(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2013/12 EP B1 (13) (51) T3 Int.Cl. C07K 16/30 ( ) A61K 39/395 ( ) A61P 35/00 ( ) C12N 5/12 ( ) A61K 47/48 ( ) A61K 51/10 ( ) (54) Tytuł wynalazku: Przeciwciała monoklonalne claudin-18 do leczenia raka (30) Pierwszeństwo: EP (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2008/31 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2013/08 (73) Uprawniony z patentu: Ganymed Pharmaceuticals AG, Mainz, DE Johannes Gutenberg-Universität Mainz, Mainz, DE (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 UGUR SAHIN, Mainz, DE ÖZLEM TÜRECI, Mainz, DE DIRK USENER, Wiesbaden, DE STEFAN FRITZ, Flonheim, DE CHRISTOPH UHEREK, Ginsheim, DE GUNDA BRANDENBURG, Wedel, DE HARALD-GERHARD GEPPERT, Hannover, DE ANJA KRISTINA SCHRÖDER, Mainz, DE PHILIPPE THIEL, Planegg, DE (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Urszula Bartnik POLSERVICE KANCELARIA RZECZNIKÓW PATENTOWYCH SP. Z O.O. ul. Bluszczańska Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 P/32500PL00 EP Opis [0001] Oparte na przeciwciałach terapie przeciwnowotworowe mogą osiągać większą swoistość oraz profil mniejszych skutków ubocznych w porównaniu z lekami konwencjonalnymi. Powodem tego jest precyzyjne odróżnianie przez przeciwciała komórek prawidłowych od nowotworowych oraz to, że ich sposób działania polega na mniej toksycznych immunologicznych mechanizmach przeciwnowotworowych, takich jak aktywacja dopełniacza i rekrutacja cytotoksycznych komórek immunologicznych. [0002] Cele terapii opartych na przeciwciałach muszą wykazywać pewne szczególne właściwości, co tworzy podstawę do właściwego odróżniania komórek prawidłowych od nowotworowych. Oczywiście idealnym punktem wyjścia do rozwoju skutecznych i bezpiecznych środków terapeutycznych na bazie przeciwciał byłby cel ograniczony wyłącznie do komórek nowotworowych i całkowicie niewykrywalny na tkankach prawidłowych. W innym aspekcie podstawą okna terapeutycznego i niewielkich skutków ubocznych może być wysoki poziom nadmiernej ekspresji, czego przykładem jest receptor typu 2 ludzkiego czynnika wzrostu naskórka (HER-2), który w wyniku powielenia genów jest odpowiednim celem dla przeciwciała trastuzumabu (Herceptin). [0003] Inne cele przeciwciał, które są lekami albo już zarejestrowanymi, albo pozostającymi w fazie rozwoju klinicznego (do zastosowania w terapii nowotworów), wykazują odrębne właściwości, które nie są oparte na liczbowej nadmiernej ekspresji cząsteczek docelowych na komórkach nowotworowych. W przypadku przeciwciał

3 przeciwko proteoglikanowi MUC-1, w komórkach nowotworowych peptydowe powtórzenie epitopu w rdzeniu celu jest niedostatecznie glikozylowane i przez to zmienione w stosunku do swego prawidłowego odpowiednika. W przypadku przeciwciał przeciwko CD20 (rytuksymab), CD52 (Campath-1H) i CD22 (epratuzumab), cele przeciwciał wykazują porównywany poziom ekspresji na komórkach nowotworowych i na prawidłowych limfocytach. W tym przypadku można tolerować atak przeciwciał na komórki prawidłowe, ponieważ ujemne pod względem celu komórki macierzyste przywracają prawidłowy skład limfocytów. Innymi przykładami różnic w dostępności celów przeciwciał są antygen rakowozarodkowy (CEA) i anhydraza węglanowa IX (CA9). Oba antygeny ulegają ekspresji na prawidłowych nabłonkach, odpowiednio, okrężnicy i nerki. Wyznakowane radioaktywnie przeciwciała obrazujące rozróżniają jednak tkanki nowotworowe od tkanek prawidłowych, i przeciwciała cytotoksyczne są dobrze tolerowane. Jest to prawdopodobnie związane z ograniczoną ekspresją CA9 i CEA od strony światła prawidłowej tkanki nabłonkowej, gdzie przeciwciała IgG nie mają dostępu. Do tej kategorii należy również antygenowa cząsteczka adhezji komórek nabłonka (Ep-CAM). Jako cząsteczka homotypowej adhezji komórek nabłonka zlokalizowana jest ona w przestrzeni międzykomórkowej. Co ciekawe, o ile wykazujące duże powinowactwo przeciwciała anty-ep-cam są bardzo toksyczne, przeciwciała o średnim powinowactwie są dobrze tolerowane. Sugeruje to dostępność celu Ep-CAM na komórkach prawidłowych, lecz

4 także wskazuje, że kinetyka wiązania przeciwciała może otwierać okno terapeutyczne. [0004] Jedna z możliwości jest taka, że do wykorzystania w metodach opartych na przeciwciałach nadają się również inne białka swoiste dla komórek nabłonkowych, odgrywające rolę w adhezji międzykomórkowej, ponieważ mogą one być prawie niedostępne dla przeciwciał w dobrze ustrukturyzowanych nabłonkach, natomiast stają się wyeksponowane na komórkach nowotworowych. Autorzy analizowali zatem białka uczestniczące w organizacji architektury tkanki nabłonkowej pod kątem tego, czy nadają się do wykorzystania jako cele dla przeciwciał terapeutycznych. Białkiem, które szczególnie przyciągnęło uwagę autorów, jest klaudyna 18. [0005] W WO 2004/ i WO 2005/ ujawniono identyfikację wariantów splicingowych klaudyny 18A1 i klaudyny 18A2 jako celów w diagnostyce i terapii chorób nowotworowych. [0006] Cząsteczka klaudyny 18 (CLD18) (numer akcesyjny Genbank: wariant splicingowy 1 (CLD18A1): NP_057453, NM_016369, wariant splicingowy 2 (CLD18A2): NM_ , NP_ ) jest integralnym białkiem przezbłonowym o masie cząsteczkowej wynoszącej około 27,9 / 27,72 kd. Klaudyny są integralnymi białkami błonowymi, umiejscowionymi w obrębie obwódek zamykających nabłonków i śródbłonków. Obwódki zamykające organizują sieć wzajemnie ze sobą połączonych nici cząstek śródbłonowych pomiędzy przylegającymi komórkami. W obwódkach zamykających najważniejszymi składowymi białkami przezbłonowymi są

5 okludyna i klaudyny. Ze względu na swe właściwości silnej adhezji międzykomórkowej tworzą one podstawową barierę do zapobiegania okołokomórkowemu transportowi substancji rozpuszczonych i regulowania tego transportu i ograniczają dyfuzję boczną lipidów i białek błonowych w celu utrzymania polarności komórek. Białka tworzące obwódkę zamykającą są w kluczowym stopniu zaangażowane w organizowaniu architektury tkanki nabłonkowej. Autorzy założyli, że takie białka mogą być w małym stopniu dostępne dla przeciwciał w dobrze ustrukturyzowanych nabłonkach, lecz stają się wyeksponowane na komórkach nowotworowych. [0007] CLD18 jest tetraspaniną i jako taka posiada 4 regiony hydrofobowe. Autorzy uzyskali dane wskazujące, że CLD 18 wykazuje kilka różnych konformacji, które mogą być wybiórczo traktowane przez przeciwciała. Jedna z konformacji (CLD18-konformacja 1) oznacza, że wszystkie cztery regiony hydrofobowe stanowią regularne domeny przezbłonowe (TM) i tworzą się dwie pętle pozakomórkowe (pętla 1 otoczona regionem hydrofobowym 1 i regionem hydrofobowym 2; pętla 2 otoczona regionami hydrofobowymi 3 i 4), jak opisano w odniesieniu do znacznej większości członków rodziny klaudyn. Druga konformacja (CLD18-konformacja 2) oznacza, że, jak opisano w przypadku PMP22 innego członka rodziny tetraspanin (Taylor i wsp., J. Neurosc. Res. 62:15-27, 2000), domeny hydrofobowe druga i trzecia nie przechodzą w pełni przez błonę plazmatyczną, tak że część (pętla D3) między domeną przezbłonową pierwszą a czwartą jest pozakomórkowa. Konformacja trzecia (CLD18- konformacja 3) oznacza, że istnieje duża domena

6 pozakomórkowa z dwoma wewnętrznymi regionami hydrofobowymi otoczonymi przez regiony hydrofobowe pierwszy i czwarty, służące jako regularne domeny przezbłonowe. Z uwagi na obecność klasycznego miejsca N-glikozylacji w pętli D3, warianty topologiczne klaudyny 18 CLD18-topologia 2 i CLD18-topologia 3 zawierają dodatkowe, pozakomórkowe miejsce N- glikozylacji. [0008] Kolejny poziom złożoności nadaje cząsteczce CLD18 obecność dwóch różnych wariantów splicingowych, które opisano u myszy i u ludzi (Niimi, Mol. Cell. Biol. 21: , 2001). Warianty splicingowe CLD18A1 i CLD18A2 różnią się pierwszymi 21 N-końcowymi aminokwasami, które zawierają pierwszą TM i pętlę 1, natomiast podstawowa sekwencja białkowa końca C jest identyczna. [0009] CLD18A1 ulega wybiórczej ekspresji na prawidłowych nabłonkach płuc i żołądka, CLD18A2 ulega zaś ekspresji tylko na komórkach żołądka (Niimi, Mol. Cell. Biol. 21: , 2001). Co najważniejsze, CLD18A2 ogranicza się do zróżnicowanych, krótko żyjących komórek nabłonka żołądka, nie ma go zaś w regionie komórek macierzystych żołądka. Stosując czułą RT-PCR, autorzy wykazali, że żaden z wariantów nie jest wykrywalny w żadnym innym prawidłowym narządzie ludzkim, ulega natomiast silnej ekspresji w kilku typach nowotworów, w tym w nowotworach żołądka, przełyku, trzustki i płuca, jak również w ludzkich liniach komórek nowotworowych. Ekspresja jest najsilniej wyrażona w podtypach gruczolakoraka tych nowotworów.

7 [0010] Masa cząsteczkowa białka różni się w niektórych nowotworach i przylegających tkankach prawidłowych. Białko o większej masie cząsteczkowej, obserwowane w zdrowej tkance, można przekształcić do białka o takiej samej masie cząsteczkowej, jak obserwowana w nowotworach, przez potraktowanie lizatów tkanki związkiem deglikozylującym - PNGazą F. Sugeruje to, że CLD18 w nowotworach jest mniej N-glikozylowane w porównaniu z jego odpowiednikiem w tkankach prawidłowych. Ta różnica strukturalna powoduje prawdopodobnie zmianę epitopu. Klasyczny motyw N- glikozylacji znajduje się w pozycji aminokwasu 116 w domenie pętli D3 cząsteczki. [0011] Terminy CLD18 i wariant CLD18 według wynalazku mają obejmować (i) warianty splicingowe CLD18 (ii) warianty N-glikozylacji CLD18 (iii) warianty konformacyjne CLD18 (iv) wolne CLD18 i homotypowo/heterotypowo powiązane warianty zlokalizowane na międzykomórkowych obwódkach zamykających oraz (v) warianty CLD18 związane z nowotworami i warianty CLD18 niezwiązane z nowotworami. [0012] Charakterystyka molekularna i funkcjonalna CLD 18 powoduje, że ta cząsteczka jest bardzo interesującym celem terapii przeciwnowotworowej opartej na przeciwciałach. Cechami, które o tym przesądzają, są w szczególności (i) nieobecność CLD18 w znacznej większości istotnych dla toksyczności tkanek prawidłowych (ii) ograniczenie ekspresji wariantu CLD18A2 do nieniezbędnych populacji komórek, takich jak zróżnicowane komórki żołądka, których populacja może być odnowiona przez ujemne pod względem celu komórki

8 macierzyste żołądka (iii) dane na temat potencjalnych różnic w glikozylacji pomiędzy komórkami prawidłowymi a nowotworowymi i (iv) obecność różnych topologii konformacyjnych. Do właściwego okna terapeutycznego może przyczyniać się ponadto rola CLD18 jako białka obwódki zamykającej. Jako że komórki nowotworowe wykazują ekspresję klaudyn, lecz często nie tworzą klasycznych obwódek zamykających przez homotypowe i heterotypowe połączenie klaudyn, jak to stwierdza się w prawidłowej tkance nabłonkowej, w komórkach nowotworowych może być obecna istotna pula wolnych klaudyn, która jest dostępna do wiązania z przeciwciałami pozakomórkowymi i do immunoterapii. Możliwe, że epitopy wiązania klaudyn w zdrowym nabłonku są chronione w obwódkach zamykających przed dostępem takich przeciwciał. [0013] Celem niniejszego wynalazku jest zapewnienie przeciwciał użytecznych do terapii chorób, w których CLD18 ulega ekspresji, takich jak choroby nowotworowe. Opisywane tu przeciwciała znajdują również zastosowanie w rozpoznawaniu takich chorób. KRÓTKI OPIS WYNALAZKU [0014] Przedmiotem niniejszego wynalazku są ogólnie przeciwciała użyteczne jako środki terapeutyczne do leczenia i(lub) profilaktyki chorób związanych z komórkami wykazującymi ekspresję CLD18, takich jak choroby związane z nowotworami, takimi jak nowotwór żołądka, nowotwór przełyku, nowotwór trzustki, nowotwór płuca, nowotwór jajnika, nowotwór okrężnicy, nowotwór wątroby, nowotwór głowy i szyi i nowotwór pęcherzyka żółciowego.

9 [0015] W jednym z aspektów przedmiotem niniejszego wynalazku jest przeciwciało monoklonalne o zdolności wiązania z klaudyną 18A2 (CLD18A2), które można otrzymać sposobem obejmującym etap immunizowania zwierzęcia peptydem o sekwencji aminokwasowej SEQ ID nr 16 albo kwasem nukleinowym lub komórką gospodarza wykazującą ekspresję tego peptydu, przy czym przeciwciało wykazuje zdolność pośredniczenia w zabijaniu komórek nowotworowych wykazujących ekspresję CLD18A2 in vivo, a to zabijanie jest indukowane przez wiązanie przeciwciała z CLD 18A2 ulegającym ekspresji przez te komórki i przy czym przeciwciało pośredniczy w zabijaniu komórek wykazujących ekspresję CLD 18A2 przez indukowanie lizy w mechanizmie cytotoksyczności zależnej od dopełniacza (CDC) i(lub) lizy w mechanizmie cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC). [0016] Korzystnie, przeciwciało wiąże się z CLD18A1 i CLD18A2, korzystniej, przeciwciało wiąże się z CLD18A2, lecz nie z CLD18A1. Korzystnie, przeciwciała według wynalazku wiążą się z pętlą 1 CLD-konformacji 1 i są wobec niej swoiste. [0017] Komórkami wykazującymi ekspresję CLD18 A2 są korzystnie komórki nowotworowe, w szczególności komórki dobrane z grupy obejmującej kancerogenne komórki nowotworów żołądka, przełyku, trzustki, płuca, jajnika, okrężnicy, wątroby, głowy i szyi oraz pęcherzyka żółciowego. [0018] Korzystnie, liza komórek w mechanizmie ADCC zachodzi w obecności komórek efektorowych, które w

10 poszczególnych przykładach wykonania są dobrane z grupy obejmującej monocyty, komórki jednojądrzaste, komórki NK i PMN. [0019] Przeciwciało według wynalazku może być przeciwciałem chimerowym, ludzkim lub humanizowanym albo fragmentem przeciwciała i może być dobrane z grupy obejmującej przeciwciała IgG 1, IgG2, korzystnie IgG2a i IgG2b, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, wydzielnicze przeciwciało IgA, przeciwciała IgD i IgE. [0020] Według wszystkich aspektów wynalazku, CLD18 jest to korzystnie ludzki CLD18, korzystnie ludzki CLD18A2, sekwencja aminokwasowa CLD18A2 korzystnie jest sekwencją według SEQ ID nr 2, a sekwencja aminokwasowa CLD18A1 korzystnie jest sekwencją według SEQ ID nr 8. [0021] W szczególnie korzystnych przykładach wykonania, przeciwciało według wynalazku wiąże się z natywnymi epitopami CLD18A2 obecnymi na powierzchni żywych komórek. W dalszych korzystnych przykładach wykonania, przeciwciało według wynalazku jest swoiste wobec komórek nowotworowych, korzystnie wobec komórek nowotworów żołądka. [0022] W niektórych przykładach wykonania wynalazku CLD18A2 ulega ekspresji na powierzchni komórek. [0023] Przeciwciała według wynalazku można otrzymywać sposobem obejmującym etap immunizowania zwierzęcia białkiem lub peptydem o sekwencji aminokwasowej dobranej z grupy obejmującej SEQ ID nr 2, 4, 6, 16, 20, 21-23, 28 i 31, jego immunogennym fragmentem, kwasem nukleinowym lub komórką gospodarza wykazującą ekspresję tego białka lub peptydu lub ich immunogennym fragmentem. Korzystnie, przeciwciało według wynalazku

11 jest swoiste wobec wyżej wymienionych białek, peptydów lub ich immunogennych fragmentów. [0024] W kolejnym aspekcie przedmiotem niniejszego wynalazku jest przeciwciało wytwarzane przez klon o numerze akcesyjnym DSM ACC2737 (182-D ), DSM ACC2738 (182-D ), DSM ACC2739 (182-D ), DSM ACC2740 (182-D ), DSM ACC2741 ( ), DSM ACC2742 (182-D ), DSM ACC2743 (182- D ), DSM ACC2745 (182-D ), DSM ACC2746 (182-D ), DSM ACC2747 (182-D ), DSM ACC2748 (182-D ), DSM ACC2808 (182-D ), DSM ACC2809 (182-D ) lub DSM ACC2810 (182-D ) lub przez jego chimeryzowaną lub humanizowaną postać. [0025] W jednym z przykładów wykonania przeciwciało według wynalazku jest sprzężone ze środkiem terapeutycznym, takim jak toksyna, radioizotop, lek lub środek cytotoksyczny. [0026] W kolejnym aspekcie przedmiotem niniejszego wynalazku jest hybrydoma zdolna do wytwarzania przeciwciała według wynalazku. Korzystne są hybrydomy o numerze akcesyjnym DSM ACC2737 (182-D ), DSM ACC2738 (182-D ), DSM ACC2739 (182-D ), DSM ACC2740 (182-D ), DSM ACC2741 (182-D ), DSM ACC2742 (182-D ), DSM ACC2743 (182- D ), DSM ACC2745 (182-D ), DSM ACC2746 (182-D ), DSM ACC2747 (182-D ), DSM ACC2748 (182-D ), DSM ACC2808 (182-D ), DSM ACC2809 (182-D ) lub DSM ACC2810 (182-D ). [0027] Przeciwciała według wynalazku oznaczono tu przez odniesienie się do oznaczenia przeciwciała, na przykład

12 D , i(lub) przez odniesienie się do klonu wytwarzającego przeciwciało, na przykład 26D12. [0028] Przedmiotem niniejszego wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna, zawierająca przeciwciało według wynalazku i(lub) jego koniugat ze środkiem terapeutycznym oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. [0029] W kolejnym aspekcie przedmiotem niniejszego wynalazku jest przeciwciało, koniugat lub kompozycja farmaceutyczna według niniejszego wynalazku do zastosowania w leczeniu lub profilaktyce choroby nowotworowej, obejmującej komórki nowotworowe wykazujące ekspresję CLD18A2, przy czym to przeciwciało, koniugat lub kompozycję farmaceutyczną podaje się osobnikowi. [0030] Korzystnie nowotwór jest dobrany z grupy obejmującej nowotwór żołądka, nowotwór przełyku, nowotwór trzustki, nowotwór płuca, nowotwór jajnika, nowotwór okrężnicy, nowotwór wątroby, nowotwór głowy i szyi i nowotwór pęcherzyka żółciowego. CLD18A2 ulega korzystnie ekspresji na powierzchni tych komórek. [0031] Korzystnie, przeciwciała według wynalazku wykazują zdolność do rozróżniania wariantów CLD18, ulegających ekspresji przez różne typy komórek, w tym komórki nowotworowe i komórki niezłośliwe. W szczególnie korzystnym przykładzie wykonania przeciwciała według wynalazku wykazują zdolność do wiązania się z CLD18A2, natomiast nie wiążą się z CLD18A1, lub wiążą się z CLD18A1 ze swoistością mniejszą w porównaniu ze swoistością wiązania z CLD18A2.

13 [0032] Termin wiązanie według wynalazku korzystnie odnosi się do wiązania swoistego. Wiązanie swoiste oznacza, że środek, taki jak przeciwciało, wiąże się silniej z celem, takim jak epitop, wobec którego jest swoisty, w porównaniu z wiązaniem z innym celem. Środek wiąże się silniej z pierwszym celem w porównaniu z drugim celem, jeżeli wiąże się on z pierwszym celem ze stałą dysocjacji (KD) mniejszą niż stała dysocjacji wobec drugiego celu. Korzystnie, stała dysocjacji (KD) wobec celu, z którym środek wiąże się swoiście, jest ponad 10-krotnie, korzystnie ponad 20-krotnie, korzystniej ponad 50-krotnie, jeszcze korzystniej ponad 100-krotnie, 200-krotnie, 500-krotnie lub 1000-krotnie mniejsza niż stała dysocjacji (KD) wobec celu, z którym środek nie wiąże się swoiście. [0033] Przeciwciała według wynalazku pośredniczą w zabijaniu komórek wykazujących ekspresję CLD18A2 przez wiązanie się z CLD18A2, korzystnie ulegających ekspresji na powierzchni tych komórek. W jednym z przykładów wykonania, przeciwciała według wynalazku indukują cytotoksyczność zależną od dopełniacza (CDC), na przykład lizę w mechanizmie CDC co najmniej około 20-40%, korzystnie lizę w mechanizmie CDC około 40-50%, i korzystniej lizę w mechanizmie CDC ponad 50% komórek wykazujących ekspresję CLD18A2. Przykładami takich przeciwciał są tu następujące przeciwciała: 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 61C2, 26B5, 26D12, 28D10, 163E12, 175D10, 45C1, 125E1, ch-163e12 i ch-175d10. Zamiast lub oprócz indukowania CDC, przeciwciała według wynalazku mogą indukować cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał (ADCC) komórek wykazujących ekspresję

14 CLD18A2 w obecności komórek efektorowych (na przykład monocytów, komórek jednojądrzastych, komórek NK i PMN). Przykładami takich przeciwciał są tu następujące przeciwciała: 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 43A11, 61C2, 26B5, 26D12, 28D10, 42E12, 163E12, 175D10, 45C1 i 125E1. Przeciwciała według wynalazku mogą wykazywać zdolność do indukowania apoptozy komórek wykazujących ekspresję CLD18A2, indukowania homotypowej adhezji komórek wykazujących ekspresję CLD18A2 i(lub) indukowania fagocytozy komórek wykazujących ekspresję CLD18A2 w obecności makrofagów. Korzystnie, przeciwciała według wynalazku indukują lizę zależną od CDC i lizę zależną od ADCC komórek wykazujących ekspresję CLD18A2, korzystniej indukują lizę zależną od ADCC komórek wykazujących ekspresję CLD18A2, nie indukują zaś zależnej od CDC lizy tych komórek. Do przykładowych komórek docelowych przeciwciał według niniejszego wynalazku należą między innymi komórki nowotworowe wykazujące ekspresję CLD18A2, takie jak karcynogenne komórki nowotworów żołądka, trzustki, przełyku i płuca. W szczególnie korzystnym przykładzie wykonania, zabijanie komórek za pośrednictwem przeciwciał według wynalazku jest swoiste wobec CLD18A2, to znaczy przeciwciała według wynalazku pośredniczą w zabijaniu komórek, korzystnie w zależnej od CDC i(lub) ADCC lizie komórek wykazujących ekspresję CLD18A2, lecz nie pośredniczą w zabijaniu komórek wykazujących ekspresję CLD18A1, a niewykazujących ekspresji CLD18A2. Wyżej opisane przeciwciała można stosować do pośredniczenia w zabijaniu komórek nowotworowych w leczeniu lub profilaktyce nowotworów,

15 takich jak nowotwór żołądka, nowotwór przełyku, nowotwór trzustki, nowotwór płuca, nowotwór jajnika, nowotwór okrężnicy, nowotwór wątroby, nowotwór głowy i szyi i nowotwór pęcherzyka żółciowego. [0034] Przeciwciała według wynalazku można podzielić na odrębne klasy według ich właściwości wiązania i ich zdolności do pośredniczenia w funkcjach efektorowych na komórkach wykazujących ekspresję CLD18. Przeciwciała według wynalazku można dzielić na kategorie według następujących cech: właściwości wiązania z komórkami wykazującymi ekspresję CLD18A1 lub CLD18A2 i(lub) funkcje efektorowe zależne od tych komórek (rozróżnianie wariantów splicingowych CLD18) właściwości wiązania z komórkami wykazującymi ekspresję glikozylowanych lub nieglikozylowanych wariantów CLD18 i(lub) funkcje efektorowe zależne od tych komórek (rozróżnianie wariantów CLD18 z N- glikozylacją i bez N-glikozylacji) właściwości wiązania z komórkami nowotworowymi lub komórkami prawidłowymi i(lub) funkcje efektorowe zależne od tych typów komórek (rozróżnianie wariantów CLD18 ulegających ekspresji na komórkach nowotworowych od wariantów ulegających ekspresji na prawidłowych, niezłośliwych komórkach) właściwości wiązania z epitopami CLD18 maskowanymi przez tworzenie się obwódek zamykających zdolność do indukowania tworzenia się agregatów CLD18 na żywych komórkach

16 zdolność do wiązania się z wariantami CLD18 innymi niż ludzkie, szczególnie wariantami CLD18 pochodzącymi od myszy, szczurów, królików i naczelnych. [0035] Przeciwciała według wynalazku mogą wykazywać jedną lub więcej niż jedną z następujących właściwości przy czym podano odniesienie do konkretnych przykładów opisywanych tu przeciwciał według wynalazku (24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 175D10, ch- 43A11, ch-45c1, ch-125e1, ch-163e12, ch-166e2, ch- 175D10): a) wiązanie z CLD18A2, jak również z CLD18A1 (na przykład 26D12, 28D10, 37H8, 38H3, 39F11, 61C2 i 41C6) b) wiązanie z CLD18A2, lecz nie z CLD18A1 (na przykład 26B5, 37G11, 38G5, 42E12 i 43A11, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 175D10, ch-43a11, ch-45c1, ch-125e1, ch-163e12, ch-166e2, ch-175d10) c) wiązanie z CLD18 ulegającymi naturalnej ekspresji w komórkach nowotworowych, lecz nie z CLD18 ulegającymi naturalnej ekspresji w komórkach nienowotworowych lub tkankach takich, jak komórki żołądka i płuca (na przykład 26B5, 75B8, 24H5, 39F11, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 175D10) d) pośredniczenie w indukowanym przez CDC zabijaniu komórek wykazujących ekspresję CLD18A2, lecz nie komórek, które wykazują ekspresję CLD18A1 (na przykład 26D12, 28D10, 37H8, 39F11, 163E12, ch-125e1, ch-163e12, ch-175d10) e) pośredniczenie w indukowanym przez ADCC zabijaniu komórek wykazujących ekspresję CLD18 (na przykład 26B5,

17 G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 43A11, 47D12 i 61C2, ch-163e12, ch-175d10) f) pośredniczenie w indukowanym przez ADCC, lecz nie w indukowanym przez CDC zabijaniu komórek wykazujących ekspresję CLD 18 (na przykład 37G11, 42E12 i 43A11) g) pośredniczenie w indukowanym przez ADCC i przez CDC zabijaniu komórek wykazujących ekspresję CLD18A2 (na przykład 37H8, 38H3, 39F11, ch-163e12, ch-175d10). [0036] Jak zilustrowano w niniejszym opisie, przeciwciała według wynalazku obejmują także cząsteczki, które posiadają następujące właściwości: a) wiążą się ze zróżnicowanymi prawidłowymi komórkami żołądka, lecz nie z komórkami macierzystymi żołądka (na przykład 39F11) b) nie wiążą się z prawidłową tkanką żołądka ani z innymi narządami prawidłowymi, lecz wyłącznie z komórkami nowotworowymi (na przykład 26B5) c) wiążą się z epitopem zawierającym nieglikozylowaną Asn w pozycji 116 CLD 18 d) wiążą się z ludzkim, jak również z mysim CLD18, umożliwiając przeprowadzenie dokładnych przedklinicznych badań toksyczności u myszy. [0037] Przeciwciała według wynalazku mogą pochodzić od różnych gatunków, w tym między innymi od myszy, szczura, królika, świnki morskiej i człowieka. Przeciwciała według wynalazku obejmują także cząsteczki chimerowe, w których region stały przeciwciała, pochodzący od jednego gatunku, korzystnie od człowieka, jest połączony z miejscem wiązania antygenu pochodzącym od innego gatunku. Ponadto do przeciwciał według wynalazku należą cząsteczki humanizowane, w których

18 miejsca wiązania antygenu przeciwciała, pochodzące od gatunku innego niż człowiek, są połączone z regionem stałym i regionem zrębowym pochodzącymi od człowieka. [0038] Do przeciwciał według wynalazku należą przeciwciała poliklonalne i monoklonalne; należą do nich przeciwciała IgG2a (na przykład IgG2a, κ, λ), IgG2b (na przykład IgG2b, κ, λ), IgG3 (na przykład IgG3, κ, λ) i IgM. Wynalazek obejmuje jednak także inne izotypy przeciwciał, w tym przeciwciała IgG 1, IgA2, wydzielnicze IgA, IgD i IgE. Przeciwciała mogą być przeciwciałami kompletnymi lub ich fragmentami wiążącymi antygen, takimi jak na przykład Fab, F(ab') 2, Fv, jednołańcuchowe fragmenty Fv lub przeciwciała dwuswoiste. Ponadto do fragmentów wiążących antygen należą immunoglobulinowe białka fuzyjne z domeną wiązania, zawierające (i) polipeptyd stanowiący domenę wiązania (taki jak region zmienny łańcucha ciężkiego lub region zmienny łańcucha lekkiego), poddany fuzji z polipeptydem regionu zawiasowego immunoglobuliny, (ii) region stały CH2 łańcucha ciężkiego immunoglobuliny poddany fuzji z regionem zawiasowym (iii) region stały CH3 łańcucha ciężkiego immunoglobuliny poddany fuzji z regionem stałym CH2. Takie immunoglobulinowe białka fuzyjne z domeną wiązania ujawniono dokładniej w US2003/ i US 2003/ [0039] Przeciwciała według niniejszego wynalazku korzystnie dysocjują od CLD18 ze stałą równowagi dysocjacji (KD) wynoszącą około nm lub mniej. Korzystnie, przeciwciała według wynalazku nie wykazują reakcji krzyżowych z pokrewnymi antygenami powierzchni komórkowej, nie hamują zatem ich funkcji.

19 [0040] W korzystnych przykładach wykonania przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą charakteryzować się jedną lub więcej niż jedną z następujących właściwości: a) swoistość wobec CLD 18, w szczególności swoistość wobec CLD18A2; b) powinowactwo wiązania z CLD18, w szczególności CLD18A2, wynoszące około 100 nm lub mniej, korzystnie, około 5-10 nm lub mniej, korzystniej, około 1-3 nm lub mniej; c) zdolność do pośredniczenia w uzyskiwaniu wysokiego poziomu CDC na komórkach CD55/59-ujemnych lub CD55/59- dodatnich; d) zdolność do hamowania wzrostu komórek, które wykazują ekspresję CLD 18; e) zdolność do indukowania apoptozy komórek, które wykazują ekspresję CLD18; f) zdolność do indukowania homotypowej adhezji komórek, które wykazują ekspresję CLD18; g) zdolność do indukowania ADCC komórek, które wykazują ekspresję CLD18 w obecności komórek efektorowych; h) zdolność do wydłużania przeżycia osobnika z komórkami nowotworowymi, które wykazują ekspresję CLD18; i) zdolność do zmniejszania liczby komórek, które wykazują ekspresję CLD18; j) zdolność do zmniejszania liczby komórek, które wykazują ekspresję CLD18 na niskim poziomie i(lub) k) zdolność do agregowania CLD18 na powierzchni żywych komórek. [0041] Z przeciwciał anty-cld 18 według niniejszego wynalazku można wytwarzać pochodne, można je łączyć z

20 innymi swoistościami wiązania lub uzyskiwać ich wspólną ekspresję z innymi swoistościami wiązania. W szczególnym przykładzie wykonania, przedmiotem niniejszego wynalazku jest cząsteczka dwuswoista lub wieloswoista, zawierająca co najmniej jedną pierwszą swoistość wiązania z CLD18 (na przykład przeciwciało anty-cld18 lub jego mimetyk) i drugą swoistość wiązania z komórką efektorową, taką jak swoistość wiązania z receptorem Fc (na przykład receptorem Fc-gamma, takim jak Fc-gamma RI, lub dowolnym innym receptorem Fc) lub receptorem komórek T, na przykład CD3. [0042] Zgodnie z tym, przedmiotem niniejszego wynalazku są cząsteczki dwuswoiste i wieloswoiste, które wiążą się zarówno z CLD18, jak i z receptorem Fc lub receptorem komórek T, na przykład CD3. Przykładami receptorów Fc są: receptor IgG, receptor Fc-gamma (FcγR), taki jak FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) i FcγRIII (CD16). Celem mogą być również inne receptory Fc, takie jak receptory IgA (na przykład Fc RI). Receptor Fc korzystnie znajduje się na powierzchni komórki efektorowej, takiej jak na przykład monocyt, makrofag lub aktywowana komórka jednojądrzasta. W korzystnym przykładzie wykonania cząsteczki dwuswoiste i wieloswoiste wiążą się z receptorem Fc w miejscu, które jest odrębne od miejsce wiązania immunoglobuliny Fc (na przykład IgG lub IgA) receptora. Wiązanie cząsteczek dwuswoistych i wieloswoistych nie ulega zatem zablokowaniu przez fizjologiczny poziom immunoglobulin. [0043] W jeszcze innym aspekcie z przeciwciał anty- CLD18 według wynalazku wytwarza się pochodne, poddaje się je sprzęganiu lub koekspresji z inną cząsteczką

21 funkcjonalną, na przykład innym peptydem lub białkiem (na przykład fragmentem Fab'). Przeciwciało według wynalazku może być na przykład funkcjonalnie sprzężone (na przykład przez sprzęganie chemiczne, fuzję genetyczną, wiązanie niekowalencyjne lub w inny sposób) z jedną lub więcej niż jedną inną jednostką molekularną, taką jak inne przeciwciało (na przykład po to, aby utworzyć przeciwciało dwuswoiste lub wieloswoiste), cytotoksynę, ligand komórkowy lub antygen (na przykład po to, aby utworzyć immunokoniugat, taki jak immunotoksyna). Przeciwciało według niniejszego wynalazku można sprzęgać z innymi cząstkami terapeutycznymi, na przykład z radioizotopem, drobnocząsteczkowym lekiem przeciwnowotworowym, rekombinowaną cytokiną lub chemokiną. Zgodnie w tym, niniejszy wynalazek obejmuje szerokie spektrum koniugatów przeciwciał, cząsteczek dwuswoistych i wieloswoistych i białek fuzyjnych, z których wszystkie wiążą się z komórkami wykazującymi ekspresję CLD18 i które można stosować do ukierunkowywania innych cząsteczek na takie komórki. [0044] W jeszcze innym aspekcie, przedmiotem niniejszego wynalazku są kompozycje, na przykład kompozycje/zestawy farmaceutyczne i diagnostyczne, zawierające farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, połączony w jeden preparat z jednym przeciwciałem według niniejszego wynalazku lub z kombinacją przeciwciał według wynalazku. W szczególnym przykładzie wykonania kompozycja zawiera kombinację przeciwciał, które wiążą się z odrębnymi epitopami lub które wykazują odrębne cechy czynnościowe, takie jak

22 indukowanie CDC i(lub) ADCC i indukowanie apoptozy. W tym przykładzie wykonania wynalazku przeciwciała można stosować w skojarzeniu, na przykład jako kompozycję farmaceutyczną, zawierającą dwa lub więcej niż dwa przeciwciała monoklonalne anty-cld18. Przeciwciała anty-cld18 o różnej, lecz uzupełniającej się aktywności można na przykład łączyć w jednej terapii, żeby uzyskać pożądany efekt terapeutyczny. W korzystnym przykładzie wykonania kompozycja zawiera przeciwciało anty-cld18, które pośredniczy w CDC, skojarzone z innym przeciwciałem anty-cld18, które indukuje apoptozę. W innym przykładzie wykonania kompozycja zawiera przeciwciało anty-cld18, które pośredniczy w wysoce skutecznym zabijaniu komórek docelowych w obecności komórek efektorowych, skojarzone z innym przeciwciałem anty-cld 18, które hamuje wzrost komórek wykazujących ekspresję CLD 18. [0045] Niniejszy wynalazek obejmuje również jednoczesne lub kolejne podawanie dwóch lub więcej przeciwciał anty-cld18 według wynalazku, przy czym co najmniej jedno z tych przeciwciał jest chimerowym przeciwciałem anty-cld18, a co najmniej jedno kolejne przeciwciało jest ludzkim przeciwciałem anty-cld18, przy czym przeciwciała wiążą się z tymi samymi lub różnymi epitopami CLD18. Korzystnie, najpierw podaje się chimerowe przeciwciało CLD18 według wynalazku, po czym następuje podanie ludzkiego przeciwciała anty-cld18 według wynalazku, przy czym ludzkie przeciwciało anty- CLD18 korzystnie podaje się przez dłuższy czas, to znaczy jako terapię podtrzymującą.

23 [0046] Przeciwciała, immunokoniugaty, dwuswoiste i wieloswoiste cząsteczki i kompozycje według niniejszego wynalazku można stosować w rozmaitych sposobach hamowania wzrostu komórek wykazujących ekspresję CLD18A2 i(lub) wybiórczego zabijania komórek wykazujących ekspresję CLD18A2 przez stykanie komórek ze skuteczną ilością przeciwciała, immunokoniugatu, dwuswoistych/wieloswoistych cząsteczek lub kompozycji, tak że wzrost komórki ulega zahamowaniu i(lub) komórka jest zabijana. Do wykazujących ekspresję CLD18A2 komórek, których wzrost można hamować lub które można zabijać z użyciem przeciwciał według wynalazku, należą komórki nowotworów, takie jak karcynogenne komórki żołądka, trzustki, przełyku, płuca, jajnika, okrężnicy, wątroby, głowy i szyi oraz pęcherzyka żółciowego. [0047] Zgodnie z tym, przeciwciała według niniejszego wynalazku można stosować do leczenia i(lub) profilaktyki szeregu chorób dotyczących komórek wykazujących ekspresję CLD18A2 przez podawanie przeciwciał pacjentom cierpiącym na takie choroby. Do przykładowych chorób, które można leczyć (na przykład uzyskiwać w nich poprawę) lub którym można zapobiegać, należą między innymi choroby nowotworowe. Przykłady chorób nowotworowych, które można leczyć i(lub) którym można zapobiegać, obejmują nowotwór żołądka, nowotwór trzustki, nowotwór przełyku, nowotwór płuca, nowotwór jajnika, nowotwór jelita grubego, nowotwór wątroby, nowotwór głowy i szyi i nowotwór pęcherzyka żółciowego. [0048] W szczególnym przykładzie wykonania wynalazku pacjenta, któremu podaje się przeciwciało, dodatkowo leczy się środkiem chemioterapeutycznym,

24 napromienianiem lub środkiem, który moduluje, na przykład wzmaga lub hamuje, ekspresję lub aktywność receptora Fc, na przykład receptora Fc-gamma, takim jak cytokina. Do typowych cytokin do podawania w ramach leczenia należą czynnik stymulujący kolonie granulocytów (G-CSF), czynnik stymulujący kolonie granulocytów i makrofagów (GM-CSF), interferon γ (IFNγ) i czynnik martwicy nowotworu (TNF). Do typowych środków terapeutycznych należą między innymi środki przeciwnowotworowe, takie jak doksorubicyna, cysplatyna, Taxotere, 5-fluorouracyl, metotreksat, gemzytabina i cyklofosfamid. [0049] Zwierzęta inne niż człowiek, takie jak myszy, można immunizować ludzkim CLD18A2 lub jego fragmentem peptydowym, żeby uzyskać przeciwciała. Peptydami korzystnymi do immunizacji są peptydy dobrane z grupy obejmującej SEQ ID nr 2, 4, 6, 16, 20-23, 28 i 31. Zgodnie z tym, w korzystnych przykładach wykonania przeciwciałami według wynalazku są przeciwciała uzyskane przez immunizację peptydami dobranymi z grupy obejmującej SEQ ID nr 2, 4, 6, 16, 20-23, 28 i 31. Analogicznie, przeciwciała przeciwko CLD18A2 można wytwarzać w organizmach zwierząt transgenicznych innych niż człowiek, takich jak transgeniczna mysz. Zwierzęciem transgenicznym innym niż człowiek może być transgeniczna mysz, której genom zawiera transgen łańcucha ciężkiego i transgen łańcucha lekkiego kodujące całe przeciwciało lub część przeciwciała. [0050] Zwierzę typu dzikiego, jak również zwierzę transgeniczne inne niż człowiek można immunizować oczyszczonym lub wzbogaconym preparatem antygenu i(lub)

25 kwasów nukleinowych CLD 18A2 i(lub) komórkami wykazującymi ekspresję CLD18A2 lub jego fragmentu peptydowego. Korzystnie, zwierzę inne niż człowiek jest zdolne do wytwarzania wielu izotypów ludzkich przeciwciał monoklonalnych przeciwko CLD18A2 (na przykład IgG, IgA i(lub) IgM) na drodze rekombinacji V- D-J i przełączania izotypu. Przełączanie izotypu może zachodzić poprzez na przykład klasyczne lub nieklasyczne przełączanie izotypu. [0051] Izolowane komórki B, uzyskane od zwierzęcia innego niż człowiek, jak opisano powyżej, można następnie unieśmiertelniać poprzez fuzję z unieśmiertelnioną komórką, aby uzyskać źródło (na przykład hybrydomę) przeciwciał według wynalazku. Takie hybrydomy (to znaczy hybrydomy wytwarzające przeciwciała według wynalazku) są również objęte zakresem wynalazku. [0052] Jak tu opisano, przeciwciała według wynalazku można uzyskiwać bezpośrednio z hybrydom wykazujących ekspresję przeciwciała lub można je klonować i uzyskiwać na drodze ekspresji rekombinacyjnej w komórce gospodarza (na przykład komórce CHO lub limfocycie). Kolejnymi przykładami komórek gospodarzy są drobnoustroje, takie jak E. coli, i grzyby, takie jak drożdże. Zamiast tego można je wytwarzać rekombinacyjnie u zwierzęcia transgenicznego innego niż człowiek lub w roślinie. [0053] Komórkami hybrydoma korzystnymi do wytwarzania przeciwciała według wynalazku są komórki sekwencjonowane lub złożone w DSMZ (Mascheroder Weg 1b, Braunschweig, Niemcy; nowy adres: Inhoffenstr.

