(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (1) T3 Int.Cl. A61K 39/39 (06.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy /32 EP B1 (4) Tytuł wynalazku: Sposoby leczenia guzów litych wykazujących ekspresję antygenu powierzchniowego CD40 () Pierwszeństwo: US P US 279 P US 67 P US 6634 P (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 06/29 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 11/04 (73) Uprawniony z patentu: Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc., Emeryville, US XOMA Technology Ltd., Hamilton, BM (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 LI LONG, Emeryville, US MOHAMMAD LUQMAN, Emeryville, US ASHA YABANNAVAR, Emeryville, US ISABEL ZAROR, Emeryville, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Urszula Bartnik POLSERVICE KANCELARIA RZECZNIKÓW PATENTOWYCH SP. Z O.O. ul. Bluszczańska Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 2 1 2 EP B1 Opis patentowy DZIEDZINA WYNALAZKU [0001] Wynalazek dotyczy produktów leczniczych przeznaczonych do leczenia guzów litych oraz sposobów hamowania wzrostu guzów litych in vitro z użyciem antagonistycznych ludzkich przeciwciał anty-cd40, w których to guzach litych znajdują się komórki nowotworowe, wykazujące ekspresję komórkowego antygenu powierzchniowego CD40. TŁO WYNALAZKU [0002] CD40 jest komórkowym antygenem powierzchniowym o wielkości kda, występującym na powierzchni zarówno prawidłowych, jak i nowotworowych ludzkich komórek B, komórek dendrytycznych, komórek prezentujących antygen (APC), komórek śródbłonka, komórek monocytarnych i nabłonkowych, niektórych nowotworów komórek nabłonkowych i w wielu guzach litych, w tym w raku płuca, raku piersi, jajnika i okrężnicy. Ekspresja CD40 przebiega w komórkach transformowanych pochodzących od pacjentów z chłoniakami z komórek B o małej i dużej złośliwości, z ostrą białaczką limfoblastyczną z komórek B, szpiczakiem mnogim, przewlekłą białaczką limfocytową i z chłoniakiem Hodgkina. Ekspresję CD40 wykrywa się również w dwóch trzecich przypadków ostrej białaczki mieloblastycznej i w 0% chłoniaków związanych z AIDS. Złośliwe komórki B z kilku nowotworów linii komórek B wykazują wysoki stopień ekspresji CD40 i wydaje się, że ich przeżycie i proliferacja zależą od przekazywania sygnałów CD40. Do nowotworów wykazujących ekspresję CD40 należy rak pęcherza moczowego (Paulie i wsp. (1989) J. Immunol. 142: 90-9; Braesch-Andersen i wsp. (1989), J. Immunol. 142:

3 ), rak piersi (Hirano i wsp. (1999) Blood 93: ; Wingett i wsp. (1998) Breast Cancer Res. Treat. 0: 27-36); rak gruczołu krokowego (Rokhlin i wsp. (1997) Cancer Res. 7: ), rak nerkowokomórkowy (Kluth i wsp. (1997) Cancer Res. 7: ), rak niezróżnicowany jamy nosowo-gardłowej (UNPC) (Agathanggelou i wsp. (199) Am.J. Pathol. 147: ), rak płaskokomórkowy (SCC) (Amo i wsp. (00) Eur. J. Dermatol. : ; Posner i wsp. (1999) Clin. Cancer Res. : ), rak brodawkowaty tarczycy (Smith i wsp. (1999) Thyroid 9: 749-7), czerniak złośliwy skóry (van den Oord i wsp., (1996) Am. J. Pathol. 149: ), szpiczak mnogi (Maloney i wsp. (1999) Semin. Hematol. 36(1 Suppl.3, -33), komórki Hodgkina i Reed-Sternberga (komórki stymulowane) (Gruss i wsp. (1994) Blood 84: ), rak żołądka (Yamaguchi i wsp. (03) Int. J. Oncol. 23(6): ), mięsaki (patrz na przykład Lollini i wsp. (1998) Clin. Cancer Res. 4(8): , w którym opisano ludzkiego kostniakomięsaka i mięsaka Ewinga) i rak wątroby (patrz na przykład Sugimoto i wsp. (1999) Hepatology (4): 9-26, w którym opisano ludzkiego raka wątrobowokomórkowego). [0003] Antygen CD40 jest związany z ludzkim receptorem czynnika wzrostu nerwów (NGF), receptorem czynnika martwicy nowotworu α (TNF-α) i Fas, co sugeruje, że CD40 jest receptorem dla ligandu o funkcjach ważnych dla aktywacji komórek B. Wykazano, że pełni on krytyczną rolę w prawidłowym rozwoju i funkcjonowaniu komórek B. Ekspresja CD40 na komórkach APC pełni ważną kostymulującą rolę w aktywacji zarówno limfocytów T pomocniczych, jak i limfocytów T cytotoksycznych. Ekspresja receptora CD40 przebiega na aktywowanych komórkach T, na aktywowanych płytkach i na zapalnych komórkach mięśni gładkich naczyń krwionośnych. Receptory CD40 można również znaleźć na

4 4 1 2 eozynofilach, błonach maziowych w reumatoidalnym zapaleniu stawów, fibroblastach skóry i na innych, nielimfoidalnych typach komórek. Wiązanie CD40L z receptorem CD40 stymuluje proliferację i różnicowanie się komórek B, wytwarzanie przeciwciał, zmianę izotypu i powstawanie komórek B pamięci. Pomimo tego, że pewne komórki nowotworowe wykazują wysoki poziom ekspresji CD40, to rola przekazywania sygnałów CD40 w odniesieniu do ekspresji CD40 na tych komórkach nowotworowych jest mniej poznana. [0004] W publikacji WO-A-96/18413 ujawniono leczenie nowotworów w komórkach nabłonkowych i zapobieganie proliferacji komórek nabłonkowych przez użycie środka wiążącego receptor CD40. Ten środek wiążący receptor CD40 można stosować w połączeniu z co najmniej jednym środkiem przeciwnowotworowym i/lub środkiem indukującym CD40. W publikacji WO-A-02/06048 ujawniono przeciwciała immunoregulacyjne. Ujawniono kombinację terapii przeciwciałem do leczenia nowotworów z komórek B z użyciem przeciwciała immunoregulacyjnego, zwłaszcza przeciwciała anty-b7, anty-cd23 lub anty-cd40l i przeciwciała obniżającego poziom komórek B, zwłaszcza anty-cd19, anty- CD, anty-cd22 lub anty-cd37. [000] Większość przypadków nowotworów stanowią tak zwane guzy lite. Biorąc pod uwagę częstość ich występowania, potrzebne są sposoby leczenia tych nowotworów. STRESZCZENIE WYNALAZKU [0006] Przedmiotem wynalazku jest ludzkie przeciwciało monoklonalne anty-cd40, mające zdolność swoistego wiązania z antygenem CD40, które to przeciwciało monoklonalne jest wolne od znaczącej aktywności agonistycznej, jeśli jest związane z antygenem CD40, i to przeciwciało jest wybrane z grupy obejmującej:

5 1 2 a) przeciwciało monoklonalne wiążące się z epitopem zdolnym do związania przeciwciała monoklonalnego CHIR-.9 możliwego do otrzymania z linii komórek hybrydoma zdeponowanej w banku ATCC jako depozyt patentowy pod numerem PTA-42 albo przeciwciała monoklonalnego CHIR możliwego do otrzymania z linii komórek hybrydoma zdeponowanej w banku ATCC jako depozyt patentowy pod numerem PTA-43; b) przeciwciało monoklonalne wiążące się z epitopem zawierającym reszty ludzkiej sekwencji CD40 przedstawionej w sekwencji SEQ ID nr albo SEQ ID nr 12; c) przeciwciało monoklonalne wiążące się z epitopem zawierającym reszty ludzkiej sekwencji CD40 przedstawionej w sekwencji SEQ ID nr albo SEQ ID nr 12; d) przeciwciało monoklonalne współzawodniczące z przeciwciałem monoklonalnym CHIR-.9 otrzymywanym z linii komórek hybrydoma zdeponowanej w banku ATCC jako depozyt patentowy pod numerem PTA-42 albo z przeciwciałem monoklonalnym CHIR otrzymywanym z linii komórek hybrydoma zdeponowanej w banku ATCC jako depozyt patentowy pod numerem PTA-43, w próbie wiązania kompetycyjnego, do stosowania w leczeniu osobnika (człowieka) z powodu guza litego zawierającego komórki nowotworowe, w których przebiega ekspresja antygenu CD40. [0007] Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie skutecznej ilości ludzkiego przeciwciała monoklonalnego anty-cd40, mającego zdolność swoistego wiązania się z antygenem CD40, do wytwarzania leku do leczenia u osobnika (człowieka) guza litego zawierającego komórki nowotworowe, w których przebiega ekspresja antygenu CD40, przy czym to przeciwciało monoklonalne jest wolne od znaczącej aktywności agonistycznej, jeśli jest związane z antygenem CD40, i to przeciwciało jest wybrane z grupy obejmującej:

6 6 1 2 a) przeciwciało monoklonalne wiążące się z epitopem zdolnym do związania przeciwciała monoklonalnego CHIR-.9 możliwego do otrzymania z linii komórek hybrydoma zdeponowanej w banku ATCC jako depozyt patentowy pod numerem PTA-42 albo przeciwciała monoklonalnego CHIR możliwego do otrzymania z linii komórek hybrydoma zdeponowanej w banku ATCC jako depozyt patentowy pod numerem PTA-43; b) przeciwciało monoklonalne wiążące się z epitopem zawierającym reszty ludzkiej sekwencji CD40 przedstawionej w sekwencji SEQ ID nr albo SEQ ID nr 12; c) przeciwciało monoklonalne wiążące się z epitopem zawierającym reszty ludzkiej sekwencji CD40 przedstawionej w sekwencji SEQ ID nr albo SEQ ID nr 12; i d) przeciwciało monoklonalne współzawodniczące z przeciwciałem monoklonalnym CHIR-.9 otrzymywanym z linii komórek hybrydoma zdeponowanej w banku ATCC jako depozyt [0008] patentowy pod numerem PTA-42 albo z przeciwciałem monoklonalnym CHIR otrzymywanym z linii komórek hybrydoma zdeponowanej w banku ATCC jako depozyt patentowy pod numerem PTA-43, w próbie wiązania kompetycyjnego. [0009] Przedmiotem wynalazku jest również sposób in vitro hamowania wzrostu guza litego zawierającego komórki nowotworowe, w których przebiega ekspresja antygenu CD40, który to sposób polega na kontaktowaniu tych komórek ze skuteczną ilością ludzkiego przeciwciała monoklonalnego anty-cd40 zdolnego do swoistego wiązania z tym antygenem CD40, przy czym to przeciwciało monoklonalne jest wolne od znaczącej aktywności agonistycznej, jeśli jest związane z antygenem CD40, i to przeciwciało jest wybrane z grupy obejmującej:

7 7 1 2 a) przeciwciało monoklonalne wiążące się z epitopem zdolnym do związania przeciwciała monoklonalnego CHIR-.9 możliwego do otrzymania z linii komórek hybrydoma zdeponowanej w banku ATCC jako depozyt patentowy pod numerem PTA-42 albo przeciwciała monoklonalnego CHIR możliwego do otrzymania z linii komórek hybrydoma zdeponowanej w banku ATCC jako depozyt patentowy pod numerem PTA-43; b) przeciwciało monoklonalne wiążące się z epitopem zawierającym reszty ludzkiej sekwencji CD40 przedstawionej w sekwencji SEQ ID nr albo SEQ ID nr 12; c) przeciwciało monoklonalne wiążące się z epitopem zawierającym reszty ludzkiej sekwencji CD40 przedstawionej w sekwencji SEQ ID nr albo SEQ ID nr 12; i d) przeciwciało monoklonalne współzawodniczące z przeciwciałem monoklonalnym CHIR-.9 otrzymywanym z linii komórek hybrydoma zdeponowanej w banku ATCC jako depozyt patentowy pod numerem PTA-42 albo z przeciwciałem monoklonalnym CHIR otrzymywanym z linii komórek hybrydoma zdeponowanej w banku ATCC jako depozyt patentowy pod numerem PTA-43, w próbie wiązania kompetycyjnego. [00] Przedmiotem wynalazku jest również ludzkie przeciwciało monoklonalne anty-cd40, zdolne do swoistego wiązania z antygenem CD40, które to przeciwciało monoklonalne jest wolne od znaczącej aktywności agonistycznej, jeśli jest związane z antygenem CD40, i to przeciwciało jest wybrane z grupy obejmującej: a) przeciwciało monoklonalne wiążące się z epitopem zdolnym do związania przeciwciała monoklonalnego CHIR-.9 możliwego do otrzymania z linii komórek hybrydoma zdeponowanej w banku ATCC jako depozyt patentowy pod numerem PTA-42 albo przeciwciała monoklonalnego CHIR możliwego do

8 8 1 2 otrzymania z linii komórek hybrydoma zdeponowanej w banku ATCC jako depozyt patentowy pod numerem PTA-43; b) przeciwciało monoklonalne wiążące się z epitopem zawierającym reszty ludzkiej sekwencji CD40 przedstawionej w sekwencji SEQ ID nr albo SEQ ID nr 12; c) przeciwciało monoklonalne wiążące się z epitopem zawierającym reszty ludzkiej sekwencji CD40 przedstawionej w sekwencji SEQ ID nr albo SEQ ID nr 12; i d) przeciwciało monoklonalne współzawodniczące z przeciwciałem monoklonalnym CHIR-.9 otrzymywanym z linii komórek hybrydoma zdeponowanej w banku ATCC jako depozyt patentowy pod numerem PTA-42 albo z przeciwciałem monoklonalnym CHIR otrzymywanym z linii komórek hybrydoma zdeponowanej w banku ATCC jako depozyt patentowy pod numerem PTA-43, w próbie wiązania kompetycyjnego, do stosowania w hamowaniu wzrostu guza litego zawierającego komórki nowotworowe, w których przebiega ekspresja antygenu CD40. [0011] Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie skutecznej ilości ludzkiego przeciwciała monoklonalnego anty-cd40, mającego zdolność swoistego wiązania się z antygenem CD40, do wytwarzania leku do hamowania wzrostu guza litego zawierającego komórki nowotworowe, w których przebiega ekspresja antygenu CD40, przy czym to przeciwciało monoklonalne jest wolne od znaczącej aktywności agonistycznej, jeśli jest związane z antygenem CD40, i to przeciwciało jest wybrane z grupy obejmującej: a) przeciwciało monoklonalne wiążące się z epitopem zdolnym do związania przeciwciała monoklonalnego CHIR-.9 możliwego do otrzymania z linii komórek hybrydoma zdeponowanej w banku ATCC jako depozyt patentowy pod numerem PTA-42 albo przeciwciała monoklonalnego CHIR możliwego do

9 9 1 otrzymania z linii komórek hybrydoma zdeponowanej w banku ATCC jako depozyt patentowy pod numerem PTA-43; b) przeciwciało monoklonalne wiążące się z epitopem zawierającym reszty ludzkiej sekwencji CD40 przedstawionej w sekwencji SEQ ID nr albo SEQ ID nr 12; c) przeciwciało monoklonalne wiążące się z epitopem zawierającym reszty ludzkiej sekwencji CD40 przedstawionej w sekwencji SEQ ID nr albo SEQ ID nr 12; i d) przeciwciało monoklonalne współzawodniczące z przeciwciałem monoklonalnym CHIR-.9 otrzymywanym z linii komórek hybrydoma zdeponowanej w banku ATCC jako depozyt patentowy pod numerem PTA-42 albo z przeciwciałem monoklonalnym CHIR otrzymywanym z linii komórek hybrydoma zdeponowanej w banku ATCC jako depozyt patentowy pod numerem PTA-43, w próbie wiązania kompetycyjnego. [0012] Inne aspekty wynalazku są zawarte w załączonych zastrzeżeniach. KRÓTKI OPIS WYNALAZKU 2 [0013] Ujawniono sposoby leczenia osobnika z guzem litym, którego komórki nowotworowe wykazują ekspresję komórkowego antygenu powierzchniowego CD40. Sposoby te polegają na leczeniu tego osobnika antagonistycznym przeciwciałem monoklonalnym anty-dc40 albo jego fragmentem wiążącym antygen, które to przeciwciało jest wolne od znaczącej aktywności agonistycznej, jeśli jest związane z antygenem CD40 na ludzkiej komórce wykazującej ekspresję CD40. Wiązanie tego antagonistycznego przeciwciała monoklonalnego anty-cd40 (bądź jego odpowiedniego fragmentu wiążącego antygen, zawierającego część Fc tego antagonistycznego przeciwciała anty-cd40) z antygenem CD40 ulegającym ekspresji na komórkach nowotworowych powoduje zabijanie

10 1 2 tych komórek nowotworowych w mechanizmie cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC). W niektórych wykonaniach antagonistyczne przeciwciała anty-cd40 podaje się w połączeniu z jednym lub z większą liczbą innych protokołów terapii nowotworu, obejmujących między innymi zabieg chirurgiczny, napromienianie, chemioterapię, terapię cytokinową lub stosowanie innego przeciwciała monoklonalnego przeznaczonego do stosowania w leczeniu guza litego. Do guzów litych, które można leczyć lub którym można zapobiegać sposobami według niniejszego ujawnienia, należą między innymi rak jajnika, rak płuca (na przykład postacie płaskokomórkowa, gruczolakorak i wielkokomórkowa niedrobnokomórkowego raka płuc oraz drobnokomórkowy rak płuc), rak piersi, rak okrężnicy, nerki (w tym na przykład rak nerkowokomórkowy), rak pęcherza moczowego, rak wątroby (w tym na przykład raki wątrobowokomórkowe), rak żołądka, rak szyjki macicy, rak gruczołu krokowego, rak jamy nosowogardłowej, rak tarczycy (na przykład brodawkowaty rak tarczycy) i nowotwory skóry, takie jak czerniak i mięsaki (w tym na przykład kostniakomięsaki i mięsaki Ewinga). Ujawnia się również sposoby hamowania wzrostu guzów litych zawierających komórki nowotworowe, w których przebiega ekspresja CD40. [0014] Do przeciwciał odpowiednich do użycia w sposobach według wynalazku należą przeciwciała monoklonalne opisane w niniejszym opisie, wykazujące silne powinowactwo do CD40 i charakteryzujące się stałą równowagi dysocjacji (K D ) o wartości co najmniej -6 M, korzystnie od co najmniej około -7 M do około -8 M, korzystniej, od co najmniej około -8 M do około -12 M. Przeciwciała monoklonalne i ich fragmenty wiążące antygen, które są odpowiednie do stosowania w sposobach według wynalazku, mają zdolność

11 swoistego wiązania z ludzkim antygenem CD40 ulegającym ekspresji na powierzchni komórki ludzkiej, zwłaszcza ludzkiej komórki nowotworowej z guza litego. Są one pozbawione znaczącej aktywności agonistycznej, ale wykazują aktywność antagonisty, jeśli są związane z antygenem CD40 na komórkach ludzkich, co wykazano dla wykazujących ekspresję CD40 prawidłowych i nowotworowych ludzkich komórek B. Odpowiednie przeciwciała monoklonalne zawierają ludzkie regiony stałe; korzystnie, zawierają one również całkowicie lub częściowo humanizowane regiony zrębowe, a najkorzystniej, są przeciwciałami w pełni ludzkimi lub wiążącymi antygen fragmentami tych przeciwciał. [001] Przykładami takich przeciwciał monoklonalnych są przeciwciała oznaczone w niniejszym opisie symbolami CHIR-.9 i CHIR-12.12, które można wytwarzać techniką rekombinacji; przeciwciała monoklonalne wytwarzane przez linie komórek hybrydoma, oznaczone symbolem 131.2F8..9 (w niniejszym opisie nazwane linią komórkową.9) i 13.8E2.D.D (w niniejszym opisie nazwane linią komórkową 12.12); przeciwciało monoklonalne zawierające sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej sekwencję przedstawioną w sekwencji SEQ ID nr 6; sekwencję przedstawioną w sekwencji SEQ ID nr 7, sekwencję przedstawioną w sekwencji SEQ ID nr 8, zarówno sekwencję przedstawioną w SEQ ID nr 6, jak i sekwencję przedstawioną w SEQ ID nr 7 oraz zarówno sekwencję przedstawioną w SEQ ID nr 6, jak i sekwencję przedstawioną w SEQ ID nr 8; przeciwciało monoklonalne posiadające sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej sekwencję przedstawioną w sekwencji SEQ ID nr 2, sekwencję przedstawioną w SEQ ID nr 4, sekwencję przedstawioną w SEQ ID nr, zarówno sekwencję przedstawioną w SEQ ID nr 2, jak i sekwencję przedstawioną w SEQ ID nr 4 oraz zarówno

12 sekwencję przedstawioną w SEQ ID nr 2, jak i sekwencję przedstawioną w SEQ ID nr ; przeciwciało monoklonalne o sekwencji aminokwasowej kodowanej przez cząsteczkę kwasu nukleinowego o sekwencji nukleotydowej wybranej z grupy obejmującej sekwencję przedstawioną w SEQ ID nr 1, sekwencję przedstawioną w SEQ ID nr 3 i zarówno sekwencję przedstawioną w SEQ ID nr 1, jak i sekwencję przedstawioną w SEQ ID nr 3; wiążące antygen te fragmenty tych przeciwciał monoklonalnych, które zachowały zdolność swoistego wiązania z ludzkim CD40 i które są wolne od znaczącej aktywności agonistycznej, ale wykazują aktywność antagonisty po związaniu z antygenem CD40 na komórkach ludzkich, czego dowiedziono w odniesieniu do wykazujących ekspresję CD40 prawidłowych i nowotworowych ludzkich komórkach B. Przykłady takich przeciwciał monoklonalnych obejmują również przeciwciało monoklonalne, które wiąże się z epitopem zdolnym do wiązania przeciwciała monoklonalnego wytwarzanego przez linię komórek hybrydoma albo przeciwciała monoklonalnego wytwarzanego przez linię komórek hybrydoma.9; przeciwciało monoklonalne, które wiąże się z epitopem zawierającym reszty sekwencji aminokwasowej przedstawionej w sekwencji SEQ ID nr albo SEQ ID nr 12; przeciwciało monoklonalne, które współzawodniczy z przeciwciałem monoklonalnym CHIR albo CHIR-.9 w próbie wiązania kompetycyjnego oraz przeciwciało monoklonalne, które jest wiążącym antygen fragmentem przeciwciała monoklonalnego CHIR albo dowolnym spośród powyższych przeciwciał monoklonalnych, którego fragment zachowuje zdolność swoistego wiązania z ludzkim antygenem CD40 i wykazuje aktywność antagonisty po związaniu z tym antygenem, czego dowiedziono w odniesieniu do wykazujących ekspresję CD40 prawidłowych i nowotworowych ludzkich komórek B.

13 13 1 [0016] W jednym z wykonań niniejszego wynalazku sposoby leczenia obejmują podawanie pacjentowi skutecznej leczniczo dawki kompozycji farmaceutycznej zawierającej odpowiednie antagonistyczne przeciwciała anty-cd40 albo wiążące antygen ich fragmenty. Skuteczna leczniczo dawka przeciwciała anty- CD40 lub jego fragmentu zawiera się w zakresie od około 0,01 mg/kg do około 40 mg/kg, od około 0,01 mg/kg do około mg/kg, od około 0,1 mg/kg do około mg/kg, od około 1 mg/kg do około mg/kg, od około 3 mg/kg do około mg/kg, od około 3 mg/kg do około 2 mg/kg, od około 3 mg/kg do około mg/kg, od około mg/kg do około 1 mg/kg, od około 7 mg/kg do około 12 mg/kg. Przyjmuje się, że ten sposób leczenia może w sobie zawierać pojedyncze podanie dawki skutecznej leczniczo albo wielokrotne podawanie dawki skutecznej leczniczo antagonistycznego przeciwciała anty- CD40 albo wiążącego antygen jego fragmentu. [0017] Antagonistyczne przeciwciała anty-cd40 zidentyfikowane w opisie jako odpowiednie do stosowania w sposobach według wynalazku można modyfikować. Modyfikacje tych antagonistycznych przeciwciał anty-cd40 obejmują między innymi aktywne immunologicznie chimerowe przeciwciała anty-cd40, humanizowane przeciwciała anty-cd40 i aktywne immunologicznie mysie przeciwciała anty-cd40. KRÓTKI OPIS RYSUNKÓW 2 [0018] Na Fig. 1 przedstawiono sekwencje aminokwasowe łańcuchów lekkiego i ciężkiego mab CHIR Na Fig. 1A przedstawiono regiony: liderowy (reszty 1- SEQ ID nr 2), zmienny (reszty SEQ ID nr 2) i stały (reszty SEQ ID nr 2) łańcucha lekkiego. Na Fig. 1B przedstawiono regiony: liderowy (reszty 1-19 SEQ ID nr 4), zmienny (reszty -139 SEQ ID nr 4) i stały (reszty SEQ ID

14 nr 4) łańcucha ciężkiego. Alternatywny region stały dla łańcucha ciężkiego z mab CHIR przedstawiony na Fig. 1B odzwierciedla zamianę reszty alaniny na resztę seryny w pozycji 13 w SEQ ID nr 4. Całkowitą sekwencję tego wariantu łańcucha ciężkiego mab CHIR przedstawiono w SEQ ID nr. Fig. 2 przedstawia sekwencję kodującą łańcucha lekkiego (Fig. 2A; SEQ ID nr 1) i łańcucha ciężkiego (Fig. 2B; SEQ ID nr 3) mab CHIR Fig. 3 przedstawia sekwencje aminokwasowe łańcuchów lekkiego i ciężkiego mab CHIR-.9. Na Fig. 3A przedstawiono regiony: liderowy (reszty 1- SEQ ID nr 6), zmienny (reszty SEQ ID nr 6) i stały (reszty SEQ ID nr 6) łańcucha lekkiego. Na Fig. 3B przedstawiono regiony: liderowy (reszty 1-19 SEQ ID nr 7), zmienny (reszty -144 SEQ ID nr 7) i stały (reszty SEQ ID nr 7) łańcucha ciężkiego. Alternatywny region stały łańcucha ciężkiego mab CHIR-.9 przedstawiony na Fig. 3B odzwierciedla zamianę reszty alaniny na resztę seryny w pozycji 18 w SEQ ID nr 7. Całkowitą sekwencję tego wariantu łańcucha ciężkiego mab CHIR-.9 przedstawiono na SEQ ID nr 8. Fig. 4 przedstawia sekwencję kodującą (Fig. 4A; SEQ ID nr 9) krótkiej izoformy ludzkiego CD40 (sekwencja aminokwasowa przedstawiona na Fig. 4B; SEQ ID nr ) i sekwencję kodującą (Fig. 4C; SEQ ID nr 11) długiej izoformy ludzkiego CD40 (sekwencja aminokwasowa przedstawiona na Fig. 4D). Fig. przedstawia aktywność cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (aktywność ADCC) przeciwciał monoklonalnych CHIR-.9 i CHIR w próbach na liniach komórek raka jajnika SKO3 (Fig. A) i Hey (Fig. B), na linii raka płaskokomórkowego skóry A431 (Fig. C) i linii komórek raka okrężnicy HCT116 (Fig. D).

15 1 1 2 Fig. 6 przedstawia aktywność cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (aktywność ADCC) przeciwciał monoklonalnych CHIR-.9 i CHIR w próbach na liniach komórek raka piersi MDA-MB231 (Fig. 6A) i MDA-MB43 (Fig. 6B) oraz na liniach komórek raka płuc NCI-H460 (Fig. 6C) i SK-MES-1 (Fig. 6D). Fig. 7 przedstawia aktywność przeciwnowotworową in vivo przeciwciał monoklonalnych CHIR-.9 (oznaczonych na tym rysunku jako.9) i CHIR (oznaczonych na tym rysunku jako 12.12) z użyciem modelu przeszczepu heterogenicznego raka okrężnicy opartego na linii komórek ludzkiego raka okrężnicy HCT116. Fig. 8 przedstawia wpływ dootrzewnowo podanego przeciwciała monoklonalnego anty-cd40, CHIR (oznaczonego na rysunku symbolem 12.12) albo przeciwciała monoklonalnego anty-her2 Herceptin na procentowe przeżycie w modelu mysiego ortotopowego raka jajnika bez określania stadium, z użyciem ludzkiej linii raka jajnika SKOV3i.p.1. Na Fig. 9 porównano skutki dootrzewnowego względem dożylnego podania przeciwciała monoklonalnego CHIR (oznaczonego na rysunku symbolem 12.12) albo leku Herceptin na procentowe przeżycie w modelu mysiego ortotopowego raka jajnika bez określania stadium, z użyciem ludzkiej linii raka jajnika SKOV3i.p.1. Fig. przedstawia aktywność przeciwnowotworową in vivo przeciwciała monoklonalnego CHIR (oznaczonego na rysunku symbolem 12.12) i CHIR-.9 ( oznaczonego na rysunku symbolem.9) względem aktywności obserwowanej dla leku Herceptin w modelu mysiego ortotopowego raka jajnika bez określania stadium, z użyciem ludzkiej linii raka jajnika SKOV3i.p.1.

16 Fig. 11 przedstawia temperaturę topnienia CHIR w preparatach o różnych wartościach ph, oznaczaną metodą różnicowej kalorymetrii skaningowej (DSC). SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU [0019] W niniejszym opisie, określenie nowotwór odnosi się do każdego nowotworowych wzrostu i proliferacji komórek, zarówno złośliwego, jak i łagodnego, i do wszystkich przednowotworowych i nowotworowych komórek i tkanek. Termin guz lity odnosi się do raka lub nowotworu tkanek organizmu innych niż krew, szpik kostny i układ limfatyczny. [00] Terminy nowotwór i nowotworowy odnoszą się do stanu fizjologicznego lub opisują stan fizjologiczny u ssaków, który z zasady cechuje się nieregulowanym wzrostem komórek. Przykłady nowotworów, które klasyfikuje się jako guzy lite, obejmują między innymi raka płuca, raka piersi, raka jajnika, raka okrężnicy, raka wątroby, raka żołądka, raka gruczołu krokowego i nowotwory skóry. [0021] Przeciwciała i immunoglobuliny (Ig) są glikoproteinami o takich samych cechach charakterystycznych struktury. Podczas gdy przeciwciała wykazują swoistość wiązania z antygenem, immunoglobuliny obejmują zarówno przeciwciała, jak i inne cząsteczki przeciwciałopodobne, niewykazujące swoistości względem konkretnego antygenu. Polipeptydy tego ostatniego rodzaju są na przykład wytwarzane w małej ilości przez układ limfatyczny, a na podwyższonym poziomie przez szpiczaki. [0022] Termin przeciwciało stosuje się w najszerszym znaczeniu tego słowa; obejmuje on przeciwciała o całkowitej konstrukcji, fragmenty przeciwciał, które mają zdolność wiązania z antygenem (np. Fab, Fab (ab) 2, Fv, przeciwciała jednołańcuchowe, diabodies) i peptydy rekombinowane zawierające powyższe jednostki.

