(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 PL/EP T3 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (1) T3 Int.Cl. A61K 39/39 (06.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy /29 EP B1 (4) Tytuł wynalazku: Sposoby leczenia szpiczaka mnogiego z zastosowaniem antagonistycznych monoklonalnych przeciwciał przeciwko CD40 () Pierwszeństwo: US P US 0279P US 04067P US P (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 06/31 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego /12 (73) Uprawniony z patentu: Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc., Emeryville, US XOMA Technology Ltd., Hamilton, BM (72) Twórca(y) wynalazku: Li LONG, Emeryville, US Mohammad LUQMAN, Emeryville, US Asha YABANNAVAR, Emeryville, US Isabel ZAROR, Emeryville, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Urszula Bartnik POLSERVICE KANCELARIA RZECZNIKÓW PATENTOWYCH SP. Z O.O. ul. Bluszczańska Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 4 Opis ZAKRES WYNALAZKU [0001] Wynalazek odnosi się do sposobów leczenia szpiczaka mnogiego z zastosowaniem antagonistycznych monoklonalnych przeciwciał przeciwko CD40. PODSTAWA WYNALAZKU 1 2 [0002] Szpiczak mnogi (ang. multiple myeloma MM) jest złośliwą komórką B, charakteryzującą się ukrytym nagromadzeniem w szpiku kostnym wydzielniczych komórek osocza o niskim indeksie proliferacyjnym i wydłużonym czasie życia. Choroba ostatecznie atakuje kości i szpik, powodując powstawanie wielu guzów i zmian w układzie kostnym. Szpiczakowi mnogiemu można przypisać w przybliżeniu 1% wszystkich nowotworów i nieco więcej niż % złośliwych nowotworów układu krwiotwórczego. Zachorowalność na MM wzrasta wraz ze starzeniem się populacji: średni wiek w momencie zdiagnozowania wynosi 61 lat. Obecne protokoły leczenia, obejmujące kombinację czynników chemioterapeutycznych, takich jak winkrystyna, BCNU, melfalan, cyklofosfamid, adriamycyna i prednizon lub deksametazon, pozwalają uzyskać całkowitą remisję jedynie u około % chorych, a mediana przeżywalności wynosi, od momentu czasu zdiagnozowania, w przybliżeniu miesięcy. Ostatnie postępy, z zastosowaniem chemioterapii w wysokich dawkach, po której wykonuje się autologiczny przeszczep szpiku lub przeszczep prekursorowych komórek krwi obwodowej (PBMC), zwiększyły odsetek całkowitej remisji i czas trwania remisji. Ogólny czas przeżycia

3 1 2 został jednak przedłużony tylko w niewielkim stopniu i nie udowodniono wyleczenia. Ostatecznie, u wszystkich pacjentów z MM występowały nawroty, nawet po zastosowaniu leczenia podtrzymującego samym interferonem alfa (IFN-α) lub interferonem alfa w połączeniu ze steroidami. [0003] Skuteczność dostępnych chemioterapeutycznych schematów leczenia MM jest ograniczona przez niewielkie tempo proliferacji komórek i rozwój oporności wielolekowej. U ponad 90% pacjentów z MM choroba staje się chemiooporna. W rezultacie poszukuje się alternatywnych schematów leczenia, mających na celu adoptywną immunoterapię celowaną w antygeny powierzchniowe na komórkach osocza, takie jak CD i CD40. [0004] CD40 jest komórkowym antygenem powierzchniowym o masie cząsteczkowej kda, obecnym na powierzchni zarówno prawidłowych, jak i nowotworowych ludzkich komórek B, komórek dendrytycznych, komórek prezentujących antygen (APC), komórek śródbłonka, komórek monocytowych i komórek nabłonkowych. Wiązanie ligandu CD40 z antygenem CD40 na powierzchni komórki B stymuluje komórkę B, powodując dojrzewanie komórki B do komórki osocza wydzielającej duże ilości rozpuszczalnej immunoglobuliny. Złośliwe komórki B z kilku guzów linii komórek B wykazują ekspresję dużych ilości CD40 i, jak się wydaje, ich przetrwanie i proliferacja zależą od przekazywania sygnałów CD40. I tak, transformowane komórki od pacjentów z chłoniakami z komórek B o niskiej i wysokiej złośliwości, ostrą białaczką limfoblastyczną z komórek B, szpiczakiem mnogiem, przewlekłą białaczką limfatyczną, białaczką mieloblastyczną i chorobą Hodgkina wykazują ekspresję CD40. Co istotne, CD40 w porównaniu z CD znajduje się na większym odsetku komórek szpiczaków mnogich (Maloney i wsp. (1999) Semin. Hematol. 36 (Suppl. 3): -33).

4 6 [000] Z uwagi na złe rokowanie u pacjentów ze szpiczakiem mnogim potrzebne są alternatywne protokoły leczenia. [0006] W WO01/837 i WO02/28480 opisano przeciwciała zdolne do wiązania się z CD40, sposoby wytwarzania tych przeciwciał i sposoby ich stosowania. [0007] Ellmark i wsp. (Immunology 02, 6, ) donoszą o modulacji interakcji ligandów CD40-CD40 przy stosowaniu jednołańcuchowych fragmentów ludzkiego przeciwciała przeciwko CD40. KRÓTKI OPIS WYNALAZKU 1 2 [0008] Wynalazek zapewnia ludzkie monoklonalne przeciwciało przeciwko CD40, zdolne do swoistego wiązania z ludzkim antygenem CD40 ulegającym ekspresji na powierzchni ludzkiej komórki z ekspresją CD40, przy czym wspomniane przeciwciało monoklonalne nie wykazuje znaczącej aktywności agonistycznej, przez co, gdy wspomniane przeciwciało monoklonalne wiąże się z antygenem CD40 ulegającym ekspresji na powierzchni wspomnianej komórki, zahamowany zostaje wzrost i różnicowanie wspomnianej komórki, do zastosowania w sposobie leczenia szpiczaka mnogiego osobnika (człowieka), obejmującym podawanie wspomnianemu osobnikowi efektywnej ilości ludzkiego monoklonalnego przeciwciała przeciwko CD40, przy czym to ludzkie przeciwciało monoklonalne przeciwko CD40 wybiera się z grupy, do której należy: a) przeciwciało monoklonalne, które wiąże się z epitopem zdolnym do wiązania się z przeciwciałem monoklonalnym CHIR-.9, możliwym do otrzymania z linii komórkowej hybrydoma, zdeponowanej w ATCC jako depozyt patentowy nr PTA-42, lub przeciwciałem monoklonalnym CHIR możliwym do

5 7 1 2 otrzymania z linii komórkowej hybrydoma, zdeponowanej w ATCC jako depozyt patentowy nr PTA-43, b) przeciwciało monoklonalne, które wiąże się z epitopem zawierającym reszty sekwencji ludzkiego CD40 przedstawionej w SEQ ID nr lub SEQ ID nr 12, c) przeciwciało monoklonalne, które wiąże się z epitopem zawierającym reszty sekwencji ludzkiego CD40 przedstawionej w SEQ ID nr lub SEQ ID nr 12 i d) przeciwciało monoklonalne, które współzawodniczy z przeciwciałem monoklonalnym CHIR-.9 możliwym do otrzymania z linii komórkowej hybrydoma, zdeponowanej w ATCC jako depozyt patentowy nr PTA-42 lub przeciwciałem monoklonalnym CHIR-12.12, możliwym do otrzymania z linii komórkowej hybrydoma, zdeponowanej w ATCC jako depozyt patentowy nr PTA-43, w analizie współzawodnictwa wiązania. [0009] Wynalazek zapewnia również ludzkie przeciwciało monoklonalne przeciwko CD40, które jest zdolne do swoistego wiązania z antygenem CD40, przy czym wspomniane przeciwciało monoklonalne nie wykazuje znaczącej aktywności agonistycznej, gdy jest związane z antygenem CD40, do stosowania w sposobie hamowania wzrostu komórek szpiczaka mnogiego z ekspresją antygenu CD40, przy czym sposób ten obejmuje łączenie wspomnianych komórek z efektywną ilością ludzkiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko CD40; wspomniane przeciwciało wybiera się z grupy, do której należy: a) przeciwciało monoklonalne, które wiąże się z epitopem zdolnym do wiązania przeciwciała monoklonalnego CHIR-.9, możliwego do otrzymania z linii komórkowej hybrydoma, zdeponowanej w ATCC jako depozyt patentowy nr PTA-42, lub przeciwciała monoklonalnego CHIR-12.12, możliwego do

6 8 1 2 otrzymania z linii komórkowej hybrydoma, zdeponowanej w ATCC jako depozyt patentowy nr PTA-43, b) przeciwciało monoklonalne, które wiąże się z epitopem zawierającego reszty sekwencji ludzkiego CD40 przedstawionej w SEQ ID nr lub SEQ ID nr 12, c) przeciwciało monoklonalne, które wiąże się z epitopem zawierającym reszty sekwencji ludzkiego CD40 przedstawionej w SEQ ID nr lub SEQ ID nr 12 i d) przeciwciało monoklonalne, które współzawodniczy z przeciwciałem monoklonalnym CHIR-.9 możliwym do otrzymania z linii komórkowej hybrydoma zdeponowanej w ATCC jako depozyt patentowy nr PTA-42 lub przeciwciałem monoklonalnym CHIR możliwym do otrzymania z linii komórkowej hybrydoma, zdeponowanej w ATCC jako depozyt patentowy nr PTA-43 w analizie współzawodnictwa wiązania. [00] Wynalazek zapewnia również stosowanie efektywnej ilości ludzkiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko CD40, zdolnego do swoistego wiązania z ludzkim antygenem CD40 ulegającym ekspresji na powierzchni ludzkiej komórki z ekspresją CD40, do wytwarzania leku do leczenia szpiczaka mnogiego u osobnika (człowieka), przy czym to przeciwciało monoklonalne nie wykazuje znaczącej aktywności agonistycznej, przez co, gdy wspomniane przeciwciało monoklonalne wiąże się z antygenem CD40 ulegającym ekspresji na powierzchni wspomnianej komórki, zahamowany zostaje wzrost lub różnicowanie wspomnianej komórki; to ludzkie przeciwciało monoklonalne przeciwko CD40 wybiera się z grupy, do której należy: a) przeciwciało monoklonalne, które wiąże się z epitopem zdolnym do wiązania się z przeciwciałem monoklonalnym CHIR-.9, możliwym do otrzymania z linii komórek hybrydoma, zdeponowanej w ATCC jako depozyt patentowy nr PTA-42 lub przeciwciałem monoklonalnym CHIR-12.12, możliwym do

7 9 1 2 otrzymania z linii komórkowej hybrydoma, zdeponowanej w ATCC jako depozyt patentowy nr PTA-43, b) przeciwciało monoklonalne, które wiąże się z epitopem zawierającym reszty sekwencji ludzkiego CD40 przedstawionej w SEQ ID nr lub SEQ ID nr 12, c) przeciwciało monoklonalne, które wiąże się z epitopem zawierającym reszty sekwencji ludzkiego CD40 przedstawionej w SEQ ID nr lub SEQ ID nr 12 i d) przeciwciało monoklonalne, które rywalizuje z przeciwciałem monoklonalnym CHIR-.9 możliwym do otrzymania z linii komórkowej hybrydoma zdeponowanej w ATCC jako depozyt patentowy nr PTA-42 lub przeciwciałem monoklonalnym CHIR możliwym do otrzymania z linii komórkowej hybrydoma, zdeponowanej w ATCC jako depozyt patentowy nr PTA-43, w analizie współzawodnictwa wiązania. [0011] Wynalazek zapewnia również stosowanie efektywnej ilości ludzkiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko CD40, zdolnego do swoistego wiązania z antygenem CD40, do wytwarzania leku do hamowania wzrostu komórek szpiczaka mnogiego z ekspresją antygenu CD40, przy czym to przeciwciało monoklonalne nie wykazuje znaczącej aktywności agonistycznej, gdy jest związane z antygenem CD40; wspomniane przeciwciało wybiera się z grupy, do której należy: a) przeciwciało monoklonalne, które wiąże się z epitopem zdolnym do wiązania przeciwciała monoklonalnego CHIR-.9 możliwego do otrzymania z linii komórkowej hybrydoma zdeponowanej w ATCC jako depozyt patentowy nr PTA-42 lub przeciwciała monoklonalnego CHIR możliwego do otrzymania z linii komórkowej hybrydoma zdeponowanej w ATCC jako depozyt patentowy nr PTA-43,

8 1 2 b) przeciwciało monoklonalne, które wiąże się z epitopem zawierającym reszty sekwencji ludzkiego CD40 przedstawionej w SEQ ID nr lub SEQ ID nr 12, c) przeciwciało monoklonalne, które wiąże się z epitopem zawierającym reszty sekwencji ludzkiego CD40 przedstawionej w SEQ ID nr lub SEQ ID nr 12 i d) przeciwciało monoklonalne, które rywalizuje z przeciwciałem monoklonalnym CHIR-.9 możliwym do otrzymania z linii komórkowej hybrydoma zdeponowanej w ATCC jako depozyt patentowy nr PTA-42 lub przeciwciałem monoklonalnym CHIR możliwym do otrzymania z linii komórkowej hybrydoma, zdeponowanej w ATCC jako depozyt patentowy nr PTA-43, w analizie współzawodnictwa wiązania. [0012] Wynalazek zapewnia również sposób in vitro hamowania wzrostu komórek szpiczaka mnogiego z ekspresją antygenu CD40, przy czym wspomniany sposób obejmuje łączenie wspomnianych komórek z efektywną ilością ludzkiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko CD40, zdolnego do swoistego wiązania ze wspomnianym antygenem CD40, przy czym to przeciwciało monoklonalne nie wykazuje znaczącej aktywności agonistycznej, gdy jest związane z antygenem CD40; wspomniane przeciwciało wybiera się z grupy, do której należy: a) przeciwciało monoklonalne, które wiąże się z epitopem zdolnym do wiązania przeciwciała monoklonalnego CHIR-.9 możliwego do otrzymania z linii komórkowej hybrydoma zdeponowanej w ATCC jako depozyt patentowy nr PTA-42 lub przeciwciała monoklonalnego CHIR możliwego do otrzymania z linii komórek hybrydoma zdeponowanej w ATCC jako depozyt patentowy nr PTA-43,

9 11 1 b) przeciwciało monoklonalne, które wiąże się z epitopem zawierającym reszty sekwencji ludzkiego CD40 przedstawionej w SEQ ID nr lub SEQ ID nr 12, c) przeciwciało monoklonalne, które wiąże się z epitopem zawierającym reszty sekwencji ludzkiego CD40 przedstawionej w SEQ ID nr lub SEQ ID nr 12 i d) przeciwciało monoklonalne, które współzawodniczy z przeciwciałem monoklonalnym CHIR-.9 możliwym do otrzymania z linii komórkowej hybrydoma zdeponowanej w ATCC jako depozyt patentowy nr PTA-42 lub przeciwciałem monoklonalnym CHIR możliwym do otrzymania z linii komórkowej hybrydoma, zdeponowanej w ATCC jako depozyt patentowy nr PTA-43, w analizie współzawodnictwa wiązania. [0013] Inne aspekty wynalazku przedstawiono w załączonych zastrzeżeniach. KRÓTKI OPIS UJAWNIENIA 2 [0014] Ujawniono sposoby leczenia osobnika (człowieka) ze szpiczakiem mnogim, obejmujące podawanie osobnikowi przeciwciała przeciwko CD40 lub jego fragmentu wiążącego antygen, niewykazującego znaczącej aktywności agonistycznej, gdy jest związany z antygenem CD40 na ludzkich komórkach z ekspresją CD40. Ujawniono również sposoby hamowania wzrostu komórek szpiczaka mnogiego z ekspresją antygenu CD40. [001] Odpowiednie do stosowania w ujawnionych tutaj sposobach antagonistyczne przeciwciała przeciwko CD40 wykazują silne powinowactwo do CD40 i charakteryzują się stałą równowagi dysocjacji (K D ) wynoszącą co najmniej -6 M, korzystnie, od co najmniej około -7 M do około -8 M, korzystniej od co najmniej około -8 M do około -12 M. Te

10 przeciwciała monoklonalne i ich fragmenty wiążące antygen są zdolne do swoistego wiązania z ludzkim antygenem CD40 ulegającym ekspresji na powierzchni ludzkiej komórki. Nie wykazują one znaczącej aktywności agonistycznej, wykazują natomiast aktywność antagonistyczną, gdy są związane z antygenem CD40 na ludzkich komórkach. W jednym z wykonań wynalazku przeciwciało przeciwko CD40 lub jego fragment wykazuje aktywność antagonistyczną, gdy jest związane z antygenem CD40 na prawidłowych ludzkich komórkach B. W innym wykonaniu wynalazku przeciwciało przeciwko CD40 lub jego fragment wykazuje aktywność antagonistyczną, gdy jest związane z antygenem CD40 na złośliwych ludzkich komórkach B. Odpowiednie przeciwciała monoklonalne zawierają ludzkie regiony stałe, korzystnie, zawierają one również całkowicie lub częściowo humanizowane regiony zrębowe, najkorzystniej, są przeciwciałami w pełni ludzkimi lub ich fragmentami wiążącymi antygen. [0016] Przykładami takich monoklonalnych przeciwciał są przeciwciała oznaczone tutaj jako.9 i CHIR-12.12, które można wytwarzać na drodze rekombinacji, przeciwciała monoklonalne wytwarzane przez linie komórkowe hybrydoma oznaczone symbolem 131.2F8..9 (określana w dalszym ciągu niniejszego opisu jako linia komórkowa.9) i 13.8E2.D.D (określana w dalszym ciągu niniejszego opisu jako linia komórkowa 12.12), przeciwciało monoklonalne zawierające sekwencję aminokwasów wybraną z grupy, do której należy sekwencja ukazana w SEQ ID nr 6, sekwencja ukazana w SEQ ID nr 7, sekwencja ukazana w SEQ ID nr 8, sekwencje ukazane w SEQ ID nr 6 i SEQ ID nr 7 i sekwencje ukazane w SEQ ID nr 6 i SEQ ID nr 8, przeciwciało monoklonalne zawierające sekwencję aminokwasów wybraną z grupy, do której należy sekwencja ukazana w SEQ ID nr 2, sekwencja ukazana w SEQ ID nr 4, sekwencja ukazana w SEQ ID

11 nr, sekwencje ukazane w w SEQ ID nr 2 i SEQ ID nr 4 i sekwencje ukazane w SEQ ID nr 2 i SEQ ID nr, przeciwciało monoklonalne zawierające sekwencję aminokwasów kodowaną za pomocą cząsteczki kwasu nukleinowego, zawierającej sekwencję nukleotydów wybraną z grupy, do której należy sekwencja ukazana w SEQ ID nr 1, sekwencja ukazana w SEQ ID nr 3 i sekwencje ukazane w SEQ ID nr 1 i SEQ ID nr 3 i wiążące antygen fragmenty tych przeciwciał monoklonalnych, zachowujące zdolność swoistego wiązania z ludzkim CD40 i niewykazujące znaczącej aktywności agonistycznej, wykazujące natomiast aktywność antagonistyczną, gdy są związane z antygenem CD40 na ludzkich komórkach. Przykłady takich przeciwciał monoklonalnych obejmują również przeciwciało monoklonalne, które wiąże się z epitopem zdolnym do wiązania z przeciwciałem monoklonalnym wytworzonym przez linię komórkową hybrydomy 12.12, przeciwciało monoklonalne, które wiąże się z epitopem zawierającym reszty sekwencji aminokwasów ukazanej w SEQ ID nr lub SEQ ID nr 12, przeciwciało monoklonalne, które rywalizuje z przeciwciałem monoklonalnym CHIR w analizie współzawodnictwa wiązania i przeciwciało monoklonalne, które jest wiążącym antygen fragmentem przeciwciała monoklonalnego CHIR lub którymkolwiek z poprzednich przeciwciał monoklonalnych, przy czym fragment zachowuje zdolność swoistego wiązania z ludzkim antygenem CD40. [0017] W jednym z wykonań wynalazku sposoby leczenia obejmują podawanie pacjentowi terapeutycznie efektywnej dawki kompozycji farmaceutycznej, zawierającej odpowiednie przeciwciała antagonistyczne przeciwko CD40 lub ich fragmenty wiążące antygen. Terapeutycznie efektywna dawka przeciwciała przeciwko CD40 lub jego fragmentu mieści się w zakresie od około 0,01 mg/kg do około 40 mg/kg, od około

12 14 1 0,01 mg/kg do około mg/kg, od około 0,1 mg/kg do około mg/kg, od około 1 mg/kg do około mg/kg, od około 3 mg/kg do około mg/kg, od około 3 mg/kg do około 2 mg/kg, od około 3 mg/kg do około mg/kg, od około mg/kg do około 1 mg/kg lub od około 7 mg/kg do około 12 mg/kg. Uznaje się, że sposób leczenia może obejmować jednokrotne podanie terapeutycznie efektywnej dawki lub wielokrotne podawanie terapeutycznie efektywnej dawki antagonistycznego przeciwciała przeciwko CD lub jego fragmentu wiążącego antygen. [0018] Antagonistyczne przeciwciała przeciwko CD40 zidentyfikowane w niniejszym opisie jako odpowiednie do stosowania w ujawnianych tu sposobach mogą być modyfikowane. Modyfikacje tych antagonistycznych przeciwciał przeciwko CD40 obejmują między innymi immunologicznie aktywne chimeryczne przeciwciała przeciwko CD40, humanizowane przeciwciała przeciwko CD40 i immunologicznie aktywne mysie przeciwciała przeciwko CD40. KRÓTKI OPIS RYSUNKÓW 2 [0019] Fig. 1 przedstawia sekwencje aminokwasów łańcuchów lekkich i ciężkich przeciwciała monoklonalnego (mab) CHIR Na Fig. 1A przedstawiono regiony liderowe (reszty 1- SEQ ID nr 2), zmienne (reszty SEQ ID nr 2) i stałe (reszty SEQ ID nr 2) łańcucha lekkiego. Na Fig. 1B przedstawiono regiony liderowe (reszty 1-19 SEQ ID nr 4), zmienne (reszty -139 SEQ ID nr 4) i stałe (reszty SEQ ID nr 4) łańcucha ciężkiego. Alternatywny region stały łańcucha ciężkiego mab CHIR-12.12, ukazany na Fig. 1B, odzwierciedla podstawienie reszty alaniny za resztę seryny w pozycji 13 SEQ ID nr 4. Całkowitą

13 1 1 2 sekwencję tego wariantu łańcucha ciężkiego mab CHIR przedstawiono w SEQ ID nr. Fig. 2 przedstawia sekwencję kodującą łańcucha lekkiego (Fig. 2A, SEQ ID nr 1) i ciężkiego (Fig. 2B; SEQ ID nr 3) mab CHIR Fig. 3 przedstawia sekwencje aminokwasów łańcuchów lekkiego i ciężkiego mab.9. Na Fig. 3A przedstawiono regiony liderowe (reszty 1- SEQ ID nr 6), zmienne (reszty SEQ ID nr 6) i stałe (reszty SEQ ID nr 6) łańcucha lekkiego. Na Fig. 3B przedstawiono regiony liderowe (reszty 1-19 SEQ ID nr 7), zmienne (reszty -144 SEQ ID nr 7) i stałe (reszty SEQ ID nr 7) łańcucha ciężkiego. Alternatywny region stały łańcucha ciężkiego mab.9, ukazany na Fig. 3B, odzwierciedla podstawienie reszty alaniny za resztę seryny w pozycji 18 SEQ ID nr 7. Całkowitą sekwencję tego wariantu łańcucha ciężkiego mab.9 przedstawiono w SEQ ID nr 8. Fig. 4 przedstawia sekwencję kodującą (Fig. 4A, SEQ ID nr 9) krótkiej izoformy ludzkiego CD40 (sekwencja aminokwasów przedstawiona na Fig. 4B, SEQ ID nr ) i sekwencję kodującą (Fig. 4C, SEQ ID nr 11) długiej izoformy ludzkiego CD40 (sekwencja aminokwasów przedstawiona na Fig. 4D). Fig. przedstawia zwiększenie aktywności przeciwnowotworowej in vivo leczenia skojarzonego przeciwciałem monoklonalnym CHIR i bortezomibem (VELCADE ) z zastosowaniem modelu przeszczepu ksenogenicznego ludzkiego szpiczaka mnogiego IM-9. Fig. 6 przedstawia temperaturę topnienia przy ogrzewaniu CHIR w preparatach o różnym ph, mierzoną metodą skaningowej kalorymetrii różnicowej (DSC). SZCZEGÓŁOWY OPIS

14 [00] Terminy nowotwór lub guz, w rozumieniu niniejszego opisu, odnoszą się do wzrostu i proliferacji wszystkich komórek nowotworowych, złośliwych lub łagodnych, i wszystkich komórek i tkanek przednowotworowych i nowotworowych. [0021] Terminy nowotwór i nowotworowy odnoszą się do stanu fizjologicznego u ssaków, charakteryzujący się zazwyczaj rozregulowanym wzrostem komórek, lub opisują ten stan. Przykłady nowotworów obejmują między innymi chłoniaki, szpiczaka mnogiego i białaczkę. [0022] Przeciwciała i immunoglobuliny (Ig) są glikoproteinami o takich samych właściwościach strukturalnych. Przeciwciała wykazują swoistość wiązania z antygenem, natomiast termin immunoglobuliny obejmuje zarówno przeciwciała, jak i inne podobne do przeciwciał cząsteczki, pozbawione swoistości antygenowej. Polipeptydy ostatniego rodzaju są na przykład wytwarzane w niewielkich ilościach przez układ chłonny i w zwiększonych ilościach przez szpiczaki. [0023] Termin przeciwciało jest używany w najszerszym znaczeniu i obejmuje przeciwciała pełne, fragmenty przeciwciał, które mogą wiązać antygen (np. Fab, F (ab) 2, Fv, jednołańcuchowe przeciwciała, diabody) i zawierające je zrekombinowane peptydy. [0024] Termin przeciwciało monoklonalne odnosi się w niniejszym opisie do przeciwciała otrzymanego z populacji zasadniczo homogennych przeciwciał, to znaczy, że poszczególne przeciwciała zawarte w populacji są identyczne, z wyjątkiem pojawiających się naturalnie możliwych mutacji, które mogą być obecne w niewielkich ilościach. [002] Przeciwciała natywne i immunoglobuliny natywne są zwykle heterotetramerycznymi glikoproteinami, o masie

15 około 000 daltonów, złożonymi z dwóch identycznych łańcuchów lekkich (L) i dwóch identycznych łańcuchów ciężkich (H). Każdy łańcuch lekki jest połączony z łańcuchem ciężkim jednym kowalencyjnym wiązaniem dwusiarczkowym, natomiast liczba sprzężeń dwusiarczkowych różni się pomiędzy łańcuchami ciężkimi różnych izotopów immunoglobuliny. Każdy łańcuch ciężki i lekki posiada również regularnie rozmieszczone wewnątrzłańcuchowe mostki dwusiarczkowe. Każdy łańcuch ciężki zawiera na jednym końcu domenę zmienną (V H ), po której następuje kilka domen stałych. Każdy łańcuch lekki zawiera domenę zmienną (V L ) na jednym końcu i domenę stałą na drugim końcu; domena stała łańcucha lekkiego jest ustawiona w linii z pierwszą domeną stałą łańcucha ciężkiego, a domena zmienna łańcucha lekkiego jest ustawiona w linii z domeną zmienną łańcucha ciężkiego. Uważa się, że pewne reszty aminokwasów tworzą obszar wzajemnego oddziaływania pomiędzy zmiennymi domenami łańcuchów lekkiego i ciężkiego. [0026] Termin zmienne odnosi się do faktu, że pewne części zmiennych domen w dużym stopniu różnią się sekwencjami pomiędzy przeciwciałami i są wykorzystywane do wiązania i swoistości poszczególnych przeciwciał z ich określonymi antygenami. Jednakże zmienność nie jest równomiernie rozmieszczona w całych zmiennych domenach przeciwciał. Jest ona skoncentrowana w trzech segmentach, zwanych regionami określającymi komplementarność (CDR) lub regionami hiperzmiennymi, zarówno w domenach zmiennych łańcucha lekkiego, jak i w domenach zmiennych łańcucha ciężkiego. Bardziej konserwatywne części zmiennych domen nazywane są regionami zrębowymi (FR). Każda domen zmiennych natywnych łańcuchów ciężkich i lekkich zawiera cztery regiony FR, w większości przyjmujące konfigurację β-kartki, złączonej trzema CDR, które tworzą łączące pętle, w

16 niektórych przypadkach tworząc część struktury β-kartki. CDR w każdym łańcuchu są utrzymywane razem w bliskim sąsiedztwie przez regiony FR i wraz z CDR z innego łańcucha przyczyniają się do tworzenia miejsca wiążącego antygen przeciwciał (patrz Kabat i wsp. (1991) NIH Publ. No , t. I, strony ). [0027] Domeny stałe nie są bezpośrednio zaangażowane w wiązaniu przeciwciał z antygenem, lecz wykazują funkcje efektorowe, takie jak wiązanie receptora Fc (FcR), udział przeciwciała w zależnej od przeciwciał toksyczności komórkowej, opsonizację, inicjacja cytotoksyczności zależnej od dopełniacza i degranulacja komórek tucznych. [0028] Termin region hiperzmienny" w rozumieniu niniejszego opisu odnosi się do reszt aminokwasów przeciwciał odpowiedzialnych za wiązanie antygenu. Region hiperzmienny zawiera reszty aminokwasów z regionów określających komplementarność, czyli CDR (tj. reszty (L1), 0-6 (L2) i (L3) w domenie zmiennej łańcucha lekkiego i 31-3 (H1), 0-6 (H2) i 9-2 (H3) w domenie zmiennej łańcucha ciężkiego, Kabat i wsp. (1991) Sequence of Proteins of Immunological Interest (wyd., Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD, USA) i/lub reszty z pętli hiperzmiennej (tj. reszty (L1), 0-2 (L2) i (L3) w domenie zmiennej łańcucha lekkiego i H1), 3- (H2) i 96-1 (H3) w domenie zmiennej łańcucha ciężkiego, Clothia i Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: ). Reszty szkieletu, czyli FR, są to pozostałe reszty domen zmiennych (poza resztami regionu hiperzmiennego). [0029] Fragmenty przeciwciał zawierają część nienaruszonego przeciwciała, korzystnie, wiążącą antygen, lub region zmienny nienaruszonego przeciwciała. Przykłady fragmentów przeciwciała obejmują fragmenty Fab, Fab,

17 F(ab )2 i Fv, diabody, przeciwciała liniowe (Zapata i wsp. (199) Protein Eng. 8():7-62), cząsteczki przeciwciała jednołańcuchowego i przeciwciała wieloswoiste, utworzone z fragmentów przeciwciał. W wyniku trawienia przeciwciał papainą wytwarza się dwa identyczne fragmenty wiążące antygeny, zwane fragmentami Fab, każdy z pojedynczym miejscem wiążącym antygen, i pozostały fragment Fc, którego nazwa odzwierciedla jego zdolność do łatwego krystalizowania. W wyniku traktowania pepsyną powstaje fragment F(ab )2, zawierający dwa miejsca wiążące antygen i nadal zdolny do sieciowania antygenu. [00] Fv jest minimalnym fragmentem przeciwciała, który zawiera całkowite miejsce rozpoznawania i wiązania antygenu. W dwułańcuchowych rodzajach Fv region ten składa się z dimeru jednej domeny zmiennej łańcucha ciężkiego i jednej domeny zmiennej łańcucha lekkiego związanych ściśle, niekowalencyjnie. W jednołańcuchowych typach Fv jedna domena zmienna ciężkiego i jedna domena zmienna łańcucha lekkiego może być kowalencyjnie połączona elastycznym linkerem peptydowym tak, że łańcuchy lekkie i ciężkie mogą łączyć się w strukturę dimeryczną, analogiczną do struktury obecnej w dwułańcuchowych rodzajach Fv. To właśnie w takiej konfiguracji trzy CDR każdej domeny zmiennej oddziałują na siebie wzajemnie, definiując miejsce wiążące antygen na powierzchni dimeru V H -V L. Wspólnie sześć CDR nadaje przeciwciału swoistość wiązania antygenu. Nawet pojedyncza domena zmienna (lub połowa Fv zawierającego tylko trzy CDR swoiste dla antygenu) ma jednak zdolność rozpoznawania i wiązania antygenu, chociaż z mniejszym powinowactwem niż całkowite miejsce wiązania. [0031] Fragment Fab zawiera również domenę stałą łańcucha lekkiego i pierwszą domenę stałą (CH1) łańcucha ciężkiego. Fragmenty Fab różnią się od fragmentów Fab dodatkiem kilku

18 1 2 reszt na końcu węglowym domeny CH1 łańcucha ciężkiego, i obejmują jedną lub więcej cystein z regionu zawiasowego przeciwciała. Fab -SH jest tutaj oznaczeniem dla Fab, w którym reszta(y) cysteiny domen stałych zawiera wolną grupę tiolową. Fragmenty F(ab )2 przeciwciała pierwotnie powstały jako pary fragmentów Fab, z cysteinami zawiasowymi między nimi. Znane są również inne połączenia chemiczne fragmentów przeciwciał. [0032] Łańcuchy lekkie przeciwciał (immunoglobulin) jakiegokolwiek gatunku kręgowca można zaliczyć do jednego z dwóch wyraźnie odrębnych typów, zwanych kappa (κ) i lambda (λ), na podstawie sekwencji aminokwasów ich domen stałych. [0033] Zależnie od sekwencji aminokwasów domeny stałej ich łańcuchów ciężkich, immunoglobuliny można podzielić na różne klasy. Istnieje pięć głównych klas ludzkich immunoglobulin: IgA, IgD, IgE, IgG, i IgM; kilka z nich można dalej podzielić na podklasy (izotypy), np. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA i IgA2. Domeny stałe łańcucha ciężkiego, odpowiadające poszczególnym klasom immunoglobulin, oznacza się odpowiednio jako alfa, delta, epsilon, gamma i mu. Struktura podjednostek i konfiguracja trójwymiarowa różnych klas immunoglobulin są dobrze znane. Różne izotypy pełnią różne funkcje efektorowe. Ludzkie izotypy IgG1 i IgG3 pośredniczą na przykład w zależnej od przeciwciał cytotoksyczności komórkowej (ADCC). [0034] Słowo znacznik, gdy jest tutaj używane, odnosi się do wykrywalnego związku lub kompozycji, połączonej bezpośrednio lub pośrednio z przeciwciałem tak, żeby wygenerować znakowane przeciwciało. Znacznik może być wykrywalny sam z siebie (np. znaczniki radioizotopowe lub fluoroscencyjne) lub, w przypadku znacznika enzymatycznego, może katalizować przemianę chemiczną związku lub kompozycji substratu, który jest wykrywalny. Do radionuklidów, które

19 mogą służyć jako wykrywalne znaczniki, należą na przykład I-131, I-123, I-12, Y-90, Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212 i Pd-9. Znacznik może być również jednostką niewykrywalną, taką jak toksyna. [003] Termin antagonista jest używany w najszerszym znaczeniu i obejmuje każdą cząsteczkę, która częściowo lub w pełni blokuje, hamuje lub neutralizuje biologiczną aktywność natywnego, ujawnionego tutaj celu albo jego transkrypcję lub translację. [0036] Nośniki, w rozumieniu niniejszego opisu, obejmują farmaceutycznie akceptowalne nośniki, zaróbki lub środki stabilizujące, które nie są toksyczne dla komórki lub ssaka, który został wystawiony na działanie stosowanych dawek i stężenia. Często fizjologicznie akceptowalnym nośnikiem jest roztwór wodny o zbuforowanym ph. Przykłady fizjologicznie akceptowalnych nośników obejmują bufory, takie jak fosforanowy, cytrynianowy, bursztynianowy i inne kwasy organiczne, antyoksydanty, w tym kwas askorbinowy, polipeptydy o małej masie cząsteczkowej (mniej niż około reszt), białka, takie jak albumina surowicy, żelatyna lub immunoglobuliny, polimery hydrofilowe, takie jak poliwinylopyrolidon, aminokwasy, takie jak glicyna, glutamina, asparagina, arginina lub lizyna, monosacharydy, disacharydy i inne węglowodany łącznie z glukozą, mannozą lub dekstrynami, czynniki chelatujące, takie jak EDTA, alkohole cukrowe, takie jak mannitol lub sorbitol, przeciwjony tworzące sól, takie jak sód i/lub niejonowe środki powierzchniowo czynne, takie jak TWEEN, glikol polietylenowy (PEG) i pluroniki. Podawanie w skojarzeniu jednego lub więcej czynników terapeutycznych obejmuje jednoczesne (współdziałające) i następujące po sobie podawanie w dowolnej kolejności.