26 B, Braunschweig, Niemcy), o następujących oznaczeniach i numerach akcesyjnych: a. 182-D , nr akcesyjny DSM ACC2737, złożona 19 października 2005 b. 182-D , nr akcesyjny DSM ACC2738, złożona 19 października 2005 c. 182-D , nr akcesyjny DSM ACC2739, złożona 19 października 2005 d. 182-D , nr akcesyjny DSM ACC2740, złożona 19 października 2005 e. 182-D , nr akcesyjny DSM ACC2741, złożona 19 października 2005 f. 182-D , nr akcesyjny DSM ACC2742, złożona 19 października 2005, g. 182-D , nr akcesyjny DSM ACC2743, złożona 19 października 2005 h. 182-D , nr akcesyjny DSM ACC2745, złożona 17 listopada 2005 i. 182-D , nr akcesyjny DSM ACC2746, złożona 17 listopada 2005 j. 182-D , nr akcesyjny DSM ACC2747, złożona 17 listopada 2005 k. 182-D , nr akcesyjny DSM ACC2748, złożona 17 listopada 2005 l. 182-D , nr akcesyjny DSM ACC2808, złożona 26 października 2006 m. 182-D , nr akcesyjny DSM ACC2809, złożona 26 października 2006 n. 182-D , nr akcesyjny DSM ACC2810, złożona 26 października 2006.

27 [0054] Korzystnymi przeciwciałami według wynalazku są przeciwciała wytworzone i dające się uzyskać z wyżej opisanych hybrydom, to znaczy 37G11 w przypadku 182- D , 37H8 w przypadku 182-D , 38G5 w przypadku 182-D , 38H3 w przypadku 182-D , 39F11 w przypadku 182-D , 43A11 w przypadku 182-D , 6 1 C2 w przypadku 182-D , 26B5 w przypadku 182-D , 26D12 w przypadku 182-D , 28D10 w przypadku 182-D , 42E12 w przypadku 182- D , 125E1 w przypadku 182-D , 163E12 w przypadku 182-D i 175D10 w przypadku 182-D oraz ich postacie chimeryzowane i humanizowane. [0055] W korzystnych przykładach wykonania do przeciwciał, w szczególności chimeryzowanych postaci przeciwciał według wynalazku, należą przeciwciała zawierające region stały łańcucha ciężkiego (CH) zawierający sekwencję aminokwasową pochodzącą z ludzkiego regionu stałego łańcucha ciężkiego, taką jak sekwencja aminokwasowa przedstawiona jako SEQ ID nr 46 lub 150 albo jej fragment. W dalszych korzystnych przykładach wykonania do przeciwciał, w szczególności chimeryzowanych postaci przeciwciał według wynalazku, należą przeciwciała zawierające region stały łańcucha lekkiego (CL), zawierający sekwencję aminokwasową pochodzącą z ludzkiego regionu stałego łańcucha lekkiego, taką jak sekwencja aminokwasowa przedstawiona jako SEQ ID nr 41 lub 148 albo jej fragment. W szczególnie korzystnym przykładzie wykonania do przeciwciał, w szczególności chimeryzowanych postaci przeciwciał według wynalazku, należą przeciwciała, w skład których wchodzi CH zawierający sekwencję

28 aminokwasową pochodzącą z ludzkiego CH, taką jak sekwencja aminokwasowa przedstawiona jako SEQ ID nr 46 lub 150 albo jej fragment oraz CL zawierający sekwencję aminokwasową pochodzącą z ludzkiego CL, taką jak sekwencja aminokwasowa przedstawiona jako SEQ ID nr 41 lub 148 albo jej fragment. [0056] CH zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 46 może być kodowany przez kwas nukleinowy zawierający sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną jako SEQ ID nr 45. CH zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 150 może być kodowany przez kwas nukleinowy zawierający sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną jako SEQ ID nr 149. CL zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 41 może być kodowany przez kwas nukleinowy zawierający sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną jako SEQ ID nr 40. CL zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 148 może być kodowany przez kwas nukleinowy zawierający sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną jako SEQ ID nr 147. [0057] W pewnych korzystnych przykładach wykonania do chimeryzowanych postaci przeciwciał należą przeciwciała zawierające łańcuch ciężki zawierający sekwencję aminokwasową dobraną z grupy obejmującej SEQ ID nr 115, 116, 117, 118, 119, 120 i ich fragmenty i(lub) zawierający łańcuch lekki zawierający sekwencję aminokwasową dobraną z grupy obejmującej SEQ ID nr 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 i ich fragmenty. [0058] W pewnych korzystnych przykładach wykonania do chimeryzowanych postaci przeciwciał należą przeciwciała

29 zawierające kombinację łańcuchów ciężkich i łańcuchów lekkich wybranych spośród następujących możliwości od (i) do (ix): (i) łańcuch ciężki zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 115 lub jej fragment, a łańcuch lekki zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 122 lub jej fragment; (ii) łańcuch ciężki zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 116 lub jej fragment, a łańcuch lekki zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 121 lub jej fragment; (iii) łańcuch ciężki zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 117 lub jej fragment, a łańcuch lekki zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 123 lub jej fragment; (iv) łańcuch ciężki zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 119 lub jej fragment, a łańcuch lekki zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 126 lub jej fragment; (v) łańcuch ciężki zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 118 lub jej fragment, a łańcuch lekki zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 125 lub jej fragment; (vi) łańcuch ciężki zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 120 lub jej fragment, a łańcuch lekki zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 124 lub jej fragment; (vii) łańcuch ciężki zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 120 lub jej fragment, a łańcuch lekki zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 127 lub jej fragment;

30 (viii) łańcuch ciężki zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 120 lub jej fragment, a łańcuch lekki zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 128 lub jej fragment; (ix) łańcuch ciężki zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 120 lub jej fragment, a łańcuch lekki zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 129 lub jej fragment. [0059] Zastosowane powyżej terminy fragment lub fragment sekwencji aminokwasowej odnoszą się do części sekwencji przeciwciała, to znaczy do sekwencji odpowiadającej sekwencji przeciwciała skróconej na końcu N- i(lub) C, przy czym, gdy zastępuje ona tę sekwencję przeciwciała, przeciwciało zachowuje wiązanie z CLD18A2 i korzystnie swoje opisywane tu funkcje, takie jak na przykład liza zależna od CDC lub liza zależna od ADCC. Korzystnie, fragment sekwencji aminokwasowej zawiera co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 90%, 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% reszt aminokwasów tej sekwencji aminokwasowej. Określenie fragment sekwencji aminokwasowej dobranej z grupy obejmującej SEQ ID nr 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128 i 129 korzystnie odnosi się do tej sekwencji, z której usunięto 17, 18, 19, 20, 21, 22 lub 23 aminokwasy na końcu N. Fragmenty opisywanych tu sekwencji aminokwasowych mogą być kodowane przez odpowiednie fragmenty sekwencji kwasów nukleinowych kodujących te sekwencje aminokwasowe. [0060] Łańcuch ciężki zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 115 może być kodowany przez kwas nukleinowy zawierający sekwencję

31 kwasu nukleinowego przedstawioną jako SEQ ID nr 100. Łańcuch ciężki zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 116 może być kodowany przez kwas nukleinowy zawierający sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną jako SEQ ID nr 101. Łańcuch ciężki zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 117 może być kodowany przez kwas nukleinowy zawierający sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną jako SEQ ID nr 102. Łańcuch ciężki zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 119 może być kodowany przez kwas nukleinowy zawierający sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną jako SEQ ID nr 104. Łańcuch ciężki zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 118 może być kodowany przez kwas nukleinowy zawierający sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną jako SEQ ID nr 103. Łańcuch ciężki zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 120 może być kodowany przez kwas nukleinowy zawierający sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną jako SEQ ID nr 105. [0061] Łańcuch lekki zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 122 może być kodowany przez kwas nukleinowy zawierający sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną jako SEQ ID nr 107. Łańcuch lekki zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 121 może być kodowany przez kwas nukleinowy zawierający sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną jako SEQ ID nr 106. Łańcuch lekki zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 123 może być kodowany przez kwas nukleinowy zawierający sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną

32 jako SEQ ID nr 108. Łańcuch lekki zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 126 może być kodowany przez kwas nukleinowy zawierający sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną jako SEQ ID nr 111. Łańcuch lekki zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 125 może być kodowany przez kwas nukleinowy zawierający sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną jako SEQ ID nr 110. Łańcuch lekki zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 124 może być kodowany przez kwas nukleinowy zawierający sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną jako SEQ ID nr 109. Łańcuch lekki zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 127 może być kodowany przez kwas nukleinowy zawierający sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną jako SEQ ID nr 112. Łańcuch lekki zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 128 może być kodowany przez kwas nukleinowy zawierający sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną jako SEQ ID nr 113. Łańcuch lekki zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 129 może być kodowany przez kwas nukleinowy zawierający sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną jako SEQ ID nr 114. [0062] W korzystnym przykładzie wykonania przeciwciało według wynalazku zawiera region zmienny (VH) łańcucha ciężkiego, zawierający sekwencję aminokwasową dobraną z grupy obejmującej SEQ ID nr 132, 133, 134, 135, 136, 137 i ich fragmenty. [0063] W korzystnym przykładzie wykonania, przeciwciało według wynalazku zawiera region zmienny (VL) łańcucha lekkiego, zawierający sekwencję aminokwasową dobraną z

33 grupy obejmującej SEQ ID nr 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146 i ich fragmenty. [0064] W pewnych korzystnych przykładach wykonania przeciwciało według wynalazku zawiera kombinację regionu zmiennego (VH) łańcucha ciężkiego i regionu zmiennego (VL) łańcucha lekkiego, dobraną z następujących możliwości od (i) do (ix): (i) VH zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 132 lub jej fragment, a VL zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 139 lub jej fragment; (ii) VH zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 133 lub jej fragment, a VL zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 138 lub jej fragment; (iii) VH zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 134 lub jej fragment, a VL zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 140 lub jej fragment; (iv) VH zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 136 lub jej fragment, a VL zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 143 lub jej fragment; (v) VH zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 135 lub jej fragment, a VL zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 142 lub jej fragment; (vi) VH zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 137 lub jej fragment, a VL zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 141 lub jej fragment;

34 (vii) VH zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 137 lub jej fragment, a VL zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 144 lub jej fragment; (viii) VH zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 137 lub jej fragment, a VL zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 145 lub jej fragment; (ix) VH zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 137 lub jej fragment, a VL zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 146 lub jej fragment. [0065] VH zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 132 może być kodowany przez kwas nukleinowy zawierający sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną jako SEQ ID nr 55. VH zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 133 może być kodowany przez kwas nukleinowy zawierający sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną jako SEQ ID nr 56. VH zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 134 może być kodowany przez kwas nukleinowy zawierający sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną jako SEQ ID nr 57. VH zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 136 może być kodowany przez kwas nukleinowy zawierający sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną jako SEQ ID nr 59. VH zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 135 może być kodowany przez kwas nukleinowy zawierający sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną jako SEQ ID nr 58. VH zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną jako

35 SEQ ID nr 137 może być kodowany przez kwas nukleinowy zawierający sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną jako SEQ ID nr 60. [0066] VL zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 139 może być kodowany przez kwas nukleinowy zawierający sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną jako SEQ ID nr 62. VL zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 138 może być kodowany przez kwas nukleinowy zawierający sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną jako SEQ ID nr 61. VL zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 140 może być kodowany przez kwas nukleinowy zawierający sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną jako SEQ ID nr 63. VL zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 143 może być kodowany przez kwas nukleinowy zawierający sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną jako SEQ ID nr 66. VL zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 142 może być kodowany przez kwas nukleinowy zawierający sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną jako SEQ ID nr 65. VL zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 141 może być kodowany przez kwas nukleinowy zawierający sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną jako SEQ ID nr 64. VL zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 144 może być kodowany przez kwas nukleinowy zawierający sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną jako SEQ ID nr 67. VL zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 145 może być kodowany przez kwas nukleinowy zawierający sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną

36 jako SEQ ID nr 68. VL zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID nr 146 może być kodowany przez kwas nukleinowy zawierający sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną jako SEQ ID nr 69. [0067] W korzystnym przykładzie wykonania przeciwciało według wynalazku zawiera VH zawierający zestaw regionów determinujących komplementarność CDR1, CDR2 i CDR3 dobranych z następujących przykładów wykonania od (i) do (vi): (i) CDR1: pozycje SEQ ID nr 115, CDR2: pozycje SEQ ID nr 115, CDR3: pozycje SEQ ID nr 115; (ii) CDR1: pozycje SEQ ID nr 116, CDR2: pozycje SEQ ID nr 116, CDR3: pozycje SEQ ID nr 116; (iii) CDR1: pozycje SEQ ID nr 117, CDR2: pozycje SEQ ID nr 117, CDR3: pozycje SEQ ID nr 117; (iv) CDR1: pozycje SEQ ID nr 118, CDR2: pozycje SEQ ID nr 118, CDR3: pozycje SEQ ID nr 118; (v) CDR1: pozycje SEQ ID nr 119, CDR2: pozycje SEQ ID nr 119, CDR3: pozycje SEQ ID nr 119; (vi) CDR1: pozycje SEQ ID nr 120, CDR2: pozycje SEQ ID nr 120, CDR3: pozycje SEQ ID nr 120. [0068] W korzystnym przykładzie wykonania przeciwciało według wynalazku zawiera VL, w skład którego wchodzi zestaw regionów determinujących komplementarność CDR1,

37 CDR2 i CDR3, dobranych z następujących przykładów wykonania od (i) do (ix): (i) CDR1: pozycje SEQ ID nr 121, CDR2: pozycje SEQ ID nr 121, CDR3: pozycje SEQ ID nr 121; (ii) CDR1: pozycje SEQ ID nr 122, CDR2: pozycje SEQ ID nr 122, CDR3: pozycje SEQ ID nr 122; (iii) CDR1: pozycje SEQ ID nr 123, CDR2: pozycje SEQ ID nr 123, CDR3: pozycje SEQ ID nr 123; (iv) CDR1: pozycje SEQ ID nr 124, CDR2: pozycje SEQ ID nr 124, CDR3: pozycje SEQ ID nr 124; (v) CDR1: pozycje SEQ ID nr 125, CDR2: pozycje SEQ ID nr 125, CDR3: pozycje SEQ ID nr 125; (vi) CDR1: pozycje SEQ ID nr 126, CDR2: pozycje SEQ ID nr 126, CDR3: pozycje SEQ ID nr 126; (vii) CDR1: pozycje SEQ ID nr 127, CDR2: pozycje SEQ ID nr 127, CDR3: pozycje SEQ ID nr 127; (viii) CDR1: pozycje SEQ ID nr 128, CDR2: pozycje SEQ ID nr 128, CDR3: pozycje SEQ ID nr 128; (ix) CDR1: pozycje SEQ ID nr 129, CDR2: pozycje SEQ ID nr 129, CDR3: pozycje SEQ ID nr 129. [0069] W korzystnym przykładzie wykonania przeciwciało według wynalazku zawiera kombinację VH i VL, z których

38 każdy zawiera zestaw regionów determinujących komplementarność CDR1, CDR2 i CDR3 dobranych z następujących przykładów wykonania od (i) do (ix): (i) VH: CDR1: pozycje SEQ ID nr 115, CDR2: pozycje SEQ ID nr 115, CDR3: pozycje SEQ ID nr 115, VL: CDR1: pozycje SEQ ID nr 122, CDR2: pozycje SEQ ID nr 122, CDR3: pozycje SEQ ID nr 122; (ii) VH: CDR1: pozycje SEQ ID nr 116, CDR2: pozycje SEQ ID nr 116, CDR3: pozycje SEQ ID nr 116, VL: CDR1: pozycje SEQ ID nr 121, CDR2: pozycje SEQ ID nr 121, CDR3: pozycje SEQ ID nr 121; (iii) VH: CDR1: pozycje SEQ ID nr 117, CDR2: pozycje SEQ ID nr 117, CDR3: pozycje SEQ ID nr 117, VL: CDR1: pozycje SEQ ID nr 123, CDR2: pozycje SEQ ID nr 123, CDR3: pozycje SEQ ID nr 123; (iv) VH: CDR1: pozycje SEQ ID nr 119, CDR2: pozycje SEQ ID nr 119, CDR3: pozycje SEQ ID nr 119, VL: CDR1: pozycje SEQ ID nr 126, CDR2: pozycje SEQ ID nr 126, CDR3: pozycje SEQ ID nr 126; (v) VH: CDR1: pozycje SEQ ID nr 118, CDR2: pozycje SEQ ID nr 118, CDR3: pozycje SEQ ID nr 118, VL: CDR1: pozycje SEQ ID nr 125, CDR2: pozycje SEQ ID nr 125, CDR3: pozycje SEQ ID nr 125; (vi) VH: CDR1: pozycje SEQ ID nr 120, CDR2: pozycje SEQ ID nr 120, CDR3: pozycje SEQ ID nr 120, VL: CDR1: pozycje SEQ ID nr 124, CDR2:

39 pozycje SEQ ID nr 124, CDR3: pozycje SEQ ID nr 124; (vii) VH: CDR1: pozycje SEQ ID nr 120, CDR2: pozycje SEQ ID nr 120, CDR3: pozycje SEQ ID nr 120, VL: CDR1: pozycje SEQ ID nr 127, CDR2: pozycje SEQ ID nr 127, CDR3: pozycje SEQ ID nr 127; (viii) VH: CDR1: pozycje SEQ ID nr 120, CDR2: pozycje SEQ ID nr 120, CDR3: pozycje SEQ ID nr 120, VL: CDR1: pozycje SEQ ID nr 128, CDR2: pozycje SEQ ID nr 128, CDR3: pozycje SEQ ID nr 128; (ix) VH: CDR1: pozycje SEQ ID nr 120, CDR2: pozycje SEQ ID nr 120, CDR3: pozycje SEQ ID nr 120, VL: CDR1: pozycje SEQ ID nr 129, CDR2: pozycje SEQ ID nr 129, CDR3: pozycje SEQ ID nr 129. [0070] W dalszych korzystnych przykładach wykonania przeciwciało według wynalazku korzystnie zawiera jeden lub więcej niż jeden region determinujący komplementarność (CDR), korzystnie co najmniej region zmienny CDR3, regionu zmiennego łańcucha ciężkiego(vh) i(lub) regionu zmiennego łańcucha lekkiego (VL) przeciwciała monoklonalnego przeciwko CLD18A2, korzystnie przeciwciała monoklonalnego przeciwko CLD18A2 opisanego w niniejszym zgłoszeniu, i korzystnie zawiera jeden lub więcej niż jeden region determinujący komplementarność (CDR), korzystnie co najmniej region zmienny CDR3, regionów zmiennych łańcucha ciężkiego (VH) i(lub) regionów zmiennych łańcucha lekkiego (VL) opisanych w niniejszym zgłoszeniu. W jednym z

40 przykładów wykonania ten jeden lub więcej niż jeden region determinujący komplementarność (CDR) dobiera się z opisywanego tu zestawu regionów determinujących komplementarność CDR1, CDR2 i CDR3. W szczególnie korzystnym przykładzie wykonania przeciwciało według wynalazku korzystnie zawiera regiony determinujące komplementarność CDR1, CDR2 i CDR3 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego (VH) i(lub) regionu zmiennego łańcucha lekkiego (VL) przeciwciała monoklonalnego przeciwko CLD18A2, korzystnie opisywanego tu przeciwciała monoklonalnego przeciwko CLD18A2, i korzystnie zawiera regiony determinujące komplementarność CDR1, CDR2 i CDR3 regionów zmiennych łańcucha ciężkiego (VH) i(lub) regionów zmiennych łańcucha lekkiego (VL) opisanych w niniejszym zgłoszeniu. [0071] W jednym z przykładów wykonania przeciwciało według wynalazku, w skład którego wchodzi jeden lub więcej niż jeden CDR, zestaw CDR lub kombinacja zestawów CDR, jak tu opisano, zawiera te CDR wraz z ich regionami zrębowymi. Korzystnie, ta część będzie także obejmować co najmniej około 50% dowolnego spośród regionów zrębowych pierwszego i czwartego (lub obu tych regionów), przy czym te 50% stanowi C-końcowe 50% pierwszego regionu zrębowego i N-końcowe 50% czwartego regionu zrębowego. Konstruowanie przeciwciał według niniejszego wynalazku z użyciem metod rekombinacji DNA może spowodować wprowadzenie reszt N- lub C-końcowych do regionów zmiennych kodowanych przez łączniki, wprowadzane celem ułatwienia klonowania lub innych etapów manipulacji, co obejmuje wprowadzanie łączników

41 w celu połączenia regionów zmiennych według niniejszego wynalazku z kolejnymi sekwencjami białkowymi, takimi jak łańcuchy ciężkie immunoglobulin, inne domeny zmienne (na przykład przy wytwarzaniu diaciał) lub znaczniki białkowe. [0072] W jednym z przykładów wykonania przeciwciało według wynalazku, w skład którego wchodzi jeden lub więcej niż jeden CDR, zestaw CDR lub kombinacja zestawów CDR, jak tu opisano, zawiera te CDR w zrębie przeciwciała ludzkiego. [0073] Gdy w niniejszym opisie mowa jest o przeciwciele zawierającym, w odniesieniu do swego łańcucha ciężkiego, konkretny łańcuch, region lub sekwencję, korzystnie chodzi tu o sytuację, gdy wszystkie łańcuchy ciężkie tego przeciwciała zawierają ten konkretny łańcuch, region lub sekwencję. Odnosi się to odpowiednio do łańcucha lekkiego przeciwciała. [0074] Kwasy nukleinowe, zawierające geny lub sekwencje kwasów nukleinowych kodujące przeciwciała lub ich części, na przykład łańcuch przeciwciała, jak tu opisano, mogą być zawarte w wektorze, na przykład plazmidzie, kosmidzie, wirusie, bakteriofagu lub innym wektorze, na przykład stosowanym konwencjonalnie w inżynierii genetycznej. Wektor może zawierać dalsze geny, takie jak geny markerowe, umożliwiające selekcję wektora w odpowiedniej komórce gospodarza i w odpowiednich warunkach. Wektor może ponadto zawierać elementy regulacji ekspresji, umożliwiające właściwą ekspresję regionów kodujących u odpowiednich gospodarzy. Takie elementy regulacyjne są znane

42 specjaliście i mogą obejmować promotor, kasetę splicingową i kodon inicjacji translacji. [0075] Korzystnie, kwas nukleinowy jest przyłączony w sposób umożliwiający działanie do wyżej opisanych sekwencji regulacji ekspresji, umożliwiających ekspresję w komórkach eukariotycznych lub prokariotycznych. Elementy regulacyjne zapewniające ekspresję w komórkach eukariotycznych lub prokariotycznych są dobrze znane specjalistom. [0076] Sposoby konstruowania powyższych cząsteczek kwasu nukleinowego, celem uzyskania wektorów zawierających powyższe cząsteczki kwasu nukleinowego, do wprowadzania wektorów do odpowiednio wybranych komórek gospodarza po to, aby spowodować lub uzyskać ekspresję, są dobrze znane w stanie techniki. [0077] Ujawniany tu kwas nukleinowy lub wektor może znajdować się w komórce gospodarza. [0078] Inne cechy i korzyści niniejszego wynalazku staną się oczywiste po zapoznaniu się z poniższym szczegółowym opisem i zastrzeżeniami. KRÓTKI OPIS RYSUNKÓW [0079] Fig. 1 przedstawia analizę immunofluorescencyjną komórek HEK293 transfekowanych CLD18A2 sprzężonym z zielonym fluorochromem i poddanych reakcji z surowicą mysią po immunizacji DNA z użyciem SEQ ID nr 15 poddanej fuzji z epitopem pomocniczym. Fig. 2 przedstawia analizę Western blot komórek HEK293 transfekowanych CLD 18A2-myc (SEQ ID nr 3) oraz nietransfekowanych komórek HEK293 z monoklonalnym mysim przeciwciałem anty-c-myc 9E11 (Serotec, CRL MCA2200).

43 Fig. 3 przedstawia analizę immunofluorescencyjną z zastosowaniem komórek CHO transfekowanych CLD18A2 i poliklonalnego króliczego przeciwciała anty-cld18 (Zymed, CRL ). Fig. 4A i B przedstawiają wiązanie nadsączy hybrydom 24H5 i 85A3 z komórkami HEK293 przejściowo transfekowanymi ludzkim CLD18A2 i markerem fluorescencyjnym, oceniane metodą cytometrii przepływowej. Fig. 4C przedstawia wiązanie nadsączy hybrydom 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 i 175D10 z komórkami HEK293 stabilnie transfekowanymi ludzkim CLD18A2 i poddanym barwieniu kontrastowemu jodkiem propidyny. Fig. 5 przedstawia wiązanie nadsączy hybrydom 24H5 (A), 9E8 (B), 26B5 (C) i 19B9 (D) z komórkami HEK293 przejściowo transfekowanymi markerem fluorescencyjnym i ludzkim CLD18A2, CLD I 8A2-Myc lub CLD18A2-HA, analizowane metodą cytometrii przepływowej. Fig. 6A i B przedstawiają wiązanie nadsączy hybrydom 37H8, 43A11, 45C1 i 163E12 z komórkami HEK293 stabilnie transfekowanymi ludzkim CLD18A2 lub CLD18A1, oceniane metodą cytometrii przepływowej. Fig. 7 przedstawia analizę immunofluorescencji skierowanego swoiście przeciwko izoformie CLD18A2 przeciwciała monoklonalnego 37G11 poprzez barwienie komórek HEK293 transfekowanych, odpowiednio, CLD18A2 (A, C) i CLD18A1 (B, D), w warunkach natywnych (A, B) i warunkach utrwalenia paraformaldehydem (C, D). Fig. 8 przedstawia analizę immunofluorescencyjną przeciwciała monoklonalnego CLD18 26B5 przez barwienie komórek HEK293 transfekowanych, odpowiednio, CLD18A2

44 (A, C) i CLD18A1 (B, D), w warunkach natywnych (A, B) i warunkach utrwalenia paraformaldehydem (C, D). Fig. 9. RT-PCR linii komórkowych. Analiza RT-PCR z użyciem primerów swoistych wobec CLD18A2 wykazała ewidentną ekspresję w 4/5 z badanych linii komórkowych. Fig. 10 przedstawia analizę immunofluorescencyjną komórek DAN-G (subklon F2) i poliklonalnego króliczego przeciwciała anty-cld 18 (Zymed, CRL ). Fig. 11 przedstawia analizę immunofluorescencyjną komórek KATO-III (subklon 3B9 4D5) i poliklonalnego króliczego przeciwciała anty-cld18 (Zymed, CRL ). Fig. 12A przedstawia analizę immunofluorescencyjną komórek SNU-16 (subklon G5) z użyciem poliklonalnego króliczego przeciwciała anty-cld18 (Zymed, CRL ). Fig. 12 B przedstawia analizę immunofluorescencyjną komórek KATO-III z użyciem przeciwciał monoklonalnych według wynalazku. Fig. 13 przedstawia ekspresję powierzchnia CLD18 na komórkach KATO-III i NUGC-4, analizowaną poprzez barwienie komórek przeciwciałem monoklonalnym 61C2 i 163E12 i następnie przeprowadzenie cytometrii przepływowej. Fig. 14. Dopasowanie białek ludzkiego CLD18A1 (NP_057453), ludzkiego CLD18A2 (NP_ ), mysiego CLD18A1 (NP_062789) i mysiego CLD 18A2 (AAL15636). Fig. 15 A i B przedstawiają wiązanie nadsączy hybrydom, odpowiednio, 38G5, 38H3, 37G11, 45C1 i 163E12, z komórkami HEK293 przejściowo transfekowanymi markerem fluorescencyjnym i mysim CLD18A1 lub mysim CLD I 8A2, analizowane metodą cytometrii przepływowej.

45 Fig. 16. Analizy immunohistochemiczne z zastosowaniem poliklonalnego AB p105. Barwienie immunohistochemiczne podzbioru tkanek prawidłowych (żołądek, płuca, szpik kostny i gruczoł krokowy) potwierdza swoistość tkanki żołądka (A). Ekspresję wykrywano także w rakach żołądka (rząd górny) i rakach płuca (B). Ekspresję CLD18A2 wykazują tylko komórki zróżnicowane, lecz nie komórki macierzyste (C). Fig. 17. Analizy immunohistochemiczne z zastosowaniem monoklonalnego AB 39F11D7 (A) Ekspresję swoistego białka wykrywano w prawidłowej śluzówce żołądka, natomiast wszystkie inne badane tkanki prawidłowe dały wynik ujemny. (B) Silną ekspresję CLD18A2 wykryto w rakach żołądka i płuca. Fig. 18. Analizy immunohistochemiczne z zastosowaniem monoklonalnego AB 26B5 (A), 175D10 (B), 43A11 (C), 163E12 (D) i 45C1 (E). Wszystkie przeciwciała zapewniają silne barwienie próbek ksenogenicznie przeszczepionych guzów HEK293-CLD 18A2 i nowotworów żołądka, lecz nie guzów z transfekcją kontrolną (HEK293 bez dodatku innej substancji czynnej). Fig. 19 stanowi wykres porównujący odsetek martwych komórek po indukcji CDC przez 85A3, 28D10, 24H5 lub 26D12 przeciwko komórkom HEK293 stabilnie transfekowanym ludzkim CLD18A2, oceniany metodą cytometrii przepływowej. Fig. 20 stanowi wykres porównujący odsetek swoistej lizy komórek po indukcji CDC przez 24H5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12 lub 6 1 C2 przeciwko adherentnym komórkom

46 CHO, stabilnie transfekowanym ludzkim CLD 18A2 lub ludzkim CLD18A1, oceniany metodą pomiaru fluorescencji. Fig. 21 przedstawia zależną od stężenia indukcję CDC przeciwko komórkom CHO stabilnie transfekowanym ludzkim CLD18A2 przez 75B8 (A), 28D10 (B) lub 37H8 (C), ocenianą metodą pomiaru fluorescencji. Fig. 22 przedstawia lizę komórek HEK293-CLD18A2 odpowiednio przez 26B5, 37H8, 38G5 i 47D C2, w obecności MNC. Fig. 23 przedstawia lizę komórek HEK293-CLD18A1 odpowiednio przez 26B5, 37H8, 38G5 i 47D12 61 C2, w obecności MNC. Fig. 24 przedstawia hamowanie wzrostu guza przez przeciwciała według wynalazku w modelu wczesnego leczenia przeszczepienia ksenogenicznego komórkami HEK293-CLD18A2. Fig. 25A i B przedstawia wydłużenie przeżycia przez leczenie przeciwciałami według wynalazku w dwóch modelach wczesnego leczenia przeszczepienia ksenogenicznego komórkami HEK293-CLD18A2. Fig. 26 przedstawia wydłużenie przeżycia przez przeciwciała według wynalazku w modelu leczenia w zaawansowanym stadium przeszczepienia ksenogenicznego komórkami HEK293-CLD 18A2. Fig. 27A przedstawia hamowanie wzrostu guza przez przeciwciała według wynalazku w modelu wczesnego leczenia przeszczepienia ksenogenicznego. Fig. 27B przedstawia wydłużenie przeżycia przez przeciwciała według wynalazku w modelu wczesnego leczenia przeszczepienia ksenogenicznego. Zastosowano komórki DAN-G wykazujące endogenną ekspresję CLD18A2.

47 Fig. 28 przedstawia ekspresję mrna CLD18A2 w tkankach mysich. Badania RT-PCR z zastosowaniem primerów swoistych wobec CLD18A2 nie wykazały istotnej ekspresji w obrębie wszystkich badanych tkanek prawidłowych z wyjątkiem żołądka. Analizowano następujące tkanki prawidłowe: 1: jelito cienkie 2: śledziona 3: skóra 4: żołądek 5: płuca 6: trzustka 7: węzeł chłonny 8: grasica 9: kontrola ujemna. Fig. 29 przedstawia ekspresję CLD 18 w prawidłowym żołądku. Analiza immunohistochemiczna żołądka mysiego z zastosowaniem przeciwciała swoistego wobec CLD 18 ujawnia wzorzec ekspresji konserwatywnej. O ile nabłonki powierzchniowe i głębsze krypty wykazują ekspresję CLD18 na powierzchni swych komórek, środkowa okolica szyjki jest CLD 18-ujemna. Fig. 30 przedstawia barwienie hematoksyliną i eozyną tkanek żołądka myszy. Ukazano ogólnie (A) i szczegółowo (B) żołądek myszy leczonej 37G11 w porównaniu z myszą kontrolną (C i D), której podawano tylko PBS. Fig. 31 A i B ukazują barwienie metodą cytometrii przepływowej komórek HEK293 stabilnie transfekowanych, odpowiednio, ludzkim CLD18A1 i A2, jak również wykazujące endogenną ekspresję komórek KATO-III, przeciwciałami według wynalazku (43A11, 125E1, 163E12, 166E2 i 175D10). Fig. 32 przedstawia CDC komórek wykazujących ekspresję CLD 18A2, w której pośredniczą chimerowe przeciwciała według wynalazku. Fig. 33 przedstawia ADCC komórek KATO-III, w której pośredniczą chimerowe przeciwciała według wynalazku. SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU

48 [0080] Opisywane tu przeciwciała mogą być izolowanymi przeciwciałami monoklonalnymi, które swoiście wiążą się z epitopem obecnym na CLD18A2. Do izolowanych przeciwciał monoklonalnych objętych zakresem niniejszego wynalazku należą przeciwciała IgA, IgG1-4 IgE, IgM i IgD. W jednym z przykładów wykonania przeciwciałem jest przeciwciało IgG 1, konkretniej izotyp IgG 1 kappa lub IgG1 lambda. W innym przykładzie wykonania przeciwciałem jest przeciwciało IgG3, konkretniej izotyp IgG3 kappa lub IgG3 lambda. W jeszcze innym przykładzie wykonania przeciwciałem jest przeciwciało IgG4, konkretniej izotyp IgG4 kappa lub IgG4 lambda. W jeszcze innym przykładzie wykonania przeciwciałem jest przeciwciało IgA1 lub IgA2. W jeszcze innym przykładzie wykonania przeciwciałem jest przeciwciało IgM. [0081] W jednym z przykładów wykonania przedmiotem niniejszego wynalazku są przeciwciała, które swoiście wiążą się z komórkami wykazującymi ekspresję CLD18A2 i korzystnie (i) wiążą się z komórkami wykazującymi ekspresję CLD18A2 i (ii) nie wiążą się z komórkami niewykazującymi ekspresji CLD18A2, a wykazującymi ekspresję CLD18A1. Przeciwciała według wynalazku korzystnie (i) pośredniczą w zabijaniu komórek wykazujących ekspresję CLD18A2 i (ii) nie pośredniczą w zabijaniu komórek niewykazujących ekspresji CLD18A2, a wykazujących ekspresję CLD18A1. [0082] W innym przykładzie wykonania przedmiotem niniejszego wynalazku są przeciwciała, które (i) wiążą się z komórkami nowotworowymi wykazującymi ekspresję CLD18 (ii) nie wiążą się z wykazującymi ekspresję CLD18

49 komórkami prawidłowej śluzówki żołądka i(lub) (iii) nie wiążą się z wykazującymi ekspresję CLD18 komórkami nienowotworowej tkanki płuca. [0083] Przedmiotem niniejszego wynalazku są również przeciwciała, które (i) pośredniczą w zabijaniu komórek nowotworowych wykazujących ekspresję CLD18 (ii) nie pośredniczą w zabijaniu wykazujących ekspresję CLD18 komórek prawidłowej śluzówki żołądka i(lub) (iii) nie pośredniczą w zabijaniu wykazujących ekspresję CLD18 komórek nienowotworowej tkanki płuca. [0084] W szczególnych przykładach wykonania przeciwciała według wynalazku (i) wiążą się z epitopem na CLD18A2, który nie jest obecny na CLD18A1, korzystnie SEQ ID nr 21, 22 i 23 (ii) wiążą się z epitopem zlokalizowanym na CLD18A2-pętli 1, korzystnie SEQ ID nr 28 (iii) wiążą się z epitopem, który obejmuje CLD18A2-pętlę 1 i CLD18A2-pętlę D3 lub (iv) wiążą się z epitopem obecnym w ludzkim i mysim CLD18 (odpowiednio, SEQ ID nr 2, SEQ ID nr 8 i SEQ ID nr 35, SEQ ID nr 37). [0085] W szczególnie korzystnych przykładach wykonania przeciwciała według wynalazku wiążą się z epitopem na CLD18A2, który nie jest obecny na CLD18A1. [0086] Przeciwciała według wynalazku obejmują przeciwciała w pełni ludzkie. Takie przeciwciała można wytwarzać w organizmach zwierząt transgenicznych innych niż człowiek, na przykład u transgenicznych myszy, zdolnych do tworzenia wielu izotypów ludzkich przeciwciał monoklonalnych przeciwko CLD18 przez uleganie rekombinacji V-D-J i przełączanie izotypu. Takim zwierzęciem transgenicznym może być również transgeniczny królik, u którego wytwarza się

50 przeciwciała poliklonalne, jak ujawniono w US 2003/ [0087] Celem ułatwienia zrozumienia niniejszego wynalazku najpierw zdefiniowane zostaną pewne terminy. Dodatkowe definicje przedstawiono w szczegółowym opisie. DEFINICJA TERMINÓW [0088] Termin CLD18 odnosi się do klaudyny 18 i obejmuje dowolne warianty, w tym CLD18A1 i CLD18A2, konformacje, izoformy i homologi CLD18, które ulegają naturalnej ekspresji w komórkach lub ulegają ekspresji w komórkach transfekowanych genem CLD18. Korzystnie, termin CLD 18 odnosi się do ludzkiego CLD18, w szczególności CLD18A2 (SEQ ID nr 1, 2) i(lub) CLD18A1 (SEQ ID nr 7, 8), korzystniej CLD18A2. [0089] Termin CLD18A1 obejmuje zmodyfikowane posttranslacyjnie warianty, izoformy i homologi ludzkiego CLD18A1, które ulegają naturalnej ekspresji w komórkach lub ulegają ekspresji na komórkach transfekowanych genem CLD18A1. [0090] Termin CLD 18A2 obejmuje modyfikowane posttranslacyjnie warianty, izoformy i homologi ludzkiego CLD18A2, które ulegają naturalnej ekspresji przez komórki lub ulegają ekspresji na komórkach transfekowanych genem CLD18A2. [0091] Termin wariant CLD18 ma obejmować (i) warianty splicingowe CLD 18 (ii) modyfikowane posttranslacyjnie warianty CLD 18, w tym korzystnie warianty o różnym statusie N-glikozylacji (iii) warianty konformacyjne CLD18, w tym korzystnie warianty CLD18-konformacja 1, CLD18-konformacja 2 i CLD18-konformacja 3 (iv) wolne i

51 homotypowo/heterotypowo połączone warianty CLD18, zlokalizowane na międzykomórkowych obwódkach zamykających (v) warianty CLD18 związane z nowotworami i warianty CLD18 niezwiązane z nowotworami. [0092] Termin tratwa (ang. raft) oznacza bogate w sfingolipidy i cholesterol mikrodomeny błonowe, zlokalizowane na powierzchni listka zewnętrznego błony plazmatycznej komórki. Zdolność pewnych białek do łączenia się z takimi domenami i ich zdolność do tworzenia agregatów lub ogniskowych agregatów może wpływać na czynność białka. Translokacja cząsteczek CLD 18 do takich struktur po związaniu przez przeciwciała według niniejszego wynalazku powoduje na przykład powstanie w błonach plazmatycznych kompleksów antygenu CLD18-przeciwciało o dużej gęstości. Takie kompleksy antygenu CLD 18 antygen-przeciwciało o dużej gęstości mogą uruchamiać skuteczną aktywację układu dopełniacza w czasie CDC. [0093] Terminy konformacja i topologia opisują, w jaki sposób integralna cząsteczka błony jest ulokowana w błonie na powierzchni komórki i, w szczególności, które z jej regionów są pozakomórkowe i w ten sposób dostępne dla przeciwciał. CLD18 może na przykład występować w trzech różnych konformacjach, co najprawdopodobniej zależy od tego, czy obecny jest głównie w postaci homomerów, czy heteromerów i od tego, czy jest zintegrowany w supramolekularne struktury obwódki zamykającej, czy wolna. Te różne stany powodują, że różne epitopy są dostępne dla przeciwciał.