17 [0023] Termin przeciwciało monoklonalne stosowany w niniejszym opisie odnosi się do przeciwciała uzyskanego z populacji zasadniczo homogennych przeciwciał, to znaczy, że poszczególne przeciwciała zawarte w danej populacji są identyczne, z wyjątkiem możliwych, pojawiających się w sposób naturalny mutacji, które mogą występować w niewielkich ilościach. [0024] Przeciwciała natywne i immunoglobuliny natywne są na ogół glikoproteinami heterotetramerycznymi o wielkości około 000 daltonów, złożonymi z dwóch identycznych łańcuchów lekkich (L) i dwóch identycznych łańcuchów ciężkich (H). Każdy łańcuch lekki jest połączony z łańcuchem ciężkim jednym kowalencyjnym wiązaniem dwusiarczkowym, natomiast liczba wiązań dwusiarczkowych jest różna w różnych izotypach immunoglobulin. Każdy łańcuch ciężki i lekki ma również regularnie rozmieszczone wewnątrzłańcuchowe mostki dwusiarczkowe. Każdy łańcuch ciężki ma na jednym końcu domenę zmienną (V H ), po której następuje wiele domen stałych. Każdy łańcuch lekki ma na jednym końcu domenę zmienną (V L ), a na drugim końcu domenę stałą; domena stała łańcucha lekkiego jest dopasowana do pierwszej stałej domeny stałej łańcucha ciężkiego, a domena zmienna łańcucha lekkiego jest dopasowana do domeny zmiennej łańcucha ciężkiego. Przypuszcza się, że poszczególne reszty aminokwasowe tworzą powierzchnię graniczną pomiędzy domenami zmiennymi łańcuchów lekkich i ciężkich. [002] Termin zmienny odnosi się do faktu, że niektóre części domen zmiennych różnych przeciwciał różnią się znacząco pod względem sekwencji i mają one znaczenie w wiązaniu i swoistości każdego konkretnego przeciwciała względem jego konkretnego antygenu. Jednakże, zmienność nie

18 jest równomiernie rozmieszczona w domenach zmiennych przeciwciał. Koncentruje się ona w trzech segmentach zwanych regionami determinującymi dopasowanie (CDR) albo regionami hiperzmiennymi, zarówno w domenach zmiennych łańcuchów lekkich, jak i ciężkich. Części o wyższej konserwatywności domen zmiennych nazywane są regionami zrębowymi (FR). Każda z domen zmiennych natywnych łańcuchów ciężkich i lekkich zawiera cztery regiony FR, w większości przyjmujących konfigurację pasma β, połączonych przez trzy CDR, tworzące pętle łączące, a w niektórych przypadkach tworzące część struktury pasma β. W każdym łańcuchu regiony CDR utrzymywane są w ścisłym sąsiedztwie przez regiony FR i razem z regionami CDR z innego łańcucha przyczyniają się do powstania miejsca wiązania antygenu w przeciwciele (patrz Kabat i wsp. (1991) NIH Publ. nr , tom I, strony ). [0026] Regiony stałe nie są bezpośrednio zaangażowane w wiązanie przeciwciała z antygenem, ale wykazują różne funkcje efektorowe, takie jak wiązanie receptora Fc (FcR), udział przeciwciała w zależnej od przeciwciała toksyczności komórkowej, opsonizacja, inicjowanie cytotoksyczności zależnej od dopełniacza i degranulacja komórek tucznych. [0027] Termin region hiperzmienny w niniejszym opisie odnosi się do reszt aminokwasowych przeciwciała odpowiedzialnych za wiązanie antygenu. Region hiperzmienny zawiera reszty aminokwasowe z regionu determinującego dopasowanie, czyli CDR (to jest, reszty (L1), 0-6 (L2) i (L3) w domenie zmiennej łańcucha lekkiego i 31-3 (H1), 0-6 (H2) i 9-2 (H3) w domenie zmiennej łańcucha ciężkiego; Kabat i wsp. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (wydanie, Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD, USA) i/lub reszty z pętli hiperzmiennej (czyli reszty 26-

19 (L1), 0-2 (L2) i (L3) w domenie zmiennej łańcucha lekkiego oraz (H1), 3- (H2) i 96-1 (H3) w domenie zmiennej łańcucha ciężkiego; Clothia i Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: ). Resztami regionu zrębowego, czyli FR, są reszty z domeny zmiennej inne niż reszty regionu hiperzmiennego. [0028] Fragmenty przeciwciała zawierają część nienaruszonego przeciwciała, korzystnie region wiążący antygen albo region zmienny nienaruszonego przeciwciała. Przykłady fragmentów przeciwciała obejmują fragmenty Fab, Fab, F(ab )2 i Fv; diabodies; przeciwciała liniowe (Zapata i wsp. (199) Protein Eng. 8(): 7-62); jednołańcuchowe cząsteczki przeciwciała; i przeciwciała wieloswoiste utworzone z fragmentów przeciwciał. Trawienie przeciwciał papainą daje dwa identyczne fragmenty wiążące antygen, zwane fragmentami Fab, każdy z pojedynczym miejscem wiążącym antygen i pozostały fragment Fc, którego nazwa odzwierciedla zdolność łatwej krystalizacji. Trawienie pepsyną daje fragment F(ab )2, który ma dwa miejsca wiązania antygenu i zachowuje zdolność sieciowania antygenu. [0029] Fv jest minimalnym fragmentem przeciwciała, zawierającym całkowite miejsce rozpoznania antygenu i miejsce wiązania. W typach zawierających dwa łańcuchy Fv ten region składa się z dimeru jednego łańcucha ciężkiego i jednego łańcucha lekkiego w domenie zmiennej, pozostających w ścisłej asocjacji niekowalencyjnej. W typach jednołańcuchowych Fv jedna domena zmienna łańcucha ciężkiego i jedna łańcucha lekkiego mogą być połączone kowalencyjnie przez elastyczny łącznik peptydowy, w taki sposób, że łańcuchy lekki i ciężki mogą asocjować do struktury dimerycznej analogicznej do tej, jaka występuje w dwułańcuchowych gatunkach Fv. W tej właśnie konfiguracji

20 1 2 dzieje się tak, że trzy regiony CDR z każdej domeny zmiennej oddziałują ze sobą, określając miejsce wiązania antygenu na powierzchni dimeru V H -V L. Sześć regionów CDR razem nadaje przeciwciału swoistość wiązania antygenu. Jednakże, nawet pojedyncza domena zmienna (albo połowa Fv zawierająca jedynie trzy CDR swoiste dla antygenu) ma zdolność rozpoznawania i wiązania antygenu, jakkolwiek z niższym powinowactwem niż całkowite miejsce wiązania. [00] Fragment Fab również zawiera domenę stałą łańcucha lekkiego i pierwszą domenę stałą (C H 1) łańcucha ciężkiego. Fragmenty Fab różnią się od fragmentów Fab tym, że mają dodanych kilka reszt przy końcu karboksylowym w domenie C H 1 łańcucha ciężkiego, w tym jedną albo większą liczbę reszt cysteinowych z regionu zawiasowego przeciwciała. W niniejszym opisie Fab -SH oznacza Fab, w którym reszta (reszty) cysteiny z domen stałych zawierają wolną grupę tiolową. Fragmenty przeciwciała F(ab )2 pierwotnie wytwarzano jako pary fragmentów Fab, pomiędzy którymi znajdowały się zawiasowe cysteiny. Znane są również inne sprzężenia chemiczne fragmentów przeciwciał. [0031] Łańcuchy lekkie przeciwciał (immunoglobulin) z gatunków kręgowców można przypisać do jednego z dwóch wyraźnie różniących się typów, zwanych kappa (κ) i lambda (λ), na podstawie sekwencji aminokwasowych ich domen stałych. [0032] Zależnie od sekwencji aminokwasowych domeny stałej ich łańcuchów ciężkich, immunoglobuliny można przypisać do różnych klas. Istnieje pięć głównych klas immunoglobulin ludzkich: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a kilka z nich można dalej podzielić na podklasy (izotypy), np. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA i IgA2. Domeny stałe łańcuchów ciężkich, które odpowiadają tym różnym klasom immunoglobulin, nazwane

21 21 1 są odpowiednio: alfa, delta, epsilon, gamma i mu. Dobrze poznano struktury podjednostek i konfiguracje przestrzenne (trójwymiarowe) różnych klas immunoglobulin. Różne izotypy mają różne funkcje efektorowe. Izotypy ludzkiej IgG1 i IgG3 pośredniczą na przykład w aktywności opartej na cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC). [0033] Słowo znacznik stosowane w niniejszym opisie odnosi się do wykrywalnego związku lub kompozycji, która jest sprzężona bezpośrednio lub pośrednio z przeciwciałem, generując znakowane przeciwciało. Znacznik może być wykrywalny jako taki (np. mogą to być znaczniki radioizotopowe lub fluorescencyjne) albo, w przypadku znaczników enzymatycznych, może katalizować zmianę chemiczną będącego substratem związku lub kompozycji, która jest wykrywalna. Do radionuklidów, które mogą służyć jako wykrywalne znaczniki, należą na przykład 131 I, 123 I, 12 I, 90 Y, 188 Re, 186 Re, 211 At, 67 Cu, 212 Bi i 9 Pd. Znacznikiem może 2 też być jednostka niewykrywalna, taka jak toksyna. [0034] Termin antagonista jest stosowany w najszerszym znaczeniu i obejmuje każdą cząsteczkę, która częściowo lub całkowicie blokuje, hamuje lub neutralizuje aktywność biologiczną natywnego celu, ujawnioną w niniejszym opisie, lub transkrypcję bądź translację tej cząsteczki. [003] W niniejszym opisie termin nośniki obejmuje dopuszczalne farmaceutycznie nośniki, substancje pomocnicze lub środki stabilizujące, które nie są toksyczne dla komórki lub ssaka eksponowanego na ten nośnik w stosowanych dawkach i stężeniu. Nośnikiem dopuszczalnym fizjologicznie jest często roztwór wodny o buforowanej wartości ph. Przykłady fizjologicznie dopuszczalnych nośników obejmują bufory takie jak fosforan, cytrynian, bursztynian i inne kwasy organiczne; środki przeciwutleniające, w tym kwas

22 askorbinowy; polipeptydy o niskiej masie cząsteczkowej (poniżej około reszt); białka, takie jak albumina surowicy, żelatyna lub immunoglobuliny; polimery hydrofilowe, takie jak poliwinylopirolidon; aminokwasy, takie jak glicyna, glutamina, asparagina, arginina lub lizyna; monosacharydy, disacharydy i inne węglowodany, w tym glukoza, mannoza lub dekstryny; środki chelatujące, takie jak EDTA; alkohole cukrowe, takie jak mannitol albo sorbitol; przeciwjony tworzące sole, takie jak sód, i/lub niejonowe związki powierzchniowo czynne, takie jak TWEEN, glikol polietylenowy (PEG) i środki dostarczane na rynek pod nazwami Pluronic. Stosowanie w połączeniu z jednym lub z większą liczbą dalszych środków leczniczych obejmuje stosowanie jednoczesne (wspólne) i kolejne, w dowolnym porządku. [0036] W niniejszym opisie określenie komórka gospodarza odnosi się do drobnoustroju lub komórki eukariotycznej albo linii komórkowej hodowanej jako jednostka jednokomórkowa, która może być użyta lub została użyta jako biorca rekombinowanego wektoru albo innych polinukleotydów transferowych i obejmuje potomstwo pierwszej komórki, która została transfekowana. Rozumie się, że potomstwo jednej komórki niekoniecznie musi być całkowicie identyczne pod względem morfologii bądź struktury genomowej albo całkowitego komplementarnego DNA z pierwotną komórką rodzicielskiej ze względu na mutację naturalną, przypadkową lub zamierzoną. [0037] Ludzkie komórki efektorowe są leukocytami, w których przebiega ekspresja jednego lub większej liczby FcR i które wykazują funkcje efektorowe. Korzystnie, w komórkach tych przebiega ekspresja co najmniej FcγRIII i wykazują one funkcję efektorową cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC). Przykładami ludzkich

23 23 1 leukocytów, które pośredniczą w ADCC, są jednojądrzaste komórki krwi obwodowe (PBMC), komórki naturalni zabójcy (NK), monocyty, makrofagi, eozynofile i neutrofile, przy czym korzystne są komórki PBMC i NK. Przeciwciałami, które wykazują aktywność ADCC, są na ogół przeciwciała izotypu IgG1 lub IgG3. Należy zauważyć, że poza izolowaniem przeciwciał IgG1 i IgG3 takie przeciwciała pośredniczące w ADCC można uzyskać przez zmianę drogą inżynierii genetycznej regionu zmiennego z przeciwciała nie-adcc albo z fragmentu regionu zmiennego na region stały izotypu IgG1 lub IgG3. [0038] Terminy receptor Fc albo FcR odnoszą się do receptora, który wiąże się z regionem Fc przeciwciała. Korzystnym FcR jest ludzki FcR o sekwencji natywnej. Poza tym, korzystnym FcR jest receptor, który wiąże przeciwciało IgG (receptor gamma) i obejmuje receptory z podklas FcγRI, FcγRII i FcγRIII, w tym warianty alleliczne i ewentualnie rozszczepione formy tych receptorów. Do receptorów FcγRII 2 należą: FcγRIIA ( receptor aktywujący i FcγRIIB ( receptor hamujący ), które mają podobne sekwencje aminokwasowe, różniące się głównie w swych domenach cytoplazmatycznych. Receptor aktywujący FcγRIIA zawiera w domenie cytoplazmatycznej motyw immunoreceptorowy aktywujący oparty na tyrozynie (ITAM). Receptor hamujący FcγRIIB zawiera w domenie cytoplazmatycznej motyw immunoreceptorowy hamujący oparty na tyrozynie (ITIM) (patrz Daeron (1997) Annu. Rev. Immunol. 1: 3-234). Przegląd receptorów FcR znajduje się w publikacjach: Ravetch i Kinet (1991) Annu. Rev. Immunol. 9: (1991); Capel i wsp. (1994) Immunomethods 4: 2-34 i de Haas i wsp. (199) J. Lab. Clin. Med. 126: Terminem FcR objęte są też inne FcR, również te, które zostaną zidentyfikowane w przyszłości. Termin ten obejmuje

24 również receptor noworodkowy, FcRn, odpowiadający za przenoszenie matczynych IgG do płodu (Guyer i wsp. (1976) J. Immunol. 117: 87 i Kim i wsp. (1994) J. Immunol. 24: 249 (1994). [0039] Istnieje wiele sposobów wytwarzania ludzkich przeciwciał. Komórki je wydzielające można na przykład unieśmiertelniać przez zakażenie wirusem Epsteina-Barr (EBV). Komórki zakażone wirusem EBV są jednak trudne do klonowania i na ogół wytwarzają stosunkowo niewielkie ilości immunoglobuliny (James i Bell (1987) J. Immunol. Methods 0: -40). W przyszłości prawdopodobnie będzie można unieśmiertelniać ludzkie komórki B przez wprowadzenie określonej kombinacji genów transformujących. Taką możliwość podkreślono przez niedawne wykazanie, że ekspresja katalitycznej podjednostki telomerazy razem z dużą onkoproteiną SV40 oraz onkogennym allelem H-ras powoduje przemianę prawidłowych ludzkich komórek nabłonkowych i fibroblastów w komórki nowotworowe (Hahn i wsp. (1999) Nature 400: ). Obecnie istnieje możliwość wytwarzania zwierząt transgenicznych (np. myszy), które w wyniku immunizacji mają zdolność wytwarzania całego asortymentu ludzkich przeciwciał przy braku możliwości wytwarzania immunoglobuliny endogennej (Jakobovits i wsp. (1993) Nature 362: 2-28; Lonberg i Huszar (199) Int. Rev. Immunol. 13: 6-93; Fishwild i wsp. (1996) Nat. Biotechnol. 14: 84-81; Mendez i wsp. (1997) Nat. Genet. 1: ; Green (1999) J. Immunol. Methods 231: 11-23; Tomizuka i wsp. (00) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: ; przegląd dokonany przez Little a i wsp. (00) Immunol. Today 21: ). Opisano na przykład, że homozygotyczna delecja w genie regionu łączącego łańcuch ciężki (J H ) przeciwciała linii komórek chimerycznych i zarodkowych zmutowanych myszy powoduje całkowite

25 2 1 zahamowanie wytwarzania endogennego przeciwciała (Jakobovits i wsp. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 21-2). Przeniesienie tego zbioru genów ludzkiej immunoglobuliny linii zarodkowej do takich myszy zmutowanych linią zarodkową wywołuje wytwarzanie ludzkich przeciwciał w wyniku prowokacji antygenem (Jakobovits i wsp. (1993) Nature 362: 2-28). Mendez i wsp. (1997) Nature Genetics 1: ) wygenerowali linię transgenicznych myszy, które po prowokacji antygenem wytwarzały w pełni ludzkie przeciwciała o dużym powinowactwie. Uzyskano to przez włączenie poprzez linię zarodkową loci ludzkiego łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego o wielkości milionów par zasad do myszy z delecją w endogennym segmencie J H opisanym powyżej. W organizmie tych myszy (XenoMouse II Technology; Abgenix; Fremont, Kalifornia, USA) znajduje się locus ludzkiego łańcucha ciężkiego o wielkości kb, zawierające około 66 genów V H, pełnych regionów D H i J H i trzech różnych regionów stałych, jak również ludzki locus κ o wielkości 800 kb, obejmujący 32 geny Vκ, segmenty Jκ i geny Cκ. Przeciwciała wytwarzane przez te myszy ściśle przypominają przeciwciała obserwowane u człowieka pod każdym względem, w tym pod względem uszeregowania genów, budowy i ich asortymentu. Te ludzkie przeciwciała ulegają 2 preferencyjnej ekspresji w stosunku do przeciwciał endogennych w wyniku delecji w endogennym segmencie, co zapobiega przegrupowaniu genów w locus mysim. Takie myszy można immunizować antygenem będącym przedmiotem szczególnego zainteresowania. [0040] Można dokonywać skriningu surowic tak immunizowanych zwierząt pod kątem reaktywności przeciwciał przeciw początkowemu antygenowi. Można izolować limfocyty z węzłów

26 chłonnych lub komórki śledziony i można prowadzić ich dalszą selekcję na obecność komórek B poprzez selekcję komórek CD138-ujemnych i CD19-dodatnich. W jednym z aspektów można dokonywać fuzji takich hodowli komórek B (BCC) z komórkami szpiczaka, generując hybrydoma, co opisano powyżej. [0041] W innym aspekcie można dokonywać, korzystnie, dalszego skriningu takich hodowli komórek B pod kątem reaktywności przeciw początkowemu antygenowi. Taki skrining obejmuje próbę ELISA z białkiem cel/antygen, próbę współzawodnictwa ze znanymi przeciwciałami, które wiążą dany antygen i wiązanie in vitro z przejściowo transfekowanymi komórkami CHO lub innymi komórkami, które wykazują ekspresję docelowego antygenu. [0042] Niniejsze ujawnienie dotyczy sposobów leczenia osobników (ludzi) z guzami litymi, które zawierają komórki nowotworowe wykazujące ekspresję CD40, w tym między innymi chorych na raka jajnika, płuc (w tym np. na postacie płaskokomórkową, gruczolakoraka i wielkokomórkową niedrobnokomórkowego raka płuc oraz na drobnokomórkowego raka płuc), raka piersi, okrężnicy, nerek (w tym np. raka nerkowokomórkowego), pęcherza moczowego, wątroby (w tym np. raka wątrobowokomórkowego), raka żołądka, szyjki macicy, gruczołu krokowego, jamy nosowo-gardłowej, tarczycy (w tym np. brodawkowatego raka tarczycy) i nowotwory skóry, takie jak czerniak i mięsaki (w tym np. kostniakomięsak i mięsak Ewinga). Sposoby te polegają na stosowaniu opisanego w niniejszym opisie przeciwciała anty-cd40 albo jego fragmentu wiążącego antygen, przy czym stosowanie tego przeciwciała lub jego fragmentu wiążącego antygen wywołuje pozytywną odpowiedź leczniczą u osobnika poddawanego temu sposobowi leczenia. Przeciwciała anty-cd40 odpowiednie do stosowania w sposobach według wynalazku swoiście wiążą

27 ludzki antygen CD40 ulegający ekspresji na powierzchni ludzkiej komórki nowotworowej i nie wykazują znaczącej aktywności agonistycznej, ale wykazują aktywność antagonistyczną po związaniu z antygenem CD40 albo z ludzką komórką wykazującą ekspresję CD40, czego dowiedziono zarówno w przypadku prawidłowych komórek wykazujących ekspresję CD40, jak i nowotworowych ludzkich komórek B. Te przeciwciała anty-cd40 i ich fragmenty wiążące antygen nazwane są w niniejszym opisie antagonistycznymi przeciwciałami anty-cd40. Do tych przeciwciał należą między innymi w pełni ludzkie monoklonalne przeciwciała CHIR-.9 i CHIR-2.12 opisane poniżej oraz przeciwciała monoklonalne wykazujące właściwości wiązania przeciwciał monoklonalnych CHIR-.9 i CHIR Takie przeciwciała monoklonalne, które można wytwarzać technikami rekombinacji, opisano poniżej. [0043] Do przeciwciał wykazujących właściwości wiązania przeciwciał monoklonalnych CHIR-.9 i CHIR należą przeciwciała, które kompetycyjnie zakłócają wiązanie CHIR-.9 lub CHIR z CD40 i/lub wiążą te same epitopy, co CHIR-.9 i CHIR Specjalista będzie w stanie stwierdzić, czy przeciwciało współzawodniczy z CHIR-.9 lub CHIR-12.12, wykorzystując standardowe metody znane ze stanu techniki. [0044] Kiedy te przeciwciała wiążą CD40 znajdujące się na powierzchni wykazujących ekspresję CD40 komórek guza litego (nazwanych w niniejszym opisie również wykazującymi ekspresję CD40 komórkami nowotworowymi), wówczas przeciwciała te nie wykazują znaczącej aktywności agonistycznej; w niektórych wykonaniach ich wiązanie z CD40 znajdującym się na powierzchni komórek nowotworowych wykazujących ekspresję CD40 powoduje ADCC-zależne zabijanie tych komórek nowotworowych i przez to zmniejszanie

28 28 1 objętości guza. Do antagonistycznych przeciwciał anty-cd40 odpowiednich do stosowania w sposobach według wynalazku należą więc przeciwciała monoklonalne zdolne do wykazywania aktywności antagonisty w stosunku do komórek ludzkich wykazujących ekspresję powierzchniowego antygenu CD40, czego dowiedziono w odniesieniu do wykazujących ekspresję CD-40 prawidłowych i nowotworowych ludzkich komórek B. Antagonistyczne przeciwciała anty-cd40 [004] Monoklonalne przeciwciała CHIR-.9 i CHIR są antagonistycznymi przeciwciałami anty-cd40 odpowiednimi do stosowania w sposobach według wynalazku. Przeciwciała CHIR-.9 i CHIR są w pełni ludzkimi przeciwciałami monoklonalnymi anty-cd40 należącymi do izotypu IgG 1, wytworzonymi z linii komórkowych hybrydoma 131.2F8..9 (w niniejszym opisie nazywanymi linią komórkową.9) i 13.8D.D (w niniejszym opisie nazywanymi linią komórkową 12.12). Te linie komórkowe wytworzono, stosując limfocyty śledziony od immunizowanych myszy ksenotypowych, posiadających locus ludzkiego łańcucha ciężkiego IgG 1 i locus ludzkiego łańcucha κ (technologia XenoMouse ; Abgenix; Fremont, Kalifornia, USA). Prowadzono fuzję tych komórek śledziony z komórkami szpiczaka mysiego SP2/0 (Sierra BioSource). Otrzymane komórki hybrydoma subklonowano kilka razy, uzyskując stabilne linie komórek 2 monoklonalnych.9 i Podobnie można wytwarzać inne przeciwciała według wynalazku, wykorzystując myszy transgeniczne z loci ludzkiej immunoglobuliny, bądź innymi sposobami znanymi ze stanu techniki i/lub opisanymi w niniejszym opisie. [0046] Sekwencje aminokwasowe regionów liderowego, zmiennego i stałego łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego mab CHIR przedstawiono w niniejszym opisie,

29 odpowiednio, na Fig. 1A i 1B. Patrz również SEQ ID nr 2 (całkowita sekwencja łańcucha lekkiego mab CHIR-12.12), SEQ ID nr 4 (całkowita sekwencja łańcucha ciężkiego mab CHIR ) i SEQ ID nr (całkowita sekwencja wariantu łańcucha ciężkiego mab CHIR przedstawiona w SEQ ID nr 4, której wariant zawiera zamianę alaniny na serynę w pozycji 13 tej SEQ ID nr 4). Sekwencje nukleotydowe kodujące łańcuch lekki i łańcuch ciężki mab CHIR przedstawiono, odpowiednio, na Fig. 2A i 2B. Patrz również SEQ ID nr 1 (sekwencja kodująca łańcucha lekkiego mab CHIR ) i SEQ ID nr 3 (sekwencja kodująca łańcucha ciężkiego mab CHIR-12.12). Sekwencje aminokwasowe regionów liderowego, zmiennego i stałego łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego mab CHIR-.9 przedstawiono, odpowiednio, na Fig. 3A i 3B. Patrz również SEQ ID nr 6 (całkowita sekwencja łańcucha lekkiego mab CHIR-.9), SEQ ID nr 7 (całkowita sekwencja łańcucha ciężkiego mab CHIR-.9) i SEQ ID nr 8 (całkowita sekwencja wariantu łańcucha ciężkiego mab CHIR-.9 przedstawiona w SEQ ID nr 7, której wariant zawiera zamianę alaniny na serynę w pozycji 18 tej SEQ ID nr 7). Poza tym, hybrydoma wykazujące ekspresję przeciwciał CHIR-.9 i CHIR zdeponowano w banku ATTC pod numerami depozytów patentowych odpowiednio PTA-42 i PTA-43. [0047] Korzystne jest, aby poza aktywnością antagonistyczną przeciwciała anty-cd40 odpowiednie do stosowania w sposobach według wynalazku wykazywały jeszcze inny mechanizm działania przeciw komórkom nowotworowym. Natywne przeciwciała CHIR-.9 i CHIR wykazują na przykład aktywność ADCC. Alternatywnie, można dokonać ekspresji regionów zmiennych przeciwciał CHIR-.9 i CHIR na innym izotypie przeciwciał, które wykazuje aktywność ADCC. Możliwe jest również sprzęganie form natywnych, form

30 1 2 rekombinowanych albo fragmentów wiążących antygen z CHIR-.9 i CHIR z toksyną komórkową. [0048] Przeciwciała monoklonalne CHIR-.9 i CHIR wiążą rozpuszczalny CD40 w próbach typu ELISA, zapobiegają wiązaniu ligand-cd40 z CD40 na powierzchni komórki i przemieszczają wstępnie związany ligand-cd40, co oznaczono w próbach metodą cytometrii przepływowej. Przeciwciała CHIR-.9 i CHIR współzawodniczą ze sobą pod względem wiązania z CD40, ale nie z 1B8, przeciwciałem monoklonalnym anty-cd40 opisanym w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym PCT, PCT/US01/87, opublikowanym jako WO 02/28904, zatytułowanym również Human Anti-CD40 Antibodies ( Ludzkie przeciwciała anty-cd40 ), zgłoszonym w dniu 2 października 01 (numer sprawy: PP ). Podczas badania in vitro wpływu na proliferację komórek B pobranych od osób zdrowych, CHIR-.9 i CHIR działały jako antagonistyczne przeciwciała anty-cd40. Ponadto, CHIR-.9 i CHIR nie indukują silnej proliferacji ludzkich limfocytów pochodzących od osób zdrowych. Te przeciwciała mają zdolność zabijania docelowych komórek wykazujących ekspresję CD40 (linie chłoniaków i linie komórkowe guzów litych) drogą zależnej od przeciwciał cytotoksyczności komórkowej (ADCC). Powinowactwo wiązania CHIR-.9 z ludzkim CD40 wynosi 1,2 x -8 M, a powinowactwo wiązania CHIR wynosi x - M, co oznaczono w próbie Biacore. [0049] Antagonistyczne przeciwciała anty-cd40 odpowiednie do stosowania w sposobach według wynalazku wykazują silne jednomiejscowe powinowactwo wiązania z antygenem powierzchniowym CD40. Stała równowagi dysocjacji przeciwciał monoklonalnych według wynalazku (K D) dla CD40 wynosi co najmniej - M, co najmniej 3 x - M, korzystnie, od co najmniej -6 M do -7 M, bardziej

31 31 korzystnie, od co najmniej -8 M do co najmniej -12 M, 1 2 przy oznaczeniu w standardowej próbie, takiej jak Biacore. Analiza Biacore jest znana ze stanu techniki, a szczegółowy jej opis znajduje się w podręczniku BIAapplications handbook. W celu modulowania powinowactwa wiązania można wykorzystać sposoby opisane w publikacji zgłoszeniowej WO 01/ [000] Pod określeniami antygen CD40, antygen powierzchniowy komórkowy CD40, receptor CD40 albo CD40 rozumie się przezbłonową glikoproteinę, która należy do rodziny receptorów czynnika martwicy nowotworu (TNF) (patrz na przykład patenty Stanów Zjednoczonych,674,492 i 4,708,871; Stamenkovic i wsp. (1989) EMBO 8: 1403; Clark (1990) Tissue Antigen 36: 33; Barclay i wsp. (1997) The Leucocyte Antigen Facts Book (II wyd., Academic Press, San Diego)). Zidentyfikowano dwie izoformy ludzkiego CD40, kodowane przez alternatywnie rozszczepiane warianty transkrypcyjne tego genu. Ekspresja pierwszej izoformy (znanej również jako izoforma długa albo izoforma 1 ) następuje w formie prekursorowego polipeptydu o długości 277 aminokwasów (SEQ ID nr 12) (pierwotnie opisanego jako numer akcesyjny GenBank CAA44 i zidentyfikowanego jako izoforma 1 w banku GenBank pod numerem akcesyjnym Nap_001241), kodowanego przez sekwencję SEQ ID nr 11 (patrz GenBank, numery akcesyjne X6092 i NM_001), która zawiera sekwencję sygnałową reprezentowaną przez 19 pierwszych reszt. Ekspresja drugiej izoformy (znanej również jako izoforma krótka albo izoforma 2 ) następuje w formie prekursorowego polipeptydu o długości 3 aminokwasów (SEQ ID nr ), GenBank numer akcesyjny NP_69093), kodowanego przez sekwencję SEQ ID nr 9 (GenBank, numer akcesyjny NM_1284)), która również zawiera sekwencję sygnałową reprezentowaną przez 19

32 pierwszych reszt. Prekursorowe polipeptydy tych dwóch izoform ludzkiego CD40 mają jednakowe pierwsze 16 reszt (czyli reszty 1-16 SEQ ID nr i SEQ ID nr 12). Prekursorowy polipeptyd izoformy krótkiej (ukazany w sekwencji SEQ ID nr ) jest kodowany przez wariant transkrypcyjny (SEQ ID nr 9), który nie ma segmentu kodującego, co prowadzi do przesunięcia ramki translacji; otrzymana izoforma CD40 zawiera C-koniec krótszy (reszty sekwencji SEQ ID nr ) i różniący się od końca zawartego w izoformie długiej CD40 (C-koniec przedstawiony w resztach w sekwencji SEQ ID nr 12). Do celów niniejszego wynalazku, terminy antygen CD40, powierzchniowy antygen CD40, receptor CD40 albo CD40 obejmują izoformy krótką i długą CD40. Przeciwciała anty- CD40 według wynalazku wiążą się z epitopem na ludzkim CD40, który znajduje się w tej samej lokalizacji, albo w krótkiej albo w długiej izoformie tego komórkowego antygenu powierzchniowego, co opisano poniżej. [001] Antygen CD40 jest prezentowany na powierzchni wielu różnych typów komórek, co opisano w dalszej części opisu. Pod pojęciami prezentowany na powierzchni i ulegający ekspresji na powierzchni rozumie się, że całość albo część antygenu CD40 jest wystawiona na zewnątrz komórki. Prezentowany lub ulegający ekspresji antygen CD40 może być poddany całkowitej lub częściowej glikozylacji. [002] Aktywność agonisty oznacza, że dana substancja pełni funkcję agonisty. Agonista łączy się z receptorem na komórce i zapoczątkowuje reakcję albo działanie, które jest podobne albo takie samo jak działanie inicjowane przez naturalny ligand tego receptora. Agonista CD40 indukuje na przykład między innymi dowolną lub wszystkie z wymienionych, następujących odpowiedzi: proliferacja i różnicowanie się komórek B, wytwarzanie przeciwciał,

33 adhezja międzykomórkowa, generowanie pamięci komórek B, zmiana izotypu, regulacja w górę ekspresji na powierzchni komórki MHC klasy II i CD80/86 oraz wydzielanie cytokin prozapalnych, takich jak IL-8, IL-12 i TNF. Wyrażenie aktywność antagonistyczna oznacza, że dana substancja działa jako antagonista. Antagonista CD40 na przykład zapobiega pobudzeniu lub zmniejsza indukcji jakiejkolwiek odpowiedzi indukowanej przez wiązanie receptora CD40 z agonistycznym ligandem, zwłaszcza CD40L. Antagonista może zmniejszać indukowanie jednej lub większej liczby odpowiedzi na wiązanie z agonistą o %, %, 1%, %, 2%, %, 3%, korzystnie o 40%, 4%, 0%, %, 60%, korzystniej o 70%, 80%, 8% a najkorzystniej o 90%, 9%, 99% lub o 0%. Metody oznaczania przeciwciała anty-cd40 i swoistości wiązania CD40 z ligandem oraz aktywności antagonistycznej są znane specjalistom i obejmują między innymi standardowe kompetycyjne próby wiązania, próby monitorowania wydzielania immunoglobulin przez komórki B, próby proliferacji komórek B, próby proliferacji komórek B Banchereau-podobnych, próby z komórkami T pomocniczymi na wytwarzanie przeciwciała, próby proliferacji z kostymulacją komórek B i próby na regulację w górę markerów aktywacji komórek B. Takie próby ujawniono na przykład w publikacji patentowej WO 00/7348 i patencie Stanów Zjednoczonych 6,087,329. [003] Pod pojęciem znaczącej aktywności agonisty rozumie się aktywność agonistyczną większą o co najmniej %, 3%, 40%, 4%, 0%, 60%, 70%, 7%, 80%, 8%, 90%, 9% lub 0% od aktywności agonistycznej indukowanej przez substancję obojętną albo kontrolę negatywną w oznaczeniu w próbie odpowiedzi komórek B. Korzystnie, znaczącą aktywnością agonisty jest aktywność agonistyczna co najmniej dwukrotnie wyższa albo co najmniej trzykrotnie wyższa od aktywności

34 agonistycznej indukowanej przez substancję obojętną albo kontrolę negatywną w oznaczeniu w próbie odpowiedzi komórek B. Jeśli zatem na przykład będącą przedmiotem zainteresowania odpowiedzią komórki B jest proliferacja komórek B, wówczas znaczącą aktywnością agonistyczną mogłoby być indukowanie proliferacji komórek B na poziomie co najmniej dwukrotnie wyższym albo co najmniej trzykrotnie wyższym od poziomu proliferacji komórek wywołanej przez substancję obojętną albo kontrolę negatywną. W jednym z wykonań jako kontrola negatywna służy immunoglobulina nieswoista, na przykład IgG1, która nie wiąże się z CD40. Substancja wolna od znaczącej aktywności agonisty powinna wykazywać aktywność agonisty w stopniu nie większym niż około 2% wyższym od aktywności agonistycznej indukowanej przez substancję obojętną albo kontrolę negatywną, korzystnie nie większą niż o około % wyższą, 1% wyższą, % wyższą, % wyższą, 1% wyższą, 0,% wyższą, a nawet nie większą niż o około 0,1% wyższą niż aktywność agonistyczna indukowana przez substancję obojętną albo kontrolę negatywną, w oznaczeniu w próbie odpowiedzi komórek B. Antagonistyczne przeciwciała anty-cd40 użyteczne w sposobach według wynalazku są wolne od znaczącej aktywności agonistycznej, jak podano powyżej, kiedy wiążą się z antygenem CD40 na komórce ludzkiej. W jednym z wykonań wynalazku antagonistyczne przeciwciało anty-cd40 jest wolne od znaczącej aktywności agonistycznej w jednej odpowiedzi komórek B. W innym wykonaniu wynalazku antagonistyczne przeciwciało anty-cd40 jest wolne od znaczącej aktywności agonistycznej w próbach więcej niż jednej odpowiedzi komórek B (np. w próbach proliferacji i różnicowania albo proliferacji, różnicowania i wytwarzania przeciwciał). [004] Stosowany w niniejszym opisie termin przeciwciało anty-cd40 obejmuje każde przeciwciało, które swoiście

35 3 1 2 rozpoznaje antygen powierzchniowy komórkowy CD40, w tym przeciwciała poliklonalne, przeciwciała monoklonalne, przeciwciała jednołańcuchowe i ich fragmenty, takie jak Fab, Fab(ab ) 2, Fv i ich fragmenty, które zachowały funkcję wiązania antygenu rodzicielskiego przeciwciała anty-cd40. W sposobach według wynalazku przedmiotem szczególnego zainteresowania są właściwości wiążące wykazywane przez opisane powyżej monoklonalne przeciwciała CHIR-.9 i CHIR Do takich przeciwciał należą między innymi następujące przeciwciała: (1) przeciwciała monoklonalne wytwarzane przez linie komórek hybrydoma oznakowane symbolem 131.2F8..9 (w niniejszym opisie nazwane linią komórkową.9) i 13.8E2.D.D (w niniejszym opisie nazwane linią komórkową 12.12), zdeponowane w banku ATCC odpowiednio jako depozyt patentowy o numerze PTA-42 i jako depozyt patentowy o numerze PTA-43; (2) przeciwciało monoklonalne zawierające sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej sekwencję przedstawioną w sekwencji SEQ ID nr 2, przedstawioną w sekwencji SEQ ID nr 4, przedstawioną w sekwencji SEQ ID nr, sekwencje przedstawione na sekwencjach SEQ ID nr 2 i SEQ ID nr 4 oraz sekwencje przedstawione na sekwencjach SEQ ID nr 2 i SEQ ID nr ; (3) przeciwciało monoklonalne zawierające sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej sekwencję przedstawioną w sekwencji SEQ ID nr 6; przedstawioną w sekwencji SEQ ID nr 7, przedstawioną w sekwencji SEQ ID nr 8, sekwencje przedstawione na sekwencjach SEQ ID nr 6 i SEQ ID nr 7 oraz sekwencje przedstawione na sekwencjach SEQ ID nr 6 i SEQ ID nr 8; (4) przeciwciało monoklonalne zawierające sekwencję aminokwasową kodowaną przecz cząsteczkę kwasu nukleinowego, w skład której wchodzi sekwencja nukleotydowa wybrana z grupy obejmującej sekwencję nukleotydową przedstawioną w sekwencji SEQ ID nr

36 , sekwencja nukleotydowa przedstawiona w sekwencji SEQ ID nr 3 i sekwencje przedstawione na sekwencjach SEQ ID nr 1 i SEQ ID nr 3; () przeciwciało monoklonalne wiążące się z epitopem zdolnym do wiązania przeciwciała monoklonalnego wytwarzanego przez linię komórek hybrydoma.9 albo linię komórek hybrydoma 12.12; (6) przeciwciało monoklonalne wiążące się z epitopem zawierającym reszty sekwencji aminokwasowej przedstawionej w sekwencji SEQ ID nr albo SEQ ID nr 12; (7) przeciwciało monoklonalne współzawodniczące z przeciwciałem monoklonalnym CHIR-.9 albo CHIR w próbie wiązania kompetycyjnego i (8) przeciwciało monoklonalne będące fragmentem wiążącym antygen przeciwciała monoklonalnego CHIR-12.12, CHIR-.9 bądź powyższych przeciwciał monoklonalnych z poprzednich punktów (1)-(7), przy czym fragment ten zachowuje zdolność swoistego wiązania z ludzkim antygenem CD40. Specjaliści mają świadomość, że ujawnione w niniejszym opisie antagonistyczne przeciwciała i fragmenty wiążące antygen tych przeciwciał obejmują przeciwciała i ich fragmenty wiążące antygen, które są wytwarzane rekombinacyjnie, z wykorzystaniem sposobów znanych ze stanu techniki i opisanych poniżej i obejmują na przykład wytwarzane rekombinacyjnie przeciwciała monoklonalne CHIR-.9 i CHIR Wytwarzanie antagonistycznych przeciwciał anty-cd40 [00] Antagonistyczne przeciwciała anty-cd40 do stosowania w sposobach według wynalazku można wytwarzać, wykorzystując dowolną technikę wytwarzania przeciwciał znaną specjalistom z tej dziedziny. Można zatem wytwarzać surowice poliklonalne metodami konwencjonalnymi. Na ogół, na początku, roztwór zawierający antygen CD40 stosuje się do immunizacji odpowiedniego zwierzęcia, korzystnie myszy,

