumatoidalne zapalenie stawów, aktywność 3 Czynnik reumatoidalny: 2; stadium: 2 Płeć: K; wiek: 48; początek choroby: 00 Dodatkowa terapia: diklofenak mg dziennie

18 18 Tabela III Badania kliniczne Przed leczeniem W czasie leczenia (dni) Po leczeniu (tyg.) Ocena bólu w stawach 8,2 8,2 2,9 2,2 0,6 (0-) Sztywność poranna w minutach Nasilenie Lekarz choroby (1-) Pacjent Liczba stawów z obrzękiem Liczba bolesnych stawów Wskaźnik obrzęków (0-30) Siła ręki Prawa Lewa Ocena zmęczenia (0-) 8,7,1 2,2 2,2 1,1 0,7 Ocena efektów leczenia Pacjent / Lekarz / OB Białko C-reaktywne 1,2 0,2 0,8 Pacjent 3 (tabela IV): [008] Rozpoznanie: reumatoidalne zapalenie stawów, aktywność 3 Czynnik reumatoidalny: 3; stadium: 2 Płeć: K; wiek: 49; początek choroby: 1989 Dodatkowa terapia: diklofenak mg dziennie

19 19 Tabela IV Badania kliniczne Przed leczeniem W czasie leczenia (dni) Po leczeniu (tyg.) Ocena bólu w stawach 7,9 7,6 7,6 7,2,0 3,0 1, 1,3 (0-) Sztywność poranna w minutach Nasilenie Lekarz choroby (1-) Pacjent Liczba stawów z obrzękiem Liczba stawów bolesnych Wskaźnik obrzęków (0-30) Siła ręki Prawa Lewa Ocena zmęczenia (0-) 8, 7,2, Ocena Lekarz efektów leczenia Pacjent 3 4/3 4 4 OB Białko C-reaktywne 8 3,7 3,3 PRZYKŁAD 4: AKTYWACJA KOMÓREK Treg CD4 + CD2 + PRZEZ hb-f Izolowanie komórek T: 1) Regulatorowe komórki T (Treg): [009] - Izoluje się komórki CD2 + stosując mikrokulki CD2; - Zmniejsza się liczbę zanieczyszczeń komórek CD14-, CD8-, CD19-dodatnich za pomocą kulek CD14/CD8/CD19 DYNALbead;

20 Zmniejsza się liczbę komórek CD4RA + za pomocą mab CD4RA + antymysich DYNALbead: czystość:> 9% komórek Treg CD4 + CD2 + 2) Komórki efektorowe [0060] - Izoluje się komórki T CD4 + stosując mikrokulki CD4; - Zmniejsza się liczbę komórek CD4RO + za pomocą mab CD4RO + + antymysich DYNALbead; czystość:> 98% CD4/CD4RA +, CD2- efektorowych komórek T. 3) Układ testu Komórki Treg CD2 + od dawcy A poddawano współhodowli przez 2 dni z syngenicznymi PBMC po eliminacji CD2, bez dodatków (kontrola ujemna = brak aktywacji = brak aktywności immunosupresyjnej), lub w obecności 0, µg/ml anty-cd3 (OKT-3 = kontrola dodatnia = pełna aktywacja Treg), lub obecności µg/ml lub 30 µg/ml hb-f. Po intensywnym płukaniu wstępnie hodowanych komórek, komórki Treg CD2 + izoluje się i traktuje promieniowaniem (3000 radów). 4) Test aktywności supresyjnej: [0063] Wstępnie hodowane komórki Treg CD2 + poddaje się współhodowli przez 4 dni ze świeżo izolowanymi efektorowymi komórkami T CD4 + (1:1) od dawcy B w obecności APC (PBMC po eliminacji CD2) od dawcy A (syngeniczne w stosunku do wstępnie hodowanych komórek T (bez dodatkowej aktywacji), allogeniczne w stosunku do efektorowych komórek T (= reakcja allogenicznych, mieszanych limfocytów). Następnie komórki inkubuje się przez 16h z 3 H-tymidyną i wykrywa się proliferację efektorowych komórek T.

21 21 [0064] Wyniki przedstawiono na Fig. 9. [006] Legenda do Fig. 9: - kontrola ujemna (brak aktywacji) = precd2; - 0, μg/ml OKT-3 (kontrola dodatnia, pełna aktywacja) = precd2-cd3; - μg/ml hb-f (test 1) = precd2-cd4; - 30 μg/ml hb-f (test 2) = precd2-cd4. 1 Warunki [0066] 1) Humanizowane przeciwciało (hb-f) pochodzące z mysiego przeciwciała monoklonalnego anty-cd4 B-F, przy czym to przeciwciało hb-f zawiera domeny V zdefiniowane przez następujące sekwencje polipeptydowe: - domena V łańcucha H: (SEQ ID nr 1) - domena V łańcucha L: (SEQ ID nr 2). 2 2) Fragment przeciwciała hb-f według warunku 1, przy czym fragment ten zawiera domeny V o sekwencji oznaczonej SEQ ID nr 1 i SEQ ID nr 2. 3) Polinukleotyd wybrany spośród: - polinukleotydu zawierającego sekwencję kodującą domenę V łańcucha H o sekwencji oznaczonej SEQ ID nr 1; - polinukleotydu zawierającego sekwencję kodującą

22 22 1 domenę V łańcucha L o sekwencji oznaczonej SEQ ID nr 2. 4) Polinukleotyd według warunku 3, wybrany spośród: - polinukleotydu zawierającego sekwencję oznaczoną SEQ ID nr 3; - polinukleotydu zawierającego sekwencję oznaczoną SEQ ID nr 4. ) Kompozycja terapeutyczna zawierająca humanizowane przeciwciało według warunku 1 lub fragment według warunku 2. 6) Zastosowanie humanizowanego przeciwciała według warunku 1, lub fragmentu według warunku 2, do wytwarzania kompozycji immunosupresyjnej. 7) Zastosowanie humanizowanego przeciwciała według warunku 1 do aktywowania in vitro regulatorowych komórek T CD2 + CD4 +.