52 [0094] Według wynalazku, termin choroba odnosi się do dowolnego stanu patologicznego, w tym nowotworu, w szczególności do opisywanych tu postaci nowotworów. [0095] Określenie guz ma oznaczać nieprawidłową grupę komórek lub tkankę, które rosną na drodze szybkiej, niekontrolowanej proliferacji komórkowej i kontynuują wzrost po ustaniu działania bodźców, które zainicjowały nowy wzrost. Guzy wykazują częściowy lub całkowity brak organizacji strukturalnej i koordynacji czynnościowej z tkanką prawidłową, i zwykle tworzą masę odrębną od tkanki. Guz może być łagodny lub złośliwy. [0096] Termin przerzut ma oznaczać szerzenie się komórek nowotworowych z ich pierwotnej lokalizacji do innego miejsca organizmu. Powstawanie przerzutu jest procesem bardzo złożonym i jest uzależnione od oddzielania się komórek złośliwych od pierwotnego nacieku guzowatego macierzy pozakomórkowej, penetracji błon podstawnych śródbłonka celem wejścia do jam ciała i do naczyń i następnie, po przetransportowaniu przez naciekanie drogą krwi, nacieku narządów docelowych. I wreszcie, wzrost nowego guza w miejscu docelowym jest uzależniony od angiogenezy. Do przerzutu nowotworu dochodzi często nawet po usunięciu guza pierwotnego, ponieważ komórki lub składowe guza mogą pozostać i rozwinąć potencjał dawania przerzutów. W jednym z przykładów wykonania termin przerzut według wynalazku oznacza przerzut odległy pojęcie to dotyczy przerzutu oddalonego od guza pierwotnego i od układu regionalnych węzłów chłonnych. [0097] Termin leczenie choroby obejmuje uzyskiwanie wyleczenia, skracanie czasu trwania choroby,

53 uzyskiwanie poprawy, zapobieganie progresji lub pogorszeniu, spowalnianie lub hamowanie progresji lub pogorszenia albo zapobieganie wystąpieniu choroby lub jej objawów bądź opóźnianie pojawienia się choroby lub jej objawów. [0098] Według wynalazku próbką może być dowolna próbka użyteczna według niniejszego wynalazku, w szczególności próbka biologiczna, taka jak próbka tkanki, w tym próbka płynów ustrojowych i(lub) próbka komórek; można ją otrzymywać w sposób konwencjonalny, na przykład przez biopsję tkankową, w tym biopsję sztancową, i przez pobieranie krwi, aspiratu z oskrzeli, plwociny, moczu, kału lub innych płynów ustrojowych. Według wynalazku, termin próbka biologiczna obejmuje także frakcje próbek biologicznych. [0099] Termin przeciwciało odnosi się do glikoproteiny zawierającej co najmniej dwa łańcuchy ciężkie (H) i dwa łańcuchy lekkie (L), połączone ze sobą wzajemnie wiązaniami dwusiarczkowymi, albo do ich części wiążącej antygen. Termin przeciwciało obejmuje także wszystkie rekombinowane postacie przeciwciał, w szczególności przeciwciał opisywanych w niniejszym zgłoszeniu, na przykład przeciwciał ulegających ekspresji u prokariontów, przeciwciała nieglikozylowane oraz wszelkie wiążące antygen fragmenty i pochodne przeciwciał, jak opisano poniżej. Każdy łańcuch ciężki składa się z regionu zmiennego łańcucha ciężkiego (w niniejszym opisie oznaczanego skrótem VH) i regionu stałego łańcucha ciężkiego. Każdy łańcuch lekki składa się z regionu zmiennego łańcucha lekkiego (w niniejszym opisie oznaczanego skrótem VL) i regionu stałego

54 łańcucha lekkiego. Regiony VH i VL można podzielić na regiony hiperzmienności, określane terminem regiony determinujące komplementarność (CDR), które są rozdzielone regionami bardziej konserwowanymi, określanymi terminem regiony zrębowe (FR). Każdy VH i VL składa się z trzech CDR i czterech FR, ułożonych od końca aminowego do końca karboksylowego w następującej kolejności: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Regiony zmienne łańcuchów ciężkiego i lekkiego zawierają domenę wiązania, wchodzącą w interakcję z antygenem. Regiony stałe przeciwciał mogą pośredniczyć w wiązaniu immunoglobuliny z tkankami lub czynnikami gospodarza, takimi jak różne komórki układu immunologicznego (na przykład komórki efektorowe) i pierwszy komponent (Clq) klasycznego układu dopełniacza. [0100] Termin przeciwciało humanizowane odnosi się do cząsteczki, zawierającej miejsce wiązania antygenu, pochodzące zasadniczo z immunoglobuliny od gatunku innego niż człowiek, natomiast pozostała część struktury immunoglobulinowej cząsteczki opiera się na strukturze i(lub) sekwencji immunoglobuliny ludzkiej. Miejsce wiązania antygenu może zawierać pełne domeny zmienne poddane fuzji z domenami stałymi lub tylko regiony determinujące komplementarność (CDR) przeszczepione na odpowiednie regiony zrębowe w domenach zmiennych. Miejsca wiązania antygenu mogą być miejscami typu dzikiego lub mogą być zmodyfikowane jedną lub więcej niż jedną substytucją aminokwasową, na przykład modyfikowane tak, aby były bardziej podobne do immunoglobulin ludzkich. Niektóre postacie przeciwciał

55 humanizowanych zachowują wszystkie sekwencje CDR (na przykład humanizowane przeciwciało mysie, które zawiera wszystkie sześć CDR z przeciwciała mysiego). W innych postaciach jeden lub więcej niż jeden CDR jest zmieniony w stosunku do przeciwciała wyjściowego. [0101] Termin przeciwciało chimerowe odnosi się do przeciwciał, w których jedna część każdej sekwencji aminokwasowej łańcucha ciężkiego i lekkiego jest homologiczna do odpowiednich sekwencji w przeciwciałach pochodzących od danego gatunku lub należących do danej klasy, natomiast pozostały segment łańcucha jest homologiczny do odpowiednich sekwencji w drugim. Typowo region zmienny łańcucha zarówno lekkiego, jak i ciężkiego jest podobny do regionów zmiennych przeciwciał pochodzących od jednego gatunku ssaka, podczas gdy części stałe są homologiczne do sekwencji przeciwciał pochodzących od drugiego gatunku. Ewidentną zaletą takich postaci chimerowych jest to, że region zmienny może korzystnie pochodzić z obecnie znanych źródeł, i można go wytwarzać, stosując łatwo dostępne komórki B lub hybrydomy od organizmów gospodarzy innych niż człowiek w skojarzeniu z regionami stałymi pochodzącymi na przykład z preparatów komórek ludzkich. Region zmienny jest korzystny z uwagi na łatwość wytwarzania, a jego źródło nie wpływa negatywnie na jego swoistość; to, że region stały jest ludzki, zmniejsza prawdopodobieństwo powstania odpowiedzi immunologicznej u pacjenta-człowieka, gdy wstrzykuje się przeciwciała, w porównaniu z przeciwciałami, w których region stały pochodziłby ze źródła innego niż

56 człowiek. Definicja nie ogranicza się jednak do tego konkretnego przykładu. [0102] Termin część wiążąca z antygenem przeciwciała (czyli po prostu część wiążąca ), w rozumieniu niniejszego opisu, odnosi się do jednego lub więcej niż jednego fragmentu przeciwciała, który zachowuje zdolność do swoistego wiązania się z antygenem. Wykazano, że zdolność przeciwciała do wiązania antygenu może przejawiać się przy zastosowaniu fragmentów przeciwciała o pełnej długości. Do przykładów fragmentów wiążących, objętych terminem część wiążąca z antygenem przeciwciała, należą (i) fragmenty Fab, fragmenty monowalentne, złożone z domen VL, VH, CL i CH; (ii) fragmenty F(ab') 2, fragmenty biwalentne, zawierające dwa fragmenty Fab połączone mostkiem dwusiarczkowym na regionie zawiasowym; (iii) fragmenty Fd, złożone z domen VH i CH; (iv) fragmenty Fv, złożone z domen VL i VH przeciwciała jednoramiennego (v) fragmenty dab (Ward i wsp., (1989) Nature 341: ), które składają się z domen VH; (vi) izolowane regiony determinujące komplementarność (CDR) i (vii) kombinacje dwóch lub więcej izolowanych CDR, które mogą opcjonalnie być połączone łącznikiem syntetycznym. Ponadto, jakkolwiek obie domeny fragmentu Fv - VL i VH są kodowane przez oddzielne geny, można je połączyć, metodami rekombinacji, syntetycznym łącznikiem, który pozwala na utworzenie z nich pojedynczego łańcucha białkowego, w którym regiony VL i VH tworzą parę i przez to powstają cząsteczki monowalentne (znane jako Fv jednołańcuchowe (scfv); zob. na przykład Bird i wsp. (1988) Science 242: ; i Huston i wsp. (1988)

57 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: ). Takie przeciwciała jednołańcuchowe mają również być objęte terminem część wiążąca z antygenem przeciwciała. Kolejnym przykładem są białka fuzyjne z immunoglobuliną z domeną wiązania, zawierające (i) polipeptyd stanowiący domenę wiązania, poddany fuzji z polipeptydem stanowiącym region zawiasowy immunoglobuliny (ii) region stały łańcucha ciężkiego CH2 immunoglobuliny, poddany fuzji z regionem zawiasowym (iii) region stały łańcucha ciężkiego CH3 immunoglobuliny, poddany fuzji z regionem stałym CH2. Polipeptyd stanowiący domenę wiązania może być regionem zmiennym łańcucha ciężkiego lub regionem zmiennym łańcucha lekkiego. Białka fuzyjne z immunoglobuliną z domeną wiązania opisano dokładniej w US 2003/ i US 2003/ Te fragmenty przeciwciał uzyskuje się konwencjonalnymi sposobami znanymi specjalistom i poddaje się je badaniom przesiewowym pod kątem ich użyteczności, w taki sam sposób, jak przeciwciała nienaruszone. [0103] Termin epitop oznacza determinantę białkową zdolną do wiązania z przeciwciałem, przy czym termin wiązanie według niniejszego wynalazku korzystnie odnosi się do wiązania swoistego. Epitopy zwykle składają się z aktywnych chemicznie ugrupowań powierzchniowych cząsteczek, takich jak aminokwasowe lub cukrowe łańcuchy boczne i zwykle wykazują swoistą trójwymiarową charakterystykę strukturalną, jak również swoistą charakterystykę ładunku. Epitopy konformacyjne i niekonformacyjne różnią się tym, że wiązanie z

58 pierwszymi z nich, lecz nie z ostatnimi, ulega eliminacji w obecności rozpuszczalników denaturujących. [0104] Termin epitop nieciągły w rozumieniu niniejszego opisu oznacza epitop konformacyjny na antygenie białkowym, utworzony z co najmniej dwóch oddzielnych regionów w pierwszorzędowej sekwencji białka. [0105] Termin cząsteczka dwuswoista ma obejmować dowolny środek, na przykład białko, peptyd albo kompleks białkowy lub peptydowy, który wykazuje dwie różne swoistości wiązania. Cząsteczka może na przykład wiązać się (a) z antygenem powierzchni komórkowej i (b) z receptorem Fc na powierzchni komórki efektorowej lub wykazywać interakcje z tym antygenem i z tym receptorem. Termin cząsteczka wieloswoista lub cząsteczka heteroswoista ma obejmować dowolny środek, na przykład białko, peptyd albo kompleks białkowy lub peptydowy, który wykazuje więcej niż dwie różne swoistości wiązania. Cząsteczka może na przykład wiązać się (a) z antygenem powierzchni komórkowej (b) z receptorem Fc na powierzchni komórki efektorowej i (c) z co najmniej jedną inną składową - lub wykazywać interakcje z tym antygenem, z tym receptorem i z tą składową. Zgodnie z tym, wynalazek obejmuje między innymi cząsteczki dwuswoiste, trójswoiste, czteroswoiste i inne wieloswoiste, skierowane przeciwko CLD18 i innym celom, takim jak receptory Fc na komórkach efektorowych. Termin przeciwciało dwuswoiste obejmuje także diaciała. Diaciała są to biwalentne, dwuswoiste przeciwciała, w których domeny VH i VL ulegają ekspresji na pojedynczym łańcuchu

59 polipeptydowym, lecz za pośrednictwem łącznika, który jest zbyt krótki, aby umożliwić utworzenie par między dwiema domenami na tym samym łańcuchu, co wymusza tworzenie przez domeny par z domenami komplementarnymi drugiego łańcucha i powstawanie dwóch miejsc wiązania antygenu (zob. na przykład Holliger, P. i wsp. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: ; Poljak, R. J. i wsp. (1994) Structure 2: ). [0106] Wynalazek obejmuje także pochodne opisywanych tu przeciwciał. Termin pochodna przeciwciała odnosi się do dowolnej modyfikowanej postaci przeciwciała, na przykład do koniugatu przeciwciała i innego środka lub przeciwciała. W rozumieniu niniejszego opisu, przeciwciało pochodzi z konkretnej sekwencji linii zarodkowej, jeżeli przeciwciało uzyskuje się z układu przez immunizowanie zwierzęcia lub skrining biblioteki genów immunoglobulin i gdy wybrane przeciwciało jest w co najmniej 90%, korzystniej co najmniej 95%, jeszcze korzystniej co najmniej 96%, 97%, 98% lub 99% identyczne pod względem sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasowej kodowanej przez gen immunoglobuliny linii zarodkowej. Typowo, przeciwciało pochodzące z konkretnej sekwencji linii zarodkowej będzie wykazywać nie więcej niż 10 różnic aminokwasowych, korzystniej nie więcej niż 5 lub jeszcze korzystniej nie więcej niż 4, 3, 2 lub 1 różnicę aminokwasowych w porównaniu z sekwencją aminokwasową kodowaną przez gen immunoglobuliny linii zarodkowej. [0107] W rozumieniu niniejszego opisu, termin heteroprzeciwciała odnosi się do dwóch lub więcej

60 przeciwciał, ich pochodnych lub regionów wiążących antygen połączonych ze sobą, przy czym co najmniej dwa z nich mają różną swoistość. Do tych różnych swoistości należą swoistość wiązania receptora Fc na komórce efektorowej i swoistość wiązania antygenu lub epitopu na komórce docelowej, na przykład komórce nowotworowej. [0108] Opisywane tu przeciwciała mogą być przeciwciałami ludzkimi. Termin przeciwciało ludzkie w rozumieniu niniejszego opisu ma obejmować przeciwciała, których regiony zmienne i regiony stałe pochodzą z ludzkich sekwencji linii zarodkowej immunoglobulin. Przeciwciała ludzkie według wynalazku mogą obejmować reszty aminokwasowe niekodowane przez ludzkie sekwencje linii zarodkowej immunoglobulin (na przykład mutacje wprowadzane przez losową lub swoistą dla miejsca mutagenezę in vitro lub przez mutację somatyczną in vivo). [0109] Termin przeciwciało monoklonalne w rozumieniu niniejszego opisu odnosi się do preparatu cząsteczek przeciwciała o jednakowym składzie cząsteczkowym. Przeciwciało monoklonalne wykazuje jedną swoistość wiązania i powinowactwo do konkretnego epitopu. W jednym z przykładów wykonania przeciwciała monoklonalne wytwarzane są przez hybrydomę, która obejmuje komórkę B uzyskaną od zwierzęcia innego niż człowiek, na przykład od myszy, poddaną fuzji z komórką unieśmiertelnioną. [0110] Termin przeciwciało rekombinowane w rozumieniu niniejszego opisu obejmuje wszystkie przeciwciała, które wytwarza się, uzyskuje ich ekspresję, tworzy się lub izoluje metodami rekombinacji, takie jak (a) przeciwciała izolowane od zwierzęcia (na przykład

61 myszy), które jest transgeniczne lub transchromosomalne w odniesieniu do genów immunoglobulin lub z hybrydomy uzyskanej z takiego zwierzęcia (b) przeciwciała izolowane z komórki gospodarza transformowanej tak, aby wykazywała ekspresję przeciwciała, na przykład z transfektomy (c) przeciwciała izolowane z rekombinacyjnej, kombinatorycznej biblioteki przeciwciał i (d) przeciwciała wytworzone, przeciwciała, których ekspresję uzyskano, przeciwciała wytworzone lub izolowane dowolnymi innymi sposobami, obejmującymi splicing sekwencji genu immunoglobuliny z innymi sekwencjami DNA. [0111] Termin transfektoma w rozumieniu niniejszego opisu obejmuje rekombinowane, eukariotyczne komórki gospodarza wykazujące ekspresję przeciwciała, takie jak komórki CHO, komórki NS/0, komórki HEK293, komórki HEK293T, komórki roślin lub grzybów, w tym komórki drożdży. [0112] W rozumieniu niniejszego opisu przeciwciało heterologiczne definiuje się w odniesieniu do transgenicznego organizmu wytwarzającego takie przeciwciało. Termin ten odnosi się do przeciwciała, które ma sekwencję aminokwasową lub koduje sekwencję kwasu nukleinowego odpowiadającą sekwencji występującej w organizmie, który nie składa się z organizmu transgenicznego i które ogólnie pochodzi z gatunku innego niż organizm transgeniczny. [0113] W rozumieniu niniejszego opisu określenie przeciwciało heterohybrydowe odnosi się do przeciwciała posiadającego łańcuchy lekki i ciężki pochodzące z różnych organizmów. Przeciwciałem

62 heterohybrydowym jest na przykład przeciwciało, w którym ludzki łańcuch ciężki jest powiązany z mysim łańcuchem lekkim. [0114] Opisywane tu przeciwciała są korzystnie izolowane. Określenie przeciwciało izolowane w rozumieniu niniejszego opisu ma oznaczać przeciwciało, które jest w zasadzie wolne od innych przeciwciał o różnej swoistości antygenowej (na przykład przeciwciało izolowane, które swoiście wiąże się z CLD 18, jest zasadniczo wolne od przeciwciał, które swoiście wiążą antygeny inne niż CLD18). Przeciwciało izolowane, które swoiście wiąże się z izoformą lub wariantem epitopu ludzkiego CLD18, może jednak wykazywać reaktywność krzyżową z innymi, pokrewnymi antygenami, na przykład pochodzącymi od innych gatunków (na przykład homologi gatunkowe CLD18). Przeciwciało izolowane może być ponadto zasadniczo wolne od innego materiału komórkowego i(lub) środków chemicznych. W jednym z przykładów wykonania wynalazku, gdy mowa o kombinacji izolowanych przeciwciał monoklonalnych, chodzi o przeciwciała o różnej swoistości, skojarzone w dobrze zdefiniowanej kompozycji. [0115] Według wynalazku termin wiązanie korzystnie odnosi się do wiązania swoistego. W rozumieniu niniejszego opisu, określenie wiązanie swoiste odnosi się do wiązania przeciwciała z określonym z góry antygenem. Typowo, przeciwciało wiąże się z powinowactwem odpowiadającym KD wynoszącej około 1 x 10-7 M lub mniej i wiąże się z określonym z góry antygenem z powinowactwem odpowiadającym KD, która jest o co najmniej dwa rzędy wielkości mniejsza niż jego

63 powinowactwo wiązania z antygenem nieswoistym (na przykład BSA, kazeina) innym niż antygen określony z góry lub antygen blisko spokrewniony. [0116] Termin KD (M), w rozumieniu niniejszego opisu, ma oznaczać stałą równowagi dysocjacji danej interakcji przeciwciało-antygen. [0117] W rozumieniu niniejszego opisu termin izotyp odnosi się do klasy przeciwciała (na przykład IgM lub IgG 1), która jest kodowana przez geny regionu stałego łańcucha ciężkiego. [0118] W rozumieniu niniejszego opisu określenie przełączanie izotypu odnosi się do zjawiska, w którym klasa lub izotyp przeciwciała zmienia się z jednej klasy Ig na inną klasę Ig. [0119] Termin występujące naturalnie w rozumieniu niniejszego opisu, odnoszący się do przedmiotu, oznacza to, że ten przedmiot można znaleźć w naturze. Występujący naturalnie jest na przykład polipeptyd lub sekwencja polinukleotydowa, które są obecne w organizmie (w tym w wirusach), które można izolować ze źródła w naturze i które nie zostały poddane celowej modyfikacji przez człowieka, w laboratorium. [0120] Termin o zmienionym układzie, o zmienionej konfiguracji w rozumieniu niniejszego opisu odnosi się do konfiguracji locus łańcucha ciężkiego lub łańcucha lekkiego immunoglobuliny, w której segment V przylega bezpośrednio do segmentu D-J lub J w konformacji kodującej zasadniczo, odpowiednio, pełną domenę VH lub VL. Locus genu immunoglobuliny (przeciwciała) o zmienionym układzie można zidentyfikować przez porównanie z DNA linii zarodkowej; w locus o zmienionym

64 układzie co najmniej jeden element homologów heptameru/nonameru będzie rekombinowany. [0121] Termin o niezmienionym układzie lub o konfiguracji linii zarodkowej w rozumieniu niniejszego opisu, zastosowany w odniesieniu do segmentu V, oznacza konfigurację, w której segment V nie jest rekombinowany tak, aby bezpośrednio przylegał do segmentu D lub J. [0122] Termin cząsteczka kwasu nukleinowego w rozumieniu niniejszego opisu ma obejmować cząsteczki DNA i cząsteczki RNA. Cząsteczka kwasu nukleinowego może być jednoniciowa lub dwuniciowa, lecz korzystnie jest to DNA dwuniciowy. [0123] Opisywane kwasy nukleinowe według wynalazku są to korzystnie kwasy, które zostały izolowane. Termin izolowany kwas nukleinowy oznacza według wynalazku, że kwas nukleinowy został (i) powielony in vitro, na przykład na drodze polimerazowej reakcji łańcuchowej (PCR) (ii) wytworzony rekombinacyjnie przez klonowanie (iii) oczyszczony, na przykład przez rozszczepienie i frakcjonowanie na drodze elektroforezy w żelu (iv) zsyntetyzowany, na przykład poprzez syntezę chemiczną. Izolowany kwas nukleinowy jest to kwas nukleinowy, który jest dostępny do manipulacji technikami rekombinacji DNA. [0124] Kwasy nukleinowe mogą według wynalazku być obecne same lub w skojarzeniu z innymi kwasami nukleinowymi, które mogą być homologiczne lub heterologiczne. W korzystnych przykładach wykonania kwas nukleinowy jest funkcjonalnie połączony z sekwencjami kontroli ekspresji, które mogą być homologiczne lub heterologiczne w odniesieniu do tego

65 kwasu nukleinowego. Termin homologiczny oznacza, że kwas nukleinowy jest także funkcjonalnie połączony z sekwencjami kontroli ekspresji naturalnie, a termin heterologiczny oznacza, że kwas nukleinowy nie jest funkcjonalnie połączony z sekwencjami kontroli ekspresji naturalnie. [0125] Kwas nukleinowy, taki jak kwas nukleinowy wykazujący ekspresję RNA i(lub) białka lub peptydu, i sekwencja kontroli ekspresji są funkcjonalnie połączone ze sobą, jeżeli są ze sobą połączone kowalencyjnie w taki sposób, że ekspresja lub transkrypcja tego kwasu nukleinowego jest regulowana lub pozostaje pod wpływem tej sekwencji kontroli ekspresji. Jeżeli kwas nukleinowy ma ulegać translacji do funkcjonalnego białka, to, gdy sekwencja kontroli ekspresji jest funkcjonalnie połączona z sekwencją kodującą, indukcja tej sekwencji kontroli ekspresji powoduje transkrypcję tego kwasu nukleinowego, nie powodując przesunięcia ramki w sekwencji kodującej lub ta sekwencja kodująca nie jest zdolna do translacji do pożądanego białka lub peptydu. [0126] Termin sekwencja kontroli ekspresji według wynalazku obejmuje promotory, miejsca wiązania rybosomów, wzmacniacze i inne elementy kontrolne, regulujące transkrypcję genu lub translację RNA. W szczególnych przykładach wykonania wynalazku sekwencje kontroli ekspresji mogą być regulowane. Dokładna struktura sekwencji kontroli ekspresji może być zmienna, w zależności od gatunku lub typu komórek, lecz ogólnie są to niepoddane transkrypcji od końca 5' i niepoddane translacji od końców 5' i 3' sekwencje

66 odgrywające rolę, odpowiednio, w zapoczątkowywaniu transkrypcji i translacji, takie jak sekwencja TATA, sekwencja czapeczki i sekwencja CAAT. Konkretniej, niepoddane transkrypcji od końca 5' sekwencje kontroli ekspresji zawierają region promotora, który obejmuje sekwencję promotora do regulacji transkrypcyjnej funkcjonalnie połączonego kwasu nukleinowego. Sekwencje kontroli ekspresji mogą również zawierać sekwencje wzmacniacza lub sekwencje aktywacji w górę sekwencji. [0127] Według wynalazku terminy promotor lub region promotora odnoszą się do sekwencji kwasu nukleinowego, znajdującej się w górę (w kierunku 5') w stosunku do ulegającej ekspresji sekwencji kwasu nukleinowego i sekwencji kontroli ekspresji i zapewniają miejsce rozpoznawania i wiązania polimerazy RNA. Region promotora może obejmować dalsze miejsca rozpoznawania i wiązania kolejnych czynników, odgrywających rolę w regulacji transkrypcji genu. Promotor może regulować transkrypcję genu prokariotycznego lub eukariotycznego. Promotor może być ponadto indukowalny i może zapoczątkowywać transkrypcję w odpowiedzi na środek indukujący lub może być konstytutywny, jeżeli transkrypcja nie jest regulowana przez środek indukujący. Gen regulowany przez promotor indukowalny nie ulega ekspresji lub ulega ekspresji jedynie w niewielkim stopniu, jeżeli środek indukujący jest nieobecny. W obecności środka indukującego gen włącza się lub dochodzi do podwyższenia poziomu transkrypcji. W procesie tym pośredniczy ogólnie wiązanie swoistego czynnika transkrypcji.

67 [0128] Do promotorów korzystnych według wynalazku należą promotory polimerazy SP6, T3 i T7, ludzki promotor U6 RNA, promotor CMV i ich sztuczne promotory hybrydowe (na przykład CMV), w których część lub części są poddane fuzji z częścią lub częściami promotorów genów innych białek komórkowych, takich jak na przykład ludzka GAPDH (dehydrogenaza gliceraldehydo-3- fosforanu), zawierającymi lub niezawierającymi dodatkowego intronu (dodatkowych intronów). [0129] Według wynalazku termin ekspresja stosuje się w jego najbardziej ogólnym znaczeniu i obejmuje on wytwarzanie RNA lub RNA i białka/peptydu. Obejmuje on również częściową ekspresję kwasów nukleinowych. Ponadto ekspresję można przeprowadzać przejściowo lub stabilnie. [0130] W korzystnym przykładzie wykonania cząsteczka kwasu nukleinowego jest według wynalazku obecna w wektorze, gdy jest to odpowiednie z promotorem, który reguluje ekspresję kwasu nukleinowego. Termin wektor stosuje się w jego najbardziej ogólnym znaczeniu i obejmuje on wszelkie pośrednie nośniki kwasu nukleinowego, umożliwiające na przykład wprowadzenie tego kwasu nukleinowego do komórek prokariotycznych i(lub) eukariotycznych i, gdy jest to odpowiednie, ich integrację do genomu. Wektory tego rodzaju ulegają korzystnie replikacji i(lub) ekspresji w komórkach. Wektory obejmują plazmidy, fagmidy, bakteriofagi lub genomy wirusowe. Termin plazmid w rozumieniu niniejszego opisu ogólnie odnosi się do konstruktu pozachromosomalnego materiału genetycznego, zwykle

68 kolistego dupleksu DNA, który może ulegać replikacji niezależnie od DNA chromosomalnego. [0131] Jako wektor do ekspresji przeciwciała można stosować albo typ wektora, w którym łańcuch ciężki i łańcuch lekki przeciwciała są obecne w różnych wektorach, albo typ wektora, w którym łańcuch ciężki i łańcuch lekki przeciwciała są obecne w tym samym wektorze. [0132] Opis podany w niniejszym zgłoszeniu, w odniesieniu do konkretnego kwasu nukleinowego i sekwencji aminokwasowych, na przykład ukazanych w wykazie sekwencji, należy rozumieć tak, że odnosi się on również do modyfikacji tych konkretnych sekwencji, w których wyniku powstają sekwencje funkcjonalnie równoważne tym konkretnym sekwencjom, na przykład do sekwencji aminokwasowych wykazujących właściwości identyczne lub podobne do właściwości konkretnych sekwencji aminokwasowych i sekwencji kwasów nukleinowych kodujących sekwencje aminokwasowe wykazujące właściwości identyczne lub podobne do właściwości sekwencji aminokwasowych kodowanych przez konkretne sekwencje kwasów nukleinowych. Istotną właściwością jest zachowanie wiązania przeciwciała z celem lub utrzymanie funkcji efektorowych przeciwciała. Korzystnie, sekwencja modyfikowana w odniesieniu do konkretnej sekwencji, gdy zastępuje ona konkretną sekwencję w przeciwciele, zachowuje wiązanie tego przeciwciała z CLD 18 i korzystnie opisywane tu funkcje tego przeciwciała, takie jak na przykład liza zależna od CDC lub liza zależna od ADCC.

69 [0133] Specjaliści zauważą, że w szczególności sekwencje CDR, regionów hiperzmiennych i regionów zmiennych można modyfikować bez utraty zdolności do wiązania CLD 18. Regiony CDR będą na przykład identyczne lub wysoce homologiczne z regionami tu opisywanymi. Za wysoce homologiczne uważa się wprowadzenie od 1 do 5, korzystnie od 1 do 4, na przykład od 1 do 3 albo 1 lub 2 substytucje do CDR. Dodatkowo regiony hiperzmienne i regiony zmienne można modyfikować tak, żeby wykazywały znaczącą homologię z regionami tu konkretnie ujawnionymi. [0134] Należy rozumieć, że konkretne opisywane tu kwasy nukleinowe obejmują także kwasy nukleinowe modyfikowane w celu optymalizowania wykorzystania kodonów w konkretnej komórce gospodarza lub organizmie. Różnice w wykorzystaniu kodonów w organizmach mogą prowadzić do szeregu problemów dotyczących ekspresji genów heterologicznych. Optymalizacja kodonów przez zmianę jednego lub więcej niż jednego nukleotydu w sekwencji wyjściowej może powodować optymalizację ekspresji kwasu nukleinowego, zwłaszcza optymalizację skuteczności translacji u gospodarza homologicznego lub heterologicznego, u którego ma dochodzić do ekspresji tego kwasu nukleinowego. Jeżeli na przykład według niniejszego wynalazku mają być wykorzystywane kwasy nukleinowe pochodzące od człowieka, kodujące regiony stałe i(lub) regiony zrębowe przeciwciał, na przykład do wytwarzania przeciwciał chimerowych lub humanizowanych, korzystna może być modyfikacja tych kwasów nukleinowych celem optymalizacji wykorzystania kodonów, zwłaszcza jeżeli te kwasy nukleinowe,

70 ewentualnie poddane fuzji z heterologicznymi kwasami nukleinowymi na przykład z kwasami nukleinowymi pochodzącymi z innych organizmów, jak tu opisano, mają ulegać ekspresji w komórkach pochodzących z organizmu innego niż człowiek, na przykład od myszy lub chomika. Można na przykład modyfikować sekwencje kwasów nukleinowych, kodujące regiony stałe ludzkich łańcuchów lekkich i ciężkich, na przykład regionów zgodnych, odpowiednio, z SEQ ID nr 40 i 45, tak żeby zawierały jedną lub więcej, korzystnie, co najmniej 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 i korzystnie do 10, 15, 20, 25, 30, 50, 70, 100 lub więcej substytucji nukleotydów, skutkujących optymalizacją wykorzystania kodonów, lecz niepowodujących zmian sekwencji aminokwasowej. Takie substytucje nukleotydów korzystnie związane są z zamianami nukleotydów, odpowiednio, w SEQ ID nr 40 i 45, dobranymi spośród zamian ukazanych w następującym dopasowaniu, odpowiednio, SEQ ID nr 40 i 45, na ich zmodyfikowane odpowiedniki, niepowodujących zmian w kodowanej sekwencji aminokwasowej, lub dotyczą stosownych zamian w odpowiednich pozycjach w innych sekwencjach kwasów nukleinowych, kodujących, odpowiednio, regiony stałe ludzkiego łańcucha lekkiego i ciężkiego. Korzystnie, wszystkie zamiany ukazane w poniższych dopasowaniach, odpowiednio, SEQ ID nr 40 i 45, na ich zmodyfikowane odpowiedniki, niepowodujące zmian w kodowanej sekwencji aminokwasowej, skutkują sekwencjami kwasów nukleinowych kodujących, odpowiednio, regiony stałe ludzkiego łańcucha lekkiego i ciężkiego.