37 szczura, królika lub kozy. Korzystne do wytwarzania surowic poliklonalnych są króliki i kozy ze względu na objętość uzyskiwanej surowicy oraz dostępność znakowanych przeciwciał antykróliczych i antykozich. [006] Surowice poliklonalne można wytwarzać w zwierzęciu transgenicznym, korzystnie w myszy zawierającej loci ludzkiej immunoglobuliny. W korzystnym wykonaniu jako immunogen stosuje się komórki Sf9 wytwarzające CD40. Immunizację można również prowadzić przez zmieszanie lub zemulgowanie roztworu zawierającego antygen w soli fizjologicznej, korzystnie w adiuwancie, takim jak kompletny adiuwant Freunda, i wstrzyknięcie tej mieszaniny lub emulsji pozajelitowo (na ogół podskórnie lub domięśniowo). Na ogół wystarcza dawka 0-0 µg/wstrzyknięcie. Immunizację na ogół wzmacnia się po 2-6 tygodniach, podając jedno lub więcej wstrzyknięć białka w soli fizjologicznej, korzystnie, stosując niekompletny adiuwant Freunda. Alternatywnie, można generować przeciwciała przez immunizację in vitro, wykorzystując sposoby znane ze stanu techniki, które do celów niniejszego wynalazku uznaje się za równoważne z immunizacją in vivo. Poliklonalne surowice odpornościowe otrzymuje się przez pobranie krwi immunizowanego zwierzęcia do szklanego lub plastykowego pojemnika, inkubację tej krwi w temperaturze 2 o C przez godzinę i następnie inkubację w temperaturze 4 o C przez 2-18 godzin. Surowicę odzyskuje się przez wirowanie (np. z prędkością 00 x g przez minut). Od królików można uzyskać około -0 ml z jednego pobrania. [007] Wytwarzanie komórek Sf9 (Spodoptera frugiperda) ujawniono w publikacji patentowej 6,004,2, wprowadzonej do niniejszego opisu jako pozycja piśmiennictwa. Pokrótce, sekwencje kodujące ludzki CD40 wprowadza się przez rekombinację do bakulowirusa z użyciem wektorów

38 transferowych. Plazmidy razem z DNA bakulowirusa typu dzikiego wprowadza się metodą kotransfekcji do komórek Sf9. Rekombinacyjne, zakażone bakulowirusem komórki Sf9 identyfikuje się i oczyszcza przez klonowanie. [008] Korzystnie, przeciwciało jest w swej naturze monoklonalne. Termin przeciwciało monoklonalne oznacza przeciwciało uzyskane z populacji przeciwciał zasadniczo homogennych, to znaczy, że poszczególne przeciwciała zawarte w tej populacji są identyczne z wyjątkiem możliwych naturalnie występujących mutacji, które mogą występować w niewielkich ilościach. Ten termin nie jest ograniczony co do gatunku lub źródła przeciwciała. Termin ten obejmuje całe immunoglobuliny oraz ich fragmenty, takie jak Fab, F(ab ) 2, Fv i inne, które zachowały funkcję wiązania antygenu tego przeciwciała. Przeciwciała monoklonalne są wysoce swoiste, gdyż są skierowane przeciw jednemu miejscu antygenowemu, na przykład, w niniejszym wynalazku, przeciw antygenowi powierzchniowemu CD40. Ponadto, w odróżnieniu od preparatów konwencjonalnych (poliklonalnych) przeciwciał, które na ogół zawierają różne przeciwciała skierowane przeciw różnym determinantom (epitopom), każde przeciwciało monoklonalne jest skierowane przeciw pojedynczej determinancie na antygenie. Określenie monoklonalne wskazuje na charakter przeciwciała jako otrzymanego z zasadniczo homogennej populacji przeciwciał i nie jest tak skonstruowane, aby było wymagane wytwarzanie tego przeciwciała jakimkolwiek konkretnym sposobem. Przeciwciała monoklonalne przeznaczone do stosowania zgodnie z wynalazkiem można na przykład wytworzyć sposobem z użyciem hybrydoma, opisanym po raz pierwszy przez Kohlera i wsp. (197) Nature 26: 49, albo można je wytworzyć metodami rekombinacji DNA (patrz np. patent Stanów Zjednoczonych 4,816,67). Przeciwciała monoklonalne można również

39 wyizolować z fagowych bibliotek przeciwciał, wykorzystując techniki opisane między innymi przez Clacksona i wsp. (1991) Nature 32: ; Marksa i wsp. (1991) J. Mol. Biol. 222: i w patencie Stanów Zjednoczonych,14,48. [009] Pod pojęciem epitopu rozumie się część cząsteczki antygenu, w stosunku do której wytwarza się przeciwciało i z którą to przeciwciało się wiąże. Epitopy mogą zawierać liniowe reszty aminokwasowe (reszty w epitopie są ułożone kolejno jedna po drugiej w sposób liniowy), nieliniowe reszty aminokwasowe (nazwane w niniejszym opisie epitopami nieliniowymi ; te epitopy nie są ułożone sekwencyjnie) albo reszty aminokwasowe zarówno liniowe, jak i nieliniowe. [0060] Przeciwciała monoklonalne można wytwarzać, stosując metodę Kohlera i wsp. (197) Nature 26: albo jej modyfikację. Typowo, mysz immunizuje się roztworem zawierającym antygen. Immunizację można prowadzić przez zmieszanie lub zemulgowanie roztworu zawierającego antygen w soli fizjologicznej, korzystnie w adiuwancie, takim jak kompletny adiuwant Freunda, i wstrzyknięcie tej mieszaniny lub emulsji pozajelitowo. W celu otrzymania przeciwciała monoklonalnego według wynalazku można stosować dowolną metodę immunizacji znaną ze stanu techniki. Po immunizacji zwierzęcia usuwa się śledzionę (i ewentualnie kilka dużych węzłów chłonnych) i rozdziela się je na pojedyncze komórki. Komórki śledziony można poddawać skriningowi przez naniesienie zawiesiny komórek na płytkę lub studzienkę pokrytą danym antygenem. Komórki B wykazujące ekspresję wiążącej się z błoną immunoglobuliny swoistej dla tego antygenu wiążą się z płytką i nie są wymywane. Otrzymane komórki B albo wszystkie zdysocjowane komórki śledziony pobudza się następnie do fuzji z komórkami szpiczaka, do wytwarzania hybrydoma i hoduje się je w pożywce

40 selekcyjnej. Otrzymane komórki posiewa się na płytki metodą seryjnych rozcieńczeń i bada pod kątem wytwarzania przeciwciał, które swoiście wiążą dany antygen (i które nie wiążą się z niespokrewnionymi antygenami). Następnie, komórki hybrydoma wydzielające wyselekcjonowane przeciwciało monoklonalne (mab) hoduje się albo in vitro (np. w butelkach do hodowli tkankowych lub w reaktorach z otwartych włókien), albo in vivo (jako puchliny brzuszne u myszy). [0061] Jeśli antagonistyczne przeciwciała anty-cd40 według wynalazku mają być wytwarzane metodami rekombinacji DNA, to DNA kodujący te przeciwciała monoklonalne łatwo izoluje się i sekwencjonuje, wykorzystując konwencjonalne procedury (np. stosując sondy oligonukleotydowe zdolne do swoistego wiązania z genami kodującymi łańcuchy ciężkie i lekkie przeciwciał mysich). Opisane w niniejszym opisie komórki hybrydoma służą jako korzystne źródło takiego DNA. Po wyizolowaniu DNA można wprowadzić do wektorów ekspresyjnych, którymi następnie zakaża się przez transfekcję komórki gospodarza, takie jak komórki E. coli, małpie komórki COS, komórki jajnika chomika chińskiego (CHO) albo komórki szpiczaka, które same nie wytwarzają białka immunoglobuliny, w wyniku czego następuje synteza przeciwciał monoklonalnych w rekombinowanych komórkach gospodarza. Jako artykuły przeglądowe na temat rekombinantowej ekspresji w bakteriach DNA kodującego przeciwciało można wymienić: Skerra i wsp. (1993) Curr. Opinion in Immunol. :26 oraz Phickthun (1992) Immunol. Revs. 1: 11. W sposobie alternatywnym do użycia hybrydoma przeciwciało można wytwarzać w linii komórkowej, takiej jak linia komórek CHO, co ujawniono w patentach Stanów Zjednoczonych,4,403,,4,40 i,998,144. Pokrótce, linię komórkową transfekuje się wektorami

41 zdolnymi do ekspresji, odpowiednio, łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego. Przez wprowadzenie przez transfekcję genów dla tych dwóch białek na oddzielnych wektorach można otrzymać przeciwciała chimerowe. Inną korzyścią jest prawidłowa glikozylacja przeciwciała. [0062] W pewnych wykonaniach antagonistyczne przeciwciało anty-cd40, na przykład przeciwciało CHIR-12.12, CHIR-.9 albo jego fragment wiążący antygen, wytwarza się w komórkach CHO, stosując układ ekspresji genu GS (Lonza Biologics, Portsmouth, New Hampshire, USA), w którym jako znacznik wykorzystuje się syntetazę glutaminową. Patrz również patenty Stanów Zjednoczonych o numerach:,122,464,,91,639,,68,79,,770,39,,827,739,,879,936,,891,693 i,981,216. [0063] Przeciwciała monoklonalne przeciwko CD40 są znane ze stanu techniki. Patrz na przykład rozdziały poświęcone antygenowi komórki B w publikacji McMichaela (1987; 1989) Leucocyte Typing III and IV (Oxford University Press, Nowy Jork); patenty Stanów Zjednoczonych o numerach:,674,492,,874,082,,677,16, 6,06,99; publikacja międzynarodowa WO 00/6339; publikacje międzynarodowe o numerach WO 02/2890 i WO 02/28904; Gordon i wsp. (1988) J. Immunol. 140: 142; Valle i wsp. (1989) Eur. J. Immunol. 19: 1463; Clark i wsp. (1986) PNAS 83: 4494; Paulie i wsp. (1989) J. Immunol. 142: 90; Gordon i wsp. (1987) Eur. J. Immunol. 17: 13; Jabara i wsp. (1990) J. Exp. Med. 172: 1861; Zhang i wsp. (1991) J. Immunol. 146: 1836: Gascan i wsp. (1991) J. Immunol. 147: 8; Banchereau i wsp. (1991) Clin. Immunol. Spectrum 3: 8; i Banchereau i wsp. (1991) Science 21:70. Przedmiotem szczególnego zainteresowania niniejszego wynalazku są antagonistyczne przeciwciała anty- CD40 ujawnione w opisie, o charakterystyce wiązania takiej

42 samej jak na przykład opisane powyżej CHIR-.9 i CHIR [0064] Termin epitop antygenu CD40 oznacza w niniejszym opisie cząsteczkę, która odznacza się reaktywnością immunologiczną w stosunku do przeciwciał monoklonalnych według wynalazku, z wyłączeniem samego antygenu CD40. Epitopy antygenu CD40 mogą być białkami, fragmentami białek, peptydami, węglowodanami, lipidami i innymi cząsteczkami, ale dla celów niniejszego wynalazku są to najczęściej białka, krótkie oligopeptydy, związki naśladujące oligopeptydy (czyli związki organiczne, które naśladują właściwości wiązania przeciwciała antygenu CD40) albo ich kombinacje. Odpowiednie związki naśladujące oligopeptydy opisano między innymi w zgłoszeniu PCT US 91/ [006] Poza tym, termin przeciwciało anty-cd40 obejmuje w niniejszym opisie chimerowe przeciwciała anty-cd40; takie chimerowe przeciwciała anty-cd40 przeznaczone do stosowania w sposobach według wynalazku wykazują charakterystykę wiązania opisanych tu przeciwciał monoklonalnych CHIR-.9 i CHIR Pod pojęciem chimerowych przeciwciał rozumie się przeciwciała, które najkorzystniej są otrzymywane z użyciem technik rekombinacji kwasu dezoksyrybonukleinowego i które zawierają komponenty zarówno ludzkie (w tym gatunki immunologicznie pokrewne, np. szympansie), jak i inne niż ludzkie. Region stały chimerowego przeciwciała jest zatem najkorzystniej zasadniczo identyczny z regionem stałym naturalnego ludzkiego przeciwciała; region zmienny tego chimerowego przeciwciała pochodzi najkorzystniej ze źródła innego niż ludzkiego i wykazuje żądaną swoistość antygenową wobec komórkowego antygenu powierzchniowego CD40. Tym źródłem innym niż ludzkie może być dowolne źródło z kręgowca, które może być użyte do generowania przeciwciał

43 wobec komórkowego antygenu powierzchniowego CD40 albo wobec materiału zawierającego ludzki komórkowy antygen powierzchniowy CD40. Do tych źródeł innych niż ludzkie należą między innymi gryzonie (np. królik, szczur, mysz itp.; patrz np. patent Stanów Zjednoczonych 4,816,67, wprowadzony do niniejszego opisu jako pozycja piśmiennictwa) i naczelne niebędące ludźmi (np. małpa Starego Świata, małpa bezogonowa i podobne; patrz np. patenty Stanów Zjednoczonych o numerach,70, i,76,096; wprowadzone do niniejszego opisu jako pozycja piśmiennictwa). W niniejszym opisie wyrażenie reaktywny immunologicznie użyte w odniesieniu do chimerowych przeciwciał anty-cd40 oznacza przeciwciało chimerowe, które wiąże ludzki CD40. [0066] Terminem przeciwciała anty-cd40 są również w niniejszym opisie objęte przeciwciała anty-cd40 chimerowe i humanizowane. Przeciwciała chimerowe zawierają segmenty przeciwciał pochodzących z różnych gatunków. Przykładem chimerowego przeciwciała ze zmiennym regionem mysim i ludzkim regionem stałym jest Rituxan (IDEC Pharmaceuticals Corp., San Diego, Kalifornia, USA). [0067] Wyrażenie humanizowany oznacza formy przeciwciał anty-cd40, które zawierają minimalną sekwencję pochodzącą z innych niż ludzkie sekwencji immunoglobuliny. Przeciwciałami humanizowanymi są w większości ludzkie immunoglobuliny (przeciwciało biorcy), w którym reszty regionu hiperzmiennego (znanego również jako region determinujący dopasowanie albo CDR) biorcy są zastąpione przez reszty pochodzące z regionu hiperzmiennego gatunku innego niż człowiek (przeciwciało dawcy), takiego jak mysz, szczur, królik albo naczelny niebędący człowiekiem, charakteryzujące się pożądaną swoistością, powinowactwem i zdolnością do spełniania funkcji. Wyrażenie region

44 determinujący dopasowanie odnosi się do sekwencji aminokwasowych, które łącznie definiują powinowactwo wiązania i swoistość naturalnego regionu Fv miejsca wiązania immunoglobuliny natywnej. Patrz np. Chothia i wsp. (1987) J. Mol. Biol. 196: ; Kabat i wsp. (1991) US Dept. of Health and Human Services, NIH Publication nr ). Określenie region stały odnosi się do tej części cząsteczki przeciwciała, która nadaje funkcje efektorowe. W poprzedniej pracy ukierunkowanej na wytwarzanie przeciwciał nieimmunogennych do stosowania w leczeniu chorób u człowieka podstawiano mysie regiony stałe ludzkimi regionami stałymi. Regiony stałe tych humanizowanych przeciwciał pochodziły z immunoglobulin ludzkich. Jednakże, takie humanizowane przeciwciała nadal wywoływały niepożądaną i potencjalnie groźną odpowiedź immunologiczną u ludzi, a także traciły one powinowactwo. Charakterystyka wiązania humanizowanych przeciwciał anty-cd40 do stosowania w sposobach według wynalazku jest podobna do charakterystyki opisanych w niniejszym zgłoszeniu monoklonalnych przeciwciał CHIR-.9 i CHIR [0068] Humanizację można przeprowadzić w zasadzie wykorzystując sposób Wintera i wsp. (Jones i wsp., (1986) Nature 321: 22-2; Riechmanna i wsp. (1988) Nature 332: ; Verhoeyena i wsp. (1988) Science 239: ), przez zamianę odpowiednich sekwencji przeciwciała ludzkiego przez CDR lub sekwencji CDR gryzoni lub zmutowanych gryzoni. Patrz również patenty Stanów Zjednoczonych o numerach:,22,39,,8,089,,693,761,,693,762 i,89,. W niektórych przypadkach reszty regionów zrębowych jednego lub większej ilości regionów zmiennych ludzkiej immunoglobuliny zastępuje się odpowiednimi resztami innymi niż ludzkie (patrz np. patenty Stanów Zjednoczonych o numerach:,8,089,,693,761,,693,762 i

45 ,180,370). Poza tym, humanizowane przeciwciała mogą zawierać reszty, które nie występują ani w przeciwciele biorcy, ani w przeciwciele dawcy. Takich modyfikacji dokonuje się w celu dalszego ulepszenia właściwości przeciwciała (np. w celu otrzymania żądanego powinowactwa). Generalnie, humanizowane przeciwciało będzie zawierało zasadniczo całość z co najmniej jednej, a typowo z dwóch domen zmiennych, w których wszystkie albo w zasadzie wszystkie regiony hiperzmienne odpowiadają regionom immunoglobuliny innej niż ludzka i wszystkie albo w zasadzie wszystkie regiony zrębowe są regionami sekwencji ludzkiej immunoglobuliny. To humanizowane przeciwciało będzie również ewentualnie zawierać co najmniej część regionu stałego immunoglobuliny (Fc), typowo, z immunoglobuliny ludzkiej. Szczegółowe dane są zawarte w pracach: Jones i wsp. (1986) Nature 331: 22-2; Riechmann i wsp. (1988) Nature 332: i Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2: Przeciwciała humanizowane mogą zatem obejmować przeciwciała, w których fragment znacząco mniejszy niż nienaruszona ludzka domena zmienna został podstawiony przez odpowiednią sekwencję z gatunku innego niż człowiek. W praktyce, humanizowane przeciwciała są typowo przeciwciałami ludzkimi, w których pewne reszty CDR i ewentualnie pewne reszty zrębowe zostały podstawione resztami z analogicznych miejsc w przeciwciałach gryzoni. Patrz na przykład patenty Stanów Zjednoczonych o numerach:,22,39,,8,089,,693,761,,693,762 i,89,. Patrz również patent Stanów Zjednoczonych o numerze 6,180,370 i publikacja zgłoszenia międzynarodowego WO 01/27160, w których ujawniono humanizowane przeciwciała i techniki wytwarzania humanizowanych przeciwciał wykazujących ulepszone powinowactwo do określonego antygenu.

46 [0069] Terminem przeciwciała anty-cd40 są również objęte przeciwciała anty-cd40 heterogeniczne lub modyfikowane, wytwarzane w ssaku niebędącym człowiekiem jako gospodarzu, konkretniej, w transgenicznej myszy, charakteryzującej się nieaktywnymi loci endogennej immunoglobuliny (Ig). W takich zwierzętach transgenicznych kompetentne endogenne geny do ekspresji podjednostek lekkiej i ciężkiej immunoglobulin gospodarza unieczynnia się i podstawia analogicznymi loci immunoglobuliny ludzkiej. Takie transgeniczne zwierzęta produkują ludzkie przeciwciała przy zasadniczym braku podjednostek lekkiej i ciężkiej immunoglobuliny gospodarza. Patrz również np. patenty Stanów Zjednoczonych o numerach:,877,397 i,939,98. [0070] Korzystnie, w pełni ludzkie przeciwciała przeciw CD40 uzyskuje się przez immunizację transgenicznych myszy. Jedną taką mysz otrzymano z użyciem technologii XenoMouse (Abgenix; Fremont, Kalifornia, USA). Opisano ją w patentach Stanów Zjednoczonych o numerach: 6,07,181, 6,091,001 i 6,114,98. W celu wytworzenia przeciwciał ujawnionych w niniejszym opisie myszy transgeniczne immunizowano locus łańcucha ciężkiego ludzkiej IgG 1 i locus ludzkiego łańcucha lekkiego κ za pomocą komórek Sf9 wykazujących ekspresję ludzkiego CD40. Myszy mogą być także transgeniczne pod względem innych izotypów. W pełni ludzkie przeciwciała użyteczne w sposobach według wynalazku charakteryzują się właściwościami wiązania podobnymi do właściwości ujawnionych w niniejszym opisie przeciwciał monoklonalnych CHIR-.9 i CHIR [0071] Fragmenty przeciwciał anty-cd40 nadają się do stosowania w sposobach według wynalazku, o ile zachowują żądane powinowactwo przeciwciała o pełnej długości. Fragment przeciwciała anty-cd40 zachowa więc zdolność

47 47 1 wiązania z komórkowym antygenem powierzchniowym CD40 na komórce ludzkiej, szczególnie z komórkowym antygenem powierzchniowym CD40 na wykazujących ekspresję CD40 komórkach nowotworowych guzów litych. Takie fragmenty charakteryzują się właściwościami podobnymi do odpowiedniego antagonistycznego przeciwciała anty-cd40 o pełnej długości, to znaczy, fragmenty te będą swoiście wiązać ludzki antygen CD40 ulegający ekspresji na powierzchni komórki ludzkiej i będą wolne od znaczącej aktywności agonistycznej, ale wykażą aktywność antagonisty po związaniu z antygenem CD40 na ludzkiej komórce wykazującej ekspresję CD40. Takie fragmenty są w niniejszym opisie nazwane fragmentami wiążącymi antygen. Odpowiednie fragmenty wiążące antygen tego przeciwciała zawierają część przeciwciała o pełnej długości, na ogół jego region wiążący antygen albo region zmienny. Przykłady fragmentów przeciwciała obejmują między innymi fragmenty Fab, F(ab ) 2 2 i Fv oraz jednołańcuchowe cząsteczki przeciwciała. Jako Fab rozumie się monowalentny fragment immunoglobuliny wiążący antygen, składający się z łańcucha lekkiego i części łańcucha ciężkiego. F(ab ) 2 oznacza biwalentny fragment immunoglobuliny wiążący antygen, zawierający obydwa łańcuchy lekkie i część obydwu łańcuchów ciężkich. Jednołańcuchowe fragmenty przeciwciała Fv, czyli sfv, oznaczają fragmenty zawierające domeny V H i V L przeciwciała, przy czym te domeny występują w jednym łańcuchu polipeptydowym. Patrz na przykład patenty Stanów Zjednoczonych o numerach: 4,946,778,,260,3,,4,0 i,86,46. Generalnie, polipeptyd Fv zawiera ponadto łącznik polipeptydowy pomiędzy domenami V H i V L, który pozwala na przybieranie przez sfv struktury potrzebnej do związania antygenu. Przegląd na temat sfv znajduje się w

48 publikacji Pluckthuna (1994), The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, tom 113, red. Rosenburg i Moore (Springer-Verlag, Nowy Jork), str Fragmenty wiążące antygen antagonistycznych przeciwciał anty-cd40 ujawnionych w niniejszym opisie można również sprzęgać z cytokiną, aby doprowadzić do zabijania docelowych komórek nowotworowych, co opisano poniżej. [0072] Przeciwciała lub fragmenty przeciwciała można izolować z fagowych bibliotek przeciwciał z użyciem technik opisanych przykładowo przez McCafferty ego i wsp. (1990) Nature 348: 2-4 (1990) i w patencie Stanów Zjednoczonych o numerze,14,48. Clackson i wsp. (1991) Nature 32: i Marks i wsp (1991) J. Mol. Biol. 222: opisali izolowanie, odpowiednio, mysich i ludzkich przeciwciał z użyciem bibliotek fagowych. Następne publikacje opisują wytwarzanie ludzkich przeciwciał o wysokim powinowactwie (zakres nm) przez tasowanie łańcucha (Marks i wsp (1992) Bio/Technology : ) oraz kombinatoryjną infekcję i rekombinację in vivo jako strategię konstruowania bardzo dużych bibliotek fagowych (Waterhouse i wsp (1993) Nucleic Acids Res. 21: Techniki te są zatem realnymi możliwościami izolowania przeciwciał monoklonalnych, alternatywnymi wobec tradycyjnych technik hybrydoma przeciwciał monoklonalnych. [0073] Do wytwarzania fragmentów przeciwciał opracowano różne techniki. Tradycyjnie, fragmenty te uzyskiwano drogą proteolitycznego trawienia nienaruszonych przeciwciał (patrz Morimoto i wsp. (1992) Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: (1992) i Brennan i wsp. (198) Science 229: 81). Jednak obecnie fragmenty te mogą być wytwarzane bezpośrednio przez rekombinowane komórki gospodarza. Fragmenty przeciwciała można na przykład izolować z fagowych bibliotek przeciwciał opisanych

49 powyżej. Alternatywnie, można bezpośrednio odzyskać fragmenty Fab -SH z E. coli i sprzęgać je chemicznie z utworzeniem fragmentów F(ab ) 2 (Carter i wsp. (1992) Bio/Technology : ). W innym podejściu fragmenty F(ab ) 2 można izolować bezpośrednio z hodowli rekombinowanych komórek gospodarza. Inne techniki wytwarzania fragmentów przeciwciał będą oczywiste dla specjalistów z tej dziedziny. [0074] Do antagonistycznych przeciwciał anty-cd40 użytecznych w sposobach według wynalazku należą opisane tu przeciwciała monoklonalne CHIR-.9 i CHIR oraz przeciwciała różniące się od tych przeciwciał, ale zachowujące CDR; a także przeciwciała z addycją (addycjami), delecją (delecjami) lub podstawieniem (podstawieniami) jednego lub większej liczby aminokwasów, w których aktywność antagonistyczną oznacza się poprzez hamowanie proliferacji i/lub różnicowania się komórek B. Wynalazek obejmuje również deimmunizowane antagonistyczne przeciwciała anty-cd40, które można wytworzyć w sposób opisany na przykład w publikacjach zgłoszeń międzynarodowych WO 98/2976 i WO 00/ W ten sposób modyfikuje się reszty w obrębie antagonistycznych przeciwciał anty-cd40 według wynalazku tak, aby spowodować, aby stały się nieimmunogenne albo mniej immunogenne dla ludzi, zachowując przy tym aktywność antagonistyczną w stosunku do ludzkich komórek wykazujących ekspresję CD40, przy czym tę aktywność oznacza się w próbach opisanych w innych częściach niniejszego opisu. Zakresem zastrzeżeń objęte są również białka fuzyjne zawierające antagonistyczne przeciwciało anty-cd40 według wynalazku albo jego fragment, które to białka fuzyjne można syntetyzować albo prowadzić ich ekspresję z odpowiednich

50 0 1 2 wektorów polinukleotydowych, co jest znane ze stanu techniki. Takie białka fuzyjne opisano w odniesieniu do sprzęgania przeciwciał, w dalszej części zgłoszenia. [007] Przeciwciała według wynalazku mogą zawierać zmiany w sekwencjach, wprowadzone z użyciem sposobów opisanych przykładowo w publikacjach patentowych EP A1, WO 00/34317 i WO 98/2976. Wykazano na przykład, że sekwencje w obrębie CDR mogą powodować, że przeciwciało wiąże się z głównym układem zgodności tkankowej (MHC) klasy II i inicjuje niepożądaną odpowiedź pomocniczych komórek T. Substytucja konserwatywna może spowodować, że przeciwciało zachowa aktywność wiązania, tracąc zdolność do inicjowania niepożądanej odpowiedzi komórek T. Wszystkie te substytucje konserwatywne i niekonserwatywne można przeprowadzić metodami znanymi ze stanu techniki, takimi jak te, które są opisane w dalszej części niniejszego opisu, a otrzymane przeciwciała będą objęte zakresem wynalazku. Te wariantowe przeciwciała można badać rutynowo pod kątem aktywności antagonistycznej, powinowactwa i swoistości sposobami podanymi w niniejszym opisie. [0076] Przeciwciało wytworzone dowolnym sposobem opisanym w niniejszym opisie albo innym sposobem, nieujawnionym w niniejszym opisie, będzie objęte zakresem wynalazku, jeśli wykazuje co najmniej jedną z następujących aktywności biologicznych: hamowanie wydzielania immunoglobulin przez prawidłowe ludzkie obwodowe komórki B stymulowane przez komórki T, hamowanie proliferacji prawidłowych ludzkich obwodowych komórek B stymulowanych przez komórki T Jurkata, hamowanie proliferacji prawidłowych ludzkich obwodowych komórek B stymulowanych przez komórki wykazujące ekspresję CD40 albo rozpuszczalny ligand CD40 (scd40l), hamowanie wewnątrzkomórkowych sygnałów antyapoptotycznych przeżycia w dowolnej komórce stymulowanej przez scd40l albo CD40L w

51 1 1 2 fazie stałej, hamowanie przenoszenia sygnału CD40 w dowolnej komórce w wyniku ligacji z scd40l albo CD40L w fazie stałej i hamowanie proliferacji ludzkich nowotworowych komórek B, co opisano poniżej. Takie próby można przeprowadzić w sposób opisany przez Schultze i wsp. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 80-84; Dentona i wsp. (1998) Pediatr. Transplant. 2: 6-1; Evansa i wsp. (00) J. Immunol. 164: ; Noelle a (1998) Agents Actions Suppl. 49: 17-22; Ledermana i wsp. (1996) Curr. Opin. Hematol. 3: 77-86; Coligana i wsp. (1991) Current Protocols in Immunology 13: 12; Kwekkeboom i wsp. (1993) Immunology 79: ; oraz w patentach Stanów Zjednoczonych,674,492 i,847,082. [0077] Reprezentatywną próbą służącą do wykrywania antagonistycznych przeciwciał anty-cd40 swoistych dla epitopów antygenu CD40 wskazaną w niniejszym opisie jest kompetycyjna próba wiązania. Kompetycyjne próby wiązania są próbami serologicznymi, w których substancje nieznane wykrywa się i oznacza ilościowo na podstawie ich zdolności hamowania wiązania znakowanego znanego ligandu ze swoistym dla niego przeciwciałem. Zwana jest ona również kompetycyjną próbą hamowania. W tej reprezentatywnej kompetycyjnej próbie wiązania, znakowany polipeptyd CD40 strąca się badanymi przeciwciałami w próbce, na przykład, w połączeniu z monoklonalnymi przeciwciałami powstałymi w odpowiedzi przeciw jednemu lub kilku epitopom przeciwciał monoklonalnych według wynalazku. Przeciwciała anty-cd40, które swoiście reagują z danym interesującym epitopem, można identyfikować przez skrining serii przeciwciał wytworzonych przeciw białku CD40 albo przeciw fragmentowi tego białka, zawierającemu konkretny interesujący epitop z tego danego białka CD40. W przypadku ludzkiego CD40 do interesujących epitopów należą na przykład epitopy

52 2 1 2 zawierające liniowe i/lub nieliniowe reszty aminokwasowe krótkiej izoformy ludzkiego CD40 (patrz numer akcesyjny GenBank NP_69093) przedstawionej na Fig. 4B (SEQ ID nr ), kodowanej przez sekwencję przedstawioną na Fig. 4A (SEQ ID nr 9; patrz również numer akcesyjny GenBank NM_1284) albo długiej izoformy ludzkiego CD40 (patrz numer akcesyjny GenBank CAA44 i NP_001241) przedstawionej na Fig. 4D (SEQ ID nr 12), kodowanej przez sekwencję przedstawioną na Fig. 4C (SEQ ID nr 11; patrz numer akcesyjny GenBank X6092 i NM_001). Alternatywnie do selekcji przeciwciał monoklonalnych porównywalnych z uprzednio zidentyfikowanymi przeciwciałami można zastosować kompetycyjne próby wiązania z uprzednio zidentyfikowanymi odpowiednimi antagonistycznymi przeciwciałami anty-cd40. [0078] Przeciwciała stosowane w takich próbach immunologicznych mogą być znakowane albo nieznakowane. Nieznakowane przeciwciała można stosować w próbie aglutynacji; znakowane przeciwciała można stosować w wielu różnych próbach, wykorzystując wiele różnych znaczników. Wykrywanie tworzenia się kompleksu przeciwciało-antygen pomiędzy przeciwciałem anty-cd40 a interesującym epitopem można ułatwić przez przyłączenie do przeciwciała substancji wykrywalnej. Do odpowiednich narzędzi do wykrywania należą znaczniki takie jak radionuklidy, enzymy, koenzymy, substancje fluorescencyjne, chemiluminescencyjne, chromogeny, substraty lub kofaktory dla enzymów, inhibitory enzymów, kompleksy grupy prostetycznej, wolne rodniki, cząsteczki, barwniki i podobne. Przykłady odpowiednich enzymów obejmują peroksydazę chrzanową, fosfatazę alkaliczną, β-galaktozydazę i acetylocholinesterazę; przykłady odpowiednich kompleksów grup prostetycznych obejmują kompleksy: streptawidyna/biotyna i awidyna/biotyna; do przykładów odpowiednich materiałów

53 3 fluorescencyjnych należą umbelliferon, fluoresceina, izotiocyjanian fluoresceiny, rodamina, dichlorotriazynyloaminofluoresceina; chlorek dansylu lub fikoerytryna; przykład materiału luminescencyjnego stanowi luminol; przykłady materiałów bioluminescencyjnych obejmują lucyferazę, lucyferynę i ekworynę; jako przykłady odpowiedniego materiału radioaktywnego można podać 12 I, 131 I, 3 S albo 3 H. Takie znakowane odczynniki można stosować 1 2 w wielu różnych dobrze znanych próbach, takich jak próby radioimmunologiczne, enzymatyczne próby immunologiczne, np. ELISA, fluorescencyjne próby immunologiczne i podobne. Patrz na przykład patenty Stanów Zjednoczonych 3,766,162, 3,791,932, 3,817,837 i 4,233,402. [0079] Przed użyciem w sposobach według wynalazku dowolne spośród poprzednio opisanych antagonistycznych przeciwciał anty-cd40 albo fragmentów tych przeciwciał można sprzęgać. Sposoby wytwarzania sprzężonych przeciwciał są znane ze stanu techniki. Przeciwciało anty-cd40 można zatem znakować przez znakowanie pośrednie lub wykorzystując podejście znakowania pośredniego. Terminy znakowanie pośrednie albo podejście znakowania pośredniego oznaczają, że do przeciwciała przyłącza się kowalencyjnie środek chelatujący, a do środka chelatującego wbudowuje się co najmniej jeden radionuklid. Środki chelatujące i radionuklidy opisali na przykład Srivagtava i Mease (1991) Nucl. Med. Bio. 18: Publikację tę wprowadzono do piśmiennictwa niniejszego opisu. Do odpowiednich znaczników należą fluorofory, chromofory, atomy radioaktywne (zwłaszcza P i I), odczynniki o dużej gęstości elektronowej, enzymy i ligandy posiadające swoistych partnerów wiązania. Enzymy typowo wykrywa się poprzez ich aktywność. Peroksydazę chrzanową na przykład wykrywa się na