20 [0037] Komórka gospodarza, w rozumieniu niniejszego opisu, odnosi się do drobnoustroju, komórki euokariotycznej lub linii komórkowej hodowanej jako jednokomórkowa całość, która może być lub była stosowana jako odbiorca wektora rekombinacyjnego lub innych transferujących polinukleotydów i obejmuje potomstwo komórki pierwotnej, która została transfekowana. Należy rozumieć, że w związku z występowaniem mutacji spontanicznych, przypadkowych lub wywołanych, potomstwo pojedynczej komórki nie musi być całkowicie identyczne pod względem morfologicznym lub genomowym ani komplementarne do całkowitego DNA pochodzenia rodzicielskiego. [0038] Ludzkie komórki efektorowe są leukocytami, w których zachodzi ekspresja jednego lub więcej FcR i które pełnią funkcje efektorowe. Korzystnie, w komórkach zachodzi przynajmniej ekspresja FcγRIII i pełnią one funkcję efektorową zależnej od antygenu cytotoksyczności komórkowej. Przykłady ludzkich leukocytów, które pośredniczą w ADCC, obejmują jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC), naturalne komórki cytotoksyczne (NK), monocyty, makrofagi, eozynofile i neutrofile, przy czym korzystne są komórki PBMC i NK. Przeciwciała wykazujące aktywność ADCC są zazwyczaj izotypami IgG1 i IgG3. Należy zauważyć, że oprócz izolowania IgG1 i IgG3, takie przeciwciała regulujące ADCC można otrzymać, wstawiając region zmienny z przeciwciała niepośredniczącego w ADCC lub jego fragment do regionu stałego izotypu IgG1 i IgG3. [0039] Terminy Fc receptor" lub FcR" są stosowane do opisania receptora, który wiąże się z regionem Fc przeciwciała. Korzystne FcR jest natywną sekwencją ludzkiego FcR. Co więcej, korzystny jest FcR, które wiąże przeciwciało IgG (receptor gamma): grupa ta obejmuje receptory podklas FcγRI, FcγRII i FcγRIII, w tym warianty

21 alleliczne i postacie o alternatywnym splajsingu tych receptorów. Receptory FcγRII obejmują FcγRIIA ( receptor aktywujący ) i FcγRIIB ( receptor hamujący ), które mają podobne sekwencje aminokwasów i które różnią się przede wszystkim w swych domenach cytoplazmatycznych. Receptor aktywujący FcγRIIA zawiera w swojej domenie cytoplazmatycznej motyw immunoreceptora aktywującego bogatego w tyrozynę (ITAM). Receptor hamujący FcγRIIB zawiera w swojej domenie cytoplazmatycznej motyw immunoreceptora hamującego bogatego w tyrozynę (ITIM) (patrz Daeron (1997) Annu. Rev. Immunol. 1:3-234). Przegląd FcR przedstawiono w Ravetch i Kinet (1991) Annu. Rev. Immunol. 9: (1991), Capel i wsp. (1994) Immunomethods 4:2-34 i de Haas i wsp. (199) J. Lab. Clin. Med. 126: Inne FcR, łącznie z tymi, które będą zidentyfikowane w przyszłości, są tutaj objęte terminem FcR. Termin ten obejmuje również receptor noworodkowy FcRn, odpowiedzialny za transfer IgG matczynych do płodu (Guyer i wsp. (1976) J. Immunol. 117:87 i Kim i wsp. (1994) J. Immunol. 24:249 (1994)). [0040] Wiele jest sposobów wytworzenia ludzkich przeciwciał. Można na przykład unieśmiertelniać komórki wydzielnicze przez zakażenie wirusem Epsteina-Barr (EBV). Komórki zakażone EBV są jednak trudne do klonowania i zazwyczaj wytwarzają jedynie stosunkowo niewielkie ilości immunoglobuliny (James i Bell (1987) J. Immunol. Methods 0:-40). W przyszłości unieśmiertelnianie ludzkich komórek B może być ewentualnie osiągnięte przez wprowadzenie określonej kombinacji genów transformujących. Na taką możliwość zwróciło uwagę niedawne doniesienie, że ekspresja katalitycznej podjednostki telomerazy wspólnie z dużą onkoproteiną SV40 i allelem onkogenu H-ras wywołuje przemianę nowotworową prawidłowych ludzkich komórek

22 nabłonkowych i fibroblastów (Hahn i wsp. (1999) Nature 400: ). Obecnie możliwe jest wytwarzanie zwierząt transgenicznych (np. myszy), które po immunizacji zdolne są do wytwarzania całego zakresu ludzkich przeciwciał przy braku wytwarzania endogennej immunoglobuliny (Jakobovits i wsp. (1993) Nature 362:2-28, Lonberg i Huszar (199) Int. Rev. Immunol. 13:6-93, Fishwild i wsp. (1996) Nat. Biotechnol. 14:84-81, Mendez i wsp. (1997) Nat. Genet. 1:146-16, Green (1999) J. Immunol. Methods 231:11-23, Tomizuka i wsp. (00) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: , praca przeglądowa przedstawiona przez Little i wsp. (00) Immunol. Today 21: ). Opisano na przykład, że usunięcie homozygotyczne genu regionu łączącego łańcucha ciężkiego przeciwciała (J H ) u myszy chimerycznych i w zarodkowej linii mutantów myszy prowadzi do całkowitego zahamowania wytwarzania przeciwciał endogennych (Jakobovits i wsp. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:21-2). Transfer układu genu immunoglobuliny z ludzkiej linii zarodkowej do takiej zarodkowej linii mutanta myszy powoduje w rezultacie wytwarzanie ludzkich przeciwciał po ekspozycji na antygen (Jakobovits i wsp. (1993) Nature 362:2-28). Mendez i wsp. (1997) (Nature Genetics 1:146-16) wytworzył linię myszy transgenicznych, które po ekspozycji na antygen wytwarzały w pełni ludzkie przeciwciała o wysokim powinowactwie. Osiągnięto to poprzez integrację miliona par zasad linii zarodkowej z loci ludzkiego łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego do myszy z delecją w endogennym segmencie J H, jak opisano powyżej. Myszy te (technika XenoMouse II (Abgenix, Fremont, Kalifornia, USA)) są nosicielkami 1 0 kb z locus zawierającego w przybliżeniu 66 genów V H, całkowite regiony D H i J H i trzy różne stałe regiony ludzkiego łańcucha ciężkiego oraz 800 kb ludzkiego locus κ, zawierającego 32

23 2 1 2 geny Vκ, segmenty Jκ i geny Cκ. Przeciwciała wytwarzane w tych myszach blisko przypominają pod każdym względem przeciwciała występujące u ludzi, łącznie z kombinacją genów, ustawieniem i zakresem. Ludzkie przeciwciała podlegają ekspresji preferencyjnej w porównaniu z przeciwciałami endogennymi z powodu delecji w segmencie endogennym, co zapobiega rearanżacji genów w locus mysim. Takie myszy mogą być immunizowane antygenem będącym przedmiotem szczególnego zainteresowania. [0041] Surowice pochodzące z takich immunizowanych zwierząt można badać przesiewowo pod względem reaktywności przeciwciała przeciwko inicjującemu antygenowi. Limfocyty można izolować z węzłów chłonnych lub komórek śledziony i następnie wybierać pod kątem komórek B przez wybieranie komórek CD138-negatywnych i CD19-pozytywnych. W jednym z aspektów takie hodowle komórek B (BCC) można łączyć z komórkami szpiczaka, żeby wytwarzać hybrydomy, jak wyszczególniono powyżej. [0042] W innym aspekcie, korzystnie, takie hodowle komórek B można następnie badać przesiewowo pod względem reaktywności przeciwko inicjującemu antygenowi. Takie badanie przesiewowe obejmuje badanie ELISA białka docelowego/antygenu, analizę współzawodnictwa ze znanymi przeciwciałami, które wiążą antygen będący przedmiotem zainteresowania i wiązanie in vitro z krótkotrwale transfekowanym CHO lub z innymi komórkami, w których zachodzi ekspresja antygenu docelowego. [0043] Niniejszy wynalazek odnosi się do kompozycji i sposobów leczenia osobników (ludzi) ze szpiczakiem mnogim. Sposoby obejmują leczenie opisanym tutaj przeciwciałem przeciwko CD40 lub jego fragmentem wiążącym antygen, przy czym podawanie przeciwciała lub jego fragmentu wiążącego antygen pobudza pozytywną odpowiedź terapeutyczną u

24 osobnika poddawanego temu sposobowi leczenia. Przeciwciała przeciwko CD40 odpowiednie do stosowania w sposobach tutaj ujawnionych swoiście wiążą ludzki antygen CD40 ulegający ekspresji na powierzchni ludzkiej komórki i są pozbawione znaczącej aktywności agonistycznej, lecz wykazują aktywność antagonistyczną, gdy są związane z antygenem CD40 na ludzkiej komórce z ekspresją CD40, jak to przedstawiono dla prawidłowych i nowotworowych ludzkich komórek B z ekspresją CD40. Te przeciwciała przeciwko CD40 i ich fragmenty wiążące antygen zwane są dalej antagonistycznymi przeciwciałami przeciwko CD40. Takie przeciwciała obejmują między innymi całkowicie ludzkie przeciwciała monoklonalne.9 i CHIR oraz przeciwciała monoklonalne o charakterystyce wiązania przeciwciał monoklonalnych.9 i CHIR Te przeciwciała monoklonalne, które można wytwarzać na drodze rekombinacji, opisano poniżej. [0044] Przeciwciała o charakterystyce wiązania przeciwciał monoklonalnych.9 i CHIR obejmują przeciwciała, które interferują konkurencyjnie w wiązaniu CD40 i/lub wiążą te same epitopy, co.9 i CHIR Stosując standardowe sposoby znane ze stanu techniki, wykwalifikowany w dziedzinie może określić, czy przeciwciało interferuje konkurencyjnie z.9 i CHIR [004] Gdy te przeciwciała wiążą CD40 ulegające ekspresji na powierzchni komórek ludzkich, takich jak ludzkie komórki B, przeciwciała są pozbawione znaczącej aktywności agonistycznej; w niektórych wykonaniach wynalazku ich wiązanie do CD40 ulegającego ekspresji na powierzchni ludzkich komórek powoduje zahamowanie proliferacji i różnicowania tych komórek ludzkich. Antagonistyczne przeciwciała przeciwko CD40 odpowiednie do stosowania w wynalazku obejmują zatem przeciwciała monoklonalne, które mogą wykazywać aktywność antagonistyczną wobec prawidłowych

25 27 i złośliwych ludzkich komórek z ekspresją na powierzchni komórki antygenu CD Antagonistyczne przeciwciała przeciwko CD40 [0046] Przeciwciała monoklonalne.9 i CHIR są antagonistycznymi przeciwciałami przeciwko CD40 odpowiednimi do stosowania w opisanych tutaj sposobach. Przeciwciała.9 i są całkowicie ludzkimi przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko CD40 izotypu IgG1, wytwarzanymi z linii komórkowych hybrydoma 131.2F8..9 (określanej tutaj jako linia komórkowa.9) i 13.8E2.D.D (określanej tutaj jako linia komórkowa 12.12). Te linie komórkowe utworzono przy zastosowaniu splenocytów od immunizowanych ksenotypowych myszy, posiadających locus ludzkiego łańcucha ciężkiego IgG1 i locus ludzkiego łańcucha κ (technika XenoMouse, Abgenix, Fremont, Kalifornia, USA). Dokonano fuzji komórek śledziony z komórkami SP2/0 mysiego szpiczaka (Sierra BioSource). Powstałe w wyniku hybrydomy kilka razy subklonowano, żeby utworzyć stabilne monoklonalne linie komórkowe.9 i Podobnie można wytwarzać inne przeciwciała według wynalazku, z zastosowaniem myszy transgenicznych pod kątem loci ludzkich immunoglobulin lub innymi sposobami znanymi w sztuce i/lub tutaj opisanymi. [0047] Sekwencje aminokwasów regionów liderowego, zmiennego i stałego łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego mab CHIR przedstawiono, odpowiednio, na Fig. 1A i 1B. Patrz również SEQ ID nr 2 (całkowita sekwencja łańcucha lekkiego mab CHIR-12.12), SEQ ID nr 4 (całkowita sekwencja łańcucha ciężkiego mab CHIR-12.12) i SEQ ID nr (całkowita sekwencja wariantu łańcucha ciężkiego mab CHIR przedstawiona w SEQ ID nr 4, gdzie wariant zawiera serynę

26 podstawioną w miejscu reszty alaninowej w pozycji 13 SEQ ID nr 4). Sekwencje nukleotydów kodujące łańcuch lekki i łańcuch ciężki mab CHIR przedstawiono, odpowiednio, na Fig. 2A i 2B. Patrz również SEQ ID nr 1 (sekwencja kodująca łańcuch lekki mab CHIR-12.12)i SEQ ID nr 3 (sekwencja kodująca łańcuch ciężki mab CHIR-12.12). Sekwencje aminokwasów regionów liderowego, zmiennego i stałego łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego mab.9 przedstawiono, odpowiednio, na Fig. 3A i 3B. Patrz również SEQ ID nr 6 (całkowita sekwencja łańcucha lekkiego mab.9), SEQ ID nr 7 (całkowita sekwencja łańcucha ciężkiego mab.9) oraz SEQ ID nr 8 (całkowita sekwencja wariantu łańcucha ciężkiego mab.9 przedstawiona w SEQ ID nr 7, gdzie wariant zawiera serynę podstawioną w miejscu reszty alaninowej w pozycji 18 SEQ ID nr 7). Następnie hybrydomy z ekspresją przeciwciał.9 i CHIR zdeponowano w ATCC z oznaczeniem depozytu patentowego, odpowiednio, PTA-42 i PTA-43. [0048] Oprócz działania jako antagonista, korzystne jest, żeby przeciwciała przeciwko CD40 według tego wynalazku wykazywały inny mechanizm działania przeciwko komórkom guza. Natywne przeciwciała.9 i CHIR wykazują na przykład aktywność ADCC. Alternatywnie, zmienne regiony przeciwciał.9 i CHIR mogą ulegać ekspresji na innych izotypach przeciwciał, które wykazują aktywność ADCC. Możliwe jest sprzęganie z cytotoksynami form natywnych, form zrekombinowanych lub wiążących antygen fragmentów.9 lub CHIR [0049] Przeciwciała monoklonalne.9 i CHIR wiążą rozpuszczalny CD40 w teście typu ELISA, zapobiegają wiązaniu liganda CD40 z CD40 na powierzchni komórki i wypierają związany wstępnie ligand CD40, jak stwierdzono testami cytometrii przepływowej. Przeciwciała.9 i CHIR-

27 współzawodniczą ze sobą w wiązaniu się z CD40, ale nie współzawodniczą z 1B8, przeciwciałem monoklonalnym opisanym w W002/ Kiedy badano in vitro wpływ na proliferację komórek B u zdrowych osobników (ludzi),.9 i CHIR12.12 działały jako antagonistyczne przeciwciała przeciwko CD40. Co więcej,.9 i CHIR nie indukują silnej proliferacji ludzkich limfocytów pochodzących od osób zdrowych. Przeciwciała te mogą zabijać docelowe komórki z ekspresją CD40, poprzez zależną od przeciwciał cytotoksyczność komórkową (ADCC). Jak ustalono testem Biacore, powinowactwo wiązania.9 do ludzkiego CD40 wynosi 1,2x -8 M, a powinowactwo wiązania CHIR wynosi x - M. [000] Odpowiednie antagonistyczne przeciwciała przeciwko CD40 do stosowania w wynalazku wykazują silne powinowactwo do jednego miejsca wiązania antygenu CD40 na powierzchni komórki. Wykonując pomiar z zastosowaniem standardowego oznaczenia, takiego jak Biacore, można stwierdzić, że przeciwciała monoklonalne wykazują stałą równowagi dysocjacji (K D ) dla CD40 co najmniej - M, co najmniej 3x - M, korzystnie od co najmniej -6 M do -7 M, korzystniej od co najmniej -8 M do około -12 M. Analiza Biacore jest znana ze stanu techniki, a jej szczegóły można znaleźć w BIA applications handbook. Do modulowania powinowactwa wiązania można stosować sposoby opisane w WO 01/ [001] Przez antygen CD40, powierzchniowy antygen komórkowy CD40, receptor CD40, lub CD40 rozumie się przezbłonową glikoproteinę, która należy do rodziny receptora czynnika martwicy nowotworów (TNF) (patrz na przykład patenty Stanów Zjednoczonych o numerach i , Stamenkovic i wsp. (1989) EMBO 8:1403, Clark (1990) Tissue Antigens 36:33, Barclay i wsp. (1997) The

28 1 2 Leucocyte Antigen Facts Book (wyd. 2, Academic Press, San Diego)). Zidentyfikowano dwie izoformy ludzkiego CD40 kodowane jako dwa warianty transkryptu o alternatywnym składaniu tego genu. Pierwsza izoforma (znana również jako izoforma długa lub izoforma 1 ) ulega ekspresji jako 277-aminokwasowy polipeptyd prekursorowy (SEQ ID nr 12 (po raz pierwszy przedstawiony jako nr akcesyjny GenBank CAA44 i identyfikowany jako izoforma 1 w nr. akcesyjnym GenBank NP_001241), kodowany przez SEQ ID nr 11 (patrz nr akcesyjny GenBank nr X6092 i NM_001)), którego sekwencja sygnałowa odpowiada pierwszym 19 resztom. Druga izoforma (znana również jako krótka izoforma lub izoforma 2 ) ulega ekspresji jako 3-aminokwasowy polipeptyd prekursorowy (SEQ ID nr (nr akcesyjny GenBank NP_69093), kodowany przez SEQ ID nr 9 (nr akcesyjny GenBank NM_1284)), którego sekwencja sygnałowa także odpowiada pierwszym 19 resztom. Polipeptydy prekursorowe tych dwóch izoform ludzkiego CD40 mają wspólne 16 pierwszych reszt (tj. reszt 1-16 SEQ ID nr i SEQ ID nr 12). Polipeptyd prekursorowy krótkiej izoformy (ukazany w SEQ ID nr ) jest kodowany wariantem transkrypcyjnym (SEQ ID nr 9), w którym brakuje segmentu kodującego, co prowadzi do przesunięcia ramki odczytu translacji, dając w rezultacie izoformę CD40, zawierającą krótszy i odróżniający się koniec C (reszty z SEQ ID nr ) od końca zawartego w długiej izoformie CD40 (koniec C ukazany w resztach SEQ ID nr 12). Dla celów niniejszego wynalazku termin antygen CD40, powierzchniowy antygen komórkowy CD40, receptor CD40 lub CD40 obejmuje zarówno krótkie, jak i długie izoformy CD40. Przeciwciała przeciwko CD40 według niniejszego wynalazku wiążą się z epitopem ludzkiego CD40, który znajduje się, jak wspomniano poniżej, w takim samym

29 położeniu zarówno w izoformie krótkiej, jak i izoformie długiej tego powierzchniowego antygenu komórkowego. [002] Antygen CD40 jest wystawiony na powierzchni różnych rodzajów komórek, jak opisano w innym miejscu tego ujawnienia. Przez wystawiony na powierzchni i ulegający ekspresji na powierzchni rozumie się, że wszystkie lub część antygenu CD40 jest wystawiona na zewnątrz komórki. Wystawiony lub ulegający ekspresji antygen CD40 może być całkowicie lub częściowo glikozylowany. [003] Przez aktywność agonistyczną rozumie się, że substancja działa jako agonista. Agonista łączy się na komórce z receptorem i rozpoczyna reakcję lub aktywność, która jest podobna (lub taka sama), jak aktywność zapoczątkowana przez naturalny ligand receptora. Agonista CD40 wywołuje na przykład którąkolwiek lub wszystkie z m.in. następujących odpowiedzi: proliferację i różnicowanie komórek B, wytwarzanie przeciwciał, adhezję międzykomórkową, wytworzenie komórki B pamięci, przełączanie izotypów, zwiększenie ekspresji MHC klasy II i CD80/86 na powierzchni komórki oraz wydzielanie prozapalnych cytokin, takich jak IL-8, IL-12 i TNF. Przez aktywność antagonistyczną rozumie się, że substancja działa jako antagonista. Antagonista CD40 na przykład uniemożliwia lub zmniejsza wywoływanie jakiejkolwiek z odpowiedzi wywoływanych wiązaniem receptora CD40 do ligandu agonisty, w szczególności CD40L. Antagonista może zmniejszyć wywoływanie jakiejś jednej lub więcej z odpowiedzi na wiązanie agonisty o %, %, 1%, %, 2%, %, 3%, korzystnie o 40%, 4%, 0%, %, 60%, korzystniej o 70%, 80%, 8%, najkorzystniej o 90%, 9%, 99% lub 0%. Sposoby mierzenia swoistości wiązania i aktywności antagonistycznej przeciwciała przeciwko CD40 i liganda CD40 są znane specjaliście i obejmują między innymi standardowe

30 analizy współzawodnictwa wiązania, testy monitorowania wydzielania immunoglobuliny przez komórki B, testy proliferacji komórek B, testy proliferacji komórek B typu testu Banchereau, testy wytwarzania przeciwciał przez pomocnicze komórki T, testy kostymulacji proliferacji komórek B i testy regulacji w górę znaczników aktywacji komórek B. [004] Przez znaczącą aktywność agonistyczną rozumie się aktywność agonistyczną o co najmniej %, 3%, 40%, 4%, 0%, 60%, 70%, 7%, 80%, 8%, 90%, 9% lub 0% większą niż aktywność agonistyczna wywołana przez substancję obojętną lub kontrolę negatywną, mierzoną w teście odpowiedzi komórki B. Korzystnie, znacząca aktywność agonistyczna jest aktywnością agonistyczną, która jest co najmniej 2- krotnie większa lub co najmniej 3-krotnie większa niż aktywność agonistyczna wywołana przez substancję obojętną lub kontrolę negatywną, mierzoną w teście odpowiedzi komórki B. Gdy zatem na przykład odpowiedzią komórki B, którą się zajmujemy, jest proliferacja komórki B, znaczącą aktywnością agonistyczną będzie wywołanie poziomu proliferacji komórki B, który jest co najmniej 2- krotnie większy lub co najmniej 3-krotnie większy niż poziom proliferacji komórki B wywołanej przez substancję obojętną lub kontrolę negatywną. W jednym z wykonań wynalazku jako kontrola negatywna służy nieswoista immunoglobulina, na przykład IgG1, która nie wiąże się z CD40. Substancja wolna od znaczącej aktywności agonistycznej wykaże aktywność agonistyczną nie więcej niż około 2% większą, niż aktywność agonistyczna wywołana przez substancję obojętną lub kontrolę negatywną, korzystnie nie większą niż o około % większą, 1% większą, % większą, % większą, 1% większą, 0,% większą lub nawet nie większą niż o około 0,1% większą niż

31 aktywność agonistyczna wywołana przez substancję obojętną lub kontrolę negatywną, mierzona w teście odpowiedzi komórki B. Antagonistyczne przeciwciała przeciwko CD40 użyteczne w wynalazku są pozbawione, jak wspomniano powyżej, znaczącej aktywności agonistycznej, gdy są związane z antygenem CD40 na ludzkiej komórce. W jednym z wykonań wynalazku antagonistyczne przeciwciało przeciwko CD40 jest pozbawione znaczącej aktywności agonistycznej w jednej odpowiedzi komórki B. W innej postaci wynalazku antagonistyczne przeciwciało przeciwko CD40 jest pozbawione znaczącej aktywności agonistycznej w testach więcej niż jednej odpowiedzi komórki B (np. proliferacja i różnicowanie lub proliferacja, różnicowanie i wytwarzanie przeciwciała). [00] W rozumieniu niniejszego opisu przeciwciało przeciwko CD40 obejmuje jakiekolwiek przeciwciało, które swoiście rozpoznaje powierzchniowy antygen CD40 komórki B, łącznie z przeciwciałami poliklonalnymi, przeciwciałami monoklonalnymi, przeciwciałami jednołańcuchowymi i ich fragmentami, takimi jak Fab, F(ab ) 2, Fv i innymi fragmentami, które zachowują działanie wiązania antygenu rodzicielskiego przeciwciała przeciwko CD40. Przedmiotem szczególnego zainteresowania niniejszego wynalazku są ujawnione tutaj antagonistyczne przeciwciała przeciwko CD40, które wykazują charakterystykę wiązania taką samą, jak opisane powyżej przeciwciała monoklonalne CHIR-.9 i CHIR Takie przeciwciała obejmują między innymi następujące: (1) przeciwciała monoklonalne wytwarzane przez linie komórek hybrydoma oznaczonych 131.2F8..9 (określana tutaj jako linia komórkowa.9) i 13.8E2.D.D (określana tutaj jako linia komórkowa 12.12), zdeponowane w ATCC, odpowiednio, jako depozyt patentowy nr PTA-42 i depozyt patentowy nr PTA-43, (2) przeciwciało

32 monoklonalne zawierające sekwencję aminokwasów wybraną z grupy, do której należy sekwencja przedstawiona w SEQ ID nr 2, sekwencja przedstawiona w SEQ ID nr 4, sekwencja przedstawiona w SEQ ID nr, sekwencje (obie) przedstawione w SEQ ID nr 2 i SEQ ID nr 4 oraz sekwencje (obie) przedstawione w SEQ ID nr 2 i SEQ ID nr, (3) przeciwciało monoklonalne zawierające sekwencję aminokwasów wybraną z grupy, do której należy sekwencja przedstawiona w SEQ ID nr 6, sekwencja przedstawiona w SEQ ID nr 7, sekwencja przedstawiona w SEQ ID nr 8, sekwencje (obie) przedstawione w SEQ ID nr 6 i SEQ ID nr 7 oraz sekwencje (obie) przedstawione w SEQ ID nr 6 i SEQ ID nr 8, (4) przeciwciało monoklonalne, którego sekwencja aminokwasów jest kodowana przez cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydów wybraną z grupy, do której należy sekwencja nukleotydów przedstawiona w SEQ ID nr 1, sekwencja nukleotydów przedstawiona w SEQ ID nr 3 oraz sekwencje (obie) przedstawione w SEQ ID nr 1 i SEQ ID nr 3, () przeciwciało monoklonalne, które wiąże się z epitopem zdolnym do wiązania przeciwciała monoklonalnego wytworzonego przez linię.9 komórek hybrydoma lub linię komórek hybrydoma, (6) przeciwciało monoklonalne, które wiąże się z epitopem zawierającym reszty sekwencji aminokwasów przedstawionej w SEQ ID nr lub SEQ ID nr 12, (7) przeciwciało monoklonalne, które konkuruje z przeciwciałem monoklonalnym CHIR-.9 lub CHIR w analizie współzawodnictwa wiązania i (8) przeciwciało monoklonalne, które jest fragmentem wiążącym antygen przeciwciała monoklonalnego CHIR lub CHIR-.9 lub uprzednich przeciwciał monoklonalnych w poprzednich pozycjach (1)-(7), gdzie fragment zachowuje zdolność swoistego wiązania z ludzkim antygenem CD40. Specjaliści zdają sobie sprawę z tego, że ujawnione tutaj

33 3 antagonistyczne przeciwciała i wiążące antygen fragmenty tych przeciwciał obejmują przeciwciała i ich fragmenty wiążące antygen, które są wytwarzane na drodze rekombinacji z zastosowaniem sposobów dobrze znanych ze stanu techniki i opisanych poniżej i obejmują na przykład przeciwciała monoklonalne CHIR-.9 i CHIR wytworzone na drodze rekombinacji. 1 2 Wytwarzanie antagonistycznych przeciwciał przeciwko CD40 [006] Antagonistyczne przeciwciała przeciwko CD40 do stosowania w wynalazku można wytwarzać z zastosowaniem jakiegokolwiek sposobu znanego specjalistom. Surowice poliklonalne można zatem wytwarzać sposobami konwencjonalnymi. Ogólnie, roztworu zawierającego antygen CD40 używa się najpierw do immunizowania odpowiedniego zwierzęcia, korzystnie myszy, szczura, królika lub kozy. Przy wytwarzaniu surowic poliklonalnych korzystne są króliki lub kozy ze względu na objętość otrzymywanej surowicy i dostępność znakowanych przeciwciał przeciwkróliczych i przeciwkozich. [007] Surowice poliklonalne można wytwarzać w transgenicznym zwierzęciu, najlepiej u myszy-nosicielek loci ludzkiej immunoglobuliny. W korzystnym wykonaniu jako immunogenu używa się komórek Sf9 z ekspresją CD40. Immunizację można również przeprowadzać przez zmieszanie lub zemulgowanie roztworu zawierającego antygen w soli fizjologicznej, najlepiej w adiuwancie, takim jak kompletny adiuwant Freunda, i wstrzyknięcie mieszaniny lub emulsji pozajelitowo (zwykle podskórnie lub domięśniowo). Zazwyczaj wystarczająca jest dawka 0-0 μg/wstrzyknięcie. Zwykle wykonuje się immunizację dawką przypominającą, 2-6 tygodni później, jednym lub więcej niż jednym wstrzyknięciem białka

