Ćwiczenie 19 Wyzncznie molowego współczynnik bsorpcji. Ilościowe ozncznie p-nitrofenolu. Zleżność molowego współczynnik bsorpcji od ph. Część teoretyczn: Spektroskopi obejmuje szereg metod bdni mterii przy użyciu promieniowni elektromgnetycznego (np. świtł), które może być zrówno emitowne, jk i pochłnine (bsorbowne). Brdzo szerokie zstosowni znlzł zwłszcz spektroskopi elektronow w zkresie świtł widzilnego (VIS; 400-800 nm) i ndfioletu (UV; 200-400 nm). W widmch bsorpcyjnych UV-VIS w wyniku przejści świtł (promieniowni elektromgnetycznego) przez roztwór dnego związku chemicznego obserwuje się przejści elektronów wlencyjnych ze stnu podstwowego do wzbudzonego. W wyniku tkiego przejści promieniownie elektromgnetyczne o pewnych długościch fli jest pochłnine (bsorbowne). bsorpcj promieniowni związn jest z przejścimi elektronów n wyższe poziomy energetyczne. Nleży jednk pmiętć, że by kwnty promieniowni elektromgnetycznego doprowdziły do tkiego przejści, to muszą posidć odpowiednią energię, odpowidjącą różnicy energii pomiędzy poziommi energetycznymi ( E=hν). Widm elektronowe chrkteryzujące stny elektronowo-oscylcyjno-rotcyjne ndją się szczególnie dobrze do bdni substncji brwnych. Widm tkie ułtwiją np. identyfikcję niektórych leków i sprwdznie ich stopni czystości Związki wykzujące bsorpcję w zkresie UV-VIS często posidją w swej budowie grupy tomów zwierjących elektrony o młych energich wzbudzeni. Grupy tkie, nzywne są chromoformi (grec. chrom phoros kolor niosący ). Njczęściej są to pierścienie romtyczne (romtyczny sekstet elektronów), wiązni wielokrotne (wiązni typu π), czy też tomy zwierjące wolne pry elektronowe (tzw. elektrony niewiążące n). Związki zwierjące elektrony niewiążące (n) i elektrony typu π njczęściej bsorbują świtło w obszrze ndfioletu. Obok chromoforów w cząsteczkch mogą znjdowć się inne grupy tomów określne minem uksochromów (sme nie bsorbują promieniownie promieniowni, le ich obecność powoduje wzrost intensywności zbrwieni). Wzmcniją one dziłnie chromoforów, orz mogą przesuwć mksimum bsorpcji w kierunku fl dłuższych (tzw. btochromy, np.: -NH 2, -OH, -OR), bądź w kierunku fl krótszych (tzw. hipsochromy, np.: CH 3, -CO-, -C 6 H 5 CO-). Efekt dziłni grup chromoforowych i uksochromowych n widm bsorpcyjne możemy zdemonstrowć porównując widm 3 związków: cykloheksnu, benzenu orz p-nitrofenolu. Jk widzimy są to cykliczne związki zwierjące 6 węgli. Jeżeli jednk poptrzymy n ich widm to zobserwujemy, że cykloheksn wcle nie bsorbuje świtł (brk chromoforów), benzen silnie dsorbuje w ndfiolecie (200-300 nm), p-nitrofenol zrówno w zkresie UV (poniżej 380 nm), jk i w zkresie świtł widzilnego (powyżej 400 nm). 1
OH NO 2 cykloheksn benzen p-nitrofenol Obecność pierścieni romtycznego (grupy chromoforowej) w benzenie powoduje, że związek ten bsorbuje świtło o długościch fl 190-300 nm (ultrfiolet), zś obecność grupy nitrowej i fenolowej (uksochromów) powoduje przesunięcie mksimum bsorpcji w kierunku fl dłuższych (λ mx =405-415 nm). Ztem p-nitrofenol (zwierjący 2 grupy uksochromowe) bsorbuje zrówno świtło UV i świtło widzilne (mksymlną bsorpcję wykzuje dl długości fli ok. 405 nm, któr odpowid brwie niebieskiej). Nleży podkreślić, że brw substncji zleży od selektywnej bsorpcji określonej długości świtł widzilnego i jest on brwą dopełnijącą do pochłoniętej. Poniewż bsorbowne jest świtło o brwie niebieskiej to roztwór wykzuje żółte zbrwienie (brw żółt jest brwą dopełnijącą do niebieskiej, czerwon