54 4 1 2 ogół z wykorzystaniem jej zdolności przekształcania 3,3,, -tetrametylobenzydyny (TMB) w barwnik niebieski, oznaczany ilościowo w spektrofotometrze. Określenie swoisty partner wiązania odnosi się do białka zdolnego do związania cząsteczki ligandu z wysoką swoistością, jak na przykład w przypadku antygenu i swoiście skierowanego przeciwko niemu przeciwciała monoklonalnego. Do innych swoistych partnerów należą: biotyna i awidyna albo streptawidyna, IgG i białko A oraz wiele par receptorligand znanych ze stanu techniki. Należy mieć na uwadze, że celem niniejszego opisu nie jest przydzielenie różnych znaczników do poszczególnych klas, gdyż ten sam znacznik może służyć w kilku różnych trybach. 12 I może na przykład służyć jako znacznik radioaktywny albo jako odczynnik o dużej gęstości elektronowej. Peroksydaza chrzanowa (HRP) może służyć jako enzym albo jako antygen dla mab. Poza tym, można łączyć różne znaczniki, żeby osiągnąć pożądany efekt. Przeciwciała monoklonalne i awidyna wymagają na przykład również znaczników przy wykorzystaniu według niniejszego wynalazku; można więc znakować mab biotyną i wykrywać jego 12 obecność za pomocą awidyny znakowanej jodem I albo za pomocą mab przeciw biotynie znakowanego HRP. Inne odmiany i możliwości będą oczywiste dla specjalistów z tej dziedziny i zakłada się, że jako równoważne, wchodzą w zakres niniejszego wynalazku. [0080] Alternatywnie, przeciwciało anty-cd40 można znakować, stosując znakowanie bezpośrednie albo podejście bezpośredniego znakowania, w którym radionuklid jest przyłączony kowalencyjnie bezpośrednio do przeciwciała (na ogół poprzez resztę aminokwasową). Korzystne radionuklidy są opisane przez Srivagtava i Mease (1991), jak wyżej. Szczególnie korzystne jest podejście znakowania

55 1 2 pośredniego. Patrz również np. publikacje zgłoszeń międzynarodowych WO 00/31 i WO 00/2473, w których do związania znacznika radioaktywnego z przeciwciałem użyto łącznika i znakowane formy przeciwciał anty-cd40 opisane w patencie Stanów Zjednoczonych 6,01,42. [0081] Poza tym, przeciwciało (lub jego fragment) można sprzęgać z cząstką leczniczą, taką jak cytotoksyna, środek leczniczy albo jon metalu radioaktywnego bądź radioizotop. Cytotoksyną lub środkiem cytotoksycznym może być dowolny środek, który jest szkodliwy dla komórek. Przykłady obejmują taksol, cytochalazynę B, gramicydynę D, bromek etydowy, emetynę, mitomycynę, etopozyd, tenopozyd, winkrystynę, winblastynę, kolchicynę, doksorubicynę, daunorubicynę, dihydroksyantracynodion, mitoksantron, mitramycynę, aktynomycynę D, 1-dehydrotestosteron, glikokortykoidy, prokainę, tetrakainę, lidokainę, propranolol i puromycynę oraz ich analogi i homologi. Jako środek leczniczy można między innymi stosować antymetabolity (np. metotreksat, 6-merkaptopurynę, 6- tioguaninę, cytarabinę, -fluorouracyl, dakarbazynę), środki alkilujące (np. mechloretaminę, tiotepa, chlorambucyl, melfalan, karmustynę (BSNU) i lomustynę (CCNU), cyklofosfamid, busulfan, dibromomannitol, streptozotocynę, mitomycynę C i cis-dichlorodiaminoplatynę(ii) (DDP); cisplatynę), antracykliny (np. daunorubicynę (dawna nazwa: daunomycyna) i doksorubicynę), antybiotyki (np. daktynomycynę (dawniej aktynomycyna), bleomycynę, mitramycynę i antramycynę (AMC) oraz środki antymitotyczne (np. winkrystynę i winblastynę). Do 131 radioizotopów należą między innymi I, 123 I, 12 I, 90 Y, 188 Re, 186 Re, 211 At, 67 Cu, 212 Bi, 213 Bi, 9 Pd, 99 Tc, 111 In i podobne. Koniugaty według wynalazku można stosować do

56 6 1 2 modyfikacji danej odpowiedzi biologicznej; cząstka terapeutyczna nie ogranicza się do klasycznych chemicznych środków leczniczych. Cząstka terapeutyczna może być na przykład białkiem albo polipeptydem wykazującym żądaną aktywność biologiczną. Do takich białek należy np. toksyna, taka jak abryna, rycyna A, egzotoksyna Pseudomonas albo toksyna błonicy, białko, takie jak czynnik martwicy nowotworu, α-interferon, β-interferon, czynnik wzrostu nerwów, płytkowy czynnik wzrostu, tkankowy aktywator plazminogenu, albo modyfikatory odpowiedzi biologicznej, takie jak na przykład limfokiny, interleukina 1 ( IL-1 ), interleukina 2 ( IL-2 ), interleukina 6 ( IL-6 ), czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów ( GM-CSF ), czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów ( G-CSF, lub inne czynniki wzrostu. [0082] Techniki sprzęgania takiej cząstki terapeutycznej z przeciwciałami są dobrze znane. Patrz na przykład Arnon i wsp.(198) Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy ( Przeciwciała monoklonalne do immunologicznego docelowego podawania leków w leczeniu nowotworów ) w publikacji Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pod red. Reisfelda i wsp. (Alan R. Liss Inc.) str ; red. Hellstrom i wsp. (1987) Antibodies for Drug Delivery ( Przeciwciała do dostarczania leków ) w publikacji Controlled Drug Delivery, pod red. Robinsona i wsp. (wyd. II, Marcel Dekker, Inc.), str ; Thorpe (198) Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy; A Review ( Środki cytotoksyczne w leczeniu nowotworów; przegląd ) w publikacji: Monoclonal antibodies 84: Biological and Clinical Applications, pod red. Pinchera i wsp., str (wyd. Editrice Kurtis, Mediolan, Włochy, 198); Analysis, Results and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody

57 7 1 2 in Cancer Therapy ( Analiza, wyniki i perspektywy na przyszłość leczniczego stosowania przeciwciała znakowanego pierwiastkiem radioaktywnym w leczeniu nowotworów ) w publikacji Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, red. Baldwin i wsp. (Academic Press, Nowy Jork, 198), str , i Thorpe i wsp. (1982) Immunol. Rev. 62: [0083] Alternatywnie, przeciwciało można sprzęgać z drugim przeciwciałem, tworząc heterokoniugat przeciwciała, co opisano w patencie Stanów Zjednoczonych 4,676,980. Poza tym, pomiędzy znacznikami a przeciwciałami według wynalazku można użyć łączników (patrz patent Stanów Zjednoczonych 4,831,17). Przeciwciała albo ich fragmenty wiążące antygen można bezpośrednio znakować radioaktywnym jodem, indem, itrem lub inną radioaktywną cząsteczką znaną ze stanu techniki (patent Stanów Zjednoczonych,9,721). Leczenie może polegać na połączonym leczeniu sprzężonymi i niesprzężonymi przeciwciałami, podawanymi jednocześnie albo kolejno (WO 00/31 i WO 00/2473). Warianty antagonistycznych przeciwciał anty-cd40 [0084] W sposobach według wynalazku można użyć odpowiednich biologicznie aktywnych wariantów antagonistycznych przeciwciał anty-cd40. Takie warianty będą zachowywać właściwości wiązania rodzicielskiego antagonistycznego przeciwciała anty-cd40. Sposoby wytwarzania wariantów przeciwciał są ogólnie znane ze stanu techniki. [008] Warianty sekwencji aminokwasowej antagonistycznego przeciwciała anty-cd40, np. opisanych w niniejszym opisie przeciwciał monoklonalnych CHIR-.9 albo CHIR-12.12, można wytworzyć na przykład przez mutacje w klonowanej sekwencji DNA kodującej dane przeciwciało. Metody mutagenezy i zmian sekwencji nukleotydowej są dobrze znane ze stanu techniki.

58 8 1 2 Patrz np. Walker i Gaastra (1983), Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nowy Jork); Kunkel (198) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: ; Kunkel i wsp. (1987) Methods Enzymol. 14: ; Sambrook i wsp. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, Nowy Jork); patent Stanów Zjednoczonych 4,873,192 i cytowane tam piśmiennictwo. Wskazówki odnośnie do odpowiednich substytucji aminokwasowych, niewpływających na aktywność biologiczną danego polipeptydu, można znaleźć w modelu Dayhoffa i wsp. (1987) w publikacji Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C., USA). Korzystne mogą być substytucje konserwatywne, takie jak wymiana jednego aminokwasu na inny o podobnych właściwościach. Przykłady substytucji konserwatywnych obejmują między innymi substytucje: Gly Ala, Val Ile Leu, Asp Glu, Lys Arg, Asn Gln i Phe Trp Tyr. [0086] Przy konstruowaniu wariantów interesującego polipeptydu antagonistycznego przeciwciała anty-cd40 dokonuje się modyfikacji takich, że warianty nadal wykazują żądaną aktywność, czyli podobne powinowactwo wiązania, mają zdolność swoistego wiązania z ludzkim antygenem CD40 ulegającym ekspresji na powierzchni komórki ludzkiej i są wolne od znaczącej aktywności agonistycznej, natomiast wykazują aktywność antagonistyczną po związaniu z antygenem CD40 na ludzkiej komórce wykazującej ekspresję CD40. Oczywiście, jakiekolwiek mutacje dokonane w DNA kodującym ten wariantowy polipeptyd nie mogą przemieścić tej sekwencji poza ramkę odczytu i korzystnie, nie tworzą regionów komplementarnych, które mogłyby tworzyć drugorzędową strukturę mrna. Patrz publikacja zgłoszenia patentowego europejskiego EP 7,444.

59 9 1 2 [0087] Ponadto można poddawać mutacji region stały antagonistycznego przeciwciała anty-cd40 tak, aby zmieniać na różne sposoby funkcje efektorowe. Przykład takiej mutacji można znaleźć w patencie Stanów Zjednoczonych 6,737,06 B1 i publikacji zgłoszenia patentowego Stanów Zjednoczonych 04/01321 A1, w których ujawniono mutacje Fc, optymalizujące wiązanie przeciwciała z receptorami Fc. [0088] Korzystnie, sekwencje aminokwasowe wariantów referencyjnego antagonistycznego przeciwciała anty-cd40 wykazują co najmniej 70% albo 7% identyczności (dopasowania) sekwencji, korzystnie co najmniej 80% albo 8% identyczności sekwencji, korzystniej, co najmniej 90%, 91%, 92%, 93%, 94% albo 9% identyczności sekwencji w stosunku do sekwencji aminokwasowej referencyjnej cząsteczki antagonistycznego przeciwciała anty-cd40, na przykład opisanych w niniejszym opisie przeciwciał monoklonalnych CHIR-.9 lub CHIR albo do krótszej części tej referencyjnej cząsteczki przeciwciała. Korzystniej, cząsteczki te wykazują co najmniej 96%, 97%, 98% albo 99% identyczność sekwencji. Dla celów niniejszego wynalazku procentową identyczność sekwencji oznacza się za pomocą algorytmu poszukiwania homologii Smitha-Watermana z użyciem poszukiwania przerw afinicznych z karą za otwarcie przerwy 12 punktów i karą za przedłużenie przerwy 2 punkty, według macierzy podobieństwa BLOSUM 62. Algorytm poszukiwania homologii Smitha-Watermana jest opisany przez Smitha i Watermana (1981) w Adv. Appl. Math. 2: Wariant może się różnić od referencyjnego antagonistycznego przeciwciała anty-cd40 nawet tylko o 1-1 reszt aminokwasowych, tylko o 1- reszt aminokwasowych, tylko o 6-, tylko o, tylko o 4, 3, 2, a nawet o jedną resztę aminokwasową.

60 [0089] Pod względem optymalnego dopasowania dwóch sekwencji aminokwasowych, przyległy segment wariantowej sekwencji aminokwasowej może zawierać dodatkowe reszty aminokwasowe albo może mieć wycięte reszty aminokwasowe w odniesieniu do referencyjnej sekwencji aminokwasowej. Przyległy segment użyty do porównania z referencyjną sekwencją aminokwasową będzie zawierał co najmniej przylegających reszt aminokwasowych, a może mieć, 40, 0 lub więcej reszt aminokwasowych. Można wprowadzać poprawki na identyczność sekwencji związane z podstawieniami lub z przerwami w resztach konserwatywnych (patrz algorytm poszukiwania homologii Smitha Watermana). [0090] Dokładna struktura chemiczna polipeptydu zdolnego do swoistego wiązania CD40 i zachowującego aktywność antagonistyczną, zwłaszcza po związaniu z antygenem CD40 albo ze złośliwymi komórkami B albo wykazującymi ekspresję CD40 komórkami guza litego, zależy od wielu czynników. Jako że w cząsteczce występują zdolne do jonizacji grupy aminowe i karboksylowe, konkretny polipeptyd można otrzymać jako sól kwaśną lub zasadową albo w postaci obojętnej. Wszystkie takie preparaty, które zachowują swą aktywność biologiczną po umieszczeniu ich w odpowiednich warunkach środowiska, są objęte definicją antagonistycznych przeciwciał anty-cd40 podaną w niniejszym opisie. Poza tym pierwszorzędowa aminokwasowa sekwencja polipeptydu może być powiększona przez derywatyzację z użyciem reszt cukrowych (glikozylacja) albo innych dodatkowych cząsteczek, takich jak lipidy, grupy fosforanowe, acetylowe i podobne. Może być też powiększona przez sprzęganie z sacharydami. Pewne rodzaje takiego powiększania prowadzi się w posttranslacyjnych układach przetwarzania wytwarzającego je gospodarza; inne tego typu modyfikacje można wprowadzić in vitro. W każdym przypadku, takie modyfikacje są objęte

61 61 1 definicją przeciwciała anty-cd40 podaną w opisie, o ile nie uległy wyeliminowaniu antagonistyczne właściwości przeciwciała anty-cd40. Zakłada się, że te modyfikacje mogą ilościowo lub jakościowo wpływać na aktywność oznaczaną w różnych próbach, wzmacniając bądź osłabiając aktywność tego polipeptydu. Ponadto, poszczególne reszty aminokwasowe w łańcuchu można modyfikować przez utlenianie, redukcję lub inny rodzaj derywatyzacji i polipeptyd można rozszczepiać, uzyskując fragmenty zachowujące aktywność. Takie zmiany, które nie eliminują aktywności antagonistycznej, nie wykluczają sekwencji polipeptydowej z zakresu definicji interesujących przeciwciał anty-cd40 stosowanej w niniejszym opisie. [0091] Ze stanu techniki znane są wystarczające wskazówki odnośnie do wytwarzania i stosowania wariantów polipeptydowych. Przy wytwarzaniu wariantów przeciwciała anty-cd40 specjalista z łatwością określi, które modyfikacje w nukleotydzie kodującym natywne białko albo sekwencję aminokwasową dadzą wariant nadający się do stosowania jako leczniczo aktywny składnik kompozycji farmaceutycznej z użyciem sposobów według wynalazku. Sposoby leczenia z użyciem antagonistycznych przeciwciał anty-cd40 według wynalazku 2 [0092] Sposoby opisane w niniejszym ujawnieniu są skierowane na stosowanie antagonistycznych przeciwciał anty-cd40 do leczenia osobników (pacjentów) z guzami litymi, zawierającymi komórki wykazujące ekspresję powierzchniowego antygenu CD40. Pod pojęciem wykazująca ekspresję CD40 komórka nowotworowa rozumie się każdą złośliwą (to znaczy nowotworową) lub przednowotworową komórkę guza litego, która wykazuje ekspresję antygenu powierzchniowego CD40. Sposoby wykrywania ekspresji CD40 na

62 komórkach są dobrze znane ze stanu techniki i obejmują między innymi techniki PCR, immunohistochemiczne, cytometrię przepływową, technikę Western blot, ELISA i podobne. Guzy lite, które można leczyć sposobami według niniejszego ujawnienia, obejmują między innymi raka jajnika, raka płuc (na przykład postacie płaskokomórkową, gruczolakoraka i wielkokomórkową niedrobnokomórkowego raka płuc oraz drobnokomórkowego raka płuc), raka piersi, okrężnicy, nerek (w tym np. raka nerkowokomórkowego), pęcherza moczowego, wątroby (w tym np. raki wątrobowokomórkowe), raka żołądka, szyjki macicy, gruczołu krokowego, raka jamy nosowo-gardłowej, tarczycy (np. brodawkowatego raka tarczycy) i nowotwory skóry, takie jak czerniak i mięsaki (w tym na przykład kostniakomięsaki i mięsaki Ewinga). [0093] Leczenie definiuje się w niniejszym opisie jako podanie osobnikowi lub stosowanie u osobnika antagonistycznego przeciwciała anty-cd40 lub jego fragmentu wiążącego antygen, albo podanie lub stosowanie antagonistycznego przeciwciała anty-cd40 lub jego fragmentu do izolowanej tkanki lub linii komórkowej pochodzącej od tego osobnika, przy czym u osobnika tego występuje guz lity, objawy związane z guzem litym albo predyspozycja do rozwoju guza litego, przy czym celem jest leczenie, uzdrowienie, złagodzenie, ulga, zmiana, leczenie, polepszenie, poprawa albo wpływ na guza litego, na każde zmiany związane z guzem litym albo na predyspozycję do rozwoju guza litego. Termin leczenie obejmuje również podanie osobnikowi lub stosowanie u osobnika kompozycji farmaceutycznej zawierającej antagonistyczne przeciwciała anty-cd40 lub jego fragmenty albo podanie lub stosowanie kompozycji farmaceutycznej zawierającej antagonistyczne przeciwciała anty-cd40 lub jego fragmenty do izolowanej

63 tkanki lub linii komórkowej pochodzącej od osobnika, u którego występuje guz lity, objawy związane z guzem litym albo predyspozycja do rozwoju guza litego, przy czym celem jest leczenie, uzdrowienie, złagodzenie, ulga, zmiana, leczenie, polepszenie, poprawa albo wpływ na guza litego, na każde zmiany związane z guzem litym albo na predyspozycję do rozwoju guza litego. [0094] Pod terminem aktywność przeciwnowotworowa rozumie się zmniejszenie szybkości proliferacji złośliwych komórek wykazujących ekspresję CD40 albo ich narastania, a zatem zmniejszenie szybkości wzrostu istniejącego guza albo guza, który pojawił się podczas leczenia i/lub zniszczenie istniejących komórek nowotworowych albo nowo utworzonych komórek nowotworowych, a zatem zmniejszenie całkowitej wielkości guza podczas leczenia. Leczenie przynajmniej jednym przeciwciałem anty-cd40 (lub jego fragmentem wiążącym antygen) powoduje odpowiedź fizjologiczną, która jest korzystna w odniesieniu do leczenia guzów litych u ludzi, u których guzy lite zawierają komórki nowotworowe wykazujące ekspresję CD40. Jest zrozumiałe, że sposoby według ujawnienia mogą być użyteczne w zapobieganiu wznowom i kolejnym pojawiającym się podczas leczenia przerzutom nowotworowym. [009] Zgodnie ze sposobami według ujawnienia, do wzmocnienia pozytywnej odpowiedzi leczniczej wobec guza litego stosuje się przynajmniej jedno antagonistyczne przeciwciało anty-cd40 (albo jego fragment wiążący antygen) zdefiniowane w innej części opisu. Pod pojęciem pozytywnej odpowiedzi leczniczej w odniesieniu do leczenia nowotworu rozumie się polepszenie w chorobie w związku z aktywnością przeciwnowotworową tych przeciwciał albo ich fragmentów i/lub polepszenie w objawach towarzyszących tej chorobie. Oznacza to, że można zaobserwować działanie

64 antyproliferacyjne, zapobieganie pojawianiu się wznowy lub kolejnych przerzutów nowotworu, zmniejszenie wielkości guza, zmniejszenie ilości komórek nowotworowych i/lub zmniejszenie nasilenia jednego lub większej liczby objawów wywołanych stymulacją komórek wykazujących ekspresję CD40. Polepszenie w chorobie może więc na przykład charakteryzować się odpowiedzią całkowitą. Pod pojęciem odpowiedzi całkowitej rozumie się brak klinicznych objawów choroby z normalizacją wszystkich spośród poprzednio nieprawidłowych wyników badań radiologicznych, szpiku kostnego i płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF). Taka odpowiedź musi się utrzymywać przez co najmniej miesiąc po leczeniu, zgodnie ze sposobami według ujawnienia. Alternatywnie, polepszenie w chorobie może określić jako odpowiedź częściową. Przez odpowiedź częściową rozumie się co najmniej około 0% zmniejszenie wszystkich dających się oznaczyć obciążeń nowotworowych (np. liczby komórek nowotworowych obecnych u danego osobnika), bez pojawienia się nowych zmian, utrzymujące się co najmniej przez miesiąc. Taka odpowiedź ma zastosowanie jedynie do nowotworów mierzalnych. [0096] Odpowiedź nowotworu można ocenić poprzez zmiany w morfologii guza (np. w ogólnym obciążeniu nowotworem, w wielkości guza i podobne), wykorzystując techniki skriningowe, takie jak obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI), obrazowanie rentgenowskie, obrazowanie metodą tomografii komputerowej (CT), obrazowanie bioluminescencyjne, np. obrazowanie z użyciem lucyferazy, scyntygrafię kości i pobranie próbki nowotworu, w tym biopsję aspiracyjną szpiku kostnego (BMA). Poza tymi pozytywnymi odpowiedziami leczniczymi u osobnika poddanego leczeniu antagonistycznym przeciwciałem anty-cd40 albo jego fragmentem wiążącym antygen mogą występować korzystne

65 6 1 2 skutki leczenia pod względem poprawy w objawach związanych z tą chorobą. [0097] Dawka lub ilość skuteczna leczniczo albo ilość skuteczna oznacza ilość antagonistycznego przeciwciała anty-cd40 albo jego fragmentu wiążącego antygen, która po podaniu daje pozytywną odpowiedź leczniczą w odniesieniu do leczenia pacjenta z guzem litym, zawierającym wykazujące ekspresję CD40 komórki nowotworowe. W pewnych wykonaniach wynalazku skuteczna leczniczo dawka przeciwciała anty-cd40 lub jego fragmentu zawiera się w zakresie od około 0,01 mg/kg do około 40 mg/kg, od około 0,01 mg/kg do około mg/kg, od około 0,1 mg/kg do około mg/kg, od około 1 mg/kg do około mg/kg, od około 3 mg/kg do około mg/kg, od około 3 mg/kg do około 2 mg/kg, od około 3 mg/kg do około mg/kg, od około mg/kg do około 1 mg/kg, od około 7 mg/kg do około 12 mg/kg. Uznaje się, że sposób leczenia może polegać na jednorazowym podaniu skutecznej leczniczo dawki albo na wielokrotnych podaniach skutecznej leczniczo dawki antagonistycznego przeciwciała anty-cd40 lub jego fragmentu wiążącego antygen. [0098] Kolejnym wykonaniem wynalazku jest zastosowanie antagonistycznych przeciwciał anty-cd40 do diagnostycznego monitorowania poziomu białka w tkance jako części procedury testów klinicznej, np. w celu oznaczenia skuteczności danego schematu leczenia. Wykrywanie można ułatwić przez sprzęgniecie przeciwciała z wykrywalną substancją. Przykłady wykrywalnych substancji obejmują różne enzymy, grupy prostetyczne, materiały fluorescencyjne, materiały luminescencyjne, materiały bioluminescencyjne i materiały radioaktywne. Przykłady odpowiednich enzymów obejmują peroksydazę chrzanową, fosfatazę alkaliczną, β- galaktozydazę albo acetylocholinesterazę; przykłady odpowiednich kompleksów grup prostetycznych obejmują

66 66 streptawidynę/biotynę i awidynę/biotynę; przykłady odpowiednich materiałów fluorescencyjnych obejmują umbelliferon, fluoresceinę, izotiocyjanian fluoresceiny, rodaminę, dichlorotriazynylofluoresceinę, chlorek dansylu lub fikoerytrynę; przykład materiału luminescencyjnego stanowi luminol; przykłady materiałów bioluminescencyjnych obejmują lucyferazę, lucyferynę i ekworynę; jako przykłady odpowiedniego materiału radioaktywnego można podać 12 I, 131 I, 3 S albo 3 H. 1 2 [0099] W niektórych korzystnych wykonaniach antagonistyczne przeciwciała anty-cd40 według wynalazku albo ich fragmenty wiążące antygen stosuje się łącznie z co najmniej jednym innym rodzajem leczenia nowotworu, w tym między innymi z zabiegiem chirurgicznym, radioterapią, chemioterapią, terapią cytokiną lub innym przeciwciałem monoklonalnym przeznaczonym do stosowania w leczeniu danego guza litego, przy czym tę dodatkową terapię stosuje się przed terapią, podczas terapii lub po terapii przeciwciałem anty-cd40. Jeśli połączone terapie obejmują zatem stosowanie przeciwciała anty-cd40 albo jego fragmentu wiążącego antygen w kombinacji ze stosowaniem innego środka leczniczego, takiego jak chemioterapia, terapia cytokiną albo innym przeciwciałem monoklonalnym, to sposoby według ujawnienia obejmują wspólne stosowanie z użyciem oddzielnych preparatów albo jednej postaci farmaceutycznej oraz kolejne stosowanie w dowolnym porządku, przy czym korzystnie, jest okres, kiedy obydwa (albo wszystkie) środki aktywne jednocześnie wywierają swe działanie lecznicze. Jeśli sposoby według ujawnienia zawierają połączone schematy leczenia, to terapie te można zastosować jednocześnie, np. przeciwciało anty-cd40 albo jego fragment wiążący antygen podaje się wspólnie albo w tym samym

67 zakresie czasowym, co inną terapię przeciwnowotworową (np. terapie przebiegają wspólnie, ale przeciwciała anty-cd40 albo jego fragmentu wiążącego antygen nie podaje się dokładnie w tym samym czasie, co inną terapię przeciwnowotworową). Alternatywnie, przeciwciało anty-cd40 według wynalazku albo jego fragment wiążący antygen można również stosować przed tą inną terapią przeciwnowotworową albo po tej innej terapii przeciwnowotworowej. Kolejne stosowanie różnych terapii przeciwnowotworowych można prowadzić niezależnie od tego, czy leczony osobnik odpowiedział na pierwszy kurs terapii, w celu zmniejszenia prawdopodobieństwa remisji lub nawrotu. [00] W niektórych wykonaniach wynalazku opisane tu przeciwciała anty-cd40 albo ich fragmenty wiążące antygen stosuje się w kombinacji z chemioterapią lub terapią cytokiną, przy czym przeciwciało i środek chemioterapeutyczny (środki terapeutyczne) albo cytokinę (cytokiny) można podawać kolejno, w dowolnym porządku, albo jednocześnie (wspólnie albo w tym samym zakresie czasowym). Przykłady odpowiednich środków chemioterapeutycznych obejmują między innymi CPT-11 (irynotekan), który można stosować np. w leczeniu raka jelita grubego i niedrobnokomórkowego raka płuc; gemcytabinę, którą można stosować na przykład w leczeniu raka płuc, raka piersi i raka nabłonkowego jajnika; oraz inne środki chemioterapeutyczne użyteczne w leczeniu guzów litych. Do cytokin będących przedmiotem zainteresowania należą między innymi interferon α, interferon gamma, interleukina 2 (IL- 2), IL-12, IL-1 i IL-21, czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF), czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów (G-CSF) i aktywne biologicznie warianty tych cytokin.

68 [01] W innych wykonaniach wynalazku opisane tu przeciwciała anty-cd40 albo ich fragmenty wiążące antygen stosuje się w połączeniu z innymi przeciwciałami monoklonalnymi przeznaczonymi do leczenia guzów litych. Jeśli osobnika poddaje się na przykład leczeniu raka piersi zawierającego komórki nowotworowe wykazujące ekspresję CD40, wówczas terapia powinna obejmować podawanie skutecznych ilości antagonistycznych przeciwciał anty-cd40 opisanych w niniejszym opisie albo ich fragmentów wiążących antygen, w połączeniu z podawaniem skutecznych ilości leku Herceptin (Genentech, Inc. San Francisco, Kalifornia, USA), który dociera do białka receptora Her2 na Her2+ komórkach raka piersi. Podobnie, jeśli osobnika poddaje się leczeniu raka jelita grubego zawierającego komórki nowotworowe wykazujące ekspresję CD40, wówczas terapia powinna obejmować podawanie skutecznych ilości antagonistycznego przeciwciała anty-cd40 opisanego w niniejszym opisie albo jego fragmentu wiążącego antygen w połączeniu z podawaniem skutecznych ilości humanizowanego przeciwciała monoklonalnego Avastin (znanego również jako bewacyzumab; Genentech, Inc., San Francisco, Kalifornia, USA), które wiąże się z czynnikiem wzrostu śródbłonka naczyń (VEGF), białkiem, które odgrywa kluczową rolę w angiogenezie guza litego i hamuje to białko. Do innych przykładów przeciwciał monoklonalnych przeznaczonych do leczenia guzów litych, które można stosować w połączeniu w przeciwciałami anty-cd40 według wynalazku, należą między innymi przeciwciało anty-egfr, dla którego celem jest receptor czynnika wzrostu naskórka, np. IMC-C22 (ImClone Systems, Nowy Jork, Nowy Jork, USA) (patrz np. Mendelsohn i Baselga (00) Oncogene 19: i Solbach i wsp. (02) Int. J. Cancer 1: ); przeciwciało przeciw receptorowi IGF-1, dla którego celem jest białko receptora

69 69 IGF-1 (patrz na przykład Maloney i wsp. (03) Cancer Res. 63: i Hailey i wsp. (02) Mol. Cancer Ther. 1: ; przeciwciało przeciw MUC1, dla którego celem jest związany z rakiem antygen MUC1; anty-αβ1, anty-αvβ i 1 2 anty-αvβ3, dla których celami są te odpowiednie integryny, które regulują procesy adhezji komórkowej i przekazywania sygnałów biorące udział w proliferacji i przeżywalności komórki (patrz np. Laidler i wsp. (00) Acta Biochimica Polonica 47(4): i Cruet-Hennequart i wsp. (03) Oncogene 22(11): ); przeciwciało przeciw kadherynie P, dla którego celem jest członek rodziny kadheryny (patrz np. publikacja zgłoszenia patentowego Stanów Zjednoczonych 03/ w trakcie rozpatrywania); i przeciwciało przeciw kadherynie VE, dla którego celem jest funkcja angiogenna tej cząsteczki adhezyjnej swoistej wobec komórki śródbłonka (patrz np. Liao i wsp. (02) Cancer Res. 62: ). [02] Przeciwciała anty-cd40 według wynalazku i inne przeciwciało monoklonalne można stosować kolejno, w dowolnym porządku, albo jednocześnie (wspólnie albo w tym samym zakresie czasowym). Jeśli stosuje się więcej niż jeden typ monoklonalnego przeciwciała, wówczas sposoby według ujawnienia mogą dalej obejmować wystawianie na napromienianie i/lub chemioterapię dopuszczoną do leczenia danego nowotworu i zaleconą przez nadzorującego lekarza klinicystę. Preparaty farmaceutyczne i sposoby stosowania [03] Przeciwciała anty-cd40 przeznaczone do stosowania w sposobach według wynalazku podaje się w stężeniu terapeutycznie skutecznym w profilaktyce bądź leczeniu guzów litych zawierających komórki nowotworowe wykazujące ekspresję CD40, w tym raka jajnika, raka płuc (np. postaci

70 płaskokomórkowej, gruczolakoraka i wielkokomórkowej niedrobnokomórkowego raka płuc oraz drobnokomórkowego raka płuc), raka piersi, raka okrężnicy, raka nerki (w tym np. gruczolakoraków nerki), pęcherza moczowego, wątroby (w tym np. raka wątrobowokomórkowego), żołądka, szyjki macicy, gruczołu krokowego, jamy nosowo-gardłowej, tarczycy (np. brodawkowatego raka wątroby) i nowotworów skóry, takich jak czerniak i mięsaki (w tym np. kostniakomięsaki i mięsaki Ewinga). Dla osiągnięcia tego celu, z przeciwciał można wytwarzać preparaty, wykorzystując wiele różnych substancji pomocniczych znanych ze stanu techniki. Przeciwciała podaje się na ogół przez wstrzyknięcie dożylne, dootrzewnowe albo do guza litego. Sposoby wykonania tego podania są znane specjalistom z tej dziedziny. Istnieje również możliwość uzyskania kompozycji, które można podawać miejscowo albo doustnie albo takich, które mają właściwości przenikania przez błony śluzowe. [04] Korzystnym sposobem podawania dożylnego jest podawanie przez wlewy trwające od około godziny do około godzin, korzystniej od około 1 do około 8 godzin, jeszcze korzystniej, od około 2 do około 7 godzin, a jeszcze bardziej korzystnie, od około 4 do około 6 godzin, zależnie od rodzaju podawanego przeciwciała anty-cd40. Pierwszy wlew tej kompozycji farmaceutycznej można podawać przez czas od około 4 do około 6 godzin, a następne wlewy można podawać szybciej. Następne wlewy mogą trwać od około 1 do około 6 godzin, w tym na przykład od około 1 do około 4 godzin, od około 1 do około 3 godzin albo od około 1 do około 2 godzin. [0] Kompozycję farmaceutyczną według wynalazku wytwarza się tak, aby była zgodna z zamierzoną drogą podania. Przykłady możliwych dróg stosowania obejmują drogę pozajelitową (np. dożylną (i.v.), domięśniową (i.m.),

71 śródskórną, podskórną (s.c.), dootrzewnową, do guza litego lub wlew), drogę doustną lub dopłucną (np. przez inhalacje), donosową, przezskórną (miejscową), przez błony śluzowe i doodbytniczą. Roztwory i zawiesiny przeznaczone do stosowania pozajelitowego, śródskórnego lub podskórnego mogą zawierać następujące składniki: jałowy rozcieńczalnik, taki jak woda do wstrzyknięć, roztwór soli fizjologicznej, oleje utwardzone, glikole polietylenowe, glicerynę, glikol propylenowy bądź inne rozpuszczalniki syntetyczne; środki przeciwbakteryjne, takie jak alkohol benzylowy lub metyloparabeny; środki przeciwutleniające, takie jak kwas askorbinowy lub dwusiarczyn sodu; środki chelatujące, takie jak kwas etylenodiaminoczterooctowy; bufory, takie jak octany, cytryniany lub fosforany i środki służące do ustawienia toniczności, takie jak chlorek sodu i dekstroza; wartość ph można ustawiać kwasami lub zasadami, takimi jak kwas chlorowodorowy i wodorotlenek sodu. Preparat pozajelitowy można zamknąć w ampułkach, strzykawkach jednorazowego użytku lub we fiolkach wielodawkowych wykonanych ze szkła lub z tworzywa plastycznego. [06] Przeciwciała anty-cd40 na ogół dostarcza się technikami standardowymi, w dopuszczalnym farmaceutycznie buforze, na przykład w jałowej soli fizjologicznej, w jałowej buforowanej wodzie, w glikolu propylenowym, w połączeniach powyższych środków i innych. Sposoby wytwarzania środków stosowanych pozajelitowo opisano w encyklopedii Remington s Pharmaceutical Sciences (wyd. 18; Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania, USA, 1990). [07] Patrz również na przykład WO 98/6418, w którym opisano stabilizowane preparaty farmaceutyczne przeciwciała, odpowiednie do stosowania w sposobach według niniejszego ujawnienia.