34 w soli fizjologicznej, korzystnie z zastosowaniem niekompletnego adiuwantu Freunda. Alternatywnie przeciwciała można wytwarzać przez immunizację in vitro, stosując sposoby znane ze stanu techniki, które uważa się dla celów tego wynalazku za równoważne immunizacji in vivo. Antysurowice poliklonalne otrzymuje się przez pobranie krwi od immunizowanego zwierzęcia do szklanego lub plastykowego pojemnika, inkubowanie krwi w temperaturze 2 C przez jedną godzinę, następnie inkubowanie w temperaturze 4 C przez 2-18 godzin. Surowicę odzyskuje się przez odwirowanie (np. 00 x g przez minut). Od królików można uzyskać około -0 ml na jedno pobranie krwi. [008] Wytwarzanie komórek Sf 9 (Spodoptera frugiperda) ujawniono w patencie Stanów Zjednoczonych nr 6,004,2. W skrócie, sekwencje kodujące ludzki CD40 rekombinowano w bakulowirusie, stosując wektory transferowe. Plazmidy kotransfekowano z DNA dzikiego szczepu bakulowirusa do komórek Sf 9. Zrekombinowane komórki Sf 9 zainfekowane bakulowirusem identyfikowano i oczyszczano przez klonowanie. [009] Korzystnie, przeciwciało ma naturę przeciwciała monoklonalnego. Przez przeciwciało monoklonalne rozumie się przeciwciało otrzymane z populacji zasadniczo homogenicznych przeciwciał, tj. populacji zawierającej pojedyncze przeciwciała, które są identyczne, z wyjątkiem możliwych, występujących naturalnie mutacji, które mogą być obecne w niewielkich ilościach. Termin nie jest ograniczony ze względu na gatunki lub źródło przeciwciała. Termin obejmuje całe immunoglobuliny, jak również fragmenty takie jak Fab, F(ab )2, Fv i inne, zachowujące wiążące antygen działanie przeciwciała. Przeciwciała monoklonalne są wysoce swoiste, skierowane przeciwko pojedynczym miejscom antygenowym, tj. antygenowi powierzchniowemu komórki CD40 w

35 niniejszym wynalazku. Co więcej, w przeciwieństwie do konwencjonalnych (poliklonalnych) preparatów przeciwciała, które zazwyczaj obejmują różne przeciwciała skierowane przeciwko różnym determinantom (epitopom), każde przeciwciało monoklonalne jest skierowane przeciwko pojedynczej determinancie na antygenie. Określenie monoklonalny wskazuje na charakter przeciwciała jako przeciwciała otrzymanego z zasadniczo homogenicznej populacji przeciwciał i nie należy rozumieć go jako wymogu wytwarzania przeciwciała jakimś szczególnym sposobem. Przeciwciała do stosowania według niniejszego wynalazku można na przykład wytwarzać sposobem z wykorzystaniem hybrydom, opisanym po raz pierwszy przez Kohler i wsp. (197) Nature 26:49, lub sposobami rekombinacji DNA (patrz np. patent Stanów Zjednoczonych nr 4,816,67). Przeciwciała monoklonalne można również wyizolować z bibliotek bakteriofagów przeciwciał z zastosowaniem technik opisanych na przykład w Clackson i wsp. (1991) Nature 32: , Marks i wsp. (1991) J. Mol. Biol. 222:81-97 i patencie Stanów Zjednoczonych nr,14,48. [0060] Przez epitop rozumie się część cząsteczki antygenowej, przeciwko której wytwarzane jest przeciwciało i z którą przeciwciało będzie się wiązać. Epitopy mogą zawierać liniowe reszty aminokwasów (tj. reszty w epitopie są rozmieszczone sekwencyjnie, jedna za drugą w sposób liniowy), nieliniowe reszty aminokwasów (nazywane tutaj nieliniowymi epitopami, te epitopy nie są rozmieszczone sekwencyjnie), albo zarówno liniowe, jak i nieliniowe reszty aminokwasów. [0061] Przeciwciała monoklonalne można wytwarzać z zastosowaniem sposobu Kohler i wsp., (197) Nature 26:49-496, lub jego modyfikacji. Zazwyczaj mysz immunizuje się roztworem zawierającym antygen. Immunizację można

36 przeprowadzić przez zmieszanie lub emulgowanie w soli fizjologicznej roztworu zawierającego antygen, korzystnie w adiuwancie, takim jak kompletny adiuwant Freunda, i pozajelitowe wstrzyknięcie mieszaniny lub emulsji. Do otrzymania przeciwciała monoklonalnego według wynalazku można zastosować jakikolwiek sposób immunizacji znany ze stanu techniki. Po immunizacji zwierzęcia usunięta zostaje śledziona (i opcjonalnie kilka dużych węzłów chłonnych) i rozdzielona na pojedyncze komórki. Komórki śledziony można badać metodą przesiewową przez nałożenie zawiesiny komórkowej na płytkę lub do dołka pokrytego antygenem będącym przedmiotem zainteresowania. Komórki B, w których zachodzi ekspresja związanych z błoną immunoglobulin swoistych dla antygenu, wiążą się z płytką i nie są wymywane. Powstałe w rezultacie komórki B lub wszystkie rozdzielone komórki śledziony pobudza się następnie do fuzji z komórkami szpiczaka, żeby utworzyć hybrydomy, i hoduje się w pożywce selektywnej. Powstałe w ten sposób komórki umieszcza się na płytkach w seryjnych rozcieńczeniach i badane się pod kątem wytwarzania przeciwciał swoiście wiążących antygen będący przedmiotem zainteresowania (i niewiążących się z antygenami niespokrewnionymi). Wyselekcjonowane hybrydomy wydzielające przeciwciało monoklonalne (mab) hoduje się następnie in vitro (np. w butelkach do hodowli tkankowej lub reaktorach zbudowanych z wydrążonych włókien) lub in vivo (jako puchlina brzuszna u myszy). [0062] Gdy antagonistyczne przeciwciała przeciwko CD40 wynalazku mają być otrzymane z zastosowaniem sposobów rekombinacji DNA, DNA kodujące przeciwciała monoklonalne można łatwo izolowanć i sekwencjonować przy zastosowaniu konwencjonalnych procedur (np. przez stosowanie oligonukleotydowych sond, zdolnych do swoistego wiązania z

37 genami kodującymi łańcuchy ciężkie i lekkie mysich przeciwciał). Korzystnym źródłem takiego DNA są komórki hybrydoma opisane tutaj. Po wyizolowaniu DNA może być umieszczone w wektorach ekspresyjnych, które transfekuje się później do komórek gospodarza, takich jak komórki E. coli, małpie komórki COS, komórki jajnika chomika chińskiego (CHO) lub komórki szpiczaka, które skądinąd nie wytwarzają białka immunoglobuliny, żeby otrzymać syntezę przeciwciał monoklonalnych w rekombinowanych komórkach gospodarza. Z artykułów przeglądowych na temat rekombinacyjnej ekspresji DNA kodującego przeciwciało u bakterii można wspomnieć Skerra i wsp. (1993) Curr. Opinion in Immunol. :26 i Phickthun (1992) Immunol. Revs. 1:11. Zamiast stosowania hybrydom przeciwciała można wytwarzać w linii komórkowej, takiej jak linia komórkowa CHO, jak ujawniono w patentach Stanów Zjednoczonych o numerach,4,403,,4,40 i,998,144. Pokrótce, linię komórkową transfekuje się wektorami zdolnymi do ekspresji, odpowiednio, łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego. Przez transfekowanie dwóch białek na oddzielnych wektorach można utworzyć przeciwciała chimeryczne. Inną korzyścią jest prawidłowa glikozylacja przeciwciała. [0063] W niektórych wykonaniach antagonistyczne przeciwciało przeciwko CD40, na przykład, przeciwciało CHIR lub CHIR-.9 lub ich fragment wiążący antygen, jest wytwarzane w komórkach CHO z zastosowaniem systemu ekspresji genu GS (Lonza Biologics, Portsmouth, New Hampshire, USA), który wykorzystuje jako znacznik syntetazę glutaminy. Patrz również patenty Stanów Zjednoczonych o numerach,122,464,,91,639,,68,79,,770,39,,827,739,,879,936,,891,693 i,981,216. [0064] Przeciwciała monoklonalne do CD40 są znane ze stanu techniki. Patrz na przykład rozdziały poświęcone antygenowi

38 komórki B w McMichael (red.) (1987; 1989) Leukocyte Typing III and IV (Oxford University Press, New York); patenty Stanów Zjednoczonych o numerach,674,492,,874,082,,677,16, 6,06,99, WO 00/6339, międzynarodowe publikacje WO 02/2890 i WO 02/28904, Gordon i wsp. (1988) J. Immunol. 140:142, Valle i wsp. (1989) Eur. J. Immunol. 19:1463, Clark i wsp. (1986) PNAS 83:4494 Paulie i wsp. (1989) J. Immunol. 142:90, Gordon i wsp. (1987) Eur. J. Immunol. 17:13, Jabara i wsp. (1990) J. Exp. Med. 172:1861, Zhang i wsp. (1991) J. Immunol. 146:1836, Gascan i wsp. (1991) J. Immunol. 147:8, Banchereau i wsp. (1991) Clin. Immunol. Spectrum 3:8 i Banchereau i wsp. (1991) Science 21:70. Przedmiotem szczególnego zainteresowania w niniejszym wynalazku są ujawnione tutaj antagonistyczne przeciwciała przeciwko CD40 o charakterystyce wiązania takiej samej, jak opisane powyżej przeciwciała monoklonalne.9 i CHIR [006] Termin epitop antygenu CD40 w rozumieniu niniejszego opisu odnosi się do cząsteczki zdolnej do immunoreaktywności z przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko CD40 według tego wynalazku, z wyłączeniem samego antygenu CD40. Epitopy antygenu CD40 mogą zawierać białka, fragmenty białek, peptydy, węglowodany, lipidy i inne cząsteczki, lecz dla celów niniejszego wynalazku najczęściej są to białka, krótkie oligopeptydy, oligopeptydy naśladujące (tj. związki organiczne, które naśladują własności wiązania przeciwciała antygenu CD40) lub ich kombinacje. Odpowiednie oligopeptydy naśladujące opisano między innymi w zgłoszeniu PCT US 91/ [0066] Dodatkowo, termin przeciwciało przeciwko CD40, w rozumieniu niniejszego opisu, obejmuje chimeryczne przeciwciała przeciwko CD40; takie chimeryczne przeciwciała przeciwko CD40 do stosowania w wynalazku posiadają

39 charakterystykę wiązania opisanych tutaj przeciwciał monoklonalnych.9 i CHIR Przez przeciwciała chimeryczne rozumie się przeciwciała, które najkorzystniej wytwarza się przy zastosowaniu technik rekombinacji kwasu dezoksyrybonukleinowego i które zawierają zarówno składniki ludzkie (łącznie z immunologicznie pokrewnymi rodzajami, np. szympansem), jak i składniki niepochodzące od człowieka. Najkorzystniej zatem region stały chimerycznego przeciwciała jest zasadniczo identyczny z regionem stałym występującego w naturze ludzkiego przeciwciała, korzystnie, region zmienny chimerycznego przeciwciała nie pochodzi ze źródła ludzkiego i posiada pożądaną swoistość antygenową wobec komórkowego antygenu powierzchniowego CD40. Źródłem innym niż człowiek może być jakik kręgowiec: źródło to można stosować do wytworzenia przeciwciał do ludzkiego komórkowego antygenu powierzchniowego CD40 lub materiału zawierającego ludzki komórkowy antygen powierzchniowy CD40. Do takich źródeł innych niż człowiek należą między innymi gryzonie (np. królik, szczur, mysz itp., patrz na przykład, patent Stanów Zjednoczonych nr 4,816,67) i inne niż człowiek naczelne (np. małpa starego świata, małpa człekokształtna itp., patrz na przykład patenty Stanów Zjednoczonych o numerach,70, i,76,096). W rozumieniu niniejszego opisu, fraza immunologicznie aktywny, jeśli jest używana w odniesieniu do chimerycznych przeciwciał przeciwko CD40, oznacza chimeryczne przeciwciało, które wiąże ludzki CD40. [0067] Termin przeciwciało przeciwko CD40 w rozumieniu niniejszego opisu obejmuje również chimeryczne i humanizowane przeciwciała przeciwko CD40. Przeciwciała chimeryczne zawierają segmenty przeciwciał pochodzących od różnych gatunków. Przykładem przeciwciała chimerycznego

40 jest Rituxan, z mysim regionem zmiennym i ludzkim regionem stałym. [0068] Przez humanizowany rozumie się postacie przeciwciał przeciwko CD40, które zawierają sekwencję minimalną pochodzącą z sekwencji immunoglobuliny innej niż ludzka. Humanizowane przeciwciała są najczęściej ludzkimi immunoglobulinami (przeciwciało biorcy), w których reszty z regionu hiperzmiennego (znanego również jako region określający komplementarność, czyli lub CDR) odbiorcy zostają podstawione resztami regionu hiperzmiennego gatunków innych niż człowiek (przeciwciało dawcy), takich jak mysz, szczur, królik lub naczelny niebędący człowiekiem, o pożądanej swoistości, powinowactwie i wydajności. Fraza region określający komplementarność odnosi się do sekwencji aminokwasów, które wspólnie określają powinowactwo wiązania i swoistość występującego w naturze regionu Fv miejsca wiązania natywnej immunoglobuliny. Patrz np. Chothia i wsp. (1987) J. Mol. Biol. 196: , Kabat i wsp. (1991) U. S. Dept. of Health and Human Services, NIH Publication nr ). Fraza region stały odnosi się do części cząsteczki przeciwciała, która nadaje funkcje efektorowe. W poprzedniej pracy ukierunkowanej na wytwarzanie nieimmunogenicznych przeciwciał do stosowania w leczeniu ludzkiej choroby, mysie regiony stałe były podstawione ludzkimi regionami stałymi. Regiony stałe humanizowanych przeciwciał pacjentów pochodziły z ludzkich immunoglobulin. Jednakże te humanizowane przeciwciała nadal wywoływały niepożądaną i potencjalnie niebezpieczną odpowiedź immunologiczną u ludzi i zachodziło w nich zmniejszenie powinowactwa. Charakterystyka wiązania humanizowanych przeciwciał przeciwko CD40 do stosowania w niniejszym

41 wynalazku jest podobna, jak opisywanych tutaj przeciwciał monoklonalnych.9 i CHIR [0069] Humanizację można w zasadzie przeprowadzać, kierując się sposobem Wintera i wsp. (Jones i wsp. (1986) Nature 321:22-2, Riechmann i wsp. (1988) Nature 332: , Verhoeyen i wsp. (1988) Science 239: ), przez zastępowanie sekwencji CDR lub CDR gryzonia lub zmutowanych sekwencji CDR lub CDR gryzonia odpowiednimi sekwencjami przeciwciała ludzkiego. Patrz również patenty Stanów Zjednoczonych o numerach,22,39,,8,089,,693,761,,693,762,,89,. W niektórych przypadkach reszty w regionach zrębowych jednego lub więcej zmiennych regionów ludzkiej immunoglobuliny zastępuje się odpowiadającymi resztami niepochodzącymi od człowieka (patrz na przykład patenty Stanów Zjednoczonych o numerach,8,089,,693,761,,693,762 i 6,180,370). Co więcej, humanizowane przeciwciała mogą zawierać reszty, które nie znajdują się w przeciwciele odbiorcy lub w przeciwciele dawcy. Te modyfikacje przeprowa się w celu udoskonalenia osiągów przeciwciała (np. żeby otrzymać pożądane powinowactwo). Ogólnie, humanizowane przeciwciało będzie zawierać zasadniczo wszystkie z co najmniej jednej, a zazwyczaj z dwóch zmiennych domen, w których wszystkie lub zasadniczo wszystkie regiony hiperzmienne odpowiadają regionom immunoglobulin niepochodzących od człowieka, a wszystkie lub zasadniczo wszystkie regiony zrębowe są takie, jak w sekwencji immunoglobuliny ludzkiej. Przeciwciało humanizowane opcjonalnie będzie również zawierać co najmniej część regionu stałego immunoglobuliny (Fc), zazwyczaj część pochodzącą z immunoglobuliny ludzkiej. Dalsze szczegóły patrz Jones i wsp. (1986) Nature 331:22-2, Riechmann i wsp. (1988) Nature 332: i Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2: Stosownie

42 do tego, takie przeciwciała humanizowane mogą obejmować przeciwciała, w których zasadniczo niecała ludzka domena zmienna została podstawiona przez odpowiadającą sekwencję z gatunków innych niż człowiek. Praktycznie humanizowane przeciwciała są zazwyczaj przeciwciałami ludzkimi, w których niektóre reszty CDR i ewentualnie niektóre reszty zrębowe zostały podstawione przez reszty z analogicznych miejsc przeciwciał gryzoni. Patrz na przykład patenty Stanów Zjednoczonych o numerach,22,39,,8,089,,693,761,,693,762,,89,. Patrz również patent Stanów Zjednoczonych nr 6,180,370 i międzynarodowa publikacja nr WO01/27160, w których ujawniono przeciwciała humanizowane i techniki otrzymywania przeciwciał humanizowanych o ulepszonym powinowactwir eobrv z góry określonego antygenu. [0070] Terminem przeciwciała przeciwko CD40 objęte są również ksenogeniczne lub modyfikowane przeciwciała przeciwko CD40 wytwarzane u gospodarza-ssaka innego niż człowiek, bardziej szczegółowo, u transgenicznej myszy, odznaczającej się loci zinaktywowanej endogennej immunoglobuliny (Ig). U takich transgenicznych zwierząt sprawne geny endogenne do ekspresji podjednostek lekkich i ciężkich immunoglobulin gospodarza unieczynnia się zastępuje analogicznymi loci immunoglobuliny ludzkiej. Takie transgeniczne zwierzęta wytwarzają ludzkie przeciwciała zasadniczo przy braku lekkich lub ciężkich podjednostek immunoglobuliny gospodarza. Patrz na przykład patenty Stanów Zjednoczonych o numerach,877,397 i,939,98. [0071] Korzystnie, całkowicie ludzkie przeciwciała przeciwko CD40 otrzymuje się przez immunizowanie transgenicznej myszy. Jedną taką mysz otrzymano z zastosowaniem techniki XenoMouse (Abgenix, Fremont,

43 4 1 2 Kalifornia, USA) i ujawniono w patentach Stanów Zjednoczonych 6,07,181, 6,091,001 i 6,114,98. W celu wytworzenia ujawnionych tutaj przeciwciał immunizowano myszy transgeniczne względem locus łańcucha ciężkiego ludzkiego IgG1 i lekkiego łańcucha ludzkiego κ komórkami Sf 9 z ekspresją ludzkiego CD40. Myszy mogą być również transgeniczne pod względem innych izotypów. Całkowicie ludzkie przeciwciała użyteczne w niniejszym wynalazku cechują się właściwościami wiązania podobnymi do opisanych tutaj właściwości przeciwciał monoklonalnych.9 i CHIR [0072] Fragmenty przeciwciał przeciwko CD40 są odpowiednie do zastosowania w wynalazku pod warunkiem, że zachowują pożądane powinowactwo przeciwciała o pełnej długości. Fragment przeciwciała przeciwko CD40 zachowa zatem zdolność do wiązania do antygenu powierzchniowego CD40 komórki B. Takie fragmenty cechują się właściwościami podobnymi do odpowiadającego antagonistycznego przeciwciała przeciwko CD40 o pełnej długości, to jest fragmenty będą wiązać swoiście ludzki antygen CD40 z ekspresją na powierzchni ludzkiej komórki i będą pozbawione znaczącej aktywności agonistycznej, wykazując jednocześnie aktywność antagonistyczną po związaniu z antygenem CD40 na ludzkich komórkach z ekspresją CD40. Takie fragmenty są tutaj nazywane fragmentami wiążącymi antygen. [0073] Odpowiednie fragmenty przeciwciała wiążące antygen zawierają część przeciwciała o pełnej długości, zazwyczaj część wiążącą antygen lub jej region zmienny. Przykłady fragmentów przeciwciał obejmują między innymi fragmenty Fab, F(ab ) 2, Fv i cząsteczki przeciwciała jednołańcuchowego. Przez Fab rozumie się monowalentny fragment wiążący antygen immunoglobuliny, złożony z łańcucha lekkiego i części łańcucha ciężkiego. Przez

44 F(ab ) 2 rozumie się biwalentny fragment immunoglobuliny wiążący antygen, zawierający oba łańcuchy lekkie i część obu łańcuchów ciężkich. Przez jednołańcuchowe Fv lub sfv fragmenty przeciwciała rozumie się fragmenty zawierające domeny V H i V L przeciwciała, w których te domeny są obecne w pojedynczym łańcuchu polipeptydu. Patrz na przykład patenty Stanów Zjednoczonych o numerach 4,946,778,,260,3,,4,0 i,86,46. Ogólnie polipeptyd Fv zawiera ponadto pomiędzy domenami V H i V L polipeptydowy linker, który umożliwia sfv utworzenie pożądanej struktury wiązania antygenu. W celu przeglądu sfv - patrz Pluckthun (1994) w The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, t. 113, red. Rosenburg i Moore (Springer- Verlag, New York), str Ujawnione tutaj fragmenty wiążące antygen antagonistycznego przeciwciała przeciwko CD40 mogą być również związane z cytotoksyną, żeby, jak opisano poniżej, zabijać docelowe komórki nowotworowe. [0074] Przeciwciała lub fragmenty przeciwciał można wyizolować z fagowych bibliotek przeciwciał wytwarzanych z zastosowaniem technik opisanych na przykład w McCafferty i wsp. (1990) Nature 348:2-4 (1990) i patencie Stanów Zjednoczonych nr,14,48. Clackson i wsp. (1991) Nature 32: i Marks i wsp. (1991) J. Mol. Biol. 222:81-97 opisują izolowanie, odpowiednio, mysich i ludzkich przeciwciał z wykorzystaniem bibliotek fagowych. W kolejnych publikacjach opisano wytwarzanie ludzkich przeciwciał o wysokim powinowactwie (zakres nm) przez wymieszanie łańcuchów (Marks i wsp. (1992) Bio/Technology : ), jak również kombinatoryczną infekcję i rekombinację in vivo jako strategię wytwarzania bardzo dużych bibliotek fagowych (Waterhouse i wsp. (1993) Nucleic. Acids Res. 21: ). Techniki te są zatem rozsądnymi metodami alternatywnymi wobce tradycyjnych

45 technik hybrydoma w zakresie izolowania przeciwciał monoklonalnych. [007] Do wytwarzania fragmentów przeciwciał wprowadzono różne techniki. Tradycyjnie te fragmenty otrzymywano poprzez proteolitycze trawienie całych przeciwciał (patrz np. Morimoto i wsp. (1992) Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:7-117 (1992) i Brennan i wsp. (198) Science 229:81). Jednakże obecnie te fragmenty można wytwarzać bezpośrednio przez rekombinowane komórki gospodarza. Fragmenty przeciwciała można na przykład izolować z omawianych powyżej bibliotek fagowych przeciwciał. Alternatywnie, fragmenty Fab -SH można odzyskiwać bezpośrednio z E. coli i dołączać chemicznie, by utworzyć fragmenty F(ab ) 2 (Carter i wsp. (1992) BiolTechnology : ). Według innego podejścia fragmenty F(ab ) 2 można izolować bezpośrednio z hodowli rekombinowanych komórek gospodarza. Dla specjalisty oczywiste będą inne techniki wytwarzania fragmentów przeciwciał. [0076] Antagonistyczne przeciwciała przeciwko CD40, użyteczne w niniejszym wynalazku, obejmują ujawnione tutaj przeciwciała monoklonalne.9 i CHIR-12.12, jak również przeciwciała różniące się od tego przeciwciała, ale zachowujące CDR i przeciwciała z jednym lub więcej dodatkiem(ami) aminokwasów, delecją(cjami) lub podstawieniem(ami), przy czym aktywność antagonistyczną mierzy się na podstawie zahamowania proliferacji i/lub różnicowania komórki B. Wynalazek obejmuje również deimmunizowane antagonistyczne przeciwciała przeciwko CD40, które można wytwarzać na przykład w sposób opisany w międzynarodowych publikacjach nr nr WO 98/2976 i WO W ten sposób reszty w antagonistycznym przeciwciele przeciwko CD40 wynalazku modyfikuje się tak,

46 żeby całkowicie wyeliminować lub zmniejszyć immunogenność przeciwciała dla ludzi, przy jednoczesnym zachowaniu ich aktywności antagonistycznej w stosunku do ludzkich komórek z ekspresją CD40, przy czym taką aktywność mierzy za pomocą doświadczeń opisywanych w innym miejscu tego ujawnienia. W zakres zastrzeżeń włączone są również białka fuzyjne zawierające antagonistyczne przeciwciało przeciwko CD40 wynalazku lub jego fragment, które to białka fuzyjne mogą być syntetyzowane lub ulegać ekspresji z odpowiadających wektorów polinukleotydowych, jak wiadomo ze stanu techniki. Takie białka fuzyjne opisano w odniesieniu do sprzęgania przeciwciał, jak opisano poniżej. [0077] W przeciwciałach według niniejszego wynalazku można dokonywać zmian sekwencji przy zastosowaniu sposobów opisanych na przykład w publikacjach patentowych o numerach EP A1, WO 00/34317 i WO 98/2976. Wykazano na przykład, że sekwencje w CDR mogą spowodować wiązanie przeciwciała z MHC klasy II i wywołać niepożądaną odpowiedź pomocniczych komórek T. Podstawienie konserwatywne może umożliwić zachowanie aktywności wiązania przez przeciwciało przy jednoczesnym wyeliminowaniu jego zdolności do wywoływania niepożądanej odpowiedzi komórki T. Stosując znane ze stanu techniki sposoby można wykonać jakiekolwiek konserwatywne lub niekonserwatywne podstawienia, takie jak te opisane w innych miejscach niniejszego ujawnienia, a powstałe przeciwciała będą objęte zakresem niniejszego wynalazku. Warianty przeciwciał można rutynowo badać pod kątem aktywności antagonistycznej, powinowactwa i swoistości przy zastosowaniu opisanych tutaj sposobów. [0078] Przeciwciało wytworzone jakimkolwiek opisanym powyżej sposobem lub innym nieujawnionym tutaj sposobem będzie objęte zakresem wynalazku, jeśli będzie wykazywało co najmniej jedną z następujących aktywności biologicznych:

47 hamowanie wydzielania immunoglobuliny przez prawidłowe ludzkie obwodowe komórki B stymulowane komórkami T, hamowanie proliferacji prawidłowych ludzkich obwodowych komórek B stymulowanych komórkami Jurkat T, hamowanie proliferacji prawidłowych ludzkich obwodowych komórek B stymulowanych komórkami z ekspresją CD40L lub z rozpuszczalnym ligandem CD40 (scd40l), hamowanie wewnątrzkomórkowych antyapoptotycznych sygnałów przeżywalności w każdej komórce stymulowanej przez scd40l lub CD40L w fazie stałej, hamowanie sygnału transdukcji CD40 w każdej komórce po połączeniu scd40l lub CD40L w fazie stałej i hamowanie proliferacji ludzkich złośliwych komórek B, jak opisano poniżej. Patrz również testy opisane w Schultze i wsp. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:80-84, Denton i wsp. (1998) Pediatr. Transplant. 2:6-1, Evans i wsp. (00) J. Immunol. 164: , Noelle (1998) Agents Actions Suppl. 49:17-22, Lederman i wsp. (1996) Curr. Opin. Hematol. 3:77-86, Coligan i wsp. (1991) Current Protocols in Immunology 13:12, Kwekkeboom i wsp. (1993) Immunology 79: i patenty Stanów Zjednoczonych o numerach,674,492 i,847,082. [0079] Reprezentatywnym testem służącym wykrywaniu antagonistycznych przeciwciał przeciwko CD40 swoistych dla epitopów antygenu CD40, podanym tutaj, jest analiza współzawodnictwa wiązania. Analizy współzawodnictwa wiązania są próbami serologicznymi, w których niewiadome substancje są wykrywane i określane ilościowo na podstawie ich zdolności do hamowania wiązania znanego oznakowanego ligandu z jego swoistym przeciwciałem. Test ten określa się również jako analizę współzawodnictwa hamowania. W reprezentatywnej analizie współzawodnictwa wiązania znakowany polipeptyd CD40 jest wytrącany przez badane przeciwciała w próbce, na przykład w połączeniu z

48 0 1 2 przeciwciałami monoklonalnymi skierowanymi przeciwko jednemu lub większej liczbie epitopów przeciwciał monoklonalnych wynalazku. Przeciwciała przeciwko CD40, które swoiście reagują z epitopem będącym przedmiotem zainteresowania, można zidentyfikować przez skrining serii przeciwciał wytworzonych przeciwko białku CD40 lub fragmentowi białka zawierającemu konkretny epitop białka CD40, będącego przedmiotem zainteresowania. Dla ludzkiego CD40, na przykład, epitopy będące przedmiotem zainteresowania obejmują epitopy zawierające linearne i/lub nielinearne reszty aminokwasów krótkiej izoformy ludzkiego CD40 (patrz nr akcesyjny GenBank NP_69093) przedstawione na Fig. 4B (SEQ ID nr ), kodowane przez sekwencję przedstawioną na Fig. 4A (SEQ ID nr 9, patrz również nr akcesyjny GenBank NM_1284) lub krótkiej izoformy ludzkiego CD40 (patrz nr akcesyjny GenBank nr CAA44 i NP_001241), przedstawione na Fig. 4D (SEQ ID N0:12), kodowane przez sekwencję przedstawioną na Fig. 4C (SEQ ID nr 11, patrz nr akcesyjny GenBank nr X6092 i NM_001). Alternatywnie do selekcji przeciwciał monoklonalnych porównywalnych z uprzednio zidentyfikowanymi przeciwciałami mogłaby być zastosowana analiza współzawodnictwa wiązania z zidentyfikowanym uprzednio odpowiednim antagonistycznym przeciwciałem przeciwko CD40. [0080] Przeciwciała stosowane w takim teście immunologicznym mogą być znakowane lub nieznakowane. Przeciwciała nieznakowane można stosować w aglutynacji, przeciwciała znakowane można stosować w szerokim zakresie testów, z zastosowaniem szerokiego zakresu znakowań. Wykrywanie tworzenia kompleksu przeciwciało-antygen pomiędzy przeciwciałem przeciwko CD40 i będącym przedmiotem zainteresowania epitopem można ułatwić przez dołączenie do przeciwciała substancji wykrywalnej. Odpowiednie narzędzia

49 1 1 2 do wykrywania obejmują takie znaczniki jak radionuklidy, enzymy, koenzymy, substancje fluorescencyjne, substancje chemiluminescencyjne, chromogeny, substraty enzymów lub kofaktory, inhibitory enzymów, kompleksy grup prostetycznych, wolne rodniki, cząsteczki, barwniki i tym podobne. Przykłady odpowiednich enzymów obejmują: peroksydazę chrzanową, fosfatazę alkaliczną, β- galaktozydazę lub acetylocholinoesterazę; przykłady odpowiednich kompleksów grup prostetycznych obejmują: kompleks streptawidyna/biotyna i kompleks awidyna/biotyna; przykłady odpowiednich materiałów fluorescencyjnych obejmują: umbelliferon, fluoresceinę, izotiocyjanian fluoresceiny, rodaminę, dichlorotriazynylaminę fluoresceiny, chlorek dansylu lub fikoerytrynę; przykładem materiału luminescencyjnego jest luminol; przykłady materiałów bioluminescencyjnych obejmują: lucyferazę, lucyferynę i akwarynę, a przykłady odpowiednich materiałów radioaktywnych obejmują: 12 I, 131 I, 3 S lub 3 H. Takie wyznakowane odczynniki można stosować w różnych dobrze znanych testach, takich jak: testy radioimmunologiczne, testy immunoenzymatyczne, na przykład ELISA, test immunofluorescencyjny i podobne. Patrz na przykład patenty Stanów Zjednoczonych o numerach 3,766,162, 3,791,932, 3,817,837 i 4,233,402. [0081] Jakiekolwiek uprzednio opisane antagonistyczne przeciwciała przeciwko CD40 lub ich fragmenty przed zastosowaniem w niniejszym wynalazku można sprzęgać. Sposoby wytwarzania sprzężonych przeciwciał są znane ze stanu techniki. Przeciwciało przeciwko CD40 można więc wyznakować z użyciem znakowania pośredniego (metody znakowania pośredniego). Przez znakowanie pośrednie lub metodę znakowania pośredniego rozumie się, że czynnik chelatujący jest związany z przeciwciałem kowalencyjnie i w