71 70 Dopasowanie SEQ ID nr 40 i SEQ ID nr 147:

72 71 Dopasowanie SEQ ID nr 45 i SEQ ID nr 149:

73 [0135] Ponadto według niniejszego wynalazku korzystne może być modyfikowanie opisywanych tu sekwencji aminokwasowych, zwłaszcza sekwencji ludzkich regionów stałych łańcucha ciężkiego, celem zaadaptowania sekwencji do pożądanego allotypu, na przykład allotypu występującego w populacji rasy kaukaskiej. Takie modyfikacje korzystnie dobiera się z grupy obejmującej następujące substytucje aminokwasowe w obrębie SEQ ID nr 46 lub w odpowiadających im pozycjach w obrębie innych regionów stałych ludzkiego łańcucha ciężkiego:

74 K93R, D235E i L237M. Korzystnie, wszystkie te modyfikacje wchodzą w skład sekwencji aminokwasowych regionów stałych ludzkiego łańcucha ciężkiego. [0136] Według niniejszego wynalazku termin odpowiadające pozycje odnosi się do nukleotydów lub reszt aminokwasowych, które w dopasowaniu sekwencji dwóch kwasów nukleinowych lub białek są dopasowane ze sobą. [0137] Korzystnie, stopień tożsamości między konkretną opisywaną tu sekwencją kwasu nukleinowego a sekwencją kwasu nukleinowego, który poddawany jest modyfikacji w odniesieniu do tej konkretnej sekwencji kwasu nukleinowego, będzie wynosić co najmniej 70%, korzystnie co najmniej 75%, korzystniej co najmniej 80%, jeszcze korzystniej co najmniej 90% lub najkorzystniej co najmniej 95%, 96%, 97%, 98% lub 99%. Korzystnie, obie sekwencje są zdolne do hybrydyzacji i tworzenia ze sobą stabilnego dupleksu, przy czym hybrydyzację korzystnie prowadzi się w warunkach umożliwiających swoistą hybrydyzację między polinukleotydami (warunki rygorystyczne). Warunki rygorystyczne opisano na przykład w Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook i wsp. (red.), wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 lub Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel i wsp. (red.), John Wiley & Sons Inc., New York, i oznaczają one na przykład hybrydyzację w temperaturze 65 C w buforze hybrydyzacyjnym (3,5 x SSC, 0,02% Ficoll, 0,02% poliwinylopirolidon, 0,02% bydlęca albumina surowicy, 2,5 mm NaH 2 PO 4 (ph 7), 0,5% SDS, 2 mm EDTA). SSC jest

75 to 0,15 M chlorek sodu/0,15 M cytrynian sodu o ph 7. Po hybrydyzacji błonę, na którą przeniesiono DNA, płucze się, na przykład w 2 x SSC w temperaturze pokojowej i następnie w 0,1-0,5 x SSC/0,1 x SDS w temperaturze do 68 C. [0138] Korzystnie, stopień podobieństwa, korzystnie tożsamości między konkretną opisywaną tu sekwencją aminokwasową a sekwencją aminokwasową, która jest modyfikowana w odniesieniu do tej konkretnej sekwencji aminokwasowej, na przykład między sekwencjami aminokwasowymi wykazującymi istotną homologię, będzie wynosić co najmniej 70%, korzystnie co najmniej 80%, jeszcze korzystniej co najmniej 90% lub najkorzystniej co najmniej 95%, 96%, 97%, 98% lub 99%. [0139] Wszystkie powyżej opisane sekwencje modyfikowane pozostają w zakresie niniejszego wynalazku. [0140] Podobieństwo sekwencji wskazuje odsetek aminokwasów, które są identyczne lub które odpowiadają konserwatywnym substytucjom aminokwasów. Tożsamość sekwencji między dwoma polipeptydami lub sekwencjami kwasów nukleinowych wskazuje odsetek aminokwasów lub nukleotydów, które są w tych sekwencjach identyczne. [0141] Procentową tożsamość uzyskuje się po najlepszym dopasowaniu; ten odsetek jest wartością czysto statystyczną, a różnice między obiema sekwencjami mają dystrybucję losową i są rozmieszczone na całej ich długości. Porównanie dwóch sekwencji nukleotydowych lub aminokwasowych konwencjonalnie przeprowadza się przez porównanie tych sekwencji po optymalnym ich dopasowaniu; porównanie prowadzi się segmentami lub oknami porównania w celu

76 zidentyfikowania i porównania lokalnych regionów podobieństwa sekwencji. Optymalne dopasowanie sekwencji do porównania można uzyskać oprócz metody manualnej z wykorzystaniem algorytmu lokalnej homologii Smitha i Watermana, 1981, Ads App. Math. 2, 482, z wykorzystaniem algorytmu lokalnej homologii Neddlemana i Wunscha, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, z wykorzystaniem metody poszukiwania podobieństwa Pearsona i Lipmana, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444 lub z wykorzystaniem programów komputerowych, które stosują te algorytmy (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N i TFASTA w pakiecie oprogramowania Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis., USA). [0142] Procent tożsamości oblicza się przez określenie liczby identycznych pozycji między dwiema porównywanymi sekwencjami, podzielenie tej liczby przez liczbę porównywanych pozycji i pomnożenie uzyskanego wyniku przez 100 celem uzyskania procentowej tożsamości między tymi dwiema sekwencjami. [0143] Substytucji konserwatywnych można dokonywać na przykład na podstawie podobieństwa polarności, ładunku, rozpuszczalności, hydrofobowości, hydrofilowości i(lub) amfipatyczności danych reszt. Przykłady: (a) do aminokwasów niepolarnych (hydrofobowych) należą alanina, leucyna, izoleucyna, walina, prolina, fenyloalanina, tryptofan i metionina; (b) do aminokwasów polarnych obojętnych należą glicyna, seryna, treonina, cysteina, tyrozyna, asparagina i glutamina; (c) do aminokwasów dodatnio naładowanych (zasadowych) należą arginina, lizyna i histydyna; (d)

77 do aminokwasów ujemnie naładowanych (kwasowych) należą kwas asparaginowy i kwas glutaminowy. Substytucji można typowo dokonywać w obrębie grup (a)-(d). Ponadto glicynę i prolinę można podstawiać wzajemnie za siebie na podstawie ich zdolności do zaburzania struktury alfa-helis. Kilku korzystnych substytucji można dokonywać w następujących grupach: (i) S i T; (ii) P i G; (iii) A, V, L i I. Po uwzględnieniu znanego kodu genetycznego oraz metod rekombinacji i syntezy DNA, specjalista może łatwo skonstruować DNA kodujący konserwatywne warianty aminokwasów. [0144] Niniejszy wynalazek obejmuje przeciwciała, w których dokonano zmian w regionie Fc w celu zmiany właściwości funkcjonalnych lub farmakokinetycznych przeciwciał. Takie zmiany mogą powodować osłabienie lub wzmocnienie wiązania C1q i CDC albo wiązania FcγR i ADCC. Można na przykład dokonać substytucji w jednej lub więcej niż jednej z reszt aminokwasowych regionu stałego łańcucha ciężkiego, powodując w ten sposób zmianę czynności efektorowej przy zachowaniu zdolności do wiązania z antygenem w porównaniu z przeciwciałem zmodyfikowanym - por. US 5,624,821 i US 5,648,260. [0145] Czas półtrwania przeciwciał in vivo można ulepszyć przez modyfikację epitopu receptora ratowniczego (ang. salvage) domeny stałej IgG lub Igpodobnej domeny stałej, tak aby cząsteczka nie zawierała nienaruszonej domeny CH2 ani nienaruszonego regionu Fc Ig - por. US 6,121,022 i US 6,194,551. Czas półtrwania in vivo można ponadto wydłużać przez dokonywanie mutacji w regionie Fc, na przykład przez podstawienie leucyny treoniną w pozycji 252, przez

78 podstawienie seryny treoniną w pozycji 254 lub przez podstawienie fenyloalaniny treoniną w pozycji por. US 6,277,375. [0146] Można także modyfikować wzorzec glikozylacji przeciwciał w celu zmiany funkcji efektorowej przeciwciał. Można na przykład uzyskiwać ekspresję przeciwciał w transfektomie, przez co nie dochodzi do dodawania jednostki fukozy, która jest normalnie przyłączona do Asn w pozycji 297 regionu Fc, żeby zwiększyć powinowactwo regionu Fc do receptorów Fc, co z kolei będzie powodować zwiększenie ADCC przeciwciał w obecności komórek NK - por. Shield i wsp. (2002) JBC, 277: Można ponadto dokonywać modyfikacji galaktozylacji w celu modyfikowania CDC. [0147] Zamiast tego, w innym przykładzie wykonania, można wprowadzać mutacje losowo wzdłuż całości lub części sekwencji kodującej przeciwciała anty-cld18, na przykład przez mutagenezę saturacji, a uzyskane modyfikowane przeciwciała anty-cld18 można poddawać badaniu przesiewowemu pod kątem aktywności wiązania. [0148] Termin rekombinowana komórka gospodarza (lub po prostu komórka gospodarza ) w rozumieniu niniejszego opisu ma odnosić się do komórki, do której wprowadzono rekombinowany wektor ekspresyjny. Należy rozumieć, że takie terminy mają odnosić się nie tylko do danej komórki, lecz także do jej potomstwa. Jako że w kolejnych pokoleniach mogą zachodzić pewne modyfikacje, z powodu mutacji lub wpływów środowiskowych, takie potomstwo może w istocie nie być identyczne, jak komórka rodzicielska, mimo to jednak jest objęte zakresem terminu komórka gospodarza w

79 rozumieniu niniejszego opisu. Do rekombinowanych komórek gospodarza należą na przykład transfektomy, takie jak komórki CHO, komórki NS/0 i komórki limfocytarne. [0149] W rozumieniu niniejszego opisu termin osobnik obejmuje każdego człowieka lub zwierzę inne niż człowiek. Termin zwierzę inne niż człowiek obejmuje wszystkie kręgowce, na przykład ssaki i kręgowce inne niż ssaki, takie jak naczelne inne niż człowiek, owce, psy, bydło, kury, płazy, gady itd. [0150] Termin zwierzę transgeniczne odnosi się do zwierzęcia posiadającego w genomie jeden lub więcej transgenów, korzystnie transgenów łańcucha ciężkiego i(lub) lekkiego, lub transchromosomów (zintegrowanych lub niezintegrowanych do naturalnego genomowego DNA zwierzęcia) i korzystnie zdolnego do ekspresji transgenów. Mysz transgeniczna może na przykład posiadać transgen ludzkiego łańcucha lekkiego i albo transgen ludzkiego łańcucha ciężkiego, albo transchromosom ludzkiego łańcucha ciężkiego, tak że mysz wytwarza ludzkie przeciwciała anty-cld18 po immunizacji antygenem CLD18 i(lub) komórkami wykazującymi ekspresję CLD18. Transgen ludzkiego łańcucha ciężkiego może być zintegrowany do chromosomalnego DNA myszy, jak w przypadku myszy transgenicznych, na przykład myszy HuMAb, takich jak myszy HCo7 lub HCo12, lub transgen ludzkiego łańcucha ciężkiego może być utrzymywany poza chromosomami, jak w przypadku myszy transchromosomalnych (na przykład KM), jak opisano w WO 02/ Takie myszy transgeniczne i transchromosomalne mogą być zdolne do wytwarzania wielu

80 izotypów ludzkich przeciwciał monoklonalnych przeciwko CLD18 (na przykład IgG, IgA i(lub) IgE) na drodze rekombinacji V-D-J i przełączania izotypu. Mechanizmy działania mab [0151] Jakkolwiek poniżej zawarto rozważania dotyczące mechanizmu skuteczności terapeutycznej przeciwciał według wynalazku, nie należy ich uważać za jakiekolwiek ograniczenie wynalazku. [0152] Opisywane tu przeciwciała korzystnie wchodzą w interakcję ze składowymi układu immunologicznego, korzystnie poprzez ADCC lub CDC. Przeciwciała według wynalazku można również wykorzystywać do ukierunkowywania substancji czynnych (na przykład radioizotopów, leków lub toksyn) tak, żeby bezpośrednio zabijały komórki nowotworowe lub można je stosować synergistycznie z tradycyjnymi środkami chemioterapeutycznymi, atakującymi nowotwory w komplementarnych mechanizmach działania, które mogą obejmować przeciwnowotworową odpowiedź immunologiczną, która mogła zostać osłabiona przez cytotoksyczne działanie uboczne chemioterapeutyków na limfocyty T. [0153] Cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał. ADCC oznacza zdolność komórek efektorowych do zabijania komórek, jak tu opisano, zwłaszcza limfocytów, co korzystnie wymaga oznakowania komórki docelowej przez przeciwciało. [0154] ADCC korzystnie występuje, gdy przeciwciała wiążą się z antygenami na komórkach nowotworowych, a domeny Fc przeciwciała angażują receptory Fc (FcR) na powierzchni immunologicznych komórek efektorowych. Zidentyfikowano kilka rodzin receptorów Fc; swoiste

81 populacje komórek wykazują charakterystycznie ekspresję zdefiniowanych receptorów Fc. ADCC można postrzegać jako mechanizm bezpośredniej indukcji zmiennego stopnia bezpośredniego niszczenia guza, prowadzący do prezentacji antygenu i indukcji skierowanej na nowotwór odpowiedzi komórek T. Korzystnie, indukcja ADCC in vivo będzie prowadzić do skierowanej przeciwko nowotworowi odpowiedzi komórek T i pochodzącej od gospodarza odpowiedzi przeciwciał. [0155] Cytotoksyczność zależna od dopełniacza. CDC jest to inny sposób zabijania komórek, który może być kierowany przez przeciwciała. Izotypem najskuteczniejszym do aktywacji dopełniacza jest IgM. Także IgG 1 i IgG3 są bardzo skuteczne w zakresie kierowania CDC przez klasyczny szlak aktywacji dopełniacza. Korzystnie, w tej kaskadzie tworzenie kompleksów antygen-przeciwciało powoduje odsłonięcie wielu miejsc wiązania C1q w bliskim sąsiedztwie na domenach CH2 uczestniczących cząsteczek przeciwciał, takich jak cząsteczki IgG (C1q jest jednym z trzech subkomponentów dopełniacza C1). Korzystnie, te odsłonięte miejsca wiązania C1q przekształcają interakcję C1q-IgG, wykazującą uprzednio małe powinowactwo, do interakcji o dużej awidności, co wyzwala kaskadę zdarzeń obejmujących serię innych białek dopełniacza i prowadzi do proteolitycznego uwalniania środków powodujących chemotaksję/aktywację komórek efektora - C3a i C5a. Korzystnie, kaskada dopełniacza kończy się powstaniem kompleksu atakującego błonę, który tworzy pory w błonie komórkowej,

82 ułatwiające swobodne przechodzenie wody i substancji rozpuszczonych do komórki i na zewnątrz komórki. Wytwarzanie przeciwciał [0156] Przeciwciała według wynalazku można wytwarzać rozmaitymi sposobami, w tym konwencjonalną metodologią przeciwciał monoklonalnych, na przykład standardową techniką hybrydyzacji komórek somatycznych Kohlera i Milsteina, Nature 256: 495 (1975). Jakkolwiek procedury hybrydyzacji komórek somatycznych są zasadniczo korzystne, można stosować inne metody wytwarzania przeciwciał monoklonalnych, na przykład wirusową lub onkogenną transformację limfocytów B lub techniki fagowe z wykorzystaniem biblioteki genów przeciwciał. [0157] Korzystnym układem zwierzęcym do wytwarzania hybrydom, które mają wydzielać przeciwciała monoklonalne, jest układ mysi. Wytwarzanie hybrydom u myszy jest znaną i uznaną procedurą. Protokoły immunizacji i sposoby izolowania immunizowanych splenocytów do fuzji są znane w stanie techniki. Znani są również partnerzy fuzji (na przykład mysie komórki szpiczaka) i procedury fuzji. [0158] Do innych korzystnych układów zwierzęcych do wytwarzania hybrydom wydzielających przeciwciała monoklonalne należą układ szczurzy i króliczy (opisany na przykład w Spieker-Polet i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:9348 (1995), zob. także Rossi i wsp., Am. J. Clin. Patol. 124: 295 (2005)). [0159] W jeszcze innym korzystnym przykładzie wykonania ludzkie przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko CLD 18 można wytwarzać z wykorzystaniem myszy transgenicznych lub transchromosomalnych, posiadających

83 części ludzkiego układu immunologicznego zamiast układu mysiego. Do takich myszy transgenicznych i transchromosomalnych należą, odpowiednio, myszy znane jako myszy HuMAb i myszy KM; określane są one w niniejszym zgłoszeniu wspólną nazwą myszy transgeniczne. Wytwarzanie przeciwciał ludzkich u takich myszy transgenicznych można przeprowadzać w sposób szczegółowo opisany w odniesieniu do CD20 w WO [0160] Jeszcze inną strategią wytwarzania przeciwciał monoklonalnych jest bezpośrednio izolowanie genów kodujących przeciwciała z limfocytów wytwarzających przeciwciała według zdefiniowanej strategii zob. na przykład Babcock i wsp., 1996; A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single isolated lymphocytes producing antibodies of defined strategy. Szczegóły wytwarzania przeciwciał rekombinowanych - zob. także Welschof i Kraus, Recombinant antibodies for cancer therapy ISBN i Benny K.C. Lo Antibody Engineering ISBN Immunizacja [0161] W celu wytworzenia przeciwciał przeciwko CLD18 myszy można immunizować sprzężonymi z nośnikiem peptydami pochodzącymi z sekwencji CLD 18, wzbogaconym preparatem ulegającego rekombinacyjnej ekspresji antygenu CLD18 lub jego fragmentów i(lub) komórek wykazujących ekspresję CLD18, jak opisano. Zamiast tego myszy można immunizować DNA kodującym ludzki CLD 18 o pełnej długości (na przykład SEQ ID nr 1) lub jego fragmentami, w szczególności fragmentami o SEQ ID nr 15, 17 i 19. W przypadku, gdy w wyniku immunizacji z

84 zastosowaniem oczyszczonego lub wzbogaconego preparatu antygenu CLD 18 nie uzyska się przeciwciał, myszy można także immunizować komórkami wykazującymi ekspresję CLD18, na przykład linią komórkową, w celu promocji odpowiedzi immunologicznej. [0162] Odpowiedź immunologiczną można monitorować w czasie protokołu immunizacji, pobierając próbki osocza i surowicy przez nakłucie żyły ogonowej lub splotów zaoczodołowych. Do fuzji można wykorzystywać myszy o odpowiednich mianach immunoglobuliny anty-cld18. Myszom można podawać dodatkowy bodziec immunologiczny dootrzewnowo lub dożylnie w postaci komórek wykazujących ekspresję CLD18 na 3 dni przed uśpieniem i usunięciem śledziony w celu zwiększenia ilości hybrydom wydzielających swoiste przeciwciała. Wytwarzanie hybrydom produkujących przeciwciała monoklonalne [0163] W celu wytworzenia hybrydom produkujących przeciwciała monoklonalne przeciwko CLD18, można izolować splenocyty i komórki węzłów chłonnych od immunizowanych myszy i poddawać je fuzji z odpowiednią unieśmiertelnioną linią komórkową, taką jak mysia linia komórek szpiczaka. Uzyskane hybrydomy można następnie poddawać badaniu przesiewowemu pod kątem wytwarzania przeciwciał swoistych wobec antygenu. Następnie poszczególne studzienki można poddawać badaniu przesiewowemu metodą ELISA pod kątem przeciwciał wydzielających hybrydomy. Przeciwciała o swoistości wobec CLD 18 można identyfikować metodą immunofluorescencji i analizy FACS z wykorzystaniem komórek wykazujących ekspresję CLD18. Hybrydomy

85 wydzielające przeciwciała można ponownie posiać, ponownie poddać badaniu przesiewowemu i jeżeli są nadal dodatnie w odniesieniu do przeciwciał monoklonalnych anty-cld 18 - można je subklonować przez rozcieńczenie ograniczające. Stabilne subklony można następnie hodować in vitro w celu uzyskania przeciwciała w pożywce do hodowli tkankowej, żeby móc określić jego właściwości. Wytwarzanie transfektom produkujących przeciwciała monoklonalne [0164] Przeciwciała według wynalazku można również wytwarzać w transfektomie komórki gospodarza, wykorzystując na przykład kombinację technik rekombinacji DNA i metod transfekcji genowej, które są dobrze znane w stanie techniki (Morrison, S. (1985) Science 229: 1202). [0165] W jednym z przykładów wykonania gen lub geny będące przedmiotem zainteresowania, na przykład geny przeciwciała, można na przykład poddawać ligacji do wektora ekspresyjnego, takiego jak eukariotyczny plazmid ekspresyjny, taki jak wykorzystywany przez układ ekspresji genu GS, ujawniony w WO 87/04462, WO 89/01036 i EP , lub inne układy ekspresji dobrze znane w stanie techniki. Oczyszczony plazmid ze sklonowanymi genami przeciwciała można wprowadzać do eukariotycznych komórek gospodarza, takich jak komórki CHO, komórki NS/0, komórki HEK293T lub komórki HEK293 albo lub zamiast tego do innych komórek eukariotycznych, takich jak komórki pochodzące z roślin, komórki grzybów lub drożdży. Sposobem stosowanym do wprowadzenia tych genów mogą być sposoby

86 opisane w stanie techniki, takie jak elektroporacja, zastosowanie Lipofectin, Lipofectamine lub inne. Po wprowadzeniu tych genów przeciwciał do komórek gospodarza, komórki wykazujące ekspresję przeciwciał można zidentyfikować i wybrać. Te komórki są to transfektomy, które można następnie powielać z uwagi na ich poziom ekspresji i zwiększać skalę produkcji, żeby uzyskiwać przeciwciała. Z nadsączy tych hodowli i(lub) z komórek można izolować i oczyszczać rekombinowane przeciwciała. Zamiast tego, można uzyskiwać ekspresję klonowanych genów przeciwciał w innych układach ekspresji, w tym w komórkach prokariotycznych, takich jak drobnoustroje, na przykład E. coli. Przeciwciała można także wytwarzać u zwierząt transgenicznych innych niż człowiek, na przykład w mleku od owiec i królic lub w jajach kur, albo w transgenicznych roślinach; zob. na przykład Verma, R. i wsp. (1998) J. Immunol. Meth. 216: ; Pollock i wsp. (1999) J. Immunol. Meth. 231: ; i Fischer, R. i wsp. (1999) Biol. Chem. 380: Zastosowanie częściowych sekwencji przeciwciał do ekspresji nienaruszonych przeciwciał (to znaczy humanizowania i chimeryzacji) a) Chimeryzacja [0166] Mysie przeciwciała monoklonalne można stosować jako przeciwciała terapeutyczne u ludzi, gdy są wyznakowane toksynami lub izotopami radioaktywnymi. Niewyznakowane przeciwciała mysie są wysoce immunogenne u człowieka przy wielokrotnym stosowaniu, co prowadzi do zmniejszenia efektu terapeutycznego. Główny kierunek działania immunogennego zależy od regionów stałych

87 łańcucha ciężkiego. Immunogenność przeciwciał mysich u człowieka można zmniejszyć lub całkowicie wyeliminować, jeżeli odpowiednie przeciwciała są chimeryzowane lub humanizowane. Przeciwciała chimerowe są to przeciwciała, których różne części pochodzą od różnych gatunków zwierząt, na przykład przeciwciała, których region zmienny pochodzi z przeciwciała mysiego, a region stały pochodzi z ludzkiej immunoglobuliny. Chimeryzację przeciwciał osiąga się przez połączenie regionów zmiennych mysiego łańcucha ciężkiego i lekkiego przeciwciała z regionem stałym ludzkiego łańcucha ciężkiego i lekkiego (na przykład tak, jak opisali Kraus i wsp. w serii Methods in Molecular Biology, Recombinant Antibodies for cancer therapy ISBN ). W korzystnym przykładzie wykonania przeciwciała chimerowe tworzy się przez połączenie ludzkiego regionu stałego łańcucha lekkiego kappa z mysim regionem zmiennym łańcucha lekkiego. W również korzystnym przykładzie wykonania przeciwciało chimerowe można uzyskać przez połączenie ludzkiego regionu stałego łańcucha lekkiego lambda z mysim regionem zmiennym łańcucha lekkiego. Korzystnymi regionami stałymi łańcucha ciężkiego do wytwarzania przeciwciał chimerowych są IgG 1, IgG3 i IgG4. Innymi regionami stałymi łańcucha ciężkiego korzystnymi do wytwarzania przeciwciał chimerowych są IgG2, IgA, IgD i IgM. b) Humanizacja [0167] Przeciwciała wchodzą w interakcje z antygenami docelowymi głównie poprzez reszty aminokwasowe, zlokalizowane w sześciu regionach determinujących komplementarność (CDR) łańcucha ciężkiego i lekkiego.

88 Dlatego też sekwencje aminokwasowe w obrębie CDR są bardziej odmienne w poszczególnych przeciwciałach niż sekwencje poza CDR. Jako że sekwencje CDR odpowiadają za większość interakcji przeciwciało-antygen, możliwa jest ekspresja rekombinowanych przeciwciał, które naśladują właściwości swoistych naturalnie występujących przeciwciał przez skonstruowanie wektorów ekspresyjnych, zawierających sekwencje CDR ze swoistych, naturalnie występujących przeciwciał przeszczepionych na sekwencje zrębowe z różnych przeciwciał o różnych właściwościach (zob. na przykład Riechmann, L. i wsp. (1998) Nature 332: ; Jones, P. i wsp. (1986) Nature 321: ; i Queen, C. i wsp. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86: ). Takie sekwencje zrębowe można uzyskać z publicznych baz danych DNA, obejmujących sekwencje genów przeciwciał linii zarodkowej. Te sekwencje linii zarodkowej będą różnić się od sekwencji dojrzałych genów przeciwciał, ponieważ nie będą zawierały w pełni zmontowanych genów zmiennych, które powstają na drodze łączenia V (D) J w czasie dojrzewania komórek B. Sekwencje genów linii zarodkowej będą także różnić się od sekwencji przeciwciał repertuaru drugorzędowego o dużym powinowactwie indywidualnym, równomiernie w całym regionie zmiennym. Mutacje somatyczne są na przykład względnie rzadkie w części aminokońcowej regionu zrębowego 1 i w części karboksykońcowej regionu zrębowego 4. Ponadto wiele mutacji somatycznych nie powoduje istotnej zmiany właściwości wiązania przeciwciała. Dlatego też nie jest konieczne uzyskiwanie całej sekwencji DNA danego przeciwciała,

89 żeby odtworzyć nienaruszone przeciwciało rekombinowane o właściwościach wiązania podobnych do właściwości przeciwciała wyjściowego (zob. WO 99/45962). Do tego celu wystarczające są typowo częściowe sekwencje łańcucha ciężkiego i lekkiego, obejmujące regiony CDR. Sekwencję częściową wykorzystuje się do określenia, który region zmienny linii zarodkowej i które łączące segmenty genowe przyczyniają się do powstania genów regionu zmiennego przeciwciała rekombinowanego. Następnie sekwencję linii zarodkowej wykorzystuje się do uzupełnienia brakujących części regionów zmiennych. Sekwencje liderowe łańcucha ciężkiego i lekkiego ulegają rozszczepieniu w czasie dojrzewania białka i nie przyczyniają się do właściwości ostatecznego przeciwciała. Aby dodać brakujące sekwencje, klonowane sekwencje cdna można łączyć z syntetycznymi oligonukleotydami przez ligację lub powielenie PCR. Zamiast tego można syntetyzować cały region zmienny jako zestaw krótkich, częściowo na siebie nakładających się oligonukleotydów i łączyć przez powielenie PCR, tworząc klon w pełni syntetycznego regionu zmiennego. Ten proces ma pewne zalety, takie jak eliminacja lub włączenie pewnych miejsc restrykcyjnych lub optymalizacja konkretnych kodonów. [0168] Sekwencje nukleotydowe transkryptów łańcucha ciężkiego i lekkiego z hybrydom stosuje się do opracowania zestawu częściowo nakładających się oligonukleotydów syntetycznych, żeby utworzyć syntetyczne sekwencje V o identycznej zdolności kodowania aminokwasów, jak sekwencje naturalne. Syntetyczne sekwencje łańcucha ciężkiego i łańcucha

90 kappa mogą różnić się od sekwencji naturalnych trojako: łańcuchy powtarzających się zasad nukleotydowych są przerwane, co ułatwia syntezę oligonukleotydów i powielenie PCR; włączone są optymalne miejsca inicjacji translacji według zasad Kozak (Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266: ) oraz włączone są miejsca HindIII w górę od miejsc inicjacji translacji. [0169] W przypadku regionów zmiennych zarówno łańcucha ciężkiego, jak i lekkiego, optymalizowane kodujące i odpowiadające im niekodujące sekwencje nici ulegają rozdzieleniu na odcinki po nukleotydów mniej więcej w połowie odpowiedniego oligonukleotydu niekodującego. W przypadku każdego łańcucha oligonukleotydy można zatem montować do częściowo zachodzących na siebie zestawów podwójnych nici o segmentach o długości nukleotydów. Pule stosuje się następnie jako matryce do powielania produktów PCR po nukleotydów. Typowo pojedynczy zestaw oligonukleotydów regionu zmiennego ulega podzieleniu na dwie pule, które oddzielnie powiela się, tworząc dwa częściowo nakładające się produkty PCR. Te częściowo nakładające się produkty łączy się następnie przez powielenie PCR, tworząc kompletny region zmienny. Korzystne może być także objęcie powieleniem PCR częściowo nakładającego się fragmentu regionu stałego łańcucha ciężkiego lub lekkiego, żeby uzyskać fragmenty, które można łatwo klonować do konstruktów wektora ekspresyjnego. [0170] Rekonstruowane chimeryzowane lub humanizowane regiony zmienne łańcucha ciężkiego i lekkiego łączy się następnie z klonowaną sekwencją promotorową, liderową,

91 sekwencją inicjacji translacji, regionem stałym, sekwencją niepoddaną translacji na końcu 3', sekwencją poliadenylacji i sekwencją terminacji transkrypcji, tworząc konstrukty wektora ekspresyjnego. Konstrukty ekspresji łańcucha ciężkiego i lekkiego można łączyć do jednego wektora, poddawać kotransfekcji, seryjnej transfekcji lub oddzielnej transfekcji do komórek gospodarza, gdzie ulegają one fuzji, tworząc komórkę gospodarza wykazującą ekspresję obu łańcuchów. Plazmidy do zastosowania w konstruowaniu wektorów ekspresyjnych ludzkiej IgGκ opisano poniżej. Plazmidy skonstruowano tak, żeby powielone metodą PCR sekwencje cdna V łańcucha ciężkiego i V łańcucha lekkiego kappa można było zastosować do rekonstrukcji pełnych minigenów łańcucha ciężkiego i lekkiego. Te plazmidy można stosować do ekspresji w pełni ludzkich lub chimerowych przeciwciał IgG 1 kappa lub IgG4 kappa. Można konstruować podobne plazmidy do ekspresji innych izotypów łańcuchów ciężkich lub do ekspresji przeciwciał zawierających łańcuchy lekkie lambda. [0171] Według innego aspektu wynalazku wykorzystuje się zatem cechy strukturalne przeciwciał anty-cld18 według wynalazku do wytworzenia pokrewnych strukturalnie humanizowanych przeciwciał anty-cld 18, które zachowują co najmniej jedną właściwość funkcjonalną przeciwciał według wynalazku, taką jak wiązanie z CLD18. Konkretniej, jeden lub więcej niż jeden region CDR mysich przeciwciał monoklonalnych można rekombinacyjnie łączyć ze znanymi ludzkimi regionami zrębowymi i CDR, tworząc dodatkowe, wytworzone metodami

92 rekombinacyjnymi, humanizowane przeciwciała anty-cld18 według wynalazku. Wiązanie z komórkami wykazującymi ekspresję antygenu [0172] Zdolność przeciwciała do wiązania CLD18 można określać w standardowych testach wiązania, takich jak testy przedstawione w przykładach (na przykład ELISA, immunofluorescencja Western Blot i analiza metodą cytometrii przepływowej) Określanie charakterystyki wiązania przeciwciał [0173] Celem oczyszczenia przeciwciał anty-cld18, wybrane hybrydomy można hodować w dwulitrowych butlach zapewniających napowietrzenie (ang. spinner-flasks) do oczyszczania przeciwciał monoklonalnych. Zamiast tego, przeciwciała anty-cld18 można wytwarzać w bioreaktorach dializacyjnych. Nadsącze można filtrować i, jeżeli jest to niezbędne, zatężać przed przeprowadzeniem chromatografii powinowactwa z białkiem G-Sepharose lub białkiem A-Sepharose. Eluowaną IgG można sprawdzać poprzez elektroforezę w żelu i chromatografię cieczową wysokosprawną, żeby zapewnić jej oczyszczenie. Roztwór buforowy można wymieniać do PBS i określać stężenie przy OD280, stosując współczynnik ekstynkcji 1,43. Z przeciwciał monoklonalnych można pobierać próbki i przechowywać je w temperaturze -80 C. [0174] Do ustalenia, czy wybrane przeciwciała monoklonalne anty-cld18 wiążą się z unikalnymi epitopami, można stosować mutagenezę ukierunkowaną na miejsce lub ukierunkowaną na wiele miejsc. Określanie izotypu [0175] W celu ustalenia izotypu oczyszczonych przeciwciał można wykonać testy ELISA izotypu z

93 wykorzystaniem różnych dostępnych w handlu zestawów (na przykład Zymed, Roche Diagnostics). Studzienki płytek do mikromiareczkowania można powlekać antymysią Ig. Po zablokowaniu płytki poddaje się reakcji z przeciwciałami monoklonalnymi lub oczyszczonymi kontrolami izotypów w temperaturze otoczenia przez 2 godziny. Następnie studzienki poddaje się reakcji z mysią IgG 1, IgG2a IgG2b lub IgG3, IgA lub swoistymi dla IgM sondami sprzężonymi z peroksydazą. Po przepłukaniu płytki można wywoływać z zastosowaniem substratu ABTS (1 mg/ml) i analizować przy OD Zamiast tego można stosować zestaw do izotypowania IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody (Roche, nr kat ) według instrukcji producenta. Analiza metodą cytometrii przepływowej [0176] W celu wykazania obecności przeciwciał anty- CLD18 w surowicy immunizowanych myszy lub wiązania przeciwciał monoklonalnych z żywymi komórkami wykazującymi ekspresję CLD 18, można stosować cytometrię przepływową. Linie komórkowe wykazujące ekspresję naturalnie lub po transfekcji CLD18 i kontrole ujemne, pozbawione ekspresji CLD18 (hodowane w standardowych warunkach wzrostu), można mieszać z przeciwciałami monoklonalnymi w różnym stężeniu w nadsączach hybrydomy lub w PBS zawierającym 1% FBS i można je inkubować w temperaturze 4 C przez 30 min. Po przepłukaniu wyznakowane APC lub Alexa647 przeciwciało anty-igg może wiązać się z przeciwciałem monoklonalnym związanym z CLD18 w tych samych warunkach, jak przy barwieniu przeciwciała pierwszorzędowego. Próbki można analizować metodą cytometrii przepływowej za pomocą

94 instrumentu FACS, stosując właściwości rozpraszania światła w bok do bramkowania pojedynczych żywych komórek. W celu odróżnienia przeciwciał monoklonalnych swoistych wobec CLD18 od substancji wiążących się nieswoiście w pojedynczym pomiarze można zastosować metodę kotransfekcji. Komórki przejściowo transfekowane plazmidami kodującymi CLD18 i marker fluorescencyjny można barwić w sposób opisany powyżej. Transfekowane komórki można wykrywać w kanale fluorescencyjnym innym niż komórki zabarwione przeciwciałem. Jako że większość transfekowanych komórek wykazuje ekspresję obu transgenów, swoiste wobec CLD18 przeciwciała monoklonalne wiążą się preferencyjnie z komórkami wykazującymi ekspresję markera fluorescencji, natomiast przeciwciała nieswoiste wiążą się w porównywalnym stosunku z komórkami nietransfekowanymi. Oprócz lub zamiast testu cytometrii przepływowej można stosować test alternatywny z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej. Komórki można barwić dokładnie w sposób opisany powyżej i badać metodą mikroskopii fluorescencyjnej. [0177] Obwódka zamykająca białka ulega zazwyczaj internalizacji, jeżeli dochodzi do utraty kontaktu między sąsiadującymi szczególnie adherentnych komórek, na przykład wskutek odwarstwienia komórek. Ekspresję powierzchniową CLD18 można optymalizować przez a) dostosowanie warunków hodowli, na przykład przez hodowlę z dużą gęstością komórek w sposób wystandaryzowany, z wykorzystaniem delikatnego odwarstwiania (na przykład 2mM EDTA/PBS lub akutaza), z obróbką w temperaturze pokojowej i dodaniem inhibitorów

95 endocytozy (na przykład azydku sodu) lub aktywatorów transkrypcji lub translacji CLD18 i przez b) selekcję i klonowanie komórek utrzymujących wysoki poziom CLD18 na powierzchni komórek, na przykład poprzez selekcję antybiotykami w odniesieniu do transfekowanych komórek, przez sortowanie komórek immunomagnetyczne lub metodą FACS i przez klonowanie z użyciem ograniczonego rozcieńczenia. Mikroskopia immunofluorescencyjna [0178] W celu wykazania obecności przeciwciał anty- CLD18 w surowicy immunizowanych myszy lub wiązania przeciwciał monoklonalnych z żywymi komórkami wykazującymi ekspresję CLD18, można stosować analizę metodą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Hoduje się na przykład linie komórkowe wykazujące ekspresję samoistnie lub po transfekcji CLD18 i kontrole ujemne pozbawione ekspresji CLD18 w płytkach Chamber Slide w standardowych warunkach wzrostu w pożywce DMEM/F12, z dodatkiem 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS), 2 mm L- glutaminy, 100 IU/ml penicyliny i 100 g/ml streptomycyny. Następnie komórki można utrwalać metanolem lub paraformaldehydem albo pozostawiać bez żadnej obróbki. Następnie komórki można poddawać reakcji z przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko CLD18 przez 30 min w temperaturze 25 C. Po przepłukaniu komórki można poddawać reakcji z wyznakowanym Alexa555 antymysim przeciwciałem drugorzędowym IgG (Molecular Probes) w tych samych warunkach. Następnie komórki można oceniać metodą mikroskopii fluorescencyjnej. [0179] Całkowity poziom CLD18 w komórkach można obserwować, gdy komórki są utrwalone w metanolu lub w

96 paraformaldehydzie i permeabilizowane Triton X-100. W komórkach żywych i niepermeabilizowanych można oceniać lokalizację powierzchniową CLD 18 w komórkach utrwalonych paraformaldehydem. Dodatkowo ukierunkowanie CLD18 na obwódki zamykające można analizować przez jednoczesne barwienie markerami obwódki zamykającej, takimi jak ZO-1. Można poza tym oceniać efekty wiązania przeciwciała i lokalizację CLD18 w obrębie błony komórkowej. Western Blot [0180] IgG anty-cld18 można poddawać dalszym testom na reaktywność z antygenem CLD 18 metodą Western Blotting. Pokrótce, można wytwarzać ekstrakty komórkowe z komórek wykazujących ekspresję CLD18 i odpowiednie kontrole ujemne i poddawać je elektroforezie w żelu poliakrylamidowym z użyciem żelu soli sodowej siarczanu dodecylowego (SDS). Po elektroforezie oddzielone antygeny będą przenoszone na błony nitrocelulozowe, blokowane i sondowane badanymi przeciwciałami monoklonalnymi. Wiązanie IgG można wykrywać, stosując wyznakowaną peroksydazą antymysią IgG i wywoływać wiązanie przy użyciu substratu ECL. Analizy immunohistochemiczne [0181] Mysie IgG przeciwko CLD18 można poddawać dalszym badaniom pod kątem reaktywności z antygenem CLD18 metodami immunohistochemicznymi w sposób dobrze znany specjaliście, na przykład z użyciem utrwalonych paraformaldehydem lub acetonem krioskrawków lub zatopionych w parafinie skrawków tkanek utrwalonych paraformaldehydem, pochodzących z tkanek nienowotworowych lub próbek tkanek nowotworowych,

97 uzyskanych od pacjentów w czasie rutynowych procedur chirurgicznych lub od myszy z przeszczepami ksenogenicznymi guzów, po inokulacji liniami komórkowymi wykazującymi samoistnie (na przykład DAN-G, SNU-16 lub KATO-III) lub po transfekcji (na przykład HEK293) ekspresję CLD18. Do immunobarwienia, przeciwciała reagujące z CLD18 można następnie inkubować ze sprzężonymi z peroksydazą chrzanową kozimi przeciwciałami antymysimi lub kozimi przeciwciałami antykróliczymi (DAKO) według instrukcji dostawcy. Aktywność fagocytarna i aktywność zabijania komórek przez przeciwciała in vitro [0182] Oprócz swoistego wiązania z CLD18, przeciwciała anty-cld18 można badać pod kątem ich zdolności do pośredniczenia w fagocytozie i zabijaniu komórek wykazujących ekspresję CLD 18. Analiza aktywności przeciwciał monoklonalnych in vitro zapewni wstępne badanie przesiewowe przed oceną w modelach in vivo. Cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał (ADCC): [0183] Pokrótce, komórki cechujące się różnokształtnością jąder komórkowych (PMN), komórki NK, monocyty, komórki jednojądrzaste lub inne komórki efektorowe od zdrowych dawców można oczyszczać przez odwirowanie w gradiencie gęstości Ficoll Hypaque i następnie lizę zanieczyszczających erytrocytów. Przepłukane komórki efektorowe można zawieszać w RPMI z dodatkiem 10% unieczynnionej cieplnie płodowej surowicy cielęcej lub zamiast tego z 5% unieczynnionej cieplnie surowicy ludzkiej i mieszać z wyznakowanymi 51 Cr komórkami docelowymi wykazującymi ekspresję CLD18, w

98 różnym stosunku komórek efektorowych do komórek docelowych. Zamiast tego, komórki docelowe można znakować ligandem wzmagającym fluorescencję (BATDA). Wysoce fluorescencyjny chelat europu z ligandem wzmagającym, uwalniany z martwych komórek, można mierzyć za pomocą fluorometru. W innej alternatywnej metodzie można wykorzystywać transfekcję komórek docelowych lucyferazą. Dodana żółcień lucyferowa może być następnie utleniana tylko przez żywe komórki. Następnie można dodawać oczyszczone IgG anty-cld18 w różnym stężeniu. Jako kontrolę ujemną można stosować nieistotną ludzką IgG. Testy można prowadzić przez czas od 4 do 20 godzin w temperaturze 37 C w zależności od typu stosowanej komórki efektorowej. Próbki można poddawać testom na cytolizę przez pomiar uwalniania 51 Cr lub obecności chelatu EuTDA w nadsączu hodowli. Zamiast tego, miarą żywych komórek może być luminescencja wynikająca z utleniania żółcieni lucyferowej. [0184] Przeciwciała monoklonalne anty-cld18 można również badać w różnych kombinacjach, żeby stwierdzić, czy cytoliza ulega wzmocnieniu przy stosowaniu wielu przeciwciał monoklonalnych. Cytotoksyczność zależna od dopełniacza (CDC): [0185] Przeciwciała monoklonalne anty-cld18 można badać pod kątem ich zdolności do pośredniczenia w CDC, stosując rozmaite znane metody. Surowicę do dopełniacza można na przykład uzyskać z krwi w sposób znany specjaliście. Do określenia aktywności CDC mab można stosować różne metody. Można na przykład mierzyć uwalnianie 51 Cr lub podwyższenie przenikalności błony,

99 stosując test wykluczenia z użyciem jodku propidyny (PI). Pokrótce, komórki docelowe można płukać i 5 x 10 5 /ml komórek można inkubować z mab w różnym stężeniu przez min w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 37 C. Następnie można dodawać surowicę lub osocze do ostatecznego stężenia 20% (obj./obj.) i komórki inkubować w temperaturze 37 C przez min. Wszystkie komórki z każdej próbki można dodawać do roztworu PI w tubie FACS. Mieszaninę można następnie natychmiast analizować metodą cytometrii przepływowej, stosując FACSArray. [0186] W alternatywnym teście indukcję CDC można oznaczać na komórkach adherentnych. W jednym z przykładów wykonania tego testu komórki posiewa się na 24 h przed testem z gęstością 3 x 10 4 /studzienkę w płaskodennych płytkach do mikromiareczkowania, do hodowli tkankowej. Następnego dnia usuwa się pożywkę wzrostową i komórki inkubuje się w trzech egzemplarzach z przeciwciałami. Komórki kontrolne inkubuje się, odpowiednio, z pożywką wzrostową lub pożywką wzrostową zawierającą 0,2% saponiny celem oznaczenia, odpowiednio, lizy tła i lizy maksymalnej. Po inkubacji przez 20 min w temperaturze pokojowej nadsącz usuwa się, do komórek dodaje się 20% (obj./obj.) ludzkiego osocza lub surowicy w DMEM (ogrzanych wstępnie do temperatury 37 C) i inkubuje się przez kolejne 20 min w temperaturze 37 C. Wszystkie komórki z każdej próbki dodaje się do roztworu jodku propidyny (10 g/ml). Następnie nadsącze zastępuje się PBS zawierającym 2,5 g/ml bromku etydowego i mierzy się emisję fluorescencji po pobudzeniu przy 520 nm w 600 nm za