zielon; bił-czrn, itp.). Poniżej przedstwiono dl przykłdu widm bsorpcyjne benzenu i p-nitrofenolu: Ryc. 2. Porównnie widm bsorpcji benzenu i p-nitrofenolu Przejści elektronowe odpowidjące bsorpcji świtł widzilnego obserwuje się też w przypdku pierwistków bloku d. Cechą tych pierwistków jest niecłkowicie zpełnienie podpowłoki d, w związku z czym elektron z łtwością może być przeniesiony w obrębie poziomów energetycznych podpowłoki d. Wrtość energii przejści pomiędzy poziommi d odpowid energii promieniowni widzilnego (400-800 nm). Dltego też większość roztworów związków zwierjących pierwistki bloku wykzuje zbrwienie, co jest wykorzystywne do ich nlizy (np. Cu 2+ - niebieskie, CrO 2-4 - żółte, Cr 2 O 2-7 - pomrńczowe, Cr 3+ - zielone, MnO - 4 - fioletowe, Fe 2+ - jsnozielone, Fe 3+ - żółte). Przy cłkowicie zpełnionej podpowłoce d lub brku n niej elektronów jony proste metli bloku d są bezbrwne (np.: bezbrwny Cu + (ntomist Cu 2+ niebieskie), czy bezbrwny Ti 4+, w odróżnieniu od fioletowego Ti 3+ ). 2
Prw bsorpcji Widmo bsorpcyjne związku chemicznego jest mirą ilości świtł zbsorbownego przez ten związek (bsorbncj) w zleżności od długości fli świetlnej (λ). Jeżeli n próbkę pd promieniownie elektromgnetyczne (świtło) o ntężeniu I 0 to część tego promieniowni zostnie zbsorbown, część przechodzi przez tą próbkę. Rejestrując ntężeni promieniowni pdjącego (I 0 ) i przechodzącego (I T ) możemy wyznczyć ilość świtł któr uleg pochłonięciu przez roztwór (bsorbncj, ), lub któr przeszł przez niego (trsmitncj, T): I 1 log 0 = log I T = (1) T bsorbncj przy dnej długości fli zleży od molowego współczynnik bsorpcji (ε), grubości wrstwy bsorbującej (zwykle 1cm) i stężeni bdnego roztworu. Zleżność t mtemtycznie jest wyrżon przez prwo Lmbert-Beer (bsorbncj jest wprost proporcjonln do stężeni roztworu i grubości wrstwy bsorbującej), co możemy zpisć: = ε l C (2) gdzie: bsorbncj l grubość wrstwy bsorpcyjnej ε molowy współczynnik bsorpcji [cm 2 /mol] C stężenie bdnego roztworu [mol/dm 3 ] Molowy współczynnik bsorpcji (ε) jest chrkterystyczny dl dnej substncji i m stłą wrtość przy określonej długości fli. Jego wielkość jest proporcjonln do prwdopodobieństw przejść pomiędzy poziommi energetycznymi cząsteczki i jest zleżn od energii fotonów promieniowni (hν). Liczbowo przedstwi on bsorbncję wykzywną przez roztwór o stężeniu 1 mol/dm 3, przy grubości wrstwy 1cm. Znjomość wrtości molowego współczynnik bsorpcji pozwl określić stężenie roztworu po oznczeniu jego bsorbncji (ekstynkcji* 1 ) bądź też wykorzystywć do obliczni przewidywnej bsorbncji substncji o znnym stężeniu. W tbeli poniżej zestwiono wrtości molowego współczynnik bsorpcji (ε) dl kilku związków, wrz z podniem długości fli świetlnej (λ mx ) przy jkiej dokonno pomiru. * 1 <łc. exstinctio wygśnięcie> osłbienie wiązki świtł przechodzącej przez jkiś ośrodek, wynikjące z pochłnini i rozprszni świtł w tym ośrodku. Termin ekstynkcj często był używny zmiennie z terminem bsorpcj, zwłszcz w strszych podręcznikch pochodzących z lt 60-70-tych XX wieku. Obecnie wg. Międzynrodowej Unii Chemii Czystej i Stosownej (ng. Interntionl Union of Pure nd pplied Chemistry), nie jest to termin zlecny i w odniesieniu do pochłnini świtł powinno się używć terminu: bsorbncj/ bsorpcj (IUPC. Compendium of Chemicl Terminology: http://goldbook.iupc.org/html//00036.html) 3