72 [08] Ilość co najmniej jednego przeciwciała anty-cd40 lub jego fragmentu, jaką należy podać, z łatwością określi specjalista z tej dziedziny bez zbędnego eksperymentowania, biorąc pod uwagę ujawnienie podane w niniejszym opisie. Do czynników wpływających ma sposób podawania i odpowiednią ilość co najmniej jednego antagonistycznego przeciwciała anty-cd40 (albo jego fragmentu) należą między innymi konkretny typ guza podlegający terapii, stopień zaawansowania choroby, historia choroby, wiek, wzrost, masa ciała, ogólny stan zdrowia i kondycja fizyczna osobnika poddawanego leczeniu. Podobnie, ilość antagonistycznego przeciwciała anty-cd40 albo jego fragmentu, jaka ma być podana, będzie zależeć od drogi podania i od tego, czy osobnik ten otrzymuje pojedynczą dawkę czy wiele dawek tego środka przeciwnowotworowego. Generalnie, zaleca się tym wyższe dawki przeciwciała anty-cd40 albo jego fragmentu, im większa jest masa ciała pacjenta poddawanego leczeniu. Dawka przeciwciała anty-cd40 albo jego fragmentu, jaka ma być zastosowana, zawiera się w zakresie od około 0,003 mg/kg do około 0 mg/kg, korzystnie, w zakresie od około 0,01 mg/kg do około 40 mg/kg. Dawką tą może być więc na przykład 0,01 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0, mg/kg, 1 mg/kg, 1, mg/kg, 2 mg/kg, 2, mg/kg, 3 mg/kg, mg/kg, 7 mg/kg, mg/kg, 1 mg/kg, mg/kg, 2 mg/kg, mg/kg, 3 mg/kg, 40 mg/kg, 4 mg/kg lub 0 mg/kg. [09] W innym wykonaniu wynalazku sposób polega na stosowaniu dawek wielokrotnych antagonistycznego przeciwciała anty-cd40 albo jego fragmentu. Sposób ten może polegać na stosowaniu 1, 2, 3, 4,, 6, 7, 8, 9,, 1,, 2,, 3, 40 lub większej ilości skutecznych leczniczo dawek kompozycji farmaceutycznej, zawierającej antagonistyczne przeciwciało anty-cd40 albo jego fragment. Częstość i czas trwania podawania dawek wielokrotnych

73 kompozycji farmaceutycznych, zawierających przeciwciało anty-cd40 lub jego fragment, może łatwo określić specjalista bez zbędnego eksperymentowania, na podstawie niniejszego ujawnienia. Poza tym, leczenie danego osobnika skuteczną leczniczo ilością przeciwciała będzie polegać na leczeniu jednorazowym bądź korzystnie, może obejmować serie leczenia. W korzystnym przykładzie, osobnika leczy się antagonistycznym przeciwciałem anty-cd40 albo jego fragmentem wiążącym antygen, podawanym w dawce zawierającej się w zakresie od około 0,1 do mg/kg masy ciała, raz na tydzień przez okres od około jednego do tygodni, korzystnie, od około 2 do 8 tygodni, korzystniej, od około 3 do 7 tygodni a jeszcze korzystniej, przez około 4, lub 6 tygodni. Leczenie można stosować co rok, aby zapobiec nawrotowi albo przy wykryciu nawrotu choroby. Bierze się również pod uwagę, że skuteczna dawka przeciwciała lub jego fragmentu wiążącego antygen użyta do leczenia może być zwiększona lub zmniejszona w czasie trwania danego leczenia. Zmiany w dawkowaniu mogą wynikać i stawać się oczywiste w świetle prób diagnostycznych opisanych w niniejszym opisie. W jednym z wykonań schemat dawkowania obejmuje więc pierwsze podawanie skutecznej leczniczo dawki co najmniej jednego przeciwciała anty-cd40 lub jego fragmentu w dniach 1, 7, 14 i 21 kursu leczenia. W innym wykonaniu schemat dawkowania obejmuje pierwsze podanie skutecznej leczniczo dawki co najmniej jednego przeciwciała anty-cd40 lub jego fragmentu w dniach 1, 2, 3, 4,, 6 i 7 tygodnia w danym kursie leczenia. Dalsze wykonania obejmują schemat dawkowania polegający na pierwszym podaniu skutecznej leczniczo dawki co najmniej jednego przeciwciała anty-cd40 lub jego fragmentu w dniach 1, 3, i 7 tygodnia w danym kursie leczenia; schemat dawkowania polegający na pierwszym podaniu skutecznej leczniczo dawki co najmniej

74 jednego przeciwciała anty-cd40 lub jego fragmentu w dniach 1 i 3 tygodnia w danym kursie leczenia; oraz zalecany schemat dawkowania polegający na pierwszym podaniu skutecznej leczniczo dawki co najmniej jednego przeciwciała anty-cd40 lub jego fragmentu w dniu 1 tygodnia w danym kursie leczenia. Kurs leczenia może trwać jeden tydzień, 2 tygodnie, 3 tygodnie, miesiąc, 3 miesiące, 6 miesięcy lub rok. Kursy leczenia mogą następować po sobie albo być oddzielone jeden od drugiego przerwą jednodniową, tygodniową, 2-tygodniową, miesięczną, 3-miesięczną, 6- miesięczną albo roczną. [01] W niektórych wykonaniach, leczniczo skuteczne dawki antagonistycznego przeciwciała anty-cd40 lub jego fragmentu wiążącego antygen zawierają się w zakresie od około 0,003 mg/kg do około 0 mg/kg, w zakresie od około 0,01 mg/kg do około 40 mg/kg, od około 0,01 mg/kg do około mg/kg, od około 0,1 mg/kg do około mg/kg, od około 0, mg/kg do około mg/kg, od około 1 mg/kg do około mg/kg, od około 3 mg/kg do około mg/kg, od około 3 mg/kg do około 2 mg/kg, od około 3 mg/kg do około mg/kg, od około mg/kg do około 1 mg/kg, od około 7 mg/kg do około 12 mg/kg. Dawką dowolnego antagonistycznego przeciwciała anty- CD40 albo jego fragmentu wiążącego antygen, na przykład przeciwciała monoklonalnego anty-cd40 CHIR-12.12, CHIR-.9 albo jego fragmentu wiążącego antygen, może być zatem na przykład dawka 0,003 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0, mg/kg, 1 mg/kg, 1, mg/kg, 2 mg/kg, 2, mg/kg, 3 mg/kg, mg/kg, 7 mg/kg, mg/kg, 1 mg/kg, mg/kg, 2 mg/kg, mg/kg, 3 mg/kg, 40 mg/kg, 4 mg/kg lub 0 mg/kg lub inne takie dawki zawierające się w zakresie od około 0,003 mg/kg do około 0 mg/kg. W każdym tygodniu dawkowania przeciwciała można podawać takie same skuteczne leczniczo dawki antagonistycznego przeciwciała

75 7 1 2 anty-cd40 albo jego fragmentu wiążącego antygen. Alternatywnie, w czasie trwania danego kursu leczenia można stosować różne dawki skuteczne leczniczo antagonistycznego przeciwciała anty-cd40 albo jego fragmentu wiążącego antygen. [0111] W innych wykonaniach, początkowa, skuteczna leczniczo dawka antagonistycznego przeciwciała anty-cd40 lub jego fragmentu wiążącego antygen zdefiniowana w innych częściach niniejszego opisu, może się zawierać w niższym zakresie dawek (np. od około 0,003 mg/kg do około mg/kg), a następne dawki wchodzą w wyższy zakres dawek (np. od około mg/kg do około 0 mg/kg). [0112] W wykonaniach alternatywnych, początkowa, skuteczna leczniczo dawka antagonistycznego przeciwciała anty-cd40 lub jego fragmentu wiążącego antygen zdefiniowana w innych częściach niniejszego opisu może się zawierać w górnym zakresie dawkowania (np. od około mg/kg do około 0 mg/kg), natomiast następne dawki będą się mieścić w niższym zakresie dawek (np. od 0,003 mg/kg do około mg/kg). W jednym z wykonań początkowa, skuteczna leczniczo dawka antagonistycznego przeciwciała anty-cd40 lub jego fragmentu wiążącego antygen wynosi więc od około mg/kg do około 3 mg/kg, obejmując dawki około mg/kg, około 2 mg/kg, około mg/kg, około 3 mg/kg i następne skuteczne leczniczo dawki antagonistycznego przeciwciała anty-cd40 lub jego fragmentu wiążącego antygen będą wynosić od około mg/kg do około 1 mg/kg, obejmując dawki około mg/kg, 8 mg/kg, mg/kg, 12 mg/kg i około 1 mg/kg. [0113] W niektórych wykonaniach według niniejszego ujawnienia terapię antagonistycznym przeciwciałem anty-cd40 rozpoczyna się przez podanie dawki nasycającej tego przeciwciała lub jego fragmentu wiążącego antygen osobnikowi potrzebującemu terapii antagonistycznym

76 przeciwciałem anty-cd40. Przez dawkę nasycającą rozumie się początkową dawkę antagonistycznego przeciwciała anty- CD40 lub jego fragmentu wiążącego antygen, jaką podaje się danemu osobnikowi, przy czym podana dawka tego przeciwciała lub jego fragmentu wiążącego antygen zawiera się w wyższym zakresie dawkowania (czyli od około mg/kg do około 0 mg/kg). Dawkę nasycającą można stosować jako jedno podanie, na przykład, jako jeden wlew, w którym przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen podaje się dożylnie albo jako podawania wielokrotne, na przykład, drogą wielu wlewów, w których przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen podaje się dożylnie tak długo, aż w czasie około 24 godzin zostanie podana całkowita dawka nasycająca. Po podaniu dawki nasycającej osobnikowi temu podaje się następnie jedną lub większą ilość dodatkowych dawek skutecznych leczniczo antagonistycznego przeciwciała anty-cd40 lub jego fragmentu wiążącego antygen. Następne dawki skuteczne leczniczo można podawać na przykład w schemacie dawkowania co tydzień albo raz na dwa tygodnie, raz na trzy tygodnie albo raz na cztery tygodnie. W tych wykonaniach następne dawki skuteczne leczniczo na ogół zawierają się w niższym zakresie dawkowania (np. od 0,003 mg/kg do około mg/kg). [0114] Alternatywnie, w pewnych wykonaniach, po podaniu dawki nasycającej, następne skuteczne leczniczo dawki antagonistycznego przeciwciała anty-cd40 lub jego fragmentu wiążącego antygen podaje się według schematu podtrzymującego, w którym skuteczną leczniczo dawkę przeciwciała lub jego fragmentu wiążącego antygen podaje się raz na miesiąc, raz na 6 tygodni, raz na dwa miesiące, raz na tygodni, raz na trzy miesiące, raz na 14 tygodni, raz na 4 miesiące, raz na 18 tygodni, raz na pięć miesięcy, raz na 22 tygodnie, raz na sześć miesięcy, raz na 7

77 miesięcy, raz na 8 miesięcy, raz na 9 miesięcy, raz na miesięcy, raz na 11 miesięcy albo raz na 12 miesięcy. W takich wykonaniach skuteczne leczniczo dawki antagonistycznego przeciwciała anty-cd40 lub jego fragmentu wiążącego antygen mieszczą się w niższym zakresie dawek (np. od 0,003 mg/kg do około mg/kg), szczególnie wtedy, gdy następne dawki podaje się w krótszych odstępach czasu, na przykład, raz na dwa tygodnie do raz na miesiąc albo w wyższym zakresie dawek (np. od około mg/kg do około 0 mg/kg), szczególnie wtedy, gdy następne dawki podaje się w dłuższych odstępach czasu, na przykład, gdy następne dawki podaje się w odstępach od jednego miesiąca do 12 miesięcy. [011] Antagonistyczne przeciwciała anty-cd40 występujące w kompozycjach farmaceutycznych opisanych w niniejszym zgłoszeniu do stosowania w sposobach według ujawnienia, mogą być natywne albo otrzymane z użyciem technik rekombinacji i mogą pochodzić z dowolnego źródła, w tym od ssaków, takich jak mysz, szczur, królik, naczelny, świnia i człowiek. Korzystnie, te polipeptydy pochodzą ze źródła ludzkiego, a jeszcze korzystniej, są ludzkimi białkami rekombinowanymi, otrzymanymi z linii ludzkich komórek hybrydoma. [0116] Kompozycje farmaceutyczne użyteczne w sposobach według wynalazku mogą zawierać aktywne biologicznie warianty antagonistycznych przeciwciał anty-cd40 według wynalazku. Takie warianty powinny zachować pożądaną aktywność biologiczną natywnego polipeptydu, tak aby po podaniu osobnikowi kompozycja farmaceutyczna zawierająca wariantowy polipeptyd wywierała takie samo działanie, jak kompozycja farmaceutyczna zawierająca natywny polipeptyd. Oznacza to, że wariantowe przeciwciało anty-cd40 będzie pełnić rolę aktywnego składnika leczniczego w kompozycji farmaceutycznej w sposób podobny do tego, jaki obserwuje

78 się w przypadku natywnego antagonistycznego przeciwciała, na przykład CHIR-.9 lub CHIR-12.12, ulegającego ekspresji w liniach komórek hybrydoma, odpowiednio,.9 i Ze stanu techniki znane są sposoby oznaczania, czy wariantowe przeciwciało anty-cd40 zachowuje żądaną aktywność biologiczną, a więc, czy służy jako składnik aktywny leczniczo w kompozycji farmaceutycznej. Aktywność biologiczną wariantów przeciwciała można oznaczać, wykorzystując próby specjalnie zaprojektowane do pomiaru aktywności natywnego antagonistycznego przeciwciała, w tym próby opisane w niniejszym wynalazku. [0117] Jako składnik aktywny leczniczo w sposobach według ujawnienia można stosować dowolną kompozycję farmaceutyczną, zawierającą antagonistyczne przeciwciało anty-cd40 o właściwościach wiązania opisanych w niniejszym opisie. Ciekłe, liofilizowane albo suszone rozpryskowo kompozycje zawierające jedno lub większą ilość antagonistycznych przeciwciał anty-cd40 według wynalazku można zatem wytwarzać w postaci wodnego lub niewodnego roztworu lub zawiesiny do późniejszego stosowania u osobnika zgodnie ze sposobami niniejszego ujawnienia. Każda z tych kompozycji będzie zawierała co najmniej jedno spośród antagonistycznych przeciwciał anty-cd40 według wynalazku jako składnik aktywny leczniczo lub profilaktycznie. Pod pojęciem składnik aktywny leczniczo lub profilaktycznie rozumie się, że przeciwciało anty-cd40 jest specjalnie wprowadzone do kompozycji w celu wywarcia pożądanej odpowiedzi leczniczej lub profilaktycznej w odniesieniu do leczenia, profilaktyki albo diagnozy guza litego u osobnika, kiedy ta kompozycja farmaceutyczna zostanie podana temu osobnikowi. Korzystnie, kompozycje farmaceutyczne zawierają odpowiednie środki stabilizujące, zagęszczające albo jedne i drugie celem zminimalizowania

79 79 problemów związanych ze zmniejszaniem się stabilności białka i spadkiem aktywności biologicznej podczas wytwarzania preparatu i jego przechowywania. 1 2 [0118] Do kompozycji farmaceutycznych zawierających antagonistyczne przeciwciało według wynalazku można dodać środki pomocnicze. Do takich środków pomocniczych należą między innymi oleje, polimery, witaminy, węglowodany, aminokwasy, sole, bufory, albumina, środki powierzchniowo czynne albo zagęszczające. Korzystnie, jako węglowodany można stosować cukier albo alkohole cukrowe, takie jak mono-, di- albo polisacharydy albo rozpuszczalne w wodzie glukany. Sacharydy lub glukany mogą obejmować fruktozę, glukozę, mannozę, sorbozę, ksylozę, maltozę, sacharozę, dekstran, pullulan, dekstrynę, α- i β-cyklodekstrynę, skrobię rozpuszczalną, hydroksyetyloskrobię i karboksymetylocelulozę albo ich mieszaniny. Alkohol cukrowy definiuje się jako C 4 do C 8 -węglowodór posiadający grupę hydroksylową; definicja ta obejmuje galaktytol, inozytol, mannitol, ksylitol, sorbitol, glicerol i arabitol. Powyższe cukry bądź alkohole cukrowe mogą być stosowane indywidualnie albo w połączeniu. Stężenie cukru bądź alkoholu cukrowego wynosi od 1,0% do 7% wagowoobjętościowych (masa/obj.), bardziej korzystnie, od 2,0% do 6% masa/obj. Korzystnie, aminokwasy obejmują lewoskrętne formy (L) karnityny, argininy i betainy; można jednak dodać inne aminokwasy. Do korzystnych polimerów należą: poliwinylopirolidon (PVP) o średniej masie cząsteczkowej od 00 do 00 albo glikol polietylenowy (PEG) o średniej masie cząsteczkowej od 00 do 000. Środki powierzchniowo czynne, które można dodać do preparatu, omówiono w publikacjach patentowych EP i EP 2681.

80 [0119] Dodatkowo, przeciwciała można modyfikować chemicznie przez kowalencyjne sprzęgniecie z polimerem, na przykład w celu zwiększenia ich czasu półtrwania w układzie krążenia. Korzystne polimery i sposoby przyłączania ich do peptydów ujawniono w patentach Stanów Zjednoczonych 4,766,6, 4,179,337, 4,49,28 i 4,609,46. Korzystnymi polimerami są polioksyetylowane poliole i glikol polietylenowy (PEG). PEG jest rozpuszczalny w wodzie w temperaturze pokojowej i ma wzór ogólny: R(O-CH 2 -CH 2 ) n -O-R, w którym R może oznaczać wodór albo grupę ochronną, taką jak grupa alkilowa albo alkanolowa. Korzystnie, grupa ochronna zawiera od 1 do 8 atomów węgla, korzystnie, jest to grupa metylowa. Symbol n oznacza liczbę całkowitą dodatnią, korzystnie ma wartość od 1 do 00, bardziej korzystnie od 2 do 00. Średnia masa cząsteczkowa PEG wynosi korzystnie od 00 do 40000, korzystniej od 00 do 000, a najkorzystniej od 00 do 100. Korzystnie, PEG zawiera co najmniej jedną grupę hydroksylową, korzystniej jest to końcowa grupa hydroksylowa. To właśnie grupa hydroksylowa jest tą grupą, którą korzystnie aktywuje się do reakcji z wolną grupą aminową inhibitora. Jednakże, należy rozumieć, że typ i ilość grup reaktywnych można zmieniać celem osiągnięcia kowalencyjnego sprzężenia PEG/przeciwciało według wynalazku. [01] W niniejszym wynalazku są również użyteczne rozpuszczalne w wodzie polioksyetylowane poliole. Należą do nich: polioksyetylowany sorbitol, polioksyetylowana glukoza, polioksyetylowany glicerol (POG) i podobne. Zalecany jest POG. Jedną z przyczyn jest to, że rdzeń glicerolu w polioksyetylowanym glicerolu jest taki sam, jaki występuje w stanie naturalnym, na przykład u zwierząt i u ludzi w mono-, di- i trójglicerydach. Takie rozgałęzienie nie musiałoby zatem być rozpoznawane jako

81 obcy środek w organizmie. POG ma korzystną masę cząsteczkową, mieszczącą się w tym samym zakresie, co PEG. Strukturę POG podano w publikacji Knaufa i wsp. (1988) J. Bio. Chem. 263: 64-70, a opis koniugatów POG/IL-2 znajduje się w patencie Stanów Zjednoczonych 4,766,6. [0121] Innym układem dostarczania leku, zwiększającym czas półtrwania w układzie krążenia, jest liposom. Sposoby wytwarzania liposomowych układów dostarczania są opisane w publikacjach: Gabizon i wsp. (1982) Cancer Research 42: 4734; Cafiso (1981) Biochem. Biophys. Acta 649: 129; i Szoka (1980) Ann. Rev. Biophys. Eng. 9: 467. Inne układy dostarczania są znane ze stanu techniki i są opisane np. w publikacji Poznansky i wsp. (1980) Drug Delivery Systems (wyd. R.L. Juliano, Oxford, N.Y.) strony 23-31; Poznansky (1984) Pharm. Revs 36: 277. [0122] Środki pomocnicze wprowadzane do kompozycji farmaceutycznej powinny zapewnić stabilność antagonistycznego przeciwciała anty-cd40 albo jego fragmentu wiążącego antygen. Oznacza to, że to antagonistyczne przeciwciało anty-cd40 albo jego fragment wiążący antygen powinien zachować swą stabilność fizyczną i/lub chemiczną i wykazywać żądaną aktywność biologiczną, czyli jedną lub więcej aktywności antagonistycznych zdefiniowanych powyżej, w tym między innymi hamowanie wydzielania immunoglobuliny wytwarzanej przez prawidłowe ludzkie obwodowe komórki B stymulowane komórkami T, hamowanie przeżywalności i/lub proliferacji prawidłowych ludzkich obwodowych komórek B stymulowanych komórkami T Jurkata, hamowanie przeżywalności i/lub proliferacji prawidłowych ludzkich obwodowych komórek B stymulowanych komórkami wykazującymi ekspresję CD40L albo rozpuszczalnym ligandem CD40 (scd40l), hamowanie antyapoptotycznych wewnątrzkomórkowych sygnałów przeżycia w dowolnej komórce

82 stymulowanej przez scd40l albo stałą fazę CD40L, hamowanie przesyłania sygnału CD40 w dowolnej komórce w wyniku ligacji z scd40l albo ze stałą fazą CD40L i hamowanie proliferacji ludzkich złośliwych komórek B, jak podano w innej części niniejszego opisu. [0123] Sposoby monitorowania stabilności białka są dobrze znane ze stanu techniki. Patrz na przykład Jones (1993) Adv. Grug Delivery Rev. : 29-90; Lee, red. (1991) Peptide and Protein Drug Delivery (Marcel Dekker, Inc., Nowy Jork, Nowy Jork) oraz próby stabilności opisane poniżej w niniejszym opisie. Stabilność białka oznacza się zwykle w wybranej temperaturze w określonym czasie. W korzystnych wykonaniach stabilny preparat farmaceutyczny przeciwciała zapewnia stabilność antagonistycznego przeciwciała anty- CD40 albo jego fragmentu wiążącego antygen, jeśli jest przechowywany w temperaturze pokojowej (około 2 o C) przez co najmniej 1 miesiąc, przez co najmniej 3 miesiące, przez co najmniej 6 miesięcy i/lub jest stabilny w temperaturze około 2-8 o C przez co najmniej 6 miesięcy, przez co najmniej 9 miesięcy, przez co najmniej 12 miesięcy, przez co najmniej 18 miesięcy, przez co najmniej 24 miesiące. [0124] Uznaje się, że białko takie jak przeciwciało, po wytworzeniu go w formie kompozycji farmaceutycznej, zachowuje stabilność fizyczną w danym punkcie czasowym, jeśli nie wykazuje żadnych wizualnych oznak (np. zabarwienia albo utraty klarowności) albo cech dających się oznaczyć (z użyciem na przykład metody chromatografii wykluczenia (SEC) albo rozproszenia światła UV), strącania, agregacji i/lub denaturacji w tej kompozycji farmaceutycznej. W odniesieniu do stabilności chemicznej, uznaje się, że białko takie jak przeciwciało, po wytworzeniu go w formie kompozycji farmaceutycznej,

83 zachowuje stabilność chemiczną w danym punkcie czasowym, jeśli oznaczenia stabilności chemicznej wskazują, że białko to (np. przeciwciało) zachowuje będącą przedmiotem zainteresowania aktywność biologiczną w tej kompozycji farmaceutycznej. Sposoby monitorowania zmian w stabilności chemicznej są dobrze znane ze stanu techniki i obejmują między innymi metody wykrywania zmienionych chemicznie form białka, takich jakie są wynikiem cięcia z użyciem na przykład SDS-PAGE, SEC i/lub spektrometrii masowej z jonizacją techniką desorpcji laserowej z udziałem matrycy, z analizatorem czasu przelotu i rozpadu związanego ze zmianami w ładunkach cząsteczki (na przykład związanych z deamidacją), za pomocą na przykład chromatografii jonowymiennej. Patrz na przykład sposoby ujawnione w dalszej części niniejszego opisu. [012] Uznaje się, że antagonistyczne przeciwciało anty- CD40 bądź jego fragment wiążący antygen po wytworzeniu go w formie kompozycji farmaceutycznej zachowuje żądaną aktywność biologiczną w danym punkcie czasowym, jeśli ta żądana aktywność biologiczna w tym czasie zawiera się w zakresie około %, korzystnie w zakresie około % żądanej aktywności biologicznej wykazywanej w czasie wytworzenia tej kompozycji farmaceutycznej, według oznaczenia w odpowiedniej próbie na żądaną aktywność biologiczną. Próby pomiaru żądanej aktywności biologicznej ujawnionych antagonistycznych przeciwciał anty-cd40 i ich fragmentów wiążących antygen można przeprowadzić w sposób opisany w przykładach w niniejszym opisie. Patrz również próby opisane przez Schultze i wsp. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 80-84; Denton i wsp. (1998) Pediatr. Transplant. 2: 6-1; Evans i wsp. (00) J. Immunol. 164: ; Noelle (1998) Agents Actions Suppl. 49: 17-22; Lederman i wsp. (1996) Curr. Opin. Hematol. 3: 77-86;

84 Coligan i wsp. (1991) Current Protocols in Immunology 13: 12; Kwekkeboom i wsp. (1993) Immunology 79: i patenty Stanów Zjednoczonych,674,492 i,847,082. [0126] W pewnych wykonaniach wynalazku antagonistyczne przeciwciało anty-cd40, na przykład przeciwciało monoklonalne CHIR-12.12, CHIR-.9 albo jego fragment wiążący antygen wytwarza się w postaci ciekłego preparatu farmaceutycznego. Antagonistyczne przeciwciało anty-cd40 albo jego fragment wiążący antygen można wytworzyć dowolnym sposobem znanym ze stanu techniki, w tym również sposobami ujawnionymi w niniejszym opisie, powyżej. W jednym z wykonań antagonistyczne przeciwciało anty-cd40, na przykład przeciwciało monoklonalne CHIR-12.12, CHIR-.9 albo jego fragment wiążący antygen, wytwarza się techniką rekombinacyjną w linii komórek CHO. [0127] Po wytworzeniu i oczyszczeniu z antagonistycznego przeciwciała anty-cd40 albo jego fragmentu wiążącego antygen można wytwarzać ciekły preparat farmaceutyczny w sposób podany w niniejszym opisie. Jeśli antagonistyczne przeciwciało anty-cd40 albo jego fragment wiążący antygen trzeba przechowywać przed wytworzeniem preparatu farmaceutycznego, wówczas można go utrzymywać w stanie zamrożenia, na przykład w temperaturze - o C, i następnie rozmrozić w temperaturze pokojowej do dalszego przetwarzania. Ciekły preparat farmaceutyczny zawiera skuteczną leczniczo ilość antagonistycznego przeciwciała anty-cd40 albo jego fragmentu wiążącego antygen. Ilość przeciwciała lub jego fragmentu wiążącego antygen obecna w preparacie jest dostosowana do drogi podania i żądanej objętości dawki. [0128] W ten sposób, ciekła kompozycja farmaceutyczna zawiera antagonistyczne przeciwciało anty-cd40, na przykład przeciwciało CHIR-12.12, CHIR-.9 albo jego fragment

85 8 1 2 wiążący antygen, w stężeniu od około 0,1 mg/ml do około 0,0 mg/ml, od około 0, mg/ml do około 40,0 mg/ml, od około 1,0 mg/ml do około,0 mg/ml, od około,0 mg/ml do około 2,0 mg/ml, od około,0 mg/ml do około,0 mg/ml albo od około 1,0 mg/ml do około 2,0 mg/ml. W pewnych wykonaniach ta ciekła kompozycja farmaceutyczna zawiera antagonistyczne przeciwciało anty-cd40 albo jego fragment wiążący antygen w stężeniu od około 0,1 mg/ml do około,0 mg/ml, od około,0 mg/ml do około,0 mg/ml, od około,0 mg/ml do około 1,0 mg/ml, od około 1,0 mg/ml do około,0 mg/ml, od około,0 mg/ml do około 2,0 mg/ml, od około 2,0 mg/ml do około,0 mg/ml, od około,0 mg/ml do około 3,0 mg/ml, od około 3,0 mg/ml do około 40,0 mg/ml, od około 40,0 mg/ml do około 4,0 mg/ml, od około 4,0 mg/ml do około 0,0 mg/ml. W innych wykonaniach ta ciekła kompozycja farmaceutyczna zawiera antagonistyczne przeciwciało anty-cd40 albo jego fragment wiążący antygen w stężeniu około 1,0 mg/ml, około 16,0 mg/ml, około 17,0 mg/ml, około 18,0 mg/ml, około 19,0 mg/ml, około,0 mg/ml, około 21,0 mg/ml, około 22,0 mg/ml, około 23,0 mg/ml, około 24,0 mg/ml albo około 2,0 mg/ml. Ta ciekła kompozycja farmaceutyczna zawiera antagonistyczne przeciwciało anty-cd40, na przykład przeciwciało CHIR , CHIR-.9 albo jego fragment wiążący antygen i bufor, który utrzymuje wartość ph preparatu w zakresie od około,0 do około 7,0, przy czym zakres ten obejmuje wartości ph około,0,,1,,2,,3,,4,,,,6,,7,,8,,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0 i inne takie wartości mieszczące się w zakresie od około,0 do około 7,0. W niektórych wykonaniach bufor utrzymuje ph preparatu w zakresie od około,0 do około 6,, od około,0 do około 6,0, od około,0 do około,, od około,

86 86 do około 7,0, od około, do około 6,, od około, do około 6,0. [0129] W tym preparacie może być użyty dowolny odpowiedni bufor, który utrzymuje wartość ph ciekłego preparatu przeciwciała anty-cd40 w zakresie od około,0 do około 7,0, o ile utrzymana jest stabilność fizykochemiczna i żądana aktywność biologiczna przeciwciała, co opisano powyżej. Do odpowiednich buforów należą między innymi konwencjonalne kwasy i ich sole, w których przeciwjonem może być na przykład jon sodowy, potasowy, amonowy, wapniowy lub magnezowy. Przykłady konwencjonalnych kwasów i ich soli, które można zastosować do buforowania tego ciekłego preparatu farmaceutycznego, obejmują między innymi bufory kwasu bursztynowego lub bursztynianu, kwasu 1 cytrynowego lub cytrynianu, kwasu octowego lub octanu, kwasu winowego lub winianu, kwasu fosforowego lub fosforanu, kwasu glukonowego lub glukonianu, kwasu glutaminowego lub glutaminianu, kwasu asparaginowego lub asparaginianu, kwasu maleinowego lub maleinianu i kwasu jabłkowego lub jabłczanu. Stężenie buforu w preparacie może wynosić od około 1 nm do około 0 mm, w tym około 1 mm, 2 mm, mm, 8 mm, mm, 1 mm, mm, 2 mm, mm, 3 mm, 40 mm, 4 mm, 0 mm lub może mieć inną wartość zawierającą się w zakresie od około 1 mm do około 0 mm. W pewnych 2 wykonaniach stężenie buforu w tym preparacie wynosi od około mm do około 1 mm, w tym może wynosić około mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, mm, 11 mm, 12 mm, 13 mm, 14 mm, 1 mm lub może mieć inną taką wartość w zakresie od około mm do około 1 mm. [01] W pewnych wykonaniach wynalazku ciekły preparat farmaceutyczny zawiera skuteczną leczniczo ilość antagonistycznego przeciwciała anty-cd40, na przykład przeciwciała monoklonalnego CHIR-12.12, CHIR-.9 albo jego

87 fragmentu wiążącego antygen i bufor bursztynianowy lub bufor cytrynianowy w stężeniu, które utrzymuje wartość ph tego preparatu w zakresie od około,0 do około 7,0, korzystnie od około,0 do około 6,. Terminy bufor bursztynianowy lub bufor cytrynianowy oznaczają bufor zawierający, odpowiednio, sól kwasu bursztynowego lub sól kwasu cytrynowego. W korzystnym wykonaniu przeciwjonem w bursztynianie lub cytrynianie jest kation sodowy, buforem jest zatem odpowiednio bursztynian sodu lub cytrynian sodu. Jednakże, zakłada się, że skuteczny jest każdy kation. Do innych możliwych kationów bursztynianu lub cytrynianu należą między innymi kation potasowy, amonowy, wapniowy i magnezowy. Jak wspomniano powyżej, stężenie buforu bursztynianowego lub cytrynianowego w tym preparacie może wynosić od około 1 mm do około 0 mm, w tym może wynosić około 1 mm, 2 mm, mm, 8 mm, mm, 1 mm, mm, 2 mm, mm, 3 mm, 40 mm, 4 mm, 0 mm lub może mieć inną wartość zawierającą się w zakresie od około 1 mm do około 0 mm. W pewnych wykonaniach stężenie buforu w tym preparacie wynosi od około mm do około 1 mm, w tym może wynosić około mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, mm, 11 mm, 12 mm, 13 mm, 14 mm albo około 1 mm. W innych wykonaniach ten ciekły preparat farmaceutyczny zawiera antagonistyczne przeciwciało anty-cd40, na przykład przeciwciało monoklonalne CHIR-12.12, CHIR-.9 albo jego fragment wiążący antygen w stężeniu od około 0,1 mg/ml do około 0,0 mg/ml albo od około,0 mg/ml do około 2,0 mg/ml i bufor bursztynianowy lub cytrynianowy, na przykład bufor bursztynianu sodu lub cytrynianu sodu, w stężeniu od około 1 nm do około mm, od około mm do około 1 mm, korzystnie około mm. [0131] Jeśli jest pożądane, aby ciekły preparat farmaceutyczny był prawie izotoniczny, wówczas ten ciekły

88 preparat farmaceutyczny zawierający skuteczną leczniczo ilość antagonistycznego przeciwciała anty-cd40, na przykład przeciwciała monoklonalnego CHIR-12.12, CHIR-.9 albo jego fragmentu wiążącego antygen i bufor, służący do utrzymania wartości ph tego preparatu w zakresie od około,0 do około 7,0, zawiera ponadto ilość środka nadającego izotoniczność wystarczającą, żeby wytworzyć preparat prawie izotoniczny. Pod terminem prawie izotoniczny rozumie się, że osmolarność preparatu wodnego wynosi od około 240 mmoli/kg do około 360 mmoli/kg, korzystnie od około 240 mmoli/kg do około 340 mmoli/kg, korzystniej, od około mmoli/kg do około 3 mmoli/kg, jeszcze bardziej korzystnie, od około 260 mmoli/kg do około 3 mmoli/kg i jeszcze bardziej korzystnie, od około 270 mmoli/kg do około 3 mmoli/kg. Sposoby oznaczania izotoniczności roztworu są znane specjalistom z tej dziedziny. Patrz na przykład Setnikar i wsp. (199) J. Am. Pharm. Assoc. 48: 628. [0132] Specjalistom z tej dziedziny znanych jest wiele różnych dopuszczalnych farmaceutycznie substancji rozpuszczonych, użytecznych w zapewnieniu izotoniczności kompozycji farmaceutycznych. Środkiem izotonizującym może być każdy odczynnik mający zdolność doprowadzenia ciśnienia osmotycznego ciekłego preparatu farmaceutycznego według wynalazku do wartości prawie równej ciśnieniu osmotycznemu płynu ustrojowego. Zalecane jest użycie dopuszczalnego fizjologicznie środka izotonizującego. Ciekły preparat farmaceutyczny zawierający skuteczną leczniczo ilość antagonistycznego przeciwciała anty-cd40, na przykład przeciwciała monoklonalnego CHIR-12.12, CHIR-.9 albo jego fragmentu wiążącego antygen i bufor, służący do utrzymania wartości ph tego preparatu w zakresie od około,0 do około 7,0, może więc ponadto zawierać składniki, które można stosować do zapewnienia izotoniczności, takie jak na

89 przykład chlorek sodu, aminokwasy, takie jak alanina, walina i glicyna, cukry, takie jak alkohole cukrowe (poliole), w tym między innymi glukozę, dekstrozę, fruktozę, sacharozę, maltozę, mannitol, trehalozę, glicerol, sorbitol i ksylitol, kwas octowy, inne kwasy organiczne i ich sole oraz względnie małe ilości cytrynianów lub fosforanów. Specjalista powinien znać dodatkowe środki odpowiednie do uzyskania optymalnej izotoniczności ciekłego preparatu. [0133] W pewnych korzystnych wykonaniach ten ciekły preparat farmaceutyczny, zawierający skuteczną leczniczo ilość antagonistycznego przeciwciała anty-cd40, na przykład przeciwciała monoklonalnego CHIR-12.12, CHIR-.9 albo jego fragmentu wiążącego antygen i bufor, służący do utrzymania wartości ph tego preparatu w zakresie od około,0 do około 7,0, zawiera ponadto jako środek izotonizujący chlorek sodu. Stężenie chlorku sodu w tym preparacie będzie zależeć od udziału innych składników w izotoniczności. W niektórych wykonaniach stężenie chlorku sodu wynosi od około 0 mm do około 0 mm, od około 0 mm do około mm, od około 0 mm do około 0 mm, od około 0 mm do około 17 mm, od około 0 mm do około mm, od około 7 mm do około 17 mm, od około 7 mm do około mm, od około 0 mm do około 17 mm, od około 0 mm do około 0 mm, od około 0 mm do około mm, od około 12 mm do około 17 mm, od około 12 mm do około mm, od około 1 mm do około 170 mm, od około 1 mm do około 160 mm, od około 13 mm do około 1 mm, od około 140 mm do około 1 mm albo od około 14 mm do około 1 mm. W jednym z wykonań stężenie chlorku sodu wynosi około mm. W innych takich wykonaniach stężenie chlorku sodu wynosi około mm, buforem jest bufor bursztynianu sodu albo cytrynianu sodu w stężeniu od około mm do około 1 mm, ten ciekły preparat