100 pomocą Tecan Safire. Odsetek lizy swoistej oblicza się następująco: % liza swoista = (fluorescencja próbki - fluorescencja tła)/ (fluorescencja lizy maksymalna - fluorescencja tła) x 100. Hamowanie proliferacji komórek przez przeciwciała monoklonalne: [0187] Celem badania zdolności do zapoczątkowywania apoptozy, przeciwciała monoklonalne anty-cld18 można na przykład inkubować z CLD18-dodatnimi komórkami nowotworowymi, takimi jak na przykład komórki nowotworowe transfekowane SNU-16, DAN-G, KATO-III lub CLD18 w temperaturze 37 C przez około 20 godzin. Komórki można zebrać, przepłukać w buforze wiązania Annexin V (BD Biosciences) i inkubować z Annexin V sprzężonym z FITC lub APC (BD Biosciences) przez 15 min w ciemności. Wszystkie komórki z każdej próbki można dodawać do roztworu PI (10 g/ml w PBS) w tubie FACS i natychmiast oceniać metodą cytometrii przepływowej (jak wyżej). Zamiast tego można wykrywać ogólne hamowanie proliferacji komórkowej przez przeciwciała monoklonalne przy zastosowaniu zestawów dostępnych na rynku. Zestaw DELFIA Cell Proliferation Kit (Perkin-Elmer, nr kat. AD0200) jest to immunotest nieizotopowy, oparty na pomiarze włączania 5-bromo-2'-deoksyurydyny (BrdU) w czasie syntezy DNA komórek proliferujących w mikropłytkach. Włączone BrdU wykrywa się, stosując wyznakowane europem przeciwciało monoklonalne. Aby umożliwić wykrywanie przeciwciała, komórki utrwala się, a DNA denaturuje się, stosując roztwór Fux. Niezwiązane przeciwciało wymywa się i dodaje się induktor DELFIA, aby oddysocjować jony europu od wyznakowanego

101 przeciwciała do roztwory, gdzie tworzą one wysoce fluorescencyjne chelaty ze składowymi induktora DELFIA. Zmierzona fluorescencja pomiaru dokonuje się z wykorzystaniem do detekcji fluorometrii czasoworozdzielczej jest proporcjonalna do syntezy DNA w komórce z każdej studzienki. Badania przedkliniczne [0188] Przeciwciała monoklonalne, które wiążą się z CLD18, można również badać w modelu in vivo (na przykład u myszy z niedoborami odporności, z ksenogenicznymi przeszczepami guzów, po inokulacji linii komórkowych wykazujących ekspresję CLD18, na przykład DAN-G, SNU-16 lub KATO-III, lub po transfekcji, na przykład HEK293), aby określić ich skuteczność w zakresie regulowania wzrostu komórek nowotworowych wykazujących ekspresję CLD 18. [0189] Z użyciem przeciwciał według wynalazku można przeprowadzić badania in vivo po przeszczepieniu ksenogenicznym wykazujących ekspresję CLD 18 komórek nowotworowych do organizmów myszy lub innych zwierząt z niedoborami odporności. Przeciwciała można podawać myszom wolnym od guza i następnie można wstrzykiwać komórki nowotworowe, aby zmierzyć efekty przeciwciał w zakresie zapobiegania tworzeniu się guzów lub pojawianiu objawów związanych z guzem. Przeciwciała można podawać myszom z guzem, żeby określić skuteczność terapeutyczną danych przeciwciał w zakresie zmniejszania wzrostu guza, pojawiania się przerzutów lub objawów związanych z guzem. Zastosowanie przeciwciała można kojarzyć ze stosowaniem innych substancji, takich jak leki cystostatyczne, inhibitory

102 czynnika wzrostu, blokery cyklu komórkowego, inhibitory angiogenezy lub inne przeciwciała, żeby określić skuteczność synergistyczną i potencjalną toksyczność kombinacji. W celu przeprowadzenia analizy toksycznych objawów niepożądanych przeciwciał według wynalazku zwierzęta można poddać inokulacji przeciwciałami lub odczynnikami kontrolnymi i dokładnie zbadać pod kątem objawów, które mogą być związane z terapią przeciwciałem przeciwko CLD18. Do możliwych objawów ubocznych zastosowania in vivo przeciwciał przeciwko CLD18 należą zwłaszcza toksyczność w odniesieniu do tkanek wykazujących ekspresję CLD18, takich jak żołądek i płuca. Przeciwciała rozpoznające CLD18 u ludzi i u innych gatunków, na przykład myszy, są szczególnie użyteczne do przewidywania potencjalnych efektów ubocznych zastosowania monoklonalnych przeciwciał przeciwko CLD18 u ludzi. Mapowanie epitopów [0190] Mapowanie epitopów rozpoznawanych przez przeciwciała według niniejszego wynalazku można przeprowadzać w sposób szczegółowo opisany w Epitope Mapping Protocols (Methods in Molecular Biology) przez Glenn E. Morris ISBN i w Epitope Mapping: A Practical Approach, Practical Approach Series, 248, autorstwa Olwyn M. R. Westwood, Frank C. Hay. I. Cząsteczki dwuswoiste/wieloswoiste, które wiążą się z CLD18 [0191] W jeszcze innym przykładzie wykonania wynalazku, z przeciwciał przeciwko CLD18 można wytwarzać pochodne lub można je łączyć z inną cząsteczką funkcjonalną, na przykład z innym peptydem lub białkiem (na przykład

103 fragmentem Fab'), żeby uzyskać cząsteczkę dwuswoistą lub wieloswoistą, które wiąże się z wieloma miejscami wiązania lub epitopami docelowymi. Przeciwciało według niniejszego wynalazku może na przykład być funkcjonalnie połączone (na przykład przez sprzęganie chemiczne, fuzję genetyczną, łączenie niekowalencyjne lub inaczej) z jedną lub więcej niż jedną cząsteczką wiążącą, taką jak inne przeciwciało, peptyd lub mimetyk wiązania. [0192] Zgodnie z tym, niniejszy wynalazek obejmuje cząsteczki dwuswoiste i wieloswoiste, wykazujące co najmniej jedną pierwszą swoistość wiązania wobec CLD18 i drugą swoistość wiązania wobec drugiego epitopu docelowego. W szczególnym przykładzie wykonania wynalazku drugim epitopem docelowym jest receptor Fc, na przykład ludzki Fc-gammaRI (CD64) lub ludzki Fc-alfa receptor (CD89) lub receptor komórek T, na przykład CD3. Wynalazek obejmuje zatem cząsteczki dwuswoiste i wieloswoiste zdolne do wiązania się z komórkami efektorowymi wykazującymi ekspresję Fc-gammaR, Fc-alfaR lub Fc-epsilonR (takimi jak na przykład monocyty, makrofagi lub komórki cechujące się różnokształtnością jąder komórkowych (PMN)) i z komórkami docelowymi wykazującymi ekspresję CLD18. Te cząsteczki dwuswoiste i wieloswoiste mogą ukierunkowywać komórki docelowe wykazujące ekspresję CLD18 na komórki efektorowe i mogą wyzwalać aktywności komórek efektorowych zależne od receptora Fc, takie jak fagocytoza komórek wykazujących ekspresję CLD18, cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał (ADCC), uwalnianie cytokin lub wytwarzanie anionu nadtlenkowego.

104 [0193] Cząsteczki dwuswoiste i wieloswoiste według wynalazku mogą ponadto wykazywać trzecią swoistość wiązania, oprócz swoistości wiązania anty-fc i swoistości wiązania anty-cld18. W jednym z przykładów wykonania trzecia swoistość wiązania jest to część przeciwko czynnikowi wzmagającemu (EF), na przykład cząsteczka, które wiąże się z białkiem powierzchniowym odgrywającym rolę w aktywności cytotoksycznej i przez to zwiększa odpowiedź immunologiczną przeciwko komórce docelowej. Częścią przeciwko czynnikowi wzmagającemu może być przeciwciało, funkcjonalny fragment przeciwciała lub ligand, który wiąże się z daną cząsteczką, na przykład antygenem lub receptorem, i powoduje przez to nasilenie efektu determinant wiązania z receptorem receptor lub antygenem komórki docelowej. Część przeciwko czynnikowi wzmagającemu może wiązać się z receptorem Fc lub antygenem komórki docelowej. Zamiast tego, część przeciwko czynnikowi wzmagającemu może wiązać się z jednostką różną od jednostki, z którą wiążą się swoistości wiązania pierwsza i druga. Część przeciwko czynnikowi wzmagającemu może na przykład wiązać się z cytotoksyczną komórką T (poprzez na przykład CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 lub inne komórki immunologiczne, powodujące nasilenie odpowiedzi immunologicznej przeciwko komórce docelowej). [0194] W jednym z przykładów wykonania cząsteczki dwuswoiste i wieloswoiste według wynalazku zawierają jako swoistość wiązania co najmniej jedno przeciwciało, w tym na przykład Fab, Fab', F(ab')2, Fv lub jednołańcuchowe Fv. Przeciwciało może być także dimerem

105 łańcucha lekkiego lub ciężkiego albo dowolnym jego minimalnym fragmentem, takim jak Fv lub konstrukt jednołańcuchowy, jak opisano w Ladner i wsp., US 4,946,778. Przeciwciało może być także białkiem fuzyjnym domeny wiązania immunoglobuliny, jak ujawniono w US2003/ i US 2003/ [0195] W jednym z przykładów wykonania cząsteczki dwuswoiste i wieloswoiste według wynalazku wykazują swoistość wiązania Fc-gammaR lub Fc-alfaR obecnego na powierzchni komórki efektorowej i drugą swoistość wiązania antygenu komórki docelowej, na przykład CLD18. [0196] W jednym z przykładów wykonania swoistość wiązania z receptorem Fc zapewnia przeciwciało monoklonalne, którego wiązanie nie jest blokowane przez ludzką immunoglobulinę G (IgG). W rozumieniu niniejszego opisu termin receptor IgG odnosi się do dowolnego z ośmiu genów łańcucha gamma, zlokalizowanych na chromosomie 1. Te geny kodują w sumie 12 izoform receptora przezbłonowego lub rozpuszczalnego, które są pogrupowane na trzy klasy receptorów Fc-gamma: FcgammaRI (CD64), Fc-gammaRII (CD32) i Fc-gammaRIII (CD 16). W jednym z korzystnych przykładów wykonania receptor Fc-gamma jest to ludzki Fc-gammaRI o dużym powinowactwie. [0197] Wytwarzanie i określanie charakterystyki tych korzystnych przeciwciał monoklonalnych opisali Fanger i wsp. w WO 88/00052 i w US 4,954,617. Te przeciwciała wiążą się z epitopem Fc-gammaRI, Fc-gammaRII lub FcgammaγRIII w miejscu, które jest odrębne od miejsca wiązania receptora Fcγ, ich wiązanie nie ulega zatem istotnemu blokowaniu przez fizjologiczny poziom IgG.

106 Swoistymi przeciwciałami anty-fc-gammari użytecznymi według niniejszego wynalazku są mab 22, mab 32, mab 44, mab 62 i mab 197. W innych przykładach wykonania przeciwciało przeciwko receptorowi Fcγ jest humanizowaną postacią monoklonalnego przeciwciała 22 (H22). Wytwarzanie i określanie charakterystyki przeciwciała H22 opisano w Graziano, R. F. i wsp. (1995) J. Immunol. 155 (10): i WO 94/ Linia komórkowa wytwarzająca przeciwciało H22 została złożona w American Type Culture Collection 4 listopada 1992 pod oznaczeniem HA022CL1; jej numer akcesyjny to CRL [0198] W jeszcze innych korzystnych przykładach wykonania swoistość wiązania z receptorem Fc zapewnia się przez przeciwciało, które wiąże się z ludzkim receptorem IgA, na przykład receptorem Fc-alfa (FcalfaRI (CD89)), którego wiązanie korzystnie nie ulega zablokowaniu przez ludzką immunoglobulinę A (IgA). Termin receptor IgA ma obejmować produkt genowy genu alfa (Fc-alfaRI) znajdujący się na chromosomie 19. Wiadomo, że ten gen koduje kilka przezbłonowych izoform o alternatywnym splicingu i wielkości od 55 do 110 kda. Fc-alfaRI (CD89) ulega konstytutywnej ekspresji na monocytach/makrofagach, granulocytach kwasochłonnych i obojętnochłonnych, lecz nie na populacjach komórek nieefektorowych. Fc-alfaRI wykazuje średnie powinowactwo zarówno do IgA1, jak i do IgA2; zwiększa się ono po ekspozycji na cytokiny, takie jak G-CSF lub GM-CSF (Morton, H. C. i wsp. (1996) Critical Reviews in Immunology 16: ). Opisano cztery przeciwciała monoklonalne swoiste wobec Fc-alfaRI, zidentyfikowane

107 jako A3, A59, A62 i A77, która wiążą Fc-alfaRI poza domeną wiążącą ligand IgA (Monteiro, R. C. i wsp. (1992) J.Immunol. 148: 1764). [0199] Fc-alfaRI i Fc-gammaRI są korzystnymi receptorami wyzwalającymi do zastosowania według niniejszego wynalazku, ponieważ (1) ulegają one ekspresji głównie na immunologicznych komórkach efektorowych, na przykład monocytach, PMN, makrofagach i komórkach dendrytycznych; (2) ulegają ekspresji na wysokim poziomie (na przykład na komórkę); (3) są mediatorami aktywności cytotoksycznych (na przykład ADCC, fagocytoza); (4) pośredniczą w zwiększonej prezentacji antygenów, w tym antygenów własnych, które są przeciw nim skierowane. [0200] W innym przykładzie wykonania cząsteczka dwuswoista składa się z dwóch przeciwciał monoklonalnych według wynalazku, wykazujących komplementarne właściwości funkcjonalne, takich jak jedno przeciwciało działające głównie poprzez indukowanie CDC i drugie przeciwciało działające głównie poprzez indukowanie apoptozy. [0201] Określenie przeciwciało swoiste wobec komórki efektorowej w rozumieniu niniejszego opisu odnosi się do przeciwciała lub funkcjonalnego fragmentu przeciwciała, które wiąże receptor Fc komórek efektorowych. Korzystne przeciwciała do zastosowania według niniejszego wynalazku wiążą receptor Fc komórek efektorowych w miejscu, które nie wiąże się z immunoglobuliną endogenną. [0202] W rozumieniu niniejszego opisu, termin komórka efektorowa odnosi się do komórki immunologicznej,

108 uczestniczącej w fazie efektorowej odpowiedzi immunologicznej, w przeciwieństwie do faz rozpoznawania i aktywacji odpowiedzi immunologicznej. Do przykładowych komórek immunologicznych należą komórki pochodzenia mieloidalnego lub limfoidalnego, na przykład limfocyty (na przykład komórki B i komórki T, w tym cytolityczne komórki T (CTL), komórki-zabójcy, komórki naturalni zabójcy (NK), makrofagi, monocyty, eozynofile, neutrofile, komórki cechujące się różnokształtnością jąder komórkowych, granulocyty, komórki tuczne i bazofile. Niektóre komórki efektorowe wykazują ekspresję swoistych receptorów Fc i pełnią swoiste funkcje immunologiczne. W korzystnych przykładach wykonania komórka efektorowa jest zdolna do indukowania cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC), na przykład jest to neutrofil zdolny do indukowania ADCC. Komórki takie, jak na przykład monocyty czy makrofagi wykazujące ekspresję FcR, uczestniczą w swoistym zabijaniu komórek docelowych i prezentacji antygenów innym składowym układu immunologicznego lub wiązaniu z komórkami prezentującymi antygeny. W innych przykładach wykonania komórka efektorowa może fagocytować antygen docelowy, komórkę docelową lub drobnoustrój. Ekspresję konkretnego FcR na komórce efektorowej można regulować czynnikami humoralnymi, takimi jak cytokiny. Stwierdzono na przykład, że ekspresja Fc-gammaRI ulega regulacji w górę pod wpływem interferonu gamma (IFN-γ). Ta wzmożona ekspresja zwiększa aktywność cytotoksyczną zawierających Fc-gammaRI komórek przeciwko celom.

109 Komórka efektorowa może poddawać fagocytozie lub lizie antygen docelowy lub komórkę docelową. [0203] Komórka docelowa ma oznaczać dowolną niepożądaną komórkę u osobnika (na przykład człowieka lub zwierzęcia), na którą można ukierunkować przeciwciało według wynalazku. W korzystnych przykładach wykonania komórka docelowa jest to komórka wykazująca ekspresję lub nadmierną ekspresję CLD 18. Do komórek wykazujących ekspresję CLD 18 należą typowo komórki nowotworowe. [0204] Cząsteczki dwuswoiste i wieloswoiste według niniejszego wynalazku można wytwarzać metodami chemicznymi (zob. na przykład D. M. Kranz i wsp. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5807), metodami polidoma (zob. US 4,474,893 na nazwisko Reading) lub metodami rekombinacji DNA. [0205] W szczególności, cząsteczki dwuswoiste i wieloswoiste według niniejszego wynalazku można wytwarzać przez sprzęganie składników swoistości wiązania, na przykład swoistości wiązania anty-fcr i anty-cld18, metodami znanymi w stanie techniki. Każdą swoistość wiązania cząsteczki dwuswoistej i wieloswoistej można na przykład wytwarzać oddzielnie i następnie sprzęgać ze sobą nawzajem. Gdy swoistościami wiązania są białka lub peptydy, można stosować rozmaite środki do sprzęgania lub sieciowania celem uzyskania sprzęgania kowalencyjnego. Do przykładów środków sieciujących należą białko A, karbodiimid, N- sukcynoimidylo-s-acetylo-tiooctan (SATA), kwas 5,5'- ditiobis(2-nitrobenzoesowy) (DTNB), o- fenylenodimaleimid (op-dm), N-sukcynoimidylo-3-(2-

110 pirydyloditio)propionian (SPDP) i sulfosukcynoimidylo- 4-(N-maleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylan (sulfo- SMCC) (zob. na przykład Karpovsky i wsp. (1984) J. Exp. Med. 160: 1686; Liu, MA i wsp. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 8648). Do innych metod należą metody opisane przez Paulus (Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78, ); Brennan i wsp. (Science (1985) 229: 81-83) i Glennie i wsp. (J. Immunol. (1987) 139: ). Korzystnymi środkami sprzęgającymi są SATA i sulfo-smcc oba te środki są dostępne w firmie Pierce Chemical Co. (Rockford, IL, USA). [0206] Gdy swoistościami wiązania są przeciwciała, można je sprzęgać mostkami sulfhydrylowymi C-końcowych regionów zawiasowych obu łańcuchów ciężkich. W szczególnie korzystnym przykładzie wykonania region zawiasowy modyfikuje się tak, żeby przed sprzęganiem zawierał nieparzystą liczbę reszt sulfhydrylowych, korzystnie jedną. [0207] Zamiast tego, obie swoistości wiązania mogą być kodowane w tym samym wektorze i ulegać ekspresji i składaniu w tej samej komórce gospodarza. Sposób ten jest szczególnie użyteczny wtedy, gdy cząsteczką dwuswoistą i wieloswoistą jest mab x mab, mab x Fab, Fab x F(ab')2 lub ligand x Fab białko fuzyjne. Cząsteczka dwuswoista i wieloswoista według wynalazku, na przykład cząsteczka dwuswoista, może być cząsteczką jednołańcuchową, taką jak jednołańcuchowe przeciwciało dwuswoiste, jednołańcuchowa cząsteczka dwuswoista, zawierająca jedno przeciwciało jednołańcuchowe i determinantę wiązania lub jednołańcuchowa cząsteczka dwuswoista zawierająca dwie determinanty wiązania.

111 Cząsteczki dwuswoiste i wieloswoiste mogą być także cząsteczkami jednołańcuchowymi lub mogą zawierać co najmniej dwie cząsteczki jednołańcuchowe. Sposoby wytwarzania cząsteczek dwuswoistych i wieloswoistych opisano na przykład w US 5,260,203; US 5,455,030; US 4,881,175; US 5,132,405; US 5,091,513; US 5,476,786; US 5,013,653; US 5,258,498 i US 5,482,858. [0208] Wiązanie cząsteczek dwuswoistych i wieloswoistych z ich swoistymi celami można potwierdzić w enzymatycznym teście immunoabsorbcyjnym (ELISA), teście radioimmunologicznym (RIA), analizie FACS, teście biologicznym (na przykład hamowanie wzrostu) lub teście Western Blot. Każdy z tych testów ogólnie wykrywa obecność kompleksów białko-przeciwciało będących przedmiotem szczególnego zainteresowania poprzez wykorzystanie wyznakowanego odczynnika (na przykład przeciwciała) swoistego wobec kompleksu będącego przedmiotem zainteresowania. Kompleksy FcRprzeciwciało można na przykład wykrywać, stosując połączone z enzymem przeciwciało lub fragment przeciwciała, który rozpoznaje i swoiście wiąże kompleksy przeciwciało-fcr. Zamiast tego, kompleksy można wykrywać, stosując wiele innych testów immunologicznych. Przeciwciało można na przykład znakować radioaktywnie i stosować w teście radioimmunologicznym (RIA) (zob. na przykład Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, marzec 1986). Izotop radioaktywny można wykrywać takimi sposobami, jak zastosowanie licznika

112 gamma lub licznika scyntylacyjnego albo przez autoradiografię. II. Immunokoniugaty [0209] W innym aspekcie, przedmiotem niniejszego wynalazku jest przeciwciało anty-cld18 sprzężone z cząstką lub środkiem terapeutycznym, takim jak cytotoksyna, lek (na przykład immunosupresant) lub radioizotop. Takie koniugaty określa się w niniejszym zgłoszeniu jako immunokoniugaty. Immunokoniugaty zawierające jedną lub więcej niż jedną cytotoksynę określa się jako immunotoksyny. Pojęcie cytotoksyny lub środka cytotoksycznego obejmuje dowolny środek, który jest szkodliwy wobec komórek, w szczególności, zabija komórki. Do przykładów należą taksol, cytochalazyna B, gramicydyna D, bromek etydowy, emetyna, mitomycyna, etopozyd, tenopozyd, winkrystyna, winblastyna, kolchicyna, doksorubicyna, daunorubicyna, dihydroksyantracyndion, mitoksantron, mitramycyna, aktynomycyna D, 1-dehydrotestosteron, glukokortykoidy, prokaina, tetrakaina, lidokaina, propranolol i puromycyna oraz ich analogi lub homologi. [0210] Do środków terapeutycznych odpowiednich do tworzenia immunokoniugatów według niniejszego wynalazku należą między innymi antymetabolity (na przykład metotreksat, 6-merkaptopuryna, 6-tioguanina, cytarabina, fludarabina, 5-fluorouracyl, dakarbazyna), środki alkilujące (na przykład mechloretamina, tiotepa, chlorambucyl, melfalan, karmustyna (BSNU) i lomustyna (CCNU), cyklofosfamid, busulfan, dibromomannitol, streptozotocyna, mitomycyna C i cisdichlorodiaminoplatyna (II) (DDP) cysplatyna),

113 antracykliny (na przykład daunorubicyna (uprzednio zwana daunomycyną)) i doksorubicyna), antybiotyki (na przykład daktynomycyna (uprzednio zwana aktynomycyną)), bleomycyna, mitramycyna i antramycyna (AMC) oraz środki antymitotyczne (na przykład winkrystyna i winblastyna). W korzystnym przykładzie wykonania środkiem terapeutycznym jest środek cytotoksyczny lub środek radiotoksyczny. W innym przykładzie wykonania środkiem terapeutycznym jest immunosupresant. W jeszcze innym przykładzie wykonania środkiem terapeutycznym jest GM- CSF. W korzystnym przykładzie wykonania środkiem terapeutycznym jest doksorubicyna, cysplatyna, siarczan bleomycyny, karmustyna, chlorambucyl, cyklofosfamid lub rycyna A. [0211] Przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być również sprzężone z radioizotopem, na przykład jodem 131, itrem 90 lub indem 111, z wytworzeniem cytotoksycznych środków radiofarmaceutycznych do leczenia zaburzenia związanego z CLD18, takiego jak nowotwór. Koniugaty przeciwciał według niniejszego wynalazku można stosować do modyfikowania odpowiedzi biologicznej; cząstki leczniczej nie należy uważać za ograniczonej do klasycznych chemicznych środków terapeutycznych. Cząstką leczniczą może być na przykład białko lub polipeptyd wykazujący pożądaną aktywność biologiczną. Do takich białek mogą należeć na przykład enzymatycznie czynna toksyna lub jej aktywny fragment, takie jak abryna, rycyna A, egzotoksyna Pseudomonas lub toksyna błonicy; białko, takie jak czynnik martwicy nowotworu lub interferon γ; lub środek modyfikujący odpowiedź biologiczną, taki jak na przykład limfokiny,

114 interleukina 1 (IL-1), interleukina 2 (IL-2), interleukina 6 (IL-6), czynnik stymulujący wzrost kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF), czynnik stymulujący wzrost kolonii granulocytów (G-CSF) lub inne czynniki wzrostu. [0212] Sposoby sprzęgania takiej cząstki terapeutycznej z przeciwciałami są dobrze znane; zob. na przykład Amon i wsp., Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy w: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld i wsp. (red.), str (Alan R. Liss Inc. 1985); Hellstrom i wsp., Antibodies For Drug Delivery w: Controlled Drug Delivery (wyd. 2), Robinson i wsp. (red.), str (Marcel Dekkert Inc. 1987); Thorpe, Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review w: Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, Pincherai wsp. (red.), str (1985); Analysis, Results and Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy w: Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy, Baldwin i wsp. (red.), str (Academic Press 1985) i Thorpe i wsp., The Preparation and Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates Immunol. Rev., 62: (1982). [0213] W kolejnym przykładzie wykonania przeciwciała według wynalazku są przyłączone do łącznika-chelatora, takiego jak na przykład tiuksetan, co umożliwia sprzęganie przeciwciała z radioizotopem. III. Kompozycje farmaceutyczne [0214] W innym aspekcie przedmiotem niniejszego wynalazku jest kompozycja, na przykład kompozycja

115 farmaceutyczna, zawierająca jedno przeciwciało lub kombinację przeciwciał według niniejszego wynalazku. Kompozycje farmaceutyczne można tworzyć z użyciem farmaceutycznie dopuszczalnych nośników lub rozcieńczalników, jak również wszelkich innych znanych adiuwantów i zaróbek, zgodnie z konwencjonalnymi metodami, jakie ujawniono na przykład w Remington: The Science and Practice of Pharmacy, wyd. 19, Gennaro (red.), Mack Publishing Co., Easton, PA, USA, W jednym z przykładów wykonania kompozycje zawierają kombinację wielu (na przykład dwóch lub więcej) izolowanych przeciwciał według wynalazku, działających poprzez różne mechanizmy, na przykład jedno przeciwciało, działające głównie przez indukowanie CDC w skojarzeniu z innym przeciwciałem, działającym głównie przez indukowanie apoptozy. [0215] Kompozycje farmaceutyczne według niniejszego wynalazku można również podawać w terapii skojarzonej, to znaczy w połączeniu z innymi środkami. Terapia skojarzona może na przykład obejmować kompozycję według niniejszego wynalazku z co najmniej jednym środkiem przeciwzapalnym lub co najmniej jednym środkiem immunosupresyjnym. W jednym z przykładów wykonania takie środki terapeutyczne zawierają jeden lub więcej niż jeden środek przeciwzapalny, taki jak lek steroidowy lub NLPZ (niesteroidowy lek przeciwzapalny). Do korzystnych środków należą na przykład aspiryna i inne salicylany, inhibitory COX-2, takie jak rofekoksyb (Vioxx) i celekoksyb (Celebrex), NLPZ takie jak ibuprofen (Motrin, Advil), fenoprofen (Nalfon), naproksen (Naprosyn), sulindak (Clinoril), diklofenak

116 (Voltaren), piroksykam (Feldene), ketoprofen (Orudis), diflunisal (Dolobid), nabumeton (Relafen), etodolak (Lodine), oksaprozyna (Daypro) i indometacyna (Indocin). [0216] W innym przykładzie wykonania takie środki terapeutyczne zawierają środki prowadzące do obniżenia poziomu lub funkcjonalnego unieczynnienia regulatorowych komórek T, takie jak cyklofosfamid w małych dawkach, przeciwciała anty-ctla4, przeciwciała anty-il2 lub przeciwciała przeciwko receptorowi IL2. [0217] W jeszcze innym przykładzie wykonania takie środki terapeutyczne zawierają jeden lub więcej niż jeden środek chemioterapeutyczny, taki jak pochodne taksolu, Taxotere, gemcytabina, 5-fluoruracyl, doksorubicyna (adriamycyna), cysplatyna (Platinol), cyklofosfamid (Cytoxan, Procytox, Neosar). W innym przykładzie wykonania przeciwciała według niniejszego wynalazku można podawać w skojarzeniu ze środkami chemioterapeutycznymi, które korzystnie wykazują skuteczność terapeutyczną u pacjentów cierpiących na nowotwór żołądka, przełyku, trzustki i płuca. [0218] W jeszcze innym przykładzie wykonania przeciwciała według wynalazku można podawać w skojarzeniu z radioterapią i(lub) przeszczepieniem autologicznych obwodowych komórek macierzystych lub szpiku kostnego. [0219] W jeszcze innym przykładzie wykonania przeciwciała według wynalazku można podawać w skojarzeniu z jednym lub więcej niż jednym przeciwciałem dobranym z grupy obejmującej przeciwciała

117 anty-cd25, przeciwciała anty-epcam, przeciwciała anty- EGFR, anty-her2/neu i anty-cd40. [0220] W jeszcze innym przykładzie wykonania przeciwciała według wynalazku można podawać w skojarzeniu z przeciwciałem anty-c3b (i) w celu zwiększenia aktywacji dopełniacza. [0221] W rozumieniu niniejszego opisu, pojęcie farmaceutycznie dopuszczalny nośnik obejmuje wszelkie rozpuszczalniki, środki dyspergujące, powłoki, środki przeciwbakteryjne i przeciwgrzybicze, środki izotonizujące i opóźniające wchłanianie, które są fizjologicznie zgodne. Korzystnie, nośnik nadaje się do podawania dożylnego, domięśniowego, podskórnego, pozajelitowego, dordzeniowego lub naskórkowego (na przykład przez wstrzyknięcie lub wlew). W zależności od drogi podawania, związek czynny, to znaczy przeciwciało, cząsteczka dwuswoista i wieloswoista, może być powlekany materiałem chroniącym związek przed działaniem kwasów i przed innymi warunkami naturalnymi, które mogą unieczynniać związek. [0222] Określenie farmaceutycznie dopuszczalna sól odnosi się do soli, która zachowuje pożądaną aktywność biologiczną związku rodzicielskiego i nie powoduje żadnych niepożądanych efektów toksycznych (zob. na przykład Berge, S. M. i wsp. (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19). [0223] Do przykładów takich soli należą kwasowe sole addycyjne i zasadowe sole addycyjne. Do kwasowych soli addycyjnych należą sole pochodzące z nietoksycznych kwasów nieorganicznych, takich jak kwas solny, azotowy, fosforowy, siarkowy, bromowodorowy, jodowodorowy i

118 fosforawy, jak również z nietoksycznych kwasów organicznych, takich jak alifatycznych kwasów mono- i dikarboksylowych, podstawionych fenylem kwasów alkanowych, kwasów hydroksyalkanowych, kwasów aromatycznych, alifatycznych i aromatycznych kwasów sulfonowych. Do zasadowych soli addycyjnych należą sole pochodzące od metali ziem alkalicznych, takich jak sód, potas, magnez i wapń, jak również od nietoksycznych amin organicznych, takich jak N,N'- dibenzyloetylenodiamina, N-metyloglukamina, chloroprokaina, cholina, dietanoloamina, etylenodiamina i prokaina. [0224] Kompozycję według niniejszego wynalazku można podawać rozmaitymi metodami znanymi w stanie techniki. Jak zauważy specjalista, droga i(lub) tryb podawania będą różne w zależności od pożądanych rezultatów. Związki czynne można wytwarzać z nośnikami, które będą chronić związek przed szybkim uwalnianiem, jak na przykład w preparatach o kontrolowanym uwalnianiu, takich jak wszczepy, plastry przezskórne i układy podawania z mikrokapsułkami. Można stosować ulegające rozpadowi biologicznemu i wykazujące zgodność biologiczną polimery, takie jak etylen/octan winylu, polibezwodniki, kwas poliglikolowy, kolagen, poliortoestry i kwas polimlekowy. Sposoby wytwarzania takich preparatów są znane specjalistom. Zob. na przykład Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson (red.), Marcel Dekker Inc., New York, [0225] W celu podania związku według niniejszego wynalazku pewnymi drogami podawania konieczne może być

119 powleczenie związku materiałem zapobiegającym jego unieczynnieniu lub jednoczesne podawanie związku z takim materiałem. Związek można podawać na przykład osobnikowi w odpowiednim nośniku, takim jak na przykład liposomy, lub rozcieńczalniku. Do farmaceutycznie dopuszczalnych rozcieńczalników należą sól fizjologiczna i wodne roztwory buforowe. Do liposomów należą emulsje typu woda w oleju w wodzie, jak również konwencjonalne liposomy (Strejan i wsp. (1984) J. Neuroimmunol. 7: 27). [0226] Do farmaceutycznie dopuszczalnych nośników należą jałowe wodne roztwory lub dyspersje i jałowe proszki do sporządzania bezpośrednio przed podaniem jałowych roztworów lub dyspersji do wstrzyknięć. Zastosowanie takich środków do substancji farmaceutycznie czynnych jest znane w stanie techniki. O ile tylko dany, dowolny środek konwencjonalny nie wykazuje niezgodności ze związkiem czynnym, przewiduje się możliwość jego zastosowania w kompozycjach farmaceutycznych według niniejszego wynalazku. Do kompozycji można także włączać dodatkowe związki czynne. [0227] Kompozycje terapeutyczne typowo muszą być jałowe i stabilne w warunkach wytwarzania i przechowywania. Z kompozycji można wytwarzać roztwór, mikroemulsję, liposom lub inną uporządkowaną strukturę odpowiednią do dużego stężenia leku. Nośnikiem może być rozpuszczalnik lub środek dyspergujący, zawierający na przykład wodę, etanol, poliol (na przykład glicerol, glikol propylenowy i ciekły glikol polietylenowy) i ich odpowiednie mieszaniny. Odpowiednią płynność można

120 utrzymać na przykład przez zastosowanie powłoki, takiej jak lecytyna, przez utrzymanie niezbędnej wielkości cząstek w przypadku dyspersji i przez zastosowanie środków powierzchniowo czynnych. W wielu przypadkach korzystne będzie włączenie do kompozycji środków izotonizujących, na przykład cukrów, polialkoholi, takich jak mannitol, sorbitol lub chlorek sodu. Wydłużenie wchłaniania kompozycji do wstrzyknięć można uzyskać przez włączenie do kompozycji środka opóźniającego wchłanianie, na przykład soli monostearynianowych i żelatyny. [0228] Jałowe roztwory do wstrzyknięć można wytwarzać przez włączanie związku czynnego w niezbędnej ilości, w odpowiednim rozpuszczalniku, z jednym z wymienionych powyżej składników lub ich kombinacją, w zależności od potrzeb, i następnie przez wyjaławianie metodą mikrofiltracji. [0229] Ogólnie, dyspersje wytwarza się przez włączenie związku czynnego do jałowej zaróbki, zawierającej podstawowy środek dyspergujący i niezbędne składniki inne niż składniki wymienione powyżej. W przypadku jałowych proszków do sporządzania jałowych roztworów do wstrzyknięć korzystnymi metodami wytwarzania są suszenie w próżni i liofilizacja, w wyniku których uzyskuje się sproszkowany składnik czynny plus dowolny dodatkowy pożądany składnik z jego roztworu, uprzednio wyjałowionego przez filtrację. [0230] Schematy dawkowania dostosowuje się tak, aby zapewnić optymalną pożądaną odpowiedź (na przykład odpowiedź terapeutyczną). Można na przykład podawać pojedynczy bolus, można podawać kilka dawek

121 podzielonych w pewnym czasie lub dawkę można proporcjonalnie zmniejszać lub zwiększać w zależności od wymogów sytuacji terapeutycznej. Szczególnie korzystne jest wytwarzanie kompozycji pozajelitowej w postaci dawek jednostkowych celem ułatwienia podawania i zapewnienia jednolitości dawkowania. Pojęcie postaci dawek jednostkowych w rozumieniu niniejszego opisu odnosi się do fizycznie odrębnych jednostek, nadających się do zastosowania jako dawki jednostkowe u osobników, które mają być poddane leczeniu; każda jednostka zawiera z góry określoną ilość związku czynnego, obliczoną tak, aby zapewnić pożądany efekt terapeutyczny, w połączeniu z niezbędnym nośnikiem farmaceutycznym. Specyfikacja postaci dawek jednostkowych według niniejszego wynalazku jest podyktowana następującymi czynnikami i od nich bezpośrednio zależna: (a) unikalna charakterystyka związku czynnego i konkretny efekt terapeutyczny, który ma być osiągnięty (b) nieuchronne, znane ze stanu techniki ograniczenia związane z tworzeniem związków, takie jak związek czynny do leczenia wrażliwości u osobników. [0231] Do przykładów farmaceutycznie dopuszczalnych środków przeciwutleniających należą: (1) środki przeciwutleniające rozpuszczalne w wodzie, takie jak kwas askorbinowy, chlorowodorek cysteiny, dwusiarczan sodu, metadwusiarczyn sodu i siarczyn sodu; (2) środki przeciwutleniające rozpuszczalne w oleju, takie jak palmitynian askorbylowy, butylowany hydroksyanizol (BHA), butylowany hydroksytoluen (BHT), lecytyna, galusan propylowy i alfa-tokoferol; i (3) środki

122 chelatujące metale, takie jak kwas cytrynowy, kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), sorbitol, kwas winowy i kwas fosforowy. [0232] W przypadku kompozycji terapeutycznych, do preparatów według niniejszego wynalazku należą preparaty nadające się do podawania doustnego, donosowego, miejscowego (w tym podpoliczkowego i podjęzykowego), doodbytniczego, dopochwowego i(lub) pozajelitowego. Preparaty można korzystnie wytwarzać w postaci dawki jednostkowej, dowolnymi metodami znanymi w stanie techniki. Ilość składnika czynnego, którą można łączyć z materiałem nośnikowym, żeby uzyskać pojedynczą postać dawkową, będzie różna, w zależności od leczonego osobnika i konkretnego trybu podawania. Ilość składnika czynnego, którą można łączyć z materiałem nośnikowym, żeby uzyskać pojedynczą postać dawkową, będzie to ogólnie taka ilość kompozycji, która zapewnia efekt terapeutyczny. [0233] Ogólnie, ze 100%, ta ilość będzie wynosić od około 0,01% do około 99% składnika czynnego, korzystnie od około 0,1% do około 70%, najkorzystniej od około 1% do około 30%. [0234] Do preparatów według niniejszego wynalazku, nadających się do podawania dopochwowego, należą również krążki maciczne, tampony, kremy, żele, pasty, pianki lub preparaty w postaci sprayu, zawierające takie nośniki, o jakich ze stanu techniki wiadomo, że są odpowiednie. Do postaci dawkowych do podawania miejscowego lub przezskórnego kompozycji według niniejszego wynalazku należą proszki, spraye, maści, pasty, kremy, płyny, żele, roztwory, plastry i środki

123 wziewne. Związek czynny można mieszać w warunkach jałowych z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem i z dowolnymi środkami konserwującymi, buforami lub propelentami, które mogą być niezbędne. [0235] Zwroty podawanie pozajelitowe i podawany pozajelitowo w rozumieniu niniejszego opisu oznacza sposoby podawania inne niż podawanie dojelitowe i miejscowe, zwykle przez wstrzyknięcie, i obejmuje między innymi podawanie dożylne, domięśniowe, dotętnicze, do przestrzeni płynowych, do torebek stawowych, do oczodołu, dosercowe, śródskórne, dootrzewnowe, przeztchawicze, podskórne, podnaskórkowe, dostawowe, pod torebkę stawową, do przestrzeni podpajęczynówkowej, wewnątrzrdzeniowo, nadtwardówkowo i domostkowo, przez wstrzyknięcie lub wlew. [0236] Do przykładów odpowiednich nośników wodnych i niewodnych, które można wykorzystywać w kompozycjach farmaceutycznych według niniejszego wynalazku, należą woda, etanol, poliole (takie jak glicerol, glikol propylenowy i glikol polietylenowy) oraz ich odpowiednie mieszaniny, oleje roślinne, takie jak oliwa z oliwek i estry organiczne do wstrzyknięć, takie jak oleinian etylowy. Odpowiednią płynność można utrzymać na przykład przez zastosowanie materiałów powlekających, takich jak lecytyna, przez utrzymywanie niezbędnej wielkości cząstek w przypadku dyspersji i przez zastosowanie środków powierzchniowo czynnych. [0237] Te kompozycje mogą także zawierać adiuwanty, takie jak środki konserwujące, zwilżające, emulgujące i dyspergujące. Zapobieganie obecności drobnoustrojów można zapewnić zarówno przez procedury wyjaławiania,