50 2 1 2 czynnik chelatujący wbudowany jest co najmniej jeden radionuklid. Patrz na przykład czynniki chelatujące i radionuklidy opisane w Srivagtava i Mease (1991) Nucl. Med. Bio. 18: Odpowiednie znaczniki obejmują fluorofory, chromofory, atomy radioaktywne (szczególnie 32 P i 12 I, odczynniki o wysokiej gęstości elektronowej, enzymy i ligandy posiadające swoistych partnerów do wiązania). Enzymy zazwyczaj wykrywa się przez oznaczanie ich aktywności. Peroksydazę chrzanową zazwyczaj wykrywa się na przykład poprzez jej zdolność do przekształcania 3,3,, - tetrametylobenzydyny (TMB) do niebieskiego barwnika, oznaczanego spektrofotometrem. Swoisty partner wiązania odnosi się do białka zdolnego do wiązania, z wysoką swoistością cząsteczki ligandu, jak na przykład w przypadku antygenu i swoistego przeciwciała monoklonalnego. Inni swoiści partnerzy wiązania obejmują biotynę i awidynę lub streptawidynę, IgG i białko A oraz liczne znane ze stanu techniki pary ligand-receptor. Powinno być zrozumiałe, że powyższy opis nie oznacza przydzielania różnych znaczników do osobnych klas, ponieważ ten sam znacznik może pełnić funkcję na kilka różnych sposobów. 12 I może na przykład występować jako znacznik radioaktywny lub jako odczynnik o wysokiej gęstości elektronowej. HRP może tu występować jako enzym lub jako antygen dla mab. Ponadto celem osiągnięcia pożądanego skutku można łączyć różne znaczniki. mabs i awidyna według niniejszego wynalazku również na przykład wymagają znaczników: mab można byłoby więc wyznakować biotyną i wykryć jego obecność znakowaną 12 I awidyną lub mab przeciwko biotynie znakowanym HRP. Inne odmiany i możliwości będą ewidentne dla specjalistów i uważa się je za równoważne w zakresie niniejszego wynalazku. [0082] Alternatywnie, przeciwciało przeciwko CD40 można znakować z zastosowaniem znakowania bezpośredniego

51 3 1 2 ( metody znakowania bezpośredniego ), w którym radionuklid jest kowalencyjnie związany bezpośrednio z przeciwciałem (zazwyczaj poprzez resztę aminokwasów). Korzystne radionuklidy opisano w Srivagtava i Mease (1991) supra. Szczególnie korzystna jest metoda znakowania pośredniego. Patrz również na przykład międzynarodowe publikacje o numerach WO 00/31 i WO 00/2473, w których stosowano linker, żeby dołączyć do przeciwciała radioaktywny znacznik; znakowane formy przeciwciał przeciwko CD40 opisano w patencie Stanów Zjednoczonych nr 6,01,42. [0083] Przeciwciało (lub jego fragment) może być także przyłączone do cząsteczki terapeutycznej, takiej jak cytotoksyna, czynnik terapeutyczny lub jon metalu radioaktywnego lub radioizotop. Cytotoksyna lub czynnik cytotoksyczny oznacza każdy czynnik, który jest dla komórki szkodliwy. Przykłady obejmują taksol, cytochalazynę B, gramicydynę D, bromek etydyny, emetynę, mitomycynę, etopozyd, tenopozyd, winkrystynę, winblastynę, kolchicynę, doksorubicynę, daunorubicynę, dihydroksyantracenedion, mitoksantron, mitramycynę, aktynomycynę D, 1- dehydrotestosteron, glukokortykoidy, prokainę, tetrakainę, lidokainę, propanolol i puromycynę oraz ich analogi i homologi. Czynniki terapeutyczne obejmują między innymi: antymetabolity (np. metotreksat, 6-merkaptopurynę, 6- tioguaninę, cytarabinę, -fluorouracyl dekarbazynę), czynniki alkilujące (np. mechloretaminę, tioepa chlorambucyl, melfalan, karmustynę (BSNU) i lomustynę (CCNU), cyklofosfamid, busulfan, dibromomannitol, streptozocynę, mitomycynę C i cis-dichlorodiaminę dichloroplatyny (II) (DDP) cisplatynę), antracykliny (np. daunorubicynę (poprzednio daunomycynę) oraz doksorubicynę), antybiotyki (np. daktynomycynę (poprzednio aktynomycynę), bleomycynę, mitramycynę i antramycynę (AMC)) oraz czynniki

52 4 1 2 antymitotyczne (np. winkrystynę i winblastynę). Radioizotopy obejmują między innymi I-131, I-123, I-12, Y- 90, Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212, Bi-213, Pd-9, Tc-99, In-111 i podobne. Koniugaty według wynalazku można stosować do modyfikowania danej odpowiedzi biologicznej; cząsteczka leku nie może być rozumiana jako ograniczona do klasycznych chemicznych czynników terapeutycznych. Cząsteczka leku może być na przykład białkiem lub polipeptydem wykazującym pożądaną aktywność biologiczną. Takie białka mogą obejmować na przykład: toksyny, takie jak: abryna, rycyna A, egzotoksyna Pseudomonas lub toksyna błonicy, białka takie, jak czynnik martwicy nowotworów, interferon alfa, interferon beta, czynnik wzrostu nerwów, czynnik wzrostu pochodzenia płytkowego, tkankowy aktywator plazminogenu, lub modyfikatory odpowiedzi biologicznej, takie jak na przykład: limfokiny, interleukina 1 ( IL-1 ), interleukina 2 ( IL-2 ), interleukina 6 ( IL-6 ), czynnik stymulujący kolonie makrofagów i granulocytów ( GM-CSF ), czynnik stymulujący kolonie granulocytów ( G-CSF ) lub inne czynniki wzrostu. [0084] Techniki sprzęgania takich cząsteczek terapeutycznych z przeciwciałami są dobrze znane. Patrz na przykład: Arnon i wsp. (198) Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy w Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, red. Reisfeld i wsp. (Alan R. Liss, Inc.), str ; red. Hellstrom i wsp. (1987) Antibodies for Drug Delivery, w Controlled Drug Delivery, red. Robinson i wsp. (wyd. 2; Marcel Dekker, Inc.), str ; Thorpe (198) Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review w Monoclonal Antibodies 84: Biological and Clinical Applications (red.) Pinchera i wsp., str (Editrice Kurtis, Mediolan, Włochy, 198); Analysis, Results, and Future Prospective of the

53 1 Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy w Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, red. Baldwin i wsp. (Academic Press, New York, 198), str ; oraz Thorpe i wsp. (1982)Immunol. Rev. 62: [008] Alternatywnie, przeciwciało może być sprzężone z drugim przeciwciałem, tworząc heterokoniugat, jak opisano w patencie Stanów Zjednoczonych nr 4,676,980. Ponadto między znacznikami a przeciwciałami według wynalazku można stosować linkery (patrz patent Stanów Zjednoczonych nr 4,831,17). Przeciwciała lub ich fragmenty wiążące antygen można znakować bezpośrednio radioaktywnym jodem, indem, itrem lub innymi radioaktywnymi cząstkami znanymi ze stanu techniki (patent Stanów Zjednoczonych nr,9,721). Leczenie może składać się z leczenia skojarzonego przez podawanie jednoczesne lub kolejno przeciwciał sprzężonych i niesprzężonych (WO 00/31 i WO 00/2473). Warianty antagonistycznych przeciwciał przeciwko CD40 2 [0086] W niniejszym wynalazku można stosować odpowiednie biologicznie aktywne warianty antagonistycznych przeciwciał przeciwko CD40. Takie warianty zachowają pożądane właściwości rodzicielskiego antagonistycznego przeciwciała przeciwko CD40. Sposoby wytwarzania wariantów przeciwciał są ogólnie znane ze stanu techniki. [0087] Warianty sekwencji aminokwasów antagonistycznego przeciwciała przeciwko CD40, na przykład, opisanych tu monoklonalnych przeciwciał.9 lub CHIR-12.12, można wytwarzać na przykład przez wywołanie mutacji w klonowanej sekwencji DNA kodującej przeciwciało, będące przedmiotem zainteresowania. Sposoby mutagenezy i zmiany sekwencji nukleotydów są dobrze znane ze stanu techniki. Patrz na przykład Walker i Gaastra (red.) (1983) Techniques in

54 6 1 2 Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York), Kunkel (198) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: , Kunkel i wsp. (1987) Methods Enzymol. 14: , Sambrook i wsp. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York), patent Stanów Zjednoczonych nr 4,873,192 i cytowane tam pozycje piśmiennictwa. Wskazówki co do odpowiednich podstawień aminokwasów, niewpływających na biologiczną aktywność będącego przedmiotem zainteresowania polipeptydu, można znaleźć w modelu Dayhoffa i wsp. (1978) w Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C., USA). Korzystne mogą być podstawienia konserwatywne, takie jak wymiana jednego aminokwasów na drugi o podobnych właściwościach. Przykłady podstawień konserwatywnych obejmują między innymi: Gly Ala, Val Ile Leu, Asp Glu, Lys Arg, Asn Gln i Phe Trp Tyr. [0088] W konstruowaniu wariantów będącego przedmiotem zainteresowania polipeptydu antagonistycznego przeciwciała przeciwko CD40, dokonuje się takich modyfikacji, żeby warianty nadal wykazywały żądaną aktywność, tj. podobne powinowactwo wiązania, były zdolne do swoistego wiązania się z ludzkim antygenem CD40 ulegającym ekspresji na powierzchni ludzkiej komórki i były wolne od znaczącej aktywności agonistycznej, lecz żeby wykazywały aktywność antagonistyczną po związaniu z antygenem CD40 na ludzkiej komórce z ekspresją D40. Oczywiście, żadna mutacja w DNA kodującym wariant polipeptydu nie może umiejscawiać sekwencji poza ramką odczytu i korzystnie nie będzie tworzyła regionów komplementarnych, które mogłyby wytwarzać wtórną strukturę mrna. Patrz publikacja zgłoszenia patentowego nr [0089] Można także poddawać różnym mutacjom stały region antagonistycznego przeciwciała przeciwko CD40, żeby

55 7 1 2 zwiększyć funkcję efektorową. Patrz na przykład patent Stanów Zjednoczonych nr 6,737,06B1 i publikacja zgłoszenia patentowego Stanów Zjednoczonych nr 04/01321A1, w których ujawniono mutacje Fc optymalizujące wiązanie przeciwciała z receptorami Fc. [0090] Korzystnie, warianty referencyjnego antagonistycznego przeciwciała przeciwko CD40 zawierają sekwencje aminokwasów, wykazujące co najmniej 70% lub 7% identyczność sekwencji, korzystnie co najmniej 80% lub 8% identyczność sekwencji, korzystniej co najmniej 90%, 91%, 92%, 93%, 94% lub 9% identyczność sekwencji z sekwencją aminokwasów referencyjnej cząsteczki antagonistycznego przeciwciała przeciwko CD40, na przykład opisanego tu przeciwciała monoklonalnego.9 lub CHIR lub z krótszą częścią referencyjnej cząsteczki przeciwciała. Korzystniej, cząsteczki wykazują co najmniej 96%, 97%, 98% lub 99% identyczność sekwencji. Dla celów niniejszego wynalazku, odsetek identyczności sekwencji określa się z użyciem algorytmu wyszukiwania sekwencji homologicznych Smitha-Watermana z afiniczną punktacją przerw w dopasowaniu, z karą za otwarcie przerwy równą 12, z karą za wydłużenie przerwy równą 2 oraz z macierzą podstawień BLOSUM 62. Algorytm wyszukiwania sekwencji homologicznych Smitha-Watermana przedstawiono w Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: Wariant może na przykład różnić się od antagonistycznego przeciwciała przeciwko CD40 zaledwie 1-1 resztami aminokwasowymi, zaledwie 1- resztami aminokwasowymi, na przykład 6-, zaledwie, zaledwie 4, 3, 2 lub nawet 1 resztą aminokwasową. [0091] W odniesieniu do optymalnego dopasowania dwóch sekwencji aminokwasowych, przyległe grupy wariantowych sekwencji aminokwasów mogą, w odniesieniu do referencyjnej sekwencji aminokwasów, zawierać dodatkowe reszty

56 8 1 2 aminokwasów lub delecje reszt aminokwasów. Grupy przyległe stosowane do porównania z referencyjnymi sekwencjami aminokwasów będą obejmowały co najmniej reszt aminokwasów z grupami przyległymi i mogą zawierać, 40, 0 lub więcej reszt aminokwasów. Można dokonywać korekty identyczności sekwencji związanej z podstawieniami lub przerwami reszt konserwatywnych (patrz algorytm wyszukiwania sekwencji homologicznych Smitha-Watermana). [0092] Dokładna struktura chemiczna polipeptydu zdolnego do swoistego wiązania CD40 i utrzymania aktywności antagonistycznej, szczególnie jeśli jest związany z antygenem CD40 na nowotworowych komórkach B, zależy od wielu czynników. Ponieważ w cząsteczce obecne są ulegające jonizacji grupy aminowe i karboksylowe, konkretny polipeptyd można otrzymywać jako sól kwaśną lub zasadową lub w postaci obojętnej. Wszystkie takie preparaty, które zachowują swoją biologiczną aktywność po umieszczeniu ich w odpowiednich warunkach środowiska, są objęte definicją antagonistycznych przeciwciał przeciwko CD40 w rozumieniu niniejszego opisu. Następnie, pierwotna sekwencja aminokwasów polipeptydu może być powiększona przez wytworzenie pochodnych, przez stosowanie cząstek cukru (glikozylacja) lub przez inne dodatkowe cząsteczki, takie jak tłuszcze, grupy fosforanowe, acetylowe i podobne. Może być ona także powiększona przez sprzężenie z sacharydami. Pewne aspekty takiego powiększenia są dokonane przez system obróbki potranslacyjnej wytwarzającego gospodarza; inne takie modyfikacje mogą być wprowadzone in vitro. W każdym przypadku, takie modyfikacje są objęte stosowaną tu definicją przeciwciała przeciwko CD40, o ile nie zostaną zniszczone właściwości antagonistyczne przeciwciała przeciwko CD40. Spodziewane jest, że takie modyfikacje mogą ilościowo lub jakościowo wpływać na aktywność poprzez

57 9 1 zwiększenie lub zmniejszenie aktywności polipeptydu w różnych testach. Następnie poszczególne reszty aminokwasów w łańcuchu mogą być modyfikowane przez utlenianie, redukcję lub inne reakcje wytwarzania pochodnych, a polipeptyd może być rozszczepiany celem otrzymania fragmentu zachowującego aktywność. Takie zmiany, które niszczą antagonistyczną aktywność, nie usuwają sekwencji polipeptydu z używanej tu definicji będących przedmiotem zainteresowania przeciwciał przeciwko CD40. [0093] Ze stanu techniki znane są istotne wskazówki dotyczące wytwarzania i stosowania wariantów polipeptydów. Przy wytwarzaniu wariantów przeciwciał przeciwko CD40 specjalista może bez trudu określić, które modyfikacje w sekwencjach natywnych białek, nukleotydów lub aminokwasów będą dawały w wyniku wariant odpowiedni do stosowania jako terapeutycznie aktywny składnik kompozycji farmaceutycznej stosowanej w niniejszym wynalazku. Sposoby leczenia z zastosowaniem antagonistycznych przeciwciał przeciwko CD40 według wynalazku 2 [0094] Ujawnione tutaj sposoby mają na celu zastosowanie antagonistycznych przeciwciwciał przeciwko CD40 do leczenia osobników (tj. pacjentów) ze szpiczakiem mnogim, u których w komórkach tego nowotworu zachodzi ekspresja antygenu CD40. Przez komórki szpiczaka mnogiego z ekspresją antygenu CD40 rozumie się komórki, w których zachodzi ekspresja antygenu CD40. Pomyślne leczenie szpiczaka mnogiego zależy od stopnia zaawansowania nowotworu w momencie rozpoznania i od tego, czy pacjent został lub zostanie poddany leczeniem innymi sposobami w skojarzeniu z podawaniem przeciwciała przeciwko CD40.

58 [009] Do klasyfikacji stadium szpiczaka mnogiego można stosować wiele kryteriów. Ujawnione tutaj sposoby można wykorzystywać w leczeniu szpiczaków mnogich klasyfikowanych systemem kwalifikacji według Durie-Salmon, który obejmuje trzy stadia. Zgodnie z tym systemem klasyfikacji, u osobnika w pierwszym stadium szpiczaka mnogiego obecne jest, w niewielkim stężeniu, tzw. białko M; nie ma objawów niedokrwistości ani hiperkalcemii, w badaniu rentgenowskim nie stwierdza się zmian kostnych albo stwierdza się pojedynczą zmianę. Białko M oznacza obecność w nadmiarze immunoglobulin jednego rodzaju. W miarę progresji szpiczaka mnogiego u pacjentów pojawia się wysoki poziom białka M (przeciwciał IgA lub IgG), przy niskim poziomie innych immunoglobulin. Stadium II oznacza stan pośredni, bardziej zaawansowany niż stadium I, lecz bez cech charakterystycznych dla stadium III. Stadium trzecie jest osiągnięte, kiedy wykrywa się jedno lub więcej z wymienionych: hiperkalcemię, niedokrwistość, liczne zmiany kostne lub wysoki poziom białka M. [0096] Celem uzyskania dokładniejszej charakterystyki stadium choroby system klasyfikacji Durie-Salmon można kojarzyć z pomiarami poziomu kreatyniny. Poziom kreatyniny u pacjentów ze szpiczakiem mnogim jest klasyfikuje się jako A lub B, przy czym wynik B wskazuje na gorsze rokowanie niż A. B wskazuje na wysoki poziom kreatyniny i uszkodzenie funkcji nerek. W ten sposób przypadek stadium IA szpiczaka mnogiego wskazywałby na brak niedokrwistości, hiperkalcemii i innych objawów w skojarzeniu z niskim poziomem kreatyniny. Jako dalsze metody oceny rokowania te kryteria można zastosować w połączeniu z monitorowaniem poziomu we krwi beta-2- mikroglobuliny, która jest wytwarzana przez komórki

59 szpiczaka mnogiego. Wysoki poziom białka wskazuje na obecność dużej ilości komórek nowotworowych. [0097] Ujawnione tutaj sposoby można zastosować w leczeniu szpiczaka mnogiego klasyfikowanego według jakichkolwiek uprzednich kryteriów. Tak samo, jak kryteria te można zastosować do charakterystyki progresywnych stadiów choroby, te same parametry, tj. niedokrwistość, hiperkalcemia, poziom kreatyniny i poziom beta-2- mikroglobuliny, liczba zmian kostnych i białko M, można monitorować celem oceny skuteczności leczenia. [0098] Leczenie definiuje się tutaj jako zastosowanie lub podanie pacjentowi antagonistycznego przeciwciała przeciwko CD40 lub jego fragmentu wiążącego antygen albo zastosowanie lub podanie do izolowanej tkanki lub linii komórkowej pochodzącej od pacjenta antagonistycznego przeciwciała przeciwko CD40 lub jego fragmentu wiążącego antygen, przy czym pacjent choruje na szpiczaka mnogiego, ma objawy związane ze szpiczakiem mnogim lub predyspozycje do rozwoju szpiczaka mnogiego, a celem jest leczenie, zwalczanie, łagodzenie, ulżenie, zmiana, zaradzenie, naprawienie, poprawa lub oddziaływanie na szpiczaka mnogiego, jakiekolwiek objawy szpiczaka mnogiego lub predyspozycje do rozwoju szpiczaka mnogiego. Przez leczenie rozumie się również zastosowanie lub podanie pacjentowi ze szpiczakiem mnogim kompozycji farmaceutycznej zawierającej antagonistyczne przeciwciała przeciwko CD40 lub ich fragmenty albo zastosowanie lub podanie do izolowanej tkanki lub linii komórkowej pochodzącej od pacjenta kompozycji farmaceutycznej zawierającej antagonistyczne przeciwciała przeciwko CD40 lub ich fragmenty, przy czym pacjent ze szpiczakiem mnogim ma objawy związane ze szpiczakiem mnogim lub predyspozycje do rozwoju szpiczaka mnogiego, a celem jest leczenie, zwalczanie, łagodzenie,

60 ulżenie, zmiana, zaradzenie, naprawienie, poprawa lub oddziaływanie na szpiczaka mnogiego, jakiekolwiek objawy szpiczaka mnogiego lub predyspozycje do rozwoju szpiczaka mnogiego. [0099] Przez działanie przeciwnowotworowe rozumie się redukcję tempa proliferacji lub gromadzenia komórek nowotworowych z ekspresją CD40, i przez to obniżenie tempa wzrostu istniejącego guza lub guza, który pojawia się podczas leczenia i/lub zniszczenie istniejących komórek nowotworu (guza) lub nowo powstałych komórek nowotworowych, a zatem zmniejszenie całkowitego rozmiaru guza podczas leczenia. Leczenie co najmniej jednym przeciwciałem przeciwko CD40 (lub jego fragmentem wiążącym antygen), gdy choroba obejmuje komórki z ekspresją antygenu CD40, powoduje odpowiedź fizjologiczną, która jest korzystna w odniesieniu leczenia szpiczaka mnogiego. Uznaje się, że sposoby ujawnione tutaj mogą być użyteczne w zapobieganiu dalszej proliferacji i nadmiernemu wzrostowi pojawiających się komórek szpiczaka mnogiego. [00] Zgodnie ze sposobami ujawnionymi tutaj, co najmniej jedno antagonistyczne przeciwciało przeciwko CD40 (lub jego fragment wiążący antygen), jak określono powyżej, stosuje się do pobudzenia odpowiedzi terapeutycznej pozytywnej w odniesieniu do leczenia lub profilaktyki szpiczaka mnogiego. Przez pozytywną odpowiedź terapeutyczną w odniesieniu do leczenia nowotworu rozumie się poprawę w objawach choroby w powiązaniu z przeciwnowotworowym działaniem tych przeciwciał lub ich fragmentów i/lub poprawę objawów związanych z chorobą. To jest, może być obserwowane działanie antyproliferacyjne, zapobieganie dalszemu wzrostowi guza, redukcja rozmiaru nowotworu, redukcja liczby komórek nowotworowych i/lub zmniejszenie jednego lub więcej objawów wywołanych stymulacją komórek z

61 ekspresją CD40. Poprawa w zakresie choroby może być zatem na przykład określona jako odpowiedź całkowita. Przez odpowiedź całkowitą rozumie się brak klinicznie wykrywalnej choroby, z normalizacją wszystkich uprzednio nieprawidłowych wyników badań radiologicznych, szpiku kostnego i płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF). Taka odpowiedź musi się utrzymywać przez co najmniej miesiąc po leczeniu opisywanymi tu sposobami. Alternatywnie, poprawę choroby można określać jako odpowiedź częściową. Przez odpowiedź częściową rozumie się co najmniej około 0% obniżenie wszystkich mierzalnych obciążeń guzem (tj. liczby komórek guza obecnych u pacjenta), przy nieobecności nowych zmian patologicznych, i utrzymywanie się tego stanu przez co najmniej miesiąc. Taka odpowiedź jest możliwa do zastosowania tylko w nowotworach mierzalnych. [01] Odpowiedź guza można oceniać na podstawie zmiany morfologii guza (tj. całkowite obciążenie guzem, rozmiar guza i podobne), stosując techniki przesiewowe, takie jak: obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI), obrazowanie rentgenowskie, tomografia komputerowa (CT), obrazowanie bioluminescencją, na przykład obrazowanie lucyferazą, scyntygrafia kości i pobieranie próbek guza, w tym biopsja szpiku kostnego (BMA). Oprócz tych pozytywnych odpowiedzi na leczenie, u osobnika poddawanego leczeniu antagonistycznym przeciwciałem przeciwko CD40 lub jego fragmentem wiążącym antygen może wystąpić korzystny skutek poprawy objawów związanych z chorobą. [02] Przez terapeutycznie efektywną dawkę lub ilość lub ilość efektywną rozumie się ilość antagonistycznego przeciwciała przeciwko CD40 lub jego fragmentu wiążącego antygen, która, po podaniu, wywołuje pozytywną odpowiedź na leczenie u pacjentów ze szpiczakiem mnogim. W pewnych wykonaniach ujawnienia, terapeutycznie efektywna dawka

62 przeciwciała przeciwko CD40 lub jego fragmentu mieści się w zakresie od około 0,01 mg/kg do około 40 mg/kg, od około 0,01 mg/kg do około mg/kg, od około 0,1 mg/kg do około mg/kg, od około 1 mg/kg do około mg/kg, od około 3 mg/kg do około mg/kg, od około 3 mg/kg do około 2 mg/kg, od około 3 mg/kg do około mg/kg, od około mg/kg do około 1 mg/kg, lub od około 7 mg/kg do około 12 mg/kg. Uznaje się, że sposób leczenia może obejmować jednorazowe podanie terapeutycznie efektywnej dawki lub podanie wielokrotne terapeutycznie efektywnej dawki antagonistycznego przeciwciała przeciwko CD40 lub jego fragmentu wiążącego antygen. [03] Następnym wykonaniem ujawnienia jest stosowanie antagonistycznych przeciwciał przeciwko CD40 do diagnostycznego monitorowania poziomu białek w tkankach w ramach procedury badania klinicznego, na przykład w celu określenia skuteczności danego schematu leczenia. Wykrywanie może być ułatwione przez sprzężenie przeciwciała z substancją wykrywalną. Przykłady substancji wykrywalnych obejmują: różne enzymy, grupy prostetyczne, materiały fluorescencyjne, materiały luminescencyjne, materiały bioluminescencyjne i materiały radioaktywne. Przykłady odpowiednich enzymów obejmują peroksydazę chrzanową, fosfatazę alkaliczną, β-galaktozydazę lub acetylocholinoesterazę; przykłady odpowiednich kompleksów grup prostetycznych obejmują streptawidynę/biotynę i awidynę/biotynę; przykłady odpowiednich materiałów fluorescencyjnych obejmują umbelliferon, fluoresceinę, izotiocyjanian fluoresceiny, rodaminę, dichlorotriazynylaminofluoresceinę, chlorek dansylu lub fikoerytrynę; przykład materiału luminescencyjnego obejmuje luminol; przykłady materiałów bioluminescencyjnych obejmują

63 6 1 2 lucyferazę, lucyferynę i ekworynę, a przykłady odpowiednich materiałów radioaktywnych obejmują: 12 I, 131 I, 3 S lub 3 H. [04] W leczeniu szpiczaka mnogiego antagonistyczne przeciwciała przeciwko CD40 można stosować w skojarzeniu ze znanymi chemioterapeutykami, same lub w połączeniu z przeszczepem szpiku kostnego, radioterapią, steroidami i interferonem alfa. W ten sposób opisane tutaj antagonistyczne przeciwciała przeciwko CD40 lub ich fragmenty wiążące antygen podaje się w skojarzeniu z co najmniej jednym innym leczeniem przeciwnowotworowym obejmującym między innymi radioterapię, chemioterapię, leczenie interferonem alfa lub leczenie steroidami, przy czym dodatkowe leczenie przeciwnowotworowe stosuje się przed leczeniem przeciwciałem przeciwko CD40, podczas tego leczenia lub po tym leczeniu. Gdy zatem terapia skojarzona obejmuje podawanie przeciwciała przeciwko CD40 lub jego fragmentu w połączeniu z podawaniem innych środków terapeutycznych, takich jak chemioterapia, radioterapia lub terapia interferonem alfa i(lub)lub steroidami, sposoby ujawnione tutaj obejmują jednoczesne podawanie, przy użyciu oddzielnych preparatów lub jednego preparatu farmaceutycznego, i podawanie sekwencyjne w dowolnej kolejności, przy czym korzystnie istnieje okres, w którym oba (lub wszystkie) środki aktywne wywierają jednocześnie swe działanie terapeutyczne. Gdy sposoby ujawnione tutaj obejmują złożony tryb schemat, terapie te mogą być stosowane równocześnie, tj. przeciwciało przeciwko CD40 lub jego fragment wiążący antygen podawane są jednocześnie lub w tym samym przedziale czasowym co inna terapia przeciwnowotworowa (tj. terapie przebiegają jednocześnie, ale przeciwciało CD40 lub jego fragment wiążący antygen nie są podawane dokładnie w tym samym czasie, co inne terapie przeciwnowotworowe). Alternatywnie przeciwciało przeciwko

64 CD40 według niniejszego wynalazku lub jego fragment wiążący antygen mogą być również podawane przed inną terapią przeciwnowotworową lub po niej. Sekwencyjne podanie różnych terapii przeciwnowotworowych można przeprowadzić niezależnie od tego, czy leczony osobnik odpowiada na pierwszy kurs terapii, żeby zmniejszyć możliwość remisji lub nawrotu. [0] W pewnych wykonaniach ujawnienia, opisane tutaj przeciwciało CD40 lub jego fragmenty wiążące antygen podaje się są w połączeniu z chemioterapią i opcjonalnie w połączeniu z autologicznym przeszczepem szpiku kostnego, przy czym przeciwciało i środek (środki) chemioterapeutyczne mogą być podawane kolejno, w dowolnej kolejności, lub równocześnie (tj. jednocześnie lub w tym samym przedziale czasowym). Przykłady odpowiednich środków chemioterapeutycznych obejmują między innymi winkrystynę, BCNU, melfalan, cyklofosfamid, adriamycynę i prednizon lub deksametazon. [06] W jednym z wykonań przeciwciało CD40 podawano zatem na przykład w połączeniu z melfalanem, lekiem alkilującym, i steroidem prednizonem (schemat określany jako MP). Alternatywnie zamiast melfalanu można stosować leki alkilujące cyklofosfamid i chlorambucyl w połączeniu ze steroidami i przeciwciałami przeciwko CD40 wynalazku. Jeśli osobniki nie wykazują odpowiedzi na MP lub środki alternatywne, oraz u osobników, którzy mają nawrót po leczeniu MP, przeciwciała CD40 wynalazku można podawać w skojarzeniu ze schematem chemioterapii obejmującym winkrystynę, doksorubicynę i deksametazon w dużych dawkach (schemat VAD ), który może również obejmować jednoczesne podawanie cyklofosfamidu. W innych wykonaniach wynalazku, przeciwciała przeciwko CD40 można stosować w skojarzeniu z innymi środkami o właściwościach hamowania powstawania

65 67 1 naczyń, takimi jak talidomid lub interferon alfa. Te ostatnie środki mogą być skuteczne, gdy osobnik jest oporny na leczenie MP i/lub VAD. W jeszcze innych wykonaniach wynalazku przeciwciało przeciwko CD40 można podawać w skojarzeniu z inhibitorami proteasomu, takimi jak bortezomib (Velcade ), przy czym ten ostatni podaje się osobnikom z nawrotem choroby po dwóch poprzednich terapiach i z opornością na ostatnią terapię. Alternatywnie, przeciwciała przeciwko CD40 można podawać osobnikowi w skojarzeniu z chemioterapią w dużych dawkach, same lub z autologicznym przeszczepem szpiku kostnego. [07] Opisanych tutaj przeciwciał przeciwko CD40 można także użyć do wytworzenia odczynników, na przykład znakowanych przeciwciał, które można stosować na przykład do identyfikacji komórek z ekspresją CD40. Może to być bardzo użyteczne w określaniu typu komórek nieznanej próbki. Do identyfikowania tkanek według gatunku i/lub typu narządu można stosować panele przeciwciał monoklonalnych. W podobny sposób te przeciwciała przeciwko CD40 można stosować w badaniach przesiewowych komórek hodowli tkankowej w kierunku zanieczyszczenia (tj. badanie przesiewowe na obecność w hodowli mieszaniny komórek z ekspresją CD40 i komórek bez ekspresji CD40). 2 Preparaty farmaceutyczne i sposoby podawania [08] Antagonistyczne przeciwciała przeciwko CD40 według niniejszego wynalazku podaje się w stężeniu terapeutycznie skutecznym w profilaktyce lub leczeniu szpiczaka mnogiego. Żeby spełnić ten cel, z przeciwciał można wytwarzać preparaty z zastosowaniem różnorodnych akceptowalnych zaróbek znanych ze stanu techniki. Zazwyczaj, przeciwciała podawane są przez wstrzyknięcie, albo dożylnie, albo

66 dootrzewnowo. Sposoby wykonania tego podawania znane są specjalistom. Może być również możliwe otrzymanie kompozycji nadających się do podawania miejscowego lub doustnego lub przenikających przez błony śluzowe. [09] Korzystnie, podawanie dożylne wykonuje się w postaci wlewu przez okres od około 1 godziny do około godzin, korzystniej od około 1 do około 8 godzin, jeszcze korzystniej od około 2 do około 7 godzin, jeszcze korzystniej od około 4 do około 6 godzin, zależnie od podawanego antagonistycznego przeciwciała przeciwko CD40. Początkowy wlew kompozycji farmaceutycznej może być podawany przez okres od około 4 do około 6 godzin, a kolejne wlewy szybciej. Kolejne wlewy mogą być podawane przez okres od około 1 do około 6 godzin, w tym na przykład przez czas od około 1 do około 4 godzin, od około 1 do około 3 godzin lub od około 1 do około 2 godzin. [01] Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku jest opracowana tak, żeby wykazywała zgodność z zamierzoną drogą podawania. Przykłady możliwych dróg podawania obejmują podawanie pozajelitowe (np. dożylne (i.v.), domięśniowe (i.m.), śródskórne, podskórne (s.c.) lub wlew), doustne i dopłucne (np. inhalacja), donosowe, przezskórne (miejscowo), przezśluzówkowe i doodbytnicze. Roztwory i zawiesiny stosowane do podawania pozajelitowego, śródskórnego lub podskórnego mogą zawierać następujące składniki: jałowy rozcieńczalnik, taki jak woda do wstrzyknięć, roztwór soli fizjologicznej, oleje stałe, glikole polietylenowe, glicerynę, glikol propylenowy lub inne rozpuszczalniki syntetyczne, środki przeciwbakteryjne, takie jak alkohol benzylowy lub nipaginy, przeciwutleniacze, takie jak kwas askorbinowy lub wodorosiarczyn sodu, czynniki chelatujące, takie jak kwas etylenodiaminotetraoctowy, bufory, takie jak octany,