90 farmaceutyczny zawiera skuteczną leczniczo ilość antagonistycznego przeciwciała anty-cd40, na przykład przeciwciała monoklonalnego CHIR-12.12, CHIR-.9 albo jego fragmentu wiążącego antygen i wartość ph tego preparatu mieści się w zakresie od około,0 do około 7,0, od około,0 do około 6,0 albo od około, do około 6,. W innych wykonaniach ten ciekły preparat farmaceutyczny zawiera antagonistyczne przeciwciało anty-cd40, na przykład przeciwciało monoklonalne CHIR-12.12, CHIR-.9 albo jego fragment wiążący antygen w stężeniu od około 0,1 mg/ml do około 0,0 mg/ml albo od około,0 mg/ml do około 2,0 mg/ml, około mm chlorku sodu i około mm bursztynianu sodu albo cytrynianu sodu, a jego ph wynosi około,. [0134] Rozpad białka podczas mrożenia i rozmrażania albo ścierania mechanicznego podczas procesu sporządzania ciekłych preparatów farmaceutycznych według wynalazku można zahamować przez wprowadzenie do tego preparatu środków powierzchniowo czynnych w celu obniżenia napięcia powierzchniowego na granicy faz: roztwór/powietrze. W pewnych wykonaniach ten ciekły preparat farmaceutyczny zawiera zatem skuteczną leczniczo ilość antagonistycznego przeciwciała anty-cd40, na przykład przeciwciała monoklonalnego CHIR-12.12, CHIR-.9 albo jego fragmentu wiążącego antygen, bufor służący do utrzymania wartości ph tego preparatu w zakresie od około,0 do około 7,0 i dodatkowo środek powierzchniowo czynny. W innych wykonaniach ten ciekły preparat farmaceutyczny zawiera skuteczną leczniczo ilość antagonistycznego przeciwciała anty-cd40, na przykład przeciwciała monoklonalnego CHIR , CHIR-.9 albo jego fragmentu wiążącego antygen, bufor służący do utrzymania wartości ph tego preparatu w zakresie od około,0 do około 7,0, środek izotonizujący,

91 taki jak chlorek sodu w stężeniu od około 0 mm do około 0 mm i dodatkowo środek powierzchniowo czynny. [013] Typowymi stosowanymi tu środkami powierzchniowo czynnymi są niejonowe środki powierzchniowo czynne, w tym estry polioksyetylenu z sorbitolem, takie jak polisorbat 80 (Tween 80) i polisorbat (Tween ), estry polioksypropylenowo-polioksyetylenowe, takie jak Pluronic F68, alkohole polioksyetylenowe, takie jak Brij 3, symetykon; glikol polietylenowy, taki jak PEG400, lizofosfatydylocholina i polioksyetyleno-p-t-oktylofenol, taki jak Triton X-0. Klasyczne sposoby stabilizacji środków farmaceutycznych środkami powierzchniowo czynnymi albo emulgatorami są np. opisane w pracy Levine a i wsp. (1991) J. Parenteral Sci. Technol. 4 (3): Korzystnym środkiem powierzchniowo czynnym stosowanym w praktycznym wykonaniu wynalazku jest polisorbat 80. Jeśli stosuje się środek powierzchniowo czynny, to na ogół dodaje się go w ilości od około 0,001% do około 1,0% (wagowoobjętościowych), od około 0,001% do około 0,%, od około 0,001% do około 0,4%, od około 0,001% do około 0,3%, od około 0,001% do około 0,2%, od około 0,00% do około 0,%, od około 0,00% do około 0,2%, od około 0,01% do około 0,%, od około 0,01% do około 0,2%, od około 0,03% do około 0,%, od około 0,03% do około 0,3%, od około 0,0% do około 0,% albo od około 0,0% do około 0,2%. [0136] W pewnych wykonaniach ten ciekły preparat farmaceutyczny zawiera skuteczną leczniczo ilość antagonistycznego przeciwciała anty-cd40, na przykład przeciwciała monoklonalnego CHIR-12.12, CHIR-.9 albo jego fragmentu wiążącego antygen, jako bufor zawiera bursztynian sodu lub cytrynian sodu w stężeniu od około 1 mm do około 0 mm, od około mm do około 2 mm albo od około mm do około 1 mm; wartość ph preparatu utrzymuje się w zakresie

92 od około,0 do około 7,0, od około,0 do około 6,0 albo od około, do około 6,; preparat ten poza tym zawiera środek powierzchniowo czynny, na przykład polisorbat 80, w ilości od około 0,001% do około 1,0% albo od około 0,001% do około 0,%. Takie preparaty mogą ewentualnie zawierać środek izotonizujący, taki jak chlorek sodu, w stężeniu od około 0 mm do około 0 mm, od około 0 mm do około 0 mm albo od około 0 mm do około mm. W innych wykonaniach ten ciekły preparat farmaceutyczny zawiera antagonistyczne przeciwciało anty-cd40, na przykład przeciwciało monoklonalne CHIR-12.12, CHIR-.9 albo jego fragment wiążący antygen w stężeniu od około 0,1 mg/ml do około 0,0 mg/ml albo od około,0 mg/ml do około 2,0 mg/ml, w tym około mg/ml; ilość od około 0 mm do około 0 mm chlorku sodu, w tym około mm chlorku sodu; bursztynian sodu albo cytrynian sodu w ilości od około mm do około mm, w tym około mm bursztynianu sodu albo cytrynianu sodu; chlorek sodu w stężeniu od około 0 mm do około 0 mm, w tym około mm; i ewentualnie środek powierzchniowo czynny, na przykład polisorbat 80 w ilości od około 0,001% do około 1,0%, w tym od około 0,001% do około 0,%; przy czym wartość ph tego ciekłego preparatu farmaceutycznego wynosi od około,0 do około 7,0, od około,0 do około 6,0, od około,0 do około, od około, do około 6, albo od około, do około 6,0. [0137] Ten ciekły preparat farmaceutyczny może w zasadzie nie zawierać żadnych środków konserwujących ani innych nośników, substancji pomocniczych bądź stabilizatorów opisanych powyżej. Alternatywnie, preparat ten może zawierać jeden lub większą liczbę środków konserwujących, na przykład środków przeciwbakteryjnych, dopuszczalnych farmaceutycznie nośników, substancji pomocniczych lub środków stabilizujących opisanych powyżej, pod warunkiem,

93 że nie wpływają one niekorzystnie na stabilność fizykochemiczną antagonistycznego przeciwciała anty-cd40 albo jego fragmentu wiążącego antygen. Przykłady dopuszczalnych nośników, substancji pomocniczych i środków stabilizującychobejmują między innymi dodatkowe środki buforujące, współrozpuszczalniki, środki powierzchniowo czynne, antyutleniacze, w tym kwas askorbinowy, metioninę, środki chelatujące, takie jak EDTA, kompleksy metali (na przykład kompleksy cynk-białko) i polimery biodegradowalne, takie jak poliestry. Dokładny opis wytwarzania i doboru dopuszczalnych farmaceutycznie nośników, środków stabilizujących i środków zapewniających izotoniczność znajduje się w encyklopedii Remington s Pharmaceutical Sciences (wyd. 18; Mack Publishing Company, Eaton, Pensylwania, USA, 1990). [0138] Po wytworzeniu ciekłego preparatu farmaceutycznego lub innej kompozycji farmaceutycznej opisanej w niniejszym zgłoszeniu można ją poddać liofilizacji w celu zapobieżenia rozpadowi. Sposoby liofilizacji ciekłych kompozycji są znane specjalistom z tej dziedziny. Bezpośrednio przed użyciem kompozycję tę można rekonstytuować jałowym rozcieńczalnikiem (na jałowym roztworem Ringera, wodą destylowaną lub jałową solą fizjologiczną), który może zawierać dodatkowe składniki. Po rekonstytucji, kompozycję tę korzystnie podaje się osobnikom metodami znanymi specjalistom. Użycie antagonistycznych przeciwciał anty-cd40 do wytwarzania leków [0139] Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie antagonistycznego przeciwciała anty-cd40 lub jego fragmentu wiążącego antygen do wytwarzania leku do leczenia osobnika z guzem litym, w którym znajdują się komórki nowotworowe

94 wykazujące ekspresję antygenu CD40, przy czym podanie tego leku jest skoordynowane ze stosowaniem co najmniej jednej innej terapii przeciwnowotworowej. Przykłady takich nowotworów obejmują między innymi raka jajnika, raka płuc (np. postaci płaskokomórkowej, gruczolakoraka i wielkokomórkowej niedrobnokomórkowego raka płuc oraz drobnokomórkowego raka płuc), raka piersi, raka okrężnicy, raka nerki (w tym np. gruczolakoraki nerki), pęcherza moczowego, wątroby (w tym np. raka wątrobowokomórkowego), żołądka, szyjki macicy, gruczołu krokowego, jamy nosowogardłowej, tarczycy (np. brodawkowatego raka wątroby) i nowotwory skóry, takie jak czerniak i mięsaki (w tym np. kostniakomięsaki i mięsaki Ewinga). [0140] Pod terminem skoordynowane rozumie się, że lek ma być zastosowany albo przed zastosowaniem, albo w czasie stosowania, albo po zastosowaniu u danego osobnika co najmniej jednej innej terapii przeciwnowotworowej. Przykłady innych terapii przeciwnowotworowych obejmują między innymi operację chirurgiczną, napromienianie, chemioterapię, przy czym jako odpowiednie środki chemioterapeutyczne stosuje się między innymi fludarabinę albo fosforan fludarabiny, chlorambucyl, winkrystynę, pentostatynę, 2-chlorodezoksyadenozynę (kladrybinę), cyklofosfamid, doksorubicynę, prednizon i ich połączenia, na przykład schematy z zastosowaniem antracykliny, takie jak CAP (cyklofosfamid, doksorubicyna plus prednizon), CHOP (cyklofosfamid, winkrystyna, prednizon plus doksorubicyna), VAD (winkrystyna, doksorubicyna plus deksametazon), MP (melfalan plus prednizon) i inne środki cytotoksyczne i/lub terapeutyczne, środki stosowane w chemioterapii, takie jak mitoksantron, daunorubicyna, idarubicyna, asparaginaza i antymetabolity, w tym między innymi cytarabina, metotreksat, -fluorouracyl, dekarbazyna, 6-tioguanina, 6-

95 9 merkaptopuryna i nelarabina, terapia cytokiną, w tym między 1 2 innymi terapia α-interferonem, terapia gamma-interferonem, terapia interleukiną 2 (IL-2), IL-12, IL-1 i IL-2, czynnikiem stymulującym tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF), czynnikiem stymulującym tworzenie kolonii granulocytów (G-CSF) albo aktywnymi biologicznie wariantami tych cytokin lub innym przeciwciałem monoklonalnym przeznaczonym do leczenia danego guza litego, na przykład lekiem Herceptin (Genentech, Inc. San Francisco, Kalifornia, USA), który dociera do białka receptora Her2 na Her2+ komórkach raka piersi; humanizowanym przeciwciałem monoklonalnym Avastin (znanym również jako bewacyzumab; Genentech, Inc., San Francisco, Kalifornia, USA), które wiąże się z czynnikiem wzrostu śródbłonka naczyń (VEGF) i hamuje go, i ma zastosowanie w leczeniu raka okrężnicy, przeciwciałem anty-egfr, dla którego celem jest receptor czynnika wzrostu naskórka, np. IMC-C22 (ImClone Systems, Nowy Jork, Nowy Jork); przeciwciałem przeciw receptorowi IGF-1, którego celem jest białko receptora dla IGF-1; przeciwciałem przeciw MUC1, którego celem jest związany z rakiem antygen MUC1; przeciwciałami anty-αβ1, anty-αvβ i anty-αvβ3, dla których celami są te odpowiednie integryny, które regulują procesy adhezji komórkowej i przekazywania sygnałów, biorące udział w proliferacji i przeżywalności komórki; przeciwciałem przeciw kadherynie P, dla którego celem jest substancja z rodziny kadheryn (patrz np. publikacja zgłoszenia patentowego Stanów Zjednoczonych 03/ w trakcie rozpatrywania) i przeciwciałem przeciw kadherynie VE, dla którego celem jest funkcja związana z angiogenezą tej cząsteczki adhezyjnej swoistej wobec komórki śródbłonka; przy czym stosowanie tej dodatkowej terapii przeciwnowotworowej lub dodatkowych terapii

96 przeciwnowotworowych ma miejsce przed leczeniem, podczas leczenia lub po leczeniu tego osobnika lekiem zawierającym antagonistyczne przeciwciało anty-cd40 albo jego fragment wiążący antygen, które opisano powyżej. [0141] W niektórych wykonaniach przedmiotem wynalazku jest zatem na przykład użycie przeciwciała monoklonalnego CHIR , CHIR-.9 albo jego fragmentu wiążącego antygen do wytwarzania leku do leczenia osobnika z guzem litym, w którym znajdują się komórki nowotworowe wykazujące ekspresję antygenu CD40, przy czym podanie tego leku jest skoordynowane z leczeniem chemioterapią, w której środek chemioterapeutyczny jest wybrany z grupy, w skład której wchodzi CPT-11 (irynotekan), który przykładowo można stosować w leczeniu raka jelita grubego i niedrobnokomórkowego raka płuc; gemcytabina, którą przykładowo można stosować w leczeniu taka płuc, raka piersi i nabłonkowego raka jajnika i inne środki chemioterapeutyczne odpowiednie do leczenia guzów litych, przy czym stosowanie tej dodatkowej terapii przeciwnowotworowej lub dodatkowych terapii przeciwnowotworowych ma miejsce przed leczeniem, podczas leczenia lub po leczeniu tego osobnika lekiem zawierającym antagonistyczne przeciwciało anty-cd40 albo jego fragment wiążący antygen, które opisano powyżej. [0142] W innych wykonaniach przedmiotem wynalazku jest użycie przeciwciała monoklonalnego CHIR-12.12, CHIR-.9 albo jego fragmentu wiążącego antygen do wytwarzania leku do leczenia osobnika z guzem litym, w którym znajdują się komórki nowotworowe wykazujące ekspresję antygenu CD40, przy czym podanie tego leku jest skoordynowane z leczeniem co najmniej jednym innym przeciwciałem przeciwnowotworowym wybranym z grupy obejmującej lek Herceptin (Genentech, Inc. San Francisco, Kalifornia, USA), który dociera do

97 białka receptora Her2 na Her2+ komórkach raka piersi; humanizowane przeciwciało monoklonalne Avastin (znane również jako bewacyzumab; Genentech, Inc., San Francisco, Kalifornia, USA), które wiąże się z czynnikiem wzrostu śródbłonka naczyń (VEGF) i hamuje go, i ma zastosowanie w leczeniu raka okrężnicy; przeciwciało anty-egfr, dla którego celem jest receptor czynnika wzrostu naskórka, np. IMC-C-22 (ImClone Systems, Nowy Jork, Nowy Jork); przeciwciało przeciw receptorowi IGF-1, dla którego celem jest białko receptora IGF-1; przeciwciało przeciw MUC1, dla którego celem jest związany z rakiem antygen MUC1; przeciwciała anty-αβ1, anty-αvβ i anty-αvβ3, dla których celami są te odpowiednie integryny, które regulują procesy adhezji komórkowej i przekazywania sygnałów biorące udział w proliferacji i przeżywalności komórki; przeciwciało przeciw kadherynie P, dla którego celem jest substancja z rodziny kadheryn (patrz np. publikacja zgłoszenia patentowego Stanów Zjednoczonych 03/ w trakcie rozpatrywania) i przeciwciało przeciw kadherynie VE, dla którego celem jest funkcja związana z angiogenezą tej cząsteczki adhezyjnej swoistej wobec komórki śródbłonka; przy czym stosowanie tej dodatkowej terapii przeciwnowotworowej lub dodatkowych terapii przeciwnowotworowych ma miejsce przed leczeniem, podczas leczenia lub po leczeniu tego osobnika lekiem zawierającym antagonistyczne przeciwciało anty-cd40 albo jego fragment wiążący antygen, które opisano powyżej. [0143] Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie antagonistycznego przeciwciała anty-cd40, na przykład ujawnionego w niniejszym opisie przeciwciała monoklonalnego CHIR-12.12, CHIR-.9 albo jego fragmentu wiążącego antygen, do wytwarzania leku do leczenia osobnika z guzem litym, w którym znajdują się komórki nowotworowe wykazujące

98 ekspresję antygenu CD40, przy czym lek ten stosuje się u osobnika, u którego już uprzednio stosowano co najmniej jedną inną terapię przeciwnowotworową. Termin uprzednio leczony lub uprzednie leczenie oznacza, że osobnik otrzymywał już jedną lub kilka innych terapii przeciwnowotworowych (czyli że stosowano u niego co najmniej jedną inną terapię przeciwnowotworową) przed tym, nim otrzymał lek zawierający antagonistyczne przeciwciało anty-cd40 albo jego fragment wiążący antygen. Termin uprzednio leczony lub uprzednie leczenie obejmuje osobniki, które były leczone przez stosowanie co najmniej jednej innej terapii przeciwnowotworowej w ciągu 2 lat, w ciągu 18 miesięcy, w ciągu 1 roku, w ciągu 6 miesięcy, w ciągu 2 miesięcy, w ciągu 6 tygodni, w ciągu jednego miesiąca, w ciągu 4 tygodni, w ciągu 3 tygodni, w ciągu 2 tygodni, w ciągu 1 tygodnia, w ciągu 6 dni, w ciągu dni, w ciągu 4 dni, w ciągu 3 dni, w ciągu 2 dni, a nawet w ciągu 1 dnia przed rozpoczęciem leczenia lekiem zawierającym antagonistyczne przeciwciało anty-cd40, na przykład ujawnione w niniejszym opisie przeciwciało monoklonalne CHIR-12.12, CHIR-.9 albo jego fragment wiążący antygen. Nie jest konieczne, aby osobnik ten odpowiedział na poprzednią terapię przeciwnowotworową lub poprzednie terapie przeciwnowotworowe. Osobnik, który otrzymuje lek zawierający antagonistyczne przeciwciało anty-cd40 albo jego fragment wiążący antygen, mógł zatem odpowiedzieć albo mógł nie odpowiedzieć (czyli nowotwór był oporny na leczenie) na uprzednie leczenie przez zastosowanie wcześniejszej terapii przeciwnowotworowej albo jednej lub kilku wcześniejszych terapii przeciwnowotworowych, w których wcześniejsze leczenie polegało na stosowaniu wielu terapii przeciwnowotworowych. Przykłady innych terapii przeciwnowotworowych, które

99 osobnik mógł otrzymać jako leczenie uprzednie przed otrzymaniem leku zawierającego antagonistyczne przeciwciało anty-cd40 albo jego fragment wiążący antygen, obejmują między innymi operację chirurgiczną, napromienianie, chemioterapię, w której stosowane środki chemioterapeutyczne obejmują między innymi leki wymienione powyżej, terapię innym przeciwnowotworowym przeciwciałem monoklonalnym, w tym między innymi przeciwciałami przeciwnowotworowymi wymienionymi powyżej, terapię cytokiną, w tym terapie cytokinowe opisane powyżej, albo dowolną kombinację tych terapii. [0144] Leczenie w kontekście skoordynowanego stosowania leku opisanego w niniejszym opisie łącznie z jedną lub kilkoma innymi terapiami przeciwnowotworowymi definiuje się w niniejszym opisie jako podanie lub stosowanie tego leku albo innej terapii przeciwnowotworowej u osobnika albo podanie lub stosowanie tego leku albo innej terapii przeciwnowotworowej do izolowanej tkanki lub linii komórkowej od tego osobnika, który to osobnik cierpi na guza litego, w którym znajdują się komórki nowotworowe wykazujące ekspresję antygenu CD40, objaw związany z tym guzem litym albo ma predyspozycję do rozwoju tego guza, przy czym celem jest wyleczenie, uzdrowienie, złagodzenie, ulga, zmiana, leczenie, polepszenie, poprawa albo wpływ na guza litego, na jakiekolwiek objawy związane z guzem litym albo na predyspozycję do rozwoju guza litego. [014] Poniższe przykłady podano jako ilustrację, a nie jako ograniczenie wynalazku.

100 0 CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA Wprowadzenie 1 2 [0146] Antagonistycznymi przeciwciałami anty-cd40 stosowanymi w poniższych przykładach są CHIR-.9 i CHIR Przeciwciała anty-cd40, CHIR-.9 i CHIR są ludzkim podtypem IgG 1 przeciwciał monoklonalnych przeciw ludzkiemu CD40 (mab), generowanych przez immunizację transgenicznych myszy, zawierających locus łańcucha ciężkiego ludzkiej IgG 1 i locus ludzkiego łańcucha κ (XenoMouse Technology, Abgenix; Fremont, Kalifornia, USA). Jako immunogenu użyto owadzich komórek SF9, wykazujących ekspresję zewnątrzkomórkowej domeny CD40. [0147] Pokrótce, poddawano fuzji limfocyty śledziony z immunizowanych myszy z mysimi komórkami szpiczaka SP 2/0 albo P3 x 63Ag8.63 w stosunku :1, stosując 0% glikol polietylenowy, jak to wcześniej opisał de Boer i wsp. (1988) J. Immunol. Meth. 113: 143. Powstałe z fuzji komórki zawieszano w kompletnej pożywce IMDM z dodatkiem hipoksantyny (0,1 mm), aminopteryny (0,01 mm), tymidyny (0,016 mm) i 0, ng/ml ludzkiej IL-6 (hil-6) (Genzyme, Cambridge, Massachusetts, USA). Komórki powstałe z fuzji rozprowadzono do studzienek w 96-studzienkowej płytce do hodowli tkankowych, tak, aby każda studzienka zawierała średnio jedną rosnącą komórkę hybrydoma. [0148] Po -14 dniach dokonywano skriningu supernatantów populacji komórek hybrydoma pod kątem wytwarzania swoistego przeciwciała. Do skriningu pod kątem wytwarzania swoistego przeciwciała przez klony hybrydoma łączono supernatanty z poszczególnych studzienek i testowano je pod kątem swoistości pod względem aktywności anty-cd40, początkowo w teście ELISA. Klony pozytywne zastosowano następnie do znakowania fluorescencyjnego komórek B transformowanych

101 1 1 wirusem EB, wykorzystując standardową próbę spektroskopii fluorescencyjnej FACS. Pozytywne komórki hybrydoma klonowano dwukrotnie metodą ograniczających rozcieńczeń w pożywce IMDM/FBS z dodatkiem 0, ng/ml interleukiny hil-6. [0149] Ogółem 31 mysich śledzion poddano fuzji z mysimi komórkami szpiczaka SP2/0, generując 89 przeciwciał, które rozpoznawały rekombinowane CD40 w teście ELISA. Średnio około % hybrydoma wytworzonych z użyciem technologii Abgenix XenoMouse (Abgenix; Fremont, Kalifornia, USA) może zawierać mysi lekki łańcuch lambda zamiast ludzkiego łańcucha kappa. Przeciwciała zawierające mysi lekki łańcuch lambda zostały odselekcjonowane. Do dalszej analizy wybrano podzbiór 260 przeciwciał, które również wykazywały właściwość wiązania z powierzchniowym antygenem CD40. Stabilnych komórek hybrydoma wybranych w serii procedur subklonowania użyto do dalszego badania charakterystyki w próbach wiązania i funkcjonalnych. [0] Klony z siedmiu innych komórek hybrydoma zidentyfikowano jako wykazujące aktywność antagonistyczną. Na podstawie ich względnej siły antagonistycznej i aktywności ADCC do dalszej oceny wybrano dwa klony komórek hybrydoma (tabela 1, poniżej). Oznakowano je symbolami 131.2F8..9 (.9) i 13.8E2.D.D (12.12). Tabela 1. Podsumowanie początkowego zbioru danych odnośnie 2 do przeciwciał anty-cd40 IgG 1, CHIR-.9 i CHIR Wiązanie z antygenem po- ADCC CDC cja DNA Sekwen Hybrydoma Antagoni Nr Klony hybrydoma matczyne sta CMCC wierz chniowym regionu V 131.2F 131.2F Tak 13.8E2 13.8E2DD Tak

102 2 1 2 [011] Mysią linię komórek hybrydoma 131.2F8..9 (nr CMCC 147) i linię komórek hybrydoma 13.8E2.D.D (nr CMCC 16) zdeponowano w American Type Culture Collection (Amerykańskiej Kolekcji Hodowli ATCC; 801 University Blvd. Manassas, Virginia 1-29 (USA) jako depozyty patentowe pod numerami, odpowiednio PTA-42 i PTA-43. [012] cdna kodujące regiony zmienne potencjalnie użytecznych przeciwciał powielano w reakcji PCR, klonowano i sekwencjonowano. Sekwencje aminokwasowe łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego przeciwciała CHIR przedstawiono, odpowiednio, na Fig. 1A i 1B. Patrz również SEQ ID nr 2 (łańcuch lekki mab CHIR-12.12) i SEQ ID nr 4 (łańcuch ciężki mab CHIR-12.12). Wariant łańcucha ciężkiego mab CHIR przedstawiono na Fig. 1B (patrz również SEQ ID nr ). Różni się on od przedstawionego w SEQ ID nr 4 tym, że reszta alaniny została w nim podstawiona resztą seryny w pozycji 13 sekwencji SEQ ID nr 4. Sekwencje nukleotydowe kodujące łańcuch lekki i łańcuch ciężki przeciwciała CHIR przedstawiono, odpowiednio, na Fig. 2A i 2B. Patrz również SEQ ID nr 1 (sekwencja kodująca łańcucha lekkiego mab CHIR-12.12) i SEQ ID nr 3 (sekwencja kodująca łańcucha ciężkiego mab CHIR-12.12). Sekwencje aminokwasowe łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego przeciwciała CHIR-.9 przedstawiono, odpowiednio, na Fig. 3A i 3B. Patrz również SEQ ID nr 6 (łańcuch lekki mab CHIR-.9) i SEQ ID nr 7 (łańcuch ciężki mab CHIR-.9). Wariant łańcucha ciężkiego mab CHIR-.9 jest przedstawiony na Fig. 3B (patrz również SEQ ID nr 8). Różni się on od SEQ ID nr 7 tym, że ma resztę alaninową podstawioną resztą serynową w pozycji 18 na SEQ ID nr 7. [013] Jak oczekiwano dla przeciwciał pochodzących z niezależnych komórek hybrydoma, występuje znacząca zmienność w sekwencjach nukleotydowych w regionach

103 3 determinujących dopasowanie (CDR). Zakłada się, że ta różnorodność w regionie CDR3 V H najsilniej determinuje swoistość przeciwciała. [014] Jak wykazano metodą analizy FACS, przeciwciała CHIR-.9 i CHIR wiążą się swoiście z ludzkim CD40 i mogą zapobiegać wiązaniu CD40-ligand. Obydwa przeciwciała mogą współzawodniczyć we wstępnym wiązaniu CD40-ligand z powierzchniowym CD40, nie dopuszczając do tego wiązania. Powinowactwo wiązania CHIR-.9 z ludzkim CD40 wynosi 1,2 x -8 M, a powinowactwo wiązania CHIR z ludzkim CD40 wynosi x - M. 1 [01] Przeciwciała monoklonalne CHIR i CHIR-.9 są silnymi antagonistami i hamują in vitro proliferację prawidłowych komórek B, w której pośredniczy ligand-cd40, jak również hamują in vitro zależną od wiązania CD40-ligand proliferację komórek nowotworowych pochodzących od pacjentów z NHL i CLL. W próbach in vitro, obydwa przeciwciała zabijają pierwotne komórki nowotworowe od pacjentów NHL poprzez mechanizm ADCC. Ich aktywność przeciwnowotworową zależną od dawki wykazano w modelu przeszczepu heterogenicznego ludzkiego chłoniaka. Przykład 1: CD40 ulega ekspresji w dużej ilości w guzach litych 2 [016] Wykazano, że wiele pochodzących z guzów litych hodowli linii komórek nowotworowych i biopsji pobieranych od pacjentów wykazuje ekspresję CD40. Okazało się, że wysoki procent próbek pobranych podczas biopsji od pacjentów z rakiem piersi, płuc, jajnika i nowotworem skóry wykazuje ekspresję CD40.

104 4 Przykład 2: Zdolność potencjalnie użytecznego przeciwciała monoklonalnego, CHIR-12.12, do wiązania z CD40 ulegającym ekspresji w kilku nowotworach ludzkich 1 [017] Pobrano próbki tkanki nowotworowej od osób (n=) z rakiem jajnika, płuc, sutka lub okrężnicy i zamrożono je do późniejszej analizy wiązania przeciwciała metodą immunohistochemiczną. Oznaczano procent komórek nowotworowych w różnych nowotworach ludzkich zdolnych do wiązania przeciwciała CHIR Jak przedstawiono w tabeli 2, 60% próbek raka jajnika i raka płuc plasuje się w najwyższej kategorii procentowego wiązania (czyli 0-0% komórek w tych próbkach ma zdolność wiązania z przeciwciałem CHIR-12.12). W tej najwyższej kategorii procentowego wiązania mieści się % próbek raka sutka i % próbek raka okrężnicy. Tabela 2. Zdolność przeciwciała CHIR do wiązania kilku nowotworów ludzkich Rak Jajnika n = Płuc n = Piersi n = Okrężnicy n = Procent komórek nowotworowych wiążących się z przeciwciałem CHIR Wynik ujemny <% -2% 2-0% 0-0% 0% 0% % % 60% 0% % % 0% 60% 0% % % % % 0% 70% % % %

105 Przykład 3: Przeciwciała CHIR-.9 i CHIR mają zdolność zabijania docelowych komórek zawierających CD40 w mechanizmie ADCC (cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał) 1 2 [018] Potencjalnie użyteczne przeciwciała mają zdolność zabijania docelowych komórek zawierających CD40 (linie komórek chłoniaka i linie komórek z guzów litych) w mechanizmie cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC). Zarówno CHIR-.9, jak i CHIR są w pełni ludzkimi przeciwciałami należącymi do izotypu IgG 1 i oczekuje się, że będą wykazywały zdolność inicjowania zabijania komórek docelowych w mechanizmie ADCC. Przetestowano je pod kątem zdolności zabijania linii komórek nowotworowych w próbach in vitro. Jako komórki docelowe do tych prób wybrano początkowo dwie ludzkie linie komórek chłoniaka (Ramos i Daudi) i jedną ludzką linię komórek raka okrężnicy (HTC116). Jako komórek efektorowych w tych próbach użyto komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) albo wzbogaconych komórek NK od 8 zdrowych dawców ochotników. Obserwowano wyższą ADCC przeciw liniom komórek chłoniaka niż przeciw liniom komórek raka okrężnicy. Silniejszą odpowiedź ADCC obserwowano przy CHIR w porównaniu do CHIR-.9 przeciw komórkom docelowym linii chłoniaka i raka okrężnicy. Linie komórek chłoniaka wykazują również ekspresję CD, będącego antygenem docelowym dla leku rytuksymab (Rituxan ; IDEC Pharmaceuticals Corp., San Diego, Kalifornia, USA), co pozwoliło na porównanie aktywności ADCC tych dwóch potencjalnie użytecznych przeciwciał monoklonalnych z aktywnością ADCC rytuksymabu. W przypadku docelowej linii komórek chłoniaka dla CHIR-.9, CHIR i rytuksymabu, stosowanych w stężeniu 1 µg/ml, obserwowano średnią lizę

106 6 swoistą wynoszącą odpowiednio 3%, 9% i 47%. W przypadku docelowej linii komórek raka okrężnicy, średnia liza swoista wynosiła % i 39%, odpowiednio, dla CHIR-.9 i CHIR Dane te przedstawiono w tabeli 3. Te dwa przeciwciała nie wykazują dużej aktywności w próbach cytotoksyczności zależnej od dopełniacza (CDC).