Substncj ε M -1 cm -1 ( 10 3 cm 2 mol -1 ) λ mx (nm) Streptvidin 176 280 Cscde Blue 28 400 lex Fluor 488 71 495 Oregon Green 77 488 Rhodmine B 80 570 Fluorescein 85 498 Texs Red 85 595 lex Fluor 750 240 749 PerCP 380 482 NDH 6 220 340 p-nitrofenol 18 400 405 Prwo Lmbert Beer możn też przedstwić w postci grficznej jko zleżność bsorbncji od stężeni: = f (C). Będzie to lini prost przechodząc przez początek ukłdu współrzędnych (punkt (0,0); ryc. 4), dl poszczególnych stężeń roztworów zznczono odpowidjącą im wrtość bsorbncji. Ryc. 4. Zleżność bsorbncji od stężeni brwnej substncji krzyw wzorcow. Korzystjąc z krzywej wzorcowej sporządzonej dl dnej substncji i zmierzeniu bsorbncji próbki bdnej możn n podstwie wykresu (sporządzonego n ppierze milimetrowym) określić stężenie tej substncji w bdnej próbie. Przy wykonywniu pomirów spektrofotometrycznych nleży pmiętć, iż zmierzon wrtość bsorbncji jest sumą bsorbncji próbki i bsorbncji odnośnik. Wynik to z prw ddytywności, które mówi że bsorbncj cłkowit () jest sumą niezleżnych bsorbncji poszczególnych skłdników ( 1, 2,... n ): n = 1 + 2 +... + n = i i= 1 (3) 4
Jko odnośniki stosuje się: powietrze; roztwory nie bsorbujące przy żdnej długości fli (roztwory buforowe, wod); roztwory bsorbujące, le nie wchodzące w rekcje z bdną substncją lub roztwory o znnym stężeniu, które będzie się zmieniło w wyniku zchodzących rekcji. Pomir bsorbncji Przed wykonniem pomiru bsorbncji nleży wyklibrowć spektrofotometr poprzez ustwienie bsorbncji n wrtość równą zero, gdy w kuwecie znjduje się odnośnik. Jeżeli wykonuje się widmo jkiegoś związku, również nleży wykonć widmo odnośnik. Końcowe widmo związku jest ztem widmem zmierzonym dnego związku, le pomniejszonym o widmo odnośnik. Jeżeli roztwór (wod, bufor) będący odnośnikiem nie zwier bdnej substncji w żdnej z możliwych form, wówczs uzyskujemy widmo bsolutne. Widmo różnicowe uzyskujemy, gdy roztwór odnośnik zwier bdną substncję w tkim smym stężeniu jk roztwór bdny. Przeprowdz się wówczs rekcję w kuwecie z bdną substncją, w wyniku której stężenie jej zmieni się, ntomist w kuwecie z odnośnikiem nie zchodzi żdn rekcj, ztem stężenie bdnej substncji nie zmieni się. W tego rodzju bdnich widmo przedstwi zminy bsorbncji ( bsorbncji) w próbie bdnej w porównniu do odnośnik. Ob sposoby pomiru bsorbncji są wykorzystywne w lbortorich do wyznczni stężeń czy też kinetyki rekcji chemicznych. Przy wykonywniu pomirów spektrofotometrycznych nleży pmiętć, iż n uzyskny wynik bsorbncji wpływ m również mterił, z jkiego wykonn jest kuwet pomirow. Przyczyną tego jest fkt, sm kuwet również może bsorbowć świtło. Jeżeli wiązkę świtł przepuścimy przez pustą kuwetę, to po dotrciu do detektor będzie on mił mniejsze ntężenie niż wiązk świtł pdjącego. W związku z tym w zleżności od zkresu długości fli, przy jkiej jest wykonywny pomir nleży stosowć różnego rodzju kuwety pomirowe. Poniżej podno przepuszczlność świtł dl mteriłów, z których wykonuje się kuwety: Polistyren: 340 800 nm Kwrc: 170 2600 nm Szkło: 334 2500 nm Polimetkryln: 280 800 nm W wielu oznczenich, gdzie długość fli stosownej w pomirze jest większ od 340 nm stosuje się zwykle plstikowe kuwety, które są tńsze i mniej ulegją kontmincji przy zstosowniu tkich odczynników jk np.: coomsie blue. Jednk do pomirów bsorbncji roztworów biłek przy 280 nm, czy też DN przy 260 nm stosuje się kuwety kwrcowe. Nleży pmiętć, iż przepuszczlność świtł przez dwie kuwety (wykonne z tego smego mteriłu) może nwet zncznie się różnić. Dltego nleży dobierć kuwety o zbliżonej przepuszczlności świtł lub dokonywć pomiru bsorbncji próbki i odnośnik w tej smej kuwecie. Tego typu problemy mogą również wystąpić przy stosowniu kuwet do młych objętości (<1 ml) i może to być związne z tym, iż wiązk świtł nie trfi 5