67 cytryniany, fosforany, i środki do regulacji toniczności roztworu, takie jak chlorek sodu lub dekstroza. ph może być skorygowane kwasami lub zasadami, takimi jak kwas chlorowodorowy lub wodorotlenek sodu. Preparat pozajelitowy można wytwarzać w ampułkach, jednorazowych strzykawkach lub wielodawkowych fiolkach ze szkła lub plastyku. [0111] Przeciwciała przeciwko CD40 podaje się zazwyczaj za pomocą standardowych technik w farmaceutycznie akceptowalnym buforze, na przykład w jałowej soli fizjologicznej, jałowej, zbuforowanej wodzie, glikolu polipropylenowym, kombinacji tych środków itd. Sposoby wytwarzania środków podawanych pozajelitowo opisano w Remington s Pharmaceutical Sciences (wyd. 18, Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990). Patrz również na przykład publikacja WO 98/6418, w której opisano stabilizowane farmaceutyczne preparaty przeciwciał odpowiednie do stosowania w sposobach tutaj ujawnionych. [0112] Ilość co najmniej jednego przeciwciała przeciwko CD40 lub jego fragmentu, który ma być podawany, jest łatwo bez zbytniego eksperymentowania określana przez specjalistę. Czynniki wpływające na sposób podawania i właściwą ilość co najmniej jednego antagonistycznego przeciwciała przeciwko CD40 (lub jego fragmentu) obejmują między innymi konkretną chorobę poddawaną leczeniu, ciężkość przebiegu choroby, dotychczasowy przebieg choroby oraz wiek, wzrost, masę ciała, stan zdrowia i stan fizyczny osoby poddającej się leczeniu. Podobnie, ilość antagonistycznego przeciwciała przeciwko CD40 lub jego fragmentu, który ma być podawany, będzie zależna od sposobu podawania oraz od tego, czy osobnik ma otrzymać pojedynczą dawkę czy wielokrotne dawki tego środka przeciwnowotworowego. Ogólnie, korzystne jest podawanie wyższych dawek przeciwciała przeciwko CD40 lub jego

68 fragmentu przy większej masie ciała poddawanego leczeniu pacjenta. Dawka przeciwciała przeciwko CD40 lub jego fragmentu, który ma być podany, mieści się w zakresie od około 0,003 mg/kg do około 0 mg/kg, korzystnie, w zakresie od 0,01 mg/kg do około 40 mg/kg. Dawka może zatem wynosić na przykład 0,01 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0, mg/kg, 1 mg/kg, 1, mg/kg, 2 mg/kg, 2, mg/kg, 3 mg/kg, mg/kg, 7 mg/kg, mg/kg, 1 mg/kg, mg/kg, 2 mg/kg, mg/kg, 3 mg/kg, 40 mg/kg, 4 mg/kg lub 0 mg/kg. [0113] W inneym wykonaniu ujawnienia sposób obejmuje podawanie wielokrotnych dawek antagonistycznego przeciwciała przeciwko CD40 lub jego fragmentu. Sposób może obejmować podawanie 1, 2, 3, 4,, 6, 7, 8, 9,, 1,, 2,, 3, 40 lub więcej efektywnych terapeutycznie dawek kompozycji farmaceutycznej zawierającej antagonistyczne przeciwciało przeciwko CD40 lub jego fragment. Częstotliwość i czas podawania wielokrotnych dawek kompozycji farmaceutycznych zawierających przeciwciało przeciwko CD40 lub jego fragment mogą być łatwo określone bez zbytniego eksperymentowania przez specjalistę. Co więcej, leczenie osobnika terapeutycznie efektywną ilością przeciwciała może obejmować leczenie jednorazowe lub, korzystnie, może obejmować leczenie seryjne. W korzystnym przykładzie osobnika leczy się antagonistycznym przeciwciałem przeciwko CD40 lub jego fragmentem wiążącym antygen w zakresie pomiędzy około 0,1 do mg/kg masy ciała, raz w tygodniu przez czas od około 1 do tygodni, korzystnie od około 2 do 8 tygodni, korzystniej od około 3 do 7 tygodni i jeszcze korzystniej około 4, lub 6 tygodni. Leczenie może następować corocznie, żeby zapobiec nawrotowi, lub przy wystąpieniu oznak nawrotu. Należy również zauważyć, że efektywne dawkowanie przeciwciała lub jego fragmentu wiążącego antygen stosowanego do leczenia

69 może wzrosnąć lub zmniejszyć się w trakcie trwania danej terapii. Zmiany w dawkowaniu mogą być skutkiem i stawać się oczywiste na podstawie wyników opisywanych tu testów diagnostycznych. W jednym z wykonań wynalazku schemat podawania obejmuje zatem pierwsze podanie terapeutycznie efektywnej dawki co najmniej jednego przeciwciała przeciwko CD40 lub jego fragmentu w dniach 1, 7, 14 i 21 okresu leczenia. W innym wykonaniu wynalazku schemat dawkowania obejmuje pierwsze podanie terapeutycznie efektywnej dawki co najmniej jednego przeciwciała przeciwko CD40 lub jego fragmentu w 1, 2, 3, 4,, 6, i 7 dniu tygodnia okresu leczenia. Następne wykonania wynalazku obejmują schemat dawkowania z pierwszym podaniem terapeutycznie efektywnej dawki co najmniej jednego przeciwciała przeciwko CD40 lub jego fragmentu w 1, 3,, i 7 dniu tygodnia okresu leczenia, schemat dawkowania obejmujący pierwsze podanie terapeutycznie efektywnej dawki co najmniej jednego przeciwciała przeciwko CD40 lub jego fragmentu w 1 i 3 dniu tygodnia okresu leczenia i korzystny schemat dawkowania obejmujący pierwsze podanie terapeutycznie efektywnej dawki co najmniej jednego przeciwciała przeciwko CD40 lub jego fragmentu w dniu 1 tygodnia okresu leczenia. Okres leczenia może obejmować 1 tydzień, 2 tygodnie, 3 tygodnie, miesiąc, 3 miesiące, 6 miesięcy lub rok. Okresy leczenia mogą następować po sobie lub mogą być oddzielone od siebie przez dzień, tydzień, 2 tygodnie, miesiąc, 3 miesiące lub rok. [0114] W niektórych wykonaniach wynalazku terapeutycznie efektywne dawki antagonistycznego przeciwciała przeciwko CD40 lub jego wiążącego antygen mieszczą się w zakresie od około 0,003 mg/kg do około 0 mg/kg, od około 0,01 mg/kg do około 40 mg/kg, od około 0,01 mg/kg do około mg/kg, od około 0,1 mg/kg do około mg/kg, od około 0, mg/kg do około mg/kg, od około 1 mg/kg do około mg/kg, od

70 około 3 mg/kg do około mg/kg, od około 3 mg/kg do około 2 mg/kg, od około 3 mg/kg do około mg/kg, od około mg/kg do około 1 mg/kg lub od około 7 mg/kg do około 12 mg/kg. Dawka każdego antagonistycznego przeciwciała przeciwko CD40 lub jego fragmentu wiążącego antygen, na przykład przeciwciała monoklonalnego przeciwko CD40 CHIR lub CHIR-.9 lub jego fragmentu wiążącego antygen, może zatem na przykład wynosić 0,003 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0, mg/kg, 1 mg/kg, 1, mg/kg, 2 mg/kg, 2, mg/kg, 3 mg/kg, mg/kg, 7 mg/kg, mg/kg, 1 mg/kg, mg/kg, 2 mg/kg, mg/kg, 3 mg/kg, 40 mg/kg, 4 mg/kg, 0 mg/kg lub inne takie dawki mieszczące się w zakresie od około 0,003 mg/kg do około 0 mg/kg. W każdym tygodniu podawania przeciwciała może być podawana taka sama terapeutycznie efektywna dawka antagonistycznego przeciwciała przeciwko CD40 lub jego fragmentu wiążącego antygen. Alternatywnie, w trakcie okresu leczenia można stosować różne terapeutycznie efektywne dawki antagonisty przeciwciała przeciwko CD40 lub jego wiążącego antygen fragmentu. [011] W innych wykonaniach wynalazku początkowa terapeutycznie efektywna dawka antagonistycznego przeciwciała przeciwko CD40 lub jego fragmentu wiążącego antygen, określona w innym miejscu niniejszego ujawnienia, może mieścić się w dolnym zakresie dawkowania (tj. od około 0,003 mg/kg do około mg/kg), a kolejne dawki mogą mieścić się w górnym zakresie dawkowania (tj. od około mg/kg do około 0 mg/kg). [0116] W alternatywnych wykonaniach wynalazku początkowa terapeutycznie efektywna dawka antagonistycznego przeciwciała przeciwko CD40 lub jego fragmentu wiążącego antygen, określona w innym miejscu niniejszego ujawnienia, może mieścić się w górnym zakresie dawkowania (tj. od około

71 mg/kg do około 0 mg/kg) a kolejne dawki mogą mieścić się w dolnym zakresie dawkowania (tj. od 0,003 mg/kg do około mg/kg). W jednym z wykonań wynalazku początkowa terapeutycznie efektywna dawka antagonistycznego przeciwciała przeciwko CD40 lub jego fragmentu wiążącego antygen wynosi zatem od około mg/kg do około 3 mg/kg, w tym około mg/kg, około 2 mg/kg, około mg/kg i około 3 mg/kg, a dalsze terapeutycznie efektywne dawki antagonistycznego przeciwciała przeciwko CD40 lub jego fragmentu wiążącego antygen wynoszą od około mg/kg do około 1 mg/kg, w tym około mg/kg, 8 mg/kg, mg/kg, 12 mg/kg i około 1 mg/kg. [0117] W niektórych postaciach ujawnienia leczenie antagonistycznym przeciwciałem przeciwko CD40 rozpoczyna się od podania dawki wstępnej przeciwciała lub jego fragmentu wiążącego antygen osobnikowi potrzebującemu leczenia antagonistycznym przeciwciałem przeciwko CD40. Przez dawkę początkową rozumie się początkową dawkę antagonistycznego przeciwciała przeciwko CD40 lub jego fragmentu wiążącego antygen, która jest podawana osobnikowi, przy czym podawana dawka przeciwciała lub jego fragmentu wiążącego antygen mieści się w górnym zakresie dawkowania (tj. od około mg/kg do około 0 mg/kg). Dawkę początkową można podać jako podanie pojedyncze, na przykład pojedynczy wlew, w którym przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen podaje się i.v., lub jako podania wielokrotne, na przykład wielokrotne wlewy, w których przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen jest podawany i.v. pod warunkiem, żeby całkowita dawka początkowa została podana w ciągu okresu około 24- godzinnego. Po podaniu dawki początkowej osobnikowi podaje się jedną lub więcej dodatkowych terapeutycznie efektywnych dawek antagonistycznego przeciwciała przeciwko

72 CD40 lub jego fragmentu wiążącego antygen. Następne terapeutycznie efektywne dawki mogą być podawane na przykład według cotygodniowego schematu dawkowania lub raz na dwa tygodnie, raz na trzy tygodnie lub raz na cztery tygodnie. W takich wykonaniach wynalazku te kolejne terapeutycznie efektywne dawki zwykle mieszczą się w dolnym zakresie dawkowania (tj. od 0,003 mg/kg do około mg/kg). [0118] Alternatywnie, w niektórych wykonaniach wynalazku, następujące po dawce początkowej, kolejne terapeutycznie skuteczne dawki antagonistycznego przeciwciała przeciwko CD40 lub jego fragmentu wiążącego antygen podaje się według schematu podtrzymującego, w którym terapeutycznie skuteczną dawkę przeciwciała przeciwko CD40 lub jego fragmentu wiążącego antygen podaje się raz na miesiąc, raz na 6 tygodni, raz na dwa miesiące, raz na tygodni, raz na trzy miesiące, raz na 14 tygodni, raz na cztery miesiące, raz na 18 tygodni, raz na pięć miesięcy, raz na 22 tygodnie, raz na sześć miesięcy, raz na siedem miesięcy, raz na osiem miesięcy, raz na dziewięć miesięcy, raz na dziesięć miesięcy, raz na jedenaście miesięcy lub raz na dwanaście miesięcy. W takich wykonaniach wynalazku terapeutycznie skuteczne dawki antagonistycznego przeciwciała przeciwko CD40 lub jego fragmentu wiążącego antygen mieszczą się w dolnym zakresie dawkowania (tj. od 0,003 mg/kg do około mg/kg), szczególnie gdy kolejne dawki podaje się w krótszych odstępach, na przykład od jednego razu na dwa tygodnie do jednego razu na miesiąc, lub w górnym zakresie dawkowania (tj. od około mg/kg do około 0 mg/kg), zwłaszcza gdy kolejne dawki podaje się w dłuższych odstępach, na przykład, gdy kolejne dawki podaje się w odstępach od około jednego miesiąca do około 12 miesięcy.

73 7 1 2 [0119] Opisane tutaj, obecne w farmaceutycznych kompozycjach antagonistyczne przeciwciała przeciwko CD40, do stosowania w sposobach tutaj ujawnionych, mogą być natywne lub otrzymane technikami rekombinacji i mogą pochodzić z dowolnego źródła, w tym również od ssaków, takich jak np. mysz, szczur, królik, naczelne, świnia i człowiek. Korzystnie, takie polipeptydy pochodzą ze źródła ludzkiego, korzystniej, są rekombinowanymi ludzkimi białkami z linii komórkowych hybrydoma. [01] Kompozycje farmaceutyczne użyteczne w sposobach ujawnionych tutaj mogą obejmować biologicznie czynne warianty antagonistycznych przeciwciał przeciwko CD40 wynalazku. Takie warianty powinny zachowywać pożądaną aktywność biologiczną natywnego polipeptydu po podaniu osobnikowi, tak, żeby działanie terapeutyczne kompozycji farmaceutycznej, zawierającej wariant polipeptydu, było takie samo, jak kompozycji farmaceutycznej zawierająca natywny polipeptyd. To jest, wariant przeciwciała przeciwko CD40 będzie stanowił składnik farmaceutycznie czynny w kompozycji farmaceutycznej w sposób podobny do obserwowanego w przypadku natywnego przeciwciała antagonistycznego, na przykład.9 lub CHIR-12.12, ulegających ekspresji, odpowiednio, w linii komórkowej hybrydoma.9 lub Ze stanu techniki znane są sposoby określenia, czy wariant przeciwciała CD40 zachowuje pożądaną aktywność biologiczną, a zatem służy jako terapeutycznie aktywny komponent w kompozycji farmaceutycznej. Aktywność biologiczną wariantów przeciwciała można mierzyć z zastosowaniem testów zaprojektowanych specjalnie do mierzenia aktywności natywnego antagonistycznego przeciwciała, w tym testów opisanych tutaj.

74 [0121] W sposobach tutaj ujawnionych można zatem stosować każdą kompozycję farmaceutyczną, zawierającą jako terapeutycznie aktywny składnik antagonistyczne przeciwciało CD40 o opisanych tutaj właściwościach wiązania. Ciekłe, liofilizowane lub wysuszone przez rozpylanie kompozycje zawierające jedno lub więcej antagonistycznych przeciwciał CD40 według wynalazku można zatem wytwarzać jako wodny lub bezwodny roztwór lub zawiesinę, do późniejszego podawania osobnikowi zgodnie z ujawnionymi tu sposobami. Każda z tych kompozycji będzie zawierała co najmniej jedno z antagonistycznych przeciwciał CD40 według niniejszego wynalazku jako składnik aktywny w terapii i profilaktyce. Przez składnik aktywny w terapii i profilaktyce rozumie się przeciwciało przeciwko CD40, swoiście włączone do kompozycji, powodujące pożądaną odpowiedź w terapii lub profilaktyce w odniesieniu do leczenia, profilaktyki lub diagnozowania choroby lub zaburzeń u osobnika, gdy temu osobnikowi podana jest kompozycja farmaceutyczna. Korzystnie kompozycje farmaceutyczne zawierają odpowiednie środki stabilizujące, środki zwiększające objętość lub oba te rodzaje środków, żeby podczas wytwarzania i przechowywania zminimalizować problemy związane z zmniejszeniem stabilności białek i aktywności biologicznej. [0122] Do kompozycji farmaceutycznych zawierających antagonistyczne przeciwciało przeciwko CD40 według wynalazku można dodawać wypełniacze obojętne. Te wypełniacze obojętne mogą obejmować między innymi oleje, polimery, witaminy, węglowodany, aminokwasy, sole, bufory, albuminę, środki powierzchniowo czynne lub środki zwiększające objętość. Korzystnie węglowodany obejmują cukier lub alkohole cukrowe, takie jak mono-, di- lub polisacharydy, lub rozpuszczalne w wodzie glukany.

75 Sacharydy lub glukany mogą obejmować fruktozę, glukozę, mannozę, sorbozę, ksylozę, maltozę, sacharozę, dekstran, pululan, dekstryny, α- i β-cyklodekstrynę, rozpuszczalną skrobię, hydroksyetyloskrobię i karboksymetylocelulozę lub ich mieszaniny. Alkohol cukrowy określany jest jako węglowodór zawierający atomy węgla w liczbie od C 4 do C 8, zawierający grupę hydroksylową; termin ten obejmuje galaktytol, inozytol, mannitol, ksylitol, sorbitol, glicerol i arabitol. Te cukry lub alkohole cukrowe można stosować indywidualnie lub w połączeniu. Stężenie cukru lub alkoholu cukrowego wynosi pomiędzy 1,0% a 7% masa/obj., korzystniej pomiędzy 2,0% a 6,0% masa/obj. Korzystnie aminokwasy obejmują formy lewoskrętne (L) karnityny, argininy i betainy, można jednak dodawać inne aminokwasy. Korzystne polimery obejmują poliwinylopirolidon (PVP) o średniej masie cząsteczkowej pomiędzy 00 a 00, lub glikol polietylenowy (PEG) o średniej masie cząsteczkowej pomiędzy 00 a 000. Środki powierzchniowo czynne, które można dodawać do preparatu, przedstawiono w EP nr nr i [0123] Dodatkowo, przeciwciała można modyfikować chemicznie przez połączenie z polimerem wiązaniem kowalencyjnym, żeby na przykład wydłużyć ich okres półtrwania w krążeniu. Korzystne polimery i sposoby dołączania ich do białek przedstawiono w patentach Stanów Zjednoczonych o numerach 4,766,6, 4,179,337, 4,49,28 i 4,609,46. Korzystnymi polimerami są polietylowane poliole i glikol polietylenowy (PEG). PEG jest rozpuszczalny w wodzie w temperaturze pokojowej, a jego wzór ogólny to R(O--CH 2 --CH 2 ) n O--R, w którym R może być atomem wodoru lub grupą protekcyjną, taką jak grupa alkilowa lub alkanolowa. Korzystnie grupa protekcyjna zawiera pomiędzy 1 a 8 atomów węgla, korzystniej jest to grupa metylowa. Symbol n oznacza

76 dodatnią liczbę całkowitą, korzystnie pomiędzy 1 a 1 000, korzystniej pomiędzy 2 a 00. Korzystna średnia masa cząsteczkowa PEG wynosi pomiędzy a , korzystniej pomiędzy a 000, najkorzystniej pomiędzy a Korzystnie PEG ma co najmniej jedną grupę hydroksylową, korzystniej jest to końcowa grupa hydroksylowa. Korzystnie, ta właśnie grupa hydroksylowa jest aktywowana, żeby wchodziła w reakcję z wolną grupą aminową inhibitora. Jednakże, będzie zrozumiałe, że rodzaj i liczba grup reaktywnych może być różna, żeby osiągnąć połączone wiązaniem kowalencyjnym PEG/przeciwciało według niniejszego wynalazku. [0124] Według niniejszego wynalazku korzystne są również eozpuszczalne w wodzie polioksyetylowane poliole. Obejmują one polioksyetylowany sorbitol, polioksyetylowaną glukozę, polioksyetylowany glicerol (POG) i podobne. Korzystny jest POG. Jednym z powodów jest to, że szkielet glicerolu w polioksyetylowanym glicerolu jest tym samym szkieletem, jaki występuje w naturze, na przykład w zwierzęcych i ludzkich mono-, di- i triglicerydach. Dlatego to rozgałęzienie niekoniecznie jest rozpoznawane w ciele jako czynnik obcy. Korzystnie, masa cząsteczkowa POG mieści się w tym samym zakresie, co PEG. Strukturę POG przedstawiono w Knauf i wsp. (1988) J. Bio. Chem. 263:64-70, a omówienie połączeń znajduje się w patencie Stanów Zjednoczonych nr 4,766,6. [012] Innym systemem podawania leków, wydłużającym czas półtrwania w krążeniu, jest liposom. Sposoby wytwarzania liposomowych systemów podawania omówiono w Gabizon i wsp. (1982) Cancer Research 42:4734, Cafiso (1981) Biochem Biophys Acta 649:129 i Szoka (1980) Ann. Rev. Biophys. Eng. 9:467. Inne systemy podawania leków są znane ze stanu techniki i opisane na przykład w Poznansky i wsp. (1980)

77 Drug Delivery Systems (R.L. Juliano (red.), Oxford, N.Y.) str , Poznansky (1984) Pharm Revs 36:277. [0126] Wypełniacze obojętne, które mają być włączone do kompozycji farmaceutycznej, powinny zapewniać stabilność antagonistycznego przeciwciała przeciwko CD40 lub jego fragmentu wiążącego antygen. Oznacza to, że antagonistyczne przeciwciało przeciwko CD40 lub jego fragment wiążący antygen powinien zachować swoją stabilność fizyczną i chemiczną i wykazywać pożądaną aktywność biologiczną, tj. jedną lub więcej określonych powyżej aktywności antagonistycznych, takich jak między innymi hamowanie wydzielania immunoglobulin przez prawidłowe ludzkie obwodowe komórki B stymulowane przez komórki T, hamowanie przeżywalności i/lub proliferacji prawidłowych ludzkich obwodowych komórek B stymulowanych przez komórki T linii Jurkat, hamowanie przeżywalności i/lub proliferacji prawidłowych ludzkich obwodowych komórek B stymulowanych przez komórki z ekspresją CD40L lub rozpuszczalny ligand CD40 (scd40l), hamowanie przeżywalności poprzez antyapoptotyczne sygnały wewnątrzkomórkowe w każdej komórce stymulowanej przez scd40l lub CD40L fazy stałej, hamowanie transdukcji sygnału CD40 w każdej komórce po ligacji scd40l lub CD40L stałej fazy i hamowanie proliferacji ludzkich nowotworowych komórek B, jak wspomniano w innych miejscach tego opisu. [0127] Sposoby monitorowania stabilności białek są dobrze znane ze stanu techniki. Patrz na przykład Jones (1993) Adv. Drug Delivery Rev. :29-90, Lee, red. (1991) Peptide and Protein Drug Delivery (Marcel Dekker, Inc., New York, New York) i testy stabilności ujawnione poniżej. Ogólnie, stabilność białek mierzy się w wybranej temperaturze przez określony czas. W korzystnym wykonaniu wynalazku, stabilny preparat farmaceutyczny przeciwciała zapewnia stabilność

78 antagonistycznego przeciwciała przeciwko CD40 lub jego fragmentu wiążącego antygen przy przechowywaniu w temperaturze pokojowej (około 2 C) przez co najmniej 1 miesiąc, co najmniej 3 miesiące lub co najmniej 6 miesięcy i/lub jest stabilny w temperaturze około 2-8 C co najmniej 6 miesięcy, co najmniej 9 miesięcy, co najmniej 12 miesięcy, co najmniej 18 miesięcy, co najmniej 24 miesiące. [0128] Uważą się, że białko takie jak przeciwciało, jeśli wytwarza się z niego kompozycję farmaceutyczną, zachowuje swoją stabilność fizyczną w danym punkcie czasowym, jeśli nie wykazuje oznak wizualnych (tj. odbarwienia lub utraty klarowności) ani oznak mierzalnych (określanych na przykład w chromatografii wykluczania (SEC) lub rozpraszaniu promieni nadfioletowych) wytrącania, agregacji i/lub denaturacji w kompozycji farmaceutycznej. W odniesieniu do stabilności chemicznej, uważa się, że białko takie jak przeciwciało, jeśli wytwarza się zeń kompozycję farmaceutyczną, zachowuje swoją stabilność chemiczną w danym punkcie czasowym, jeśli pomiary stabilności chemicznej wskazują, że w tej kompozycji farmaceutycznej białko (tj. przeciwciało) zachowuje będącą przedmiotem zainteresowania aktywność biologiczną. Sposoby monitorowania zmian w stabilności chemicznej są dobrze znane ze stanu techniki i obejmują między innymi sposoby wykrywania form białek zmienionych chemicznie, takich jak białka, które są wynikiem wycinania przy użyciu na przykład SDS-PAGE, SEC i/lub wspomaganej matrycą jonizacji światłem laserowym/spektrometrii mas z analizatorem czasu przelotu oraz rozpadu związanego ze zmianami w ładunku cząsteczki (na przykład związanych z deamidacją), z użyciem na przykład chromatografii jonowymiennej. Patrz na przykład sposoby ujawnione poniżej.

79 [0129] Uważa się, że antagonistyczne przeciwciało przeciwko CD40 lub jego fragment wiążący antygen, jeśli wytwarza się z niego kompozycję farmaceutyczną, zachowuje pożądaną aktywność biologiczną w danym punkcie czasowym, jeśli pożądana aktywność biologiczna w tym czasie wynosi około %, korzystnie % pożądanej aktywności biologicznej wykazywanej w czasie, gdy kompozycja farmaceutyczna była wytwarzana, jak określono w odpowiednim teście pożądanej aktywności biologicznej. Ujawnione tutaj testy pomiaru żądanej aktywności biologicznej antagonistycznych przeciwciał CD40 i ich fragmentów wiążących antygen mogą być wykonane w sposób opisany tutaj w przykładach. Patrz także testy opisane w Schultze i wsp. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:80-84, Denton i wsp. (1998) Pediatr. Transplant. 2:6-1, Evans i wsp. (00) J. Immunol. 164: , Noelle (1998) Agents Actions Suppl. 49:17-22, Lederman i wsp. (1996) Curr. Opin. Hematol. 3:77-86, Coligan i wsp. (1991) Current Protocols in Immunology 13:12, Kwekkeboom i wsp. (1993) Immunology 79: i patenty Stanów Zjednoczonych o numerach i [01] W niektórych wykonaniach wynalazku z antagonistycznego przeciwciała przeciwko CD40, na przykład przeciwciała monoklonalnego CHIR lub CHIR-.9 lub jego fragmentu wiążącego antygen, wytwarza się ciekły preparat farmaceutyczny. Antagonistyczne przeciwciało przeciwko CD40 lub jego fragment wiążący antygen można wytwarzać z zastosowaniem każdego sposobu znanego w dziedzinie, w tym sposobów ujawnionych powyżej. W jednym z wykonań wynalazku antagonistyczne przeciwciało przeciwko CD40, na przykład przeciwciało monoklonalne CHIR lub CHIR-.9 lub jego fragment wiążący antygen, wytwarza się przez rekombinację w komórkach linii CHO.

80 [0131] Po wytworzeniu i oczyszczeniu z antagonistycznego przeciwciała przeciwko CD40 lub jego fragmentu wiążącego antygen można wytwarzać ciekły preparat farmaceutyczny w sposób tutaj przedstawiony. Gdy antagonistyczne przeciwciało przeciwko CD40 lub jego fragment wiążący antygen ma być przechowywany przed wytworzeniem preparatu, można go zamrażać, na przykład w temperaturze - C a następnie, celem dalszego wytwarzania, rozmrażać w temperaturze pokojowej. Ciekły preparat farmaceutyczny zawiera efektywną terapeutycznie ilość antagonistycznego przeciwciała przeciwko CD40 lub jego fragmentu wiążącego antygen. Przy ustalaniu ilości przeciwciała lub jego fragmentu wiążącego antygen obecnego w preparacie bierze się pod uwagę sposób podawania i pożądaną objętość dawki. [0132] W ten sposób ciekła kompozycja farmaceutyczna zawiera antagonistyczne przeciwciało przeciwko CD40, na przykład przeciwciało CHIR lub CHIR-.9 lub jego fragment wiążący antygen, w stężeniu od około 0,1 mg/ml do około 0,0 mg/ml, od około 0, mg/ml do około 40,0 mg/ml, od około 1,0 mg/ml do około,0 mg/ml, od około,0 mg/ml do około 2,0 mg/ml, od około,0 mg/ml do około,0 mg/ml lub od około 1,0 mg/ml do około 2,0 mg/ml. W niektórych wykonaniach ciekła kompozycja farmaceutyczna zawiera antagonistyczne przeciwciało przeciwko CD40 lub jego fragment wiążący antygen w stężeniu od około 0,1 mg/ml do około,0 mg/ml, od około,0 mg/ml do około,0 mg/ml, od około,0 mg/ml do około 1,0 mg/ml, od około 1,0 mg/ml do około,0 mg/ml, od około,0 mg/ml do około 2,0 mg/ml, od około 2,0 mg/ml do około,0 mg/ml, od około,0 mg/ml do około 3,0 mg/ml, od około 3,0 mg/ml do około 40,0 mg/ml, od około 40,0 mg/ml do około 4,0 mg/ml lub od około 4,0 mg/ml do około 0,0 mg/ml. W innych wykonaniach ciekła kompozycja farmaceutyczna zawiera

81 antagonistyczne przeciwciało przeciwko CD40 lub jego fragment wiążący antygen w stężeniu około 1,0 mg/ml, około 16,0 mg/ml, około 17,0 mg/ml, około 18,0 mg/ml, około 19,0 mg/ml, około,0 mg/ml, około 21,0 mg/ml, około 22,0 mg/ml, około 23,0 mg/ml, około 24,0 mg/ml lub około 2,0 mg/ml. Ciekła kompozycja farmaceutyczna zawiera antagonistyczne przeciwciało przeciwko CD40, na przykład przeciwciało CHIR lub CHIR-.9 lub jego fragment wiążący antygen i bufor do doprowadzenia ph preparatu do zakresu ph od około,0 do około 7,0, w tym ph około,0,,1,,2,,3,,4,,,,6,,7,,8,,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0 i inne takie wartości w zakresie ph od około,0 do około 7,0. W niektórych wykonaniach wynalazku bufor utrzymuje ph preparatu w zakresie od około,0 do około 6,, od około,0 do około 6,0 ph, od około,0 do około,, od około, do około 7,0, od około, do około 6, lub od około, do ph około 6,0. [0133] W preparacie można stosować każdy odpowiedni bufor, który utrzymuje ph ciekłego preparatu przeciwciała CD40 w zakresie ph około, do ph około 7, pod warunkiem, jak wspomniano powyżej, zachowania stabilności fizykochemicznej i pożądanej aktywności biologicznej przeciwciała. Odpowiednie bufory obejmują między innymi konwencjonalne kwasy i ich sole, w których przeciwjon może być na przykład jonem sodowym, potasowym, amonowym, wapniowym lub magnezowym. Przykłady konwencjonalnych kwasów i ich soli, które można stosować do zbuforowania ciekłych farmaceutycznych kompozycji, obejmują między innymi bufory: kwas bursztynowy lub bursztynian, kwas cytrynowy lub cytrynian, kwas octowy lub octan, kwas winowy lub winian, kwas fosforowy lub fosforan, kwas glukonowy lub glukonian, kwas glutaminowy lub glutaminian, kwas asparaginowy lub