124 jak i przez włączenie w skład kompozycji różnych środków przeciwbakteryjnych i przeciwgrzybiczych, takich jak na przykład paraben, chlorobutanol, fenol i kwas sorbinowy. Korzystne może być także włączenie do kompozycji środków nadających izotoniczność, takich jak cukry i chlorek sodu. Dodatkowo można uzyskać przedłużone wchłanianie postaci farmaceutycznej do wstrzyknięć przez włączenie środków opóźniających wchłanianie, takich jak monostearynian glinu i żelatyna. [0238] W jednym z przykładów wykonania przeciwciała monoklonalne według wynalazku podaje się w postaci krystalicznej przez wstrzyknięcie podskórne; por. Yang i wsp. (2003) PNAS, 100 (12): Gdy związki według niniejszego wynalazku podaje się w postaci środków farmaceutycznych ludziom i zwierzętom, można je podawać same lub w postaci kompozycji farmaceutycznej zawierającej na przykład od 0,01 do 99,5% (korzystniej, od 0,1 do 90%) składnika czynnego w skojarzeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. [0239] Niezależnie od wybranej drogi podawania, ze związków według niniejszego wynalazku, które można stosować w odpowiedniej postaci wodzianu i(lub) kompozycji farmaceutycznych według niniejszego wynalazku, wytwarza się farmaceutycznie dopuszczalne postacie dawkowe konwencjonalnymi metodami znanymi specjalistom. [0240] Rzeczywisty poziom dawkowania składników czynnych w kompozycjach farmaceutycznych według niniejszego wynalazku można zmieniać, tak aby uzyskać ilość składnika czynnego, która pozwoli skutecznie

125 uzyskać pożądaną odpowiedź terapeutyczną u danego pacjenta, kompozycję i tryb podawania, bez powodowania u pacjenta toksyczności. Wybrany poziom dawkowania będzie zależał od wielu czynników farmakokinetycznych, takich jak aktywność konkretnych stosowanych kompozycji według niniejszego wynalazku, droga podawania, czas podania, prędkość wydalania danego, stosowanego związku, czas trwania leczenia, inne leki, związki i(lub) materiały stosowane w skojarzeniu z konkretnymi stosowanymi kompozycjami, wiek, płeć, masa ciała, schorzenie, ogólny stan zdrowia i dotychczas przebyte choroby leczonego pacjenta oraz od tego typu czynników, dobrze znanych w medycynie. [0241] Lekarz lub lekarz weterynarii o odpowiednich umiejętnościach może łatwo określić i zaordynować skuteczną ilość niezbędnej kompozycji farmaceutycznej. Lekarz lub lekarz weterynarii może na przykład rozpocząć od dawek związków według niniejszego wynalazku stosowanych w kompozycji farmaceutycznej na poziomie niższym od poziomu niezbędnego do uzyskania pożądanego efektu terapeutycznego i stopniowo zwiększać dawkowanie aż do uzyskania pożądanego efektu. Ogólnie, odpowiednia dawka dzienna kompozycji według wynalazku będzie to ilość związku, która jest najmniejszą dawką skutecznie powodującą efekt terapeutyczny. Taka dawka skuteczna będzie ogólnie zależeć od czynników opisanych powyżej. Korzystne jest, żeby podawanie było dożylne, domięśniowe, dootrzewnowe lub podskórne, korzystnie proksymalnie do miejsca docelowego. Jeżeli jest to pożądane, skuteczną dawkę dzienną kompozycji terapeutycznej można podawać w postaci dwóch, trzech,

126 czterech, pięciu, sześciu lub więcej dawek podzielonych, podawanych oddzielnie w odpowiednich odstępach czasowych w ciągu dnia, ewentualnie w postaci dawek jednostkowych. O ile możliwe jest podawanie związku według niniejszego wynalazku jako takiego, korzystne jest podawanie tego związku w postaci preparatu/kompozycji farmaceutycznej. [0242] W jednym z przykładów wykonania przeciwciała według wynalazku można podawać we wlewie, korzystnie powolnym, ciągłym wlewie przez długi czas, na przykład przez ponad 24 godziny, w celu zmniejszenia toksycznych objawów niepożądanych. Podawanie można również prowadzić w ciągłym wlewie przez czas od 2 do 24 godzin, na przykład od 2 do 12 godzin. Taki schemat można powtarzać jeden raz lub więcej razy, w zależności od potrzeb, na przykład po 6 miesiącach lub 12 miesiącach. Dawkowanie będzie określane lub dostosowywane na podstawie oznaczania ilości krążących monoklonalnych przeciwciał anty-cld18 po podaniu w próbce biologicznej, z zastosowaniem przeciwciał antyidiotypowych, ukierunkowanych na przeciwciała anty- CLD18. [0243] W jeszcze innym przykładzie wykonania przeciwciała podaje się w terapii podtrzymującej, na przykład jeden raz w tygodniu, przez czas 6 miesięcy lub dłużej. [0244] W jeszcze innym przykładzie wykonania przeciwciała według wynalazku można podawać w schemacie obejmującym jeden wlew przeciwciała przeciwko CLD18 i następnie wlew przeciwciała przeciwko CLD18 sprzężonego

127 z radioizotopem. Schemat ten można powtarzać, na przykład po 7-9 dniach. [0245] Kompozycje terapeutyczne można podawać z użyciem urządzeń medycznych znanych w stanie techniki. W korzystnym przykładzie wykonania kompozycję terapeutyczną według wynalazku można na przykład podawać za pomocą bezigłowego aparatu do wstrzyknięć podskórnych, takiego jak aparaty ujawnione w US 5,399,163; US 5,383,851; US 5,312,335; US 5,064,413; US 4,941,880; US 4,790,824 lub US 4,596,556. Do przykładów dobrze znanych wszczepów i modułów użytecznych według niniejszego wynalazku należą urządzenia opisane w US 4,487,603, w którym ujawniono wszczepianą mikropompę do wlewów do podawania leku w kontrolowanej ilości; US 4,486,194, w którym ujawniono urządzenie terapeutyczne do podawania leków przez skórę; US 4,447,233, w którym ujawniono pompę do wlewów leków do dostarczania leku z dokładną prędkością wlewu; US 4,447,224, w którym ujawniono wszczepiany aparat o zmiennym przepływie do ciągłego podawania leku; US 4,439,196, w którym ujawniono osmotyczny układ do podawania leku z wielokomorowymi przedziałami; i US 4,475,196, w którym ujawniono osmotyczny układ do podawania leku. [0246] Specjalistom znanych jest wiele innych takich wszczepów, układów i modułów podawania. W niektórych przykładach wykonania z przeciwciał według wynalazku można wytwarzać preparaty zapewniające odpowiednią dystrybucję in vivo. Wiele związków wysoce hydrofilowych nie jest na przykład przepuszczanych przez barierę krew-mózg (ang. blood-brain barrier - BBB). W celu umożliwienia związkom terapeutycznym

128 według niniejszego wynalazku przechodzenia przez BBB (jeżeli jest to pożądane), można z nich wytwarzać na przykład preparat liposomowy. Sposoby wytwarzania liposomów opisano na przykład w US 4,522,811; US 5,374,548 i US 5,399,331. Liposomy mogą zawierać jedną lub więcej niż jedną cząstkę, która ulega selektywnemu transportowi do swoistych komórek lub narządów, zwiększając przez to ukierunkowane dostarczanie (zob. na przykład V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685). Do przykładowych cząstek ukierunkowujących należą folan lub biotyna (zob. na przykład US 5,416,016 na nazwisko Low i wsp.); mannozydy (Umezawa i wsp., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038); przeciwciała (P.G. Bloeman i wsp. (1995) FEBS Lett. 357: 140; M. Owais i wsp. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180); i stanowiący środek powierzchniowo czynny receptor białka A (Briscoe i wsp. (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134). [0247] W jednym z przykładów wykonania wynalazku ze związków terapeutycznych według niniejszego wynalazku wytwarza się liposomy. W korzystniejszym przykładzie wykonania liposomy zawierają cząstkę ukierunkowującą. W najkorzystniejszym przykładzie wykonania związki terapeutyczne w liposomach są podawane przez wstrzyknięcie w postaci bolusu do miejsca położonego proksymalnie od pożądanej okolicy, takiej jak na przykład miejsce, w którym znajduje się guz. Kompozycja musi być płynna w stopniu umożliwiającym łatwe podanie przez strzykawkę. Musi ona zachowywać stabilność w warunkach wytwarzania i przechowywania i musi być

129 zabezpieczona przed zanieczyszczającym działaniem drobnoustrojów, takich jak bakterie i grzyby. [0248] W kolejnym przykładzie wykonania z przeciwciał według wynalazku można wytwarzać preparaty uniemożliwiające lub zmniejszające ich transport przez łożysko. Można to osiągnąć metodami znanymi w stanie techniki, na przykład przez PEGilację przeciwciał lub zastosowanie fragmentów F(ab)2'. Jeżeli chodzi o dokładniejszy opis, można się odnieść do Cunningham- Rundles C, Zhuo Z, Griffith B, Keenan J. (1992) Biological activities of polyethylene-glycol immunoglobulin conjugates. Resistance to enzymatic degradation. J. Immunol. Methods, 152: ; i to Landor M. (1995) Maternal-fetal transfer of immunoglobulins, Ann. Allergy Asthma Immunol. 74: [0249] Dawkowanie terapeutycznie skuteczne w terapii przeciwnowotworowej można mierzyć na podstawie obiektywnej odpowiedzi guza, która może być całkowita lub częściowa. Odpowiedź całkowitą (ang. complete response CR) definiuje się jako nieobecność klinicznych, radiologicznych ani jakichkolwiek innych cech choroby. Odpowiedź częściowa (ang. partial response - PR) jest skutkiem zmniejszenia sumarycznej wielkości guzów o ponad 50%. Średni czas do progresji jest wskaźnikiem charakteryzującym trwałość obiektywnej odpowiedzi guza. [0250] Można także mierzyć dawkowanie terapeutycznie skuteczne w terapii przeciwnowotworowej na podstawie zdolności do stabilizowania progresji choroby. Zdolność związku do hamowania nowotworu można oceniać w układzie

130 modelu zwierzęcego, pozwalającym przewidywać skuteczność w guzach u człowieka. Zamiast tego, tę właściwość kompozycji można oceniać poprzez badanie zdolności związku do hamowania wzrostu lub apoptozy komórek w testach in vitro znanych specjaliście. Terapeutycznie skuteczna ilość związku terapeutycznego może zmniejszać wielkość guza lub w inny sposób powodować poprawę w zakresie objawów u osobnika. Specjalista będzie w stanie określić takie ilości na podstawie czynników takich, jak wielkość ciała osobnika, nasilenie objawów u osobnika oraz konkretna wybrana kompozycja lub droga podawania. [0251] Kompozycja musi być jałowa i płynna w takim zakresie, żeby możliwe było jej podawanie przez strzykawkę. Oprócz wody, nośnikiem może być izotoniczny, zbuforowany roztwór soli fizjologicznej, etanol, poliol (na przykład glicerol, glikol propylenowy i ciekły glikol polietylenowy) oraz ich odpowiednie mieszaniny. Odpowiednią płynność można utrzymywać na przykład przez zastosowanie powłoki, takiej jak lecytyna, przez utrzymywanie odpowiedniej wielkości cząstek w przypadku dyspersji i przez zastosowanie środków powierzchniowo czynnych. W wielu przypadkach korzystne jest włączenie do kompozycji środków izotonizujących, na przykład cukrów, polialkoholi, taki jak mannitol lub sorbitol, i chlorku sodu. Długotrwałe wchłanianie kompozycji do wstrzyknięć można uzyskać przez włączenie do kompozycji środka opóźniającego wchłanianie, na przykład monostearynianu glinu lub żelatyny.

131 [0252] Gdy związek czynny jest odpowiednio chroniony, jak opisano powyżej, związek można podawać doustnie, na przykład z obojętnym rozcieńczalnikiem lub przyswajalnym, jadalnym nośnikiem. IV. Zastosowania i metody obejmujące przeciwciała według wynalazku [0253] Przeciwciała (w tym opisywane tu immunokoniugaty, przeciwciała dwuswoiste/wieloswoiste, kompozycje i inne pochodne) według niniejszego wynalazku wykazują różnokierunkową użyteczność terapeutyczną, w tym m.in. nadają się do leczenia zaburzeń obejmujących komórki wykazujące ekspresję CLD18A2. Przeciwciała można na przykład podawać komórkom w hodowli, na przykład in vitro lub ex vivo, lub ludziom, na przykład in vivo, w celu leczenia lub profilaktyki szeregu zaburzeń, takich jak tu opisano. W rozumieniu niniejszego opisu termin osobnik ma obejmować ludzi i zwierzęta inne niż człowiek, które reagują na przeciwciała przeciwko CLD18A2. Do korzystnych osobników należą pacjenci-ludzie, z zaburzeniami, które można korygować lub uzyskiwać w nich poprawę przez zabijanie chorych komórek, zwłaszcza komórek cechujących się zmienionym wzorcem ekspresji CLD18A2 w porównaniu z komórki prawidłowymi. [0254] Efekt terapeutyczny w omawianych tu terapiach korzystnie uzyskuje się przez wykorzystanie funkcjonalnych właściwości przeciwciał według wynalazku w pośredniczeniu w zabijaniu komórek. [0255] W jednym z przykładów wykonania przeciwciała według niniejszego wynalazku można na przykład stosować do leczenia osobnika z zaburzeniem nowotworowym, na

132 przykład z zaburzeniem cechującym się obecnością komórek nowotworowych wykazujących ekspresję CLD18A2, takich jak na przykład komórki nowotworu żołądka. Do przykładów chorób nowotworowych, które można leczyć i(lub) którym można zapobiegać, należą wszystkie nowotwory wykazujące ekspresję CLD18A2 i takie jednostki chorobowe spośród chorób nowotworowych, jak nowotwór żołądka, nowotwór przełyku, nowotwór trzustki, nowotwór płuca, nowotwór jajnika, nowotwór sutka, nowotwór jelita grubego, nowotwór wątroby, nowotwór pęcherzyka żółciowego i nowotwór głowy i szyi. Mogą to być nowotwory w stadium wczesnym, pośrednim lub zaawansowanym, na przykład w stadium przerzutów. [0256] Kompozycje farmaceutyczne i sposoby leczenia opisane w wynalazku można również wykorzystywać do immunizacji lub szczepienia w celu zapobiegania opisywanym tu chorobom. [0257] W innym przykładzie wykonania przeciwciała według wynalazku można stosować do wykrywania poziomu CLD18 lub konkretnych form CLD18, albo poziomu komórek, które zawierają CLD18 na powierzchni błony; następnie poziom ten można łączyć z pewnymi chorobami lub objawami chorobowymi, takimi jak opisano powyżej. Zamiast tego, przeciwciała można stosować do zmniejszania ilości lub zakłócania czynności komórek wykazujących ekspresję CLD18, co implikuje, że te komórki są ważnymi mediatorami choroby. Można to osiągać przez stykanie próbki i próbki kontrolnej z przeciwciałem anty-cld18 w warunkach umożliwiających tworzenie kompleksu między przeciwciałem a CLD 18. Wykrywa się wszelkie kompleksy wytworzone między

133 przeciwciałem a CLD 18 i porównuje się ich ilość w próbce i próbce kontrolnej, to znaczy próbce referencyjnej. [0258] Przeciwciała według wynalazku można początkowo badać pod kątem aktywności wiązania związanego z zastosowaniem terapeutycznym lub diagnostycznym in vitro. Przeciwciała można na przykład badać testami cytometrii przepływowej, jak tu opisano. [0259] Można ponadto oceniać aktywność przeciwciał w zakresie wyzwalania co najmniej jednej aktywności komórki efektorowej zależnej od efektora, takiej jak hamowanie wzrostu i(lub) zabijanie komórek wykazujących ekspresję CLD18. Można na przykład badać zdolność przeciwciał do wyzwalania CDC i(lub) apoptozy. W niniejszym zgłoszeniu opisano protokoły testowania pod kątem CDC, adhezji homotypowej, tworzenia klastrów cząsteczkowych lub apoptozy. [0260] Przeciwciała według wynalazku można stosować do wywoływania in vivo lub in vitro jednej lub więcej niż jednej z następujących aktywności biologicznych: hamowanie wzrostu i(lub) różnicowania komórki wykazującej ekspresję CLD18; zabijanie komórki wykazującej ekspresję CLD18; pośredniczenie w fagocytozie lub ADCC komórki wykazującej ekspresję CLD18 w obecności komórek efektorowych; pośredniczenie w CDC komórki wykazującej ekspresję CLD18 w obecności dopełniacza; pośredniczenie w apoptozie komórki wykazującej ekspresję CLD18; indukowanie adhezji homotypowej; i(lub) indukowanie translokacji do tratw lipidowych po związaniu CLD 18.

134 [0261] W szczególnym przykładzie wykonania przeciwciała można stosować in vivo lub in vitro do leczenia, profilaktyki lub diagnozowania szeregu chorób związanych z CLD18. Do przykładów chorób związanych z CLD18 należą między innymi nowotwory, takie jak nowotwór żołądka, nowotwór trzustki, nowotwór przełyku, nowotwór płuca i nowotwory opisane powyżej. [0262] CLD18A2 ulega również ekspresji w zróżnicowanych, prawidłowych komórkach żołądka. Możliwe indukowane przez przeciwciało kliniczne objawy niepożądane spowodowane przez zabijanie tych komórek można redukować lub można ich uniknąć przez równoległe podawanie leków chroniących żołądek, takich jak środki zobojętniające kwas lub inhibitory pompy protonowej żołądka, takie jak omeprazol lub leki pokrewne. [0263] Odpowiednie drogi podawania kompozycji przeciwciał według niniejszego wynalazku in vivo i in vitro są dobrze znane w stanie techniki i mogą być wybrane przez specjalistów. [0264] Jak opisano powyżej, przeciwciała anty-cld18 według wynalazku można podawać jednocześnie z jeszcze jednym lub więcej niż jednym środkiem terapeutycznym, na przykład środkiem cytotoksycznym, środkiem radiotoksycznym, środkiem antyangiogenetycznym i(lub) środkiem immunosupresyjnym, żeby zmniejszyć indukcję odpowiedzi immunologicznej przeciwko przeciwciałom według niniejszego wynalazku. Przeciwciało może być połączone ze środkiem (w postaci immunokompleksu) lub można podawać je oddzielnie od tego środka. W tym ostatnim przypadku (podawanie oddzielne), przeciwciało można podawać przed podaniem środka, po jego podaniu

135 lub jednocześnie z jego podaniem lub można je podawać jednocześnie z innymi znanymi terapiami, takimi jak na przykład terapia przeciwnowotworowa, na przykład radioterapia. Do takich środków terapeutycznych należą między innymi środki przeciwnowotworowe, takie jak wymieniono powyżej. Jednoczesne podawanie przeciwciał anty-cld18 według niniejszego wynalazku ze środkami chemioterapeutycznymi zapewnia dwa środki przeciwnowotworowe, działające przez różne mechanizmy i wywierające efekt cytotoksyczny na komórkę nowotworową. Takie jednoczesne podawanie może rozwiązać problemy spowodowane rozwojem oporności na leki lub zmianą antygenowości komórek nowotworowych, która spowoduje utratę ich reaktywności na przeciwciało. [0265] W innym szczególnym przykładzie wykonania wynalazku osobnik, któremu podaje się przeciwciało, jest dodatkowo leczony środkiem antyangiogenetycznym, w tym przeciwciałami ukierunkowanymi na VEGF lub VEGFR, i jednym lub więcej niż jednym związkiem chemicznym hamującym angiogenezę. Wstępne leczenie tym lekami lub równoległe ich podawanie może ulepszyć przenikanie przeciwciał w masywnych guzach. [0266] W innym szczególnym przykładzie wykonania wynalazku osobnik, któremu podaje się przeciwciało, jest dodatkowo leczony związkiem hamującym przekazywanie sygnałów receptora czynnika wzrostu, takim jak przeciwciała monoklonalne wiążące się z receptorem EGFR, jak również związki chemiczne hamujące przekazywanie sygnałów inicjowane przez receptor EGFR, Herl lub Her2/neu.

136 [0267] Jako środki terapeutyczne można także stosować swoiste dla celu komórki efektorowe, na przykład komórki efektorowe połączone z kompozycjami (na przykład przeciwciała, cząsteczki wieloswoiste i dwuswoiste) według niniejszego wynalazku. Komórkami efektorowymi do ukierunkowywania mogą być ludzkie leukocyty, takie jak makrofagi, neutrofile lub monocyty. Do innych komórek należą eozynofile, komórki NK i inne komórki posiadające receptor IgG lub IgA. Jeżeli jest to pożądane, komórki efektorowe można uzyskać od leczonego osobnika. Swoiste dla celu komórki efektorowe można podawać w postaci zawiesiny komórek w fizjologicznie dopuszczalnym roztworze. Liczba podawanych komórek może być rzędu od 10 8 do 10 9, będzie się jednak różnić w zależności od celu terapeutycznego. Ogólnie ilość będzie wystarczająca do uzyskania lokalizacji na komórce docelowej, na przykład komórce nowotworowej wykazującej ekspresję CLD18, i do wywarcia efektu zabijania komórek na przykład na drodze fagocytozy. Różne mogą być także drogi podawania. [0268] Terapię swoistymi wobec celu komórkami efektorowymi można prowadzić w skojarzeniu z innymi sposobami usuwania ukierunkowanych komórek. Terapię przeciwnowotworową z zastosowaniem kompozycji według niniejszego wynalazku i(lub) komórek efektorowych z tymi kompozycjami można stosować w skojarzeniu z chemioterapią. Dodatkowo można stosować immunoterapię skojarzoną do ukierunkowywania dwóch odrębnych populacji efektorów cytotoksycznych na odrzucanie komórek nowotworowych. Przeciwciała anty-cld18 połączone z anty-fc-ri lub anty-cd3 można na przykład

137 stosować w skojarzeniu ze środkami swoiście wiążącymi receptor IgG lub IgA. [0269] Cząsteczki dwuswoiste i wieloswoiste według wynalazku można również wykorzystywać do modulowania poziomu Fc-gammaR lub Fc-alfaR na komórkach efektorowych, na przykład przez stosowanie czapeczek i eliminowanie receptorów na powierzchni komórek. Do tego celu można również stosować mieszaniny receptorów anty- Fc. [0270] Kompozycje (na przykład przeciwciała, cząsteczki wieloswoiste i dwuswoiste oraz immunokoniugaty) według niniejszego wynalazku, posiadające miejsca wiązania dopełniacza, takie jak części z IgG 1, 2 lub 3, lub IgM wiążące dopełniacz, można również stosować w obecności dopełniacza. W jednym z przykładów wykonania leczenie ex vivo populacji komórek, w skład której wchodzą komórki docelowe, środkiem wiążącym według niniejszego wynalazku, i odpowiednimi komórkami efektorowymi, można uzupełnić dodaniem dopełniacza lub surowicy zawierającej dopełniacz. Fagocytozę komórek docelowych powleczonych środkiem wiążącym według niniejszego wynalazku można ulepszyć przez wiązanie białek dopełniacza. W innym przykładzie wykonania komórki docelowe powlekane kompozycjami według niniejszego wynalazku można również poddawać lizie dopełniaczem. W jeszcze innym przykładzie wykonania kompozycje według niniejszego wynalazku nie aktywują dopełniacza. [0271] Kompozycje według niniejszego wynalazku można również podawać razem z dopełniaczem. Zgodnie z tym objęte zakresem wynalazku są kompozycje zawierające przeciwciała, cząsteczki wieloswoiste lub dwuswoiste

138 oraz surowicę lub dopełniacz. Te kompozycje są korzystne pod tym względem, że dopełniacz znajduje się w bliskim sąsiedztwie przeciwciał, cząsteczek wieloswoistych lub dwuswoistych. [0272] Zamiast tego, przeciwciała, cząsteczki wieloswoiste lub dwuswoiste według niniejszego wynalazku i dopełniacz lub surowicę można podawać oddzielnie. Wiązanie kompozycji według niniejszego wynalazku z komórkami docelowymi powoduje translokację kompleksu antygen CLD18-przeciwciało do tratw lipidowych błony komórkowej. Taka translokacja powoduje powstanie dużej gęstości kompleksów antygenprzeciwciało, które mogą skutecznie aktywować i(lub) wzmagać CDC. [0273] Kompozycje przeciwciał według niniejszego wynalazku (na przykład przeciwciała i immunokoniugaty) i instrukcje ich zastosowania mogą wchodzić w skład zestawu. Zestaw może ponadto zawierać jeden lub więcej niż jeden dodatkowy odczynnik, taki jak odczynnik immunosupresyjny, środek cytotoksyczny lub środek radiotoksyczny, albo jedno lub więcej niż jedno dodatkowe przeciwciało według wynalazku (na przykład przeciwciało wykazujące uzupełniającą aktywność). [0274] Zgodnie z tym, pacjentom leczonym kompozycjami przeciwciał według niniejszego wynalazku można dodatkowo podawać (przez podaniem przeciwciał według wynalazku, jednocześnie z ich podawaniem lub po ich podaniu) inny środek terapeutyczny, taki jak środek cytotoksyczny lub radiotoksyczny, który nasila lub wzmaga efekt terapeutyczny przeciwciał według wynalazku.

139 [0275] W innych przykładach wykonania osobnik może być dodatkowo leczony środkiem, który moduluje, na przykład wzmaga lub hamuje, ekspresję lub aktywność receptorów Fc-gamma lub Fc-alfa, takim jak na przykład cytokina. Do korzystnych cytokin należą czynnik stymulujący kolonie granulocytów (G-CSF), czynnik stymulujący kolonie granulocytów i makrofagów (GM-CSF), interferon γ (IFN- γ) i czynnik martwicy nowotworu (TNF). Innymi ważnymi środkami do zwiększania skuteczności terapeutycznej opisywanych tu przeciwciał i kompozycji farmaceutycznych są -glukany, które są homopolisacharydami rozgałęzionych reszt glukozy i są wytwarzane przez szereg roślin i drobnoustrojów, takich jak na przykład bakterie, algi, grzyby, drożdże i zboża. Można także stosować fragmenty -glukanów wytwarzanych przez organizmy. Korzystnie, -glukan jest polimerem (1,3)-glukozy, w którym co najmniej część rdzeniowych jednostek glukozy, na przykład 3-6% rdzeniowych jednostek glukozy, ma rozgałęzienia, takie jak rozgałęzienia (1,6). [0276] Sposoby wykrywania obecności antygenu CLD 18 w próbce lub oznaczania ilości antygenu CLD18 mogą obejmować stykanie próbki i próbki kontrolnej z przeciwciałem, które swoiście wiąże się z CLD18, w warunkach umożliwiających tworzenie się kompleksu między przeciwciałem lub jego częścią a CLD18. Następnie tworzenie kompleksu wykrywa się, przy czym różnica w tworzeniu się kompleksów między próbkami w porównaniu z próbką kontrolną wskazuje na obecność antygenu CLD18 w próbce.

140 [0277] Sposób wykrywania obecności lub ilościowego oznaczania wykazujących ekspresję CLD18 komórek in vivo lub in vitro może obejmować (i) podawanie osobnikowi kompozycji według wynalazku sprzężonej z wykrywalnym markerem; (ii) eksponowanie osobnika na techniki wykrywania tego wykrywalnego markera celem identyfikowania okolic zawierających komórki wykazujące ekspresję CLD18. [0278] Opisane powyżej metody są użyteczne w szczególności do diagnozowania chorób związanych z CLD18 i(lub) lokalizowania chorób związanych z CLD18, takich jak choroby nowotworowe. Korzystnie ilość CLD18, korzystnie CLD18-A2 w próbce, wyższa od ilości CLD18, korzystnie CLD18-A2, w próbce kontrolnej wskazuje na obecność choroby związanej z CLD18 u osobnika, w szczególności u człowieka, od którego pochodzi próbka. [0279] W jeszcze innym przykładzie wykonania immunokoniugaty według niniejszego wynalazku można stosować do ukierunkowywania związków (na przykład środków terapeutycznych, znaczników, cytotoksyn, radiotoksyn, immunosupresantów itd.) na komórki, wykazujące na swej powierzchni ekspresję CLD18, przez wiązanie takich związków z przeciwciałem. [0280] Niniejszy wynalazek jest poniżej zilustrowany następującymi przykładami, które nie mają na celu ograniczenia zakresu wynalazku. PRZYKŁADY 1. Wytwarzanie mysich przeciwciał przeciwko CLD18 a. Immunizacja: [0281] Myszy Balb/c lub C57/BL6 immunizowano eukariotycznymi wektorami ekspresyjnymi, kodującymi

141 140 ludzkie fragmenty CLD18 (SEQ ID nr 15, 16; 17, 18) g lub 25 g DNA plazmidowego wstrzykiwano do mięśnia czworogłowego (domięśniowo - i.m.) w dniach 1 i 10 celem uzyskania przeciwciał monoklonalnych z zestawu 1 lub zamiast tego w dniach 1 i 9, 1 i 11 lub 1, 16 i 36 celem uzyskania przeciwciał monoklonalnych z zestawu 2 w obecności adiuwantów, na przykład CpG (szczegóły - zob. tabela 1b). CpG, jak również komórki transfekowane CLD 18A2 (SEQ ID nr 1), same lub kotransfekowane dodatkowo mysim rozpuszczalnym CD40L kodującym RNA, wstrzykiwano domięśniowo; PEI-Man wstrzykiwano domięśniowo lub dootrzewnowo. Obecność przeciwciał skierowanych przeciwko ludzkiemu CLD18 w surowicy myszy monitorowano metodą mikroskopii immunofluorescencyjnej między dniem 16 a 43 w zależności od konkretnego zastosowanego protokołu immunizacji. Immunofluorescencję oznaczano, stosując komórki HEK293 przejściowo transfekowane kwasem nukleinowym kodującym konstrukt fuzyjny zawierający ludzkie CLD18A2 (SEQ ID nr 1, 2) i fluorescencyjne białko reporterowe. Myszom z wykrywalną odpowiedzią immunologiczną (Fig. 1) podawano dawkę przypominającą na trzy dni przed usunięciem śledziony celem wytworzenia przeciwciał monoklonalnych z zestawu 1 lub myszom podawano dawkę przypominającą na trzy dni, trzy i dwa dni przed usunięciem śledziony, lub myszy podawano dawkę przypominającą na cztery, trzy i dwa dni przed usunięciem śledziony celem wytworzenia przeciwciał monoklonalnych z zestawu 2 przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 5 x 10 7 lub zamiast tego 1 x 10 8 komórek HEK293 przejściowo transfekowanych kwasem nukleinowym kodującym ludzki CLD18A2 (SEQ ID nr 1, 2)

142 141 (szczegóły - zob. tabela 1b). W tabeli 1a zastosowane protokoły immunizacji są przeznaczone do odpowiednich przeciwciał monoklonalnych. Tab. 1a: Protokoły immunizacji zastosowane do wytworzenia przeciwciał monoklonalnych mab Protokół immunizacji* mab Protokół immunizacji Zestaw 1 24H E B A D E D D G C H B8 6 38G A3 6 38H3 45 9E F B C6 45 Zestaw 2 45C E E D E12 51 * Konkretne protokoły immunizacji - zob. tab. 1b

143 142 Tab. 1b: Szczegółowe protokoły immunizacji Protokół Immunizacja (dawka pierwsza i Monitoring Dawki przypominające komórek immunizacji dawki przypominające DNA) w surowicy transfekowanych Wektorami Z adiuwantem transfeko- kotransfe- usunięciem Dzień Dzień Komórki Komórki Dni przed DNA kodującymi wane samym kowane śledziony fragmenty CLD18A2 (SEQ CLID18A2(SE CLD 18 ID nr 1) Q ID nr 1) i mysim rozpuszczalnym RNA kodującym CD40L 6 SEQ ID nr 50 g CpG 1 i x 10 7 Nieobecne 3 15: 50 g transfekowanych komórek 40 SEQ ID nr 17: 50 g 45 SEQ ID nr 15: 50 g MC3T3 50 g CpG 1 i x 10 7 komórek HEK293; 100 g CPG jako adiuwant 50 g CpG 1 i x komórek HEK293 3

144 SEQ ID nr 15: 25 g 53 I dawka: SEQ ID nr 15: 25 g i SEQ ID nr 17: 25 g; Dawka przypominająca: SEQ ID nr 17: 50 g 2,5 l PEI- Man* (150 mm) w H 2 O z 5% glukozą 50 g CpG w H 2 O z 5% glukozą 1, 16 i 36 * in vivo-jetpei -Man z PolyPlus Transfection 22, 30 i 43 5 x 10 7 transfekowanych komórek HEK293 I i x 10 7 transfekowanych komórek HEK293 Nieobecne 3 i 2 Nieobecne 4, 3 i 2

145 144 b. Wytwarzanie hybrydom produkujących ludzkie przeciwciała monoklonalne przeciwko CLD 18: [0282] Izolowano mysie splenocyty i poddano je fuzji z PEG do mysiej linii komórek szpiczaka według standardowych protokołów. Powstałe hybrydomy poddano następnie badaniu przesiewowemu pod kątem wytwarzania immunoglobulin o swoistości CLD18 z wykorzystaniem komórek HEK293 transfekowanych kwasem nukleinowym kodującym ludzki CLD 18 na drodze analizy FACS. [0283] Zawiesiny pojedynczych komórek limfocytów śledziony, pochodzących od immunizowanych myszy poddawano fuzji z P3X63Ag8U.1 niewydzielającymi mysimi komórkami szpiczaka (ATCC, CRL 1597) w stosunku 2:1, stosując 50% PEG (Roche Diagnostics, CRL ). Komórki posiano z gęstością około 3 x 10 4 /studzienkę w płaskodennych płytkach do mikromiareczkowania, i następnie przez około dwa tygodnie inkubowano w selektywnej pożywce, zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej, 2% fuzji hybrydomy i suplement do klonowania (HFCS, Roche Diagnostics, CRL ) plus 10 mm HEPES, 0,055 mm 2-merkaptoetanolu, 50 mg/ml gentamycyny i 1x HAT (Sigma, CRL H0262). Po dniach poszczególne studzienki poddawano badaniu przesiewowemu metodą cytometrii przepływowej pod kątem przeciwciał monoklonalnych anty-cld18. Hybrydomy wydzielające przeciwciała ponownie posiano, znowu poddano badaniu przesiewowemu i jeżeli nadal były dodatnie w odniesieniu do przeciwciał monoklonalnych anty-cld18, subklonowano przez rozcieńczenie ograniczające. Następnie stabilne subklony hodowano in vitro, żeby

146 145 uzyskać małe ilości przeciwciała na płytkach do hodowli tkankowej do badania ich właściwości. Wybierano co najmniej jeden klon z każdej hybrydomy, zachowujący reaktywność komórek rodzicielskich (metodą FACS). W odniesieniu do każdego klonu uzyskano 9 fiolek banku komórkowego i przechowywano je w ciekłym azocie. c. Wybór przeciwciał monoklonalnych wiążących się z CLD18: [0284] W celu ustalenia izotypu przeciwciał przeprowadzono ELISA izotypu. Do określenia podklas Ig zidentyfikowanych, reagujących z CLD 18 przeciwciał monoklonalnych zastosowano mysi zestaw monoab ID Kit (Zymed, CRL ) lub zamiast tego zestaw do izotypowania mysich przeciwciał monoklonalnych IsoStrip (Roche, nr kat ). Uzyskano 19 linii komórek hybrydoma, definiowanych jako zestaw 1 (Set1) sześć z fuzji komórek od myszy C57/BL6 immunizowanej CLD18A2- pętlą D3 (SEQ ID nr 17, 18), 13 z fuzji komórek od myszy Balb/c immunizowanej CLD18A2-pętlą 1 (SEQ ID nr 15, 16); te komórki wykazywały ekspresję następujących przeciwciał: 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9 24H5: mysie monoklonalne przeciwciało IgG2b, κ, 182- D B5: mysie monoklonalne przeciwciało IgG2a, κ, 182- D , DSM ACC D12: mysie monoklonalne przeciwciało IgG3, κ, 182- D , DSM ACC2746

147 146 28D10: mysie monoklonalne przeciwciało IgG3, κ, 182- D , DSM ACC G11: mysie monoklonalne przeciwciało IgG2a, κ, 182- D , DSM ACC H8: mysie monoklonalne przeciwciało IgG3, κ, 182- D , DSM ACC G5: mysie monoklonalne przeciwciało IgG3, κ, 182- D , DSM ACC H3: mysie monoklonalne przeciwciało IgG3, κ, 182- D , DSM ACC F11: mysie monoklonalne przeciwciało IgG3, κ, 182- D , DSM ACC C6: mysie monoklonalne przeciwciało IgG2a, κ, 182- D E12: mysie monoklonalne przeciwciało IgG2a, κ, 182- D , DSM ACC A11: mysie monoklonalne przeciwciało IgG2a, κ, 182- D , DSM ACC E10: mysie monoklonalne przeciwciało IgG3, κ, 182- D D12: mysie monoklonalne przeciwciało IgG3, κ, 182-D C2: mysie monoklonalne przeciwciało IgG2b, κ, 182- D , DSM ACC B8: mysie monoklonalne przeciwciało IgM, κ, 182-D A3: mysie monoklonalne przeciwciało IgM, κ, 182-D E8: mysie monoklonalne przeciwciało IgM, κ, 182-D

148 147 19B9: mysie monoklonalne przeciwciało IgM, κ, 182-D [0285] Wytworzono pięć linii komórek hybrydoma, definiowanych jako zestaw 2 (Set2): jedną z fuzji komórek od myszy Balb/c immunizowanej CLD18A2-pętlą D3 (SEQ ID nr 17, 18) i CLD18A2-pętlą D1 (SEQ ID nr 15, 16), cztery z fuzji komórek od myszy Balb/c immunizowanych CLD18BA2-pętlą D1 (SEQ ID nr 15, 16), wykazujących ekspresję następujących przeciwciał: 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 175D10 45C1: mysie monoklonalne przeciwciało IgG2a, κ, 182- D E1: mysie monoklonalne przeciwciało IgG2a, κ, 182- D , DSM ACC E12: mysie monoklonalne przeciwciało IgG3, κ, 182- D , DSM ACC E2: mysie monoklonalne przeciwciało IgG3, κ, 182- D D10: mysie monoklonalne przeciwciało IgG 1, κ, 182- D , DSM ACC Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych [0286] Wytwarzanie i oczyszczanie przeciwciał monoklonalnych reagujących na CLD18: w celu wytworzenia przeciwciała w ilościach rzędu mg do określania charakterystyki funkcjonalnej, komórki hybrydomy posiano w bioreaktorach dializacyjnych (CELLine CL1000 integra, Chur, Szwajcaria) w ilości 2 x 10 6 komórek/ml. Nadsącz zawierający przeciwciała zbierano jeden raz w tygodniu. Mysie przeciwciało monoklonalne oczyszczano, stosując Melon Gel (Pierce, Rockford, USA) i zatężano przez wytrącanie siarczanem amonowym lub zamiast tego

149 148 oczyszczano z użyciem białka A, stosując FPLC. Stężenie i czystość przeciwciała określano w teście BCA; czystość sprawdzano przez elektroforezę w żelu z dodecylosiarczanem sodu i przez barwienie Coomassie. 3. Charakterystyka wiązania przeciwciał monoklonalnych a. Kontrola jakości transfektantów w WB, IF: [0287] W celu wytworzenia komórek wykazujących ekspresję CLD18A2, komórki HEK293 lub CHO transfekowano kwasami nukleinowymi kodującymi CLD18A2 (SEQ ID nr 1, 2) lub CLD18A2-myc (SEQ ID nr 3,4). [0288] Komórki HEK293 transfekowano CLDN18A2-myc (SEQ ID nr 3, 4) lub pozostawiano bez transfekcji. 24 godzin po transfekcji komórki zebrano, poddano lizie i elektroforezę w żelu z dodecylosiarczanem sodu. Żel poddano blottingowi i barwiono mysim przeciwciałem anty-myc. Po inkubacji z wyznakowanym peroksydazą przeciwciałem antymysim blot wywołano, stosując odczynnik ECL, i wizualizowano za pomocą urządzenia LAS-3000 Imager (Fuji). Tylko w komórkach transfekowanych, lecz nie w kontroli ujemnej, obserwowano prążek o oczekiwanej masie cząsteczkowej CLD18-myc (Fig. 2). [0289] Komórki CHO transfekowano CLD18A2 (SEQ ID nr 1, 2) i hodowano na płytkach typu Chamber Slides przez 24 h. Komórki utrwalano metanolem i barwiono króliczym przeciwciałem poliklonalnym przeciwko CLD18 w stężeniu 1 g/ml przez 60 min w temperaturze 25 C. Po przepłukaniu komórki zabarwiono wyznakowaną Alexa488 kozią IgG antykróliczą (Molecular Probes) i oceniano metodą mikroskopii fluorescencyjnej. Fig. 3 przedstawia transfekowane komórki CHO, wykazujące ekspresję CLD 18