107 7 Tabela 3. Zależne od przeciwciała anty CD40 zabijanie komórek w liniach komórek chłoniaka i raka okrężnicy w mechanizmie ADCC Zależne od przeciwciała anty CD40 zabijanie komórek w liniach komórek chłoniaka i raka okrężnicy w mechanizmie ADCC ADCC 00 Stos. E:T Komórki docelowe: linia ludzkich komórek chłoniaka (Ramos lub Daudi) % lizy IgG1 Numer doświadczenia Komórka efektorowa Stężenie Ab (µg/ml) % lizy Rituxan % lizy % lizy IgG1 % lizy % lizy % lizy IgG1 % lizy % lizy % lizy IgG1 % lizy IgG1 Komórki docelowe: ludzka linia komórek raka okrężnicy (HCT116) Stężenie Ab (µg/ml) % lizy hunk 3 17,0,7 13,70 6,22 48,17 ND ND ND ND ND ND ND ND % lizy % lizy kontroli % lizy % lizy % lizy kontroli Alarmor Blue hunk 3 40,81 8,62 17,81 87,87 47,06 ND ND ND ND ND ND ND ND ADCC 006 hunk 2 3,09 3,0 6,9 43,71 46,8 34,82 37,91 11,14 12,78 1,64 33,6 22,46 Alarmor 8,62 1 Blue 1,48 4,13 3,7 37,07 4,69 13,6 1 8,921 4,68 21,99 8,39, 11 0,1 3,80 39,82 0,82 33,61 44,61 1,49 0,1 8,82 6,67 26,1,66 14,80 4,4 0,01 2,3 7,07 0,07 4,61 28,49 33,03 13,62 0,01 17,24 3,62 28,07 14,4 1Cr hunk 1, 32,09,9 47,24 4,742 ND ND 33,1 1,02 86,92 170,41 137,31 2,4 1 18,01 1,61 37,42 3,022 ND ND 23, ,4 11,3 166,62 143,2 2, 0,1 14,67 12,17 37,63 3,131 ND ND 46,4 0,4 141,41 9,01 19,4 113,0

108 Numer doświadczenia ADCC 009 Calcien AM ADCC 011 Calcien AM 8 Zależne od przeciwciała anty CD40 zabijanie komórek w liniach komórek chłoniaka i raka okrężnicy w mechanizmie ADCC Stos. E:T Komórki docelowe: linia ludzkich komórek chłoniaka (Ramos lub Daudi) % lizy IgG1 Komórka efektorowa Stężenie Ab (µg/ml) % lizy Rituxan % lizy % lizy IgG1 % lizy % lizy % lizy IgG1 % lizy % lizy % lizy IgG1 % lizy IgG1 Komórki docelowe: ludzka linia komórek raka okrężnicy (HCT116) Stężenie Ab (µg/ml) % lizy % lizy % lizy kontroli % lizy % lizy % lizy kontroli hunk 2,32 66, 63,88 97,70 9,38 86,2 83,88 26,4 41,3 14,9 62,3 3,9 0, , 66,72 123,00 122,2 88,2 87,72 32,8 1 43, ,8 41 1,43 0,2 78,40 79,83 118,00 119,43 88,8 90,23 33, 0,2 42,6 9,1 71,4 37,9 3,39 0,04 69, 6,71 9,00,61 84,9 81,1 26 0,04 4,8 28, hunk 8 3,18 1 1,36 12,19 1,9 48,42 22,44 19,27 11,63 1 6,31,32 19,96 8,33 4,8 0,01 7,39 2,81 46,80 42,22 14,68,,88 0,01 0,0,94 1,2 9,37,41 0,002 6,3 0,94, 0,31 9,8 4,16 4,379 0,002 3,96 0,42 0,7,13

109 9 7,03 0,0004 7,76 0,73,99 1,04,99 1,04 1,883 0,0004,13 3,2 2,82 0, hunk 13,34 73,31 9,97 117,80 4,46 0,7 37,41 0,132 18,42 18,29 36,1 3,97 Calcien AM 13,0 1 74,76 61,26 88,64 7,14 6,97 2,47 11,1 1 28,60 17,4 42,22 31,07 12,27 0,01 8,2 46,2 72,88 60,61 0,16 37,89,89 0,01 1,1 4,62 31,07,18 13,61 0,00 7,0 43,89 69,4,84 39,28 2,67 14,01 0,00 23,31 9,3 27, 13,4 11,9 0,001 6,81 44,86 6,17 3,22 33,07 21,12 14,63 0,001 24,68,0 32,3 17,9 013 PBMC 0 2,4 1 21,03 18,49 37,94 3,40 32,28 29,74 13,3 1 22,02 8,1 43,98,4 1Cr 2,4 0,1 1,0 13,0,82 28,37 27,18 24,73 1,88 0,1 21,89 6,01 43,14 27,26 2,92 0,01 14,3 11,61 22,9 19,67 12,79 9,87 16,8 0,01 19,7 2,9 37,16,31 2,78 0,001 3,90 1,12 8,99 6,21 3,13 0,3 1,4 0,001 14,36 1,09 19,22 3,77 ADCC ADCC ADCC 014 PBMC 0 4,64 3,4 48,90 6,12 1,48 ND ND 24,12 2,24 1,12 43,09 18,97 1Cr 4, ,84 42, 43,00 38,36 ND ND 24, ,68 1,44 32,12 8 4,64 0,1 4,63 40,99 39,94 3, ND ND 24,12 0,1 24,9 0,83 31,48 7,36 4,64 0,01 7,73 3,09 9,79,1 ND ND 24,12 0,01 23,67 0,4 26,14 2,02 4,64 0,001 8,83 4,19,81 6,17 ND ND 24,12 0,001 21, 2,7 21,84 2,28 Średni procent lizy przy stężeniu 1 µg/ml mab 3,31 9,03,12 38,68 Zabijanie powyżej 0% wynika z niecałkowitego zabijania przez środek powierzchniowo czynny użyty jako kontrola 0% zabijania

110 1 [019] Dalsze badania aktywności ADCC tych dwóch przeciwciał monoklonalnych anty-cd40 prowadzono na linii komórek raka okrężnicy HCT116 i na siedmiu innych liniach komórek nowotworowych, w tym na liniach raka jajnika SKOV3 i HEY, na linii komórek raka płaskokomórkowego skóry A431, na liniach komórek raka piersi MDA-MB231 i MDA-MB43 i na liniach komórek raka płuc NCI-H460 i SK-MES-1, wykorzystując procedury opisane powyżej. Jak to przedstawiono na Fig. A-D i 6A-D, przeciwciało monoklonalne CHIR generalnie wykazuje wyższą aktywność ADCC niż przeciwciało monoklonalne CHIR-.9 przy każdym stężeniu i wobec każdej testowanej linii komórkowej. Przykład 4: CHIR-.9 i CHIR wykazują aktywność przeciwnowotworową w modelach zwierzęcych 1 2 Farmakologia/skuteczność in vivo [0160] Zakłada się, że badane mab będą wywierać pożądane działanie farmakologiczne, zmniejszając obciążenie guzem w jednym lub obydwu z dwóch mechanizmów działania przeciwnowotworowego: na drodze blokady sygnału proliferacji/ przeżywania i indukcji ADCC. W obecnie dostępnych modelach przeszczepu heterogenicznego ludzkiego chłoniaka stosuje się długo żyjące linie komórek chłoniaka, których wzrost i przeżywalność, w przeciwieństwie do pierwotnych komórek nowotworowych, nie zależą od stymulacji CD40. Nie oczekuje się zatem, aby komponenta działania tych mab na drodze aktywności przeciwnowotworowej opartej na blokowaniu sygnału proliferacji/przeżywalności nowotworu przyczyniała się do skuteczności przeciwnowotworowej w tych modelach. Skuteczność w tych modelach zależy od ADCC, drugiego mechanizmu przeciwnowotworowego związanego z przeciwciałami monoklonalnymi CHIR-.9 i CHIR

111 111 Modele przeszczepu heterogenicznego chłoniaka ludzkich komórek B 1 2 [0161] Aktywność przeciwnowotworową badanych mab oceniano w dwóch modelach przeszczepu heterogenicznego ludzkiego chłoniaka opartych na liniach komórkowych Namalwa i Daudi. Celem dalszego wykazania ich aktywności leczniczej, te badane przeciwciała monoklonalne oceniano w modelu bez określania stadium (profilaktycznym) i modelu z określaniem stadium (leczniczym) modelu przeszczepu heterogenicznego chłoniaka ludzkiego z użyciem linii komórkowej Daudi. [0162] W skrócie, nagie myszy z niedoborem komórek T napromieniano na całe ciało dawką 3 Gy na dzień przed inokulacją raka, w celu dalszego stłumienia układu immunologicznego. Komórki nowotworowe wszczepiano podskórnie do prawego boku w ilości x 6 komórek na mysz. Leczenie rozpoczynano albo następnego dnia po implantacji raka (modele bez określania stadium (profilaktyczne) podskórnego przeszczepu heterogenicznego chłoniaka ludzkich komórek B, Namalwa i Daudi) albo wówczas, gdy objętość raka osiągnęła 0 mm 3 (model z określeniem stadium, czyli leczniczy) Daudiego, zwykle po 1 dniach od wszczepienia raka). Myszom z wszczepionym rakiem podawano wstrzyknięcia dootrzewnowe (i.p.) przeciwciał monoklonalnych anty-cd40 raz na tydzień. W modelu Namalwa bez określania stadium dawki wynosiły: 0,01 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,1 mg/kg, 1 mg/kg i mg/kg (mab CHIR ), 1 mg/kg (mab CHIR-.9) i mg/kg (rytuksymab). W modelu Daudiego bez określania stadium dawki wynosiły: 0,01 mg/kg, 0,1 mg/kg i 1 mg/kg (mab CHIR i CHIR-.9), 1 mg/kg (rytuksymab). Dawki w modelu Daudiego z określeniem stadium wynosiły: 0,01 mg/kg, 0,1 mg/kg, 1 mg/kg i mg/kg (mab CHIR-12.12), 1 mg/kg (mab CHIR-.9) i 1 mg/kg

112 112 (rytuksymab). Objętość guza oznaczano dwa razy w tygodniu. Jeśli w jakiejś grupie objętość guza osiągnęła 0 mm 3, 1 2 wówczas badanie kończono. Należy zauważyć, że w modelu Daudiego z określeniem stadium dane dotyczące objętości guza analizowano do 36 dnia z powodu śmierci niektórych myszy po tym dniu. Całkowitą regresję (CR) zliczano do końca badania. Dane analizowano testem ANOVA albo testem Krusskala-Wallisa i odpowiednim testem końcowym celem porównania danych uzyskanych dla różnych grup. [0163] W modelu Namalwa bez określania stadium przeciwciało anty-cd40, CHIR-12.12, ale nie rytuksymab, znacząco (p=<0,01) hamowało wzrost guzów Namalwa (zmniejszenie objętości guza o 60% w porównaniu do 2% zmniejszenia przez rytuksymab, n = myszy/grupę) (dane nie są przedstawione). W tym modelu przeciwciało anty-cd40, CHIR miało więc silniejsze działanie niż rytuksymab. Jest godne uwagi, że drugie badane przeciwciało, CHIR-.9, było co najmniej tak skuteczne, jak rytuksymab w dawce 1/ dawki rytuksymabu. Zarówno przeciwciało anty-cd40, CHIR , jak i rytuksymab znacząco zapobiegały rozwojowi nowotworu w modelu Daudiego bez określania stadium (14/1 odporność na prowokację guza) (dane nie są przedstawione). [0164] Gdy te przeciwciała monoklonalne anty-cd40 porównano dalej w modelu przeszczepu heterogenicznego Daudiego z określeniem stadium, w którym leczenie rozpoczęto, kiedy wyczuwalny był podskórny guz, okazało się, że przeciwciało anty-cd40, CHIR podane w dawce 1 mg/kg powodowało znaczące zmniejszenie guza (p=0,003) z 60% całkowitą regresją (6/), podczas gdy rytuksymab podany w tej samej dawce nie miał znaczącego hamującego wpływu na wzrost guza ani nie dawał całkowitej regresji (0/) (dane nie są przedstawione).

113 113 [016] W podsumowaniu można stwierdzić, że przeciwciało anty-cd40, CHIR-12.12, znacząco hamowało wzrost guza w doświadczalnych modelach chłoniaka. W tej samej dawce i w tym samym schemacie dawkowania mab CHIR wykazywało lepszą aktywność przeciwnowotworową niż Rituxan (rytuksymab). Poza tym nie zauważono żadnych klinicznych objawów toksyczności w tej dawce i w tym schemacie dawkowania. Powyższe dane wskazują, że przeciwciało anty- CD40, CHIR-12.12, wykazuje silną aktywność przeciw chłoniakowi ludzkiemu in vitro i na modelach przeszczepu heterogenicznego i może być skuteczny klinicznie w leczeniu chłoniaka. Model przeszczepu heterogenicznego ludzkiego raka okrężnicy 1 2 [0166] Powyższe badane mab oceniano dalej pod względem ich leczniczego działania przeciwnowotworowego w modelu guza litego. Podobnie do wielu guzów litych ludzkich, linia ludzkich komórek raka okrężnicy HCT 116 wykazuje ekspresję CD40; wybrano ją jako model przeszczepu heterogenicznego raka okrężnicy. Komórki nowotworowe wszczepiano podskórnie do prawego boku nagim myszom z niedoborem komórek T (ten nowotwór rósł w nagich myszach bez uprzedniego napromieniania) w ilości x 6 komórek na mysz. Następnego dnia po inokulacji myszy otrzymywały wstrzyknięcie dootrzewnowe (i.p.) przeciwciała anty-cd40, raz w tygodniu, w sumie dawek. [0167] Leczenie przeciwciałami anty-cd40 wykazało powtarzalną tendencję w kierunku hamowania wzrostu guza w dwóch powtórzonych badaniach. Dane uzyskane z jednego z tych dwóch badań przedstawiono na Fig. 7. Jest interesujące, że w tym modelu obserwowano odwrócenie aktywności przeciwnowotworowej przy najwyższej dawce ( mg/kg), co sugeruje, że do osiągnięcia najlepszego

114 hamowania wzrostu guza potrzebne jest ustalenie optymalnej dawki i schematu dawkowania. Monoklonalne przeciwciało CHIR-12.12, które wykazało wyższą aktywność ADCC in vitro i wyższą skuteczność przeciwnowotworową w modelu chłoniaka, testowano tylko w pojedynczej dawce 1 mg/kg w modelu raka okrężnicy. Prowadzi się badania przy innych dawkach (miareczkowanie dawki) przeciwciała CHIR w celu oznaczenia jego pełnych możliwości w tym modelu przeszczepu heterogenicznego ludzkiego raka okrężnicy. Ortotopowy model przedinwazyjnego (profilaktycznego) raka jajnika [0168] Przeciwciało monoklonalne CHIR oceniano również pod kątem jego aktywności przeciwnowotworowej w mysim ortotopowym modelu raka jajnika bez określania stadium (profilaktycznym), z użyciem linii komórkowej raka jajnika SKOV3i/p.1. Komórki nowotworowe zaszczepiano dootrzewnowo (i.p.) nagim myszom z niedoborem komórek T w ilości 2 x 6 komórek na mysz. Od pierwszego dnia po inokulacji nowotworu, myszy otrzymywały dootrzewnowe wstrzyknięcia różnych dawek przeciwciała CHIR albo leku Herceptin (Genetech, Inc., San Francisco, Kalifornia, USA), który jest obecnie oceniany w badaniach klinicznych w leczeniu raka jajnika. Przeciwciało podawano raz w tygodniu, ogółem podano 6 dawek. Wyliczano procentowe przeżycie względem czasu. [0169] Stosowanie mab CHIR przedłużało czas przeżycia w sposób zależny od dawki (Fig. 8). Po 4 dniach od wszczepienia raka procentowe przeżycie było znacząco wyższe w grupie otrzymującej mg/kg CHIR niż w kontrolnej grupie, która nie była traktowana. Chociaż podobna dawka leku Herceptin wykazywała tendencję w kierunku przedłużania przeżycia, to procentowe przeżycie po 4

115 11 dniach po inokulacji nie było znacząco wyższe od tego, które obserwowano w nieleczonej grupie kontrolnej. [0170] Na Fig. 9 przedstawiono porównanie wpływu przeciwciała CHIR na procentowe przeżycie w tym ortotopowym modelu mysim raka jajnika bez określania stadium, gdy przeciwciało to podaje się dootrzewnowo (i.p.) zamiast dożylnie (i.v.) Protokół leczenia był taki sam, jak powyżej. Jak widać na rysunku, dootrzewnowe wstrzyknięcie mab CHIR pozwalało uzyskać lepsze procentowe przeżycie w porównaniu do obserwowanego przy dożylnym podawaniu tego przeciwciała. Mysi model raka jajnika z określaniem stadium (terapeutyczny) 1 2 [0171] Przeciwciała monoklonalne CHIR-.9 i CHIR oceniano dalej pod kątem ich terapeutycznej aktywności przeciwnowotworowej w mysim modelu raka jajnika z określeniem stadium (terapeutycznym), z użyciem linii komórkowej raka jajnika SKOV3i/p.1. W tym badaniu komórki nowotworowe wszczepiano podskórnie do prawego boku nagim myszom z niedoborem komórek T w ilości x 6 komórek na mysz w % preparacie Matrigel. Od szóstego dnia od inokulacji nowotworu (gdy objętość guza osiągnęła 0-0 mm 3 ), myszy otrzymywały dootrzewnowe wstrzyknięcia tych przeciwciał raz w tygodniu, ogółem 4 dawki. Objętość guza mierzono dwa razy w tygodniu, od pierwszego dnia podania przeciwciała. [0172] Te dwa badane mab znacząco hamowały wzrost guza litego w porównaniu do nieleczonej grupy kontrolnej (Fig. ) przy wyższym testowanym stężeniu przeciwciała (1 mg/kg dla CHIR-.9 i mg/kg dla CHIR-12.12). W przypadku przeciwciała CHIR (jedyne przeciwciało, które badano w różnych dawkach), hamowanie wzrostu guza było zależne od

116 116 dawki, największe zmniejszenie guza następowało przy najwyższej dawce (czyli mg/kg). Przy tej najwyższej dawce przeciwciało CHIR było równie skuteczne, co równoważna dawka leku Herceptin. Przykład : CHIR-.9 i CHIR wiążą się z innym epitopem na CD40 niż 1B8 [0173] Badane przeciwciała monoklonalne CHIR-.9 i CHIR współzawodniczą ze sobą o wiązanie z CD40, ale nie z 1B8, przeciwciałem monoklonalnym anty-cd40 izotypu IgG (patrz publikacja zgłoszenia patentowego międzynarodowego WO 02/28904). Zaprojektowano badania współzawodnictwa wiązania przeciwciał z wykorzystaniem układu Biacore z chipami bioczujników CM, z białkiem A unieruchomionym drogą sprzęgania przez grupę aminową. Zastosowano je do wychwytywania albo anty-cd40 CHIR-12.12, albo 1B8. Obserwowano prawidłowe krzywe asocjacja/dysocjacja wiązania przy różnym stężeniu CD40-his (dane nie są przedstawione). Do badań współzawodnictwa wychwytywano albo CHIR-12.12, albo 1B8 na powierzchni białka A. Następnie kompleks CD40- his/chir-.9 Fab (0 nm CD40:1 µm CHIR-.9 Fab), przy różnym stężeniu, przepływał przez zmodyfikowaną powierzchnię. W przypadku CHIR nie obserwowano asocjacji kompleksu, co wskazuje, że CHIR-.9 blokuje wiązanie CHIR z CD40-his. W przypadku 1B8, obserwowano asocjację kompleksu Fab CHIR-.9, co wskazuje, że CHIR-.9 nie blokuje wiązania 1B8 z miejscem wiązania CD40. Jednakże, stała dysocjacji tego kompleksu gwałtownie wzrosła (dane nie są przedstawione). [0174] Stwierdzono również, że 1B8 i CHIR nie współzawodniczą o wiązanie z CD40-his. To doświadczenie było tak ustawione, że wychwytywano CHIR na chipie bioczujnika białka A, blokując resztkowe miejsca na białku

117 117 A kontrolną higg 1, wiążąc CD40-his i następnie powodowano przepływ 1B8 przez zmodyfikowaną powierzchnię. W tych warunkach 1B8 rzeczywiście się wiązało, co wskazuje, że CHIR nie blokuje wiązania 1B8 z CD40. 1 Przykład 6: Właściwości wiązania przeciwciał monoklonalnych CHIR i CHIR-.9 [017] Białko A immobilizowano na chipach bioczujnika CM drogą sprzęgania aminowego. Ludzkie monoklonalne przeciwciała anty-cd40, w stężeniu 1, µg/ml, wychwytywano na zmodyfikowanej powierzchni bioczujnika przez 1, minuty przy przepływie µl/minutę. Rekombinowane rozpuszczalne CD40-his przepływało przez powierzchnię bioczujnika przy różnym stężeniu. Przeciwciało i antygen rozcieńczano w roztworze o składzie: 0,01 M HEPES (ph 7,4), 0,1 M NaCl, 3 mm EDTA, 0,00% środka powierzchniowo czynnego P (HBS- EP). Stałe kinetyczne i powinowactwa oznaczano, wykorzystując oprogramowanie Biaevaluation z ogólnym dopasowaniem do modelu interakcji 1:1. [0176] Jak przedstawiono w tabeli 4 poniżej, występuje 121- krotna różnica w stałej dysocjacji pomiędzy CHIR-.9 a CHIR-12.12, powodująca 24-krotnie wyższe powinowactwo dla CHIR Przeciwciało Ka(M -1 s -1 ) Kd (s -1 ) KD(nM) Anty-CD40 CHIR-.9 (12,3 ± 0,64) x (1,0 ± 1,3) x -3 12,1 ± 0,3 Anty-CD40 CHIR (2,41 ± 0,13) x (1,24 ± 0,06) x -4 0,1 ± 0,02 2 Przykład 7: Określanie charakterystyki epitopu przeciwciał monoklonalnych CHIR i CHIR-.9

118 118 1 [0177] Celem oznaczenia lokalizacji epitopu na CD40 rozpoznawanego przez monoklonalne przeciwciała CHIR i CHIR-.9 przeprowadzono analizy metodami SDS-PAGE i techniką Western blot. Oczyszczone CD40 (0, µg) rozdzielono w 4-12% żelu NUPAGE w warunkach redukujących i nieredukujących, przeniesiono na filtry PVDF i znakowano monoklonalnymi przeciwciałami w stężeniu µg/ml. Prążki znakowano fosfatazą alkaliczną sprzęganą z IgG anty-ludzką i rozwijano z użyciem substratu dla fosfatazy alkalicznej (Promega), stabilizowanego odczynnikiem Western Blue. [0178] Wyniki wskazują, że monoklonalne przeciwciało anty- CD40, CHIR-12.12, rozpoznaje epitopy zarówno w formie niezredukowanej, jak i zredukowanej CD40, przy czym forma niezredukowana CD40 wykazuje większą intensywność niż forma zredukowana CD40 (tabela ; prążki nie są pokazane). Fakt, że rozpoznanie było pozytywne dla obydwu form CD40 wskazuje, że to przeciwciało wchodzi w reakcję z tą częścią konformacyjną epitopu, która jest sekwencją liniową. Przeciwciało monoklonalne CHIR-.9 w pierwszym rzędzie rozpoznaje niezredukowaną formę CD40, co wskazuje, że to przeciwciało wchodzi w reakcję z pierwszorzędowym epitopem konformacyjnym (tabela ; prążki nie są pokazane). Tabela. Identyfikacja domen Domena 1 Domena 2 Domena 3 Domena 4 mab CHIR mab CHIR mab 1B [0179] W celu zmapowania regionu antygenowego na CD40, klonowano cztery domeny zewnątrzkomórkowe CD40 i dokonano ich ekspresji w komórkach owadzich jako białek fuzyjnych GST. Wydzielanie tych czterech domen przebiegało z sygnałem

119 119 wydzielania GP67. Supernatant z komórek owadzich analizowano metodami SDS-PAGE i techniką Western blot w celu identyfikacji domeny zawierającej epitop. [0180] Przeciwciało monoklonalne CHIR rozpoznaje epitop na domenie 2 w warunkach redukujących i nieredukujących (tabela 6; prążki nie są pokazane). Przeciwnie, przeciwciało monoklonalne CHIR-.9 bardzo słabo rozpoznaje domenę 2 (tabela 6; prążki nie są pokazane). Żadne z tych przeciwciał nie rozpoznaje domen 1, 3 ani 4 w tej analizie. Tabela 6. Analiza domeny 2 Zredukowana Niezredukowana mab CHIR mab CHIR [0181] W celu bardziej precyzyjnego zdefiniowania epitopu rozpoznawanego przez przeciwciało CHIR-12.12, syntetyzowano peptydy z zewnątrzkomórkowej domeny 2 CD40, która odpowiada sekwencji PCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICT (reszty 61-4 sekwencji przedstawionej w sekwencji SEQ ID nr albo SEQ ID nr 12). Generowano filtry SPOT (Sigma), zawierające trzydzieści pięć -merowych peptydów z przesunięciem o jeden aminokwas. Przeprowadzono analizę techniką Western blot z mab CHIR i antyludzką IgG sprzężoną z beta-galaktozydazą jako przeciwciałem drugorzędowym. Prążki zeskrobywano i powtórnie znakowano przeciwciałem CHIR-.9 celem oznaczenia regionu rozpoznawanego przez to przeciwciało. [0182] Analiza SPOT ze znakowaniem przeciwciałem monoklonalnym anty-cd40, CHIR w stężeniu µg/ml

120 1 dała reakcje dodatnie z plamami Region sekwencji pokrywający się z tymi peptydami przedstawiono w tabeli 7. Tabela 7. Wyniki analizy SPOT ze znakowaniem przeciwciałem monoklonalnym anty-cd40, CHIR Numer prążka Region sekwencji 18 HQHKYCDPNL (reszty z SEQ ID nr lub 12) 19 QHKYCDPNLG (reszty z SEQ ID nr albo 12) HKYCDPNLGL (reszty z SEQ ID nr albo 12) 21 KYCDPNLGLR (reszty z SEQ ID nr albo 12) 22 YCDPNLGLRV (reszty z SEQ ID nr albo 12) [0183] Powyższe wyniki odpowiadają liniowemu epitopowi: YCDPNL (reszty sekwencji przedstawionej na SEQ ID nr albo SEQ ID nr 12). Ten epitop zawiera Y82, D84 i N86, co do których przewiduje się, że są zaangażowane w reakcję CD40 z ligandem CD40. [0184] Analiza SPOT z przeciwciałem monoklonalnym CHIR-.9 wykazała słabe rozpoznawanie peptydów reprezentowanych przez plamy -22, co przedstawiono w tabeli 8. Wskazuje to na zaangażowanie regionu YCDPNLGL (reszty sekwencji przedstawionej na SEQ ID nr albo SEQ ID nr 12) w wiązanie z CD40. Należy zauważyć, że mab CHIR i CHIR-.9 współzawodniczą ze sobą o wiązanie z CD40 w analizie w systemie Biacore. Tabela 8. Wyniki analizy SPOT ze znakowaniem przeciwciałem monoklonalnym anty-cd40, CHIR-.9 Numer plamy Region sekwencji HKYCDPNLGL (reszty z SEQ ID nr albo 12) 21 KYCDPNLGLR (reszty z SEQ ID nr albo 12) 22 YCDPNLGLRV (reszty z SEQ ID nr albo 12)

121 121 [018] Liniowe epitopy zidentyfikowane w analizach SPOT mieszczą się w module CD40 B1. Sekwencja modułu CD40 B1 jest następująca: HKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTIC (reszty 80-3 SEQ ID nr albo 12). [0186] W liniowym epitopie zidentyfikowanym dla CHIR znajduje się C83. Wiadomo, że ta reszta cysteinowa tworzy wiązanie dwusiarczkowe z C3. Jest prawdopodobne, że konformacyjny epitop z przeciwciała CHIR zawiera to wiązanie dwusiarczkowe (C83-C3) i/lub sąsiadujące aminokwasy, konformacyjnie zbliżone do C3. Przykład 8: CHIR blokuje szlaki przeżycia i przekazywania sygnałów CD40, w których pośredniczy CD40L, w prawidłowych ludzkich komórkach B 1 2 [0187] Rozpuszczalny ligand CD40 (CD40L) aktywuje komórki B i pobudza różne aspekty odpowiedzi czynnościowych, w tym wzmocnienie przeżywania i proliferacji oraz aktywacji szlaków przekazywania sygnałów NFκB, ERK/MAPK, PI3K/Akt i p38. Ponadto, stymulacja CD40, w której pośredniczy CD40L, dostarcza sygnałów przeżycia przez zmniejszenie poziomu rozszczepionej polimerazy poli(adp-rybozy)(parp) i pobudzenie antyapoptotycznych białek XIAP i McI-1 w prawidłowych komórkach B. Stymulacja CD40, w której pośredniczy CD40L, również rekrutuje TRAF2 i TRAF3 do wiązania domeny cytoplazmatycznej CD40. [0188] Następujące badania wykazują, że CHIR bezpośrednio hamowało wszystkie te efekty stymulacji w prawidłowych ludzkich komórkach B. Traktowanie przeciwciałem CHIR powodowało na przykład zwiększenie rozszczepiania kaspazy 9, kaspazy 3 i PARP oraz spadek XIAP i McI-1 w sposób zależny od czasu i od dawki, przywracając

122 122 apoptozę komórek B. Traktowanie przeciwciałem CHIR hamowało również fosforylację IκB-kinazy (IKK) α i β (szlak 1 2 NFκB), ERK, Akt i p38 w odpowiedzi na stymulację CD40, w której pośredniczy CD40L. Wykazano następnie, że CHIR nie inicjuje tych efektów apoptotycznych bez początkowej stymulacji CD40, w której pośredniczy CD40L. CHIR hamował przeżywalność, w której pośredniczy ligand CD40, przez indukowanie rozszczepienia PARP [0189] W tych doświadczeniach, 0,6 x 6 prawidłowych ludzkich komórek B od zdrowych dawców (czystość procentowa od 8 do 9%) stymulowano za pomocą 1 µg/ml scd40l (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, Wielka Brytania). Następnie dodawano CHIR ( µg/ml) i kontrolną IgG. Komórki zbierano po czasie 0, minut, 2 godzin, 6 godzin, 18 godzin i 26 godzin. Rozszczepioną kaspazę 9, rozszczepioną kaspazę 3 i rozszczepioną PARP oraz kontrole β-aktyny wykrywano w lizatach komórkowych techniką Western blot. [0190] Pokrótce, zaobserwowano, że stymulacja CD40, w której pośredniczy CD40L, dostarczała sygnałów przeżycia, gdyż nie powodowała ona wzrostu poziomu rozszczepionej kaspazy 9, rozszczepionej kaspazy 3 ani rozszczepionej PARP względem czasu, co wskazywało, że komórki nie ulegały apoptozie. Jednakże traktowanie przeciwciałem CHIR powodowało wzrost poziomu tych produktów rozszczepienia, co wskazuje, że działanie przeciwciałem CHIR znosiło skutki wiązania CD40L na przekazywanie sygnałów przeżycia w stymulowanych przez scd40l prawidłowych komórkach B, przywracając apoptozę komórek B (dane nie są przedstawione). CHIR hamowało ekspresję antyapoptotycznych białek przeżycia

123 123 [0191] W tych doświadczeniach 0,6 x 6 prawidłowych 1 ludzkich komórek B od zdrowych dawców (czystość procentowa od 8 do 9%) stymulowano za pomocą 1 µg/ml scd40l (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, Wielka Brytania). Następnie dodawano CHIR ( µg/ml) i kontrolną IgG. Komórki zbierano po czasie 0, minut, 2 godzin, 6 godzin, 18 godzin i 26 godzin. W lizatach komórkowych z techniki Western blot wykryto Mc-1, XIAP, CD40 i kontrolną β-aktynę Pokrótce, stymulacja scd40l powodowała przedłużoną ekspresję McI-1 i XIAP w czasie. Jednakże traktowanie stymulowanych przez scd40l komórek przeciwciałem CHIR powodowało spadek ekspresji tych białek w czasie (dane nie są przedstawione). Jako że McI-1 i XIAP są sygnałami przeżycia zdolnymi do blokowania szlaku apoptozy, niniejsze wyniki wykazują, że traktowanie przeciwciałem CHIR usuwa blokadę przeciw apoptozie w stymulowanych przez scd40l prawidłowych komórkach B. Traktowanie przeciwciałem CHIR hamowało fosforylację IKKα (Ser 180) i IKKβ (Ser 181) w prawidłowych komórkach B 2 [0192] W tych doświadczeniach, 1,0 x 6 prawidłowych ludzkich komórek B od zdrowych dawców (czystość procentowa od 8 do 9%) stymulowano za pomocą 1 µg/ml scd40l (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, Wielka Brytania). Następnie dodawano CHIR ( µg/ml) i kontrolną IgG. Komórki zbierano po 0 i minutach. W lizatach komórkowych wykrywano fosforylowane IKKα (Ser 180) i IKKβ (Ser 181) oraz kontrole całkowitego IKKβ techniką Western blot. [0193] Pokrótce, stymulacja przez scd40l powodowała fosforylację IKKα (Ser 180) i IKKβ (Ser 181) zależną od czasu; jednakże traktowanie przeciwciałem CHIR-12.12

124 124 odwracało tę odpowiedź na stymulację przez scd40l w prawidłowych komórkach B (dane nie są przedstawione). Traktowanie przeciwciałem CHIR hamowało przeżycie, w którym pośredniczy ligand CD40, w sposób zależny od dawki 1 [0194] W tych doświadczeniach, 0,6 x 6 prawidłowych ludzkich komórek B od zdrowych dawców (czystość procentowa od 8 do 9%) stymulowano za pomocą 1 µg/ml scd40l (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, Wielka Brytania). Następnie dodawano CHIR (w stężeniach 0,01, 0,1, 0,2, 0,, 1,0 µg/ml) i kontrolną IgG. Komórki zbierano po 24 godzinach. Rozszczepione PARP i kontrole β-aktyny wykrywano w lizatach komórkowych techniką Western blot. [019] Pokrótce, traktowanie przeciwciałem CHIR powodowało wzrost rozszczepienia PARP w komórkach stymulowanych przez scd40l w sposób zależny od dawki, znosiło zatem szlak przekazywania sygnałów przeżycia w stymulowanych przez scd40l prawidłowych komórkach B (dane nie są przedstawione). CHIR hamowało ekspresję antyapoptotycznych białek przeżycia w sposób zależny od dawki [0196] W tych doświadczeniach, 0,6 x 6 prawidłowych 2 ludzkich komórek B od zdrowych dawców (czystość procentowa od 8 do 9%) stymulowano za pomocą 1 µg/ml scd40l (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, Wielka Brytania). Następnie dodawano CHIR (w stężeniach 0,, 2 i µg/ml) i kontrolną IgG. Komórki zbierano po 22 godzinach. W lizatach komórkowych wykrywano McI-1, XIAP, rozszczepione PARP i kontrole β-aktyny techniką Western blot. [0197] Pokrótce, traktowanie przeciwciałem CHIR zmniejszało ekspresję McI-1 i XIAP i zwiększało ekspresję

125 12 rozszczepionej PARP w komórkach stymulowanych przez scd40l w sposób zależny od dawki a zatem, znosiło te blokady w szlaku apoptozy w stymulowanych przez scd40l prawidłowych komórkach B (dane nie są przedstawione). CHIR nie wpływa na ekspresję białek antyapoptotycznych, rozszczepionej PARP i XIAP w nieobecności przekazywania sygnałów rozpuszczalnego CD40L [0198] W tych doświadczeniach, 1,0 x 6 prawidłowych 1 ludzkich komórek B od zdrowych dawców (czystość procentowa od 8 do 9%) traktowano tylko przeciwciałem CHIR ( µg/ml) i kontrolną IgG (komórek nie stymulowano wstępnie przez scd40l przed dodaniem przeciwciała). Komórki zbierano po 0, 4, 14 i 16 godzinach. XIAP, rozszczepione PARP i kontrole β-aktyny wykrywano w lizatach komórkowych techniką Western blot. [0199] Pokrótce, wyniki wskazują, że bez stymulacji scd40l komórki wytwarzały zwiększone stężenie rozszczepionego białka PARP, podczas gdy ekspresja białka XIAP pozostawała stała, zarówno w komórkach kontrolnych traktowanych IgG, jak i w komórkach traktowanych CHIR (dane nie są przedstawione). Dane te dowodzą, że CHIR nie inicjuje apoptozy w prawidłowych ludzkich komórkach B bez stymulacji CD40L. 2 CHIR hamuje fosforylację IKKα (Ser 180) i IKKβ (Ser 181), Akt, ERK i p38 w prawidłowych komórkach B [00] W tych doświadczeniach, 1,0 x 6 prawidłowych ludzkich komórek B od zdrowych dawców (czystość procentowa od 8 do 9%) hodowano na pożywkach bez surowicy z dodatkiem 1% FBS i stymulowano za pomocą 1 µg/ml scd40l (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, Wielka Brytania).