82 asparaginian, kwas maleinowy lub maleinian i kwas jabłkowy lub jabłczan. Stężenie buforu w preparacie może wynosić od około 1 mm do około 0 mm, w tym około 1 mm, 2 mm, mm, 8 mm, mm, 1 mm, mm, 2 mm, mm, 3 mm, 40 mm, 4 mm, 0 mm lub inne takie wartości w zakresie od około 1 mm do około 0 mm. W niektórych wykonaniach wynalazku stężenie buforu w preparacie wynosi od około mm do około 1 mm, w tym około mm, 6 mm, 7 mm, 8mM, 9 mm, mm, 11 mm, 12 mm, 13 mm, 14 mm, 1 mm lub inne takie wartości w zakresie od około mm do około 1 mm. [0134] W niektórych wykonaniach wynalazku ciekły preparat farmaceutyczny zawiera efektywną terapeutycznie ilość antagonistycznego przeciwciała CD40, na przykład przeciwciało monoklonalne CHIR lub CHIR-.9 lub jego fragment wiążący antygen i bufor bursztynianowy lub bufor cytrynianowy w stężeniu, które utrzymuje ph preparatu w zakresie ph od około,0 do około 7,0, korzystnie od około,0 do około 6,. Przez bufor bursztynianowy lub bufor cytrynianowy rozumie się bufor zawierający, odpowiednio, sól kwasu bursztynowego lub sól kwasu cytrynowego. W korzystnym wykonaniu wynalazku, przeciwjon bursztynianowy lub cytrynianowy jest kationem sodowym, a zatem bufor jest, odpowiednio, bursztynianem sodu lub cytrynianem sodu. Jednakże, oczekuje się, że każdy kation będzie efektywny. Inne możliwe kationy bursztynianu lub cytrynianu obejmują między innymi kationy potasowy, amonowy, wapniowy i magnezowy. Jak wspomniano powyżej, stężenie buforu bursztynianowego lub cytrynianowego preparatu może wynosić od około 1 mm do około 0 mm, obejmując stężenie około 1 mm, 2 mm, mm, 8mM, mm, 1 mm, mm, 2 mm, mm, 3 mm, 40 mm, 4 mm, 0 mm lub inne takie wartości w zakresie od około 1 mm to około 0 mm. W niektórych wykonaniach wynalazku, stężenie buforu preparatu wynosi od około mm

83 8 1 2 do około 1 mm, w tym około mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, mm, 11 mm, 12 mm, 13 mm, 14 mm, lub około 1 mm. W niektórych wykonaniach wynalazku ciekły preparat farmaceutyczny zawiera antagonistyczne przeciwciało CD40, na przykład: przeciwciało monoklonalne CHIR lub CHIR-.9 lub jego fragment wiążący antygen w stężeniu od około 0,1 mg/ml do około 0,0 mg/ml lub od około,0 mg/ml do około 2,0 mg/ml i bufor bursztynianowy lub cytrynianowy, na przykład bufor złożony z bursztynianu sodowego lub cytrynianu sodowego i bufor bursztynianowy lub cytrynianowy, w stężeniu od około 1 mm do około mm, od około mm do około 1 mm, korzystnie około mm. [013] Jeżeli pożądane jest, żeby ciekły preparat farmaceutyczny był prawie izotoniczny, ciekły preparat farmaceutyczny zawierający efektywną terapeutycznie ilość antagonistycznego przeciwciała CD40, na przykład przeciwciała monoklonalnego CHIR lub CHIR-.9 lub jego fragmentu wiążącego antygen oraz bufor, żeby utrzymać ph preparatu w zakresie ph od około,0 do około 7,0, może także zawierać czynnik izotonizujący w ilości wystarczającej do nadania kompozycji niemal całkowitej izotoniczności. Przez niemal całkowitą izotoniczność rozumie się, że osmolarność preparatu wodnego wynosi od około 240 mmol/kg do około 360 mmol/kg, korzystnie, od około 240 do około 340 mmol/kg, korzystniej od około do około 3 mmol/kg, jeszcze korzystniej od 260 do około 3 mmol/kg, jeszcze bardziej korzystnie od około 270 do około 3 mmol/kg. Sposoby określania izotoniczności roztworu są znane specjalistom. Patrz na przykład Setnikar i wsp. (199) J. Am. Pharm. Assoc. 48:628. [0136] Specjaliści są dobrze obeznani z różnorodnymi, farmaceutycznie akceptowalnymi rozpuszczonymi substancjami użytecznymi do zapewnienia izotoniczności w kompozycjach

84 farmaceutycznych. Czynnikiem izotonizującym może być każdy odczynnik, który jest zdolny do doprowadzenia ciśnienia osmotycznego ciekłej kompozycji farmaceutycznej według niniejszego wynalazku do wartości prawie równej wartości w płynach ustrojowych. Pożądane jest stosowanie fizjologicznie akceptowalnego czynnika izotonizującego. Ciekły preparat farmaceutyczny zawierający efektywną terapeutycznie ilość antagonistycznego przeciwciała CD40, na przykład: przeciwciało monoklonalne CHIR lub CHIR-.9 lub jego fragment wiążący antygen i bufor do utrzymania ph preparatu w zakresie od około,0 do około 7,0, może zatem zawierać także składniki, które można stosować do zapewnienia izotoniczności, na przykład chlorek sodu, aminokwasy, takie jak alanina, walina i glicyna, cukry i alkohole cukrowe (poliole), obejmujące między innymi glukozę, dekstrozę, fruktozę, sacharozę, maltozę, mannitol, trehalozę, glicerol, sorbitol i ksolitol, kwas octowy, inne kwasy organiczne lub ich sole i stosunkowo niewielkie ilości cytrynianów lub fosforanów. Specjaliście będą znane dodatkowe czynniki odpowiednie do zachowania optymalnej toniczności ciekłego preparatu. [0137] W niektórych korzystnych wykonaniach wynalazku ciekły preparat farmaceutyczny zawierający efektywną terapeutycznie ilość antagonistycznego przeciwciała CD40, na przykład przeciwciało monoklonalne CHIR lub CHIR-.9 lub jego fragment wiążący antygen i bufor do utrzymania ph preparatu w zakresie około,0 do ph około 7,0, zawiera także, jako środek izotonizujący, chlorek sodu. Stężenie chlorku sodu w preparacie będzie zależało od wpływu innych składników na toniczność roztworu. W pewnych wykonaniach wynalazku stężenie chlorku sodu wynosi od około 0 mm do około 0 mm, od około 0 mm do około mm, od około 0 mm do około 0 mm, od około 0 mm do około 17 mm, od

85 około 0 mm do około mm, od około 7 mm do około 17 mm, od około 7 mm do około mm, od około 0 mm do około 17 mm, od około 0 mm do około 0 mm, od około 0 mm do około mm, od około 12 mm do około 17 mm, od około 12 mm do około mm, od około 1 mm do około 170 mm, od około 1 mm do około 160 mm, od około 13 mm do około 1 mm, od około 140 mm do około 1 mm lub od około 14 mm do około 1 mm. W jednym z takich wykonań wynalazku stężenie chlorku sodu wynosi około mm. W innym takim wykonaniu wynalazku stężenie chlorku sodu wynosi około mm, buforem jest bufor bursztynianu sodu lub cytrynianu sodu o stężeniu od około mm do około 1 mm, ciekły preparat farmaceutyczny zawiera efektywną terapeutycznie ilość antagonistycznego przeciwciała CD40, na przykład przeciwciała monoklonalnego CHIR lub CHIR-.9 lub jego fragmentu wiążącego antygen, a ph preparatu wynosi od około,0 do około 7,0, od około,0 do około 6,0 lub od około, do około 6,. W innych wykonaniach wynalazku ciekły preparat farmaceutyczny zawiera antagonistyczne przeciwciało CD40, na przykład przeciwciało monoklonalne CHIR lub CHIR-.9 lub jego fragment wiążący antygen w stężeniu od około 0,1 mg/ml do około 0,0 mg/ml lub od około,0 mg/ml do około 2,0 mg/ml, około mm chlorku sodu i około mm bursztynianu sodu lub cytrynianu sodu przy ph około,. [0138] Rozpad białka spowodowany zamrażaniem, rozmrażaniem lub straty mechaniczne podczas wytwarzania ciekłego preparatu farmaceutycznego według niniejszego wynalazku można zahamować przez włączenie do preparatu środków powierzchniowo czynnych, w celu zmniejszenia napięcia powierzchniowego w obszarze oddziaływania roztworu z powietrzem. W pewnych wykonaniach wynalazku, ciekły preparat farmaceutyczny zawiera zatem efektywną

86 terapeutycznie ilość antagonistycznego przeciwciała CD40, na przykład przeciwciała monoklonalnego CHIR lub CHIR-.9 lub jego fragmentu wiążącego antygen, bufor do utrzymania ph preparatu w zakresie ph około,0 do ph około 7,0 i dodatkowo zawiera środek powierzchniowo czynny. W innych wykonaniach wynalazku ciekły preparat farmaceutyczny zawiera efektywną terapeutycznie ilość antagonistycznego przeciwciała CD40, na przykład przeciwciała monoklonalnego CHIR lub CHIR-.9 lub jego fragmentu wiążącego antygen, bufor do utrzymania ph preparatu w zakresie ph około,0 do ph około 7,0, czynnik izotonizujacy taki jak chlorek sodu w stężeniu od około 0 mm do około 0 mm i dodatkowo zawiera środek powierzchniowo czynny. [0139] Typowymi środkami powierzchniowo czynnymi są stosowane środki powierzchniowo czynne niejonowe obejmujące polioksyetylenowane estry sorbitolu, takie jak polisorbat 80 (Tween 80) i polisorbat (Tween ), estry polioksypropylenu/polioksyetylenu, takie jak Pluronic F68, alkohole polioksyetylenowe, takie jak Brij 3, symetykon, glikol polietylenowy, taki jak PEG400, lizofosfatydylocholina i polimer glikolu polioksyetylenu i p-t-oktylofenolu, taki jak Triton X-0. Klasyczne metody stabilizacji farmaceutyków przez środki powierzchniowo czynne lub emulgatory opisano na przykład w Levine i wsp. (1991) J. Parenteral Sci. Technol. 4(3): Korzystnym środkiem powierzchniowo czynnym stosowanym według niniejszego wynalazku jest polisorbat 80. Gdy w skład kompozycji wchodzi środek powierzchniowo czynny, zazwyczaj dodaje się go w ilości od około 0,001% do około 1,0% (masa/obj.), od około 0,001% do około 0,%, od około 0,001% do około 0,4%, od około 0,001% do około 0,3%, od około 0,001% do około 0,2%, od około 0,00% do około 0,%, od około 0,00% do około 0,2%, od około 0,01% do około

87 ,%, od około 0,01% do około 0,2%, od około 0,03% do około 0,%, od około 0,03% do około 0,3%, od około 0,0% do około 0,% lub od około 0,0% do około 0,2. [0140] W niektórych wykonaniach wynalazku ciekły preparat farmaceutyczny zawiera zatem terapeutycznie skuteczną ilość antagonistycznego przeciwciała przeciwko CD40, na przykład, przeciwciała monoklonalnego CHIR lub CHIR-.9 lub ich fragmentu wiążącego antygen, buforem jest bufor bursztynianu sodu lub cytrynianu sodu o stężeniu od około 1 mm do około 0 mm, od około mm do około 2 mm lub od około mm do około 1 mm, ph preparatu wynosi od około,0 do około 7,0, od około,0 do około 6,0 lub od około, do około 6, i preparat zawiera r/ środek powierzchniowo czynny, na przykład polisorbat 80, w ilości od około 0,001% do około 1,0% lub od około 0,001% do około 0,%. Takie preparaty mogą opcjonalnie zawierać czynnik izotonizujący, taki jak chlorek sodu, w stężeniu od około 0 mm do około 0 mm, od około 0 mm do około 0 mm lub od około 0 mm do około mm. W innych wykonaniach wynalazku ciekły preparat farmaceutyczny zawiera antagonistyczne przeciwciało przeciwko CD40, na przykład, przeciwciało monoklonalne CHIR lub CHIR-.9 lub jego fragment wiążący antygen, w stężeniu od około 0,1 mg/ml do około 0,0 mg/ml lub od około,0 mg/ml do około 2,0 mg/ml, w tym około,0 mg/ml, od około 0 mm do około 0 mm chlorku sodu, w tym około mm chlorku sodu, bursztynianu sodu lub cytrynianu sodu, od około mm do około mm, w tym około mm bursztynianu sodu lub cytrynianu sodu, chlorku sodu o stężeniu od około 0 mm do około 0 mm, w tym około mm i opcjonalnie środek powierzchniowo czynny, na przykład, polisorbat 80, w ilości od około 0,001% do około 1,0%, w tym od około 0,001% do około 0,%, gdy ph ciekłego preparatu farmaceutycznego wynosi od około

88 90 1 2,0 do około 7,0, od około,0 do około 6,0, od około,0 do około,, od około, do około 6, lub od około, do około 6,0. [0141] Ciekły preparat farmaceutyczny może zasadniczo nie zawierać żadnych wspomnianych powyżej konserwantów ani innych nośników, zaróbek ani środków stabilizujących. Alternatywnie, preparat może zawierać jeden lub więcej konserwantów, na przykład, czynników przeciwbakteryjnych, akceptowalnych farmaceutycznie nośników, zaróbek lub opisanych powyżej środków stabilizujących, pod warunkiem, że nie wpływają one ujemnie na stabilność fizykochemiczną antagonistycznego przeciwciała przeciwko CD40 lub jego fragmentu wiążącego antygen. Przykłady akceptowalnych nośników, zaróbek i środków stabilizujących obejmują między innymi dodatkowe czynniki buforujące, współrozpuszczalniki, środki powierzchniowo czynne, przeciwutleniacze łącznie z kwasem askorbinowym i metioniną, czynniki chelatujące, takie jak EDTA, kompleksy metali (na przykład kompleksy białkowe Zn) i biodegradowalne polimery, takie jak poliestry. Gruntowne omówienie wytwarzania i doboru akceptowalnych farmaceutycznie nośników, środków stabilizujących i związków wpływających na osmotyczność można znaleźć w Remington s Pharmaceutical Sciences (wyd. 18, MackPublishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990). [0142] Po wytworzeniu opisanej tutaj ciekłego preparatu farmaceutycznego lub innej kompozycji farmaceutycznej można ją liofilizować, żeby zapobiec rozpadowi. Sposoby liofilizacji ciekłych kompozycji są znane specjalistom. Tuż przed zastosowaniem, kompozycję można odtworzyć przy użyciu jałowego rozcieńczalnika (takiego jak na przykład roztwór Ringera, woda destylowana lub jałowa sól fizjologiczna), który może zawierać dodatkowe składniki. Korzystnie po

89 91 odtworzeniu kompozycję podaje się osobnikom z zastosowaniem sposobów znanych specjalistom. Stosowanie antagonistycznych przeciwciał przeciwko CD40 przy wytwarzaniu leków 1 2 [0143] Niniejszy wynalazek zapewnia również antagonistyczne przeciwciało przeciwko CD40 lub jego fragment wiążący antygen do wytwarzania leku do leczenia CLL u pacjenta, przy czym lek jest koordynowany z leczeniem co najmniej jedną inną terapią przeciwnowotworową. Przez koordynowany rozumie się, że lek ma być stosowany albo przed co najmniej jedną inną terapią przeciwnowotworową, albo w trakcie tej terapii albo po tej terapii pacjenta,. [0144] Przykłady innych terapii przeciwnowotworowych obejmują między innymi leczenie chirurgiczne, radioterapię, chemioterapię opcjonalnie w połączeniu z autologicznym przeszczepem szpiku kostnego, przy czym odpowiednie czynniki chemioterapeutyczne obejmują między innymi fludarabinę lub fosforan fludarabiny, chlorambucyl, winkrystynę, pentostatynę, 2-chlorodezoksyadenozynę (kladrybinę), cyklofosfamid, doksorubicynę, prednizon i ich kombinacje, na przykład, schematy obejmujące antracyklinę, takie jak CAP (cyklofosfamid, doksorubicyna plus prednizon), CHOP (cyklofosfamid, winkrystyna, prednizon plus doksorubicyna), VAD (winkrystyna, doksorubicyna plus deksametazon), MP (melfalan plus prednizon) i inne środki cytotoksyczne i/lub terapeutyczne stosowane w chemioterapii, takie jak mitoksantron, daunorubicyna, idarubicyna, asparaginaza i antymetabolity, w tym między innymi cytarabinę, metotreksat, -fluorouracyl, dekarbazynę, 6-tioguaniną, 6-merkaptopurynę i nelarabinę oraz inne terapie przeciwnowotworowe przeciwciałem

90 monoklonalnym (na przykład alemtuzumabem (Campath ) lub innym przeciwciałem przeciwko CD2 celującym w glikoproteiny powierzchni komórkowej CD2 na złośliwych komórkach B, rytuksymabem (Rituxan ), całkowicie ludzkim przeciwciałem HuMax-CD, R-194, IMMU-6, TRU-01, AME- 133, tosytumomabem/i-131, tosytumomabem (Bexxar ), ibrytumomabem tiuksetanem (Zevalin ) lub jakimkolwiek innym terapeutycznym przeciwciałem przeciwko CD, skierowanym na antygen CD na złośliwych komórkach B, przeciwciałem przeciwko CD19 (takim jak na przykład MT3, przeciwciało biswoiste), przeciwciałem przeciwko CD22 (takim jak na przykład humanizowane przeciwciało monoklonalne epratuzumab), bewacyzumabem (Avastin ) lub innym przeciwciałem przeciwnowotworowym skierowanym na ludzki naczyniowo-nabłonkowy czynnik wzrostu, przeciwciałem przeciwko CD22 skierowanym na antygen CD22 na złośliwych komórkach B (takim jak na przykład przeciwciało monoklonalne BL-22, toksyna alfa CD22), przeciwciałem α-m- CSF skierowanym na czynnik stymulujący kolonie makrofagów, przeciwciałami skierowanymi na receptor aktywujący czynnik jądrowy kappab (RANK) i jego ligand (RANKL), które wykazują nadekspresję w szpiczaku mnogim, przeciwciałem przeciwko CD23 skierowanym na antygen CD23 na złośliwych komórkach B (na przykład IDEC-12), przeciwciałem przeciwko CD38 skierowanym na antygen CD38 na złośliwych komórkach B, przeciwciałami skierowanymi na receptory głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy II (przeciwciała przeciwko MHC) z ekspresją na złośliwych komórkach B, innymi przeciwciałami CD40 (na przykład SGN-40) skierowanymi na antygen CD40 na złośliwych komórkach B i przeciwciałami skierowanymi na ligand receptora 1 indukującego apoptozę zależną od czynnika martwicy nowotworu (TRAIL-R1) (takimi jak na przykład agonistyczne ludzkie przeciwciało monoklonalne

91 HGS-ETR1), ulegające ekspresji na wielu guzach litych i guzach pochodzących z układu krwiotwórczego, leczenie nowotworów z użyciem drobnych cząsteczek, takich jak między innymi inhibitory, mikrotubule i/lub topoizomerazy (na przykład dolastatyna, inhibitor mitotyczny i analogi dolastatyny, czynniki wiążące tubulinę T900607, XL119 i inhibitor topoizomerazy aminokamptotecyna), SDX- (chlorowodorek bendamustyny), iksabepilon (analog epotylonu, nazywany również BMS-2470), inhibitory kinazy białkowej C, na przykład midostauryna ((PKC-412, CGP 4121, N-benzoilostaurosporyna), piksantron, eloksatyna (środek przeciwnowotworowy), ganit (azotan galu), Thalomid (talidomid), immunomodulacyjne pochodne talidomidu (na przykład rewlimid (poprzednio rewimid)), Affinitak (antysensowny inhibitor białkowej kinazy C-alfa), SDX-1 (R-etodolak, indukujący apoptozę złośliwych limfocytów), analogi nukleozydów purynowych drugiej generacji, takie jak klofarabina, inhibitory wytwarzania przez komórki nowotworowe białka Bcl-2 (na przykład czynniki antysensowne oblimersen i Genasense ), inhibitory proteasomu (na przykład Velcade (bortezomib)), drobnocząsteczkowe inhibitory kinazy (na przykład CHIR-28), drobnocząsteczkowe inhibitory VEGF (na przykład ZD-6474), drobnocząsteczkowe inhibitory białka szoku cieplnego (HSP) 90 (na przykład 17-AAG), drobnocząsteczkowe inhibitory deacetylaz histonowych (na przykład hybrydowo/biegunowe różnicowanie komórkowe (HPC), środki takie, jak suberoiloanilid kwasu hydroksamowego (SAHA) i FR ) i środki apoptotyczne, takie jak Trisenox (trójtlenek arsenu) i Xcytrin (moteksafina gadolinu), terapie przeciwnowotworowe oparte na szczepionce/immunoterapii, w tym między innymi sposoby z wykorzystaniem szczepionek (na przykład Id-KLH, terapia fagami, witaletyna), immunoterapia

92 personalizowana lub aktywna immunoterapia idiotypowa (na przykład MyVax Personalized Immunotherapy, oznaczona formalnie jako GTOP-99), Promune (CpG 7909, syntetyczny agonista dla receptora 9 Toll-podobnego (TLR9)), terapia interferonem alfa, terapia interleukiną 2 (IL-2), terapia IL-12, terapia IL-1 i terapia IL-21, terapia steroidami lub inna terapia przeciwnowotworowa, przy czym leczenie dodatkową terapią przeciwnowotworową lub dodatkowymi terapiami przeciwnowotworowymi ma miejsce przed leczeniem pacjenta lekiem zawierającym antagonistyczne przeciwciało przeciwko CD40 lub jego fragmentem wiążącym antygen, jak opisano powyżej, podczas tego leczenia lub po tym leczeniu. [014] W niektórych wykonaniach przedmiotem niniejszego wynalazku jest zatem przeciwciało monoklonalne CHIR lub CHIR-.9 lub jego fragment wiążący antygen, do wytwarzania leku do leczenia szpiczaka mnogiego u pacjenta, u którego lek jest koordynowany z leczeniem chemioterapią, przy czym czynnik chemioterapeutyczny jest wybrany z grupy, do której należy winkrystyna, doksorubicyna, BCNU, melfalan, cyklofosfamid, adriamycyna i prednizon lub deksametazon. W jednym z takich wykonań wynalazku chemioterapią jest melfalan plus prednizon, w innych wykonaniach wynalazku chemioterapią jest VAD (winkrystyna, doksorubicyna i deksametazon). [0146] W innych wykonaniach przedmiotem niniejszego wynalazku jest przeciwciało monoklonalne CHIR lub CHIR-.9 lub jego fragment wiążący antygen, do wytwarzania leku do leczenia szpiczaka mnogiego u pacjenta, u którego lek jest koordynowany z leczeniem z co najmniej jednym innym przeciwciałem przeciwnowotworowym, wybranym z grupy, do której należy całkowicie ludzkie przeciwciało HuMax- CD, przeciwciało α-m-csf skierowane w czynnik stymulujący kolonie makrofagów, przeciwciała skierowane w aktywator

93 9 1 2 receptora czynnika jądrowego kappab (RANK) i jego ligandu (RANKL), które wykazują nadekspresję w szpiczaku mnogim, przeciwciało przeciwko CD38 skierowane na antygen CD38 na złośliwych komórkach B, przeciwciała skierowane na receptory głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy II (przeciwciała przeciwko MHC) z ekspresją na złośliwych komórkach B, inne przeciwciała przeciwko CD40 (na przykład SGN-40) skierowane na antygen CD40 na złośliwych komórkach B i przeciwciała skierowane na ligand receptora 1 indukującego apoptozę zależną od czynnika martwicy nowotworu (TRAIL-R1) (na przykład agonistyczne ludzkie przeciwciało monoklonalne HGS-ETR1) i TRAIL-R2, ulegający ekspresji na licznych guzach pochodzenia hematopoetycznego i wszelkie ich kombinacje, gdy lek ma być stosowany albo przed inną terapią przeciwnowotworową, albo podczas tej terapii albo po tej terapii, lub w przypadku terapii wielokrotnie skojarzonych, albo przed leczeniem pacjenta innymi terapiami przeciwnowotworowymi, albo podczas tego leczenia, albo po tym leczeniu. [0147] W jeszcze innych wykonaniach niniejszy wynalazek zapewnia przeciwciało monoklonalne CHIR lub CHIR-.9 lub jego fragment wiążący antygen, do stosowania do leczenia szpiczaka mnogiego u pacjenta, u którego lek jest koordynowany z leczeniem co najmniej jedną inną terapią drobnocząsteczkową wybraną z grupy, do której należy Thalomid (talidomid), immunomodulatory pochodnych talidomidu (na przykład rewlimid (poprzednio rewimid), inhibitory proteasomu (na przykład Velcade (bortezomib)), drobnocząsteczkowe inhibitory kinaz (na przykład CHIR-28), drobnocząsteczkowe inhibitory VEGF (na przykład ZD-6474), drobnocząsteczkowe inhibitory białek szoku cieplnego (HSP) 90 (na przykład 17-AAG), drobnocząsteczkowe inhibitory deacetylaz histonów, (na przykład hybrydowo/biegunowe

94 różnicowanie komórkowe (HPC), środki takie, jak suberoiloanilid kwasu hydroksamowego (SAHA) i FR ) i środki apoptotyczne, takie jak Trisenox (trójtlenek arsenu) i jakakolwiek ich kombinacja, przy czym lek ma być stosowany albo przed leczeniem pacjenta inną terapią przeciwnowotworową, albo podczas tego leczenia, albo po tym leczeniu lub w przypadku terapii wielokrotnie skojarzonych albo przed leczeniem pacjenta innymi terapiami przeciwnowotworowymi, albo podczas tego leczenia, albo po tym leczeniu. [0148] Wynalazek zapewnia również antagonistyczne przeciwciało przeciwko CD40, na przykład ujawnione tutaj przeciwciało monoklonalne CHIR lub CHIR-.9 lub ich fragment wiążący antygen, do wytwarzania leku do leczenia pacjenta na szpiczaka mnogiego, przy czym lek jest stosowany u osobnika, który był wstępnie leczony co najmniej jedną inną terapią przeciwnowotworową. Przez wstępnie leczony lub wstępne leczenie rozumie się, że osobnik otrzymał jedną lub więcej innych terapii przeciwnowotworowych (tj. był leczony co najmniej jedną inną terapią przeciwnowotworową) przed otrzymaniem leku zawierającego antagonistyczne przeciwciało przeciw CD40 lub jego fragment wiążący antygen. Wstępnie leczony lub wstępne leczenie obejmuje osobników, którzy byli leczeni co najmniej jedną inną terapią przeciwnowotworową w ciągu 2 lat, w ciągu 18 miesięcy, w ciągu 1 roku, w ciągu 6 miesięcy, w ciągu 2 miesięcy, w ciągu 6 tygodni, w ciągu 1 miesiąca, w ciągu 4 tygodni, w ciągu 3 tygodni, w ciągu 2 tygodni, w ciągu 1 tygodnia, w ciągu 6 dni, w ciągu dni, w ciągu 4 dni, w ciągu 3 dni, w ciągu 2 dni lub nawet w ciągu 1 dnia przed rozpoczęciem leczenia lekiem zawierającym antagonistyczne przeciwciało przeciw CD40, na przykład ujawnione tutaj przeciwciało monoklonalne CHIR-

95 lub CHIR-.9 lub jego fragment wiążący antygen. Nie jest konieczne, żeby osobnik reagował na wstępne leczenie poprzednią terapią przeciwnowotworową lub poprzednimi terapiami przeciwnowotworowymi. Osobnik, który otrzymuje lek zawierający antagonistyczne przeciwciało przeciw CD40 lub jego fragment wiążący antygen, mógł więc odpowiedzieć lub mógł nie odpowiedzieć (tj. nowotwór był oporny) na wstępne leczenie uprzednią terapię przeciwnowotworową lub jedną lub więcej uprzednimi terapiami przeciwnowotworowymi, w których wstępne leczenie zawierało wiele terapii przeciwnowotworowych. Przykłady innych terapii przeciwnowotworowych, które osobnik mógł otrzymywać jako leczenie wstępne przed otrzymywaniem leku zawierającego antagonistyczne przeciwciało przeciw CD40 lub jego fragment wiążący antygen, obejmują między innymi leczenie chirurgiczne, radioterapię, chemioterapię, opcjonalnie w połączeniu z autologicznym przeszczepem szpiku kostnego, przy czym odpowiednie środki chemioterapeutyczne obejmują między innymi środki wymienione powyżej, inne terapie monoklonalnymi przeciwciałami przeciwnowotworowymi, w tym między innymi przeciwciała przeciwnowotworowe wspomniane powyżej, drobnocząsteczkowe terapie przeciwnowotworowe obejmujące między innymi drobne cząsteczki wymienione powyżej, terapie przeciwnowotworowe oparte na szczepionce/immunoterapii, obejmujące między innymi terapie wspomniane powyżej, terapię steroidami, inne terapie przeciwnowotworowe lub ich kombinacje. [0149] Leczenie, w kontekście koordynowanego stosowania opisanego tutaj leku wraz z jedną lub więcej terapiami przeciwnowotworowymi, definiuje się tutaj jako stosowanie lub podawanie leku lub innej terapii przeciwnowotworowej osobnikowi albo stosowanie lub podawanie leku lub innej terapii przeciwnowotworowej do wyizolowanej tkanki lub

96 98 linii komórkowej osobnika, przy czym osobnik cierpi na szpiczaka mnogiego, objaw związany z takim nowotworem lub predyspozycję w kierunku rozwoju takiego nowotworu, a celem jest leczenie, uzdrawianie, łagodzenie, ulżenie, zmienienie, naprawienie, poprawienie, polepszenie lub wpłynięcie na nowotwór, na jakiekolwiek objawy związane z nowotworem lub na predyspozycję w kierunku rozwoju nowotworu. [0] Zaproponowano następujące przykłady jako zobrazowanie, a nie jako ograniczenie. CZEŚĆ DOŚWIADCZALNA 1 2 Wstęp [011] Anatagonistycznymi przeciwciałami przeciwko CD40 stosowanymi w przykładach poniżej są.9 i CHIR Przeciwciała przeciwko CD40.9 i CHIR są ludzkimi przeciwciałami monoklonalnymi (mab) podtypu IgG1, skierowanymi przeciwko CD40, wytwarzanymi przez immunizację myszy transgenicznych posiadających locus łańcucha ciężkiego ludzkiej IgG1 i locus łańcucha lekkiego ludzkiego κ (technika XenoMouse (Abgenix, Fremont, Kalifornia, USA). Jako immunogen stosowano owadzie komórki SF9 z ekspresją zewnątrzkomórkowej domeny CD40. [012] W skrócie, przeprowadzono fuzję komórek śledziony z immunizowanych myszy z mysimi komórkami szpiczaka SP 2/0 lub P 3 x 63Ag8.63 w stosunku :1 1, stosując glikol polietylenowy, jak opisali uprzednio de Boer i wsp. (1988) J. Immunol. Meth. 113:143. Poddane fuzji komórki zawieszano ponownie w kompletnej pożywce uzupełnionej hipoksantyną (0,1 mm), aminopteryną (0,01 mm), tymidyną (0,016 mm), i 0, ng/ml hil-6 (Genzyme, Cambridge, Massachusetts, USA).

97 Następnie poddane fuzji komórki rozdzielano do dołków 96- dołkowych płytek do hodowli tkanek tak, że każdy dołek zawierał przeciętnie 1 rosnącą hybrydomę. [013] Po -14 dniach supernatanty populacji hybrydoma badano przesiewowo pod kątem wytwarzania swoistego przeciwciała. Do badań przesiewowych wytwarzania przez klony hybrydoma swoistego przeciwciała zebrano z każdego dołka supernatanty i badano je najpierw testem ELISA na swoistość działania przeciwko CD40. Supernatantów z wynikiem pozytywnym używano następnie w barwieniu fluorescencyjnym komórek transformowanych EBV komórek B - z zastosowaniem standardowego testu FACS. Pozytywne komórki hybrydoma dwukrotnie klonowano przez ograniczające rozcieńczenie w IMDM/FBS, zawierającym 0, ng/ml hil-6. [014] Łącznie, żeby wytworzyć 89 przeciwciał, które w teście ELISA rozpoznają rekombinowane CD40, przeprowadzono 31 fuzji mysich komórek śledziony z komórkami SP2/0 mysiego szpiczaka. Średnio w przybliżeniu % hybrydom utworzonych przy zstosowaniu techniki Abgenix XenoMouse (Abgenix, Fremont, Kalifornia, USA) może zawierać mysi łańcuch lekki lambda zamiast ludzkiego łańcucha kappa. Wyselekcjonowano przeciwciała zawierające mysi łańcuch lekki lambda. Do dalszej analizy wyselekcjonowano podzbiór 260 przeciwciał, które również wykazały wiązanie z CD40 na powierzchni komórki. Określano dalszą charakterystykę stabilnych komórek hybrydom wyselekcjonowanych w serii procedur subklonowania, w testach wiązania i testach funkcjonalnych. [01] Stwierdzono, że działanie antagonistyczne wykazywały klony z 7 innych linii hybrydoma. Na podstawie względnej siły antagonistycznej i aktywności ADCC do dalszej oceny wybrano dwa klony linii hybrydoma (tabela 1 poniżej). Nazwano je 131.2F8..9 (.9) i 13.8E2.D.D (12.12).