precyzyjnie w środek przedniej ściny kuwety. W tym wypdku występujące zkłóceni możn zniwelowć poprzez zstosownie kuwet, które są cłe czrne poz szczeliną, którą docier do próbki wiązk świtł. Widzimy, ztem że kuwet pomirow m ogromny wpływ n dokłdność wykonywnych pomirów. Kuwety pozwljące n pomiry z dużą precyzją są brdzo drogie i powinny być używne i przechowywne ze szczególną ostrożnością. Ścinek kuwety, przez które przechodzi wiązk świtł nie nleży dotykć plcmi, w przypdku zbrudzeni nleży je przemyć wodą i deliktnie wytrzeć miękką chusteczką. Przed dłuższym przechowywniem kuwetę nleży opłukć wod dejonizowną i etnolem, by nie pozostły n niej zcieki. Do pomirów bsorpcji wykorzystuje się spektrofotometry, którego schemt budowy przedstwiono poniżej: Źródło świtł wysył promieniownie, z którego z pomocą monochromtor możemy wyodrębnić monochromtyczną wiązkę promieniowni (o ściśle określonej długości). Promieniownie to przechodzi przez szczelinę i pd n kuwetę z próbą. Część promieniowni jest bsorbown przez próbę, pozostł część przechodzi i jest rejestrown przez detektor. W ukłdzie detektor, nstępuje pomir ntężeni wiązki, któr przeszł przez kuwetę (I) jk i pdjącej n kuwetę (I 0 ), uzyskny wynik pomiru prezentowny jest n wyświetlczu spektrofotometru. Wpływ ph n widmo borcyjne w zkresie świtł widzilnego Widmo formy niezjonizownej związku o włściwościch zsdowych lub kwsowych różni się zsdniczo od widm formy zjonizownej. Stąd powszechne jest zstosownie spektrofotometrii do bdni równowg kwsowo-zsdowych: (kws) H H + + - (zsd) Rekcję tą opisuje stłą równowgi: + [ H ][ ] K =, z czego wynik: [ H] [ H] log K = pk = ph + log (4) [ ] 6
by wyznczyć chrkterystyczną wrtość pk dnego związku, ozncz się spektrofotometrycznie stosunek stężeni formy niezdysocjownej do zdysocjownej przy odpowiedniej wrtości ph. Stosując jednkowe stężeni roztworów w kolejnych pomirch, wzory n pk możn wyrzić jko: I dl kwsu : pk = ph + log (5) M gdzie (dl wybrnej nlitycznej długości fli): I = bsorbncj formy cłkowicie zjonizownej M = bsorbncj formy niezjonizownej = bsorbncj mieszniny obu form przy dnym ph M dl zsdy : pk = ph + log (6) I Celem precyzyjnego określeni pk wykonuje się kilk pomirów przy różnych wrtościch ph i oblicz się wrtość średnią. Krzyw bsorpcji formy zjonizownej przecin się z krzywą bsorpcji niezjonizownej w tzw. punkcie izobestycznym. W punkcie tym przecinją się wszystkie krzywe bdnego ukłdu bez względu n wrtość stosunku [H]/[ - ], poniewż sum [H] + [ - ] pozostje stł. Z równowgą kwsowo-zsdową związne są zminy zbrwieni wskźników ph, które różnią się budową w środowisku kwśnym i zsdowym. Przykłdowo fenoloftlein w środowisku zsdowym tworzy nion, który chrkteryzuje się silną bsorpcją w zkresie świtł widzilnego. Część eksperymentln: Celem ćwiczeni jest określenie wrtości molowego współczynnik bsorpcji dl p-nitrofenolu, orz określenie zmin w widmie bsorpcyjnym tego związku w zleżności od ph. Określny zostnie również wpływ lkoholu n ph i stopień dysocjcji p-nitrofenolu. 