150 149 na błonie komórkowej, jak również komórki nietransfekowane. Te komórki wykazujące heterologiczną ekspresję CLD 18 zastosowano do następujących testów w celu oceny swoistości wiązania przeciwciała. b. Wybór przeciwciał monoklonalnych wiążących się z CLD18/pierwsze badania przesiewowe metodą cytometrii przepływowej: [0290] Komórki HEK293 kotransfekowano wektorami ekspresyjnymi kodującymi ludzki CLD18A2 (SEQ ID nr 1, 2) i fluorescencyjnym białkiem reporterowym na 40 h przed testem lub zamiast tego wykorzystano zastosowano komórki HEK293 wykazujące stabilną ekspresję ludzkiego CLD 18A2 (HEK293-CLD18A2) i zastosowano przeciwbarwienie jodkiem propidyny (PI). Po oddzieleniu komórek z zastosowaniem 2mM EDTA/PBS komórki przepłukano kompletną pożywką wzrostową i posiewano z gęstością około 1-5 x 10 5 komórek/studzienkę w płytkach do mikromiareczkowania o dnie w kształcie litery U. Komórki inkubowano przez 30 min w temperaturze 4 C z nadsączem hybrydomy, po czym następowały dwa etapy płukania 1% unieczynnionym cieplnie FBS/PBS i na koniec inkubacja ze sprzężonym z APC lub Alexa647 antymysim swoistym przeciwciałem drugorzędowym klasy IgG. Po dwóch etapach płukania kotransfekowane komórki utrwalano CellFIX (BD Biosciences). Wiązanie oceniano metodą cytometrii przepływowej, stosując BD FACSArray. Sporządza się wykres zależności wiązania przeciwciała (oś pionowa) od ekspresji markera fluorescencji (oś pozioma). Stwierdzono, że wszystkie z przeciwciał mysich: 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2,

151 150 75B8, 85A3, 9E8, 19B9, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 i 175D10 wiążą się swoiście z powierzchnią komórek wykazujących ekspresję markera fluorescencji (Fig. 4, komórki w Q2), czego przykładem są nadsącze hybrydom zawierające przeciwciała monoklonalne 24H5 (Fig. 4A, komórki w Q2), 85A3 (Fig. 4B), 175D10, 125E1, 163E12, 166E2 i 45C1 (Fig. 4C, komórki w Q1). c. Porównanie wiązania przeciwciała z CLD18A2 z tagiem Myc lub HA [0291] Określano dokładniejszą charakterystykę wiązania zidentyfikowanych, swoistych wobec CLD18 przeciwciał monoklonalnych. Analizowano więc wiązanie przeciwciała monoklonalnego z mutantami CLD18A2, uzyskanymi przez wprowadzenie tagów epitopowych. CLD18A2-HA (SEQ ID nr 6) zawiera tag epitopowy HA w CLD18A2-pętli 1, natomiast CLD18A2-Myc (SEQ ID nr 4) zawiera tag epitopowy Myc wprowadzony do CLD18A2-pętli 2. Jako że wprowadzenie tych tagów powoduje niszczenie epitopów, zidentyfikowane przeciwciała monoklonalne można dzielić na grupy w zależności od utrat wiązania z dowolnym z mutantów. Komórki HEK293 przejściowo kotransfekowane markerem fluorescencji i ludzkim CLD18A2, markerem fluorescencji i CLD18A2-HA albo markerem fluorescencji i CLD18A2-Myc inkubowano z nadsączami hybrydom, zawierającymi swoiste wobec CLD18 przeciwciała monoklonalne przez 30 min w temperaturze 4 C, po czym inkubowano je ze sprzężonym z Alexa647 antymysim przeciwciałem drugorzędowym klasy IgG. Przed analizą na BD FACSArray, komórki utrwalono z użyciem CellFIX. Jak ukazano przykładowo w odniesieniu do 24H5, 9E8, 26B5 i 19B9 na Fig. 5, przeciwciała monoklonalne można dzielić

152 151 na podstawie charakterystyki wiązania na cztery różne grupy: (i) przeciwciała, które wiążą się z niezmodyfikowanym CLD18A2, jak również z CLD18A2-HA i CLD18A2-Myc, na przykład 24H5, (Fig. 5A); (ii) przeciwciała, które nie wiążą się z CLD18A2-HA, na przykład 9E8 (Fig. 5B) (iii) przeciwciała, które nie wiążą się z CLD18A2-Myc, na przykład 26B5 (Fig. 5C) (iv) przeciwciała, które nie wiążą się ani z CLD18A2- HA, ani z CLD18A2-Myc, na przykład 19B9 (Fig. 5D). d. Porównanie wiązania przeciwciał z ludzkim CLD18A1 z transfektantami CLD18A2 metodą cytometrii przepływowej. [0292] Swoistość wiązania zidentyfikowanych przeciwciał monoklonalnych z izoformami CLD18A2 analizowano metodą cytometrii przepływowej. Komórki HEK293 wykazujące stabilną ekspresję ludzkiego CLD18A2 (HEK293-CLD18A2) i komórki HEK293 wykazujące stabilną ekspresję ludzkiego CLD18A1 (SEQ ID nr 7, 8) (HEK293-CLD18A1) inkubowano przez 30 min w temperaturze 4 C z nadsączami hybrydom, zawierającymi przeciwciała monoklonalne, i następnie prowadzono inkubację ze sprzężonym z Alexa647 antymysim drugorzędowym przeciwciałem IgG i komórki utrwalano, albo zamiast tego komórek nie utrwalano, lecz poddawano przeciwbarwieniu PI. Wiązanie oceniano metodą cytometrii przepływowej z zastosowaniem BD FACSArray. Fig. 6 przedstawia przykłady dwóch grup przeciwciał monoklonalnych, które zidentyfikowano w panelu złożonym z 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 175D10: (i) przeciwciała monoklonalne 43A11, 45C1 i 163E12

153 152 wiążą się swoiście z ludzkim CLD18A2, lecz nie z ludzkim CLD18A1 (Fig 6A, B) (ii) przeciwciało monoklonalne 37H8 wiąże z obiema izoformami ludzkimi (Fig 6A). e. Porównanie wiązania przeciwciała z ludzkim CLD18A1 w porównaniu z transfektantami CLD18A2 metodą mikroskopii immunofluorescencyjnej: [0293] Komórki HEK293 przejściowo transfekowano wektorem ekspresyjnym, kodującym białko fuzyjne CLD18A1 (SEQ ID nr 8) lub CLD18A2 (SEQ ID nr 2) z reporterem fluorescencji i hodowano na płytkach Chamber Slides. Komórki barwiono w stanie nieutrwalonym lub po utrwaleniu paraformaldehydem przeciwciałem monoklonalnym, zawierającym nadsącz hodowli tkankowej przez 30 min w temperaturze 37 C. Po przepłukaniu komórki zabarwiono wyznakowanym Alexa555 antymysim przeciwciałem Ig (Molecular Probes). Wiązanie przeciwciał oceniano metodą mikroskopii fluorescencyjnej. Jak ukazano na Fig. 7, przeciwciało 37G11 swoiście reagowało z CLD18A2 (Fig. 7A), lecz nie z CLD18A1 (Fig. 7B). Przeciwciało 26B5 reagowało natomiast zarówno z CLD18A2, jak i z CLD18A (Fig. 8). [0294] W przypadku przeciwciał 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9, obserwowano wyraźną różnicę między barwieniem żywych komórek a barwieniem komórek utrwalonych paraformaldehydem. Przeciwciała tworzyły jednolite barwienie błony po utrwaleniu komórek (Fig. 7C, 8C, 8D). Inkubacja żywych komórek z tymi przeciwciałami prowadzi natomiast do wytworzenia skupisk białka,

154 153 widocznych jako cętkowany wzorzec barwienia (Fig. 7A, 8A, 8B). Oznacza to, że wszystkie przeciwciała wiążą się z epitopami natywnymi, znajdującymi się na powierzchni żywych komórek. f. Określenie linii komórkowych wykazujących ekspresję endogenną: [0295] Parę primerów swoistych wobec genu CLD18A2 (SEQ ID nr 11, 12) zastosowano w analizach RT-PCR celem badania przesiewowego linii komórkowych w odniesieniu do ekspresji CLD18A2. Stwierdzono, że ludzkie linie komórek raka żołądka NCI-SNU-16 (ATCC CRL-5974), NUGC-4 (JCRB0834) i KATO-III (ATCC HTB-103) oraz ludzka linia komórek gruczolakoraka trzustki DAN-G (DSMZ ACC249) wykazują silną endogenną ekspresję CLD18 (Fig. 9). Ekspresję potwierdzono na poziomie białka przez barwienie króliczą surowicą poliklonalną przeciwko CLD18. g. Barwienie wykazujących endogenną ekspresję linii komórkowych CLD18-swoistymi przeciwciałami i analiza immunofluorescencji: [0296] Komórki DAN-G, SNU-16, NUGC-4 i KATO-III hodowano w płytkach Chamber Slides w standardowych warunkach. Komórki pozostawiano bez utrwalenia lub zamiast tego utrwalano metanolem i barwiono odpowiednimi przeciwciałami. W przypadku przeciwciał 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9 obserwowano barwienie powierzchni komórek, czego przykład ukazano na Fig. 10, 11 i 12A. W przypadku przeciwciał 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 i 175D10 oceniano rozpoznawanie epitopu natywnego i

155 154 obserwowano barwienie powierzchni komórek na komórkach nieutrwalonych, jak ukazano na Fig 12B. Podgrupy przeciwciał wykazywały homogenne barwienie błony komórkowej, albo głównie na powierzchni granicznej między komórkami, albo na wolnych częściach błony, nieprzylegających do innych komórek. Inne przeciwciała barwiły odrębne ogniska i agregaty na błonie komórkowej, co w sumie dowodzi, że odpowiednie przeciwciała wiążą się z różnymi epitopami, w tym z epitopami, które są maskowane przez homotypowe lub heterotypowe połączenie CLD18, jak również epitopy CLD18 dostępne w uprzednio wytworzonych obwódkach zamykających. h. Barwienie wykazujących endogenną ekspresję linii komórkowych metodą cytometrii przepływowej: [0297] Analizowano ekspresję powierzchniową ulegającej konstytutywnej ekspresji CLD18A2 na żywych komórkach KATO-III i NUGC-4 metodą cytometrii przepływowej. Przykładem tego są komórki KATO-III i NUGC-4 barwione przeciwciałem monoklonalnym 61C2 lub 163E12 i następnie inkubowane ze sprzężonym z Alexa647 antymysim przeciwciałem drugorzędowym IgG, po czym następuje (lub nie następuje) utrwalenie komórek. Wiązanie oceniano metodą cytometrii przepływowej, stosując BD FACSArray. Fig. 13 przedstawia silne wiązanie 61C2 z co najmniej 70,3% komórek KATO-III i 163E12 z CLD18A2 na komórkach KATO-III i NUGC-4. i. Dopasowanie sekwencji mysiego i ludzkiego CLD18A1 i CLD18A2: [0298] Ludzki CLD18A2 (NP_ ) i ludzki CLD18A1 (NP_057453) w porównaniu sekwencji różnią się na końcu

156 155 N; mysie warianty CLD18 (NP_ i AAL15636) wykazują dużą homologię i miejsca zmienności sekwencji przy porównaniu cząsteczek (zob. Fig. 14). j. Reaktywność przeciwciał z mysim CLD18A1 i mysim CLD18A2 analizowano metodą cytometrii przepływowej: [0299] Wiązanie zidentyfikowanych przeciwciał monoklonalnych z mysim CLD18A2 i CLD18A1 analizowano metodą cytometrii przepływowej. Komórki HEK293 przejściowo kotransfekowane z markerem fluorescencji i mysim CLD18A2 (SEQ ID nr 33, 35) albo z markerem fluorescencji i mysim CLD18A1 (SEQ ID nr 36, 37) inkubowano z nadsączami hybrydom, zawierającymi ludzkie CLD 18-swoiste przeciwciała monoklonalne, odpowiednio, 38G5, 38H3, 37G11, 45C1 i 163E12, przez 30 min w temperaturze 4 C, po czym przeprowadzano inkubację sprzężonym z Alexa647 antymysim przeciwciałem drugorzędowym IgG i utrwalenie komórek. Wiązanie oceniano metodą cytometrii przepływowej, stosując BD FACSArray. Fig. 15 przedstawia trzy różne profile wiązania: 38G5 i 45C1 nie wiążą się z żadną z mysich izoform CLD18, 37G11 i 163E12 wiążą się z mysim CLD18A2, lecz nie z mysim CLD18A1, a 38H3 wiąże się z mysim CLD18A1 i CLD18A2. Te przeciwciała są cennymi narzędziami do określania potencjalnej toksyczności przeciwciał monoklonalnych CLD 18 w badaniach przedklinicznych. [0300] Dane te w sumie dowodzą, że przeciwciała monoklonalne według wynalazku 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 i 175D10, skierowane przeciwko CLD18,

157 156 wykazują rozmaitą charakterystykę wiązania z różnymi epitopami i ludzkim CLD18 o różnej topologii. [0301] Można stosować kombinację różnych właściwości opisanych w przykładach 3b, c, d, e, g, h i j do podziału przeciwciał monoklonalnych na takie różne klasy. 4. Badania immunohistochemiczne (IHC) [0302] Przeciwciało swoiste przeciwko epitopowi CLD18A2, wytworzone przez immunizację peptydem o SEQ ID nr 21, zastosowano do immunohistochemicznego określenia właściwości ekspresji CLD18A2. Do analiz ekspresji i lokalizacji białka zastosowano zatopione w parafinie skrawki tkanek, pochodzące z szerokiego panelu tkanek prawidłowych i tkanek nowotworowych. W żadnej prawidłowej tkance ani narządzie nie wykryto znamiennej ekspresji, z wyjątkiem żołądka (zob. tabela 2, Fig. 16A). Ekspresję CLD18A2 potwierdzono natomiast metodami immunohistochemicznymi w różnych nowotworach, w tym w nowotworze żołądka i nowotworze płuca (Fig. 16B). [0303] Co ciekawe, ekspresja białka CLD18A2 w śluzówce żołądka była ograniczona do końcowo zróżnicowanych komórek nabłonka żołądka w okolicach podstawy i dołeczków żołądkowych. Komórki w okolicy szyjkowej śluzówki żołądka, w szczególności komórki macierzyste żołądka w części cieśniowej, z których odbudowuje się cała śluzówka, nie wykazują ekspresji CLD18A2 (Fig. 16C). Tab. 2: Ekspresja CLD18A2 w tkankach prawidłowych i nowotworowych, analizowana metodą IHC Typ tkanki Wynik Nadnercze - Pęcherz moczowy -

158 157 Krwinki - Szpik kostny - Sutek - Okrężnica - Śródbłonek - Przełyk - Jajowód - Serce - Nerka (kłębek, cewka) - Wątroba - Płuco - Węzeł chłonny - Jajnik - Trzustka - Przytarczyce - Przysadka - Łożysko - Gruczoł krokowy - Skóra - Śledziona - Żołądek - Mięsień poprzecznie - prążkowany Jądro - Grasica - Tarczyca - Moczowód - Macica (szyjka, - endometrium) [0304] Przeciwciało monoklonalne 39F11 zastosowano do badań immunohistochemicznych swoistych wobec CLD18A2. Jak ukazano na Fig. 17A, w żadnej z badanych tkanek prawidłowych nie wykrywano znamiennej reaktywności, z wyjątkiem żołądka (Fig. 17A), natomiast raki żołądka i raki płuca pozostawały silnie dodatnie (Fig. 17B). [0305] Inna grupa przeciwciał według wynalazku prezentuje swoisty nowotworowy wzorzec barwienia, z wiązaniem z nowotworem żołądka, lecz bez reaktywności z prawidłową tkanką żołądka. Taki wzorzec barwienia

159 158 ukazano na Fig. 18A, z przeciwciałem monoklonalnym 26B5. [0306] Badania immunohistochemiczne wykorzystano do analizy swoistości 175D10 (Fig. 18B), 43A11 (Fig. 18C), 163E12 (Fig. 18D) i 45C1 (Fig. 18E) na skrawkach pochodzących z linii komórek nowotworowych HEK293: linie komórek nowotworowych HEK293, wykazujące stabilną ekspresję ludzkiego CLD18A2 (HEK293-CLD18A2) lub CLD18A1 (HEK293-CLD18A1) albo transfekowane plazmidem regulującym ekspresję, zawierające tylko gen oporności na antybiotyk do selekcji (HEK293-kontrola) przeszczepiano ksenogenicznie myszom, żeby uzyskać guzy lite. W guzach po transfekcji ksenogenicznej kontroli HEK293 ekspresja nie była wykrywalne. W przeszczepionych ksenogenicznie guzach HEK293-CLD18A2 i w próbkach raka żołądka obserwowano natomiast silne i homogenne barwienie błonowe. 5. Cytotoksyczność zależna od dopełniacza (CDC) a. CDC przeciwciał monoklonalnych z zestawu 1, mierzona metodą cytometrii przepływowej: [0307] Sporządzono osocze do lizy z udziałem dopełniacza przez pobranie krwi od zdrowych ochotników do probówek typu Vacutainer S-Monovette-EDTA (Sarstedt, Nurmbrecht, Niemcy), które następnie odwirowywano przy 600 g przez 20 min. Osocze zebrano i przechowywano w temperaturze -20 C. [0308] W pierwszej serii doświadczeń nadsącze hybrydom analizowano pod kątem ich zdolności do indukowania cytotoksyczności zależnej od dopełniacza (CDC) przeciwko komórkom HEK293 wykazującym stabilną ekspresję ludzkiego CLD18A2 (HEK293-CLD18A2). Komórki

160 159 inkubowano z nadsączami hybrydoma, zawierającymi, odpowiednio, przeciwciała monoklonalne 85A3, 28D10, 24H5 lub 26D12, przez 20 min w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu (5 min przy 450 g) nadsącz usunięto, do komórek dodano 20% ludzkie osocze w DMEM (wstępnie ogrzane do temperatury 37 C) i inkubowano przez kolejne 20 min w temperaturze 37 C. Następnie określano lizę komórek na FACS, stosując metodę barwienia z użyciem jodku propidyny (PI). PI dodawano do ostatecznego stężenia 2,5 g/ml. Do cytometrii przepływowej użyto cytometru przepływowego BD FACSArray (BD Biosciences, Mountain View, CA, USA). Do analizy zebrano co najmniej zdarzeń, z wyłączeniem resztek komórek poprzez korektę progu przedniej i bocznej detekcji rozproszenia (FCS). Odsetek komórek, które uległy lizie (komórki PIdodatnie) ukazano na Fig. 19. Przeciwciała monoklonalne 85A3, 28D10 i 26D12 indukowały lizę, odpowiednio, 33,5%, 38,2% i 39,2%, komórek HEK293-CLD18A2, natomiast CDC zależna od 24H5 wynosiła zaledwie 19,3%. b. CDC przeciwciał monoklonalnych z zestawu 1: [0309] W drugiej serii doświadczeń analizowano swoistość przeciwciał monoklonalnych do indukowania CDC na komórkach wykazujących ekspresję CLD18A2. Zestaw przeciwciał wiążących się swoiście z ludzkim CLD18A2 lub także wiążących się z ludzkim CLD18A1 badano pod kątem indukcji CDC wobec komórek CHO stabilnie transfekowanych ludzkim CLD18A2 (CHO-CLD18A2) lub ludzkim CLD18A1 (CHO-CLD18A1). Komórki CHO-CLD18A2 i CHO-CLD18A1 posiano 24 h przed testem z gęstością 3 x 10 4 /studzienkę na płaskodennej płytce do mikromiareczkowania do hodowli tkankowej. Następnego

161 160 dnia pożywkę wzrostową usunięto i komórki inkubowano w trzech powtórzeniach z nadsączami hybrydom, skorygowanymi do stężenia 10 g/ml, zawierającymi, odpowiednio, przeciwciała monoklonalne 24H5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12 i 61C2. Komórki kontrolne inkubowano z pożywką wzrostową lub z pożywką wzrostową zawierającą 0,2% saponiny celem określenia, odpowiednio, lizy tła i lizy maksymalnej. Po inkubacji przez 20 min w temperaturze pokojowej nadsącz usunięto, do komórek dodano 20% ludzkie osocze w DMEM (wstępnie ogrzane do temperatury 37 C) i inkubowano przez kolejne 20 min w temperaturze 37 C. Następnie nadsącze zastąpiono PBS, zawierającym 2,5 g/ml bromku etydowego i mierzono emisję fluorescencji po pobudzeniu przy długości fali 520 nm za pomocą Tecan Safire. Procent lizy swoistej obliczono w następujący sposób: % lizy swoistej = (fluorescencja próbki fluorescencja tła) /(fluorescencja lizy maksymalnej fluorescencja tła) x 100. Fig. 20 ukazuje, że przeciwciała monoklonalne 26D12, 28D10, 37H8, 38H3 i 39F11 pośredniczą w CDC silnej, przeciwciało monoklonalne 38G5 pośredniczy w CDC umiarkowanej, przeciwciała monoklonalne 41C6 i 61C2 pośredniczą w CDC słabej, a przeciwciała monoklonalne 24H5, 37G11, 42E12, 43A11, 44E10 i 47D12 nie pośredniczą w CDC przeciwko komórkom CHO-CLD18A2. Żadne z przeciwciał nie jest natomiast zdolne do indukowania CDC przeciwko komórkom CHO-CLDA1, jakkolwiek 26D12, 28D10, 37H8, 38H3, 39F11, 41C6, 47D12 i 61C2 wiążą się również z CLD18A1, co stwierdzono metodą cytometrii przepływowej i immunofluorescencji.

162 161 c. Miareczkowanie przeciwciał monoklonalnych i CDC z zastosowaniem przeciwciał monoklonalnych z zestawu 1: [0310] W celu zmierzenia zdolności przeciwciał anty- CLD18 do indukowania CDC w małym stężeniu, przeprowadzono doświadczenie, w którym miareczkowano trzy różne przeciwciała. Komórki CHO-CLD18A2, rosnące w płytkach do mikromiareczkowania, inkubowano z podanymi przeciwciałami w podanym zakresie stężenia: 75B8 (100, 30, 10, 3 i 1 g/ml), 37H8 (10, 3,3 i 1 g/ml) i 28D10 (10, 1 i 0,1 g/ml), przez 20 min w temperaturze pokojowej. Nadsącz usunięto, do komórek dodano 20% ludzkie osocze w DMEM (wstępnie ogrzane do temperatury 37 C) i inkubowano przez kolejne 20 min w temperaturze 37 C. Przed analizą za pomocą Tecan Safire nadsącze zastąpiono PBS, zawierającym 2,5 g/ml bromku etydowego. Fig. 21A-C przedstawia odsetek lizy swoistej w funkcji stężenia przeciwciała. Przeciwciało monoklonalne 75B8 indukuje lizę 31,0% komórek CHO- CLD18A2 w stężeniu 10 g/ml; wartość ta spada do 6,2% w stężeniu 1 g/ml (Fig. 21A), podczas gdy przeciwciała monoklonalne 28D10 i 37H8 nadal indukują, odpowiednio, 39% i 26,5% lizy swoistej w stężeniu 1 g/ml (Fig. 21B, C). d. CDC przeciwciał monoklonalnych z zestawu 2, oznaczona metodą cytometrii przepływowej: [0311] Surowicę do lizy z udziałem dopełniacza sporządzono poprzez pobranie krwi od zdrowych ochotników do probówek typu Vacutainer Serum-Monovette (Sarstedt, Nurmbrecht, Niemcy), które następnie wirowano przy 600 g przez 20 min. Surowicę zebrano i przechowywano w temperaturze -20 C. Surowicę kontrolną

163 162 unieczynniano cieplnie w temperaturze 56 C przez 30 min przed przechowywaniem. [0312] Nadsącze hybrydom analizowano pod kątem ich zdolności do indukowania cytotoksyczności zależnej od dopełniacza (CDC) przeciwko komórkom KATO-III wykazującym endogenną ekspresję ludzkiego CLD18A2. Komórki inkubowano z nieoczyszczonymi lub oczyszczonymi nadsączami hybrydom, zawierającymi, odpowiednio, przeciwciała monoklonalne 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 i 175D10, przez 30 min w temperaturze 37 C. Do komórek dodano 20% ludzką surowicę w RPMI i inkubowano przez kolejne 30 min w temperaturze 37 C. Następnie określano lizę komórek na FACS, stosując metodę barwienia jodkiem propidyny (PI). PI dodawano do ostatecznego stężenia 2,5 g/ml. Do cytometrii przepływowej zastosowano cytometr przepływowy BD FACSArray (BD Biosciences, Mountain View, CA, USA). Do analizy zebrano co najmniej zdarzeń, z wyłączeniem resztek komórek poprzez korektę progu przedniej i bocznej detekcji rozproszenia ((FSC/SSC)). Lizę swoistą obliczono z następującego wzoru: liza swoista = (% PI-dodatnich komórek w próbce - % PI-dodatnich komórek w próbce z surowicą unieczynnioną cieplnie). Szczególnie silną lizę zależną od CDC obserwowano w przypadku 163E Cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał (ADCC) [0313] Nadsącze hybrydom analizowano pod kątem ich zdolności do indukowania cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC) przeciwko komórkom HEK293 wykazującym stabilną ekspresję ludzkiego CLD18A2

164 163 (HEK293-CLD 18A2) lub ludzkiego CLD18A1 (HEK293-CLD 18A1). a. Wzbogacanie ludzkich obwodowych krwinek jednojądrzastych: ludzką krew od zdrowych dawców rozcieńczono dwukrotnie w buforze fosforanowym (PBS) i krwinki nakładano warstwą na Ficoll (pożywka Lymphocyte Separation Medium 1077 g/ml, PAA Laboratories, nr kat. J15-004). Obwodowe krwinki jednojądrzaste (MNC) zebrano z powierzchni granicznej, przepłukano i ponownie zawieszono w pożywce hodowlanej RPMI 1640 z dodatkiem 10% unieczynnionej cieplnie płodowej surowicy cielęcej, 2 mm L-glutaminy. b. Przygotowanie ADCC: komórki docelowe wyznakowano ligandem wzmagającym fluorescencję (BADTA, zestaw do badania cytotoksyczności firmy Perkin Elmer, odczynniki do badania cytotoksyczności DELFIA EuTDA, nr kat. AD0116) przez 30 minut. Po intensywnym płukaniu z RPMI- 10 z dodatkiem 10 mm probenecydu (Sigma, nr kat. P8761), mm HEPES i 10% unieczynnionej cieplnie płodowej surowicy cielęcej ilość komórek doprowadzono do 1 x 10 5 komórek/ml. Wyznakowane komórki docelowe, komórki efektorowe (MNC) i nadsącze zawierające przeciwciała monoklonalne doprowadzone do stężenia 10 g/ml dodawano do okrągłodennych płytek do mikromiareczkowania. W przypadku izolowanych komórek efektorowych zastosowano stosunek efektora do celu (E:T) wynoszący 100:1 (danych nie ukazano dla 50: 1 i 25:1). Po inkubacji (2 godziny, 37 C), testy przerwano przez odwirowanie i mierzono uwalnianie ligandu fluorescencyjnego z duplikatów w zliczeniach europu w fluorometrze czasowo-rozdzielczym. Procent

165 164 cytotoksyczności komórkowej obliczono z zastosowaniem następującego wzoru: % lizy swoistej = (zliczenia uwalniania w doświadczeniu - zliczenia uwalniania samoistnego) / (zliczenia uwalniania maksymalnego - zliczenia uwalniania samoistnego) x 100, przy czym maksymalne uwalnianie ligandu fluorescencyjnego określano przez dodanie do komórek docelowych Triton X- 100 (stężenie ostateczne 0,25%), a uwalnianie samoistne mierzono w nieobecności przeciwciał i komórek efektorowych. Fig. 22 ukazuje, że przeciwciała monoklonalne 26B5, 37H8, 38G5, 47D12 i 61C2 pośredniczą w ADCC przeciwko komórkom HEK293-CLD18A2. Przeciwciała te nie indukują natomiast cytotoksyczności wobec celów CLD18A1 albo indukują ją na niskim poziomie co dowodzi ADCC swoistej wobec CLD18A2 (Fig. 23). 7. Hamowanie proliferacji [0314] Oczyszczone mysie przeciwciała monoklonalne analizowano pod kątem ich zdolności do hamowania wzrostu komórek KATO-III wykazujących endogenną ekspresję ludzkiego CLD18A2. [0315] 1x10 4 komórek docelowych, wykazujących endogenną ekspresję CLD18A2 (KATO-III), hodowano w obecności około 10 g przeciwciał monoklonalnych. [0316] Zestaw DELFIA Cell Proliferation Kit (Perkin- Elmer, nr kat. AD0200) jest nieizotopowym testem immunologicznym opartym na pomiarze włączania 5-bromo- 2'-deoksyurydyny (BrdU) w czasie syntezy DNA proliferujących komórek w mikropłytkach. Włączona BrdU jest wykrywana z zastosowaniem wyznakowanego europem przeciwciała monoklonalnego. W celu umożliwienia wykrywania przeciwciała komórki utrwala się, a DNA

166 165 denaturuje, stosując roztwór Fix. Niezwiązane przeciwciało wymywa się i dodaje się induktor DELFIA celem oddysocjowania jonów europu z wyznakowanego przeciwciała do roztworu, gdzie tworzą one wysoce fluorescencyjne chelaty ze składowymi induktora DELFIA. Fluorescencja zmierzona metodą fluorometrii czasoworozdzielczej w detekcji jest proporcjonalna do syntezy DNA w komórce w każdej studzience. [0317] Silne hamowanie proliferacji obserwowano, odpowiednio, przy zastosowaniu przeciwciał 125E1, 163E12, 45C1, 37G11, 37H8, 28D10 i 166E2. Umiarkowane hamowanie proliferacji obserwowano przy zastosowaniu, odpowiednio, mysich przeciwciał 43A11, 175D10, 42E12, 26D12, 61C2 i 38H3. 8. Wydajność w terapeutycznym mysim modelu przeszczepienia ksenogenicznego [0318] Badano potencjał terapeutyczny zidentyfikowanego swoistego wiązania przeciwciał monoklonalnych z CLD18A2 w terapeutycznych modelach przeszczepienia ksenogenicznego a. Wczesne leczenie guzów wykazujących wysoki poziom ekspresji CLD18A2 u myszy [0319] Myszom SCID zaszczepiano podskórnie 1 x 10 7 komórek HEK293 wykazujących stabilną ekspresję na wysokim poziomie ludzkiej CLD18A2 (HEK293-CLD18A2). Poziom ekspresji ludzkiego CLD18A2 w komórkach HEK293- CLD 18A2 był porównywalny z poziomem ekspresji w pierwotnych nowotworach żołądka u pacjentów. Każda grupa leczenia doświadczalnego składała się z 10 myszy (liczba myszy na grupę n=10). Terapię myszy rozpoczynano 3 dni po zaszczepieniu guza. 200 g

167 166 oczyszczonych nadsączy hybrydom, odpowiadających mysim przeciwciałom monoklonalnym 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 39F11, 42E12, 43A11, 38H3 lub 61C2, wstrzykiwano jeden raz w tygodniu przez 4 tygodnie, dożylnie. Alternatywnie podawano 200 g oczyszczonych nadsączy hybrydom, zawierających mysie przeciwciała monoklonalne 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 lub 175D10 dwa razy w tygodniu przez 6 tygodni, na przemian przez wstrzyknięcie dożylne i dootrzewnowe. Wzrost guza u leczonych myszy monitorowano dwa razy w tygodniu (objętość guza = długość x szerokość x szerokość podzielone na 2 w mm 3 ). Myszy uśmiercano, gdy guz osiągał objętość 500 mm 3 lub w przypadku ciężkiego stanu chorobowego. Fig. 24 stanowi przykład silnego hamowania wzrostu komórek HEK293-CLD18A2 przez przeciwciała według wynalazku. Fig. 25A i 25B ukazują wydłużenie przeżycia przez leczenie przeciwciałami według wynalazku w modelu wczesnego leczenia przeszczepienia ksenogenicznego z wykorzystaniem komórek HEK293-CLD18A2. b. Rozpoczynane późno leczenie zaawansowanych guzów wykazujących ekspresję CLD18A2 na wysokim poziomie u myszy [0320] Ten sam model przeszczepienia ksenogenicznego oparty na komórkach HEK293-CLD18A2 opracowano jako protokół późnego rozpoczynania terapii, w odróżnieniu od wczesnego leczenia, opisanego powyżej. W dniu 27. po zaszczepieniu komórek nowotworowych myszy podzielono losowo na grupy badane po 5-6 myszy i rozpoczęto leczenie 200 g oczyszczonych nadsączy hybrydom, zawierających, odpowiednio, mysie przeciwciała

168 167 monoklonalne 43A11, 163E12 i 175D10. Przeciwciała podawano dwa razy w tygodniu przez 6 tygodni, na przemian przez wstrzyknięcie dożylne i dootrzewnowe. Również w tym modelu wykazano, że przeciwciała według wynalazku hamują wzrost guza. W przypadku niektórych przeciwciał powodowało to wydłużenie przeżycia (Fig. 26). c. Wczesne leczenie guzów wykazujących ekspresję CLD18A2 na niskim poziomie [0321] Myszom SCID zaszczepiano podskórnie 2 x 10 5 komórek z linii komórek nowotworowych DAN-G - linii komórek naciekającego ludzkiego gruczolakoraka trzustki, wykazujących konstytutywną ekspresję białka CLD18A2 na niskim poziomie. Leczenie myszy (10 na grupę) rozpoczynano 3 dni po przeszczepieniu guza: 200 g oczyszczonych nadsączy hybrydom, zawierających mysie przeciwciała monoklonalne 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 lub 175D10 podawano dwa razy w tygodniu przez 6 tygodni, na przemian przez wstrzyknięcie dożylne i dootrzewnowe. Z uwagi na agresywny i szybki wzrost guza z linii komórek nowotworowych trzustki DAN-G in vivo u myszy rozwinęła się kacheksja nowotworowa i padły one w ciągu kilku dni. Mimo, że w konsekwencji okno do pomiaru efektów terapeutycznych było wąskie, w tym modelu również obserwowano hamowanie wzrostu guza i wydłużenie przeżycia zależne od przeciwciał według wynalazku (Fig. 27A i 27B). d Przeciwciała według wynalazku nie powodują objawów niepożądanych u myszy [0322] Mysią CLD18A2-swoistą parę primerów (s: CTA CCA AGG GCT ATG GCG TTC, as: GCA CCG AAG GTG TAC CTG GTC)

169 168 zastosowano w analizach RT-PCR do powielenia cdna pochodzącego z szerokiego panelu prawidłowych tkanek mysich (zob. Fig. 28). [0323] Ekspresja mysiego CLD 18A2 była niewykrywalna we wszystkich badanych tkankach prawidłowych, z wyjątkiem żołądka (zob. Fig. 28). Ponadto przeciwciało swoiste wobec CLD18A2, reagujące krzyżowo z ludzkim i mysim CLD 18A2, zastosowano do immunohistochemicznej analizy ekspresji CLD 18A2 w szerokim panelu prawidłowych tkanek mysich (zob. Tab. 3). Z wyjątkiem prawidłowej tkanki żołądka, żadna z badanych tkanek prawidłowych nie wykazuje ekspresji CLD18A2. Podobnie jak to obserwowano w przypadku ludzkiego CLD18A2, wykazano również w odniesieniu do odpowiednika mysiego, że o ile nabłonek powierzchni i głębszych krypt wykazuje ekspresję CLD18A2 na powierzchni komórek, centralny region szyjkowy jest CLD18A2-ujemny (zob. Fig. 29A-C). Podsumowując, można stwierdzić, że dystrybucja tkankowa CLD18A2 jest, jak się wydaje, identyczna u ludzi i u myszy. Tabela 3: Ekspresja CLD18 w obrębie prawidłowych tkanek mysich, analizowana metodami immunohistochemicznymi Tkanka Ekspresja CLD18 Móżdżek - Mózg - Okrężnica - Przełyk - Serce - Nerka - Wątroba - Płuco -

170 169 Węzeł chłonny - Jajnik - Trzustka - Mięsień szkieletowy - Śledziona - Żołądek + Grasica - Pęcherz moczowy - [0324] Autorzy badali następnie potencjalne efekty uboczne, zależne od przeciwciał 125E1, 163E12, 166E2 i 175D10, u myszy. W odniesieniu do wszystkich tych przeciwciał uprzednio wykazano w analizie FACS, że reagują one z mysim CLD18A2, jak również z białkiem ludzkim. [0325] Nie zaobserwowano żadnych widocznych efektów niepożądanych u myszy w czasie leczenia ani po leczeniu tymi przeciwciałami; nie stwierdzono również żadnych korelatów histomorfologicznych toksyczności w śluzówce żołądka myszy leczonych przeciwciałami w porównaniu z myszami nieleczonymi (otrzymującymi PBS) (zob. Fig. 30). 9. Chimeryzacja przeciwciał a. Wytwarzanie mysio-ludzkich chimerowych przeciwciał monoklonalnych [0326] Wytworzono RNA całkowite i następnie jednoniciowe cdna z ludzkich jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC) i z ludzkiej tkanki śledziony standardowymi metodami znanymi specjalistom, na przykład przez zastosowanie zestawu RNeasy Midi Kit

171 170 (Qiagen) i odwrotnej transkryptazy Superscript II (Invitrogen). [0327] Region stały ludzkiego łańcucha lekkiego kappa powielono z cdna PBMC metodą PCR. Oligomer sensowny (SEQ ID nr 38) dodał miejsce restrykcyjne BamHI na końcu 5' regionu stałego i zmienił wyjściową sekwencję kwasu nukleinowego 5'-CGAACT-3', kodującą dwa pierwsze aminokwasy (Arg-Thr) regionu stałego na 5'-CGTACG-3', tworząc miejsce restrykcyjne BsiWI bez zmiany sekwencji aminokwasowej. Oligomer antysensowny (SEQ ID nr 39) obejmował kodon stop i dodał miejsce restrykcyjne NotI na końcu 3 powielonego regionu stałego. Produkt PCR, jak również standardowy wektor ekspresyjny (na przykład pcdna3.1(+), Invitrogen), sekwencyjnie inkubowano z enzymami restrykcyjnymi BamHI i NotI. Wektor dodatkowo traktowano cielęcą jelitową fosfatazą zasadową, aby uniemożliwić recyrkulację. Region stały na koniec poddano ligacji do wektora, tak że wszelkie kolejne fuzje regionu zmiennego z przodu regionu stałego są obecnie możliwe przez miejsce restrykcyjne HindIII (5'- AAGCTT-3') z resztkowego wektorowego miejsca wielokrotnego klonowania i przez miejsce restrykcyjne BsiWI (5'-CGTACG-3'), wytworzone z użyciem produktu PCR. Sekwencja ludzkiego regionu stałego łańcucha lekkiego kappa wprowadzona do wektora jest wymieniona jako SEQ ID nr 40, sekwencja aminokwasowa ludzkiego regionu stałego łańcucha lekkiego kappa jest wymieniona jako SEQ ID nr 41. [0328] Region stały ludzkiego łańcucha ciężkiego gamma- 1 powielono z cdna śledziony metodą PCR. 5'- fosforylowany oligomer sensowny (SEQ ID nr 42)

172 171 umieszczono nad naturalnie występującym miejscem restrykcyjnym ApaI, znajdującym się 11 nukleotydów w dół od początku regionu stałego, i dodano miejsce restrykcyjne HindIII na końcu 5 powielonej części regionu stałego. 5'-fosforylowany oligomer antysensowny (SEQ ID nr 43) obejmował kodon stop i dodawał miejsce restrykcyjne NotI na końcu 3 tak powielonego regionu stałego. Wytworzony w ten sposób produkt PCR miał tępe końce i był 5'-fosforylowany. Powielony region stały gamma, jak zweryfikowano metodą PCR z użyciem rozróżniającego oligomeru antysensownego (SEQ ID nr 44) i przez sekwencjonowanie, należał do podklasy IgG 1. Standardowy wektor ekspresyjny (na przykład pcdna3.1(+)/hygro, Invitrogen) o oporności antybiotykowej (na przykład na higromycynę) różnej niż wektor użyty do ekspresji łańcucha lekkiego (na przykład na neomycynę) inkubowano z enzymem restrykcyjnym PmeI, żeby całkowicie usunąć miejsce wielokrotnego klonowania z pozostawieniem tępych końców. Dodatkowo wektor traktowano cielęcą jelitową fosfatazą zasadową, żeby uniemożliwić recyrkulację. Region stały poddano na koniec ligacji do wektora, tak, że wszelkie przyszłe fuzje regionu zmiennego z przodu regionu stałego stały się możliwe przez miejsce restrykcyjne HindIII (5'-AAGCTT-3') i przez miejsce restrykcyjne ApaI (5'-GGGCCC-3'); oba te miejsca wygenerowano z użyciem produktu PCR. Potwierdzono prawidłową orientację regionu stałego w wektorze, to znaczy orientację odpowiednią dla poprzedzającego promotora wektora, przez sekwencjonowanie. Z uwagi na położenie miejsca restrykcyjnego ApaI, jakiekolwiek