98 0 Tabela 1 Podsumowanie początkowego zestawu danych przeciwciał IgG1.9 i CHIR przeciwko CD Hybrydoma macierzysta Klony hybrydoma Wiązanie na powierzchni komórki Antago nista ADCC CDC CMCC Region V sekwencji DNA 131.2F 131.2F Yes E2 13.8E2D1 0D Yes [016] Mysia linia hybrydoma 131.2F8..9 (CMCC#147) i linia hybrydoma 13.8E2.D.D (CMCC#16) zostały zdeponowane w American Type Culture Collection [ATCC, 801 University Blvd., Manassas, Virginia 1-29 (USA)] pod numerem depozytu patentowego, odpowiednio, PTA-42 i PTA- 43. [017] cdna kodujące regiony zmienne badanych przeciwciał powielono techniką PCR, sklonowano i zsekwencjonowano. Sekwencje aminokwasów łańcucha lekkiego i ciężkiego przeciwciała CHIR przedstawiono, odpowiednio, na Fig. 1A i 1B. Patrz również SEQ ID nr 2 (łańcuch lekki mab CHIR ) i SEQ ID nr 4 (łańcuch ciężki mab CHIR-12.12). Wariant łańcucha ciężkiego mab CHIR przedstawiono na Fig. 1B (patrz również SEQ ID nr ); różni się on od SEQ ID nr 4 podstawieniem reszty seryny resztą alaniny w pozycji 13 SEQ ID nr 4. Sekwencje nukleotydów kodujące łańcuch lekki i łańcuch ciężki przeciwciała CHIR przedstawiono, odpowiednio, na Fig. 2A i 2B. Patrz również SEQ ID nr 1 (sekwencje kodujące łańcucha lekkiego mab CHIR )i SEQ ID nr 3 (sekwencje kodujące łańcucha ciężkiego mab CHIR-12.12). Sekwencje aminokwasów łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego przeciwciała.9 przedstawiono,

99 1 1 2 odpowiednio, na Fig. 3A i 3B. Patrz również SEQ ID nr 6 (łańcuch lekki mab.9) i SEQ ID nr 7 (łańcuch ciężki mab.9). Wariant łańcucha ciężkiego mab.9 przedstawiono na Fig. 3B (patrz również SEQ ID nr 8); różni się on od SEQ ID nr 7 podstawieniem reszty seryny resztą alaniny w pozycji 18 w SEQ ID nr 7. [018] Jak oczekiwano w odniesieniu do przeciwciał pochodzących z niezależnych linii hybrydoma, występuje znaczna zmienność sekwencji nukleotydów w regionach determinujących komplementarność (CDR). Uważa się, że najbardziej znacząco swoistość przeciwciała determinuje różnorodność regionu CDR3 w V H. [019] Jak wykazano za pomocą analizy FACS,.9 i CHIR wiążą się swoiście z ludzkim CD40 i mogą zapobiegać wiązaniu ligandu CD40. Obydwa mab mogą wypierać ligand CD40 związany uprzednio z białkiem CD40 na powierzchni komórki. Powinowactwo wiązania.9 z ludzkim CD40 wynosi 1,2x -8 M, a powinowactwo wiązania CHIR z ludzkim CD40 wynosi x - M. [0160] Przeciwciała monoklonalne CHIR i.9 są silnymi antagonistami i in vitro powodują hamowanie zależnej od ligandu CD40 proliferacji prawidłowych komórek B, jak również hamowanie in vitro zależnej od ligandu CD40 proliferacji komórek nowotworowych u pacjentów z NHL i CLL. In vitro, oba przeciwciała zabijają przez ADCC pierwotne komórki nowotworowe u pacjentów z NHL. Zależną od dawki aktywność przeciwnowotworową zaobserwowano na modelu przeszczepu ksenogenicznego ludzkiego chłoniaka. [0161] Podjęto badania, żeby określić, czy antagonistyczne mab przeciwko CD40.9 i CHIR wykazują następujące właściwości: (1) wiążą się z komórkami pacjentów z szpiczakiem mnogim (co określono, stosując cytometrię przepływową), (2) przyspieszają śmierć komórek u pacjentów

100 2 z komórkami szpiczaka mnogiego, blokując sygnały przeżycia indukowane ligandem CD40, (3) same posiadają jakąś aktywność stymulującą/hamującą w stosunku do komórek szpiczaka mnogiego (MM) i/lub (4) jedną z ich właściwości jest pośredniczenie w ADCC. Przykład 1: Wiązanie mab.9 i CHIR z komórkami szpiczaka mnogiego (MM) CD40+ od pacjentów z MM 1 [0162] mab.9 i CHIR przeciwko CD40 znakowane FITC badano równocześnie z kontrolną ludzką IgG1 znakowaną FITC pod kątem barwienia komórek szpiczaka mnogiego (MM). Otrzymane od 8 pacjentów komórki MM CD40 + inkubowano ze znakowanymi FITC mab.9 i CHIR przeciwko CD40 lub znakowaną FITC ludzką IgG1. Analizy z zastosowaniem cytometrii przepływowej wykonano, stosując FACSCAN V (Becton Dickinson, San Jose, Kalifornia, USA). Przykład 2: mab.9 i CHIR przeciwko CD40 blokują zależne od ligandu CD40 sygnały przeżywalności w komórkach szpiczaka mnogiego (MM) 2 [0163] Otrzymane od 8 pacjentów komórki szpiczaka mnogiego hodowano osobno z antagonistycznym mab.9 lub CHIR przeciwko CD40 i z kontrolną ludzką IgG1, w następujących warunkach: Stężenie przeciwciała Komórki Komórki MM plus utrwalone (µg/ml) MM komórki CHO z ekspresją ligandu CD ,0 (przeciwko CD40) + +,0 (przeciwko CD40) + + 0,0 (przeciwko CD40) + +

101 3 1,0 (kontrolna IgG) + +,0 (kontrolna IgG) + + 0,0 (kontrolna IgG) + + [0164] Po 72 godzinach hodowle analizowano w następujący sposób: Liczenie komórek zdolnych do życia i pomiar komórek martwych barwieniem PI i aneksyną V, Pomiar proliferacji przez eksponowanie komórek na tymidynę znakowaną pulsacyjnie przez noc trytem. Przykład 3 Ocena działania stymulującego/hamującego mab przeciwko CD40 na komórki szpiczaka mnogiego (MM) 1 [016] Komórki szpiczaka mnogiego od 8 pacjentów hodowano w obecności mab CHIR lub.9 przeciwko CD40, stosując IgG jako kontrolę, w następujących warunkach: Stężenie przeciwciała Komórki Komórki MM plus utrwalone (µg/ml) MM komórki CHO z ekspresją ligandu CD ,0 (przeciwko CD40) + -,0 (przeciwko CD40) + - 0,0 (przeciwko CD40) + - 1,0 (kontrolna IgG) + -,0 (kontrolna IgG) + - 0,0 (kontrolna IgG) + - [0166] Po 72 godzinach hodowle analizowano w następujący sposób: Liczenie komórek zdolnych do życia i pomiar komórek martwych barwieniem PI i aneksyną V Pomiar proliferacji przez eksponowanie komórek na tymidynę znakowaną pulsacyjnie przez noc trytem.

102 4 Przykład 4. Zdolność mab CHIR i.9 przeciwko CD40 do lizy pochodzących od pacjenta komórek szpiczaka mnogiego (MM) przez cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał (ADCC) [0167] Komórki szpiczaka mnogiego otrzymane od 8 pacjentów hodowano osobno w obecności antagonistycznego mab CHIR lub.9 przeciwko CD40, stosując IgG jako kontrolę, w następujących warunkach: Stężenie przeciwciała Komórki MM obciążone 1 Cr (µg/ml) lub kalceiną AM z komórkami NK od zdrowego dawcy 0 + 0,1 (przeciwko CD40) + 1,0 (przeciwko CD40) +,0 (przeciwko CD40) + 0,1 (kontrolna IgG) + 1,0 (kontrolna IgG) +,0 (kontrolna IgG) + 0,1 (rytuksymab) + 1,0 (rytuksymab) +,0 (rytuksymab) + 1 [0168] W 4 godzinie obliczano swoistą lizę komórek przez pomiar poziomu uwolnionego 1 Cr lub barwnika fluorescencyjnego. Przykład :.9 i CHIR wiążą się z innym epitopem na CD40 niż na 1B8

103 1 2 [0169] Badane przeciwciała monoklonalne.9 i CHIR współzawodniczą ze sobą w wiązaniu z CD40, ale nie współzawodniczą w wiązaniu z 1B8, mab IgG2 przeciwko CD40 (patrz międzynarodowa publikacja nr WO 02/28904). Badania kompetycyjnego wiązania przeciwciał z użyciem Biacore zaprojektowano, stosując biosensoryczne czipy CM z unieruchomionym przez wiązanie aminowe białkiem A, które stosowano do wychwycenia zarówno przeciwko CD40, CHIR lub 1B8. Przy różnym stężeniu CD40-his obserwowano Prawidłową krzywą wiązania asocjacja/dysocjacja (dane nieprzedstawione). W badaniach kompetycji zarówno CHIR , jak i 1B8 były wychwytywane na powierzchni białka A. Następnie kompleks CD40-his/.9 Fab (0 nm CD40:1 µm.9 Fab), w różnym stężeniu, był przepuszczany przez zmodyfikowaną powierzchnię. W przypadku CHIR nie obserwowano asocjacji kompleksu, co wskazuje, że.9 blokuje wiązanie CHIR z CD40-his. W przypadku 1B8 obserwowano asocjację Fab.9, co wskazuje, że.9 nie blokuje wiazania 1B8 z miejscem wiązania CD40. Wybitnie wzrosła stała dysocjacji kompleksu (dane nieprzedstawione). [0170] Stwierdzono również, że 1B8 i CHIR nie współzawodniczą o wiązanie CD40-his. To doświadczenie zaplanowano następująco: wychwytywanie CHIR na białku A biosensorycznych czipów, blokowanie kontrolnym higg1 miejsc reszt białka A, wiązanie CD40-his, a następnie przepuszczenie 1B8 przez zmodyfikowaną powierzchnię. W tych warunkach 1B8 wiąże się, co wskazuje, że CHIR nie blokuje wiązania się 1B8 z CD40. Przykład 6: Warunki wiązania mab CHIR i.9

104 6 1 [0171] Białko A unieruchomiono na biosensorowych czipach CN wiązaniem aminowym. Ludzkie przeciwciała monoklonalne przeciwko CD40, 1, µg/ml, wychwytywano na zmodyfikowanej biosensorycznej powierzchni przez 1, minuty przy przepływie µl/min. Zrekombinowany rozpuszczalny CD40-his przepuszczano w różnym stężeniu przez powierzchnię biosensoryczną. Przeciwciało i antygen rozcieńczano w 0,01 M HEPES, ph 7,4, 0,1 M NaCl, 3 mm EDTA, 0,00% środka powierzchniowo czynnego P (HBS-EP). Stałe kinetyki i powinowactwa określano, stosując oprogramowanie Biaevaluation z modelem oddziaływania 1:1 oraz z dopasowaniem globalnym. [0172] Jak poniżej przedstawiono w tabeli 2, stwierdza się 121-krotną różnicę w stałej dysocjacji.9 i CHIR-12.12, powodującą 24-krotnie wyższe powinowactwo dla CHIR Przeciwciało Ka (M-1 (sek-1)) kd (sek-1) KD(nM).9 przeciwko CD40 (12.3±0,64)x (1,0±1,3)x -3 12,1±0,3 CHIR przeciwko CD40 (2.41±0,13)x (1,24±0,06)x -4 0,1±0,02 2 Przykład 7: Charakterystyka epitopu dla przeciwciał monoklonalnych CHIR i.9 [0173] Żeby określić lokalizację na CD40 epitopu rozpoznawanego przez przeciwciała monoklonalne CHIR i.9, wykonano analizy z użyciem SDS-PAGE i Western Blot. Oczyszczone CD40 (0, µg) rozdzielano na 4-12% żelu NUPAGE w warunkach zredukowanych i niezredukowanych, przenoszono na błony PVDF i hybrydyzowano z przeciwciałami monoklonalnymi o stężeniu µg/ml. Membrany hybrydyzowano z fosfatazą alkaliczną związaną z przeciwludzką IgG i wizualizowano, stosując stabilizowany Western Blue R substrat dla fosfatazy alkalicznej (Promega).

105 7 [0174] Wyniki wskazują, że przeciwciało monoklonalne CHIR przeciwko CD40, rozpoznaje epitopy zarówno w formie niezredukowanej, jak i zredukowanej CD40, w przypadku formy niezredukowanej CD40 wykazując większą intensywność niż w formie zredukowanej CD40 (tabela 3, prążki nieprzedstawione). Fakt pozytywnego rozpoznania obu form CD40 wskazuje, że to przeciwciało wchodzi w interakcję z epitopem konformacyjnym, którego część ma sekwencję liniową. Przeciwciało monoklonalne.9 rozpoznaje głównie niezredukowaną formę CD40, co sugeruje, że to przeciwciało wchodzi w interakcję z epitopem głównie konformacyjnym (tabela 3, prążki nieprzedstawione). 1 Tabela 3. Identyfikacja domen Domena 1 Domena 2 Domena 3 Domena 4 mab CHIR mab mab 1B [017] Żeby zmapować antygenowy region na CD40, sklonowano cztery zewnątrzkomórkowe domeny CD40 i doprowadzono do ich ekspresji w komórkach owadów jako białka fuzyjne GST. Zapewniono wydzielanie czterech domen sygnałem wydzielania GP67. Analizowano supernatant komórek owadów, stosując analizy SDS-PAGE i Western blot, żeby zidentyfikować domenę zawierającą epitop. [0176] Przeciwciało monoklonalne CHIR rozpoznaje epitop w domenie 2 w warunkach zredukowanych i niezredukowanych (tabela 4, błony nieprzedstawione). Przeciwnie, przeciwciało monoklonalne.9 bardzo słabo rozpoznaje domenę 2 (tabela 4, błony nieprzedstawione)

106 8 W tej analizie żadne z tych przeciwciał nie rozpoznaje domen 1, 3 ani 4. Tabela 4 Analiza domeny 2 Warunki zredukowane Warunki niezredukowane mab CHIR mab [0177] Żeby dokładniej określić epitop rozpoznawany przez mab CHIR-12.12, białka syntetyzowano z zewnątrzkomórkowej domeny 2 CD40, która odpowiada sekwencji PCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICT (reszty 61-4 sekwencji przedstawionej w SEQ ID nr lub SEQ ID nr 12), wytwarzano membrany SPOTs (Sigma), zawierające trzydzieści pięć -merowych peptydów z przesunięciem o 1 aminokwas. Wykonano analizę Western blot z mab CHIR i jako przeciwciała drugorzędowego użyto przeciwludzkiej IgG betagalaktozydazy. Błonę odpłukiwano i, żeby określić region rozpoznawany przez przeciwciało, powtórnie hybrydyzowano z mab.9. [0178] Analiza hybrydyzacji SPOTs z przeciwciałem monoklonalnym CHIR przy przepływie µg/ml wykazała pozytywną reakcję z plamami Region sekwencji objęty tymi peptydami przedstawiono w tabeli. 2 Tabela. Wyniki analizy hybrydyzacji SPOT z przeciwciałem monoklonalnym CHIR przeciwko CD40 Numer Region sekwencji SPOT 18 HQHKYCDPNL (reszty SEQ ID nr lub 12)

107 9 19 QHKYCDPNLG (reszty SEQ ID nr lub 12) HKYCDPNLGL (reszty SEQ ID nr lub 12) 21 KYCDPNLGLR (reszty SEQ ID nr lub 12) 22 YCDPNLGLRV (reszty SEQID NO: lub 12) [0179] Wyniki te odpowiadają liniowemu epitopowi: YCDPNL (reszty sekwencji przedstawionej w SEQ ID nr lub SEQ ID nr 12). Epitop ten zawiera Y82, D84 i N86, co do których przewidziano, że będą włączone w interakcję CD40 z ligandem CD40. [0180] Przedstawiona w tabeli 6 analiza SPOTs z mab.9 wykazała słabe rozpoznawanie peptydów reprezentowanych przez plamy -22, co sugeruje zaangażowanie regionu YCDPNLGL (reszty sekwencji przedstawionej w SEQ ID nr lub SEQ ID nr 12) w jego wiązaniu do CD40. Należy zaznaczyć, że mab CHIR i.9 współzawodniczą ze sobą w wiązaniu się do CD40 w analizie BIACORE. 1 Tabela 6. Wyniki analizy hybrydyzacji SPOT z przeciwciałem monoklonalnym CHIR-.9 przeciwko CD40 Numer SPOT Obszar sekwencji HKYCDPNLGL (reszty SEQ ID nr lub 12) 21 KYCDPNLGLR (reszty SEQ ID nr lub 12) 22 YCDPNLGLRV(reszty SEQ ID NO: lub 12) [0181] Epitopy liniowe zidentyfikowane analizą SPOTs znajdują się w module B1 CD40. Sekwencja modułu B1 Cd40 jest następująca:

108 1 HKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTIC (reszty 80-3 SEQ ID Nr: lub 12). [0182] Jako liniowy epitop dla CHIR zidentyfikowano C83. Wiadomo, że ta reszta cysteiny tworzy mostek dwusiarczkowy z C3. Jest prawdopodobne, że epitop konformacyjny mab CHIR posiada ten mostek dwusiarczkowy (C83-C3) i/lub otaczające aminokwasy konformacyjnie zbliżone do C Przykład 8: CHIR blokuje zależną od CD40L przeżywalność i drogi przekazywania sygnałów w prawidłowych ludzkich komórkach B [0183] Rozpuszczalny ligand CD40 (CD40L) aktywuje komórki B i indukuje różne aspekty odpowiedzi funkcjonalnej, w tym zwiększenie przeżywalności i proliferacji oraz aktywację dróg przekazywania sygnałów NFκB, ERK/MAPK, PI3K/Akt i p38. Dodatkowo, zależna od CD40L stymulacja CD40 dostarcza sygnałów przeżycia przez redukcję ilości rozszczepionego PARP i indukcję zależnych od CD40 białek antyapoptotycznych XIAP i Mcl-1 w prawidłowych komórkach B. Stymulacja CD40 zależna od CD40L pozyskuje również TRAF2 i TRAF3, żeby związać cytoplazmatyczną domenę CD40. [0184] Dalsze badania wykazują, że CHIR bezpośrednio hamował wszystkie te skutki na prawidłowych ludzkich komórkach B. Leczenie CHIR powoduje na przykład zwiększenie rozpadu kaspazy 9, kaspazy 3 i PARP, jak również redukcję XIAP i Mcl-1 w sposób zależny od czasu i dawki, przywracając apoptozę komórek B. Leczenie CHIR hamowało również fosforylację kinazy IκB (IKK) α i β (droga NFκB), ERK, Akt i p38 w odpowiedzi na stymulację CD40 zależną od CD40l. Następnie stwierdzono, że CHIR nie powoduje tych apopoptycznych skutków bez początkowej, zależnej od CD40L, stymulacji CD40.

109 111 CHIR hamowało przeżycie zależne od ligandu CD40 poprzez indukcję rozszczepienia PARP. 1 2 [018] W tych doświadczeniach, 0,6x 6 prawidłowych ludzkich komórek B pochodzących od zdrowych dawców (odsetek czystości pomiędzy 8-9%) stymulowano 1 µg/ml scd40l (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, Wielka Brytania). Następnie dodawano CHIR ( µg/ml) i kontrolną IgG. Komórki zbierano w punkcie 0, minucie, 2 godzinie, 6 godzinie, 18 godzinie i 26 godzinie. Rozszczepioną kaspazę 9, rozszczepioną kaspazę 3, rozszczepione PARP i kontrolną β-aktyny wykrywano w lizatach komórkowych analizą Western blot. [0186] W skrócie, obserwowano, że stymulacja CD40 zależna od CD40L dostarczała sygnały przeżycia, ponieważ nie dawała w wyniku zwiększenia ilości rozszczepionej kaspazy 9, rozszczepionej kaspazy 3 ani rozszczepionego PARP, co wskazuje, że komórki nie weszły na drogę apoptozy. Natomiast traktowanie CHIR daje w wyniku wzrost tych produktów rozpadu, co wskazuje, że traktowanie CHIR znosi działanie wiązania CD40L na przekazywanie sygnałów przeżycia w stymulowanych scd40l prawidłowych komórkach B, przywracając apoptozę komórek B (dane nieprzedstawione). Hamowanie przez CHIR ekspresji antyapoptotycznych białek przeżycia [0187] W tych doświadczeniach, 0,6x 6 prawidłowych ludzkich komórek B pochodzących od zdrowych dawców (odsetek czystości pomiędzy 8-9%) stymulowano 1 µg/ml scd40l (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, Wielka Brytania). Następnie dodawano CHIR ( µg/ml) i kontrolną IgG.

110 112 Komórki zbierano w punkcie 0, minucie, 2 godzinie, 6 godzinie, 18 godzinie i 26 godzinie. Mcl-1, XIAP, CD40, i kontrolne β-aktyny wykrywano w lizatach komórkowych analizą Western blot. W skrócie, stymulacja scd40l dawała w rezultacie nieprzerwaną ekspresję Mcl-1 i XIAP w czasie. Natomiast traktowanie CHIR komórek stymulowanych scd40l daje w rezultacie zmniejszenie ekspresji tych białek w czasie (dane nieprzedstawione). Ponieważ Mcl-1 i XIAP są sygnałami przeżycia. zdolnymi do blokowania drogi apoptozy, wyniki te wykazują, że traktowanie CHIR usuwa blokadę przeciwko apoptozie w prawidłowych, stymulowanych scd40l komórkach B. 1 Traktowanie CHIR hamowało fosforylację IKKα (Ser180) i IKKβ (Ser 181) w prawidłowych komórkach B 2 [0188] W tych doświadczeniach, 1,0x 6 prawidłowych ludzkich komórek B pochodzących od zdrowych dawców (odsetek czystości pomiędzy 8-9%) stymulowano 1 µg/ml scd40l (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, Wielka Brytania). Następnie dodawano CHIR ( µg/ml) i kontrolną IgG. Komórki zbierano w punkcie 0 i minucie. Fosforylowane IKKα (Ser180) i IKKβ (Ser 181) oraz całkowity kontrolny IKKβ wykrywano w lizatach komórek analizą Western blot. [0189] W skrócie, stymulacja scd40l daje w rezultacie fosforylację IKKα (Ser180) i IKKβ (Ser 181) w czasie. Natomiast traktowanie CHIR znosiło tę odpowiedź na stymulację scd40l w prawidłowych komórkach B (dane nieprzedstawione). Traktowanie CHIR hamowało przeżywalność zależną od ligandu CD40 w sposób zależny od dawki

111 113 1 [0190] W tych doświadczeniach, 0,6x 6 prawidłowych ludzkich komórek B pochodzących od zdrowych dawców (odsetek czystości pomiędzy 8-9%) stymulowano 1 µg/ml scd40l (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, Wielka Brytania). Następnie dodawano CHIR (0,01, 0,1, 0,2, 0,, 1,0 µg/ml) i kontrolną IgG. Komórki zbierano w 24 godzinie. Rozszczepione PARP i kontrolne β-aktyny wykrywano w lizacie analizą Western blot. [0191] W skrócie, traktowanie CHIR dawało w rezultacie zwiększenie rozszczepiania PARP w komórkach stymulowanych scd40l, w sposób zależny od dawki, a zatem znosiło drogę przekazywania sygnałów przeżywacia w stymulowanych scd40l prawidłowych komórkach B (dane nieprzedstawione). CHIR hamowało ekspresję antyapoptotycznych białek przeżywalności w sposób zależny od dawki 2 [0192] W tych doświadczeniach, 0,6x 6 prawidłowych ludzkich komórek B pochodzących od zdrowych dawców (odsetek czystości pomiędzy 8-9%) stymulowano 1 µg/ml scd40l (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, Wielka Brytania). Następnie dodawano CHIR (0,, 2 i µg/ml) i kontrolną IgG. Komórki zbierano w 22 godzinie. Mcl-1, XIAP, rozszczepione PARP i kontrolne β-aktyny wykrywano w lizacie komórkowym analizą Western blot. [0193] W skrócie, traktowanie CHIR zmniejszało ekspresję Mcl-1 i XIAP i zwiększało ekspresję rozszczepionego PARP w komórkach stymulowanych scd40l w sposób zależny od dawki i w ten sposób likwidowało te blokady drogi apoptozy w stymulowanych scd40l prawidłowych komórkach B (dane nieprzedstawione).

112 114 W nieobecności przekazywania sygnałów przez rozpuszczalne CD40L CHIR nie wpływa na ekspresję białek antyapoptotycznych, rozszczepionego PARP i XIAP 1 [0194] W tych doświadczeniach 1,0x 6 prawidłowych, ludzkich komórek B od zdrowych dawców (o odsetku czystości pomiędzy 8-9%) potraktowano jedynie CHIR ( µg/ml) i kontrolną IgG (tj. komórki nie były wstępnie stymulowane scd40l przed dodaniem przeciwciała). Komórki zbierano po 0, 4, 14 i 16 godzinach. XIAP, rozszczepione PARP i kontrolne β-aktyny wykryto w lizatach komórek analizą Western blot. [019] W skrócie, wyniki wykazują, że bez stymulacji scd40l, komórki wykazywały ekspresję zwiększonego stężenia rozszczepionego PARP, natomiast ekspresja XIAP pozostała stała zarówno w komórkach kontrolnych traktowanych IgG, jak i w komórkach CHIR (dane nieprzedstawione). Dane te wykazują, że CHIR-12.12, bez stymulacji CD40L, nie wyzwala apoptozy w prawidłowych ludzkich komórkach B. CHIR hamuje fosforylację IKKα (Ser180) i IKKβ (Ser181), Akt, ERK i p38 w prawidłowych komórkach B 2 [0196] W tych doświadczeniach 1,0x 6 prawidłowych, ludzkich komórek B od zdrowych dawców (o odsetku czystości pomiędzy 8-9%) umieszczano w pożywce bez surowicy, zawierającej 1% FBS, i stymulowano 1 µg/ml scd40l (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, Wielka Brytania). Hodowle traktowano CHIR (1 i µg/ml) i kontrolną IgG. Komórki zbierano w 0 i minucie. Fosfo-IKKα, fosfo-ikkβ, IKKβ całkowite, fosfo-erk, ERK całkowite, fosfo-akt, Akt całkowite, fosfo-p38 i p38 całkowite wykrywano w lizatach komórkowych analizą Western blot.

113 11 [0197] W skrócie, stymulacja scd40l powoduje wzrost fosforylacji IKKα/β, fosforylacji ERK, fosforylacji Akt i fosforylacji p38, prowadząc zatem do przeżycia i/lub proliferacji komórek. Traktowanie komórek CHIR znosi wpływ stymulacji scd40l na te drogi przekazywania sygnału w prawidłowych komórkach B (dane nieprzedstawione). CHIR hamuje drogi wielokrotnego przekazywania sygnału, takie jak PI3K i MEK/ERK, w kaskadzie sygnalizacyjnej CD [0198] W tych doświadczeniach 1,0x 6 prawidłowych, ludzkich komórek B od zdrowych dawców (o odsetku czystości pomiędzy 8-9%) umieszczano w pożywce bez surowicy, zawierającej 1% FBS, i stymulowano 1 µg/ml scd40l (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, Wielka Brytania). Hodowle traktowano również CHIR (1 i µg/ml), wortmaniną (inhibitor PI3K/Akt, 1 i µm), LY (inhibitor PI3K/Akt, i µm) i PD 9809 (inhibitor MEK, i µg/ml). Komórki zebrano w 0 i minucie. Fosfo-ERK, fosfo- Akt, Akt całkowite, fosfo-ikkα/β i p38 całkowite wykryto w lizatach komórki analizą Western blot. [0199] W skrócie, wyniki wykazują, że CHIR znosiło fosforylację wszystkich tych przekazujących sygnał cząsteczek, natomiast inhibitory przekazywania sygnału wykazały jedynie swoiste znoszenie przekazywania sygnału, co wskazuje, że CHIR prawdopodobnie powoduje hamowanie w górę od tych cząsteczek przekazujących sygnał za pośrednictwem stymulacji CD40L (dane nieprzedstawione). CHIR hamuje wiązanie przekazujących sygnał cząsteczek TRAF2 i TRAF3 z cytoplazmatyczną domeną CD40 w prawidłowych komórkach B

114 [00] W tych doświadczeniach 4,0x 6 prawidłowych, ludzkich komórek B od zdrowych dawców (o odsetku czystości pomiędzy 8-9%) umieszczano na cztery godziny w pożywce bez surowicy, zawierającej 1% FBS, i stymulowano przez minut 1 µg/ml scd40l (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, Wielka Brytania). Komórki zbierano w 0 i minucie. CD40 wytrącono za pomocą przeciwciał z zastosowaniem poliklonalnego przeciwciała przeciwko CD40 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), i hybrydyzowano w analizie Western blot z mab przeciwko TRAF2 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), mab przeciwko TRAF3 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) i mab przeciwko CD40 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). [01] W skrócie, wyniki wykazują, że TRAF2 i TRAF3 po stymulacji scd40l uległy koprecypitacji CD40. Przeciwnie, traktowanie CHIR znosiło tworzenie kompleksu przekazującego sygnał CD40-TRAF2/3 w stymulowanych scd40l prawidłowych komórkach B. Nie było zmian w ekspresji CD40 (dane nieprzedstawione). [02] Bez wiązania się teorią, wyniki tych doświadczeń i wyniki przedstawionych powyżej przykładów wykazują, że przeciwciało CHIR jest antagonistycznym przeciwciałem monoklonalnym przeciwko CD40 o podwójnym działaniu i unikalnej kombinacji właściwości. To w pełni ludzkie przeciwciało monoklonalne blokuje zależne od CD40L drogi przekazywania sygnałów CD40 przeżycia i proliferacji komórek B; ten antagonizm prowadzi do ostatecznej śmierci komórki. CHIR pośredniczy również w rozpoznawaniu i wiązaniu przez komórki efektorowe, inicjując zależną od przeciwciał komórkową cytotoksyczność (ADCC). Gdy tylko CHIR wiąże się z komórkami efektorowymi, uwalniane są enzymy cytolityczne, co prowadzi do apoptozy i lizy komórek

115 117 B. CHIR jest silniejszym przeciwciałem przeciwnowotworowym niż rytuksymab, gdy porównuje się je w przedklinicznych modelach nowotworów. Przykład 9: Przeciwnowotworowa aktywność CHIR w zwierzęcych modelach szpiczaka mnogiego [03] Po dootrzewnowym (i.p.) podaniu raz w tygodniu, łącznie trzech dawek, CHIR znacząco hamuje wzrost w agresywnym stopniu zaawansowania i nieokreślonym stadium szpiczaka mnogiego w sposób zależny od dawki. Skuteczność może być jeszcze bardziej ulepszona przez połączenie leczenia przeciwciałem z leczeniem bortezomibem (VELCADE ). 1 Modele ksenoprzeszczepu szpiczaka mnogiego IM-9 2 [04] Myszy SCID zaszczepiono podskórnie komórkami nowotworowymi IM-9 (ludzka linia komórek szpiczaka mnogiego z ekspresją zarówno CD40, jak i CD) w 0% MATRIGEL, w ilości x 6 komórek na mysz. W modelach z nieokreślonym stadium leczenie inicjowano jeden dzień po wszczepieniu nowotworu. W modelach z określonym stadium leczenie rozpoczynano, gdy objętość nowotworu osiągała -0 mm 3. Myszy-nosicielki nowotworu zaszczepiano dootrzewnowo raz w tygodniu wskazanymi dawkami mab przeciwko CD40. Dane analizowano z zastosowaniem logarytmicznego testu rang. [0] W warunkowym modelu przeżywalności, w nieokreślonym stadium, CHIR znacząco przedłużało przeżywalność myszy-nosicielek nowotworu, w sposób zależny od dawki, z przeżywalnością w 6 dniu, odpowiednio, 60% w grupie leczonej 0,1 mg/kg CHIR i 80% w grupach leczonych 1 i mg/kg CHIR-12.12, (odpowiednio p<0,01 i p<0,001) (dane nieprzedstawione). Wszystkie zwierzęta w grupach

116 kontrolnych IgG1 i leczonych bortezomibem uśmiercano pomiędzy 18 i 26 dniem, z powodu chorób powiązanych z rozwojem nowotworu. [06] W modelu z określonym stadium i z podawaniem podskórnym, CHIR podawane raz w tygodniu w dawkach 0,1, 1 i mg/kg znacząco hamowało wzrost guza, z redukcją objętości guza, odpowiednio, 17% (p>0,0, dane nieprzedstawione), 34% (p<0,01, Fig. A) i 44% (p<0,001, dane nieprzedstawione). Gdy testowano bortezomib, w dawkach 0, mg/kg dwa razy w tygodniu nie hamował on wzrostu guza (dane nieprzedstawione). Przy maksymalnej tolerowanej dawce (MTD) wynoszącej 1 mg/kg dwa razy na tydzień, jak ukazano na Fig. A, bortezomib hamował wzrost guza o % (p<0,01). Jednakże, gdy CHIR podawano raz na tydzień (1 mg/kg) w połączeniu z maksymalną tolerowaną dawką bortezomibu, obserwowano redukcję objętości guza o ponad 0% (p<0,001). [07] W podsumowaniu można stwierdzić, że mab CHIR przeciwko CD40 znacząco hamował wzrost guza w doświadczalnych modelach szpiczaka mnogiego. Ponadto leczenie skojarzone CHIR z bortezomibem jeszcze bardziej zwiększa skuteczność w porównaniu z jakimkolwiek leczeniem lekiem pojedynczym. Te dane sugerują, że mab CHIR przeciwko CD40 wykazuje silną aktywność przeciwnowotworową i może być klinicznie efektywne w leczeniu szpiczaka mnogiego, zarówno samo, jak i w skojarzeniu z innymi środkami chemioterapeutycznymi. Przykład : Badania kliniczne.9 i CHIR Cele kliniczne [08] Celem ogólnym jest zapewnienie skutecznego leczenia szpiczaka mnogiego przez ukierunkowanie działań IgG1

117 119 przeciwko CD40 na komórki nowotworu. Sygnał dla tej choroby określa się w II fazie, chociaż pewne wskaźniki aktywności można otrzymać w fazie I. Początkowo środek bada się w monoterapii, lecz w miarę dalszego rozwoju leku będzie on kojarzony z innymi środkami, chemioterapeutykami i radioterapią. Faza I 1 2 [09] Ocena bezpieczeństwa i farmakokinetyki zwiększanie dawki u pacjentów ze szpiczakiem mnogim. Wybranie dawki na podstawie bezpieczeństwa, tolerancji i zmiany poziomu markerów CD40 w surowicy. Ogólnie, poszukiwana jest MTD, ale do znajdowania dawki adekwatne mogą być inne wskaźniki skuteczności (zmniejszenie liczby komórek szpiczaka mnogiego z CD40+ itd.). Rozważenie więcej niż jednej dawki, ponieważ pewne badania dotyczące ustalania dawki mogą być niezbędne w fazie II Podawanie pacjentom dawek co tydzień z jednoczesnym pobieraniem próbek do oceny farmakokinetyki (PK). [02] Początkowo dopuszczalnym maksymalnym okresem dawkowania jest cykl 4-tygodniowy. PK może być wysoce zmienna zależnie od stanu chorobowego, gęstości CD40 itd. Do tego badania klinicznego (badań klinicznych) kwalifikują się pacjenci ze szpiczakiem mnogim. Decyzja o przerwaniu lub kontynuowaniu badań podejmowana jest na podstawie bezpieczeństwa, dawki i wstępnych dowodów aktywności przeciwnowotworowej. Aktywność leku, określana przez stopień odpowiedzi, określana jest w fazie II. Ustalenie dawki(ek) do stosowania w fazie II.