23 23 [0067] LISTA SEKWENCJI <1> DIACLONE 1 WIJDENES, John <1> HUMANIZOWANE PRZECIWCIAŁO ANTY-CD4 O WŁAŚCIWOŚCIACH IMMUNOSUPRESYJNYCH <130> MJP/ah-884/EP <160> 6 <170> PatentIn wersja 3.1 <2> 1 <211> 124 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Domena V łańcucha H humanizowanego przeciwciała hbf- <400> 1

24 24 <2> 2 <211> 111 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Domena V łańcucha humanizowanego przeciwciała hbf- <400> 2 1 <2> 3 <211> 372 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Domena V łańcucha H humanizowanego przeciwciała hbf- <400> 3

25 2 <2> 4 <211> 336 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Domena V łańcucha K humanizowanego przeciwciała hbf- <400> 4 <2> <211> 372 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 <2> 6 <211> 383 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 6

26 26 Zastrzeżenia patentowe 1 1. Humanizowane przeciwciało anty-cd4, zdolne do aktywacji regulatorowych komórek T CD4 + CD2 +, przy czym to humanizowane przeciwciało anty-cd4 zawiera sekwencję obejmującą regiony determinujące komplementarność (CDR) mysiego przeciwciała monoklonalnego anty-cd4 B-F, przy czym to mysie przeciwciało monoklonalne anty-cd4 B-F zawiera regiony V h i V k kodowane przez sekwencje oznaczone SEQ ID nr i SEQ ID nr Humanizowane przeciwciało anty-cd4 według zastrz. 1, które to przeciwciało otrzymane jest z mysiego przeciwciała monoklonalnego anty-cd4 B-F, którego regiony V h i V k są kodowane przez sekwencje oznaczone SEQ ID nr i SEQ ID nr Fragment przeciwciała, zawierający domeny V humanizowanego przeciwciała anty-cd4 jak określono w zastrz. 1 lub 2, zdolny do aktywacji regulatorowych komórek T CD4 + CD Polinukleotyd, zawierający sekwencję kodującą domenę V przeciwciała jak określono w zastrz. 1 lub 2.. Wektor ekspresyjny, zawierający polinukleotyd jak określono w zastrz Komórka gospodarza, zawierająca wektor ekspresyjny jak określono w zastrz.. 7. Kompozycja terapeutyczna, zawierająca przeciwciało jak określono w zastrz. 1 lub 2, albo fragment przeciwciała jak określono w zastrz Przeciwciało jak określono w zastrz. 1 lub 2,

27 27 albo fragment przeciwciała jak określono w zastrz. 3, do zastosowania jako lek. 9. Przeciwciało lub jego fragment według zastrz. 8, do leczenia lub profilaktyki odrzucenia przeszczepu, reakcji przeszczep przeciwko gospodarzowi lub reakcji gospodarz przeciwko przeszczepowi.. Przeciwciało lub jego fragment według zastrz. 8, do leczenia lub profilaktyki choroby autoimmunologicznej Przeciwciało lub jego fragment według zastrz., przy czym chorobą autoimmunologiczną jest zapalenie mięśnia serca, cukrzyca typu I, łuszczyca, toczeń rumieniowaty, choroba Crohna, stwardnienie rozsiane, reumatoidalne zapalenie stawów, wrzodziejące zapalenie jelita grubego albo atopowe zapalenie skóry. 12. Zastosowanie przeciwciała jak określono w zastrz. 1 lub 2, albo jego fragmentu jak określono w według zastrz. 3, do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki odrzucenia przeszczepu, reakcji przeszczep przeciwko gospodarzowi lub reakcji gospodarz przeciwko przeszczepowi. 13. Zastosowanie przeciwciała jak określono w zastrz. 1 lub 2, albo jego fragmentu jak określono w zastrz. 3, do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki choroby autoimmunologicznej. 14. Zastosowanie według zastrz. 13, przy czym chorobą autoimmunologiczną jest zapalenie mięśnia serca, cukrzyca typu I, łuszczyca, toczeń rumieniowaty, choroba Crohna, stwardnienie rozsiane, reumatoidalne zapalenie stawów, wrzodziejące zapalenie jelita grubego

28 28 albo atopowe zapalenie skóry. 1. Zastosowanie przeciwciała jak określono w według zastrz. 1 lub 2, albo fragmentu przeciwciała jak określono w zastrz. 3, do aktywowania in vitro regulatorowych komórek T CD4 + CD2 +. Biotest AG Pełnomocnik:

29 29 Fig. 1 1

30 30 Fig. 2 1

31 31 Fig. 3

32 32 Fig. 4

33 33 Fig. 1

34 34 Fig. 6 1

35 Fig. 7 3

36 36 Fig. 8

37 37 Fig. 9