173 172 powielenie regionu zmiennego w tym celu musi oprócz sekwencji miejsca ApaI obejmować pierwszych Sekwencja tak powielonego ludzkiego regionu stałego łańcucha ciężkiego gamma-1 wprowadzoną do wektora jest wymieniona jako SEQ ID nr 45, sekwencja aminokwasowa ludzkiego regionu stałego gamma-1, którego ekspresję uzyskano w ten sposób, jest wymieniona jako SEQ ID nr 46. Tabela 4: Mysie linie komórek hybrydoma stosowane do klonowania przeciwciała Łańcuch ciężki Łańcuch lekki Klon mab 43A D E D E1 182-D E2 182-D D D C1 182-D A D E D E1 182-D Izotyp Region zmienny Para oligomerów w PCR nukleotydów sekwencji ludzkiego regionu stałego gamma- Przeciwciało chimeryzowane IgG2a SEQ ID SEQ ID nr SEQ ID nr nr 55, 70, , IgG3 SEQ ID SEQ ID nr SEQ ID nr nr 56, 72, , IgG2a SEQ ID SEQ ID nr SEQ ID nr nr 57, 74, , IgG3 SEQ ID SEQ ID nr SEQ ID nr nr 59, 78, , IgG1 SEQ ID SEQ ID nr SEQ ID nr nr 58, 76, , IgG2a SEQ ID SEQ ID nr SEQ ID nr nr 60, 80, , IgK SEQ ID SEQ ID nr SEQ ID nr nr 62, 84, , IgK SEQ ID SEQ ID nr SEQ ID nr nr 61, 82, , IgK SEQ ID SEQ ID nr SEQ ID nr nr 63, 86, , 123

174 E2 182-D D 10 45C1 45C1 45C1 45C1 182-D D D D D IgK SEQ ID SEQ ID nr SEQ ID nr nr 66, 92, , IgK SEQ ID SEQ ID nr SEQ ID nr nr 65, 90, , IgK SEQ ID SEQ ID nr SEQ ID nr nr 64, 88, , IgK SEQ ID SEQ ID nr SEQ ID nr nr 67, 94, , IgK SEQ ID SEQ ID nr SEQ ID nr nr 68, 96, , IgK SEQ ID SEQ ID nr SEQ ID nr nr 69, 98, , [0329] Chimerowym przeciwciałom monoklonalnym nadano nazwy ich odpowiedników mysich z dodatkiem przedrostka ch-, na przykład ch-43a11, ch-163e12, ch-125e1, ch- 166E2, ch-175d10, ch-45c1. [0330] Powielenie mysich regionów zmiennych łańcuchów lekkich i ciężkich przeprowadzono metodą step-out PCR opisaną w Matz i wsp. (Nucleic Acids Research, 1999, t. 27, nr 6). W tym celu wytworzono RNA całkowite z monoklonalnych linii komórek hybrydoma (zob. tabela 4) standardowymi metodami znanymi specjalistom, na przykład z wykorzystaniem zestawu RNeasy Mini Kit (Qiagen). Jednoniciowe cdna wytworzono metodą template-switch, opisaną także w Matz i wsp. (Nucleic Acids Research, 1999, t. 27, nr 6, 1558). Oprócz oligomeru (dt)30 (SEQ ID nr 47) obejmował on oligomer hybrydowy DNA/RNA (SEQ ID nr 48), służący jako 5'- adaptor do przełączania matrycy (ang. template switching) w czasie polimeryzacji nici cdna. W tym

175 174 adaptorze oligomerowym ostatnie trzy nukleotydy były to rybonukleotydy zamiast deoksyrybonukleotydów. W późniejszym etapie step-out PCR zastosowano oligomer antysensowny skierowany na region stały mysiego łańcucha kappa lub na region stały podklas 1, 2a lub 3 łańcuchów gamma (odpowiednio, SEQ ID nr 49-52). O analizie podklasy IgG mysiego przeciwciała monoklonalnego wytwarzanej przez linie komórek hybrydoma wspomniano powyżej analiza immunologiczna z użyciem IsoStrip (zob. przykład 1); odpowiednio do tego wybrano odpowiedni oligomer antysensowny (zob. tabela 4). W step-out PCR jako oligomer sensowy służyła mieszanina primerów, zawierająca dwa oligomery wymienione w SEQ ID nr 53 i 54. Niektóre linie komórek hybrydoma wykazywały ekspresję więcej niż jednego łańcucha ciężkiego lub lekkiego (oprócz łańcuchów ulegających ekspresji w linii komórek szpiczaka, stosowanej do wytworzenia hybrydomy). W tabeli 4 podsumowano numery sekwencji (SEQ ID) klonowanych i sekwencjonowanych regionów zmiennych łańcuchów przeciwciał mysich (SEQ ID nr i SEQ ID nr ) oraz klonowanych i sekwencjonowanych łańcuchów przeciwciał chimerowych o pełnej długości (SEQ ID nr ). [0331] Zidentyfikowane mysie regiony zmienne powielono następnie metodą PCR, omijając 5'-UTR i mysi region stały 3', dodając miejsca restrykcyjne do końców, co umożliwiło subklonowanie do wytworzonych wektorów ekspresyjnych, zawierających ludzkie regiony stałe. Oligomery sensowne dostarczyły ponadto konsensusowej sekwencji Kozak (5'-GCCGCCACC-3' lub 5'-AGCCACC-3'), a

176 175 oligomery antysensowne regionów zmiennych łańcucha ciężkiego obejmowały pierwszych 11 nukleotydów ludzkiego regionu stałego gamma-1 oprócz miejsca restrykcyjnego ApaI (zob. tabela 4, SEQ ID nr 70-99). Regiony zmienne łańcucha lekkiego kappa klonowano, stosując enzymy restrykcyjne HindIII i BsiWI, regiony zmienne łańcucha ciężkiego gamma wymagały enzymów restrykcyjnych HindIII i ApaI. Region zmienny łańcucha ciężkiego gamma przeciwciała monoklonalnego 45C1 zawierał wewnętrzne miejsce restrykcyjne HindIII w tym przypadku zamiast tego zastosowano wykazujący zgodność enzym BsaI (zob. SEQ ID nr 80). SEQ ID nr ukazują sekwencję kwasów nukleinowych uzyskanych przeciwciał chimeryzowanych (zob. tabela 4). SEQ ID nr ukazują sekwencje aminokwasowe ulegających zgodnie z nimi ekspresji przeciwciał chimeryzowanych (zob. tabela 4). b. Generowanie i produkcja przeciwciał chimerowych przeciwko CLD18 [0332] Wygenerowano linie komórek ssaków, produkujące przeciwciała chimerowe o swoistości CLD18. Linie komórkowe pochodziły z komórek HEK293T (ATCC CRL ). Na dzień przed transfekcją posiano 2,5 x 10 7 komórek w 14,5-cm płytce do hodowli tkankowej i hodowano w 20 ml pożywki pełnej, albo zamiast tego 1x10 7 komórek posiano w 10-cm płytce do hodowli tkankowej i hodowano w 10 ml pożywki pełnej, albo zamiast tego 0,6 x 10 6 komórek posiano do studzienek 12-studzienkowej płytki do hodowli tkankowej i hodowano w 2-3 ml pożywki pełnej (pożywka pełna: pożywka DMEM:F12 z dodatkiem 10% FBS bez antybiotyków).

177 176 Zalecaną gęstością komórek w momencie transfekcji powinna być zlewność 90%. Bezpośrednio przed transfekcją pożywkę zastąpiono świeżą pożywką. Komórki HEK293T transfekowano odczynnikami do transfekcji, takimi jak na przykład Lipofectamine 2000 (Invitrogen, ) lub zamiast tego Polyethylenimine (Sigma- Aldrich, ). Przykładowo, do transfekcji komórek HEK293T zastosowano DNA całkowite w ilości 110 g lub 296 g na 14,5-cm płytki do hodowli tkankowej; stosunek środka transfekującego do DNA wynosił, odpowiednio, 1:2,5 i 1:12 dla Lipofectamine 2000 i PEI. 24 h po transfekcji pożywkę zastąpiono pożywką odpowiednią z punktu widzenia GMP (Właściwej Praktyki Wytwarzania), na przykład X-Vivo 15 (Cambrex) lub zdefiniowaną chemicznie pożywką, taką jak Pro293a (Cambrex) bez surowicy. Transfekowane komórki HEK293T, wytwarzające chimerowe przeciwciała monoklonalne przeciwko CLD18, hodowano przez dalsze 96 h. Nieoczyszczony nadsącz zebrano, przefiltrowano w warunkach jałowych i oczyszczano białkiem A-Sepharose. Określono stężenie przeciwciał metodą BCA Assay; czystość sprawdzono poprzez elektroforezę w żelu z dodecylosiarczanu sodu i barwienie metodą Coomassie. c. Charakterystyka wiązania chimerowych przeciwciał monoklonalnych [0333] Swoistość wiązania klonowanych i wytworzonych chimerowych przeciwciał monoklonalnych przeciwko CLD18A2 analizowano metodą cytometrii przepływowej, jak opisano w przykładzie 3. Żywe komórki HEK293 wykazujące stabilną ekspresję ludzkiego CLD18A2 (HEK293-CLD18A2) i komórki HEK293 wykazujące stabilną ekspresję ludzkiego

178 177 CLD18A1 (SEQ ID nr 7, 8) (HEK293-CLD18A1) inkubowano przez 30 min w temperaturze 4 C z oczyszczonymi nadsączami hodowli komórek HEK293T, zawierającymi chimerowe przeciwciała monoklonalne, po czym następowała inkubacja ze sprzężonym z APC fragmentem F(ab')2 koziego antyludzkiego przeciwciała drugorzędowego Fcγ klasy IgG i przeciwbarwienie PI. Wiązanie oceniano metodą cytometrii przepływowej, stosując BD FACSArray. [0334] Podobnie metodą cytometrii przepływowej analizowano ludzkie linie komórek nowotworowych wykazujące endogenną ekspresję CLD18A2, takie jak na przykład komórki KATO-III i NUGC-4. Fig. 31A i B przedstawiają analizy metodą cytometrii przepływowej chimerowych przeciwciał ch-43a11, ch-125e1, ch-163e12, ch-166e2 i ch-175d10. Wszystkie one ukazują rozpoznawanie natywnego epitopu i wykazują swoiste i silne wiązanie z komórkami wykazującymi ekspresję CLD18A2, lecz nie CLD18A1. d. Cytotoksyczność zależna od dopełniacza (CDC) [0335] Sporządzono surowicę do lizy z udziałem dopełniacza poprzez pobranie krwi od zdrowych ochotników do probówek typu Vacutainer Serum-Monovette (Sarstedt, Nurmbrecht, Niemcy), które następnie wirowano przy 600 g przez 20 min. Surowicę zebrano i przechowywano w temperaturze -20 C. Surowicę kontrolną unieczynniono cieplnie w temperaturze 56 C przez 30 min przed przechowywaniem. [0336] Przeciwciała chimerowe według niniejszego wynalazku, oczyszczone białkiem A-Sepharose, analizowano pod kątem ich zdolności do indukowania

179 178 cytotoksyczności zależnej od dopełniacza (CDC) przeciwko komórkom KATO-III wykazującym endogenną ekspresję ludzkiego CLD18A2, jak również stabilnie transfekowanym komórkom CHO-CLD18A2. Komórki inkubowano z przeciwciałami monoklonalnymi, odpowiednio, ch- 163E12, ch-166e2 i ch-175d10, w ostatecznym stężeniu wynoszącym od 2,5 g/ml do 35 g/ml przez 30 min w temperaturze 37 C. Do komórek dodano 20% ludzkiej surowicy w RPMI i inkubowano przez kolejne 30 min w temperaturze 37 C. Następnie rozróżniano komórki martwe od żywych przez barwienie PI w ostatecznym stężeniu wynoszącym 2,5 g/ml i oceniano odsetek lizy komórek zależnej od przeciwciał metodą cytometrii przepływowej. Do analizy metodą cytometrii przepływowej zastosowano cytometr przepływowy BD FACSArray (BD Biosciences, Mountain View, CA, USA). Do analizy zebrano co najmniej zdarzeń, z wyłączeniem resztek komórek poprzez korektę progu przedniej i bocznej detekcji rozproszenia (FSC/SSC). Lizę swoistą obliczono z następującego wzoru: liza swoista = (% PI-dodatnich komórek w próbce - % PI-dodatnich komórek w próbce z unieczynnioną cieplnie surowicą). W odniesieniu do kilku przeciwciał wykazano lizę swoistą zależną od CDC. Wszystkie trzy przeciwciała pośredniczą w silnej CDC na komórkach CHO- CLD18A2 (Fig. 32). Na komórkach KATO-III przeciwciała ch-163e12 i ch-175d10 indukowały silną CDC. e. Cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał (ADCC) [0337] Oczyszczone przez FPLC przeciwciała chimerowe według wynalazku analizowano pod kątem ich zdolności do indukowania cytotoksyczności komórkowej zależnej od

180 179 przeciwciał (ADCC) przeciwko komórkom KATO-III wykazujących endogenną ekspresję ludzkiego CLD 18A2. [0338] Krew ludzką od zdrowych dawców rozcieńczono dwukrotnie w buforze fosforanowym (PBS) i krwinki rozprowadzono warstwą na (1077 g/ml, Pharmacia). Po odwirowaniu, obwodowe krwinki jednojądrzaste (PBMC) zebrano z powierzchni granicznej, przepłukano i ponownie zawieszono w pożywce hodowlanej X-Vivo-15 z dodatkiem 5% unieczynnionej cieplnie surowicy ludzkiej. [0339] 15 godzin przed testem komórki KATO-III transfekowano lucyferazą i posiewano z gęstością 5 x 10 4 komórek/studzienkę na białek mikropłytce. [0340] Do tego testu dodano komórki efektorowe (PBMC, uzyskane w sposób opisany powyżej) w stosunku efektora do celu (effector to target - E:T) wynoszącym 20:1 i oczyszczone przez FPLC przeciwciała chimerowe i całość inkubowano przez 2-3h w temperaturze 37 C, 5% CO 2. Ostateczne stężenie przeciwciała w studzience wynosiło 50 g/ml. Po 2-3h inkubacji wstępnej dodano żółcień lucyferową (BD Biosciences, San Jose USA) w stężeniu 1mg/ml. Mierzono luminescencję będącą skutkiem utlenienia żółcień lucyferowej przez lucyferazę żywych komórek, w sposób ciągły, przez czas do 6h, stosując czytnik do mikropłytek (Infinite200, Tecan, Szwajcaria). Obliczono procentową cytotoksyczność komórkową z następującego wzoru: % lizy swoistej = 100- ((zliczenia luminescencji w próbce - zliczenia luminescencji samoistnej) /( zliczenia luminescencji maksymalnej - zliczenia luminescencji samoistnej) x 100), przy czym luminescencję samoistną oznaczano przez

181 180 dodanie Triton X-100 (stężenie ostateczne 0,2%) i pomiar sygnału maksymalnego w nieobecności przeciwciał. [0341] Z użyciem tego testu wykazano, że przeciwciała monoklonalne ch-163e12 i ch-175d10 pośredniczą w silnej ADCC wobec komórek KATO-III (Fig. 33). f. Hamowanie proliferacji [0342] Oczyszczone przez FPLC przeciwciała chimerowe według wynalazku analizowano pod kątem ich zdolności do hamowania wzrostu komórek KATO-III wykazujących endogenną ekspresję ludzkiego CLD18A2. [0343] Komórki docelowe (KATO-III) hodowano w obecności odpowiednich przeciwciał chimerowych (zob. hamowanie proliferacji przeciwciał mysich - przykład 7). Wykazano, że oczyszczone przez FPLC przeciwciała chimerowe ch-163e12 i ch-166e2 hamują proliferację komórkową. 10. Selekcja przeciwciał najlepiej nadających się do zastosowania klinicznego [0344] Idealny środek, najlepiej nadający się do zastosowania klinicznego, to taki, który można stosować w szerokim spektrum zastosowania terapeutycznego i diagnostycznego (zob. także rozdz. IV Zastosowania i metody obejmujące przeciwciała według wynalazku ). Według wynalazku zapewnia się przeciwciała skierowane przeciwko CLD18-A2. Wykazano, że przeciwciała dostarczane według wynalazku zapewniają szerokie spektrum właściwości dotyczących swoistości, zdolności do indukowania CDC i ADCC i hamowania proliferacji komórek wykazujących ekspresję CLD18, w szczególności komórek nowotworowych. Wykazano ponadto, że chimeryzacja przeciwciał może prowadzić do nabycia

182 181 dodatkowych, zależnych od Fc funkcji efektorowych, nieobecnych w rodzicielskiej cząsteczce mysiej. Wykazano tu na przykład, że przeciwciało 175D10 z mysią IgG 1 nie indukuje cytotoksyczności zależnej od dopełniacza (zob. przykład 5), natomiast ch-175d10 z ludzką IgG 1 indukuje lizę swoistą komórek nowotworowych wykazujących konstytutywną ekspresję CLD 18 (zob. tabele 5 i 6). [0345] Przeciwciała według niniejszego wynalazku można podzielić na odrębne klasy według ich właściwości wiązania i ich zdolności do pośredniczenia w funkcjach efektorowych wobec komórek wykazujących ekspresję CLD18. Z przeciwciał według niniejszego wynalazku można wybierać przeciwciała najlepiej nadające się do zastosowania klinicznego na podstawie ich charakterystyki funkcjonalnej. Przegląd właściwości wybranych przeciwciał mysich i chimerowych według wynalazku podano, odpowiednio, w tabelach 5 i 6. [0346] Przeciwciała najlepiej nadające się do zastosowania klinicznego według niniejszego wynalazku mogą wykazywać jedną lub więcej niż jedną z następujących właściwości: a) wiązanie z ludzkim CLD18A2, lecz nie z ludzkim CLD18A1 (na przykład 43A11, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 i 175D10 i ch-43a11, ch-45c1, ch-125e1, ch-163e12, ch- 166E2 i ch-175d10). Zob. na przykład Fig. 6A i 6B. b) wiązanie z mysim CLD I 8A2, lecz nie z mysim CLD18A1 (na przykład 125E1, 163E12, 166E2 i 175D10). Zob. na przykład Fig. 15A i 15B. c) wiązanie z CLD18 ulegającymi naturalnej ekspresji w komórkach nowotworowych (na przykład 45C1, 43A11,

183 E1, 163E12, 166E2 i 175D10 i ch-45c1, ch-43a11, ch- 125E1, ch-163e12, ch-166e2 i ch-175d10). Zob. na przykład Fig. 13. d) wiązanie z CLD18 w strefach kontaktu międzykomórkowego (na przykład 45C1, 43A11, 125E1, 163E12, 166E2 i 175D10). Zob. na przykład Fig. 12A i 12B. e) pośredniczenie w indukowanym przez CDC zabijaniu komórek wykazujących ekspresję CLD18 (na przykład 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 i 175D10 i ch-163e12 i ch-175d10). Zob. na przykład Fig. 32. f) pośredniczenie w indukowanym przez ADCC zabijaniu komórek wykazujących ekspresję CLD18 (na przykład ch- 163E12 i ch-175d10). Zob. na przykład Fig. 33. g) hamowanie proliferacji komórek wykazujących ekspresję CLD18 (na przykład 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 i 175D10 oraz ch-163e12 i ch-166e2). h) hamowanie wzrostu guza w modelu przeszczepienia ksenogenicznego komórek wykazujących ekspresję CLD18 (na przykład 43A11, 125E1, 163E12, 166E2 i 175D10). Zob. na przykład Fig. 24. i) wydłużanie przeżycia w modelu przeszczepienia ksenogenicznego z komórkami wykazującymi ekspresję CLD18 (na przykład 43A11, 125E1, 163E12, 166E2 i 175D10). Zob. na przykład Fig. 25B. Przykładowy przegląd właściwości przeciwciał najlepiej nadających się do zastosowania klinicznego [0347] Tabela 5: Przeciwciała mysie

184 183 Przeciwciało Wiązanie ludzkiego CLD 18A2, lecz nie A1 Wiązanie Wiązanie mysiego CLD18 na CLD 18A2, lecz nie A1 naturalnie wykazujących ekspresję komórkach nowotworowych 45C Wiązanie z CLD18 w strefach kontaktu 125E (+) 163E D (+) Pośredniczenie w CDC wobec komórek wykazujących ekspresję CLD18 Legenda: + Wynik znakomity (+) Wynik w różnych ustawieniach. Tabela 6: Przeciwciała chimerowe Przeciwciało Wiązanie ludzkiego CLD 18A2, lecz nie A1 Wiązanie CLD18 na naturalnie wykazujących ekspresję komórkach nowotworowych ch-45c1 + + n.d. ch-125e1 + + n.d. ch-163e ch-175d Pośredniczenie CDC wobec komóre wykazujących ekspresję CLD18 Legenda: + Wynik znakomity (+) Wynik w różnych ustawieniach; n.d. WYKAZ SEKWENCJI [0348] <110> Ganymed Pharmaceuticals AG <120> Przeciwciała monoklonalne przeciwko klaudynie 18 do leczenia chorób nowotworowych <130> PCT <150> EP <151> <160> 150 <170> PatentIn, wersja 3.3

185 184 <210> 1 <211> 786 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 <210> 2 <211> 261 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

186 <210> 3 <211>

187 186 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 <210> 4

188 187 <211> 271 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 <210> 5 <211> 813 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5

189 188 <210> 6 <211> 270 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6

190 189

191 190 <210> 7 <211> 786 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 <210> 8 <211> 261

192 191 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8

193 192

194 193 <210> 9 <211> 795 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 9 <210> 10 <211> 795 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 10

195 194 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 11 tggctctgtg tcgacactgt g 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 12 gtgtacatgt tagctgtgga c 21 <210> 13 <211> 55 <212> PRT

196 195 <213> Homo sapiens <400> 13 <210> 14 <211> 153 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14

197 196 <210> 15 <211> 390 <212> DNA <213> Homo sapiens <500> 15 <210> 16

198 197 <211> 129 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 <210> 17 <211> 411 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17

199 198 <210> 18 <211> 136 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 <210> 19 <211> 531 <212> DNA <400> 17 <213> Homo sapiens <400> 19

200 199 <210> 20 <211> 176 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20

201 200 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22

202 201 <210> 23 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 <210> 24 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens 400> 24 <210> 25 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 <210> 26 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 <210> 27 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 <210> 28 <211> 55 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28

203 202 <210> 29 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 <210> 30 <211> 40 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 <210> 31 <211> 153 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31

204 203 <210> 32 <211> 3359 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 32

205 204

206 205 <210> 33 <211> 849 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 33

207 206 <210> 34 <211> 3350 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34

208 207

209 208

210 209 <210> 35 <211> 264 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 35

211 210

212 211 <210> 36 <211> 2786 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 36

213 212 <210> 37 <211> 264 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 37

214 213

215 <210> 38 <211> 40 <212> DNA <213> Sztuczny 214

216 215 <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 38 gagaggatcc cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 40 <210> 39 <211> 37 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 39 gagagcggcc gcctaacact ctcccctgtt gaagctc 37 <210> 40 <211> 324 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: produkt PCR <400> 40 <210> 41 <211> 107 <212> PRT <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: translacja produktu PCR <400> 41

217 216 <210> 42 <211> 34 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 42 gagaaagctt tccaccaagg gcccatcggt cttc 34 <210> 43 <211> 36 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 43 gagagcggcc gctcatttac ccggagacag ggagag 36 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczny

218 217 <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 44 taccagttga acttgacctc a 21 <210> 45 <211> 981 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: produkt PCR <400> 45 <210> 46 <211> 326 <212> PRT <213> Sztuczny

219 218 <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: translacja produktu PCR <400> 46

220 <210> 47 <211>

221 220 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 47 <220> <221> misc_feature <222> (31).. (32) <223> n is a, c, g, or t <400> 47 tttttttttt tttttttttt tttttttttt nn 32 <210> 48 <211> 30 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 48 aagcagtggt atcaacgcag agtacgcggg 30 <210> 49 <211> 26 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 49 ctgctcactg gatggtggga agatgg 26 <210> 50 <211> 25 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 50 gggacagtca ctgagctgct cagag 25 <210> 51

222 221 <211> 25 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 51 acaggggcca gtggatagac cgatg 25 <210> 52 <211> 27 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 52 agccagggac caagggatag acagatg 27 <210> 53 <211> 45 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 53 gtaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt 45 <210> 54 <211> 22 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 54 gtaatacgac tcactatagg gc 22 <210> 55 <211> 351

223 222 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: produkt PCR <400> 55 <210> 56 <211> 354 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: produkt PCR <400> 56 <210> 57 <211> 348 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: produkt PCR <400> 57

224 223 <210> 58 <211> 354 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: produkt PCR <400> 58 <210> 59 <211> 354 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: produkt PCR <400> 59 <210> 60

225 224 <211> 360 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: produkt PCR <400> 60 <210> 61 <211> 339 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: produkt PCR <400> 61 <210> 62 <211> 318 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: produkt PCR <400> 62

226 225 <210> 63 <211> 321 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: produkt PCR <210> 64 <211> 339 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: produkt PCR <400> 64 <210> 65 <211> 339 <212> DNA <213> Sztuczny

227 226 <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: produkt PCR <400> 65 <210> 66 <211> 336 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: produkt PCR <400> 66 <210> 67 <211> 339 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: produkt PCR <400> 67

228 227 <210> 68 <211> 339 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: produkt PCR <400> 68 <210> 69 <211> 321 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: produkt PCR <400> 69 <210> 70 <211> 43 <212> DNA

229 228 <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 70 gagaaagctt gccgccacca tggaatggac ctgggtcttt ctc 43 <210> 71 <211> 43 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 71 gagagggccc ttggtggagg ctgcagagac agtgaccaga gtc 43 <210> 72 <211> 47 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 72 gagaaagctt gccgccacca tggattggct gtggaacttg ctattcc 47 <210> 73 <211> 44 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 73 gagagggccc ttggtggagg ctgaggagac ggtgactgag gttc 44 <210> 74 <211> 46 <212> DNA <213> Sztuczny

230 229 <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 74 gagaaagctt gccgccacca tggaatggat ctggatcttt ctcttc 46 <210> 75 <211> 44 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 75 gagagggccc ttggtggagg ctgaggagac tgtgagagtg gtgc 44 <210> 76 <211> 46 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 76 gagaaagctt gccgccacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttc 46 <210> 77 <211> 43 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 77 gagagggccc ttggtggagg ctgaggagac tgtgagagtg gtg 43 <210> 78 <211> 47 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd

231 230 <400> 78 gagaaagctt gccgccacca tggaatggag gatctttctc ttcatcc 47 <210> 79 <211> 44 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 79 gagagggccc ttggtggagg ctgaggagac ggtgactgag gttc 44 <210> 80 <211> 51 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 80 gagaggtctc aagcttagcc accatggact ggatttggat catgctccat c 51 <210> 81 <211> 44 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 81 gagagggccc ttggtggagg ctgcagagac agtgaccaga gtcc 44 <210> 82 <211> 43 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 82 gagaaagctt gccgccacca tggaatcaca gactcaggtc ctc 43

232 231 <210> 83 <211> 34 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 83 cacacgtacg tttcagctcc agcttggtcc cagc 34 <210> 84 <211> 46 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 84 gagaaagctt gccgccacca tgcattttca agtgcagatt ttcagc 46 <210> 85 <211> 30 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 85 cacacgtacg ttttatttcc agcttggtcc 30 <210> 86 <211> 44 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 86 gagaaagctt gccgccacca tggagtttca gacccaggtc tttg 44 <210> 87 <211> 33

233 232 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 87 cacacgtacg tttgatttcc agcttggtgc ctc 33 <210> 88 <211> 46 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 88 gagaaagctt gccgccacca tggattcaca ggcccaggtt cttatg 46 <210> 89 <211> 30 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 89 cacacgtacg tttcagctcc agcttggtcc 30 <210> 90 <211> 46 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 90 gagaaagctt gccgccacca tggaatcaca gactcaggtc ctcatg 46 <210> 91 <211> 30 <212> DNA

234 233 <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 91 cacacgtacg ttttatttcc aactttgtcc 30 <210> 92 <211> 49 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 92 gagaaagctt gccgccacca tggattcaca ggcccaggtt cttatattg 49 <210> 93 <211> 30 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 93 cacacgtacg ttttatttcc agcttggtcc 30 <210> 94 <211> 46 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 94 gagaaagctt gccgccacca tggattcaca ggcccaggtt cttatg 46 <210> 95 <211> 30 <212> DNA <213> Sztuczny

235 234 <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 95 cacacgtacg ttttatttcc agcttggtcc 30 <210> 96 <211> 46 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 96 gagaaagctt gccgccacca tggattcaca ggctcaggtt cttatg 46 <210> 97 <211> 33 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 97 cacacgtacg tttcagctcc agcttggtcc cag 33 <210> 98 <211> 41 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 98 gagaaagctt agccaccatg gaatcacaga ctctggtctt c 41 <210> 99 <211> 30 <212> DNA <213> Sztuczny <220>

236 235 <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 99 cacacgtacg tttcagctcc agcttggtcc 30 <210> 100 <211> 1401 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: chimerowe przeciwciało monoklonalne <400> 100

237 236 <210> 101 <211> 1404 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: chimerowe przeciwciało monoklonalne <400> 101

238 237 <210> 102 <211> 1398 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: chimerowe przeciwciało monoklonalne <400> 102

239 238 <210> 103 <211> 1404 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: chimerowe przeciwciało monoklonalne <400> 103

240 239 <210> 104 <211> 1401 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: chimerowe przeciwciało monoklonalne <400> 104

241 240 <210> 105 <211> 1410 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: chimerowe przeciwciało monoklonalne <400> 105

242 241 <210> 106 <211> 723 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: chimerowe przeciwciało monoklonalne <400> 106

243 242 <210> 107 <211> 708 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: chimerowe przeciwciało monoklonalne <400> 107

244 243 <210> 108 <211> 705 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: chimerowe przeciwciało monoklonalne <400> 108 <210> 109 <211> 723 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: chimerowe przeciwciało monoklonalne <400> 109

245 244 <210> 110 <211> 723 <212> DNA <213> Sztuczny <400> 110 <210> 111 <211> 720

246 245 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: chimerowe przeciwciało monoklonalne <400> 111 <210> 112 <211> 723 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: chimerowe przeciwciało monoklonalne <400> 112

247 246 <210> 113 <211> 723 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: chimerowe przeciwciało monoklonalne <400> 113

248 247 <210> 114 <211> 705 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: chimerowe przeciwciało monoklonalne <400> 114

249 248 <210> 115 <211> 466 <212> PRT <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: chimerowe przeciwciało monoklonalne <400> 115

250 249

251 250 <210> 116 <211> 467 <212> PRT <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: chimerowe przeciwciało monoklonalne <400> 116

252 251

253 252

254 253 <210> 117 <211> 465 <212> PRT <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: chimerowe przeciwciało monoklonalne <400> 117

255 254 Met Glu Trp Ile Trp Ile Phe Leu Phe Ile Leu Ser Gly Thr Ala Gly Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg

256 255

257 256 <210> 118 <211> 467 <212> PRT <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: chimerowe przeciwciało monoklonalne <400> 118

258 257

259 258

260 259 <210> 119 <211> 466 <212> PRT <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: chimerowe przeciwciało monoklonalne

261 <400>

262 261

263 262

264 263 <210> 120 <211> 469 <212> PRT <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: chimerowe przeciwciało monoklonalne <400> 120

265 264

266 <210> 121 <211> 240 <212> PRT <213> Sztuczny 265

267 266 <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: chimerowe przeciwciało monoklonalne <400> 121

268 <210> 122 <211>

269 268 <212> PRT <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: chimerowe przeciwciało monoklonalne <400> 122

270 <210> 123 <211>

271 270 <212> PRT <213> Sztuczny <400> 123

272 271 <210> 124 <211> 240 <212> PRT <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: chimerowe przeciwciało monoklonalne <400> 124

273 <210> 125 <211> 240 <212> PRT 272

274 273 <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: chimerowe przeciwciało monoklonalne <400> 125

275 274 <210> 126 <211> 239 <212> PRT <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: chimerowe przeciwciało monoklonalne <400> 126

276 275 <210> 127 <211> 240 <212> PRT <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: chimerowe przeciwciało monoklonalne <400> 127

277 <210> 128 <211> 240 <212> PRT 276

278 277 <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: chimerowe przeciwciało monoklonalne <400> 128

279 278 <210> 129 <211> 234 <212> PRT <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: chimerowe przeciwciało monoklonalne <400> 129

280 <210> 130 <211> 18 <212> DNA 279

281 280 <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 130 ccaagggcta tggcgttc 18 <210> 131 <211> 18 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 131 ccgaaggtgt acctggtc 18 <210> 132 <211> 117 <212> PRT <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: translacja produktu PCR <400> 132

282 281 <210> 133 <211> 118 <212> DRAT <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: translacja produktu PCR <400> 133

283 282 <210> 134 <211> 116 <212> PRT <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: translacja produktu PCR <400> 134

284 283 <210> 135 <211> 118 <212> PRT <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: translacja produktu PCR <400> 135

285 284 <210> 136 <211> 118 <212> PRT <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: translacja produktu PCR <400> 136

286 285 <210> 137 <211> 120 <212> PRT <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: translacja produktu PCR <400> 137

287 286 <210> 138 <211> 113 <212> PRT <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: translacja produktu PCR <400> 138

288 287 <210> 139 <211> 106 <212> PRT <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: translacja produktu PCR <400> 139

289 288 <210> 140 <211> 107 <212> PRT <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: translacja produktu PCR <400> 140 <210> 141 <211> 113 <212> PRT <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: translacja produktu PCR

290 289 <400> 141 <210> 142 <211> 113 <212> PRT <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: translacja produktu PCR <400> 142

291 290 <210> 143 <211> 112 <212> PRT <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: translacja produktu PCR <400> 143 <210> 144 <211> 113 <212> PRT

292 291 <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: translacja produktu PCR <400> 144 <210> 145 <211> 113 <212> PRT <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: translacja produktu PCR <400> 145

293 292 <210> 146 <211> 107 <212> PRT <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: translacja produktu PCR <400> 146

294 293 <210> 147 <211> 324 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: optymalizowany pod względem kodonu kwas nukleinowy <400> 147 <210> 148 <211> 107 <212> PRT <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: optymalizowane pod względem kodonu białko

295 294 <400> 148 <210> 149 <211> 981 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: optymalizowany pod względem kodonu kwas nukleinowy <400> 149

296 295 <210> 150 <211> 326 <212> PRT <213> Sztuczny <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: optymalizowane pod względem kodonu białko <400> 150

297 296

298 297

299 298 Zastrzeżenia patentowe 1. Przeciwciało monoklonalne posiadające zdolność do wiązania się z klaudyną 18A2 (CLD18A2) i możliwe do otrzymania sposobem obejmującym etap immunizowania zwierzęcia peptydem o sekwencji aminokwasowej SEQ ID nr 16 albo kwasem nukleinowym lub komórką gospodarza wykazującą ekspresję tego peptydu, przy czym przeciwciało posiada zdolność do pośredniczenia w zabijaniu komórek nowotworowych wykazujących ekspresję CLD18A2 in vivo, a to zabijanie jest indukowane przez wiązanie przeciwciała z CLD 18A2 ulegającym ekspresji w tych komórkach, i przy czym przeciwciało pośredniczy w zabijaniu komórek wykazujących ekspresję CLD18A2 przez indukowanie lizy na drodze cytotoksyczności zależnej od dopełniacza (CDC) i(lub) lizy na drodze cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC). 2. Przeciwciało według zastrz. 1, które wiąże się z CLD18A1 i CLD18A2. 3. Przeciwciało według zastrz. 1, które wiąże się z CLD18A2, lecz nie z CLD18A1. 4. Przeciwciało według dowolnego z zastrz. 1-3, przy czym komórkami wykazującymi ekspresję CLD18A2 są komórki nowotworowe. 5. Przeciwciało według zastrz. 4, przy czym komórki nowotworowe są dobrane z grupy składającej się z karcynogennych komórek nowotworu żołądka, przełyku, trzustki i płuca.

300 Przeciwciało według dowolnego z zastrz. 1-5, przy czym liza zależna od ADCC zachodzi w obecności komórek efektorowych dobranych z grupy obejmującej monocyty, komórki jednojądrzaste, komórki NK i PMN. 7. Przeciwciało według dowolnego z zastrz. 1-6, które jest przeciwciałem chimerowym lub humanizowanym albo fragmentem przeciwciała. 8. Przeciwciało według dowolnego z zastrz. 1-7 dobrane z grupy składającej się z przeciwciała IgG1, IgGs2, korzystnie IgG2a i IgG2b, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, wydzielniczego przeciwciała IgA, IgD i przeciwciała IgE. 9. Przeciwciało według dowolnego z zastrz. 1-8, przy czym CLD18A2 posiada sekwencję aminokwasową SEQ ID nr Przeciwciało według dowolnego z zastrz. 2-9, przy czym CLD18A1 posiada sekwencję aminokwasową SEQ ID nr Przeciwciało według dowolnego z zastrz. 1-10, które wiąże się z epitopami natywnymi CLD18A2, obecnymi na powierzchni żywych komórek. 12. Przeciwciało według dowolnego z zastrz. 1-11, które jest swoiste wobec komórek nowotworowych, korzystnie komórek nowotworu żołądka. 13. Przeciwciało według dowolnego z zastrz. 1-12, przy czym CLD18A2 ulega ekspresji na powierzchni komórek. 14. Przeciwciało wytwarzane przez klon złożony pod numerem akcesyjnym DSM ACC2737, DSM ACC2738, DSM ACC2739, DSM ACC2740, DSM ACC2741, DSM ACC2742, DSM ACC2743, DSM ACC2745, DSM ACC2746, DSM ACC2747, DSM ACC2748, DSM ACC2808, DSM ACC2809 lub DSM ACC2810.

301 Przeciwciało, które jest chimeryzowaną lub humanizowaną postacią przeciwciała według zastrz Hybrydoma zdolna do wytwarzania przeciwciała według dowolnego z zastrz Hybrydoma złożona pod numerem akcesyjnym DSM ACC2737, DSM ACC2738, DSM ACC2739, DSM ACC2740, DSM ACC2741, DSM ACC2742, DSM ACC2743, DSM ACC2745, DSM ACC2746, DSM ACC2747, DSM ACC2748, DSM ACC2808, DSM ACC2809 lub DSM ACC Koniugat zawierający przeciwciało według dowolnego z zastrz sprzężone ze środkiem terapeutycznym. 19. Koniugat według zastrz. 18, w którym środkiem terapeutycznym jest toksyna, radioizotop, lek lub środek cytotoksyczny. 20. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca przeciwciało według dowolnego z zastrz i(lub) koniugat według zastrz. 18 lub 19 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. 21. Przeciwciało według dowolnego z zastrz. 1-15, koniugat według zastrz. 18 lub 19 lub kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 20 do zastosowania w leczeniu lub profilaktyce nowotworu, zawierającego komórki nowotworowe wykazujące ekspresję CLD18A2, przy czym to przeciwciało, koniugat lub kompozycja farmaceutyczna mają być podawane osobnikowi. 22. Przeciwciało, koniugat lub kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 21, przy czym nowotwór jest dobrany z grupy składającej się z nowotworu żołądka, nowotworu przełyku, nowotworu trzustki, nowotworu płuca, nowotworu jajnika, nowotworu

302 301 okrężnicy, nowotworu wątroby, nowotworu głowy i szyi i nowotworu pęcherzyka żółciowego. 23. Przeciwciało, koniugat lub kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 21 lub 22, w których CLD 18A2 ulega ekspresji na powierzchni komórek. Ganymed Pharmaceuticals AG Johannes Gutenberg-Universität Mainz, vertreten durch den Präsidenten Zastępca:

303 302

304 303

305 304

306 305

307 306

308 307

309 308

310 309

311 310

312 311

313 312

314 313

315 314

316 315

317 316

318 317

319 318

320 319

321 320

322 321

323 322

324 323

325 324

326 325

327 326

328 327

329 328

330 329

331 330

332 331

333 332

334 333

335 334

336 335

337 336

338 337

339 338

340 339

341 340

342 341

343 342

344 343

345 344

346 345

347 346

348 347

349 348

350 349

351 350