118 1 Faza II 1 [0211] U pacjentów ze szpiczakiem mnogim zainicjowane zostanie kilka badań klinicznych. Można oceniać więcej niż jedną dawkę i więcej niż jeden schemat leczenia w warunkach randomizowanych badań klinicznych fazy II. Populacją docelową jest populacja chorych ze szpiczakiem mnogim, u których zawiodły obecne standardy leczenia (niepowodzenie chemioterapii). ν Decyzja o przerwaniu lub kontynuowaniu badania podejmowana jest na podstawie udowodnienia koncepcji terapeutycznej w fazie II ν Określenie, czy jako wczesny wskaźnik skuteczności klinicznej może być stosowany marker zastępczy ν Identyfikacja dawek do stosowania w fazie III Faza III 2 [0212] Faza III będzie zależeć od tego, gdzie zostanie wykryty sygnał w fazie II i które z dostępnych terapii uważane są za standardowe. Jeśli sygnał umiejscowiony jest w takim stadium choroby, dla którego nie ma terapii standardowej, wtedy jako badanie kluczowe może posłużyć badanie z jedną grupą terapeutyczną, z prawidłowo dobraną grupą kontrolną. Jeśli istnieją środki konkurencyjne, które uważane są za standardowe, przeprowadza się bezpośrednie badania porównawcze. Przykład 11: Ciekły preparat farmaceutyczny antagonistycznych przeciwciał przeciwko CD40

119 121 1 [0213] Celem tego badania było zbadanie wpływu ph roztworu na stabilność antagonistycznego przeciwciała przeciwko CD40 CHIR sposobami biofizycznymi i biochemicznymi w celu wybrania dla tego przeciwciała optymalnego środowiska roztworu. Wyniki skaningowej kalorymetrii różnicowej (DSC) wykazały, że stabilność konformacji CHIR jest optymalna w preparatach o ph,-6,. Na podstawie kombinacji analiz SDS-PAGE, HPLC wykluczającej pod względem wielkości (SEC-HPLC) i HPLC jonowymiennej (CEX-HPLC), stwierdzono, że stabilność fizykochemiczna CHIR jest optymalna przy ph około,0-,. W świetle tych wyników, zalecanym ciekłym preparatem farmaceutycznym zawierającym to przeciwciało jest preparat o ph około,, zawierający CHIR w ilości około mg/ml w około mm bursztynianu sodu, z około mm chlorku sodu. Materiały i metody 2 [0214] Przeciwciało CHIR stosowane w badaniach preparatu jest ludzkim przeciwciałem monoklonalnym wytworzonym w procedurze hodowli komórek linii CHO. Masa cząsteczkowa tego mab wynosi kda; składa się ono z dwóch łańcuchów lekkich i dwóch łańcuchów ciężkich połączonych razem mostkiem dwusiarczkowym. Jest ono celowane przeciwko powierzchniowemu komórkowemu receptorowi CD40 na komórkach z ekspresją CD40, w tym na prawidłowych i nowotworowych komórkach B, w leczeniu różnych chorób nowotworowych oraz chorób autoimmunologicznych/zapalnych. [021] Substancją lecznicą przeciwko CD40 stosowaną w tym badaniu była duża ilość oczyszczonego, pochodzącego z linii CHO przeciwciała przeciwko CD40 (CHIR-12.12). Skład substancji leczniczej był następujący: 9,7 mg/ml przeciwciała CHIR w mm cytrynianu sodu i ml

120 122 chlorku sodu, o ph 6,. Próbką kontrolną w badaniu była otrzymana substancja lecznicza, zamrażana następnie w temperaturze -60 C, rozmrażana w temperaturze pokojowej i badana razem z próbkami stabilności we wstępnie określonych punktach czasowych. Próbki stabilności wytwarzano metodą dializy substancji leczniczej z użyciem roztworów o różnym ph, a stężenie CHIR w każdej próbce określano w UV 280, jak przedstawiono w tabeli 7. Tabela 7: Preparaty CHIR Skład buforu ph Stężenie CHIR (mg/ml) mm cytrynianu sodu, mm chlorku sodu 4, 9,0 mm bursztynianu sodu, mm chlorku,0 9,3 sodu mm bursztynianu sodu, mm chlorku, 9,2 sodu mm cytrynianu sodu, mm chlorku 6,0 9,7, sodu mm cytrynianu sodu, mm chlorku 6, 9,4 sodu mm fosforanu sodu, mm chlorku 7,0 9,4 sodu mm fosforanu sodu, mm chlorku 7, 9, sodu mm glicyny, mm chlorku sodu 9,0 9, 1 [0216] Fizykochemiczną stabilność przeciwciała CHIR w różnych preparatach oznaczano z zastosowaniem następujących protokołów. Skaningowa kalorymetria różnicowa (DSC)

121 123 [0217] Konformacyjną stabilność próbek różnych preparatów monitorowano z zastosowaniem MicroCal VP-DSC, podgrzewając od 1 C do 90 C z prędkością 1 C/min. SDS-PAGE [0218] Fragmentację i agregację oceniano, stosując 4-% żel Tris-glicyna w warunkach niezredukowanych i zredukowanych. Białko wykrywano barwieniem błękitem Coomassie. Chromatografia wykluczania (SEC-HPLC) 1 [0219] Mierzono również fragmentację i agregację białka za pomocą HPLC Water Alliance na kolumnie Tosohaas TSKGEL 00SWXL, z fazą ruchomą 0 mm fosforanu sodu o ph 7,0 z prędkością przepływu 0,7 ml/min. Chromatografia kationowymienna (CEX-HPLC) 2 [02] Zmianę ładunku związaną z degradacją mierzono, stosując system Waters 600s HPLC na kolumnie Dionex Propac WCX-, w buforze 0 mm HEPEs o ph 7,3 z fazą ruchomą A i 0 mm buforze HEPES, zawierającym 00 mm NaCl o ph 7,3 jako ruchoma faza B, z prędkością przepływu 0,ml/min. Wyniki i omówienie Badanie stabilności konformacyjnej [0221] Termiczne rozfałdowanie CHIR ujawniło co najmniej dwie przemiany termiczne, odzwierciedlające prawdopodobnie, odpowiednio, rozfałdowanie w trakcie topnienia domen Fab i Fc. W wyższej temperaturze

122 124 przypuszczalna agregacja białka powoduje zanik sygnału DSC. Dla celów badań przesiewowych preparatu najniższą temperaturę termicznej przemiany w tym badaniu określono jako temperaturę topnienia, Tm. Fig. 6 przedstawia temperaturę topnienia termicznego jako funkcję ph preparatu. Preparaty o ph,-6, zapewniały przeciwciała przeciwko CD40 o wyższej stabilności konformacyjnej, czego dowodzi wyższa temperatura topnienia. Analiza SDS-PAGE 1 2 [0222] Próbki preparatu CHIR o ph 4,-9,0 inkubowano w temperaturze 40 C przez 2 miesiące i poddano analizie SDS-PAGE (dane nieprzedstawione). W warunkach nieredukujących w preparatach o ph powyżej, obserwowano rodzaje o masie cząsteczkowej (m.cz.) 23 kda i 27 kda, a rodzaje o m.cz. 1 kda obserwowano we wszystkich preparatach, ale mniej się ich pojawiało przy ph,0-,. Rodzaje o m.cz. 0 kda można było zaobserwować przy ph 7, i ph 9,0. [0223] W warunkach redukujących CHIR ulegało redukcji do wolnych łańcuchów ciężkich i łańcuchów lekkich o m.cz., odpowiednio, 0 kda i 24 kda. Wydaje się, że rodzaje o m.cz. 0 kda nie dawały się w pełni zredukować i ich ilość zwiększała się wraz ze wzrostem ph roztworu, co sugeruje, że w cząsteczkach mogło pojawić się inne niż dwusiarczkowe połączenie kowalencyjne. Ponieważ na SDS-PAGE znajdowały się inne rodzaje o nieznanych tożsamościach, porównanie stabilności poszczególnych preparatów oparto na zachowanej czystości CHIR Preparaty o ph,0-6,0 zapewniały bardziej stabilne środowisko dla CHIR Analizą SDS- PAGE wykryto mało agregatów (dane nieprzedstawione).

123 12 Analiza SEC-HPLC 1 [0224] Analiza SEC-HPLC pozwoliła wykryć CHIR w postaci nienaruszonej jako substancję w głównym piku, substancję zagregowaną jako pik substancji na czole chromatografu, oddzieloną od substancji głównego piku, duże fragmenty substancji jako ramiona piku na końcu głównego piku, a substancje o małych fragmentach wykrywano na chromatografie jako piki substancji po głównym piku. Po inkubacji w temperaturze C i 2 C przez 3 miesiące wykryto pomijalne ilości fragmentów białka i agregatów (<1,0%) w powyższych preparatach i substancja CHIR głównego piku zachowywała czystość większą niż 99% (dane nieprzedstawione). Jednakże fragmenty białka stopniowo rozwijały się po przechowywaniu w 40 C i tworzyło się więcej fragmentów przy ph 4, i ph 6,-9,0, jak przedstawiono w tabeli 8. Po inkubowaniu preparatu CHIR w temperaturze 40 C przez 3 miesiące wykryto około 2-3% agregatów przy ph 7, i 9,0, natomiast w preparatach o innym ph wykryto mniej niż 1% agregatów (dane nieprzedstawione). Wyniki SEC-HPLC wskazują, że CHIR jest bardziej stabilne przy ph około,0-6,0. 2 Tabela 8. Wyniki SEC-HPLC stabilności próbek CHIR w czasie rzeczywistym i przyśpieszających warunkach przechowywania Próbka Pik główny % Fragmenty % t=0 40 C 40 C 40 C t=0 40 C 40 C 40 C 1m 2m 3m 1m 2m 3m Kontrola 99,4 99,2 99,9 99, <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 ph 4, 99,4 93,2 86,0 81,3 <1,0 6,4 13,2 18,1

124 126 ph,0 99,8 98,7 91,3 89,2 <1,0 <1,0 7,8,2 ph, 99,8 98,9 91,4 90,6 <1,0 <1,0 7,6 8,8 ph 6,0 99,6 97,7 90,4 87,3 <1,0 1,9 8,2 11,7 ph 6, 99,3 93,4 89,0 86,9 <1,0,6 9,9 12,4 ph 7,0 99,2 93,9 87,4 8,1 <1,0, 11,1 13, ph 7, 99,1 92,8 84,4 81,9 <1,0 6,4 12,9 16,2 ph 9,0 99,3 82,4 61,6 0,6 <1,0 1,4 36,2 47,6 Analiza CEX-HPLC 1 [022] Analiza CEX-HPLC pozwoliła wykryć nienaruszone CHIR jako substancję piku głównego; warianty kwaśne eluowano wcześniej niż substancje piku głownego, a warianty z dodatkową lizyną na końcu C eluowano jako substancję po piku głównym. Tabela 9 przedstawia zależność odsetka pozostałych substancji CHIR w piku głównym i wariantów kwaśnych od ph roztworu. Próbka kontrolna zawierała już znaczną ilość rodzajów kwaśnych (-33%), prawdopodobnie z powodu procesów fermentacji i oczyszczania na wczesnym etapie. Podatność CHIR na roztwory o wyższym ph jest udokumentowana dwoma faktami. Po pierwsze, początkowa próbka preparatu o ph 9,0 (t=0) generowała już o 12% więcej rodzajów kwaśnych niż kontrola. Po drugie, odsetek rodzajów kwaśnych wzrastał gwałtownie ze wzrostem ph. Degradacja związana ze zmianą ładunku jest prawdopodobnie spowodowana deamidacją. Powyższe dane wskazują, że ten rodzaj rozpadu CHIR był zminimalizowany przy ph około,0-,. 2 Tabela 9. Odsetek powierzchni piku CEX-HPLC dla CHIR w preparatach o różnym ph w czasie rzeczywistym i przyśspieszających warunkach przechowywania

125 127 Próbka Główny pik % Fragmenty % t=0 C 2 C 40 C 40 C t=0 C 2 C 40 C 40 C 3m 3m 1m 2m 3m 3m 1m 2m Kontrola 49,2 49,8 49,8 49,2 0,3 32,0 33,7 33,7 32,0 33,6 ph 4, 48, 49,7 43,7 39,7,0 32, 32,6 38,0 44,2 6,4 ph,0 49,6 49,8 48,3 40,6 31,4 32,7 31,8 3,0 44,3 7,1 ph, 0,7 0,3 48,1 40,0,2 32,6 31,8 37,8 48,9 63,3 ph 6,0 0,2 49,9 47,9 37,4 23,9 33,1 33,6 38, 4,9 72,7 ph 6, 49,4 49,9 42,3 29,7 14,6 33,3 33,6 47,7 6,2 84,6 ph 7,0 49,7 49,9 21, ,4 36,4 64,4 - - ph 7, 49,3 48,3 12, , 40,1 79,2 - - ph 9,0 41,3 31, ,7 9, Podsumowanie 1 [0226] ph ma znaczący wpływ na konformacyjną i fizykochemiczną stabilność CHIR Stwierdzono, że rozpad związany ze zmianą ładunku jest podstawową drogą rozpadu CHIR-12.12, zminimalizowanego przy ph,0-,. Na podstawie całkowitych danych na temat stabilności, zalecanym ciekłym preparatem farmaceutycznym zawierającym to przeciwciało jest preparat zawierający około mg/ml CHIR w około mm bursztynianu sodu, około mm chlorku sodu i o ph około,. [0227] Specjaliście korzystającemu z przedstawionych w uprzednim opisie objaśnień i załączonych rysunków, przyjdzie na myśl wiele modyfikacji i innych wykonań przedstawionego tu wynalazku. Należy zatem rozumieć, że wynalazki nie mają być ograniczone do ujawnionych swoistych wykonań i że zakres załączonych zastrzeżeń i lista ujawnionych tutaj wykonań mają obejmować modyfikacje i inne wykonania. Chociaż używa się tutaj swoistych nazwy, są one

126 128 stosowane jedynie w ogólnym i opisowym znaczeniu, a nie w celu ograniczania. 1 2 LISTA SEKWENCJI [0228] <1> Long, Li Luqman, Mohammad Yabannavar, Asha Zaror, Isabel <1> Stosowanie antagonistycznego przeciwciała monoklonalnego przeciwko CD40 do leczenia szpiczaka mnogiego <1> PP2289,002 (28291) <> 60/6,709 <11> <> 60/6,7 <11> <> 60/2,79 <11> <> 60/17,337 <11> <160> 12 <170> FastSEQ dla Windows, wersja 4.0 <2> 1 <211> 7 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Sekwencja kodująca łańcucha lekkiego ludzkiego przeciwciała przeciwko CD40 <221> CDS <222> (1)...(7) <400> 1

127

128 1 3 <2> 2 <211> 239 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Łańcuch lekki ludzkiego przeciwciała przeciwko CD40 <400> 2

129 131 4 <2> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Sekwencja kodująca łańcucha ciężkiego ludzkiego przeciwciała przeciwko CD40 (z intronami) <400> 3 1

130 132 <2> 4 <211> 469 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna 1 <2> <223> Łańcuch ciężki ludzkiego przeciwciała przeciwko CD40 <400> 4

131 133 6

132 134 <2> <211> 469 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna 7 <2> <223> Łańcuch ciężki wariantu ludzkiego przeciwciała przeciwko CD40 <400>

133 13 8

134 136 <2> 6 <211> 239 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> > Łańcuch lekki ludzkiego przeciwciała.9 przeciwko CD40 <400> 6 <2> 7 <211> 474 <212> PRT 1 <213> Sekwencja sztuczna <2>

135 137 <223> > Łańcuch ciężki ludzkiego przeciwciała.9 przeciwko CD40 <400> 7 9

136 138 <2> 8 <211> 474 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <2>

137 139 <223> Łańcuch ciężki wariantu ludzkiego przeciwciała.9 przeciwko CD40 <400> 8

138 140 <2> 9 <211> 612 <212> DNA 11 <213> Homo sapiens

139 141 <2> <221> CDS <222> (1)...(612) <221> misc_feature <222> (0)...(0) <223> Sekwencja kodująca izoformy krótkiej ludzkiego CD40 <400> 9

140 142 <2> <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 1 <2> 11 <211> 834 <212> DNA <213> Homo sapiens <2> <221> CDS <222> (1)...(834) <221> misc_feature

141 143 <222> (0)...(0) <223> Sekwencja kodująca izoformy długiej ludzkiego CD40 <400>

142 144 14

143 14 <2> 12 <211> 277 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 1 Zastrzeżenia patentowe

144 Ludzkie przeciwciało monoklonalne przeciwko CD40, które jest zdolne do swoistego wiązania z ludzkim antygenem CD40 ulegającym ekspresji na powierzchni ludzkiej komórki z ekspresją CD40, przy czym to przeciwciało monoklonalne nie wykazuje znaczącej aktywności agonistycznej, przez co, gdy wspomniane przeciwciało monoklonalne wiąże się z antygenem CD40 ulegającym ekspresji na powierzchni wspomnianej komórki, zahamowany jest wzrost i różnicowanie wspomnianej komórki, do zastosowania w sposobie leczenia osobnika (człowieka) z powodu szpiczaka mnogiego, obejmującym podawanie wspomnianemu osobnikowi efektywnej ilości ludzkiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko CD40, przy czym to ludzkie przeciwciało monoklonalne przeciwko CD40 wybiera się z grupy, do której należy: a) przeciwciało monoklonalne, które wiąże się z epitopem zdolnym do wiązania przeciwciała monoklonalnego CHIR-.9 możliwego do otrzymania z linii komórkowej hybrydoma zdeponowanej w ATCC jako depozyt patentowy nr PTA-42 lub przeciwciała monoklonalnego CHIR możliwego do otrzymania z linii komórkowej hybrydoma zdeponowanej w ATCC jako depozyt patentowy nr PTA-43, b) przeciwciało monoklonalne, które wiąże się z epitopem zawierającym reszty sekwencji ludzkiego CD40 przedstawionej w SEQ ID nr lub SEQ ID nr 12, c) przeciwciało monoklonalne, które wiąże się z epitopem zawierającym reszty sekwencji ludzkiego CD40 przedstawionej w SEQ ID nr lub SEQ ID nr 12 i d) przeciwciało monoklonalne, które współzawodniczy z przeciwciałem monoklonalnym CHIR-.9 możliwym do otrzymania z linii komórkowej hybrydoma zdeponowanej w ATCC jako depozyt patentowy nr PTA-42 lub

145 przeciwciałem monoklonalnym CHIR możliwym do otrzymania z linii komórkowej hybrydoma zdeponowanej w ATCC jako depozyt patentowy nr PTA-43 w analizie współzawodnictwa wiązania. Ludzkie przeciwciało monoklonalne przeciwko CD40, które jest zdolne do swoistego wiązania z antygenem CD40, przy czym wspomniane przeciwciało monoklonalne nie wykazuje znaczącej aktywności agonistycznej, gdy jest związane z antygenem CD40, do stosowania w sposobie hamowania wzrostu komórek szpiczaka mnogiego z ekspresją antygen CD40, przy czym wspomniany sposób obejmuje stykanie wspomnianych komórek z efektywną ilością ludzkiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko CD40, w którym wspomniane przeciwciało wybiera się z grupy, do której należy: a) przeciwciało monoklonalne, które wiąże się z epitopem zdolnym do wiązania przeciwciała monoklonalnego CHIR-.9 możliwego do otrzymania z linii komórkowej hybrydoma zdeponowanej w ATCC jako depozyt patentowy nr PTA-42 lub przeciwciała monoklonalnego CHIR możliwego do otrzymania z linii komórkowej hybrydoma zdeponowanej w ATCC jako depozyt patentowy nr PTA-43, b) przeciwciało monoklonalne, które wiąże się z epitopem zawierającym reszty sekwencji ludzkiego CD40 przedstawionej w SEQ ID nr lub SEQ ID nr 12, c) przeciwciało monoklonalne, które wiąże się z epitopem zawierającym reszty sekwencji ludzkiego CD40 przedstawionej w SEQ ID nr lub SEQ ID nr 12 i d) przeciwciało monoklonalne, które współzawodniczy z przeciwciałem monoklonalnym CHIR-.9 możliwym do otrzymania z linii komórkowej hybrydoma zdeponowanej w ATCC jako depozyt patentowy nr PTA-42 lub

146 przeciwciałem monoklonalnym CHIR możliwym do otrzymania z linii komórkowej hybrydoma zdeponowanej w ATCC jako depozyt patentowy nr PTA-43 w analizie współzawodnictwa wiązania. Stosowanie efektywnej ilości ludzkiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko CD40, które jest zdolne do swoistego wiązania do ulegającego ekspresji ludzkiego antygenu CD40 na powierzchni ludzkiej komórki z ekspresją CD40 do wytwarzania leku do leczenia szpiczaka mnogiego u osobnika (człowieka), przy czym to przeciwciało monoklonalne nie wykazuje znaczącej aktywności agonistycznej, przez co, gdy wspomniane przeciwciało monoklonalne wiąże się z antygenem CD40 z ekspresją na powierzchni wspomnianej komórki, zahamowany zostaje wzrost lub różnicowanie wspomnianej komórki, przy czym wspomniane ludzkie przeciwciało monoklonalne przeciwko CD40 wybiera się z grupy, do której należy a) przeciwciało monoklonalne, które wiąże się z epitopem zdolnym do wiązania przeciwciała monoklonalnego CHIR-.9 możliwego do otrzymania z linii komórek hybrydoma zdeponowanej w ATCC jako depozyt patentowy nr PTA-42 lub przeciwciała monoklonalnego CHIR możliwego do otrzymania z linii komórkowej hybrydoma zdeponowanej w ATCC jako depozyt patentowy nr PTA-43, b) przeciwciało monoklonalne, które wiąże się z epitopem zawierającym reszty sekwencji ludzkiego CD40 przedstawionej w SEQ ID nr lub SEQ ID nr 12, c) przeciwciało monoklonalne, które wiąże się z epitopem zawierającym reszty sekwencji ludzkiego CD40 przedstawionej w SEQ ID nr lub SEQ ID nr 12 i d) przeciwciało monoklonalne, które współzawodniczy z przeciwciałem monoklonalnym CHIR-.9 możliwym do

147 otrzymania z linii komórkowej hybrydoma zdeponowanej w ATCC jako depozyt patentowy nr PTA-42 lub przeciwciałem monoklonalnym CHIR możliwym do otrzymania z linii komórkowej hybrydoma zdeponowanej w ATCC jako depozyt patentowy nr PTA-43 w analizie współzawodnictwa wiązania. Stosowanie efektywnej ilości ludzkiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko CD40, które jest zdolne do swoistego wiązania z antygenem CD40 do wytwarzania leku do hamowania wzrostu komórek szpiczaka mnogiego z ekspresją antygenu CD40, przy czym to przeciwciało monoklonalne nie wykazuje znaczącej aktywności agonistycznej, gdy jest związane z antygenem CD40, gdzie wspomniane przeciwciało wybiera się z grupy, do której należy: a) przeciwciało monoklonalne, które wiąże się z epitopem zdolnym do wiązania przeciwciała monoklonalnego CHIR-.9 możliwego do otrzymania z linii komórkowej hybrydoma zdeponowanej w ATCC jako depozyt patentowy nr PTA-42 lub przeciwciała monoklonalnego CHIR możliwego do otrzymania z linii komórkowej hybrydoma zdeponowanej w ATCC jako depozyt patentowy nr PTA-43, b) przeciwciało monoklonalne, które wiąże się z epitopem zawierającym reszty sekwencji ludzkiego CD40 przedstawionej w SEQ ID nr lub SEQ ID nr 12, c) przeciwciało monoklonalne, które wiąże się z epitopem zawierającym reszty sekwencji ludzkiego CD40 przedstawionej w SEQ ID nr lub SEQ ID nr 12 i d) przeciwciało monoklonalne, które współzawodniczy z przeciwciałem monoklonalnym CHIR-.9 możliwym do otrzymania z linii komórkowej hybrydoma zdeponowanej w ATCC jako depozyt patentowy nr PTA-42 lub

148 1 2. przeciwciałem monoklonalnym CHIR możliwym do otrzymania z linii komórkowej hybrydoma zdeponowanej w ATCC jako depozyt patentowy nr PTA-43 w analizie współzawodnictwa wiązania. Sposób in vitro hamowania wzrostu komórek szpiczaka mnogiego z ekspresją antygenu CD40, przy czym wspomniany sposób obejmuje stykanie wspomnianych komórek z efektywną ilością ludzkiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko CD40, które jest zdolne do swoistego wiązania się ze wspomnianym antygenem CD40, przy czym to przeciwciało monoklonalne nie wykazuje znaczącej aktywności agonistycznej, gdy jest związane z antygenem CD40, gdzie wspomniane przeciwciało wybiera się z grupy, do której należy: a) przeciwciało monoklonalne, które wiąże się z epitopem zdolnym do wiązania przeciwciała monoklonalnego CHIR-.9 możliwego do otrzymania z linii komórkowej hybrydoma zdeponowanej w ATCC jako depozyt patentowy nr PTA-42 lub przeciwciała monoklonalnego CHIR możliwego do otrzymania z linii komórek hybrydoma zdeponowanej w ATCC jako depozyt patentowy nr PTA-43, b) przeciwciało monoklonalne, które wiąże się z epitopem zawierającym reszty sekwencji ludzkiego CD40 przedstawionej w SEQ ID nr lub SEQ ID nr 12, c) przeciwciało monoklonalne, które wiąże się z epitopem zawierającym reszty sekwencji ludzkiego CD40 przedstawionej w SEQ ID nr lub SEQ ID nr 12 i d) przeciwciało monoklonalne, które współzawodniczy z przeciwciałem monoklonalnym CHIR-.9 możliwym do otrzymania z linii komórkowej hybrydoma zdeponowanej w ATCC jako depozyt patentowy nr PTA-42 lub przeciwciałem monoklonalneym CHIR możliwym do

149 otrzymania z linii komórkowej hybrydoma zdeponowanej w ATCC jako depozyt patentowy nr PTA-43 w analizie współzawodnictwa wiązania. Przeciwciało monoklonalne, zastosowanie lub sposób według któregokolwiek z zastrzeżeń 1-, gdzie wspomniane przeciwciało wybiera się z grupy, do której należy przeciwciało monoklonalne CHIR-.9 możliwe do otrzymania z linii komórkowej hybrydoma zdeponowanej w ATCC jako depozyt patentowy nr PTA-42 i przeciwciało monoklonalne CHIR możliwe do otrzymania z linii komórkowej hybrydoma zdeponowanej w ATCC jako depozyt patentowy nr PTA-43. Przeciwciało monoklonalne, zastosowanie lub sposób według któregokolwiek z zastrzeżeń 1-, gdzie wspomniane przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym wybranym z grupy, do której należy: (i) przeciwciało monoklonalne obejmujące domenę zmienną łańcucha lekkiego, zawierającą reszty 44-4, i SEQ ID nr 2 lub SEQ ID nr 6, (ii) przeciwciało monoklonalne obejmujące domenę zmienną łańcucha ciężkiego, zawierającą reszty 0-4, i SEQ ID nr 4 lub SEQ ID nr 7, (iii) przeciwciało monoklonalne obejmujące domenę zmienną łańcucha lekkiego, zawierającą reszty 46-2, i SEQ ID nr 2 lub SEQ ID nr 6 i (iv) przeciwciała monoklonalnego obejmującego domenę zmienną łańcucha ciężkiego zawierającą reszty 4-1, 72-74, 11-1 SEQ ID nr 4 lub SEQ ID nr 7. Przeciwciało monoklonalne, zastosowanie lub sposób według któregokolwiek z zastrzeżeń 1-, gdzie wspomniane przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym obejmującym sekwencję aminokwasów wybraną z grupy, do której należą:

150 (i) reszty SEQ ID nr 2, (ii) reszty SEQ ID nr 2, (iii) SEQ ID nr 2, (iv) reszty -139 SEQ ID nr 4, (v) reszty -469 SEQ ID nr 4, (vi) SEQ ID nr 4, (vii) reszty -469 SEQ ID nr, (viii) SEQ ID nr, (ix) reszty SEQ ID nr 2 i reszty -139 SEQ ID nr 4, (x) reszty SEQ ID nr 2 i reszty -469 SEQ ID nr 4, (xi) reszty SEQ ID nr 2 i reszty -469 SEQ ID nr, (xii) SEQ ID nr 2 i SEQ ID nr 4 oraz (xiii) SEQ ID nr 2 i SEQ ID nr. Przeciwciało monoklonalne, zastosowanie lub sposób według któregokolwiek z zastrzeżeń 1-, gdzie wspomniane przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym obejmującym sekwencję aminokwasów wybraną z grupy, do której należą: (i) reszty SEQ ID nr 6, (ii) reszty SEQ ID nr 6, (iii) SEQ ID nr 6, (iv) reszty -144 SEQ ID nr 7, (v) reszty -474 SEQ ID nr 7, (vi) SEQ ID nr 7, (vii) reszty -474 SEQ ID nr 8, (viii) SEQ ID nr 8, (ix) reszty SEQ ID nr 6 i reszty -144 SEQ ID nr 7, (x) reszty SEQ ID nr 6 i reszty -474 SEQ ID nr 7,

151 (xi) reszty SEQ ID nr 6 i reszty -474 SEQ ID nr 8, (xii) SEQ ID nr 6 i SEQ ID nr 7 oraz (xiii) SEQ ID nr 6 i SEQ ID nr 8.. Przeciwciało monoklonalne, zastosowanie lub sposób według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, gdzie wspomniane przeciwciało wiąże się ze wspomnianym ludzkim antygenem CD40 z powinowactwem (KD) co najmniej -6 M. 11. Przeciwciało monoklonalne, zastosowanie lub sposób według zastrzeżenia, gdzie wspomniane przeciwciało monoklonalne wiąże się ze wspomnianym ludzkim antygenem CD40 z powinowactwem (KD) co najmniej -8 M. 12. Przeciwciało monoklonalne, zastosowanie lub sposób według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, gdzie wspomniane przeciwciało jest fragmentem wiążącym antygen wspomnianego przeciwciała monoklonalnego przeciwko CD40, przy czym fragment zachowuje zdolność swoistego wiązania z wspomnianym ludzkim antygenem CD Przeciwciało monoklonalne, zastosowanie lub sposób według zastrzeżenia 12, gdzie wspomniany fragment jest wybrany z grupy, do której należy fragment Fab, fragment F(ab ) 2, fragment Fv i fragment pojedynczego łańcucha Fv. 14. Przeciwciało monoklonalne, zastosowanie lub sposób według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, gdzie wspomniane przeciwciało monoklonalne jest wytwarzane w linii komórkowej CHO. Xoma Technology Ltd. Zastępca:

152 14

153 1

154 16

155 17

156 18