1. Wyzncznie widm bsorbncji Widmo p-nitrofenolu, jk przedstwiono n ryc. 2 wykzuje bsorbncję zrówno w zkresie świtł widzilnego, jk i ultrfioletu. Poniewż spektrofotometry znjdujące się n sli ćwiczeń nie są wyposżone w źródło świtł emitujące promieniownie z zkresu UV, pomiry widm bsorbncji zostną przeprowdzone dl fluoresceiny, związku który bsorbuje w zkresie VIS. Do kuwety wprowdzić roztwór fluoresceiny (0,5 mg/ml) i dokonć pomiru bsorbncji w zkresie 400 540 nm, co 5 nm. Odnośnikiem w pomirch jest wod. Nleży przestrzegć zsdy, że do kuwety wprowdzmy tką ilość płynu by stnowił on ok. ¾ objętości kuwety. Po kżdej zminie długości fli świetlnej spektrofotometr powinien być wyzerowny (kuwet z wodą; zgodnie z instrukcją dnego prtu, klwisze: zero ; blnk ; R ), nstępnie po wstwieniu kuwety z fluoresceiną nleży odczytć wynik bsorbncji. Nrysowć n ppierze milimetrowym zleżność bsorbncji () od długości fli (λ) przy 7
której dokonno pomiru (widmo bsorpcji) przy której prowdzono pomir. N podstwie wykresu określić nlityczną długość fli dl fluoresceiny, przy której zrejestrowno njwyższą wrtość bsorpcji. 2. Wyzncznie molowego współczynnik bsorpcji (ε) dl p-nitrofenolu w środowisku zsdowym. Przygotowć 3 roztwory p-nitrofenolu (o stężenich: 10, 20 i 40 µm) poprzez rozcieńczenie roztworu wyjściowego (0,1 mm p-nitrofenol) buforem fosfornowym o ph=10. Do wykonni pomirów nleży przygotowć przynjmniej 3 ml kżdego z roztworów (podpowiedź: skorzystć z zleżności: C 1 V 1 =C 2 V 2 ). Mierzymy bsorbncję dl kżdego ze stężeń przy λ = 415 nm i obliczmy ε korzystjąc ze wzoru n prwo Lmbert Beer. Jko odnośnik stosujemy wodę. Obliczyć wrtość średnią z trzech uzysknych wyników orz odchylenie stndrdowe tej wrtości. Porównć otrzymną wrtość z wrtością podną w tbeli n stronie 4. Z czego mogą wynikć ewentulne różnice w zmierzonej wrtości? Zwrócić uwgę n długość fli, przy której dokonno odczytu. 3. Wpływ lkoholu n pk p-nitrofenolu W kolejnym etpie ćwiczeni pomiry spektroskopowe zostną wykorzystne do wyznczeni stłej dysocjcji p-nitrofenolu przy różnych wrtościch ph. Dodtkowo nleży określić jk lkohol wpływ n wrtość pk p-nitrofenolu. W czterech probówkch sporządzmy próby skłdjące się z: ) 1 ml roztworu p-nitrofenolu (0,1 mm) + 3 ml wody destylownej. b) 1 ml roztworu p-nitrofenolu (0,1 mm) + 3 ml buforu fosfornowego o ph=8; c) 1 ml roztworu p-nitrofenolu (0,1 mm) + 3 ml buforu fosfornowego o ph=8, zwierjącego 10 % (v/v) lkohol (etnol lub izopropnol) (nleży wcześniej przygotowć roztwór np.: 0,3 ml lkoholu + 2,7 buforu o ph=8) d) 1 ml roztworu p-nitrofenolu (0,1 mm) + 3 ml buforu fosfornowego o ph= 10 Roztwory w poszczególnych probówkch wymieszć, po czym zmierzyć bsorbncję kżdego z nich przy długości fli 415 nm. Zpisć wynik bsorbncji dl kżdego z roztworów. (UWG: njwyższ wrtość bsorbcji powinn być rejestrown w próbce d, njniższ w próbce ). Nleży zwrcć uwgę, by użyte kuwety były wykonne z tego smego mteriłu (różne tworzyw mogą wykzywć inną bsorpcję świtł o dnej długości), to znczy by bsorbncj kuwet nie zwierjących żdnego roztworu był do siebie jk njbrdziej zbliżon. 8
N podstwie uzysknych pomirów wyliczmy pk p-nitrofenolu, przy ph=8 w roztworze bez lkoholu orz w roztworze zwierjącym lkohol. Wyciągnąć wnioski o wpływie lkoholu n pk i bsorpcję świtł przez p-nitrofenol. Obliczeni pk: - dl roztworu bez lkoholu: pk = ph + log (d) ( b) ( b) () - dl roztworu zwierjącego lkohol: pk = ph + log (d) ( c) gdzie: (d ) bsorbncj roztworu przygotownego wg. punktu d () bsorbncj roztworu, (b) bsorbncj roztworu b, (c) bsorbncj roztworu, ( c) () Jk stopień dysocjcji p-nitrofenolu wpływ n jego brwę (bsorbncję)? Czy zwiększenie udziłu formy dysocjownej przyczyni się do zmniejszeni czy do zwiększni intensywności brwy. 9