126 126 1 Następnie do hodowli dodawano CHIR (1 µg/ml i µg/ml) i kontrolną IgG. Komórki zbierano po czasie 0 i minut. W lizatach komórkowych po analizie typu Western blot wykrywano fosfo-ikkα, fosfo-ikkβ, całkowite IKKβ, fosfo- ERK, całkowite ERK, fosfo-akt, całkowite Akt, fosfo-p38 i całkowite p38. [01] Pokrótce, stymulacja scd40l powodowała wzrost fosforylacji IKKα/β, fosforylacji ERK, fosforylacji Akt i fosforylacji p38, prowadząc w ten sposób do przeżycia i/lub proliferacji tych komórek. Traktowanie tych komórek przeciwciałem CHIR znosiło skutki stymulacji scd40l na te szlaki przekazywania sygnałów w prawidłowych komórkach B (dane nie są przedstawione). CHIR hamuje złożone szlaki przekazywania sygnałów, takie jak PI3K i MEK/ERK, w kaskadzie przekazywania sygnałów CD40 [02] W tych doświadczeniach, 1,0 x 6 prawidłowych 2 ludzkich komórek B od zdrowych dawców (czystość procentowa od 8 do 9%) hodowano na pożywkach bez surowicy z dodatkiem 1% FBS i stymulowano za pomocą 1 µg/ml scd40l (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, Wielka Brytania). Następnie do hodowli dodawano również CHIR (1 µg/ml i µg/ml), wortmaninę (inhibitor PI3K/Akt; 1 i µm), Ly (inhibitor PI3K/Akt; i µm) i PD 9809 (inhibitor MEK; i µg/ml). Komórki zbierano po czasie 0 i minut. W lizatach komórkowych po analizie techniką Western blot wykrywano fosfo-erk, fosfo-akt, całkowite Akt, fosfo-ikkα/β i całkowite. [03] Pokrótce, wyniki wskazują, że CHIR znosi fosforylację wszystkich powyższych sygnałowych cząsteczek przewodzenia, podczas gdy inhibitory sygnałów przewodzenia

127 127 wykazywały tylko swoiste znoszenie przekazywania sygnałów, co świadczy o tym, że CHIR prawdopodobnie hamuje przewodzenie w górę z udziałem tych cząsteczek przekazywania sygnałów za pośrednictwem stymulacji CD40L (dane nie są przedstawione). CHIR hamuje wiązanie cząsteczek sygnałowych TRAF2 i TRAF3 z domeną cytoplazmatyczną CD40 w prawidłowych komórkach B [04] W tych doświadczeniach, 4,0 x 6 prawidłowych 1 2 ludzkich komórek B od zdrowych dawców (czystość procentowa od 8 do 9%) hodowano przez 4 godziny na pożywkach bez surowicy, z dodatkiem 1% FBS i stymulowano za pomocą 1 µg/ml scd40l (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, Wielka Brytania) przez minut. Komórki zbierano po czasie 0 i minut. Wykonywano immunoprecypitację CD40 za pomocą poliklonalnych przeciwciał anty-cd40 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) i znakowano w analizie Western blot za pomocą mab anty-traf2 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), mab anty-traf3 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) i mab anty-cd40 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). [0] Pokrótce, wyniki wskazują, że TRAF2 i TRAF3 koprecypitują z CD40 po stymulacji przez scd40l. Odwrotnie, traktowanie przeciwciałem CHIR znosi powstawanie kompleksów przekazywania sygnałów CD40-TRAF2/3 w stymulowanych przez scd40l prawidłowych komórkach B. Nie było zmian w ekspresji CD40 (dane nie są przedstawione). [06] Nie wdając się w rozważania teoretyczne, można stwierdzić, że wyniki powyższych doświadczeń i wyniki z przykładów podanych powyżej wskazują, że przeciwciało CHIR jest antagonistycznym przeciwciałem monoklonalnym anty-cd40 o podwójnym działaniu, wykazującym unikalną kombinację właściwości. To w pełni ludzkie przeciwciało

128 128 monoklonalne blokuje stymulowane przez CD40L szlaki przekazywania sygnałów CD40 przeżycia i proliferacji komórek B; ten antagonizm prowadzi do ostatecznej śmierci komórki. CHIR pośredniczy również w rozpoznawaniu i wiązaniu przez komórki efektorowe, inicjując zależną od przeciwciała cytotoksyczność komórkową (ADCC). Kiedy CHIR zwiąże się z komórkami efektorowymi, uwalniane są enzymy cytolityczne, co prowadzi do apoptozy i lizy komórek B. CHIR jest przeciwciałem przeciwnowotworowym działającym silniej niż rytuksymab w próbach porównawczych w przedklinicznych modelach nowotworów. Przykład 9: Ciekły preparat farmaceutyczny antagonistycznych przeciwciał anty-cd [07] Celem tego badania było zbadanie wpływu wartości ph roztworu na stabilność antagonistycznego przeciwciała anty- CD40, CHIR metodami biofizycznymi, jak również biochemicznymi, celem wybrania optymalnego środowiska roztworu dla tego przeciwciała. Wyniki różnicowej kalorymetrii skaningowej (DSC) wykazały, że stabilność konformacyjna CHIR jest optymalna w preparatach o wartości ph,-6,. Na podstawie kombinacji analiz SDS- PAGE, chromatografii HPLC wykluczenia (SEC-HPLC) i HPLC kationowymiennej (CEX-HPLC) wywnioskowano, że stabilność fizykochemiczna CHIR jest optymalna przy ph,0,. Na podstawie tych wyników uznano, że zalecanym ciekłym preparatem farmaceutycznym zawierającym to przeciwciało jest preparat zawierający CHIR w stężeniu około mg/ml w roztworze zawierającym około mm bursztynianu sodu, około mm chlorku sodu, o ph około,. Materiały i metody

129 [08] Przeciwciałem CHIR użytym w badaniach preparatu farmaceutycznego jest ludzkie przeciwciało monoklonalne wytworzone w procesie hodowli komórek CHO. To mab ma masę cząsteczkową kda i składa się z dwóch łańcuchów lekkich i dwóch łańcuchów ciężkich połączonych ze sobą mostkami dwusiarczkowymi. Jest ono skierowane przeciw receptorowi powierzchniowemu CD40 na komórkach wykazujących ekspresję CD40, w tym na prawidłowych i nowotworowych komórkach B, i jest przeznaczone do leczenia różnych nowotworów i chorób autoimmunologiczno-zapalnych. [09] Substancją leczniczą anty-cd40 użytą w tym badaniu była seria substancji w masie, pochodząca z hodowli w komórkach CHO, oczyszczonego przeciwciała anty-cd40 (CHIR ). Kompozycja tej substancji leczniczej miała skład: 9,7 mg/ml przeciwciała CHIR w mm cytrynianu sodu, mm chlorku sodu (ph 6,). Kontrolną próbką w tym badaniu była otrzymana substancja lecznicza, poddana zamrożeniu w temperaturze -60 o C, rozmrożona w temperaturze pokojowej i testowana równolegle z próbkami badanymi na stabilność w określonych punktach czasowych. Próbki do badania stabilności sporządzano przez dializę substancji leczniczej wobec roztworów o różnej wartości ph. Stężenie CHIR w każdej próbce oznaczano metodą spektrometrii UV przy długości fali 280 nm, jak to przedstawiono w tabeli 9. Tabela 9. Preparaty CHIR Skład buforu ph Stężenie CHIR (mg/ml) mm cytrynian sodu, mm chlorek sodu 4, 9,0 mm bursztynian sodu, mm chlorek sodu,0 9,3 mm bursztynian sodu, mm chlorek sodu, 9,2 mm cytrynian sodu, mm chlorek sodu 6,0 9,7

130 1 mm cytrynian sodu, mm chlorek sodu 6, 9,4 mm fosforan sodu, mm chlorek sodu 7,0 9,4 mm fosforan sodu, mm chlorek sodu 7, 9, mm glicyna, mm chlorek sodu 9,0 9, [02] Stabilność fizykochemiczną przeciwciała CHIR w różnych preparatach oznaczano według następujących protokołów. Różnicowa kalorymetria skaningowa (DSC) [0211] Stabilność konformacyjną różnych próbek preparatu monitorowano w aparacie MicroCal VP-DSC przy ogrzewaniu od temperatury 1 o C do 90 o C z szybkością 1 o /minutę. SDS-PAGE [0212] Fragmentację i agregację oceniano z użyciem 4-% żelu Tris-glicyna w warunkach nieredukujących i redukujących. Białko wykrywano przez barwienie błękitem Coomassie. Chromatografia wykluczenia (SEC-HPLC) 1 2 [0213] Fragmentację i agregację białka oceniano również z użyciem chromatografu Water Alliance HPLC z kolumną Tosohaas TSK-GEL 00SWXL, stosując jako fazę ruchomą 0 mm fosforan sodu (ph 7,0) i szybkość przepływu 0,7 ml/minutę. Chromatografia kationowymienna (CEX-HPLC) [0214] Zmianę ładunku związaną z rozpadem mierzono w układzie Waters 600s HPLC System z kolumną Dionex Propac WCX-, stosując roztwór 0 mm HEPES (ph 7,3) jako fazę ruchomą A i 0 mm HEPES z dodatkiem 00 mm NaCl (ph 7,3) jako fazę ruchomą B, przy szybkości przepływu 0, o C/minutę.

131 131 Wyniki i omówienie Badanie stabilności konformacyjnej 1 [021] Termiczne rozfałdowanie CHIR ujawniło co najmniej dwie przemiany termiczne, prawdopodobnie odpowiadające rozfałdowaniu z topnieniem odpowiednio domen Fab i Fc. Przy wyższej temperaturze, białko prawdopodobnie tworzyło agregaty, co powoduje zanik sygnału DSC. Dla celów skriningu preparatu, najniższą temperaturę przemiany termicznej zdefiniowano w tym badaniu jako temperaturę topnienia, Tm. Na Fig. 11 przedstawiono temperatura topnienia termicznego jako funkcja wartości ph preparatu. Preparaty o ph w zakresie, 6, dawały przeciwciało anty- CD40 o wyższej stabilności konformacyjnej, co wykazano poprzez wyższą temperaturę topnienia termicznego. Analiza SDS-PAGE [0216] Próbki preparatu CHIR o wartościach ph od 4, do 9,0 inkubowano w temperaturze 40 o C przez 2 miesiące i 2 poddawano analizie SDS-PAGE (dane nie są przedstawione). W warunkach nieredukujących, obserwowano cząsteczki o masie cząsteczkowej (m.cz.) 23 kda i 27 kda w preparatach o wartości ph powyżej,, a cząsteczki o m.cz. 1 kda obserwowano we wszystkich preparatach, ale występowały w mniejszej ilości przy ph,0-,. Cząsteczki o m.cz. 0 kda były widoczne przy ph 7, i ph 9,0. [0217] W warunkach redukujących, CHIR było redukowane do wolnych łańcuchów ciężkich i wolnych łańcuchów lekkich, o m.cz. odpowiednio 0 kda i 24 kda. Cząsteczki o masie 0 kda wydają się nie w pełni zredukowane i ilość ich wzrasta wraz ze wzrostem wartości ph roztworu, co wskazuje, że w tych cząsteczkach mogą pojawiać się połączenia kowalencyjne inne niż dwusiarczkowe. Ponieważ w analizie SDS-PAGE

132 132 występowały inne cząsteczki niezidentyfikowane, porównanie stabilności każdego preparatu opiera się na pozostającej czystości CHIR Preparaty o ph,0 6,0 zapewniały bardziej stabilne środowisko dla CHIR Metodą SDS- PAGE wykryto kilka agregatów (dane nie są przedstawione). Analiza metodą SEC-HPLC 1 2 [0218] W analizie SEC-HPLC wykrywano nienaruszony CHIR jako cząsteczkę reprezentowaną głównym pikiem, cząsteczki zagregowane reprezentowane pikiem frontowym, oddzielonym od piku głównego, cząsteczki dużego fragmentu jako ramię piku z tyłu piku głównego i wykrywano też cząsteczki małego fragmentu w piku pojawiającym się po piku głównym. Po inkubacji w temperaturze o C i 2 o C w czasie 3 miesięcy, wykrywano niewielkie ilości fragmentów białka i agregatów (<1,0%) w powyższych preparatach, a główny pik przeciwciała CHIR wykazywał ponad 99% czystości (dane nie są przedstawione). Jednakże, przy przechowywaniu w temperaturze 40 o C ilość fragmentów białka stopniowo zwiększała się i więcej fragmentów tworzyło się przy ph 4, i ph 6,-9,0, co przedstawiono w tabeli. Po inkubacji preparatów CHIR w temperaturze 40 o C przez 3 miesiące, wykrywano około 2-3% agregatów przy ph 7, i ph 9,0, podczas gdy w preparatach o innym ph wykrywano poniżej 1% agregatów (dane nie są przedstawione). Wyniki analizy metodą SEC-HPLC wskazują, że CHIR jest bardziej stabilne w zakresie wartości ph około,0-6,0. Tabela. Wyniki badania stabilności próbek CHIR w normalnym czasie i w warunkach przyspieszonego starzenia według analizy SEC-HPLC Próbka Pik główny % Fragmenty % t = 0 40 o C 40 o C 40 o C t = 0 40 o C 40 o C 40 o C

133 133 1 mies. 2 mies. 3 mies. 1 mies. 2 mies. 3 mies. Kontrola 99,4 99,2 99,9 99, <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 ph 4, 99,4 93,2 86,0 81,3 <1,0 6,4 13,2 18,1 ph,0 99,8 98,7 91,3 89,2 <1,0 <1,0 7,8,2 ph, 99, ,4 90,6 <1,0 <1,0 7,6 8,8 ph 6,0 99,6 97,7 90,4 87,3 <1,0 1,9 8,2 11,7 ph 6, 99,3 93,4 89,4 86,9 <1,0,6 9,9 12,4 ph 7,0 99,2 93,9 87,4 8,1 <1,0, 11,1 13, ph 7, 99,1 92,8 84,4 81,9 <1,0 6,4 12,9 16,2 ph 9,0 99,3 82,4 61,6 0,6 <1,0 1,4 36,2 47,6 Analiza CEX-HPLC 1 [0219] Metodą analizy CEX-HPLC wykrywano nienaruszony CHIR jako cząsteczkę reprezentowaną głównym pikiem, warianty kwasowe eluujące wcześniej od cząsteczki piku głównego i warianty addycyjne, z dodatkiem lizyny na końcu karboksylowym, eluowane po piku głównym. W tabeli 11 przedstawiono zależność procentowej zawartości cząsteczek CHIR pozostających w piku głównym i wariantów kwasowych od wartości ph roztworu. Próbki kontrolne wykazywały już wysoką zawartość cząsteczek kwasowych ( 33%), prawdopodobnie w wyniku procesów fermentacji we wczesnym etapie i oczyszczania. Wrażliwości CHIR na wyższe wartości ph roztworów dowodzą dwa fakty. Po pierwsze, początkowy preparat próbki o ph 9,0 (t = 0) od razu generował o 12% więcej związków kwaśnych niż próbki kontrolne. Po drugie, procentowa zawartość cząsteczek kwasowych gwałtownie wzrastała przy wzrastającej wartości ph. Rozpad związany ze zmianą ładunków wynika prawdopodobnie z deamidacji. Powyższe dane wskazują, że ten typ rozpadu CHIR był zminimalizowany przy wartościach ph około,0-,. Tabela 11. Procentowe pole powierzchni piku dla CHIR w preparatach o różnych wartościach ph w czasie

134 134 rzeczywistym i w warunkach przyspieszonego starzenia, w analizie techniką CEX-HPLC Główny pik (%) Warianty kwasowe (%) Próbka o C 2 o C 40 o C 40 o C o C 2 o C 40 o C 40 o C t = 0 t = 0 3 m 3 m 1 m 2 m 3 m 3 m 1 m 2 m Kontrola 49,2 49,8 49,8 49,2 0,3 32,0 33,7 33,7 32,0 33,6 ph 4, 48, 49,7 43,7 39,7,0 32, 32,6 38,0 44,2 6,4 ph,0 49,6 49,8 48,3 40,6 31,4 32,7 31,8 3,0 44,3 7,1 ph, 0,7 0,3 48,1 40,0,2 32,6 31,8 37,8 48,9 63,3 ph 6,0 0,2 49,9 47,9 37,4 23,9 33,1 33,6 38, 4,9 72,7 ph 6, 49,4 49,9 42,3 29,7 14,6 33,3 33,6 47,7 6,2 84,6 ph 7,0 49,7 49,9 21, ,4 36,4 64,4 - - ph 7, 49,3 48,3 12, , 40,1 79,2 - - ph 9,0 41,3 31, ,7 9, Wniosek 1 [02] Wartość ph miała znaczący wpływ na stabilność konformacyjną i fizykochemiczną CHIR Wykazano, że rozpad związany ze zmianą ładunku jest głównym szlakiem rozpadu CHIR-12.12, który jest zminimalizowany przy ph,0-,. Na podstawie ogólnych danych na temat stabilności, zalecanym ciekłym preparatem farmaceutycznym tego przeciwciała jest preparat zawierający CHIR w stężeniu około mg/ml w roztworze około mm bursztynianu sodu i około mm chlorku sodu, o wartości ph około,. Przykład : Badania kliniczne z użyciem CHIR-.9 i CHIR Cele kliniczne [0221] Ogólnym celem jest zapewnienie skutecznego leczenia guzów litych, zawierających komórki nowotworowe wykazujące ekspresję CD40 przez działanie na nie anty-cd40 immunoglobuliną IgG1. Do tych guzów należą raki płuc, piersi, okrężnicy, jajnika i nowotwory skóry. Sygnał dla tych chorób określa się w fazie II, jednak pewien pomiar

135 13 aktywności można już uzyskać w fazie I. Początkowo środek ten bada się w monoterapii, ale w miarę rozwoju i badań będzie on podawany w połączeniu z innymi środkami, chemioterapeutykami i innymi przeciwciałami. Faza I [0222] 1 2 Ocenić bezpieczeństwo i zbadać farmakokinetykę zwiększanie dawki u osób z wyżej wspomnianymi guzami litymi. Wybrać dawkę na podstawie bezpieczeństwa, tolerancji i zmian w markerach CD40 w surowicy. W zasadzie poszukuje się maksymalnej dawki tolerowanej (MTD), ale do znalezienia właściwej dawki odpowiednie mogą być inne wskaźniki skuteczności (spadek komórek nowotworowych CD40 dodatnich (CD40+) i podobne). Rozważyć więcej niż jedną dawkę, zwłaszcza dla różnych wskazań, np. dawka stosowana w raku piersi może być inna niż dawka stosowana w raku jajnika. Pewne określenia dawki mogą być zatem potrzebne w fazie II. Pacjenci będą otrzymywali dawkę raz na tydzień z pobraniem próbek do badań farmakokinetycznych (PK) w czasie rzeczywistym. Początkowo maksymalnym dozwolonym dawkowaniem będzie cykl 4-tygodniowy. PK może być bardzo zmienna, zależnie od badanej choroby, gęstości antygenu CD40 i podobnych czynników. To badanie (lub badania) jest dostępne dla osób z guzami litymi wykazującymi ekspresję CD40, w tym dla osób z rakiem płuc, piersi, okrężnicy, jajnika i nowotworami skóry.

136 136 Decyzję, czy przerwać, czy kontynuować badania opiera się na bezpieczeństwie, dawce i na wstępnych dowodach aktywności przeciwnowotworowej. Aktywność leku określoną jako stopień odpowiedzi określa się w fazie II. Określić dawkę do stosowania w fazie II. Faza II 1 [0223] Będzie zainicjowanych kilka badań w wyżej wymienionych typach nowotworów ze skupieniem się na raku płuc, jajnika i piersi. W randomizowanych badaniach fazy II można oceniać więcej niż jedną dawkę i więcej niż jeden schemat dawkowania. [0224] W każdej chorobie, badanie będzie skierowane na populację, w której dotychczasowe, poniższe standardowe leczenie się nie powiodło: Rak płuca: zabieg chirurgiczny, napromienianie, chemioterapia Rak jajnika: zabieg chirurgiczny, napromienianie, chemioterapia Rak piersi: zabieg chirurgiczny, napromienianie, chemioterapia, terapia hormonalna 2 Decyzję, czy przerwać, czy kontynuować badanie opiera się na udowodnieniu założenia terapeutycznego w fazie II Ustalić, czy marker zastępczy może być użyty jako wczesny dowód skuteczności klinicznej Określić dawki do stosowania w badaniach fazy III Faza III

137 137 [022] Faza III będzie zależeć od tego, gdzie zostanie wykryty sygnał w fazie II i jakie konkurencyjne terapie przyjmuje się jako standardowe. Jeśli ten sygnał znajduje się w etapie choroby, dla którego nie ma standardowej terapii, wówczas jako badanie podstawowe będzie mogło służyć dobrze kontrolowane badanie z jedną grupą terapeutyczną. Jeśli istnieją konkurencyjne środki, które uważa się za leczenie standardowe, wówczas będą prowadzone badania bezpośrednie badania porównawcze. WYKAZ SEKWENCJI [0226] 1 <1> Long, Li Luqman, Mohammad Yabannavar, Asha Zaror, Isabel <1> Zastosowanie antagonistycznych przeciwciał monoklonalnych anty CD40 do leczenia szpiczaka mnogiego <1> PP (28291) <> 60/6.709 <11> <> 60/6.7 <11> <> 60/2.79 <11> <> 60/ <11> <160> 12 <170> FastSEQ dla wersji Windows 4.0 <2> 1 <211> 7 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna

138 138 <2> <223> Sekwencja kodująca łańcucha lekkiego ludzkiego przeciwciała anty CD40, <221> CDS <222> (1).(7) <400> 1

139 139 <2> 2 <211> 239 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Łańcuch lekki ludzkiego przeciwciała anty CD40, <400> 2

140 140 <2> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Sekwencja kodująca łańcucha ciężkiego ludzkiego przeciwciała anty CD40, (z intronami) <400> 3 1

141 141 <2> 4 <211> 469 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Łańcuch ciężki ludzkiego przeciwciała anty CD40, <400> 4

142 142

143 143 <2> <211> 469 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Łańcuch ciężki wariantu ludzkiego przeciwciała anty CD40, <400>

144 144

145 14 Leu Ser Pro Gly Lys 46 <2> 6 <211> 239 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Łańcuch lekki ludzkiego przeciwciała anty CD40,.9 <400> 6 1 <2> 7 <211> 474 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <2>

146 146 <223> Łańcuch ciężki ludzkiego przeciwciała anty CD40,.9 <400> 7

147 147 <2> 8 <211> 474 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <2>

148 148 <223> Łańcuch ciężki wariantu ludzkiego przeciwciała anty CD40,.9 <400> 8

149 149

150 1 <2> 9 <211> 612 <212> DNA <213> Homo sapiens <2> <221> CDS <222> (1)..(612) <221> cechy mieszane <222> (0) (0) <223> Sekwencja kodująca krótkiej izoformy ludzkiego CD40 <400> 9

151 11

152 12 <2> <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 <2> 11 <211> 843 <212> DNA <213> Homo sapiens <2> <221> CDS <222> (1)..(834) <221> Cechy mieszane <222> (0) (0)

153 13 <223> Sekwencja kodująca długiej izoformy ludzkiego CD40 <400> 11

154 14

155 1 <2> 12 <211> 277 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12

156 16 Zastrzeżenia patentowe 1 1. Ludzkie przeciwciało monoklonalne anty-cd40, mające zdolność swoistego wiązania się z antygenem CD40, które to przeciwciało monoklonalne, jeśli jest związane z antygenem CD40, jest wolne od znaczącej aktywności agonistycznej, przy czym przeciwciało to jest wybrane z grupy obejmującej: a) przeciwciało monoklonalne wiążące się z epitopem zdolnym do związania przeciwciała monoklonalnego CHIR-.9, możliwego do otrzymania z linii komórek hybrydoma zdeponowanej w banku ATCC jako depozyt patentowy pod numerem PTA-42 albo przeciwciała monoklonalnego CHIR , możliwego do otrzymania z linii komórek hybrydoma zdeponowanej w banku ATCC jako depozyt patentowy pod numerem PTA-43; b) przeciwciało monoklonalne wiążące się z epitopem zawierającym reszty ludzkiej sekwencji CD40 przedstawionej w sekwencji SEQ ID nr albo SEQ ID nr 12; 2 c) przeciwciało monoklonalne wiążące się z epitopem zawierającym reszty ludzkiej sekwencji CD40 przedstawionej w sekwencji SEQ ID nr albo SEQ ID nr 12; d) przeciwciało monoklonalne współzawodniczące z przeciwciałem monoklonalnym CHIR-.9 otrzymywanym z linii komórek hybrydoma zdeponowanej w banku ATCC jako depozyt patentowy pod numerem PTA-42 albo z przeciwciałem monoklonalnym CHIR otrzymywanym z linii komórek hybrydoma zdeponowanej w banku ATCC jako

157 17 depozyt patentowy pod numerem PTA-43, w próbie wiązania kompetycyjnego, 1 2 do stosowania w leczeniu u osobnika (człowieka) guza litego zawierającego komórki nowotworowe, w których przebiega ekspresja antygenu CD Zastosowanie skutecznej ilości ludzkiego przeciwciała monoklonalnego anty-cd40, mającego zdolność swoistego wiązania się z antygenem CD40, do wytwarzania leku do leczenia u osobnika (człowieka) guza litego zawierającego komórki nowotworowe, w których przebiega ekspresja antygenu CD40, przy czym to przeciwciało monoklonalne jest wolne od znaczącej aktywności agonistycznej, jeśli jest związane z antygenem CD40, które to przeciwciało jest wybrane z grupy obejmującej: a) przeciwciało monoklonalne wiążące się z epitopem zdolnym do związania przeciwciała monoklonalnego CHIR-.9 możliwego do otrzymania z linii komórek hybrydoma zdeponowanej w banku ATCC jako depozyt patentowy pod numerem PTA-42 albo przeciwciała monoklonalnego CHIR możliwego do otrzymania z linii komórek hybrydoma zdeponowanej w banku ATCC jako depozyt patentowy pod numerem PTA-43; b) przeciwciało monoklonalne wiążące się z epitopem zawierającym reszty ludzkiej sekwencji CD40 przedstawionej w sekwencji SEQ ID nr albo SEQ ID nr 12; c) przeciwciało monoklonalne wiążące się z epitopem zawierającym reszty ludzkiej sekwencji CD40 przedstawionej w sekwencji SEQ ID nr albo SEQ ID nr 12; i

158 d) przeciwciało monoklonalne współzawodniczące z przeciwciałem monoklonalnym CHIR-.9 otrzymywanym z linii komórek hybrydoma zdeponowanej w banku ATCC jako depozyt patentowy pod numerem PTA-42 albo z przeciwciałem monoklonalnym CHIR otrzymywanym z linii komórek hybrydoma zdeponowanej w banku ATCC jako depozyt patentowy pod numerem PTA-43, w próbie wiązania kompetycyjnego. 3. Sposób in vitro hamowania wzrostu guza litego zawierającego komórki nowotworowe, w których przebiega ekspresja antygenu CD40, który to sposób polega na kontaktowaniu tych komórek ze skuteczną ilością ludzkiego przeciwciała monoklonalnego anty-cd40 zdolnego do swoistego wiązania z tym antygenem CD40, przy czym to przeciwciało monoklonalne jest wolne od znaczącej aktywności agonistycznej, jeśli jest związane z antygenem CD40, które to przeciwciało jest wybrane z grupy obejmującej: a) przeciwciało monoklonalne wiążące się z epitopem zdolnym do związania przeciwciała monoklonalnego CHIR-.9 możliwego do otrzymania z linii komórek hybrydoma zdeponowanej w banku ATCC jako depozyt patentowy pod numerem PTA-42 albo przeciwciała monoklonalnego CHIR możliwego do otrzymania z linii komórek hybrydoma zdeponowanej w banku ATCC jako depozyt patentowy pod numerem PTA-43; b) przeciwciało monoklonalne wiążące się z epitopem zawierającym reszty ludzkiej sekwencji CD40 przedstawionej w sekwencji SEQ ID nr albo SEQ ID nr 12; c) przeciwciało monoklonalne wiążące się z epitopem zawierającym reszty ludzkiej sekwencji CD40

159 19 przedstawionej w sekwencji SEQ ID nr albo SEQ ID nr 12; i 1 2 d) przeciwciało monoklonalne współzawodniczące z przeciwciałem monoklonalnym CHIR-.9 otrzymywanym z linii komórek hybrydoma zdeponowanej w banku ATCC jako depozyt patentowy pod numerem PTA-42 albo z przeciwciałem monoklonalnym CHIR otrzymywanym z linii komórek hybrydoma zdeponowanej w banku ATCC jako depozyt patentowy pod numerem PTA-43, w próbie wiązania kompetycyjnego. 4. Ludzkie przeciwciało monoklonalne anty-cd40, zdolne do swoistego wiązania z antygenem CD40, które to przeciwciało monoklonalne jest wolne od znaczącej aktywności agonistycznej, jeśli jest związane z antygenem CD40, które to przeciwciało jest wybrane z grupy obejmującej: a) przeciwciało monoklonalne wiążące się z epitopem zdolnym do związania przeciwciała monoklonalnego CHIR-.9 możliwego do otrzymania z linii komórek hybrydoma zdeponowanej w banku ATCC jako depozyt patentowy pod numerem PTA-42 albo przeciwciała monoklonalnego CHIR możliwego do otrzymania z linii komórek hybrydoma zdeponowanej w banku ATCC jako depozyt patentowy pod numerem PTA-43; b) przeciwciało monoklonalne wiążące się z epitopem zawierającym reszty ludzkiej sekwencji CD40 przedstawionej w sekwencji SEQ ID nr albo SEQ ID nr 12; c) przeciwciało monoklonalne wiążące się z epitopem zawierającym reszty ludzkiej sekwencji CD40

160 160 przedstawionej w sekwencji SEQ ID nr albo SEQ ID nr 12; i d) przeciwciało monoklonalne współzawodniczące z przeciwciałem monoklonalnym CHIR-.9 otrzymywanym z linii komórek hybrydoma zdeponowanej w banku ATCC jako depozyt patentowy pod numerem PTA-42 albo z przeciwciałem monoklonalnym CHIR otrzymywanym z linii komórek hybrydoma zdeponowanej w banku ATCC jako depozyt patentowy pod numerem PTA-43, w próbie wiązania kompetycyjnego, do stosowania w hamowaniu wzrostu guza litego zawierającego komórki nowotworowe, w których przebiega ekspresja antygenu CD Zastosowanie skutecznej ilości ludzkiego przeciwciała monoklonalnego anty-cd40, mającego zdolność swoistego wiązania się z antygenem CD40, do wytwarzania leku do hamowania wzrostu guza litego zawierającego komórki nowotworowe, w których przebiega ekspresja antygenu CD40, przy czym to przeciwciało monoklonalne jest wolne od znaczącej aktywności agonistycznej, jeśli jest związane z antygenem CD40, które to przeciwciało jest wybrane z grupy obejmującej: a) przeciwciało monoklonalne wiążące się z epitopem zdolnym do związania przeciwciała monoklonalnego CHIR-.9 możliwego do otrzymania z linii komórek hybrydoma zdeponowanej w banku ATCC jako depozyt patentowy pod numerem PTA-42 albo przeciwciała monoklonalnego CHIR możliwego do otrzymania z linii komórek hybrydoma zdeponowanej w banku ATCC jako depozyt patentowy pod numerem PTA-43;

161 161 b) przeciwciało monoklonalne wiążące się z epitopem zawierającym reszty ludzkiej sekwencji CD40 przedstawionej w sekwencji SEQ ID nr albo SEQ ID nr 12; 1 c) przeciwciało monoklonalne wiążące się z epitopem zawierającym reszty ludzkiej sekwencji CD40 przedstawionej w sekwencji SEQ ID nr albo SEQ ID nr 12; i d) przeciwciało monoklonalne współzawodniczące z przeciwciałem monoklonalnym CHIR-.9 otrzymywanym z linii komórek hybrydoma zdeponowanej w banku ATCC jako depozyt patentowy pod numerem PTA-42 albo z przeciwciałem monoklonalnym CHIR otrzymywanym z linii komórek hybrydoma zdeponowanej w banku ATCC jako depozyt patentowy pod numerem PTA-43, w próbie wiązania kompetycyjnego. 6. Przeciwciało, zastosowanie lub sposób według dowolnego spośród zastrz. 1-, w którym to przeciwciało albo jego fragment wiążący antygen, jest wybrane z grupy obejmującej: 2 (i) przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen, zawierające domenę zmienną łańcucha lekkiego, w której znajdują się reszty 44-4, i SEQ ID nr 2 albo SEQ ID nr 6; (ii) przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen, zawierające domenę zmienną łańcucha ciężkiego, w której znajdują się reszty 0-4, i SEQ ID nr 4 albo SEQ ID nr 7; (iii) przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen, zawierające domenę zmienną łańcucha lekkiego, w której

162 162 znajdują się reszty 46-2, i SEQ ID nr 2 albo SEQ ID nr 6; i (iv) przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen, zawierające domenę zmienną łańcucha ciężkiego, w której znajdują się reszty 4-1, 72-74, 11-1 SEQ ID nr 4 albo SEQ ID nr Przeciwciało, zastosowanie lub sposób według dowolnego spośród zastrz. 1-, w którym to przeciwciało zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej: 1 2 (i) reszty SEQ ID nr 2; (ii) reszty SEQ ID nr 2; (iii) SEQ ID nr 2; (iv) reszty -139 SEQ ID nr 4; (v) reszty -469 SEQ ID nr 4; (vi) SEQ ID nr 4; (vii) reszty -469 SEQ ID nr ; (viii) SEQ ID nr ; (ix) reszty SEQ ID nr 2 i reszty -139 SEQ ID nr 4; (x) reszty SEQ ID nr 2 i reszty -469 SEQ ID nr 4; (xi) reszty SEQ ID nr 2 i reszty -469 SEQ ID nr ; (xii) SEQ ID nr 2 i SEQ ID nr 4 oraz (xiii) SEQ ID nr 2 i SEQ ID nr. 8. Przeciwciało, zastosowanie lub sposób według dowolnego spośród zastrz. 1-, w którym to przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej: (i) reszty SEQ ID nr 6;

163 (ii) reszty SEQ ID nr 6; (iii) SEQ ID nr 6; (iv) reszty -144 SEQ ID nr 7; (v) reszty -474 SEQ ID nr 7; (vi) SEQ ID nr 7; (vii) reszty -474 SEQ ID nr 8; (viii) SEQ ID nr 8; (ix) reszty SEQ ID nr 6 i reszty -144 SEQ ID nr 7; (x) reszty SEQ ID nr 6 i reszty -474 SEQ ID nr 7; (xi) reszty SEQ ID nr 6 i reszty -474 SEQ ID nr 8; (xii) SEQ ID nr 6 i SEQ ID nr 7; oraz (xiii) SEQ ID nr 6 i SEQ ID nr Przeciwciało, zastosowanie lub sposób według dowolnego spośród poprzednich zastrzeżeń, w którym to przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym CHIR-.9 możliwym do otrzymania z linii komórek hybrydoma zdeponowanej w banku ATCC jako depozyt patentowy pod numerem PTA-42 albo przeciwciałem monoklonalnym CHIR możliwym do otrzymania z linii komórek hybrydoma zdeponowanej w banku ATCC jako depozyt patentowy pod numerem PTA-43.. Przeciwciało, zastosowanie lub sposób według dowolnego spośród poprzednich zastrzeżeń, w którym guz lity jest wybrany z grupy obejmującej raka płuc, raka piersi, raka jajników, raka skóry, raka okrężnicy, raka pęcherza moczowego, raka wątroby, raka żołądka, raka gruczołu krokowego, raka nerkowokomórkowego, raka jamy nosowogardłowej, raka płaskokomórkowego, brodawkowatego raka tarczycy, raka szyjki macicy i mięsaki.

164 Przeciwciało, zastosowanie lub sposób według zastrz., w którym ten lek stosuje się w sposobie obejmującym ponadto podawanie osobnikowi co najmniej jednego innego protokołu terapii przeciwnowotworowej wybranej z grupy obejmującej zabieg chirurgiczny, napromienianie, chemioterapię, terapię cytokiną i innym przeciwciałem monoklonalnym przeznaczonym do stosowania w leczeniu tego guza litego. 12. Przeciwciało, zastosowanie lub sposób według dowolnego spośród zastrz. 1-, w którym to przeciwciało monoklonalne jest wiążącym antygen fragmentem przeciwciała monoklonalnego, przy czym ten fragment zachowuje zdolność swoistego wiązania z tym ludzkim antygenem CD Przeciwciało, zastosowanie lub sposób według według zastrz. 12, w którym ten fragment przeciwciała wiążący antygen jest wybrany z grupy obejmującej fragment Fab, fragment F(ab ) 2, fragment Fv i jednołańcuchowy fragment Fv. 14. Przeciwciało, zastosowanie lub sposób według dowolnego spośród poprzednich zastrzeżeń, w którym to przeciwciało monoklonalne albo jego fragment wiążący antygen wiąże się z ludzkim antygenem CD40 z powinowactwem (K D ) wynoszącym co najmniej -6 M. 1. Przeciwciało, zastosowanie lub sposób według zastrz. 14, w którym to przeciwciało monoklonalne albo jego fragment wiążący antygen wiąże się z ludzkim antygenem CD40 z powinowactwem (K D ) wynoszącym co najmniej -8 M. 16. Przeciwciało, zastosowanie lub sposób według dowolnego spośród poprzednich zastrzeżeń, w którym to przeciwciało

165 16 monoklonalne albo jego fragment wiążący antygen jest wytworzony w linii komórek CHO. Novartis Vaccines and Diagnostics Inc. Xoma Technology Ltd. Zastępca:

166 166

167 167

168 168

169 169

170 170

171 171

172 172

173 173

174 174

175 17

176 176